DE69733247T2

DE69733247T2 - Humanisiertes grünes-fluoreszenzprotein und methoden

Info

Publication number: DE69733247T2
Application number: DE69733247T
Authority: DE
Inventors: Sergei Zolotukhin; Nicholas Muzyczka; W. William HAUSWIRTH
Original assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 1996-01-18
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2017-01-18
Also published as: JP2008086327A; CA2243088A1; CA2243088C; EP0874903B1; EP0874903A1; JP4229469B2; WO1997026333A1; AU730842B2; JP2000503536A; US5874304A; DE69733247D1; NZ330957A; ATE295416T1; US5968750A; AU1750297A

Description

1. Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das technische Gebiet der Reportergene und stellt insbesondere verbesserte Gene, Konstrukte und Verwendungsverfahren für das grün fluoreszierende Protein (GFP) bereit. Bei den hier offenbarten gfp-Genen handelt es sich um durch Verwendung. bevorzugter DNA-Codons an die Expression in Säuger- und menschlichen Zellen angepaßte humanisierte gfp-Gene.
2. Stand der Technik
Reportermoleküle werden in biologischen Systemen häufig zur Verfolgung der Genexpression verwendet. Zu den allgemein verwendeten Reportergenen gehören β-Galactosidase, Leuchtkäfer (Firefly)-Luciferase, alkalische Phosphatase, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) und β-Glucuronidase (GUS). Die verfügbaren Reportergene weisen jedoch gewisse Nachteile auf, die ihre Verwendung einschränken. Eine häufig angetroffene Einschränkung besteht darin, daß die Einführung eines Substrats erforderlich ist. Zu weiteren Nachteilen zählt beispielsweise die Größe gewisser Proteine, was bedeutet, daß die Expression von Reporter-Fusionsproteinen schwierig sein kann.
Eine weitere sinnvolle Strategie besteht darin, ein Protein mit einem Fluoreszenz-Tag zu markieren, um nachfolgend den Nachweis und die Lokalisierung in intakten Zellen zu ermöglichen. Die Fluoreszenzmarkierung wird in Verbindung mit der Immunfluoreszenz und der Zytochemie mit Fluoreszenzanaloga verwendet, wobei die Biochemie und die Transportwege von Proteinen nach Mikroinjektion in lebende Zellen verfolgt werden.
Im allgemeinen wurde eine Fluoreszenzmarkierung, dadurch erzielt, daß man Proteine reinigte und sie kovalent an reaktive Derivate organischer Fluorophore konjugierte. Bei diesem Verfahren sind die Stöchiometrie und die Orte der Farbstoffbindung häufig schwierig zu kontrollieren, und normalerweise wird eine sorgfältige erneute Aufreinigung der Proteine notwendig. Ein weiteres Problem besteht in der Einführung der markierten Proteine in eine Zelle, woran häufig Mikroinjektionstechniken oder Verfahren zur reversiblen Permeabilisierung beteiligt sind, um die Proteine durch die Plasmamembran hindurch einzuschleusen.
Durch kürzlich erfolgte Fortschritte sowie die Klonierung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) wurde eine molekularbiologische Alternative zu Proteinen mit Fluoreszenz-Tag möglich gemacht. Das GFP-Gen sowie seine Verwendungen sind aus der WO 95/07463 bekannt. Bei dem vom Gen gfp10 aus der Qualle Aequorea victoria codierten grün fluoreszierenden Protein (GFP) handelt es sich um ein Protein mit 238 Aminosäuren, das blaues Licht absorbiert (Hauptbande bei 395 nm) und grünes Licht emittiert (Hauptbande bei 509 nm) (Morin und Hastings, 1971; Ward et al., 1980; Prasher et al., 1992). Das GFP-Chromophor-Hexapeptid beginnt bei Aminosäure 64 und entsteht aus der primären Aminosäuresequenz durch die Zyklisierung von Serin-Dehydrotyrosin-Glycin innerhalb dieses Hexapeptids (Shimomura, 1979; Cody et al., 1993).
Die lichtstimulierte GFP-Fluoreszenz ist speziesunabhängig und benötigt keinerlei Kofaktoren, Substrate oder zusätzliche Genprodukte von A. victoria (Chalfie et al., 1994). Dies gestattet den GFP-Nachweis in von A. victoria verschiedenen lebenden Zellen, solange sich eine sinnvolle Genexpression erzielen läßt. Die geringe Größe von gfp10 sowie der „Echtzeit"-Nachweis des Produkts machen GFP somit zu einem vielversprechenden Kandidaten für die Verwendung als Reportergen.
Vor kurzem wurden gewisse GFP-Varianten bekannt, die verbesserte Spektraleigenschaften aufweisen. So wurde beispielsweise von Heim et al. (1994) eine Mutante beschrieben, die blau fluoresziert und anstelle von Tyr66 ein Histidin enthält. Später wurde von Heim et al. (1995) eine Ser65→Thr-GFP-Mutante beschrieben, deren Spektrum deutlich näher an dem von Renilla reniformis liegt, das einen Extinktionskoeffizienten pro aufweist, der mehr als 10mal so hoch wie der der Bande bei längerer Wellenlänge von Aequorea-GFP ist.
Dennoch ist trotz gewisser Weiterentwicklungen, wie z.B. der oben beschriebenen Varianten, der derzeitige Nutzen von GFP immer noch durch variable und bestenfalls niedrige Expressionsniveaus in Säugerzellen eingeschränkt. Es ist daher offensichtlich, daß neue Entwicklungen in der GFP-Technologie nötig sind, bevor das volle Potential dieses Proteins, insbesondere bei Anwendungen, die Expression in Säugerzellen benötigen, einschließlich gentherapeutischer Strategien, realisiert werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung strebt danach, diese und weitere dem Stand der Technik innewohnende Nachteile zu überwinden, indem humanisierte Gene für grün fluoreszierendes Protein (GFP), die an die Expression in Säuger- und menschlichen Zellen angepaßt sind, bereitgestellt werden. Die erfindungsgemäßen humanisierten gfp-Gene werden durch Einbauen von zur Verwendung in menschlichen Genen bevorzugten Codons in die DNA-Sequenz hergestellt. Ebenso wurden humanisierte gfp-Expressionskonstrukte sowie verschiedene Verfahren zur Verwendung der humanisierten Gene und Vektoren bereitgestellt.
Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung in den Ansprüchen definiert und stellt humanisierte Gene für grün fluoreszierendes Protein (GFP) sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Gene bereit. Dabei wird unter dem Ausdruck ein „humanisiertes Gen für grün fluoreszierendes Protein (GFP)", wie er hier verwendet wird, ein Gen verstanden, das an die Expression in Säuger- und. menschlichen Zellen angepaßt ist, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Gen handelt, das für ein grün fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert und wobei das Gen mindestens sieben, vorzugsweise mindestens acht, stärker bevorzugt mindestens neun, humanisierte Codons von den 10 sich an den Positionen 18, 53, 93, 125, 150, 178, 195, 208, 236 und 224 der GFP-Gensequenz befindenen Codons umfaßt.
Bei den erfindungsgemäßen humanisiertem Gegen handelt es sich vorzugsweise um cDNAs, obwohl genomische Kopien keinesfalls ausgeschlossen sind. Bei den humanisierten Genen handelt es sich ebenso vorzugsweise um humanisierte Versionen, die von dem A. victoria-gfp-Gen ausgehend angepaßt wurden, obwohl wiederum andere gfp-Genquellen nicht ausgeschlossen sind.
In bestimmten Ausführungsformen werden durch die vorliegende Erfindung humanisierte gfp-Gene bereitgestellt, die für ein grün fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codieren.
In weiteren Ausführungsformen codieren humanisierte gfp-Gene für GFP-Varianten, die im allgemeinen auf der vorhergehenden Sequenz beruhen, jedoch gewisse Änderungen aufweisen. Ein besonderes Beispiel stellt ein humanisiertes Gen dar, das für ein GFP mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert, in der Serin in Position 65 durch Threonin ersetzt wurde.
Ein weiteres Beispiel stellt ein humanisiertes gfp-Gen dar, das für ein grün fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert, in der Tyrosin in Position 66 durch Histidin ersetzt wurde.
Ein weiteres Beispiel stellt ein humanisiertes gfp-Gen dar, das für ein GFP mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert, in der die Chromophorsequenz Phe Ser Tyr Gly Val Gln (SEQ ID NO: 4) zwischen den Positionen 64 und 69 durch die Sequenz Met Gly Tyr Gly Val Leu (SEQ ID NO: 5) ersetzt wurde.
Ebenso umfaßt die vorliegende Erfindung Strukturäquivalente der humanisierten gfp-Gene. Dabei werden jedoch Mutanten, die um mehr als einen Aminosäurerest am Aminoterminus oder um mehr als etwa 10 oder 15 Aminosäurereste vom Carboxyterminus her verkürzt sind, im allgemeinen nicht als sinnvoll im Zusammenhang mit der Produktion eines Fluoreszenzproteins angesehen. Das codierte GFP sollte daher eine Minimallänge von etwa 222 Aminosäuren aufweisen, wobei Proteine mit einer Länge von etwa 238 Aminosäuren im allgemeinen bevorzugt sind.
Die humanisierten Gene der vorliegenden Erfindung sind ebenso durch Gene definierbar, in denen mindestens etwa 10% der Codonpositionen ein humanisiertes Codon enthalten, das heißt, sie enthalten ein Codon, das vorzugsweise in menschlichen Genen verwendet wird, anstelle eines Codons, das nicht so häufig in menschlichen Genen verwendet wird.
In weiteren Ausführungsformen sind in den humanisierten Genen mindestens etwa 15%, etwa 20%, etwa 25%, etwa 30% oder etwa 35% der Codonpositionen durch das Vorhandensein eines humanisierten Codons definiert.
Humanisierte gfp-Gene, wobei mindestens etwa 50% oder mehr der Codonpositionen ein humanisiertes Codon enthalten, sind ebenso vorgesehen.
Bevorzugte erfindungsgemäße humanisierte gfp-Gene sind solche Gene, die gewisse Schlüsseländerungen enthalten. Dies sind beispielsweise Gene, die mindestens sieben humanisierte Codons von den 10 sich an den Codonpositionen 18, 53, 93, 125, 150, 178, 195, 208, 236 und 224 der Qualle-gfp-Sequenz befindenden Codons umfassen.
Vorzugsweise umfassen humanisierte gfp-Gene mindestens acht, mindestens neun, oder zehn, humanisierte Codons von den 10 sich an den Codonpositionen 18, 53, 93, 125, 150, 178, 195, 208, 236 und 224 der Qualle-gfp-Gensequenz befindenden Codons.
Bei solchen Konstrukten handelt es sich beispielhaft um humanisierte Gene, die an den Codonpositionen 18, 53, 125, 178, 195 und 236 der GFP-Gensequenz eines der humanisierten Leucin-Codons CTG, CTC oder TTG umfassen. Ein weiteres Beispiel ist ein humanisiertes gfp-Gen, das an den Codonpositionen 93, 150 und 224 der GFP-Gensequenz das humanisierte Valin-Codon GTG umfaßt. Weitere Beispiele stellen humanisierte Gene dar, die an der Codonposition 208 der GFP-Gensequenz das humanisierte Serin-Codon TCT umfassen.
Zu den von der vorliegenden Erfindung umfaßten humanisierten gfp-Genen gehören auch diejenigen Gene, die im Vergleich zur Qualle-Wildtypgensequenz der SEQ ID NO: 1 eine erhöhte Anzahl an für Alanin codierenden GCC- oder GCT-Codons umfassen.
Unter der Phrase „im Vergleich zur Qualle-Wildtypgensequenz der SEQ ID NO: 1 erhöhte Anzahl an Codons" wird verstanden, daß die humanisierte Sequenz eine erhöhte Anzahl von Codons enthält, die für eine bestimmte Aminosäure innerhalb des GFP codierenden Bereichs, der die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert, oder einer der hier beschriebenen Mutanten oder anderen Äquivalenten, codieren, im Vergleich zu denjenigen Codons, die für die gleiche Aminosäure, die im codierenden Bereich der Qualle-Wildtypgensequenz der SEQ ID NO: 1 vorliegt, codieren. Somit versteht sich, daß unter dem Ausdruck „erhöht" bei seiner Verwendung in diesem Zusammenhang nicht die Addition eines oder mehrerer Codons an einen terminalen Teil des codierenden Bereichs verstanden wird, sondern das Ersetzen eines ungünstigen Codons innerhalb des codierenden Bereichs durch ein Codon, das für die Translation in einer menschlichen oder Säugerzelle günstiger ist.
Im Hinblick auf die oben angegebene Definition können die erfindungsgemäßen humanisierten gfp-Gene auch als diejenigen Gene definiert werden, die eine erhöhte Anzahl an für Cystein codierenden TGC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Aspartat codierenden GAC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Glutamat codierenden GAG-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Phenylalanin codierenden TTC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Glycin codierenden GGC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Histidin codierenden CAC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Isoleucin codierende ATC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Lysin codierenden AAG-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Leucin codierenden CTG- oder CTC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Asparagin codierenden AAC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Prolin codierenden CCC- oder CCT-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Glutamin codierenden CAG-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Arginin codierenden CGC-, AGG- oder CGG-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Serin codierenden AGC- oder TCC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Threonin codierenden ACC-Codons; eine erhöhte Anzahl an für Valin codierenden GTG- oder GTC-Codons und/oder eine erhöhte Anzahl an für Tyrosin codierenden TAC-Codons im Vergleich zur Qualle-Wildtypgensequenz der SEQ ID NO: 1 umfassen.
In bestimmten Ausführungsformen können die humanisierten gfp-Gene auch ein TGA-Terminationscodon umfassen.
Humanisierte gfp-Gene können auch dadurch definiert sein, daß sie im Vergleich zur Qualle-Wildtypgensequenz der SEQ ID NO: 1 eine reduzierte Anzahl an bestimmten Codons umfassen. Unter „reduziert" wird in diesem Zusammenhang auch verstanden, daß die humanisierte Sequenz eine reduzierte Anzahl an Codons, die für eine bestimmte Aminosäure innerhalb des GFP codierenden Bereichs, der für die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert, oder eine Mutante oder ein Äquivalent davon codieren, im Vergleich zu denjenigen Codons, die für die gleiche Aminosäure codieren und die sich innerhalb des codierenden Bereichs der Qualle-Wildtypgensequenz der SEQ ID NO: 1 befinden enthält. Es versteht sich somit, daß „reduziert" in keiner Weise die einfache Deletion von Codons von einem beliebigen Teil des codierenden Bereichs widerspiegelt, sondern sich wiederum auf den Ersatz eines Qualle-Codons durch ein Codon, das häufiger in menschlichen Genen auftritt, bezieht.
Dementsprechend sind humanisierte gfp-Gene der vorliegenden Erfindung auch als diejenigen Gene definiert, die eine reduzierte Anzahl an für Alanin codierenden GCA-Codons; eine reduzierte Anzahl an für Glycin codierenden GGT-Codons; eine reduzierte Anzahl an für Leucin codierenden CCT-, CTA- oder TTA-Codons; eine reduzierte Anzahl an für Arginin codierenden AGA-Codons; eine reduzierte Anzahl an für Serin codierenden AGT-, TCA- oder TCG-Codons oder eine reduzierte Anzahl an für Valin codierenden GTT- oder GTA-Codons umfassen.
Obwohl nicht angenommen wird, daß dies erforderlich ist, ist zur Zeit bevorzugt, daß die humanisierten gfp-Gene eine stromaufwärts von der humanisierten Gensequenz operativ positionierte Kozak-Konsensussequenz enthalten sollten (d.h. das Gen ist stromabwärts von der Kozak-Konsensussequenz positioniert).
Gewisse bevorzugte humanisierte gfp-Gene umfassen die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3. Dies stellt jedoch in keiner Weise eine Beschränkung dar und ist vielmehr lediglich eine beispielhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Anmeldung enthält ausführliche Anleitungen zur Herstellung und Verwendung vieler anderer solcher humanisierter gfp-Gene. So wird beispielsweise auf die Angaben in Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 zur Erzeugung eines beliebigen aus einer Reihe geeigneter humanisierter gfp-Gene verwiesen.
Auf diese erfindungsgemäße Weise humanisierte Gene können auch mit weiteren Protein codierenden Nukleinsäuresequenzen operativ verknüpft werden. Dies führt im allgemeinen nach der Expression eines solchen Nukleinsäurekonstrukts zur Produktion eines Fusionsproteins. Dabei sind sowohl N-terminale als auch C-terminale Fusionsproteine vorgesehen.
Es kann praktisch jede Protein oder Peptid codierende DNA-Sequenz oder Kombinationen davon an eine humanisierte gfp-Sequenz fusioniert werden, um ein Fusionsprotein zu codieren. Dazu zählen DNA-Sequenzen, die für zielgerichtete Peptide, therapeutische Proteine, Proteine zur rekombinanten Expression, Proteine, an die ein oder mehrere zielgerichtete Peptide gebunden sind, Proteinuntereinheiten und dergleichen codieren.
Rekombinante Vektoren und Plasmide bilden einen weiteren wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung. In solchen Vektoren ist das humanisierte gfp-Gen unter die Transkriptionskontrolle eines Promotors, im allgemeinen eines in einer Säuger- oder menschlichen Zelle wirksamen Promotors, gestellt. Unter „gestellt unter die Transkriptionskontrolle von" wird verstanden, daß die humanisierte gfp-Sequenz stromabwärts und unter die Transkriptionskontrolle vom Promotor gestellt wird, so daß der Promotor dazu in der Lage ist, die Expression des codierten GFP-Proteins in einer Säuger- oder menschlichen Wirtszelle nach Einführung des Vektors in eine solche Zelle zu steuern.
Somit umfassen die erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren im allgemeinen ein stromabwärts von einem Promotor operativ positioniertes humanisiertes gfp- Reportergen nach Anspruch 1, wobei der Promotor dazu in der Lage ist, die Expression des humanisierten GFP-Gens in einer Säuger- oder menschlichen Zelle zu steuern. Vorzugsweise steuert der Promotor die Expression von GFP in einer ausreichenden Menge, die den GFP-Nachweis durch Nachweisen der grünen Fluoreszenz nach Expression von GFP in der Zelle gestattet. Solche Promotoren sind somit in Säuger- und menschlichen Zellen „wirksam".
Expressionsvektoren und Plasmide im Sinne der vorliegenden Erfindung können einen oder mehrere konstitutive Promotoren, wie beispielsweise virale Promotoren oder Promotoren aus Säugergenen, die allgemein beim Starten der Transkription aktiv sind, umfassen. Zu den konstitutiven viralen Promotoren gehören beispielsweise die HSV-, TK-, RSV-, SV40- und CMV-Promotoren, von denen der CMV-Promotor zur Zeit ein bevorzugtes Beispiel darstellt. Zu den konstitutiven Säugerpromotoren gehören beispielsweise verschiedene Haushaltsgenpromotoren, wie sie beispielhaft durch den β-Actin-Promotor dargestellt sind.
Induzierbare Promotoren und/oder regulatorische Elemente sind ebenso zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren vorgesehen. Zu geeigneten induzierbaren Promotoren gehören beispielsweise Promotoren aus Genen, wie z.B. Cytochrom-P450-Genen, Hitzeschockproteingenen, Metallothioneingenen, hormoninduzierbaren Genen, wie z.B. der Östrogen-Genpromotor, und dergleichen. Promotoren, die als Reaktion auf einen Kontakt mit ionisierender Strahlung aktiv werden, wie z.B. fos, jun und egr-I, sind ebenso vorgesehen. Dabei stellt der tetVP16-Promotor, der auf Tetracyclin reagiert, ein zur Zeit bevorzugtes Beispiel dar.
In gewissen Ausführungsformen sind gewebespezifische Promotoren und/oder regulatorische Elemente von Nutzen. Zu denjenigen Promotoren, die mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren verwendet werden können, gehören beispielsweise Promotoren aus dem Gen für das Fettsäure bindende (FAB-)Protein der Leber, die für Darmepithelzellen spezifisch sind, aus dem Insulingen, die spezifisch für Pankreaszellen sind; aus den Genen für Transphyretin, α1-Antitrypsin, Plasminogenaktivator-Inhibitortyp 1 (PAI-1), Apolipoprotein AI und LDL-Rezeptorgene, die spezifisch für Leberzellen sind; aus dem Gen für MBP (Myelin Basic Protein, die spezifisch für Oligodendrozyten sind; aus dem Gen für GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), die spezifisch für Gliazellen sind; OPSIN, die spezifisch für eine Ausrichtung auf das Auge sind sowie der NSE-(Neural-Specific-Enolase) Promotor, der spezifisch für Nervenzellen ist.
Die Konstruktion und Verwendung von Expressionsvektoren und Plasmiden sind dem Fachmann allgemein bekannt. Somit können im Zusammenhang mit den hier offenbarten humanisierten Genen praktisch alle Säugerzellen-Expressionsvektoren verwendet werden.
Bevorzugte Vektoren und Plasmide werden mit mindestens einer Mehrfachklonierungsstelle konstruiert. In gewissen Ausführungsformen umfaßt der Expressionsvektor eine Mehrfachklonierungsstelle, die zwischen einem Promotor und einer humanisierten gfp-Gensequenz nach Anspruch 1 operativ positioniert ist. Solche Vektoren können zusätzlich zu ihrer Verwendung in anderen Ausführungsformen zur Erzeugung N-terminaler Fusionsproteine eingesetzt werden, indem ein zweites Protein codierendes DNA-Segment in die Mehrfachklonierungsstelle kloniert wird, so daß sie mit der humanisierten gfp-Sequenz zusammenhängt und sich im Leseraster mit ihr befindet.
In weiteren Ausführungsformen können Expressionsvektoren eine stromabwärts von der exprimierbaren humanisierten gfp-Gensequenz nach Anspruch 1 operativ positionierte Mehrfachklonierungsstelle umfassen. Zusätzlich zu ihren Verwendungen eignen sich diese Vektoren bei der Erzeugung C-terminaler Fusionsproteine, indem ein zweites Protein codierendes DNA-Segment in die Mehrfachklonierungsstelle kloniert wird, so daß sie mit der humanisierten gfp-Sequenz zusammenhängt und sich im Leseraster mit ihr befindet.
Vektoren und Plasmide, in denen auch ein zweites Protein oder RNA codierendes Nukleinsäuresegment vorhanden ist, sind selbstverständlich ebenso von der Erfindung umfaßt, und zwar unabhängig von der Beschaffenheit des Nukleinsäuresegments selbst.
Ein Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung kann ein zweites Reportergen enthalten. Dabei kann das zweite Reportergen in einer zweiten Transkriptionseinheit enthalten sein. Zu geeigneten zweiten Reportergenen gehören diejenigen, die eine Resistenz gegenüber Agentien wie z.B. Neomycin, Hygromycin, Puromycin, Zeocin, Mycophenolsäure, Histidinol und Methotrexat verleihen.
Expressionsvektoren können auch weitere Nukleinsäuresequenzen, wie z.B. IRES-Elemente, Polyadenylierungssignale, Spleißdonor-/Spleißakzeptor-Signale und dergleichen, enthalten.
Geeignete Expressionsvektoren sind beispielsweise insbesondere diejenigen, die an eine Expression unter Verwendung eines rekombinanten adenoviralen, eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen (AAV) oder eines rekombinanten retroviralen Systems angepaßt sind. Unter anderem können auch Vacciniavirus, Herpes-simplex-Virus, Zytomegalievirus sowie defekte Hepatitis-B-Viren verwendet werden.
In gewissen Ausführungsformen kann der Expressionsvektor oder das Plasmid ein humanisiertes GFP-Reportergen mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3 umfassen.
Ebenso werden Reportergen-Expressionskits bereitgestellt, die im allgemeinen in geeigneten Behältnissen mindestens einen Expressionsvektor oder mindestens ein Plasmid umfassen, der bzw. das ein humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1 umfaßt. Im allgemeinen handelt es sich dabei um einen Vektor oder ein Plasmid, der bzw. das dazu in der Lage ist, GFP in ausreichender Menge zu exprimieren, um den GFP-Nachweis durch grüne Fluoreszenz nach Expression in einer Säuger- oder menschlichen Zelle zu gestatten.
Rekombinante Wirtszellen bilden einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung. Solche Wirtszellen umfassen im allgemeinen mindestens eine Kopie eines humanisierten GFP-Gens nach Anspruch 1. Säuger- und menschliche Zellen stellen für Expressionszwecke bevorzugte Zellen dar. Allerdings versteht es sich, daß andere Zellarten nicht von denen der Erfindung ausgeschlossen sind.
Dementsprechend kommen als Zellen auch Zellen wie z.B. Bakterien-, Hefe-, Pilz, Insekten-, Nematoden- und Pflanzenzellen in Frage, obwohl solche Zellen für Expressionszwecke nicht bevorzugt sind.
In gewissen Ausführungsformen wird in die rekombinanten Wirtszellen vorzugsweise ein humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1 so eingebaut, daß damit der Zelle gestattet wird, GFP, am meisten bevorzugt in einer Menge, die dazu ausreicht, den GFP-Nachweis durch dessen Fluoreszenz zu gestatten, zu exprimieren oder zu dieser Expression stimuliert zu werden. Somit enthält die rekombinante Wirtszelle vorzugsweise ein humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, das in die Zelle mittels eines rekombinanten Vektors eingeführt wurde.
In gewissen Ausführungsformen exprimiert die rekombinante Wirtszelle das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1 unter Erhalt des codierten GFP-Proteins, vorzugsweise in einer ausreichenden Menge, um den GFP-Nachweis durch dessen Fluoreszenz zu gestatten. Dabei ist vorgesehen, daß Zellen, die nur etwa 20 Kopien eines humanisierten gfp-Gens nach Anspruch 1 enthalten, häufig das GFP-Protein in einer Menge exprimieren, die ausreicht, um den GFP-Nachweis durch grüne Fluoreszenz zu gestatten. In gewissen Ausführungsformen erfüllen auch Zellen mit nur etwa 10 Kopien, etwa 5 Kopien oder sogar nur etwa 1 oder 2 Kopien eines humanisierten gfp-Gens nach Anspruch 1 ziemlich sicher die gewünschten Expressionskriterien, vor allem wenn es sich bei dem humanisierten gfp-Gen um ein mutantes Gen handelt. In weiteren Ausführungsformen können rekombinante Wirtszellen zur Expression eines humanisierten Gens nach Anspruch 1 in der Lage sein, um nachweisbares GFP-Protein in einem Zeitrahmen von etwa 10 Stunden und vorzugsweise innerhalb von etwa 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von etwa 6 Stunden oder einer noch kürzen Zeit, zu produzieren.
Zu geeigneten rekombinanten Wirtszellen gehören beispielsweise VERO-Zellen, HeLa-Zellen, Zellen von CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellinien, COS-Zellen, wie z.B. COS-7; sowie W138-, BHK-, HepG2-, 3T3-, RIN-, MDCK-, A549-, PC12-, K562- und 293-Zellen.
Die Zellen der vorliegenden Erfindung umfassen ebenso Zellen von Primärzellinien, die nach Entnehmen aus Zellen aus einem Säuger und Kultivieren der Zellen über einen beschränkten Zeitraum etabliert wurden. Dabei können diese Zellen von Hand manipuliert und in das gleiche Wirtstier, aus dem sie ursprünglich gewonnen wurden, zurückgeführt werden. Derartige Zellen, die ein humanisiertes gfp-Gen enthalten, liegen unabhängig von ihrer Lokalisierung im Rahmen der Erfindung.
Natürlicherweise umfassen rekombinante Zellen auch diejenigen Zellen, die im Körper eines tierischen oder menschlichen Individuums lokalisiert sind, wie beispielsweise solche, die als Ziel für eine Gentherapie dienen. Zu diesen Zellen gehören alle diejenigen, die mindestens eine Kopie eines humanisierten gfp-Gens oder Vektors umfassen, unabhängig von der Art, auf die das Gen erworben wurde, beispielsweise Transfektion, Infektion und dergleichen.
In gewissen bestimmten Ausführungsformen sind rekombinante Wirtszellen vorgesehen, die ein die Nukleinsäure der SEQ ID NO: 3 umfassendes humanisiertes GFP-Gen umfassen.
Durch die vorliegende Erfindung werden viele Verfahren zur Verwendung humanisierter gfp-Gene nach Anspruch 1 bereitgestellt. Dabei steht das Verfahren eine Säuger- oder menschliche Zelle durch Exprimieren mindestens eines humanisierten GFP-Gens nach Anspruch 1 mit einer Markierung oder einem Tag zu versehen, jeweils im Mittelpunkt der Verfahren. Das humanisierte gfp-Gen sollte vorzugsweise GFP in einer Menge produzieren, die dazu ausreicht, einen schnellen Nachweis von GFP in der Zelle durch Nachweisen der GFP-Fluoreszenz zu gestatten.
Ebenso werden Verfahren zur Identifizierung einer Säuger- oder menschlichen Zelle in einer Zellpopulation bereitgestellt. Bei derartigen Verfahren exprimiert man im allgemeinen zunächst mindestens ein humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1 in der Zelle auf eine Weise, die die Produktion einer ausreichenden GFP-Menge, um den GFP-Nachweis durch Fluoreszenz zu gestatten, bewirkt. Man versetzt die Zelle dann mit einer Population von Zellen, die kein GFP exprimieren, oder läßt sie mit diesen auf natürliche Weise mischen, wonach man die Zelle durch Identifizieren einer Zelle mit GFP-Fluoreszenz identifiziert.
Unter dem Ausdruck „eine Zelle mit GFP-Fluoreszenz", wie er hier verwendet wird, wird verstanden, daß eine Zelle ein humanisiertes GFP-Gen auf eine Weise exprimiert, die zur Produktion des GFP-Produkts in einer Menge, die ausreicht, um den nachfolgenden Nachweis der Zelle durch Nachweisen der grünen Fluoreszenz von GFP in der Zelle zu gestatten, führt.
Durch die Erfindung werden ferner Verfahren zur Identifizierung einer ein exogenes DNA-Segment enthaltenden Säuger- oder menschlichen Zelle bereitgestellt, bei denen man im allgemeinen zunächst einen ein humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1 in operativer Verknüpfung mit einem exogenen DNA-Segment umfassenden Expressionsvektor in eine Säuger- oder menschliche Zelle einführt. Die Zelle wird dann vorzugsweise unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die die Expression des humanisierten gfp-Gens gestatten, kultiviert, um eine ausreichende Menge an GFP zu produzieren, die den GFP-Nachweis durch grüne Fluoreszenz gestattet. Anschließend kann eine das exogene DNA-Segment enthaltende Zelle dann durch Identifizieren einer Zelle mit GFP-Fluoreszenz identifiziert werden.
Diese Verfahren eigenen sich zur Identifizierung exogener DNA-Segmente, die für nichttranslatierte Produkte codieren, wie z.B. ein Antisense-Nukleinsäuremolekül, Ribozym oder andere RNA-Spezies, sowie auch zur Identifizierung exogener DNA-Segmente, die für translatierte Produkte codieren, wie z.B. ausgewählte Proteine oder Peptide.
Bei gewissen derartigen Ausführungsformen umfaßt der Expressionsvektor zur Verwendung in derartigen Verfahren einen als das für GFP codierende humanisierte gfp-Gen nach Anspruch 1 definierten ersten codierenden Bereich sowie einen zweiten codierenden Bereich, der das exogene DNA-Segment umfaßt. Diese Vektoren sind allgemein als Vektoren bekannt, die mindestens zwei Transkriptions- oder Translationseinheiten umfassen. Zwei Transkriptionseinheiten umfassen natürlicherweise zwei Promotoren, die die Expression ihrer jeweils stromabwärts liegenden Gene steuern.
Die Verfahren zur Identifizierung von ein exogenes DNA-Segment enthaltenden Säuger- oder menschlichen Zellen eignen sich auch zur Verwendung mit Expressionsvektoren, die einen für ein GFP in operativer Verknüpfung mit einem ausgewählten Protein oder Peptid umfassendes Fusionsprotein codierenden ersten codierenden Bereich umfassen, wobei der Vektor ein GFP in operativer Verknüpfung mit dem ausgewählten Protein oder Peptid umfassendes Fusionsprotein exprimiert. Diese erfindungsgemäßen Aspekte sind im allgemeinen, obwohl nicht unbedingt ausschließlich, auf den Nachweis für translatierte Produkte codierender exogener DNA-Segmente beschränkt.
Auf solche Weise exprimierte Fusionsproteine können GFP in operativer Verknüpfung mit einem ein subzelluläres Lokalisierungssignal umfassenden Peptid, wie z.B. einem nukleären Zielpeptid oder einem mitochondrialen Zielpeptid, umfassen. Die Fusionsproteine können ebenso GFP in operativer Verknüpfung mit sowohl einem ausgewählten Protein als auch einem ein subzelluläres Lokalisierungssignal umfassenden Peptid umfassen.
Derartige Identifizierungsverfahren können in vitro durchgeführt werden, wobei verschiedene Ziele vorgesehen sind, wie unten beschrieben. Diese Identifizierungsverfahren können auch in vivo durchgeführt werden, wobei die Zelle in einem Säuger- oder menschlichem Individuum lokalisiert ist.
Zwei oder mehr humanisierte gfp-Gene nach Anspruch 1, die jeweils ein GFP-Protein mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften exprimieren, können in einer Zelle auf die oben beschriebene Weise nachgewiesen werden. Zellen mit GFP-Fluoreszenz können, gleichgültig ob sie ein, zwei oder mehr humanisierte gfp-Gene exprimieren, mit verschiedenen Verfahren, einschließlich Mikroskopie und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS) identifiziert werden.
Zu den erfindungsgemäßen Verfahren gehören ferner beispielsweise Verfahren zur Bestimmung der Lokalisation eines ausgewählten Proteins in einer Säuger- oder menschlichen Zelle. Bei diesen Verfahren führt man im allgemeinen zunächst einen eine ein humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1 in operativer Verknüpfung mit einem für das ausgewählte Protein codierenden Gen umfassende zusammenhängende DNA-Sequenz umfassenden Expressionsvektor in die Zelle ein. Dabei exprimiert der Vektor im allgemeinen ein GFP in operativer Verknüpfung mit dem ausgewählten Protein umfassendes Fusionsprotein, wobei das Fusionsprotein in ausreichenden Mengen produziert wird, die den Zellnachweis durch Nachweisen der grünen GFP-Fluoreszenz gestatten. Man kann dann die Lokalisation des ausgewählten Proteins in der Zelle durch Identifizieren der Lokalisation der grünen Fluoreszenz vom GFP identifizieren.
Diese Verfahren eignen sich zur Bestimmung der Lokalisation ausgewählter Proteine in Zellen, wobei die Lokalisation bekanntermaßen oder angenommenerweise von externen Stimuli, wie z.B. Wärme, Kälte, Salz, oder dem Vorhandensein verschiedener Agonisten, wie z.B. Hormonen, Cytokinen, Neurotransmittern und dergleichen, abhängt. Diese Verfahren eignen sich ebenso zur Bestimmung der Lokalisation ausgewählter Proteine in Zellen, wobei die Lokalisation bekanntermaßen oder angenommenerweise von internen Signalen, wie z.B. solchen, die bei Änderungen im Zellzyklus, beim Altern der Zelle und Apoptose und dergleichen, vorhanden sind, abhängt.
Zu den erfindungsgemäßen Verfahren gehören ferner auch beispielsweise Verfahren zum Abzielen eines Proteins auf eine ausgewählte Lokalisation in einer Säuger- oder menschlichen Zelle. Bei diesen Verfahren führt man im allgemeinen zunächst einen eine ein für ein Zielpeptid codierendes DNA-Sequenzelement in operativer Verknüpfung und zusammenhängend mit einem DNA-Sequenzelement eines humanisierten GFP-Gens nach Anspruch 1, das auch mit einem ein Protein codierenden DNA-Sequenzelement operativ verknüpft ist und zusammenhängt, umfassende DNA-Sequenz umfassenden Expressionsvektor in die Zelle ein. Derartige Vektoren exprimieren ein ein Zielpeptid in operativer Verknüpfung mit GFP und einem Protein umfassendes Fusionsprotein, wobei das Fusionsprotein in der Zelle in einer ausreichenden Menge produziert wird, die den Zellnachweis durch Nachweisen der GFP-Fluoreszenz gestattet. Das Protein wird dann auf eine ausgewählte Lokalisation in der Zelle abgezielt, wobei man die Lokalisation durch Identifizieren der Lokalisation der grünen Fluoreszenz bestätigt.
Zu mit der vorliegenden Erfindung assoziierten Verfahren zählen ferner auch Verfahren zum Testen von Kandidatenpromotoren in Säuger- oder menschlichen Zellen.
Bei diesen Verfahren führt man im allgemeinen einen ein humanisiertes GFP-Gen unter der Kontrolle des Kandidatenpromotors umfassenden Expressionsvektor in die Zelle ein und hält die Zelle unter Bedingungen, die auf wirksame Weise und über einen ausreichenden Zeitraum die Expression des humanisierten GFP-Gens durch den Kandidatenpromotor gestatten. Dabei werden „wirksame Bedingungen" und „ausreichende Zeiträume" als diejenigen Bedingungen und Zeiten definiert, die normalerweise zu einer GFP-Produktion in einer ausreichenden Menge, die den GFP-Nachweis durch grüne Fluoreszenz bei Verwendung eines bekannten wirksamen Promotors gestattet, führen würden.
Nachdem die Zelle unter den geeigneten Bedingungen gehalten wurde, würde man dann jegliche Zellen mit GFP-Fluoreszenz identifizieren, wobei das Vorhandensein von Zellen mit GFP-Fluoreszenz einen aktiven Promotor im Expressionskonstrukt innerhalb der identifizierten Zelle anzeigen würde.
Diese Verfahren eignen sich zur Analyse von gewebespezifischen Kandidatenpromotoren, wobei der Promotor in einer Reihe von Säuger- oder menschlichen Zellen getestet werden kann; sowie zur Analyse von induzierbaren Kandidatenpromotoren, wobei der Promotor im allgemeinen unter einer Reihe von Bedingungen getestet wird. Dabei wird der Ausdruck „gewebespezifischer Promotor", wie er hier verwendet wird, in Bezug auf Promotoren verwendet, die die Genexpression ausschließlich in bestimmten Geweben steuern, sowie auf Promotoren, die die Genexpression vorzugsweise in gegebenen Geweben steuern und die auch als Promotoren mit „Gewebebevorzugung" bezeichnet werden können. Dabei kann es sich bei den Kandidatenpromotoren auch um einen Promotor handeln, der natürlicherweise mit einem Kandidatengen, das auf Expression auf einer Säuger- oder menschlichen Zelle getestet wird, assoziiert ist.
Diese Verfahren eignen sich wiederum zur Analyse von Promotoren in vitro und in vivo, wobei im letzteren Fall die Zelle in einem Säuger- oder menschlichen Individuum lokalisiert sein würde.
Ein weiteres Beispiel von Verfahren zur Verwendung von menschlichem gfp im Zusammenhang mit Promotoren stellen diejenigen Verfahren zum Nachweis von die Transkription von einem ausgewählten Promotor in einer Säuger- oder menschlichen Zelle stimulierenden Substanzen dar. Dabei führt man im allgemeinen wiederum einen ein humanisiertes GFP-Gen unter der Kontrolle eines gegebenen Promotors umfassenden Expressionsvektor in eine Säuger- oder menschliche Zelle ein. Danach setzt man die Zelle einer Zusammensetzung aus, von der vermutet wird, daß sie eine Substanz, von der bekannt ist oder von der vermutet wird, daß sie zur Stimulierung der Transkription von dem gegebenen Promotor fähig ist, enthält. Die Zelle wird dann über einen Zeitraum, der normalerweise einem aktiven Promotor die Stimulierung der Produktion eines GFP-Fusionsproteins in einer ausreichenden Menge, die den Zellnachweis durch Nachweisen der von GFP stammenden grünen Fluoreszenz gestattet, erlauben würde, kultiviert oder gehalten. Die nachfolgende Identifizierung einer Zelle mit GFP-Fluoreszenz zeigt dann das ursprüngliche Vorhandensein einer die Transkription von dem gegebenen Promotor stimulierenden Substanz an.
Diese Verfahren eignen sich ebenso zur Verwendung in vitro und in vivo. Die in-vitro-Verwendungen gestatten den Nachweis von Substanzen, wie z.B. Toxinen und Umweltschadstoffen, durch Verwendung entsprechender Promotoren in den humanisierten gfp-Genkonstrukten.
Als Teil einer Gentherapie ist es häufig notwendig, Genexpressionsniveaus in dem behandelten Säugetier oder menschlichen Individuum zu bestimmen. Durch die vorliegende Erfindung werden auch Verfahren zur Bestimmung solcher Expressionsniveaus bereitgestellt. Bei diesen Verfahren exprimiert man im allgemeinen einen ein humanisiertes GFP-Gen in operativer Verknüpfung mit einem ausgewählten Gen umfassenden Expressionsvektor in den Zellen des Tiers. Bei dem Expressionsvektor handelt es sich vorzugsweise entweder um einen Vektor, der ein GFP-Fusionsprotein exprimiert, oder um einen Vektor, in dem das humanisierte gfp-Gen und das ausgewählte Proteingen jeweils den gleichen oder einen äquivalenten Promotor verwenden. Vorzugsweise konnte dabei gezeigt werden, daß der Promotor eine ausreichende GFP-Expression bewirkt, um den Nachweis in vitro zu gestatten. Danach bestimmt man die GFP-Fluoreszenz in den Zellen des Tiers, wobei das Niveau der GFP-Fluoreszenz das Expressionsniveau des ausgewählten Gens im Tier anzeigt.
Diese Verfahren lassen sich so anpassen, daß damit Verfahren zur Analyse der Expression eines ausgewählten Gens in unterschiedlichen Geweben eines Säuger- oder menschlichen Individuums bereitgestellt werden. Bei derartigen Verfahren führt man im allgemeinen einen das ausgewählte Gen unter der Kontrolle des natürlichen Genpromotors umfassenden Expressionsvektor in die Zellen des Säugers ein, wobei das Gen mit einem humanisierten GFP-Gen operativ verknüpft ist. Dabei exprimiert der Vektor vorzugsweise ein Fusionsprotein, das das codierte Genprodukt in operativer Verknüpfung mit GFP umfaßt, wobei das Fusionsprotein in einer ausreichenden Menge produziert wird, um den Zellnachweis durch Nachweisen der grünen Fluoreszenz von GFP zu gestatten. Nachdem der Säuger unter Bedingungen gehalten wurde, die auf wirksame Weise und über einen ausreichenden Zeitraum die Expression des Gens gestatten, analysiert man dann zum Nachweis von Zellen mit GFP-Fluoreszenz die Zellen der Gewebe des Säugers, wobei das Vorhandensein von Zellen mit GFP-Fluoreszenz in einem gegebenen Gewebe Genexpression in dem Gewebe anzeigt.
Ein weiteres Beispiel, bei dem die humanisierten gfp-Gene eingesetzt werden können, stellt die rekombinante Produktion von GFP selbst dar. Bei derartigen Verfahren zur Verwendung eines humanisierten GFP-Gens exprimiert man einfach das humanisierte Gen in einer Säuger- oder menschlichen Wirtszelle und sammelt das von der Zelle exprimierte GFP.
Diese Verfahren können ausführlicher mit den folgenden darin enthaltenden Schritten beschrieben werden:

(a) Herstellen eines rekombinanten Vektors, in dem ein humanisiertes GFP-Gen unter die Kontrolle eines in einer Säuger- oder menschlichen Zelle wirksamen Promotors gestellt wird;
(b) Einführen des rekombinanten Vektors in eine Säuger- oder menschliche Wirtszelle;
(c) Kultivierung der Wirtszelle unter Bedingungen, die auf wirksame Weise und über einen ausreichenden Zeitraum die Expression des codierten grün fluoreszierenden Proteins (GFP) gestatten; und
(d) Sammeln des exprimierten GFP und vorzugsweise Aufreinigen des GFP, wobei dieses von einer signifikanten Menge an anderen zellulären Proteinen befreit wird.

Anpassungen derartiger Verfahren umfassen solche, wobei das humanisierte GFP-Gen an eine für ein Protein oder Peptid mit bekanntem Molekulargewicht codierende DNA-Sequenz fusioniert wird. Die Expression durch die Wirtszelle führt somit zu einem GFP-Fusionsprotein, das als Fluoreszenzmolekulargewichtsmarker verwendet werden kann. Auf diese Weise könnte eine Reihe solcher Fluoreszenzmolekulargewichtsmarker zur Herstellung eines Molekulargewichtsbestimmungskits produziert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und sind zur weiteren Demonstration gewisser Aspekte der vorliegenden Erfindung enthalten. Zum besseren Verständnis der Erfindung kann auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen zusammen mit der ausführlichen Beschreibung hier dargestellter spezifischer Ausführungsformen verwiesen werden.
1. Nukleotidsequenz der gfp10-cDNA und der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz. Über jedem Codon steht die 1-Buchstaben-Bezeichnung für die Aminosäure. Die in die gfp_h-Sequenz eingeführten Mutationen sind unterhalb des substituierten Nukleotids von gfp10 dargestellt. Überlappungsbereiche von Oligonukleotiden mit gemeinsamen Priming, die zur Synthese der gfp_h-cDNA verwendet werden, sind durch die horizontalen Linien unterstrichen. Die Stellen der zur Zusammenfügung verlängerter Oligonukleotidpaare verwendeten Restriktionsenzyme sind in Fettdruck dargestellt. Die zur Herstellung der Ser₆₅Thr-Mutation, die eine höhere Fluoreszenzausbeute ergibt, sowie der Tyr₆₆His-Mutation, die eine blaue Fluoreszenz produziert, mutierten Codons sind in Fettdruck dargestellt. In 1 handelt es sich bei SEQ ID NO: 1 um die Qualle-gfp10-Nukleotidsequenz. Bei SEQ ID NO: 2 handelt es sich um die abgeleitete Aminosäuresequenz. In der SEQ ID NO: 2 kann Xaa an Position 65 für Ser oder Thr und Xaa in Position 66 für Tyr oder His stehen. Bei der SEQ ID NO: 3 handelt es sich um die unterhalb des substituierten Nukleotids von gfp10 in 1 gezeigte beispielhafte humanisierte gfp-Sequenz. In der SEQ ID NO: 3 können die Nukleotide in den Positionen 193, 195 und 196 geändert werden, um entweder für Ser oder Thr und entweder für Tyr oder His, wie oben, zu codieren.
2A. Restriktionskarte der AAV- und Ad-Vektorplasmide. Es sind nur diejenigen Restriktionsstellen gezeigt, die für die Konstruktion der rAAV-Plasmide relevant sind. Die Größen von entfernbaren Elementen und Reportergenkassetten sind jeweils in Basenpaaren angegeben. Die Genealogie der Gene und Transkriptionselemente ist wie folgt: TR steht für das PstI-BglII-Fragment (145 Bp + oligo (dG).oligo (dC), insgesamt 160 Bp) aus dl3-94 (McLaughlin et al., 1988); P_CMV steht für den unmittelbaren/frühen Promotor/Enhancer aus CMV; SD/SA stehen für die 16s/19s-Spleißdonor- bzw. -Akzeptorsignale des späten SV40-Virusproteingens; gfp steht für die cDNA des grün fluoreszierenden Proteins aus A. victoria in pTr_BS-UF oder für die chemisch synthetisierte humanisierte wt-gfp_h-cDNA in pTR_BS-UF1 oder für das Thr65-gfp_h in pTR_BS-UF2 oder für das His66-gfp_h in pTR_BS-UFB; pA₁ steht für das SV40-Polyadenylierungssignal aus dem SV40-Genom; PO_enb steht für eine Tandem-Wiederholungssequenz des Enhancers aus der Polyomavirusmutante PYF441; P_TK steht für den TK-Promotor aus HSV; neo' steht für das Neomycin-Resistenzgen aus Tn5; pA₂ steht für das Polyadenylierungssignal von Rindwachstumshormon aus pRc/CMV (Invitrogen); IRES steht für die interne ribosomale Eintrittsstelle von Poliovirus-Typ 1 aus pSBC-1 (Dirks et al., 1993).
2B. Konstruktion des Allzweckvektors pTR-UF.
3. FACS-Analyse von mit der pTR_BS-UF-Serie rekombinanter Plasmide transfizierten 293-Zellen. 293-Zellen (6-Loch-Schale) wurden mit insgesamt 2,8 μg DNA, die aus unterschiedlichen Verhältnissen von gfp-haltigem Plasmid und ultraschallbehandelter Lachssperma-Träger-DNA bestand, transfiziert, wobei die herkömmliche Calciumphosphat-Transfektionsvorschrift verwendet wurde. Die Zellen wurden 36 Std. nach der Transfektion geerntet und im Durchflußzytometer analysiert. Als positive gewertete Zellen wurden gegen die Menge an transfiziertem gfp-tragendem Plasmid graphisch aufgetragen. Dabei entsprechen die weißen Balken pTR_BS-UF, die schattierten Balken pTR_BS-UF1 sowie die schwarzen Balken pTR_BS-UF2.
4A und 4B. Expression von rAAV-GFP_H2 in 293-Zellen. 293-Zellen wurden mit CsCl-gereinigtem rAAV-GFP_H2 bei einer M. O. I. von 10 infiziert. 36 Std. nach der Infektion wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem CHROMA Filter Cube #41014 GFP-HQ (Exzitation bei 450 +/– 25 nm) photographiert. 4A: Zellen unter Phasenkontrast im Hellfeld; 4B: gleiches Feld, Epifluoreszenz.
5A, 5B, 5C und 5D. Fluoreszenz G418-resistenter Klone mit rAAV-GFP_H2-Provirus. 293-Zellen wurden mit CsCl-gereinigtem rAAV-GFP_H2 bei einer M. O. I. von 1 infiziert. 48 Std. nach der Infektion wurden die Zellen geteilt und bei niedriger Konfluenz (weniger als 10%) ausplattiert. 18 Std. später wurde G418 mit einer Endkonzentration von 200 mg/ml zugegeben. Das Medium wurde alle 4 Tage gewechselt, und G418 Kolonien wurden nach 14 Tagen Selektion photographiert. 5A und 5C: G418-resistente Kolonien unter Phasenkontrast, Hellfeld; 5B und 5D: gleiche Felder wie in 5A und 5C, Epifluoreszenz.
6A, 6B, 6C und 6D. FACS-Analyse von 293-Zellen, mit rAAV-GFP_J, rAAV-GFP_H1, oder rAAV-GFP_H2 stabil transduziert und 2 Wochen mit G418 selektioniert. 6A: FACS-Histogramm der 293-Ausgangszellinie; 6B: mit rAAV-GFP_J transduzierte 293-Zellen; 6C: mit rAAV-GFP_H1 transduzierte 293-Zellen; 6D: mit rAAV-GFP_H2 transduzierte 293-Zellen. Es wurden jeweils 20000 Zellen sortiert. Die für jede Zellpopulation nicht korrigierte Häufigkeit von Zellen mit positivem Ergebnis betrug für nicht infizierte 293-Zellen: 0,05%; für GFP_J: 0,05%; für GFP_H1: 1,67%; für GFP_H2: 9,6%.
7. Fluoreszenz der blauen His66-Mutante des humanisierten gfp. 293-Zellen wurden mit pTR_BS-UF2 und pTR_BS-UFB kotransfiziert und 4 Tage nach der Transfektion unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem Nikon Filter Cube V-2B photographiert.
8. Einzelplaque von rekombinantem AdΔE1GFP, wie unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Der Plaque wurde 40 Std. nach der Infektion photographiert.
9A, 9B, 9C und 9D. GFP-Fluoreszenz in einem Segment von mit rAAV-GFP_H2 infiziertem Meerschweinchen-RPE. 9A: Differentielle Interferenzkontrastaufnahme der Retina aus einem infiziertem Auge in der Nähe des in 9B gezeigten Bereichs. Bei der dunkel pigmentierten Zellschicht nahe dem oberen Ende der gezeigten Retina handelt es sich um die RPE-Schicht in einem leicht geneigten Abschnitt. Die Photorezeptorzellschicht sowie weitere neuroretinale Schichten sind unterhalb des RPE zu sehen. 9B: RPE-Schicht aus einem mit rAAV.GFP_H2 inokulierten Auge nahe der Injektionsstelle, beobachtet mittels konfokaler Mikroskopie unter kurzwelliger Exzitations- und Fluoresceinemissionsoptik. 9C: Fluoreszenz der RPE-Schicht aus dem gleichen Auge wie in 9B an einer zur Injektionsstelle distalen Stelle. 9D: Fluoreszenz der RPE-Schicht aus dem nicht injizierten Auge des gleichen Tiers wie in 9A, 9B und 9C.
10. pGREENLANTERN^TM-Plasmid. GFP repräsentiert das humanisierte GFP der vorliegenden Erfindung. Andere Funktionselemente und Restriktionsstellen sind dargestellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle wurde als vielversprechender Kandidat zur Verwendung als Reportergen vorgeschlagen. Allerdings ist das gfp-Gen in signifikanter Weise dahingehend eingeschränkt, daß es zu keiner hinreichenden Expression in Säugerzellsystemen fährt. Tatsächlich waren erste Versuche der Erfinder, das in eine menschliche Zelle durch ein rekombinantes Adeno-assoziiertes Virus (AAV) eingeführtes Qualle-GFP-Reportergen zu exprimieren, nicht erfolgreich.
Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung wurde die Hypothese aufgestellt, daß ein wichtiger Grund für die geringe Expression von GFP in der schlechten Translationseffizienz der mRNA im Milieu der menschlichen Zelle, das durch einen Satz von Isoakzeptor-tRNAs gekennzeichnet ist, die sich von den in der Qualle verwendeten unterscheiden, besteht. Zur Lösung dieses Expressionsproblems werden somit durch die vorliegende Erfindung synthetische Versionen der cDNA des grün fluoreszierenden Proteins der Qualle (gfp_h) bereitgestellt, die an die Expression auf hohem Niveau in Säugerzellen, vor allem in denen menschlichen Ursprungs, angepaßt sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Basensubstitutionen in gfp-Codons durchgeführt, um die Codonverwendung in der gfp10 codierenden Sequenz zu verändern, so daß sie eher der Expression in Säugerzellen entspricht. Ebenso werden Expressionsplasmide sowie eine Reihe vielseitiger rekombinanter AAV- und Ad-Vektoren zur Zuführung und Expression von Genen in Säuger- und menschlichen Zellen bereitgestellt.
In bestimmten bevorzugten Aspekten betrifft die Erfindung eine besondere synthetische Version der cDNA des grün fluoreszierenden Proteins aus A. victoria, die an die Expression auf hohem Niveau in Säuger- und menschlichen Zellen angepaßt ist. Dabei wurden in diesem beispielhaften Konstrukt insgesamt 92 Basensubstitutionen in 88 Codons durchgeführt, um die Codonverwendung in der gfp10 codierenden Sequenz zu verändern und die Expression in Säugerzellen dramatisch zu verbessern.
Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde von den Erfindern die Empfindlichkeit des GFP-Reportergensystems für ein humanisiertes Konstrukt um ungefähr das 22fache und für ein zweites humanisiertes Konstrukt um wenigstens das 45fache erhöht. In FACS-Analyse mit humanisierten Genkonstrukten war ein Konstrukt mindestens 32mal nachweisbarer als das ursprüngliche Qualle-Gen, wobei das andere Konstrukt 190mal nachweisbarer war als das ursprüngliche Qualle-Gen. Wird humanisiertes GFP als Teil der gfp-neo-Kassette des rAAV-Provirus in G418-resistenten Zellinien stabil integriert, so exprimiert ein beträchtlicher Anteil der Zellen ein optisch nachweisbares GFP.
Gemäß bereits veröffentlichter Daten integriert rAAV in Form einer Tandem-Wiederholungssequenz mit einer Anzahl an Genomkopien pro Zelle im Bereich von 1 bis 10 (Cheung et al., 1980; Laughlin et al., 1986; McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989). Daher läßt sich der Bereich von 1 bis 10 Kopien an humanisiertem GFP pro Zelle unter der Kontrolle eines starken Promotors, wie hier beschrieben, nachweisen. Für gewisse GFP-Mutanten könnte diese Anzahl nicht mehr als eins betragen.
Als ein Beispiel für vielseitige Vektoren zur Verwendung mit dem humanisierten GFP werden rAAV-Vektoren bereitgestellt. Die Konstruktion der Vektorserie pTR_BS-UF (User-Friendly) (2A) sorgt für Zweckmäßigkeit und Flexibilität bei der Konstruktion von rAAV-Vektoren. Um die maximale Klonierungskapazität von 5 kBp zu nutzen, läßt sich die gesamte Reportergenkassette durch Verdauung mit BglII deletieren, womit die beiden terminalen AAV-Wiederholungssequenzen zurückbleiben, die als einzige Sequenzen für die Replikation und Verpackung der AAV-DNA benötigt werden.
Die pTR_BS-UF-Serie enthält zwei Reportergenkassetten, GFP und neo, die jeweils ihren eigenen Promotor und ihr eigenes Polyadenylierungssignal besitzen. Diese beiden Transkriptionseinheiten lassen sich unabhängig voneinander deletieren (KnpI-NotI-Verdau für GFP und SalI-Verdau für neo), wodurch der Klonierungsplatz für das interessierende Gen vergrößert wird. Selbst wenn der Vektor so verwendet wird, wie er vorliegt, läßt sich in ihm eine weitere Transkriptionseinheit von bis zu 1,6 kBp unterbringen.
Weiterhin könnte die Wirksamkeit eines bestimmten Promotors in einer gegebenen Zellart oder einem gegebenen Zellgewebe auch dadurch getestet werden, daß man ihn stromaufwärts des gfp-Gens gegen den CMV-Promotor nach Verdauen der Vektor-DNA mit KpnI und XbaI austauscht. Die Konstruktion des pTR_BS-UF3-Vektors berücksichtigt ebenso die koordinierte Expression des Reporter-gfp-Gens und des interessierenden Gens vom gleichen Promotor durch Verwendung eines IRES-Elements.
Darüber hinaus wird von den Erfindern die Konstruktion eines Ad-Shuttle-Vektors, der das humanisierte GFP-Reportergen unter der Kontrolle des IRES-Elements trägt, beschrieben. Mit rekombinantem Ad infizierte 293-Zellen zeigten einen typischen CPE sowie eine leuchtend grüne Fluoreszenz. Durch die Expression des GFP wurde eine schnelle und einfache Selektion echter rekombinanter Ad-Klone, wobei diese von falschen Plaques unterschieden wurden, ermöglicht.
Das humanisierte GFP läßt sich ebenso in andere Virus- und Nichtvirusvektor- und -Expressionssysteme einbauen. Die humanisierten Gene und Vektoren der vorliegenden Erfindung ermöglichen die effiziente Transduktion und Expression von gfp-Gensequenzen in Säuger- und menschlichen Zellinien. Dies ist beispielhaft durch die hier gezeigte in-vivo-Genexpression in neurosensorischen. Zellen des Meerschweinchenauges dargestellt. Die humanisierten gfp-Gene finden vielerlei Verwendungen, wie z.B. bei der Zellsortierung mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) sowie bei der Gentherapie beim Menschen.
Tatsächlich läßt sich zeigen, daß hier beschriebene System die effiziente Transduktion und Expression von Genen in aus Säugern stammenden Zellen auf einem hinreichend empfindlichen Niveau vermittelt, das den Nachweis durch einfache FACS-Sortierung gestattet. Die Selektion transduzierter Zellen mit Arzneistoffen, wie z.B. G418, oder die Manipulierung von Zellen zur Sichtbarmachung enzymatischer Aktivitäten, wie z.B. β-Galactosidase, wird somit umgangen. Da AAV und Ad beispielsweise einen sehr breiten Wirtsbereich aufweisen, eignen sich die beschriebenen Vektoren für viele Genzuführungstechnologien, einschließlich der Gentherapie beim Menschen.
1. Gene für grün fluoreszierendes Protein (GFP)
Man nimmt an, daß Gene für grün fluoreszierendes Protein sowie funktionsfähige Proteine in einer Vielfalt von Organismen vorhanden sind, wie in Tabelle 1 gezeigt. Dabei läßt sich ein gfp-Gen aus einem der biolumineszenten Cnidaria- und Ctenophora-Organismen, die solche Gene exprimieren, als Startpunkt zur Herstellung eines humanisierten gfp-Gens im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
TABELLE 1 Grün fluoreszierendes Protein (GFP) präsentierende biolumineszente Cnidaria und Ctenophora
Gegenwärtig ist die Verwendung der gfp-Gensequenz aus A. victoria als Matrize zur Erzeugung eines menschlichen gfp-Gens bevorzugt, da diese leicht erhältlich ist.
Zwar sind biologisch funktionsfähige Äquivalente der gfp-Gensequenzen selbstverständlich durch die vorliegende Erfindung umfaßt, doch sollte hier festgehalten werden, daß Versuche, das Gen zu verkürzen, gezeigt haben, daß nur ein Rest vom Aminoterminus und weniger als 10 oder 15 vom Carboxyterminus fehlen dürfen, ohne daß die Fluoreszenz verschwindet (Dopf und Horiagon, 1995). Daher werden wesentlich verkürzte gfp-Gene als nicht besonders sinnvoll betrachtet. Eine Verwendung solcher Proteine könnte jedoch in dem hohen Niveau der GFP-Produktion in Säugerzellen für die anschließende Verwendung bei der Erzeugung von Antikörpern bestehen.
2. Grün fluoreszierende Proteine
Bei Aequorea-GFP handelt es sich um ein Protein mit 238 Aminosäureresten. Sein größtes Absorptionsmaximum liegt bei 395 nm, wobei ein kleineres Maximum bei 475 nm auftritt. Die Amplituden dieser Maxima (d. h. Extinktionskoeffizienten) wurden auf 21–30 bzw. 7–15 mM^–1cm^–1 geschätzt (Morise et al., 1974). Die Exzitation bei 395 nm ergibt ein Emissionsmaximum bei 508 nm. Die Quantenausbeute bzw. Wahrscheinlichkeit der Reemission eines Photons, nachdem das Molekül angeregt wurde, beträgt 0,72–0,85 (Morise et al., 1974), und die Lebensdauer des angeregten Zustands beträgt 3,25 ns (Perozzo et al., 1988).
Bei den GFPs handelt es sich um ungewöhnlich stabile Proteine, so daß ihre Spektraleigenschaften in denaturierenden Lösungen relativ unbeeinflußt sind. Das gereinigte Protein widersteht auch den meisten Proteasen mehrere Stunden lang (Ward, 1981, 1982; Ward und Bokman, 1982; Cutler und Ward, 1993). Jedoch verliert GFP bei Denaturierung seine Fluoreszenz (Ward et al., 1980). In neutralen wäßrigen Pufferlösungen wurde für Aequorea-GFP (Ward, 1981) eine Temperatur von 78°C bestimmt, bei der die Hälfte der Fluoreszenz verloren ist. Während das Aequorea-GFP unter vollständigem Verlust der Fluoreszenz durch Behandlung mit 6 M Guanidin-HCl (2 min bei 92°C), Ansäuerung auf pH 2 oder Alkalisierung auf pH 13 denaturiert werden kann, ist es möglich, GFP unter Rückgewinnung der Fluoreszenz zu renaturieren (Ward und Bokman, 1982). Für diese Renaturierung scheint Thiol erforderlich zu sein (Surphin und Ward, 1989).
Zur Bildung des GFP-Chromophors, p-Hydroxy-Zylideninudazolinon, der durch Zyklisierung von Ser65, Tyr66 und Gly67 sowie 1,2-Dehydrierung des Tyrosins gebildet wird, ist ein weiterer Aequorea-Faktor nicht unbedingt erforderlich. Der Mechanismus dieser einzigartigen posttranslationalen Modifikation stellt eine Beschränkung der Geschwindigkeit dar, mit der Änderungen in der Genexpression durch GFP angezeigt werden können.
Zwar Absorbieren den Chromophor enthaltendes denaturiertes Protein bzw. enthaltende isolierte Peptide Licht, doch sind sie praktisch nicht fluoreszierend (Ward et al., 1980), vermutlich weil der nackte Chromophor weder starr ist noch vor dem Aneinanderstoßen an Lösungsmittelmoleküle geschützt ist. Die Chromophorstruktur muß natürlich in jeder geeigneten GFP-Mutante oder -Fusion funktionsfähig bleiben.
In Hefe- und HeLa-Zellen fluoresziert bei 37°C exprimiertes GFP um ein Vielfaches weniger als das bei 15°C exprimierte. Die Wärmewirkung besteht hauptsächlich darin, daß sie eine inkorrekte Reifung verursacht, und nicht darin, daß sie die Expressionsniveaus oder die Helligkeit des korrekt gereiften GFP reduziert (Lim et al., 1995).
Mit Fluoresceinfiltern angeregtes Wildtyp Aequorea-GFP ist um ungefähr eine Größenordnung weniger hell als die gleiche Anzahl an freien Fluoresceinmolekülen. Ein Wechsel der Exzitation auf 395 nm hilft dabei nicht, da solche Wellenlängen eine schnelle Photoisomerisierung verursachen und auch zu stärkerer Hintergrundautofluoreszenz anregen.
3. GFP-Mutanten und -Varianten
Das ursprünglich aus A. victoria klonierte GFP weist mehrere nicht optimale Eigenschaften auf, einschließlich geringer Helligkeit, wie oben beschrieben, einer signifikanten Verzögerung zwischen Proteinsynthese und Fluoreszenzentwicklung sowie komplexer Photoisomerisierung. Man könnte jedoch GFP neu konstruieren mit dem Ziel, Verbindungen der zweiten Generation bereitzustellen, in denen diese Mängel abgeschwächt oder überwunden sind und bei denen Exzitations- und Emissionswellenlängen verschoben sind, so daß andere Farben und neue Anwendungen erzeugt werden.
Die meisten Mutationen in GFP führen zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Fluoreszenz, ohne daß dabei eine signifikante Änderung der relativen Absorptions- oder Emissionsmaxima auftreten. Durch diese Mutationen wird vermutlich eine Fehlfaltung des Proteins, ein Nichtausbilden der Chromophorstruktur oder ein Quentschen der Fluoreszenz durch unzureichende Abschirmung verursacht. Versuche, das Gen zu verkürzen zeigten, daß nur ein Rest vom Aminoterminus und weniger als 10 oder 15 vom Carboxyterminus fehlen dürfen, ohne daß die Fluoreszenz verschwindet (Dopf und Horiagon, 1995). Die Intoleranz des GFP gegenüber einer stärkeren Verkürzung ist eigentlich nicht allzu überraschend, da das Proteingrundgerüst sowohl den Chromophor synthetisieren als ihn auch stark gegen das Umgebungswasser abschirmen muß.
Es ist bereits bekannt, daß Aminosäureaustausche im GFP-Polypeptid zu Proteinen mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften führen. Eine Teilmenge der Mutationen beeinflußt das relative Verhältnis der Absorptionsmaxima bei 395 und 475 nm, indem vermutlich die Deprotonierung des Chromophors gefördert oder behindert wird. Beispiele dafür sind T2031 (Thr203→Ile) und E222G (Glu222→Gly), durch die die Spektren zu solchen mit einfachen Absorptionsmaxima bei entweder 395 bzw. 475 nm vereinfacht werden (Ehrig et al., 1995). Durch die Mutation I167T (Ile167→Thr) wird das Wildtyp-Verhältnis der beiden Maxima umgekehrt, ohne daß dabei eines der Maxima vollständig verschwindet (Heim et al., 1994).
Durch eine zweite Teilmenge an Mutationen werden im wesentlichen neue Exzitations- und Emissionsspektren mit in signifikanterweise veränderten Charakteristika produziert. Diese Art von Mutation findet sich beispielsweise im Chromophorbereich selbst.
(a) Tyr66-Varianten
Das GFP aus Aequorea und das der Seefeder Renilla reniformis teilen den gleichen Chromophor, doch weist Aequorea-GFP zwei Absorptionsmaxima bei 395 und 475 nm auf, wohingegen Renilla-GFP nur ein einziges Absorptionsmaximum bei 498 nm aufweist, wobei der Monomerextinktionskoeffizient ≈ 5,5mal größer ist als das Hauptmaximum des Aequorea-Proteins bei 395 nm (Ward, 1981). Für viele praktische Anwendungen wäre das Spektrum von Renilla-GFP gegenüber dem von Aequorea bevorzugt, da die Wellenlängendiskriminierung zwischen unterschiedlichen Fluorophoren sowie der Nachweis eines Resonanz-Energietransfers leichter sind, wenn die Komponentenspektren statt niedrig und breit hoch und schmal sind.
Weiterhin ist zwar das Exzitationsmaximum von Aequorea-GFP bei der längeren Wellenlänge (475 nm) fast ideal für die Fluoresceinfiltersätze und resistent gegenüber Photobleichung (Photobleaching) doch weist es eine niedrigere Amplitude als das Maximum bei der kürzeren Wellenlänge von 395 nm, das empfindlicher gegenüber Photobleichung ist, auf (Chalfie et al., 1994). Aus den obigen Gründen ist die Umwandlung des Aequorea-GFP-Exzitationsspektrums in ein einziges Maximum, vorzugsweise bei längeren Wellenlängen, wünschenswert.
Eine solche Umwandlung wurde von Heim, et al. (1994) erzielt, worin die GFP-Mutagenese sowie ein Screening, bei dem GFP-Varianten mit veränderten Spektren isoliert wurden, beschrieben sind. Durch Ersetzen des zentralen Tyrosins (Y66) durch andere aromatische Aminosäuren (Trp, His oder Phe) werden die Exzitations- und Emissionsspektren zu fortschreitend kürzeren Wellenlängen verschoben.
Von Heim et al. (1994) wurde eine Zufallsmutagenese der gfp-cDNA mit Hydroxylamin (Sikorski und Boeke, 1991) sowie durch Erhöhung der Fehlerrate der PCR^TM mit 0,1 mM MnCl₂, 50 μM dATP, und 200 μM dGTP, dCTP, und dTTp (Muhlrad et al., 1992) durchgeführt. Kolonien auf dem Agar wurden einem optischen Screening auf unterschiedliche Emissionsfarben und Helligkeitsverhältnisse bei einer Exzitation von 475 gegen 395 nm, geliefert von einer Xenonlampe und einem Gittermonochromator, für den der ausgesandte Strahl zur Belichtung einer ganzen Kulturschale erweitert wurde, unterzogen.
Von Heim et al. (1994) wurde eine Mutante isoliert, die im Gegensatz zum grün des Wildtyp-Proteins durch UV-Licht anregbar war, und eine leuchtend blaue Fluoreszenz zeigte. Die Exzitations- und Emissionsmaxima waren um 14 bzw. 60 nm gegenüber denen des Wildtyp-GFP hypsochromatisch verschoben. Die mutierte DNA des kritischen Proteins enthielt im Zentrum des Chromophors eine Änderung Tyr66→His. Die Fluoreszenzspektren von Tyr65His sind gegenüber pH-Änderungen unempfindlich, bis sich das Protein an der Grenze zur Denaturierung befindet, was ein weiterer Beleg dafür ist, daß der Chromophor für das Lösungsmittel unzugänglich ist.
Es wurde eine weitere stellengerichtete Mutagenese von Tyrosin nach Tryptophan und Phenylalanin durchgeführt (Heim et al., 1994). Dabei ergab Tryptophan Exzitations- und Emissionswellenlängen, die zwischen denen für Tyrosin und Histidin lagen, zeigte jedoch nur eine schwache Fluoreszenz, was vermutlich an einer Ineffizienz bei der Faltung oder der Chromophorbildung lag, wohingegen Phenylalanin keine nachweisbare Fluoreszenz ergab.
Obwohl die Tyr66→His-Mutante weniger fluoresziert als Wildtyp-GFP, vermutlich weil die alternativen Aminosäuren weniger gut in die zentrale Tasche passen, handelt es sich hierbei dennoch selbstverständlich um eine wichtige Variante. Durch die Verfügbarkeit mehrerer Formen von GFP mit unterschiedlichen Exzitations- und Emissionsmaxima wird die Zwei-Farben-Beurteilung von differentieller Genexpression, entwicklungsmäßiger Bestimmung und Proteintransport („protein trafficking"), wie unten erörtert, erleichtert.
(b) Ser65-Varianten
Die Arbeiten von Heim et al. (1995) wurden auch durch den Wunsch motiviert, GFP-Varianten mit Spektren, die wesentlich näher an dem von Renilla liegen, zu erzeugen. Serin 65 der Aminosäuresequenz von Aequorea-GFP wird Teil des ºp-Hydroxybenzylindenimidazolinon-Chromophors. Um die Hypothese zu testen, daß Ser 65 eine zusätzliche Dehydrierung unter Bildung einer Vinyl-Seitenkette durchläuft, wurde dieser Rest von Heim et al. (1995) zu Ala, Leu, Cys oder Thr mutiert. Würde durch Eliminierung von H₂O oder H₂S eine Vinylgruppe gebildet, so sollten Ser und Cys identische Spektren ergeben, die sich von denen für Ala und Leu, bei denen eine Eliminierung unmöglich ist, stark unterscheiden.
Von Heim et al. (1995) wurden vier Mutanten produziert, die jeweils ein zwischen 470–490 nm liegendes einziges Exzitationsmaximum zeigten, wobei dessen Amplitude bei einer gleichen Anzahl von Molekülen jeweils vier- bis sechsmal größer war als das des Wildtyp-GFP. Diese Ergebnisse schließen eine Vinylbildung aus. Für die weitere Charakterisierung wurde die Ser65→Thr-Mutante ausgewählt, da sie die längste Exzitations- und Emissionswellenlänge (490 bzw. 510 nm) aufwies, wobei diese den für Renilla-GFP bekannten Werten (498 bzw. 508 nm) sehr ähnelten.
Die kritische posttranslationale Oxidation zur Herstellung des Fluorophors aus der entstehenden Polypeptidkette lief in S65T etwa viermal so schnell ab wie im Wildtyp-Protein (Heim et al., 1995). Durch diese Beschleunigung wird eine potentiell signifikante Beschränkung bei der Verwendung von GFP als Reporterprotein für schnelle Geninduktionen verbessert.
Mutationen von Ser 65 zu Arg, Asn, Asp, Phe und Trp ergaben Fluoreszenzintensitäten, die deutlich unterhalb der des Wildtyps lagen.
Zusammenfassend gehören zu den vorteilhaften Eigenschaften der Ser65Thr-GFP-Variante (Heim et al., 1995): eine etwa sechsmal größere Helligkeit als der Wildtyp, jeweils bei einer Anregung bei dem Maximum mit der jeweils längsten Wellenlänge; eine viermal schnellere Oxidation zur endgültigen fluoreszierenden Spezies als der Wildtyp; sowie keine Photoisomerisierung und nur eine sehr langsame Photobleichung. Vorläufige Ergebnisse deuten daraufhin, daß bei einer Bestrahlung bei 488 nm in luftgesättigtem Puffer bei pH 7,1 die Photobleichung von Ser65Thr mit etwa 1/7 der Geschwindigkeit für Fluorescein stattfindet. Da unter diesen Bedingungen der Extinktionskoeffizient von Ser65Thr etwa 4/7 desjenigen für Fluorescein beträgt, kann die Quanteneffizienz der Photobleichung von Ser65Thr als etwa 1/4 derjenigen für Fluorescein berechnet werden.
Diese Vorteile machen Ser65Thr für die meisten Anwendungen, außer denjenigen, bei denen eine Exzitation mit langwelligem UV oder Photoisomerisierung wesentlich ist, attraktiver als Wildtyp-GFP. Unter Verwendung allgemein erhältlicher Filtersätze für Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Exzitation: 450–490 nm) wird dadurch insbesondere eine größere Empfindlichkeit bereitgestellt.
(c) Weitere Mutanten mit Rotverschiebung
Von Delagrave et al. (1995) wurde ebenso eine ausgedehnte Zufallsmutagenese der GFP-Reste 64–69 durchgeführt, wobei sechs Mutanten isoliert wurden, deren Spektren qualitativ ähnlich zu den oben beschriebenen Ser65-Mutanten sind. Davon weisen vier die gleichen Substitutionen (Leu, Cys oder Ala) in Position 65, wie oben aufgeführt, auf.
Die von Delagrave et al. (1995) verwendeten Verfahren zur Konstruktion von GFP-Mutanten mit Spektralverschiebung wurden in der Vergangenheit bereits zur Herstellung einer Vielfalt von spektral unterschiedlichen Bakteriochlorophyll bindenden Proteinen unter Verwendung einer optimierten kombinatorischen Mutagenese sowie des DIS-Verfahrens (Digital Imaging Spectroscopy) eingesetzt (Goldman und Youvan, 1992; Delagrave und Youvan, 1993).
DIS ermöglicht das gleichzeitige Screening Tausender Kolonien direkt auf Petrischalen durch Aufnahme ortsaufgelöster Spektralinformationen (Youvan et al., 1995; Youvan, 1994). Die Aufnahmen von bei unterschiedlichen Wellenlängen belichteten Petrischalen werden von einer CCD (Charge-Coupled Device)-Kamera aufgezeichnet und weiter mit einer eine radiometrische Kalibrierung durchführenden Software prozessiert. Weitere GFP-Mutanten können unter Verwendung von optimierter kombinatorischer Mutagenese und DIS isoliert werden.
Bei dem kombinatorischen Bibliothek-Screening nach Delagrave et al. (1995) handelte es sich bei dem als Ziel für die Mutagenese gewählten GFP-Bereich um die aus 6 Aminosäuren bestehende Sequenz zwischen Ple64 und Glu69 (Phe Ser Tyr Gly Val Gln; SEQ ID NO: 4), die den Chromophor selbst umfaßt. Um den Einbau einer aromatischen Aminosäure in Position 66 zu begünstigen und um die anderen fünf Codons einer vollständigen Randomisierung zu unterziehen, wurde ein mutagenes Oligonukleotid konstruiert. Die Sequenz des für die Mutagenese eingesetzten Oligonukleotids wurde mit dem Computerprogramm CyberDope erhalten.
Die erhaltene Bibliothek aus ungefähr 3 × 10⁵ mutanten GFP-Genen wurde in B121 (DE3) exprimiert. Tausende von Kolonien auf Petrischalen wurden einem Fluoreszenzscreening mittels DIS unterzogen (Delagrave et al., 1995). Die Mutanten mit Spektralverschiebung wurden zunächst durch die bei einer Anregung mit Licht von 490 nm beobachtete grüne Fluoreszenz, die bei einer Anregung bei 410 nm verschwindet, identifiziert. Demgegenüber ist die Wildtyp-GFP-Fluoreszenz bei einer Belichtung von 410 nm wesentlich heller. DIS zeigte, daß ungefähr eine in 10⁴ Kolonien ein funktionsfähiges Fluoreszenzprotein exprimierte.
Von Delagrave et al. (1995) wurden mehrere GFP-Klone mit Rotverschiebung (RSGFP-Klone) gepickt und sequenziert. Tyr66 und gly67 schienen dabei konserviert zu sein, während die anderen vier Positionen weniger stringent waren; ser⁶⁵ war für den beobachteten Phänotyp nicht notwendig. RSGFPs lassen sich leicht von Wildtyp-GFP unterscheiden, da ihre Exzitationsmaxima um etwa 100 nm, und zwar von 390 nm in Wildtyp Aequorea-GFP nach 490 nm in RSGFP, nach rot verschoben sind. Bei RSGFP4 handelt es sich um einen besonderen Klon, der die Chromophorsequenz Met Gly Tyr Gly Val Leu (SEQ ID NO: 5) aufweist. Die Emission von RSGFP4 ist mit der des Wildtyp-GFP nahezu identisch, doch sind die Exzitationsspektren sehr unterschiedlich.
Von Delagrave et al. (1995) wurde berichtet, daß diese Sequenzinformationen einer weiteren Manipulation durch EEM (Exponential Ensemble Mutagenesis) und REM (Recursive Ensemble Mutagenesis)-Strategien zugänglich sind (Delagrave und Youvan, 1993; Delagrave et al., 1993), wobei ein „Regenbogen" multispektraler Fluoreszenzproteine produziert werden kann. Dabei wird erwartet, daß durch die Konstruktion neuer, durch REM oder EEM optimierter kombinatorischer Bibliotheken die Häufigkeit funktionsfähiger Mutanten hoch genug ist, um die Isolierung seltener Klone mit signifikanten Emissionsverschiebungen zu gestatten.
4. Humanisierte gfp-Gene
Obwohl die Eigenschaften von Wildtyp-GFP in Mutanten, wie z.B. den oben beschriebenen, verbessert sind, fehlt Wildtyp-GFP eine in ein echtes enzymatisches Reportersystem eingebaute Amplifikationsstufe, wobei jedes Proteinmolekül jeweils tausende Chromophor- oder Fluorophormoleküle erzeugen kann. Da jedes GFP jeweils ein Fluorophor repräsentiert können relativ hohe GFP- Expressionsniveaus, z.B. bis zu 10⁶ Moleküle pro Zelle (Rizzuto et al., 1995), notwendig sein, um helle Signale zu erhalten.
Durch das oben gesagte wird die Bedeutung der vorliegenden Erfindung betont, deren Schwerpunkt darin liegt, für eine erhöhte GFP-Expression in Säuger- und menschlichen Zellen zu sorgen. Alle oben beschriebenen Mutanten oder in der Tat alle gewünschten Mutanten oder Mutantengruppen lassen sich auch in einem humanisiertem Hintergrund, wie er von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, herstellen. Der Grund dafür liegt darin, daß durch die erfindungsgemäßen humanisierenden Aspekte die DNA-Sequenz unabhängig von der Proteinsequenz verändert wird.
In früheren Versuchen zur Expression von GFP in Säugerzellen wurde die Kozak-Konsensussequenz verwendet (Adams et al., 1995). Ein auf diese Weise modifiziertes GFP-Gen wurde in einen Säuger-Expressionsvektor inseriert und in CHO-K1-Zellen verwendet (Adams et al., 1995). Von Pines (1995) wurde ebenso über eine transiente GFP-Expression in COS-7-, HeLa- und NIH-3T3-Zellen berichtet; und bei Rizzuto et al. (1995) wurde über die Expression von GFP in den Mitochondrien intakter Zellen berichtet. Es wird jedoch angenommen, daß diese Arbeiten eine Expression auf relativ niedrigem Niveau widerspiegeln und weiterhin im Gegensatz zu den von vielen auf diesem Gebiet Arbeitenden erhaltenen negativen Ergebnissen stehen. Es wird vermutet, daß diese wenigen positiven Ergebnisse auf die hohe Kopienzahl der in die Zelle eingeführten GFP-Gene zurückzuführen ist.
Der von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung unternommene Ansatz steht im Gegensatz zu dem Verfahren von Adams et al. (1995) und widmet sich der schlechten Translationseffizienz von GFP-mRNA im Milieu der menschlichen Zelle, indem Basensubstitutionen enthaltende cDNAs verwendet werden, um die Codonverwendung zu ändern, so daß sie eher der Expression in Säugerzellen entspricht. Die Verwendung solcher humanisierten Konstrukte führt zu einer grünen Fluoreszenz in Zellen, die eine niedrige Kopienzahl humanisierter gfp-Gene, beispielsweise im Bereich von weniger als 10 und sogar bei Verwendung gewisser humanisierter mutanter gfp-Gene von etwa 1 oder 2, aufweisen.
Die Korrelation zwischen der Häufigkeit von tRNAs und dem Auftreten der jeweiligen Codons in proteinexprimierenden Genen wurde für E. coli, Hefe und weitere Organismen beschrieben (Bennetzen und Hall (1982); Grantham et al. (1980); Grantham et al. (1981); Ikemura (1981a; 1981b; 1982); Wada et al. (1990)). Die Effekte der Codonänderungen auf die Translationseffizienz sowie die Gesamtexpressionsniveaus lassen sich jedoch nicht eher etablieren, bis diese Änderungen tatsächlich in einem gegebenen Gen vorgenommen wurden. Experimente zeigen, daß durch selten translatierte Codons codierte Proteine nicht notwendigerweise auf niedrigem Niveau exprimiert werden (Lammertyn et al., Mol Gen Genet, 1996, 250, S. 223–229; Kierland, FEBS Letters, 1991, Bd. 285 (2), S. 165–169). Dies ist ähnlich wie bei der Situation mit der Kozak-Sequenz, von der angenommen wird, daß sie trotz der Erwartungen nicht besonders hilfreich bei der Erhöhung der Expression von gfp in Säugerzellen war. Dadurch, daß von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung gezeigt werden konnte, daß die Humanisierung bei der gfp-Genexpression wirksam ist, konnte die Eignung der GFP-Technologie in signifikanter Weise verbessert werden.
Aus Sharp et al. sind Codonverwendungsmuster in unterschiedlichen Organismen, einschließlich dem Menschen, offenbart (Nucleic Acid Research, 1988, Bd. 16 (7), S. 8207–8211).
Um das Qualle-gfp im Sinne der vorliegenden Erfindung zu humanisieren, wurde von den Erfindern zunächst eine ausführliche Analyse der Codons im gfp-Gen unternommen. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse eines Vergleichs zwischen Qualle-gfp-Codons und in menschlichen Genen allgemein verwendeten Codons gezeigt (Wada et al., 1990). Dies ermöglichte den Erfindern, wichtige Unterschiede zwischen gfp und allgemeinen menschlichen Gensequenzen sowie wesentliche Änderungen, die durchgeführt werden sollten, zu identifizieren.
Eine humanisierte Sequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung ist beispielhaft durch die SEQ ID NO: 3 repräsentiert. Dabei versteht sich jedoch, daß die humanisierten Sequenzen der vorliegenden Erfindung in keiner Weise auf die repräsentative Sequenz der SEQ ID NO: 3 beschränkt sind. Vielmehr ist es im Licht der folgenden Anweisungen dem Fachmann leicht möglich, eine Reihe unterschiedlicher humanisierter gfp-Sequenzen herzustellen.
Zwar werden alle Änderungen, durch die ein selten verwendetes Qualle-Codon durch ein Codon, das in menschlichen Genen häufiger verwendet wird, ersetzt wird als sinnvolle Änderungen angesehen, doch sind natürlicherweise gewisse Codonänderungen gegenüber anderen bevorzugt. In dieser Hinsicht wurde von den Erfindern eine Reihe von gfp-Codons identifiziert, die selten oder fast nie in menschlichen Genen verwendet werden. Wie unten erörtert, handelt es sich bei solchen Codons um die ersten Kandidaten, die zur Herstellung eines menschlichen Gens im Sinne der vorliegenden Erfindung geändert werden sollten.
Bei der Durchführung allgemeiner humanisierender Änderungen lassen sich zu humanisierende Codons vom Fachmann durch Studieren der hier in den Tabellen 2 sowie in Tabelle 3 und 4 dargestellten Angaben identifizieren. Beispielsweise würde man unter Nutzung der in Tabelle 2 angegebenen Angaben die Häufigkeit des Qualle-Codons gegen die Häufigkeit derjenigen Codons, die in menschlichen Genen allgemein verwendet werden, vergleichen und alle entsprechenden Änderungen durchführen. Betrachtet man lediglich als Beispiel die Aminosäure Leucin, so wird das Codon CUU im gfp-Gen elfmal verwendet, doch entspricht dieses Codon lediglich dem am viertmeisten bevorzugten Codon in menschlichen Genen. Das Leucin-Codon UUA kommt ebenfalls häufig im Qualle-Gen vor, wobei dieses Codon für die Verwendung im menschlichen Genom die letzte Wahl darstellt. Eine Änderung der Leucin-Codons würde somit einen geeigneten Startpunkt zur Herstellung eines humanisierten Gens darstellen.
Weitere Änderungen, die nach einer Analyse der Tabelle 2 durchgeführt werden können, bestehen in der Änderung der Arginin-Codons von AGA, das nur eine vierte Wahl im menschlichen Genom darstellt, zu einem bevorzugteren Codon, wie z.B. CGC oder AGG; die Änderung von Serin-Codons, wie z.B. UCG oder UCA, zu bevorzugteren Codons, wie z.B. UCC und AGC; die Optimierung von Threonin-Codons zu ACC; das Vermeiden der Verwendung des Prolin-Codons GCC; die Änderung des Alanin-Codons GCA zum am meisten bevorzugten menschlichen Codon CGG; das Vermeiden der Verwendung der vorherrschenden Glycin-Codons GGA und GGU und Ersetzen dieser durch die in menschlichen Genen bevorzugten Codons, GGC und GGG; Änderung der häufig vorkommenden Valin-Codons GUU und GUA, statt derer das Codon GUG, das im menschlichen Genom deutlich bevorzugt ist, verwendet wird; und Vermeiden des Isoleucin-Codons AUA, wobei dieses in das bevorzugte Codon AUC geändert wird.
Bei denjenigen Aminosäuren, bei denen nur eine Wahl zwischen zwei Codons besteht, wurde von den Erfindern festgestellt, daß das Wildtyp-gfp-Gen normalerweise das am wenigsten bevorzugte Codon im Vergleich mit dem menschlichen Genom verwendet. Daher sollten geeignete Änderungen bei den folgenden Codons vorgenommen werden; AAA für Lysin; CAA für Glutamin; CAU für Histidin; GAA für Glutamin; GAU für Asparagin und UUU für Phenylalanin, wobei diese durch AAG, CAG, CAC, GAG, GAC bzw. UUC ersetzt werden sollten.
Zusätzliche Änderungen lassen sich auch nach Betrachtung der Angaben in Tabelle 3 und Tabelle 4 durchführen. In diesen Tabellen sind wichtige Angaben hinsichtlich der Codonpräferenz in einem einfach verwendeten Format dargestellt. In Tabelle 3 ist eine Liste der Codons aufgeführt, die zur Verwendung in den erfindungsgemäßen humanisierten gfp-Konstrukten bevorzugt sind. Bei der Tabelle 4 handelt es sich einfach um die gleichen Angaben, die U (Uridin) statt T (Thymin) beinhalten, für den leichten Querverweis zu 1.
Tabelle 3: Bevorzugte DNA-Codons zur Verwendung beim Menschen
Die linksstehenden Codons repräsentieren die zur Verwendung in menschlichen Genen am meisten bevorzugten Codons, wobei die Verwendung im Menschen nach rechts hin abnimmt.
Diejenigen Codons, die fast nie in menschlichen Genen verwendet werden, sind doppelt unterstrichen.
Tabelle 4: Bevorzugte RNA-Codons zur Verwendung beim Menschen
Die linksstehenden Codons repräsentieren die zur Verwendung in menschlichen Genen am meisten bevorzugten Codons, wobei die Verwendung im Menschen nach rechts hin abnimmt.
Diejenigen Codons, die fast nie in menschlichen Genen verwendet werden, sind doppelt unterstrichen.
Beim Studieren der Angaben in Tabelle 3 und Tabelle 4 würde ein Fachmann leicht verstehen, daß die Qualle-gfp-Codons CTA, TTA, TCG und TCA (oder CUA, UUA, UCG oder GUA) in ein bevorzugteres Codon geändert werden sollten. Als allgemeine Richtlinie repräsentieren die in Spalten 5 und 6 aufgeführten Codons im allgemeinen Codons, die man bevorzugt ändern würde, um ein humanisiertes Gen zu erzeugen; ebenso sollten oft auch die in der Spalte 4 aufgeführten Codons zur Erzeugung eines humanisierten Gens geändert werden; die in der Spalte 3 aufgeführten Codons können, je nach der Anzahl an Änderungen, die man insgesamt vornehmen möchte, sowie der bestimmten zu codierenden Aminosäure, gegebenenfalls geändert werden. Treten die in den Spalten 1 und 2 aufgeführten Codons in der Wildtyp-gfp-Sequenz auf, so sind sie im allgemeinen geeignet und sollten keiner Änderung bedürfen, außer wenn lediglich zwischen zwei Codons gewählt werden kann. Allerdings kann das Ersetzen eines Codons aus der Spalte 2 durch ein Codon aus der Spalte 1 sicherlich sinnvoll sein, besonders wenn lediglich zwischen zwei Codons gewählt werden kann. Anhand dieser Informationen ist es nun ersichtlich, daß man bei der Einführung von Änderungen in die gfp-Sequenz im allgemeinen nach Möglichkeit ein Codon der Spalte 1 einführen möchte.
Angesichts der vorangegangenen Diskussion wird deutlich, daß es sich bei der beispielhaften Sequenz der SEQ ID NO: 3 nur um eine der vielen praktikablen Spezies, die von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind, handelt. In der SEQ ID NO: 3 enthalten 88 Codons eine oder mehrere Basensubstitutionen. 88 Codons aus einer Sequenz, die für 328 Aminosäuren codiert, entspricht einer Änderung von etwa 37%. Es ist jedoch vorgesehen, daß das Ändern von etwa 10% der Codons zu einem sinnvollen Anstieg der Expressionsniveaus führen würde, womit solche Gensequenzen im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen. Das Ändern von etwa 15%, 20%, 25% oder 30% der Codons innerhalb der Qualle-gfp-Sequenz wird auch als sinnvoll angesehen, wobei die erfindungsgemäßen humanisierten Gene solche Gensequenzen, die in die zuvor erwähnten Bereiche fallen, umfassen.
In gewissen Ausführungsformen kann es, je nach der Beschaffenheit der eingeführten Codonänderungen, nicht einmal notwendig sein, eine 10%ige Änderung der Codonverwendung im gfp-Gen durchzuführen. Sollten beispielsweise die zehn am wenigsten bevorzugten Codons jeweils geändert und durch die zur Verwendung in menschlichen Genen am meisten bevorzugten Codons ersetzt werden, so ist vorgesehen, daß die erhaltene Sequenz eine vernünftige Expression in menschlichen und Säugerzellen erzielen kann. Das Ändern von zehn von 328 Codons entspricht einer prozentualen Änderung von etwa 4%. Daher liegen auch sogenannte „4% humanisierte Gene" im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter der folgenden Voraussetzung – nämlich, daß man beim Ausführen lediglich einer beschränkten Anzahl von Änderungen im allgemeinen die zehn in den Codonpositionen 18, 53, 93, 125, 150, 178, 195, 208, 236 und 224 befindlichen Codons der gfp-Gensequenz ändern möchte. Bei der Durchführung dieser Schlüsseländerungen zusammen mit einer Reihe weiterer Änderungen ist vorgesehen, daß eine Änderung von wenigstens 7, 8 oder 9 dieser Codons ausreicht, um ein humanisiertes Gen mit verbesserter Expression zu erhalten. Wie oben beschrieben, würde Leucin vorzugsweise durch CTG, CTC oder TTG; Valin vorzugsweise durch GTG; und Serin vorzugsweise durch AGC codiert werden.
Zwar sind im allgemeinen gfp-Gensequenzen bevorzugt, bei denen etwa 4–5, etwa 10, etwa 20 oder 30–35% der Codons geändert wurden, doch besteht kein Grund dafür, keine weiteren Änderungen durchzuführen, falls dies gewünscht ist. Bei humanisierten Gensequenzen im Sinne der vorliegenden Erfindung kann es sich daher um Sequenzen handeln, die in etwa 40%, 50%, 60%, 70% oder sogar in etwa 80–90% der Codonpositionen im Vollängen-Codonbereich humanisierte Codons enthalten. Bei Betrachtung der SEQ ID NO: 3 und im Hinblick auf die Einführung noch weiterer humanisierender Änderungen sind eine Anzahl von Positionen identifizierbar, in die weitere optimierende Änderungen eingeführt werden könnten. Dazu gehören beispielsweise diejenigen Codons, die sich in den Codonpositionen 6, 9, 14, 17, 19, 21, 23, 26, 27, 31, 33, 34, 35, 36, 40, 45, 50, 51, 62, 71, 83, 99, 101, 102, 111, 115, 116, 128, 130, 132, 133, 134, 136, 142, 157, 171, 173, 174, 181, 183, 186, 209, 210, 213, 223 und 230 der SEQ ID NO: 3 befinden.
5. Verwendungen von grün fluoreszierenden Proteinen
Das Potential von GFP als Reportermolekül rührt von Eigenschaften, wie z.B. schnellem Nachweis, wobei es nach Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht unter Verwendung von Standard-Lichtquellen nachgewiesen werden kann; der Möglichkeit eines Echtzeit-Nachweises in vivo; der Tatsache, daß die Einführung eines Substrats nicht erforderlich ist; und seiner relativ geringen Größe (26,9 kD) und monomerer Beschaffenheit, womit Proteinfusionen durchführbar sind, her.
Durch das humanisierte GFP der vorliegenden Erfindung werden diese Verfahren in mehreren Fällen zu praktischen und nicht theoretischen Verfahren. Humanisierte gfp-Gene lassen sich daher zur Identifizierung transformierter Zellen, beispielsweise durch Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) oder Fluoreszenzmikroskopie; zur Messung der Genexpression in vitro und in vivo; zur Markierung spezifischer Zellen in mehrzelligen Organismen, beispielsweise zur Untersuchung der Abstammung von Zellen; zur Markierung und Lokalisierung von Fusionsproteinen; und zur Untersuchung von intrazellulärem Transport und dergleichen verwenden.
Biologische Standardanwendungen für GFP sollten dabei nicht übersehen werden, beispielsweise seine Verwendung als Molekulargewichtsmarker auf Proteingelen und Western-Blots, bei Kalibrierung von Fluorometern und FACS-Geräten sowie bei der Mikroinjektion in Zellen und Gewebe.
Bei Verfahren zur Herstellung fluoreszierender Molekulargewichtsmarker wird eine humanisierte gfp-Gensequenz im allgemeinen an eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die für Proteine mit definierten Aminosäuresequenzen codieren, fusioniert, und die Fusionsproteine werden von einem Expressionsvektor exprimiert. Die Expression führt zur Produktion von Fluoreszenzproteinen mit definiertem Molekulargewicht bzw. -gewichten, die als Marker verwendet werden können (nach Berechnung der Größe der vollständigen Aminosäuresequenz).
Vorzugsweise würden gereinigte Fluoreszenzproteine einer Größenfraktionierung, wie z.B. unter Verwendung eines Gels, unterzogen. Danach wird eine Bestimmung des Molekulargewichts eines unbekannten Proteins durchgeführt, indem aus den Fluoreszenzstandards eine Eichkurve erstellt wird und das unbekannte Molekulargewicht aus der Kurve abgelesen wird.
(a) Unterschiedlich gefärbte GFPs
Wie erwähnt, gestatten Aminosäureaustausche in humanisiertem GFP, die zu unterschiedlich gefärbten Formen führen, die gleichzeitige Verwendung mehrerer Reportergene. Unterschiedlich gefärbte humanisierte GFPs lassen sich einfach zur Identifizierung mehrerer Zellpopulationen in einem Zellkulturgemisch oder zur Verfolgung mehrerer Zellarten, wobei Unterschiede in der Zellbewegung oder -wanderung in Echtzeit sichtbar gemacht werden können, ohne daß dabei zusätzliche Agentien zugegeben oder die Zellen fixiert oder abgetötet werden müssen, verwenden.
Zu weiteren Möglichkeiten gehören das Verfolgen und Bestimmen der endgültigen Lokalisierung mehrerer Proteine in einer einzigen Zelle, einem einzigen Gewebe oder Organismus; die differentielle Promotoranalyse, bei der die Genexpression von zwei verschiedenen Promotoren in der gleichen Zelle, dem gleichen Gewebe oder Organismus bestimmt wird; sowie die FACS-Sortierung gemischter Zellpopulationen.
Beim Verfolgen von Proteinen in einer Zelle würden die humanisierten GFP-Varianten ähnlich wie Fluorescein und Rhodamin eingesetzt und wechselwirkende Proteine oder Untereinheiten markieren, deren Assoziation dann in intakten Zellen durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer dynamisch verfolgt werden könnte (Adams et al., 1993).
Zu den Techniken, die mit spektraltrennbaren humanisierten GFP-Derivaten verwendet werden könnten, zählen beispielsweise konfokale Mikroskopie, Durchflußzytometrie und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter Verwendung von modularem Fluß und Doppelexzitationstechniken.
(b) Identifizierung transfizierter Zellen
Die vielen Wege, auf die humanisiertes gfp verwendet werden kann, lassen sich in bestimmte breite Bereiche einteilen. Erstens: zur einfachen Identifizierung von Zellen. Bei diesen Verfahren wird humanisiertes gfp allein zur Expression von GFP in einer Zelle verwendet. Eine Verwendung für dieses Verfahren wäre die Vormarkierung isolierter Zellen oder einer Population ähnlicher Zellen, bevor die Zellen einem Milieu ausgesetzt werden, in dem unterschiedliche Zellarten vorhanden sind. Der Nachweis von GFP in lediglich den ursprünglichen Zellen gestattet die Bestimmung der Lokalisierung solcher Zellen sowie deren Vergleich mit der Gesamtpopulation.
Eine zweite Gruppe von Verfahren betrifft die Identifizierung von Zellen, die mit interessierender exogener DNA transfiziert wurden. Die Identifizierung von mit exogener DNA transfizierten Zellen wird bei vielen in-vitro-Ausführungsformen und auch bei der in-vivo-Gentherapie benötigt.
Ein erstes Beispiel dieser allgemeinen Gruppe besteht darin, daß eine humanisierte gfp-Sequenz an eine für ein ausgewähltes Protein codierende DNA-Sequenz fusioniert wird, um das codierte Protein direkt mit GFP zu markieren. Das Exprimieren eines solchen humanisierten GFP-Fusionsproteins in einer Zelle führt zur Produktion von Proteinen mit Fluoreszenz-Tag, die sich leicht nachweisen lassen. Dies ist sinnvoll für die einfache Bestätigung, daß ein Protein von einer gewählten Wirtszelle produziert wird. Ebenso wird dadurch die Lokalisierung des zu bestimmenden ausgewählten Proteins gestattet, gleichgültig ob es sich dabei um eine natürliche Lokalisierung handelt oder ob das Protein durch menschliche Manipulation auf eine Organelle gerichtet wurde.
Mit exogener DNA transfizierte Zellen lassen sich auch ohne Erzeugung eines Fusionsproteins identifizieren. In diesem Fall beruht das Verfahren auf der Identifizierung von Zellen, die mit einem mindestens zwei Transkriptions- oder Translationseinheiten umfassenden Plasmid oder Vektor versehen wurden. Dabei codiert eine erste Einheit für das gewünschte Protein und steuert dessen Expression, während die zweite Einheit für humanisiertes GFP codiert und dessen Expression steuert. Durch die Koexpression von GFP von der zweiten Transkriptions- oder Translationseinheit wird sichergestellt, daß den Vektor enthaltende Zellen nachgewiesen und von den Zellen unterschieden werden, die den Vektor nicht enthalten.
(c) Analyse der Promotoren
Durch die humanisierten Gene der vorliegenden Erfindung wird auch eine weitere Dimension für die Analyse von Promotoren in Säugerzellen bereitgestellt. Da sich gfp nun in Säuger- und menschlichen Zellen exprimieren und leicht nachweisen läßt, können eine Reihe von Promotoren auf ihre Eignung zur Verwendung mit einem gegebenen Gen, einer gegebenen Zelle oder einem gegebenen System getestet werden. Dies gilt für in-vitro-Verwendungen, wie beispielsweise bei der Identifizierung eines geeigneten Promotors zur Verwendung bei der rekombinanten Expression und Proteinproduktion auf hohem Niveau, ebenso wie für in-vivo-Verwendungen, wie z.B. beim vorklinischen Testen oder bei der Gentherapie in menschlichen Individuen.
In praktischer Hinsicht würde man zur Analyse eines Promotors zunächst eine Kontrollzelle oder ein Kontrollsystem etablieren. Bei der Kontrolle läßt sich ein positives Ergebnis durch Verwendung eines bekannten und wirksamen Promotors, wie beispielsweise des in gewissen Aspekten der hier beschriebenen Arbeiten bevorzugten CMV-Promotors, erhalten. Zum Testen eines Kandidatenpromotors wird eine weitere Zelle oder ein weiteres System etabliert, wobei alle Bedingungen identisch sind, mit der Ausnahme, daß im Expressionsvektor oder gentechnischem Konstrukt unterschiedliche Promotoren vorliegen. Nach Durchführung des Tests über den gleichen Zeitraum und unter den gleichen Bedingungen wie bei der Kontrolle würden die endgültigen GFP-Expressionsniveaus bestimmt. Dies gestattet einen Vergleich der Stärke oder Eignung des Kandidatenpromotors mit dem Standardpromotor. Bei Verwendung eines in einem gegebenen Labor routinemäßig eingesetzten GFP-Expressionssystems kann in gewissen Untersuchungen eines Testpromotors sogar auf die Positivkontrolle verzichtet werden.
Zu den Promotoren, die sich auf diese Weise testen lassen, gehören auch gewebespezifische Kandidatenpromotoren und induzierbare Kandidatenpromotoren. Das Testen gewebespezifischer Promotoren gestattet die Identifizierung bevorzugter oder optimaler Promotoren zur Verwendung mit einer gegebenen Zelle und deren Unterscheidung von einer Reihe möglicher Promotoren. Dies eignet sich wiederum sowohl in vitro als auch in vivo. Die Optimierung der Kombination aus einem gegebenen Promotor und einer gegebenen Zellart bei rekombinanter Expression und Proteinproduktion kann häufig notwendig sein, um sicherzustellen, daß die höchstmöglichen Niveaus erreicht werden.
Es ist sogar vorgesehen, daß diese erfindungsgemäßen Aspekte zur Analyse eines Kandidatenpromotors zur Verwendung bei der Proteinproduktion unter Einsatz einer sekretorischen Zelle verwendet werden könnten. Bei diesen Ausführungsformen würde das vom Promotor exprimierte GFP höchstwahrscheinlich von der Zelle in das extrazelluläre Milieu sezerniert werden, wo es dann nachgewiesen würde.
Das Testen sowie die letztendliche Verwendung induzierbarer Promotoren bilden einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung. Bei der rekombinanten Expression zwecks Proteinproduktion kann es erwünscht sein, die Expression auf einer bestimmten Stufe der Zellkultur oder des Zellzyklus zu induzieren. Bei der Analyse der Verteilung eines gegebenen Proteins innerhalb einer Zelle oder eines gegebenen Systems ist es auch sinnvoll, einen Promotor zu verwenden, der nur unter gewissen Bedingungen, wie z.B. in Gegenwart bestimmter Cytokine oder Hormone, eingeschaltet wird.
Die Verwendung humanisierter gfp-Gene mit induzierbaren Promotoren dehnt sich auch auf eine Analyse des Promotors selbst aus. Ein Beispiel hierfür ist die Analyse eines bestimmten Promotors aus einer Gruppe von Promotoren, wie z.B. mit Hitzeschockproteinen, von denen bekannt ist, daß sie in verschiedenen Organismen über die gesamte Evolution exprimiert werden, assoziierte Promotoren. Auf diese Weise läßt sich ein Promotor, der beispielsweise in Hefe betrieben werden kann, nehmen und in einem Säugerzellsystem exprimieren, um zu bestimmen, ob er in Säugerzellen betrieben werden kann, und somit zu bestimmen, ob es wahrscheinlich ist, daß Säugerzellen ein Homolog des Hefepromotors enthalten.
Die Verwendung gewebespezifischer Promotoren und induzierbarer Promotoren ist besonders leistungsfähig bei in-vivo-Ausführungsformen. Bei der Verwendung im Zusammenhang mit der Expression eines therapeutischen Gens in einem Tier gestattet die Verwendung eines solchen Promotors nur die Expression in einem gegebenen Gewebe oder Geweben, an einer gegebenen Stelle und/oder unter definierten Bedingungen. Dies ist ein signifikanter Vorteil, der eine auf ein bestimmtes Zielorgan, -gewebe oder einen bestimmten Zielbereich beschränkte Genexpression gestattet und die gesamte Genexpression im Rest des Körpers einschränkt. Das Erreichen einer gewebespezifischen Expression ist besonders wichtig bei bestimmten gentherapeutischen Anwendungen, wie z.B. bei der Expression eines Zytotoxikums, wie es häufig bei der Krebsbehandlung eingesetzt wird. Bei der Expression anderer therapeutischer Gene mit einer positiven Wirkung ist die gewebespezifische Expression selbstverständlich ebenso bevorzugt, da sie die Wirkung der Behandlung optimiert.
Geeignete gewebespezifische und induzierbare Promotoren sind dem Fachmann bekannt. Lediglich als Beispiel erwähnt werden sollen hier der für Darmepithelzellen spezifische Promotor des Gens für das Fettsäure bindende (FAB-)Protein der Leber; der für Pankreaszellen spezifische Insulingenpromotor; die jeweils die spezifische oder bevorzugte Expression in Leberzellen steuernden Promotoren der Gene für Transphyretin, α1-Antitrypsin, Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ I (PAI-1), Apolipoprotein AI und LDL-Rezeptor. Zu den in Hirngeweben aktiven Promotoren gehören der für Oligodendrozyten spezifische MBP (Myelin Basic Protein)-Genpromotor; der für Gliazellen spezifische GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein)-Genpromotor; sowie der für Nervenzellen spezifische NSE (Neural-Specific Enolase)-Promotor.
Zu den induzierbaren Promotoren für in-vivo-Verwendungen gehören vorzugsweise solche, die auf biologisch kompatible Agentien reagieren, vorzugsweise solche, die üblicherweise in definierten Tiergeweben angetroffen werden. Dazu gehört beispielsweise der menschliche PAI-1-Promotor, der durch Tumornekrosefaktor induziert werden kann. Weiterhin eignen sich beispielsweise Cytochrom-P450-Genpromotoren, die durch verschiedene Toxine und andere Agentien induzierbar sind; durch verschiedene Streßsituationen induzierbare Hitzeschockproteingene; hormoninduzierbare Gene, wie z.B. der Östrogen-Genpromotor, und dergleichen.
Durch ionisierende Strahlung induzierbare Promotoren können ebenso bei gewissen Ausführungsformen, insbesondere bei der Gentherapie von Krebserkrankungen, wobei die Genexpression in den Krebszellen durch Einwirkenlassen von ionisierender Strahlung, wie z.B. UV- oder Röntgenstrahlung, lokal induziert wird, verwendet werden. Zu geeigneten, durch ionisierende Strahlung induzierbaren Promotoren gehören egr-1; fos und jun.
(d) Screening-Vorschriften
Eine weitere Entwicklung der Verwendung von Promotoren zusammen mit dem humanisierten gfp der vorliegenden Erfindung ist seine Verwendung in Screening-Vorschriften. Bei diesen Ausführungsformen, die im allgemeinen in vitro durchgeführt werden, wird zur Identifizierung des Vorhandenseins einer bestimmten Verbindung oder eines bestimmten Agens in einer Zusammensetzung eine gentechnisch manipulierte Zelle verwendet.
Bei den Screening-Ausführungsformen wird das humanisierte gfp-Gen stromabwärts von einem Promotor, von dem bekannt ist, daß er durch das gewünschte zu identifizierende Agens induzierbar ist, positioniert. Die gfp-Expression in den Zellen ist normalerweise „stumm" (silent) und wird angeschaltet, indem die Zelle einer Zusammensetzung ausgesetzt wird, die das ausgewählte Agens enthält. Bei Verwendung eines Promotors, der beispielsweise auf ein Schwermetall, ein Toxin, ein Hormon, ein Cytokin oder ein anderes definiertes Molekül reagiert, läßt sich das Vorhandensein eines Schwermetalls, Toxins, Hormons, Cytokins oder dergleichen leicht bestimmen.
Aus der vorangegangenen Aufzählung ist ersichtlich, daß die Screening-Aspekte der vorliegenden Erfindung in zwei grundlegende Gruppen fallen, die zweckmäßigerweise als „die biologische" und „die chemische" Gruppe bezeichnet werden können.
In den biologischen Tests können Zellen, die ein humanisiertes gfp-Gen unter der Kontrolle eines durch ein biologisches Effektormolekül induzierbaren Promotors enthalten, zum Nachweis des Vorhandenseins solcher Moleküle in verschiedenen Arten biologischer Proben, einschließlich Blut, Plasma, Samenflüssigkeit, Urin, Speichel und dergleichen, verwendet werden. Zu denjenigen Effektormolekülen, die auf diese Weise nachweisbar sind, gehören Moleküle wie beispielsweise Hormone, Cytokine, Neurotransmitter und dergleichen. Dabei versteht es sich natürlich, daß der Ausdruck „Promotor", wie er in der vorliegenden gesamten Anmeldung verwendet wird, mit Bezug auf ein beliebiges regulatorisches Element verwendet wird. Zu den besonderen Beispielen zählen hier die Verwendung des regulatorischen Sterol-Elements in Verbindung mit humanisiertem gfp zum Nachweis von Sterolen in einer gegebenen Zusammensetzung; sowie die analoge Verwendung des Serumantwort-Elements, das durch UV, EGF, PDGF und TPA induziert wird.
In den sogenannten chemischen Tests werden Zellen, die ein humanisiertes gfp-Gen unter der Kontrolle eines durch ein chemisches Agens induzierbaren Promotors enthalten, zum Nachweis des Vorhandenseins des chemischen Agens in verschiedenen Zusammensetzungen verwendet. Diese Tests können zum Nachweis von Toxinen oder Verunreinigungen in Flüssigkeiten, wie z.B. Trinkwasser, und dergleichen verwendet werden. Zu den Arten von Agentien, die auf diese Weise nachgewiesen werden können, gehören Schwermetalle, Toxine und verschiedene weitere Schadstoffe und unerwünschte Chemikalien.
Selbstverständlich ist ersichtlich, daß alle Screening-Tests jeweils im Zusammenhang mit dem Nachweis von Agentien, die die Genexpression von einem gegebenen Promotor hemmen, unterdrücken oder sonst wie herunterregulieren, verwendet werden können. Solche negativen Effekte sind anhand abnehmender Fluoreszenz sowie fallender Fluoreszenzniveaus nachweisbar, die das Ergebnis eines „Abschaltens" der Genexpression als Antwort auf das Vorhandensein eines hemmenden Agens sind.
(e) GFP in FACS-Analysen
Viele herkömmliche FACS-Verfahren erfordern die Verwendung von mit gereinigten Antikörpern konjugierten Fluoreszenzfarbstoffen. Mit einer Fluoreszenzmarkierung versehene Proteine wären gegenüber Antikörpern in FACS-Anwendungen bevorzugt, da die Zellen nicht mit dem mit dem Fluoreszenz-Tag versehenen Reagens inkubiert werden müßten und da kein durch die nichtspezifische Bindung eines Antikörperkonjugats verursachter Hintergrund vorliegt. GFP eignet sich besonders gut zur Verwendung im FACS-Verfahren, da die Fluoreszenz stabil und Spezies-unabhängig ist und keine Substrate oder Kofaktoren benötigt.
Wie bei anderen Expressionsausführungsformen kann ein gewünschtes Protein direkt mit GFP markiert werden, indem ein GFP-Fusionsprotein hergestellt und in einer Zelle exprimiert wird. GFP könnte auch, wie oben beschrieben, von einer zweiten Transkriptions- oder Translationseinheit innerhalb des Expressionsvektors, der das gewünschte Protein exprimiert, koexprimiert werden. Das Protein mit GFP-Tag exprimierende Zellen oder GFP koexprimierende Zellen würden dann durch FACS-Analyse nachgewiesen und sortiert. Die FACS-Analyse kann als endgültiges Mittel zur Verfolgung der Genexpression und Promotoraktivität verwendet werden, wenn GFP als Reportergen eingesetzt wird.
Zur Verwendung mit FACS eignen sich insbesondere GFPs mit Rotverschiebung (obwohl GFP selbst auch verwendet werden kann). Der in den meisten FACS-Instrumenten verwendete Argonionenlaser emittiert bei 488 nm, so daß die Exzitation von GFP-Varianten mit Rotverschiebung (z.B. Exzitationsmaximum: ca. 490 nm) effizienter ist als die Exzitation von Wildtyp-GFP. In der vorliegenden Anmeldung wird die erfolgreiche Verwendung von GFP mit FACS-Techniken gezeigt.
6. GFP-Fusionsproteine
Humanisierte gfp-Gene lassen sich als ein Teil eines Fusionsproteins verwenden, was die Lokalisierung des zu identifizierenden Proteins gestattet. Fusionen von GFP mit einem „exogenen" Protein sollten sowohl die Fluoreszenz des GFP als auch die Funktionen des Wirtsproteins, wie z.B. physiologische Funktionen und/oder Targeting-Funktionen, bewahren.
Sowohl der Amino- als auch der Carboxyterminus von GFP können praktisch an alle gewünschten Proteine fusioniert werden, um eine identifizierbare GFP-Fusion zu erzeugen. Es sind sowohl N- als auch C-terminale Proteinfusionen bekannt, die mit dem Wildtypgen hergestellt wurden (Wang und Hazelrigg, 1994). Die Fusion von Proteinen an den Carboxyterminus von GFP könnte durch Linker-Sequenzen verbessert werden.
(a) Subzelluläre Lokalisierung
In der Vergangenheit wurden Lokalisierungsuntersuchungen mittels subzellulärer Fraktionierung und Immunfluoreszenz durchgeführt. Allerdings können diese Techniken lediglich einen „Schnappschuß" der Position des Proteins zu einem bestimmten Augenblick im Zellzyklus liefern. Darüber hinaus können bei der Fixierung der Zellen für die Immunfluoreszenz Artefakte eingeführt werden. Somit stellt die Verwendung von GFP zur Sichtbarmachung von Proteinen in lebenden Zellen, wodurch das Verfolgen von Proteinen über den gesamten Zellzyklus in einer einzelnen Zelle ermöglicht wird, eine wichtige Technik dar.
Humanisiertes GFP läßt sich zur Analyse des intrazellulären Proteintransports in Säuger- und menschlichen Zellen unter einer Vielfalt von Bedingungen in Echtzeit einsetzen. Dabei werden vom Fixieren der Zellen herrührende Artefakte vermieden. Bei diesen Anwendungen wird humanisiertes GFP an ein bekanntes Protein fusioniert, um dessen subzelluläre Lokalisierung unter unterschiedlichen natürlichen Bedingungen zu untersuchen.
Von Pines (1995) wurde die Verwendung von Wildtyp-GFP als Tag zur Erzeugung von GFP-Cyclin-Chimären, die durch transiente Transfektion in Säugergewebekulturzellen exprimiert wurden, beschrieben. In vorläufigen Untersuchungen wurden GFP und sowohl N- als auch C-terminale GFP-Cyclin-Chimären in lebenden Zellen nachgewiesen, wobei die Fluoreszenz in derartigen Zellen über mehrere Stunden verfolgt wurde.
Pines (1995) verwendete den frühen Zytomegalievirus-Promotor zur Steuerung der GFP-Expression in transient transfizierten Zellen und exprimierte GFP in COS-7-, HeLa- und NIH-3T3-Zellen. In allen Fällen trat dabei eine Verzögerung („lag period") (> 15 h) auf, bevor die Fluoreszenz nachgewiesen werden konnte, obwohl Chimären mittels Immunfluoreszenz nach 12 h nachgewiesen wurden. Das kann daran liegen, daß GFP eine Autooxidation durchlaufen muß, was in Bakterien etwa 4 h dauert (Heim et al., 1994). Im Gegensatz zu diesen Untersuchungen in Säugerzellen weist die vorliegende Erfindung den deutlichen Vorteil auf, daß GFP-Fluoreszenz nach etwa 6 Stunden nachweisbar war.
Bei den Untersuchungen von Pines (1995) und anderen wurde die natürliche subzelluläre Lokalisierung von Proteinen durch GFP nicht gestört. Pines (1995) konnte zeigen, daß GFP allein über die Zelle, und zwar sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma, verteilt wird. Dabei wurde festgestellt, daß es als Cyclin-A-Tag vorwiegend im Zellkern und als Cyclin-B-Tag im Zytoplasma vorlag, wobei es je nach dem Cyclin-Typ-B mit Mikrotubuli oder dem Vesikelkompartiment assoziiert war (Pines, 1995).
Humanisiertes GFP kann als Tag für praktisch jedes Protein verwendet werden, wobei man der Lokalisation des Proteins unter unterschiedlichen Bedingungen folgen kann, beispielsweise beim Verfolgen eines gegebenen Proteins während der Meiose, Mitose, Apoptose oder anderen zellulären Vorgängen. Die Lokalisation eines gegebenen Proteins läßt sich auch als Antwort auf eine Reihe externer Reize bestimmen. Zu solchen Reizen gehören unterschiedliche physikalische Bedingungen, wie beispielsweise eine Erhöhung oder Reduzierung der Temperatur, sowie ebenso unterschiedliche chemische Umgebungen. Unter dem Ausdruck „chemische Umgebung" werden sowohl natürliche Umgebungen, die angetroffen werden können, wie beispielsweise Zusammensetzungen mit unterschiedlichen Niveaus an Salz oder Serumwachstumsfaktoren und dergleichen, als auch Zusammensetzungen, die mit einem Effektormolekül versetzt wurden, verstanden.
Zusammensetzungen mit Effektormolekülen werden verwendet, um eine Antwort in einer gegebenen Zelle hervorzurufen. Das erfindungsgemäße humanisierte gfp läßt sich dabei in Tests verwenden, in denen die Antwort einer Zelle auf einen gegebenen Effektor oder Agonisten bestimmt wird. Mit derartigen Verfahren läßt sich die Lokalisierung eines gegebenen Proteins als Antwort auf ein Hormon, Cytokin, einen Neurotransmitter oder ein anderes Agens bestimmen. Dabei ist allgemein bekannt, daß die Lokalisation von Proteinen als Antwort auf verschiedene externe Reize variiert und daß Proteinbewegungen zwischen internen Kompartimenten, wie z.B. der äußeren Membran, dem Cytosol, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Zellkern, stattfinden.
(b) GFP-gesteuertes Targeting
Eine weitere Verwendung von GFP-Fusionsproteinen liegt im Nachweis eines Zielproteins an einem bestimmten Ort, nachdem das Protein trotz des natürlichen Zielorts des Proteins an den Transport in ein bestimmtes Zellkompartiment angepaßt wurde. Dies wird dadurch erreicht, daß man eine Targeting-Sequenz, wie beispielsweise eine nukleäre oder mitochondriale Targeting-Sequenz, zusammen mit der GFP-Sequenz an das gewünschte Protein fusioniert. Dies steht im Gegensatz zu den unmittelbar oben beschriebenen Verfahren, bei denen unter Verwendung von GFP die natürliche Lokalisation eines Proteins bestimmt wird.
Der Zellkern enthält viele Proteine, die bei der Vermittlung seiner einzigartigen Funktionen helfen. Diese Proteine werden vom Cytosol, wo sie hergestellt werden, importiert. Dabei müssen sie sowohl die äußere als auch die innere Zellmembran durchqueren, um das innere des Zellkerns (das Kernlumen) zu erreichen. Dieser Transportvorgang ist selektiv: viele im Cytosol hergestellte Proteine sind vom Zellkern ausgeschlossen. Viele Zellkernproteine wechselwirken mit auf dem Porenrand befindlichen Rezeptorproteinen, die die Proteine aktiv in den Zellkern transportieren, während sie den Porenkanal vergrößern.
Die Selektivität des nukleären Transports liegt in den nukleären Importsignalen, die lediglich in Zellkernproteinen vorhanden sind. Nukleäre Importsignale wurden mittels gentechnischer Verfahren in einigen Zellkernproteinen genau definiert. Das Signal, das sich irgendwo im Protein befinden kann, besteht aus einem kurzen Peptid (typischerweise aus vier bis acht Aminosäureresten), das reich an den positiv geladenen Aminosäuren Lysin und Arginin ist und üblicherweise Prolin enthält. Das nukleäre Importsignal für T-Antigen ist beispielsweise Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val (SEQ ID NO: 6).
Humanisiertes GFP kann zur Bestätigung, daß ein ausgewähltes Protein in den Zellkern importiert wurde, nach Expression eins Konstrukts, in dem das betreffende Protein an GFP und eine nukleäre Targeting-Sequenz fusioniert ist, verwendet werden. Dies kann als Teil von in-vitro-Untersuchungen in der Grundlagenforschung oder sogar als Teil einer in-vivo-Therapie, beispielsweise beim Lenken von Agentien auf den Zellkern von Krebszellen und dergleichen verwendet werden.
Das Hinzufügen eines nukleären Lokalisierungssignals zu einem humanisierten gfp-Gen kann auch dazu verwendet werden, die Fluoreszenzintensität des exprimierten Proteins zu verstärken, indem das Protein auf den wesentlich kleineren Raum des Zellkerns beschränkt ist. Dies wird im Zusammenhang mit blauen GFP-Mutanten in Beispiel VII der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
Da ein Zellkernproteinmolekül wiederholt importiert werden muß, beispielsweise nach Mitose, wird das nukleäre Importsignalpeptid nach dem Transport in den Zellkern nicht abgespalten. Im Gegensatz dazu wird ein Proteinmolekül, sobald es von einem der anderen, von Membranen umgrenzten Organellen importiert wurde, in diesem Kompartiment von Generation zu Generation weitergegeben und braucht nie wieder translokalisiert werden. Daher wird das Signalpeptid auf diesen Molekülen häufig nach der Proteintranslokalisation entfernt.
Bei den Mitochondrien handelt es sich um von einer Doppelmembran umgrenzte Organellen, die auf die Synthese von ATP über Elektronentransport und oxidative Phosphorylierung spezialisiert sind. Die meisten ihrer Proteine sind im Zellkern codiert und werden aus dem Cytosol importiert. Zudem muß jedes importierte Protein das bestimmte Teilkompartiment, in dem es seine Funktion ausübt, erreichen. Bei den Mitochondrien gibt es vier Teilkompartimente: den Matrixraum; die innere Membran; den Zwischenmembranraum; sowie die äußere Membran, die dem Cytosol zugewandt ist. Jedes dieser Teilkompartimente enthält einen bestimmten Satz von Proteinen.
Die Untersuchung der mitochondrialen Biogenese wurde durch die Verwendung von Hefen, in die sich Hybridgene, die Fusionsproteine codieren (hergestellt mit rekombinanten DNA-Techniken), effizient einführen lassen. In die mitochondriale Matrix importierte Proteine werden normalerweise aus dem Cytosol innerhalb von einer oder zwei Minuten nach ihrer Freisetzung aus freien Polyribosomen aufgenommen.
Importierte Proteine weisen fast immer ein Signalpeptid (20–80 Reste lang) an ihrem Aminoterminus auf. Nach dem Import wird das Signalpeptid schnell durch eine spezifische Protease (eine Signalpeptidase) in der mitochondrialen Matrix abgetrennt und danach in der Matrix wahrscheinlich zu Aminosäuren abgebaut. Das Signalpeptid kann bemerkenswert einfach sein. Molekulargenetische Experimente, bei denen das Signalpeptid nach und nach in seiner Länge reduziert wird, zeigten, daß bei einem mitochondrialen Protein nur 12 Aminosäuren am Aminoterminus als Signal für den mitochondrialen Import benötigt werden. Diese 12 Reste lassen sich an ein beliebiges zytoplasmatische Protein anfügen und lenken das Protein in die mitochondriale Matrix.
Physikalische Untersuchungen von Vollängen-Signalpeptiden lassen vermuten, daß diese amphipathische α-helikale Strukturen bilden können, in denen positiv geladene Reste alle auf einer Seite der Helix liegen, während ungeladene hydrophobe Reste sich in Richtung der gegenüberliegenden Seite anordnen. Ein Beispiel für eine mitochondriale Importsequenz ist Met Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe Lys Pro Ala Thr Arg Thr Leu (SEQ ID NO: 7).
Der Transport mehrerer Vorläuferproteine in den mitochondrialen Zwischenmembranraum beginnt mit deren ersten Überführung in die Matrix. Hier wird eine sehr hydrophobe Aminosäuresequenz hinter dem den Import auslösenden aminoterminalen Signalpeptid strategisch plaziert. Sobald das aminoterminale Signal von der Matrixprotease abgespalten ist, wirkt die hydrophobe Sequenz als Signalpeptid zur Wiedereinführung des Proteins in die innere Membran. Dieser Transfer von der Matrix findet vermutlich über einen Mechanismus statt, der analog zu dem für den Proteinimport in die ER-Membran verwendeten Mechanismus ist und der auch als Mechanismus zur Einführung von im Mitochondrion codierten Proteinen in die innere Membran verwendet wird. Der Transport von Proteinen aus dem Cytosol zur inneren Mitochondrienmembran erfordert ebenso ein hydrophobes Signalpeptid.
Die Verwendung von GFP und einer mitochondrialen Targeting-Sequenz zur Sichtbarmachung der Mitochondrienbewegung in lebenden Zellen ist aus Rizzuto et al. (1995) bekannt. Im Gegensatz zu Farbstoffen, wie z.B. Rhodamin, konnten durch die Verwendung von GFP morphologische Änderungen gezeigt werden, die in Mitochondrien durch Arzneistoffe, die das Organellenmembranpotential zusammenbrechen lassen, induziert werden.
In diesen Untersuchungen wurde von Rizzuto et al. (1995) als Teil der für das Fusionsprotein codierenden Sequenzen ein DNA-Fragment verwendet, das für die aminoterminalen 31 Aminosäuren des Vorläufers der Untereinheit VIII der Cytochrom-C-Oxidase, die eine mitochondriale Targeting-Sequenz bilden, codiert. Es wurde eine chimäre cDNA erzeugt, die jeweils vom Amino- zum Carboxyterminus für eine mitochondriale Präsequenz sowie 6 Aminosäuren des reifen Cytochrom-C-Oxidase-Proteins; einige wenige Linker-Aminosäuren sowie für GFP codierte. Durch dieses Konstrukt wurde GFP exprimiert, das in die Mitochondrien importiert wurde.
Die Verwendung von humanisiertem GFP stellt eine Verbesserung für die Art der von Rizzuto et al. (1995) beschriebenen Untersuchungen dar, bei denen lediglich eine Markierung der Mitochondrien als Ganzes gewünscht wird. Humanisiertes GFP kann auch zur Bestätigung, daß ein ausgewähltes Protein in die Mitochondrien importiert wurde, nach Expression eines Konstrukts, in dem ein gewünschtes Protein an GFP und eine mitochondriale Targeting-Sequenz fusioniert ist, verwendet werden. Die mitochondriale Targeting-Sequenz sollte hierbei am N-Ende des Fusionsproteins (am 3'-Ende der codierenden Nukleinsäure) positioniert werden.
7. Gentherapeutische Anwendungen
Eine erfolgreiche Gentherapie benötigt im allgemeinen die Integration eines zur Korrektur der genetischen Störung fähigen Gens in das Wirtsgenom, wo es zusammen mit der Wirts-DNA koexistieren und repliziert würde und auf einem Niveau exprimiert würde, das für das defekte Gen kompensiert. Idealerweise würde dabei die Krankheit durch eine oder einige wenige Behandlungen geheilt, wobei keine ernsthaften Nebenwirkungen auftreten würden. Bis heute wurden mehrere Ansätze zur Gentherapie vorgeschlagen, die jeweils von einer Kombination mit dem humanisierten gfp der vorliegenden Erfindung profitieren könnten.
Ein Ansatz besteht in der Transfektion von das interessierende Gen enthaltender DNA in die Zellen, beispielsweise indem die Zellmembran entweder chemisch oder physikalisch permeabilisiert wird. Dieser Ansatz ist im allgemeinen auf Zellen beschränkt, die zeitweilig dem Körper entnommen werden können und die Zytoxizität der Behandlung tolerieren können (d.h. Lymphozyten). Beispiele für solche Verfahren sind die Calciumphosphatpräzipitation (Graham und Van der Eb, 1973; Rippe et al., 1990), das DEAE-Dextran-Verfahren (Gopal, 1985), die Elektroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984) und die direkte Mikroinjektion.
Liposomen oder aus bestimmten Lipiden und amphophilen Peptiden gebildete Proteinkonjugate können für die in-vivo- und in-vitro-Transfektion verwendet werden (Stewart et al., 1992; Torchilin et al., 1992; Zhu et al., 1993; Ledley et al., 1987; Nicolau et al., 1983; Nicolau und Sene, 1982), wobei an einen Polylysin-Glycoprotein-Trägerkomplex gekoppelte DNA ebenso verwendet werden kann.
Die Effizienz der auf diese Weise durchgeführten Genintegration ist im allgemeinen sehr niedrig. Man schätzt, daß das interessierende Gen in das Genom von lediglich einer aus 1000 bis 100000 Zellen integriert. Falls keine Integration vorliegt, ist die Expression des transfizierten Gens aufgrund des Abbaus der nicht integrierten DNAs in proliferierenden Zellen auf mehrere Tage oder in nicht proliferierenden Zellen auf mehrere Wochen beschränkt. Die vorliegende Erfindung kann zur einfachen Identifizierung von Zellen, die das gewünschte transfizierte Gen über längere Zeiten exprimieren, verwendet werden.
Von Jiao et al. (1993) wird der Erfolg von Vorschriften mit einem durch Partikelbeschuß vermittelten Gentransfer zur Übertragung und Expression von Genen in Hirngeweben beschrieben, was darauf schließen läßt, daß dies als effektives Verfahren für den Gentransfer in solche Gewebe eingesetzt werden kann.
Plasmide können zum direkten Transfer von humanisiertem genetischen gfp-Material in eine Zelle verwendet werden (Wolfe et al., 1990). Daher lassen sich DNA-Segmente selbst als Zuführungsmittel verwenden. Die Technologie zur Verwendung von DNA-Segmenten wurde vor kurzem entwickelt und wird im allgemeinen als „DNA-Impfung" bezeichnet (Cohen, 1993). Inzwischen ist bekannt, daß Zellen nackte DNA aufnehmen und codierte Proteine exprimieren können.
Die Nutzung dieser Technologie sowie von deren Variationen, wie z.B. den von Ulmer et al. (1993); Tang et al. (1992), Cox et al. (1993), Fynan et al. (1993), Wang et al. (1993) und Whitton et al. (1993), beschriebenen, die hiermit jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind, kann für die Zuführung von DNA zu Zielzellen verwendet werden. Dabei können parenterale und mukosale Inokulationen sowie Inokulationen mit der Genkanone (Fynan et al., 1993) verwendet werden.
Ein weiterer Ansatz, der verwendet werden kann, macht sich die natürliche Fähigkeit von Viren, in Zellen einzudringen, wobei sie ihr eigenes genetisches Material mit sich bringen, zu Nutze. Aufgrund ihrer Fähigkeit, ihre Gene in das Wirtsgenom zu integrieren, wobei eine große Menge an genetischem Fremdmaterial übertragen wird, ein breites Spektrum von Spezies und Zellarten infiziert wird und eine Verpackung in speziellen Zellinien stattfindet, handelt es sich bei Retroviren um Genzuführungsvektoren, die einiges versprechen (Miller, 1992).
Es kann eine Vielfalt von retroviralen Vektoren verwendet werden, beispielsweise Herpes-simplex-Virus (US-Patent 5,288,641, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen), Zytomegalievirus und dergleichen, wie von Miller (Miller, 1992) beschrieben. Ein Gen für Herpes-simplex-Thymidinkinase (HS-tK) konnte Hirntumoren unter Verwendung eines retroviralen Vektorsystems zugeführt werden, wo es erfolgreich eine Suszeptibilität gegenüber dem Antivirusmittel Ganciclovir induzierte (Culver, et al., 1992).
Ebenso ist die Genzuführung unter Verwendung von retroviralen Vektoren der zweiten Generation bekannt. Von Kasahara et al. (1994) wurde eine gentechnische Variante des MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus), das normalerweise nur Mauszellen infiziert, hergestellt und ein Hüllprotein so modifiziert, daß das Virus spezifisch an den Erythropoetinrezeptor (EPO-Rezeptor) tragende menschliche Zellen binden und diese infizieren konnte. Dies wurde dadurch erreicht, daß ein Teil der EPO-Sequenz in ein Hüllprotein unter Erzeugung eines chimären Proteins mit einer neuen Bindungsspezifität inseriert wurde.
Zuführungssysteme, wie sie oben beschrieben sind, können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Im Zusammenhang mit der retroviralen Therapie würde die Erfindung sowohl in der vorklinischen Entwicklungsphase als auch zur Verfolgung der Genexpression nach Verabreichung in vivo verwendet werden.
In weiteren Verfahren werden andere Viren, wie z.B. Vacciniavirus (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), defekte Hepatitis-B-Viren (Horwich et al., 1990; Chang et al., 1991), Adenovirus und Adeno-assoziiertes Virus (AAV; Muzyczka, 1992; siehe unten), die gentechnisch manipuliert werden, um als Vektoren für den Gentransfer zu dienen, verwendet. Obwohl einige Viren, die genetisches Fremdmaterial aufnehmen können, hinsichtlich der Anzahl an Nukleotiden, die sie aufnehmen können, sowie der Bandbreite von Zellen, die sie infizieren, beschränkt sind, konnte demonstriert werden, daß diese Viren eine erfolgreiche Genexpression bewirken. Adenoviren integrieren ihr genetisches Material nicht in das Wirtsgenom und benötigen daher keine Wirtsreplikation zur Genexpression, wodurch sie sich für die schnelle, effiziente, heterologe Genexpression eignen. Adenoviren und AAV (US-Patent 5,139,941, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen) sind nachfolgend beschrieben. Wiederum würde die Erfindung in der vorklinischen Entwicklung sowie während der Behandlung verwendet.
Die vorliegenden Entdeckungen können in Verbindung mit bestimmten Techniken, die in den biologischen Fachgebieten allgemein bekannt sind und in den folgenden Abschnitten eingehender beschrieben werden, genutzt werden.
8. Biologische funktionelle Äquivalente
Wie zuvor erwähnt, können in der Struktur des GFP Modifikationen und Änderungen vorgenommen werden, wobei sich dennoch ein Molekül erhalten läßt, das ähnliche oder sonstwie wünschenswerte Eigenschaften aufweist. So können beispielsweise gewisse Aminosäuren gegen andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur substituiert werden, ohne daß dabei ein nennenswerter Funktionsverlust auftritt. Es ist somit vorgesehen, daß verschiedene Änderungen in der Sequenz humanisierter gfp-Proteine durchgeführt werden können, indem die zugrunde liegende DNA geändert wird, ohne nennenswerten Verlust ihrer biologischen Nützlichkeit oder Aktivität.
Ebenso ist dem Fachmann allgemein bekannt, daß die Definition eines biologisch funktionellen äquivalenten Proteins das Konzept beinhaltet, daß die Anzahl an Änderungen, die innerhalb eines definierten Teils des Moleküls vorgenommen werden können und noch zu einem Molekül mit einem annehmbaren Niveau an äquivalenter biologischer Aktivität führen, begrenzt ist. So wurde beispielsweise bereits erläutert, daß es sich bei wesentlich verkürzten gfp-Genen nicht um biologisch funktionelle Äquivalente handelt.
Allerdings ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch ersichtlich, daß, solange eine Mutation oder eine Änderung nicht zu einem GFP-Protein führt, das seine Fluoreszenz vollständig verloren hat, das erhaltene Protein als biologisch funktionelles Äquivalent im erfindungsgemäßen Sinne betrachtet wird. In der Tat liegen Aminosäureaustausche, die Proteine mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften ergeben, im Rahmen der Erfindung. Dazu gehören Mutationen innerhalb und außerhalb des Chromophorbereichs.
9. Stellenspezifische Mutagenese
Die stellenspezifische Mutagenese kann zur Herstellung weiterer Varianten humanisierter gfp-Gene verwendet werden. Bei der stellenspezifischen Mutagenese handelt es sich um eine Technik, die sich zur Herstellung individueller Peptide oder biologisch funktioneller äquivalenter Proteine oder Peptide über die spezifische Mutagenese der zugrunde liegenden DNA eignet. Durch diese Technik wird ferner eine leichte Möglichkeit zur Herstellung und zum Testen von Sequenzvarianten durch Einführung einer oder mehrerer Nukleotidsequenzänderungen in die DNA bereitgestellt.
Die stellenspezifische Mutagenese gestattet die Produktion von Mutanten über die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation codieren, ebenso wie eine ausreichende Anzahl benachbarter Nukleotide, so daß eine Primersequenz mit hinreichender Größe und Sequenzkomplexität zur Ausbildung eines stabilen Duplexes auf beiden Seiten der überbrückten Deletionsstelle bereitgestellt wird. Dabei ist typischerweise eine Primerlänge von etwa 17 bis 25 Nukleotiden bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Sequenzverbindungsstelle geändert werden.
Die Technik der stellenspezifischen Mutagenese ist im allgemeinen im Fachgebiet allgemein bekannt, wie beispielhaft durch Veröffentlichungen dargestellt (Adelman et al., 1983). Wie ersichtlich ist, wird bei dieser Technik typischerweise ein Phagenvektor eingesetzt, der sowohl in einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form existiert. Zu den für die stellengerichtete Mutagenese geeigneten typischen Vektoren gehören Vektoren, wie z.B. der M 13-Phage (Messing et al., 1981). Diese Phagen sind kommerziell leicht erhältlich, und ihre Verwendung ist dem Fachmann allgemein bekannt. Doppelsträngige Plasmide werden ebenso routinemäßig in der stellengerichteten Mutagenese eingesetzt, wodurch der Schritt der Übertragung des interessierenden Gens von einem Plasmid in einen Phagen entfällt.
Im allgemeinen wird die stellengerichtete Mutagenese erfindungsgemäß durchgeführt, indem zunächst ein einzelsträngiger Vektor erhalten oder die beiden Stränge eines doppelsträngigen Vektors auseinander geschmolzen werden, wobei der Vektor in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die für gfp oder humanisiertes gfp codiert. Es wird ein die gewünschte mutierte Sequenz tragender Oligonukleotidprimer hergestellt, und zwar im allgemeinen synthetisch, beispielsweise mit dem Verfahren nach Crea et al. (1978). Dieser Primer wird dann mit dem einzelsträngigen Vektor zusammengefügt und DNA polymerisierenden Enzymen, wie beispielsweise E. coli-Polymerase I, Klenow-Fragment, ausgesetzt, um die Synthese des die Mutation tragenden Stranges zu vervollständigen. Somit bildet sich ein Heteroduplex aus, worin ein Strang für die ursprüngliche nichtmutierte Sequenz codiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann zur Transformation entsprechender Zellen, wie z.B. E. coli-Zellen, verwendet, wobei Klone selektioniert werden, die die mutierte Sequenzanordnung tragende rekombinante Vektoren enthalten.
Geeignete Techniken sind ebenso im US-Patent 4,888,286, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben.
Die Herstellung von Sequenzvarianten des ausgewählten humanisierten gfp-Gens unter Verwendung der stellengerichteten Mutagenese wird als Mittel zur Herstellung potentiell geeigneter GFP-Spezies bereitgestellt und sollte nicht als Beschränkung verstanden werden, da es andere Wege gibt, auf die GFP-Sequenzvarianten erhalten werden können. Beispielsweise können das gewünschte humanisierte gfp-Gen codierende rekombinante Vektoren mit mutagenen Agentien behandelt werden, um Sequenzvarianten (siehe z.B. ein von Eichenlaub, 1979 beschriebenes Verfahren) zur Mutagenese von Plasmid-DNA unter Verwendung von Hydroxylamin zu erhalten.
Zwar eignen sich die oben genannten Verfahren zur Verwendung bei der Mutagenese, doch wird heute im allgemeinen die Polymerasekettenreaktion (PCR^TM) bevorzugt. Diese Technologie bietet ein schnelles und effizientes Verfahren zur Einführung gewünschter Mutationen in eine gegebene DNA-Sequenz. Im folgenden Text wird insbesondere die Verwendung der PCR^TM zur Einführung von Punktmutationen in eine Sequenz beschrieben, wie sie zur Änderung der von der gegebenen Sequenz codierten Aminosäure verwendet werden kann. Adaptionen dieses Verfahrens eignen sich auch zur Einführung von Restriktionsenzymstellen in ein DNA-Molekül.
Bei diesem Verfahren werden synthetische Oligonukleotide zum Einbau einer Punktmutation an einem Ende eines amplifizierten Segments konstruiert. Nach der PCR^TM werden die amplifizierten Fragmente durch Behandlung mit Klenow-Fragmenten stumpfendig gemacht, wobei die stumpfendigen Fragmente danach zur Erleichterung der Sequenzanalyse in einen Vektor ligiert und subkloniert werden.
Zur Herstellung der Matrizen-DNA, die man mutagenisieren möchte, wird die DNA unter Verwendung von den zu mutierenden Bereich flankierenden Restriktionsstellen in einen Vektor mit hoher Kopienzahl, wie z.B. pUC 19, subkloniert. Danach wird die Matrizen-DNA mittels einer Plasmid-Minipräparation präpariert. Geeignete Oligonukleotidprimer, die auf der Ausgangssequenz beruhen, jedoch die gewünschte Punktmutation enthalten und am 5'-Ende von einer Restriktionsenzymstelle flankiert sind, werden mittels eines Syntheseautomaten synthetisiert. Dabei ist im allgemeinen erforderlich, daß der Primer zur Matrizen-DNA über etwa 15 oder so Basen homolog ist. Die Primer können mittels denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt werden, obwohl dies zur Verwendung in der PCR^TM nicht unbedingt notwendig ist. Das 5'-Ende der Oligonukleotide sollte dann phosphoryliert werden.
Die Matrizen-DNA sollte durch PCR^TM mit den Oligonukleotidprimern, die die gewünschten Punktmutationen enthalten, amplifiziert werden. Die MgCl₂-Konzentration im Amplifikationspuffer liegt im allgemeinen bei etwa 15 mM. Im allgemeinen sollten etwa 20–25 PCR^TM-Zyklen wie folgt durchlaufen werden: Denaturierung, 35 s bei 95°C; Hybridisierung, 2 min bei 50°C und Verlängerung, 2 min bei 72°C. Die PCR^TM beinhaltet im allgemeinen als letzten Zyklus eine Verlängerungsreaktion bei 72°C über etwa 10 min. Nach dem letzten Verlängerungsschritt sollten etwa 5 Einheiten Klenow-Fragmente zum Reaktionsansatz gegeben und eine weitere, 15minütige Inkubation bei etwa 30°C durchgeführt werden. Die Exonukleaseaktivität der Klenow-Fragmente wird zur Herstellung glatter Enden, die sich zur stumpfendigen Klonierung eignen, benötigt.
Der erhaltene Reaktionsansatz sollte im allgemeinen durch nichtdenaturierende Agarose- oder Acrylamid-Gelelektrophorese analysiert werden, um das Entstehen des vorhergesagten Produkts durch die Amplifikation zu bestätigen. Zur weiteren Bearbeitung des Reaktionsansatzes würde man dann den größten Teil der Mineralöle entfernen, eine Extraktion mit Chloroform zur Entfernung des verbliebenen Öls, eine Extraktion mit gepuffertem Phenol und danach eine Konzentration durch Ausfällen mit 100% Ethanol durchführen. Als nächstes sollte man etwa die Hälfte der amplifizierten Fragmente mit einem Restriktionsenzym, das an den Oligonukleotiden verwendeten flankierenden Sequenzen schneidet, verdauen. Die verdauten Fragmente werden auf einem Agarosegel mit niedrigem Gelier-/Schmelzpunkt gereinigt.
Zur Subklonierung der Fragmente und zum Überprüfen der Punktmutation würde man die beiden amplifizierten Fragmente mittels stumpfendiger Ligation in einen entsprechend verdauten Vektor subklonieren. Dieser würde zur Transformation von E. coli verwendet, aus denen Plasmid-DNA anschließend mit einer Minipräparation präpariert werden könnte. Der amplifizierte Teil der Plasmid-DNA würde dann durch DNA-Sequenzierung analysiert, um zu bestätigten, daß die korrekte Punktmutation erzeugt wurde. Dies ist wichtig, da Taq-DNA-Polymerase zusätzliche Mutationen in DNA-Fragmente einführen kann.
Die Einführung einer Punktmutation kann auch unter Verwendung aufeinanderfolgender PCR^TM-Schritte bewirkt werden. Bei dieser Vorgehensweise werden die beiden die Mutation umfassenden Fragmente aneinandergefügt und durch Synthese mit gegenseitigem Priming verlängert. Dieses Fragment wird dann in einem zweiten PCR^TM-Schritt amplifiziert, wodurch die im obigen Protokoll erforderliche stumpfendige Ligation vermieden wird. Bei diesem Verfahren werden die Herstellung der Matrizen-DNA, die Erzeugung der Oligonukleotidprimer sowie die erste PCR^TM-Amplifikation wie oben beschrieben, durchgeführt. Allerdings sollten bei diesem Verfahren die gewählten Oligonukleotide zur Matrizen-DNA über einen Abschnitt zwischen etwa 15 und etwa 20 Basen homolog sein und müssen auch miteinander um etwa 10 Basen oder mehr überlappen.
Bei der zweiten PCR^TM-Amplifikation würde man jedes amplifizierte Fragment und jeden flankierenden Sequenzprimer verwenden und die PCR^TM für etwa 20 bis etwa 25 Zyklen laufen lassen, wobei die wie oben beschriebenen Bedingungen verwendet werden. Man würde wiederum die Fragmente subklonieren und überprüfen, daß die Punktmutation korrekt war, indem die oben aufgeführten Schritte verwendet werden.
Bei der Verwendung der oben genannten Verfahren ist es im allgemeinen jeweils bevorzugt, die Mutation durch Amplifikation eines kleinstmöglichen Fragments einzuführen. Selbstverständlich sollten auch Parameter, wie z.B. die Schmelztemperatur des Oligonukleotids, wie sie im allgemeinen durch den GC-Gehalt sowie die Länge des Oligos beeinflußt werden, gewissenhaft berücksichtigt werden. Die Ausführung dieser Verfahren sowie ihre gegebenenfalls notwendige Optimierung sind dem Fachmann bekannt und ferner in verschiedenen Veröffentlichungen, wie z.B. Current Protocols in Molecular Biology, 1995, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben.
10. Expressionsplasmide und -vektoren
Zur Expression eines humanisierten gfp-Gens kann eine große Vielfalt rekombinanter Plasmide und Vektoren konstruiert werden und somit zur Zuführung von GFP in eine Zelle verwendet werden.
Der Ausdruck „Expressionsvektor", wie er hier verwendet wird, umfaßt alle Arten von genetischen Konstrukten, die eine Nukleinsäuresequenz eines humanisierten gfp-Gens enthalten, wobei die Nukleinsäuresequenz in einer Säuger- oder menschlichen Zelle transkribiert werden kann. Dabei sollten die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren auch die Translation in GFP-Protein steuern, wie dies durch die Erfindung selbst bereitgestellt wird. Zusätzlich zur humanisierten gfp-Sequenz enthalten Expressionsvektoren im allgemeinen Restriktionsenzymschnittstellen sowie die anderen am Anfang, am Ende und in der Mitte liegenden DNA-Sequenzen, die normalerweise in Vektoren eingesetzt werden, um deren Konstruktion und Verwendung zu erleichtern.
Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugerzellen enthalten gewöhnlicherweise einen Replikationsursprung (wie benötigt) sowie einen vor dem zu exprimierenden Gen liegenden Promotor. Vorzugsweise sind eine Polyadenylierungsstelle sowie Transkriptionsterminatorsequenzen enthalten. Ebenso können Ribosomenbindungsstellen sowie RNA-Spleißstellen enthalten sein. Ein Beispiel ist das 16S/19S-Spleißdonor/Spleißakzeptor-Signal des späten SV40-Gens.
Der Replikationsursprung kann entweder dadurch, daß die Vektorkonstruktion einen exogenen Ursprung, wie er beispielsweise aus SV40 oder einer anderen viralen Quelle (z.B. Polyomavirus, Adenovirus, VSV, BPV) gewonnen werden kann, oder durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wird der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert, so reicht letzteres häufig aus. Promotoren werden nachfolgend erörtert.
Für eine effiziente Translation können auch spezifische Initiationssignale erforderlich sein. Zu diesen Signalen gehören das ATG-Initiationscodon sowie benachbarte Sequenzen. Darüber hinaus kann es auch notwendig sein, exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationscodons, bereitzustellen. Ein Durchschnittsfachmann wäre leicht dazu in der Lage, dies zu bestimmen und die notwendigen Signale bereitzustellen. Es ist allgemein bekannt, daß sich das Initiationscodon im Leseraster (oder Inphase) mit dem Leseraster der gewünschten codierenden Sequenz befinden muß, um die Translation der gesamten Insertion sicherzustellen. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Initiationscodons können verschiedenartigen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, Ursprungs sein. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluß entsprechender Transkriptionselemente und Transkriptionsterminatoren verbessert werden (Bittner et al., 1987).
Bei der Expression in Säugern besteht typischerweise auch der Wunsch, eine geeignete Polyadenylierungsstelle (z.B. 5'-AATAAA-3') in die Transkriptionseinheit einzubauen, falls eine solche Stelle im ursprünglichen klonierten Segment nicht enthalten war. Typischerweise wird dabei die Poly-A-Additionsstelle etwa 30 bis 2000 Nukleotide „stromabwärts" der Terminationsstelle des Proteins an einer Position vor der Transkriptionstermination plaziert. Es wird nicht angenommen, daß die Beschaffenheit des Polyadenylierungssignals für die erfolgreiche Praktizierung der Erfindung kritisch ist, so daß eine beliebige derartige Sequenz eingesetzt werden kann. Die Signale aus SV40, dem Gen für Rinderwachstumshormon, sind zweckmäßig und funktionieren bekanntermaßen gut.
Zur Langzeitproduktion rekombinanter Proteine mit hoher Ausbeute wird häufig eine stabile Expression bevorzugt. Hier können, statt der Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, die Wirtszellen mit Vektoren, die von entsprechenden Expressionskontrollelementen (z.B. Promotor-, Enhancer- Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) gesteuert werden, sowie einem selektionierbaren Marker transformiert werden. Daher ist auch die gemeinsame Verwendung humanisierter gfp-Sequenzen und selektionierbarer Marker vorgesehen.
Bei der stabilen Expression kann man nach Einführung der Fremd-DNA die manipulierten Zellen 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsenlassen, wonach auf ein Selektionsmedium gewechselt wird. Der selektionierbare Marker im rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz gegenüber der Selektion und gestattet den Zellen, das Plasmid in ihre Chromosomen stabil zu integrieren und unter Bildung von Foci zu wachsen, welche wiederum kloniert und in Zellinien expandiert werden können.
Es können eine Reihe von Selektionssystemen verwendet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, der Gene für Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler et al., 1977), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska et al., 1962) bzw. Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980) in tk-, hgprt- bzw. aprt-Zellen. Ebenso kann eine Antimetabolit-Resistenz als Grundlage der Selektion auf dhfr, wodurch eine Resistenz gegenüber Methotrexat verliehen wird (Wigler et al., 1980; O'Hare et al., 1981); gpt, wodurch eine Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verliehen wird (Mulligan et al., 1981); neo, wodurch eine Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 verliehen wird (Colberre-Garapin et al., 1981); und hygro, wodurch eine Resistenz gegenüber Hygromycin verliehen wird (Santerre et al., 1984), verwendet werden.
Ebenso ist vorgesehen, daß bevorzugte Vektoren einen in Bakterien funktionsfähigen Replikationsursprung sowie ein typisches Antibiotikaresistenzgen enthalten, was die Vermehrung bzw. Selektion in transformierten Bakterienzellen gestattet.
In bevorzugten Vektoren werden an den Enden der GFP codierenden Sequenz auch multiple Klonierungsstellen (MCS) bereitgestellt, um die Erzeugung von GFP-Fusionsproteinen zu erleichtern. Die MCS sollten in drei unterschiedlichen Leserastern vorliegen, was die Erzeugung von Fusionen mit einer zweckmäßigen Restriktionsstelle im interessierenden Gen im Leseraster gestattet.
Die koordinierte Expression unterschiedlicher Gene vom gleichen Promotor in einem rekombinanten Vektor kann durch Verwendung eines IRES-Elements, wie beispielsweise der internen ribosomalen Eintrittsstelle des Poliovirus-Typ 1 aus pSBC-1 (Dirks et al., 1993), wie unten beschrieben, erreicht werden.
11. Promotoren
Expressionsvektoren umfassen Protein codierende Nukleinsäuresegmente unter der Kontrolle eines oder mehrerer Promotoren. Um eine codierende Sequenz „unter die Kontrolle" eines Promotors zu bringen, positioniert man das 5'-Ende der Transkriptionsinitiationsstelle des Transkriptionsleserasters im allgemeinen zwischen etwa 1 und 50 Nukleotide „stromabwärts" (d.h. 3') vom gewählten Promotor. Der „stromaufwärts" liegende Promotor stimuliert die Transkription der DNA und fördert die Expression des codierten rekombinanten Proteins.
„Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die von dem Syntheseapparat einer Zelle oder vom eingeführten Syntheseapparat erkannt wird und für die Initiation der spezifischen Transkription eines Gens benötigt wird. Der Promotor, wie hier verwendet, sollte in Säuger- und menschlichen Zellen einsetzbar sein. Die Phrasen „einsetzbar" und „Ausüben der Transkriptionskontrolle" bedeuten, daß sich der Promotor in bezug auf die humanisierte gfp-Nukleinsäure in der richtigen Lage und Orientierung befindet, um die RNA-Polymeraseinitiation sowie die Expression des humanisierten Gens zu steuern.
Der zur Expression des humanisierten GFP verwendete Promotor ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. In den angegebenen Beispielen wurde der „immediate early"-Genpromotor des menschlichen Zytomegalievirus (CMV) verwendet (Thomson et al., 1984), der zur konstitutiven Expression des Fremdgens auf hohem Niveau führt. Allerdings ist die Verwendung anderer Virus- und Säugerzellpromotoren, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, ebenso geeignet, um eine Expression des humanisierten gfp-Gens zu erreichen.
Es können eine Reihe von Expressionssystemen auf viraler Basis genutzt werden, wobei beispielsweise allgemein verwendete Promotoren aus Polyomavirus, Adenovirus 2 und SV40 (Simian Virus 40) stammen. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus sind besonders geeignet, da beide leicht aus dem Virus in Form eines Fragments, das auch den viralen S40-Replikationsursprung enthält, gewonnen werden können. Kürzere oder längere SV40-Fragmente können ebenso wie auch die LTR-Sequenz (Long Terminal Repeat) des Rous-Sarcoma-Virus (RSV) verwendet werden.
Durch den Einsatz eines Promotors mit allgemein bekannten Eigenschaften läßt sich das Niveau und Muster der Expression des humanisierten GFP optimieren. So gestattet beispielsweise die Auswahl eines Promotors, der spezifisch in bestimmten Zellarten aktiv ist, eine gewebespezifische Expression. Zu solchen Promotoren gehören beispielsweise der für Darmepithelzellen spezifische Promotor des Gens für das Fettsäure bindende (FAB-) Protein der Leber; der für Pankreaszellen spezifische Insulingenpromotor; die jeweils die spezifische oder bevorzugte Expression in Leberzellen steuernden Promotoren der Gene für Transphyretin, α1-Antitrypsin, Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ I (PAI-1), Apolipoprotein AI und LDL-Rezeptor. Zu den in Hirngeweben aktiven Promotoren gehören der für Oligodendrozyten spezifische MBP (Myelin Basic Protein)-Genpromotor; der für Gliazellen spezifische GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein)-Genpromotor; sowie der für Nervenzellen spezifische NSE (Neural-Specific Enolase)-Promotor.
Weiterhin kann die Auswahl eines Promotors, der als Antwort auf spezifische chemische oder physiologische Signale reguliert wird, eine induzierbare Expression des humanisierten gfp-Gens gestatten. Zu den geeigneten induzierbaren Promotoren gehören beispielsweise die PAI-1, Cytochrom-P450-Genpromotoren, Hitzeschockproteingene und hormoninduzierbare Genpromotoren sowie die durch ionisierende Strahlung induzierbaren fos- und jun-Promotoren.
Wie oben erwähnt, eignen sich induzierbare Promotoren in vivo, beispielsweise zur Gentherapie, und in vitro, bei Screening-Tests. Beim Screening auf das Vorhandensein einer bestimmten Verbindung in einer Zusammensetzung sind als Gruppen induzierbare Promotoren solche, die durch Schwermetalle aktiviert werden (Freedman et al., 1993); Cytochrom-P450-Genpromotoren, die durch eine Reihe toxischer Verbindungen aktiviert werden; Hitzeschockprotein-Genpromotoren (Stringham et al., 1992; Welch, 1993), wie z.B. der hsp70-Promotor, die durch verschiedene Streßsituationen stimuliert werden, geeignet, um einige wenige Beispiele zu nennen.
12. IRES
IRES (Internal Ribosome Binding Sites)-Elemente werden zur Erzeugung multigener oder polycistronischer Message-Nukleinsäuren verwendet. IRES-Elemente sind dazu in der Lage, den ribosomalen Abtastmechanismus der vom 5'-methylierten Cap abhängigen Translation zu umgehen, so daß die Translation an internen Stellen beginnt (Pelletier und Sonenberg, 1988). Es wurden IRES-Elemente aus zwei Mitgliedern der Picanovirusfamilie (Polio- und Encephalomyocarditisvirus) (Pelletier und Sonenberg, 1988) ebenso wie ein IRES aus einer Säuger-Message-Nukleinsäure (Macejak und Sarnow, 1991) beschrieben. Alle der oben genannten Elemente können in einem humanisierten gfp-Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
IRES-Elemente lassen sich mit heterologen offenen Leserastern verknüpfen. Dabei können mehrere offene Leseraster, jeweils durch ein IRES getrennt, zusammen transkribiert werden, wodurch polycistronische Message-Nukleinsäuren entstehen. Aufgrund des IRES-Elements ist jedes offene Leseraster den Ribosomen für eine effiziente Translation zugänglich. Auf diese Weise lassen sich mehrere Gene, von denen eines ein humanisiertes gfp-Gen ist, unter Verwendung eines einzigen Promotor/Enhancer zur Transkription einer einzigen Message-Nukleinsäure effizient exprimieren.
Jedes beliebige heterologe offene Leseraster läßt sich mit IRES-Elementen verknüpfen. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet dies ein beliebiges ausgewähltes Protein, das man exprimieren möchte, sowie ein beliebiges zweites Reportergen (oder selektionierbares Markergen). Selbst die Expression mehrerer Proteine könnte erreicht werden, wobei ein gleichzeitiges Überwachen über die GFP-Produktion erfolgt.
13. AAV-Vektoren
Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist ein attraktives Vektorsystem für die Gentherapie beim Menschen, da es für Menschen apathogen ist, eine hohe Integrationshäufigkeit aufweist und sich nicht teilende Zellen infizieren kann, womit es sich zur Zuführung von Genen in Säugerzellen sowohl in Gewebekultur als auch in ganzen Tieren eignet (Muzyczka, 1992). Kürzliche Untersuchungen konnten zeigen, daß es sich bei AAV um einen potentiell guten Vektor zur Zuführung von Genen handelt (LaFace, et al., 1988; Zhou, et al., 1993; Flotte, et al., 1993; Walsh, et al., 1994). Rekombinante AAV-Vektoren wurden erfolgreich zur in-vitro- und in-vivo-Transduktion von Markergenen (Kaplitt, et al., 1994; Lebkowski, et al., 1988; Samulski, et al., 1989; Shelling und Smith, 1994; Yoder, et al., 1994; Zhou, et al., 1994; Hermonat und Muzyczka, 1984; Tratschin, et al., 1985; McLaughtin, et al., 1988) sowie von an menschlichen Krankheiten beteiligten Genen (Flotte, et al., 1992; Luo, et al., 1994; Ohi, et al., 1990; Walsh, et al., 1992; Wei, et al., 1994) verwendet. Vor kurzem wurde ein AAV-Vektor für Testreihen zur Behandlung der zystischen Fibrose beim Menschen der Phase I zugelassen.
Bei AAV handelt es sich um ein abhängiges Parvovirus, dahingehend, daß es die Koinfektion mit einem weiteren Virus (entweder Adenovirus oder einem Mitglied der Herpesvirus-Familie) benötigt, um eine produktive Infektion in kultivierten Zellen zu durchlaufen (Muzyczka, 1992). In Abwesenheit der Koinfektion mit Helfervirus integriert das Wildtyp-AAV-Genom über seine Enden in das menschliche Chromosom 19, wo es in einem latenten Zustand als Provirus verbleibt (Kotin et al., 1990; Samulski et al., 1991). Allerdings ist rAAV bei der Integration nicht auf Chromosom 19 beschränkt, außer wenn das AAV-Rep-Protein auch exprimiert wird (Shelling und Smith, 1994). Wenn eine ein AAV-Provirus tragende Zelle mit einem Helfervirus superinfiziert, so wird das AAV-Genom aus dem Chromosom oder aus einem rekombinanten Plasmid „gerettet" und eine normale produktive Infektion etabliert (Samulski, et al., 1983; McLaughlin, et al., 1988; Berns, 1990; Kotin, et al., 1990; Muzyczka, 1992). AAV besitzt hinsichtlich der Infektiosität ein breites Wirtsspektrum (Tratschin, et al., 1984; Laughlin, et al., 1986; Lebkowski, et al., 1988; McLaughlin, et al., 1988).
Typischerweise wird ein rekombinantes AAV (rAAV)-Virus durch Kotransfizieren eines das von den beiden terminalen AAV-Wiederholungssequenzen flankierte interessierende Gen enthaltenden Plasmids (siehe z.B. 2B sowie McLaughlin, et al., 1988; Samulski, et al., 1989) und eines die Wildtyp-AAV codierenden Sequenzen ohne die terminalen Wiederholungssequenzen enthaltenden Expressionsplasmids, beispielsweise pIM45 (McCarty, et al., 1991), hergestellt. Die Zellen werden ebenso mit Adenovirus oder mit Plasmiden, die die für die AAV-Helferfunktion benötigten Adenovirusgene tragen, infiziert bzw. transfiziert.
rAAV-Virusstammlösungen, die auf diese Weise hergestellt wurden, sind mit Adenovirus kontaminiert, das von den rAAV-Partikeln physikalisch getrennt werden muß (beispielsweise mittels Cäsiumchloriddichtezentrifugation). Als Alternative könnten die AAV codierenden Bereiche enthaltende Adenovirusvektoren oder die AAV codierenden Bereiche enthaltende Zellinien sowie einige oder alle der Adenovirus-Helfergene verwendet werden (Yang et al., 1994; Clark et al., 1995). Die rAAV-DNA als integriertes Provirus tragenden Zellinien lassen sich ebenso verwenden (Flotte et al., 1995).
rAAV-Vektoren sind in den US-Patenten Nr. 5,139,941 und 4,797,368 beschrieben, die jeweils hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
14. Adenovirusvektoren
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können Adenovirusvektoren und dabei vorzugsweise replikationsdefekte Vektoren verwendet werden. Dies wird beispielsweise durch die Deletion des viralen E1A (Early Region I)-Bereichs erreicht, so daß das Virus nur in Zellen, wie z.B. menschlichen 293-Zellen, die aus ihrem zellulären Genom adenovirale E1A-Gene exprimieren, replikationskompetent ist. Dies ist wichtig, da das Virus daher keine normalen Zellen, die keine frühen Genprodukte exprimieren, abtöten kann. Techniken zur Herstellung replikationsdefekter Adenoviren sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wie beispielsweise bei Ghosh-Choudhury und Graham (1987); McGrory et al. (1988); und Gluzman et al. (1982). Von Rosenfeld et al. (1991; 1992) und Stratford-Perricaudet et al. (1990; 1992) werden auch Verwendungen für Adenoviren beschrieben.
Mit Ausnahme der Forderung, daß der Adenovirusvektor replikationsdefekt ist, wird nicht angenommen, daß die Beschaffenheit des Adenovirusvektors kritisch ist. Das Adenovirus kann zu einem der 42 verschiedenen bekannten Serotypen oder einer der Untergruppen A–F gehören. Adenovirus Typ 5 aus der Untergruppe C ist das bevorzugte Ausgangsmaterial, um den konditional replikationsdefekten Adenovirusvektor zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Dies liegt daran, daß es sich bei Adenovirus Typ 5 um ein menschliches Adenovirus handelt, über das ein großes Ausmaß an biochemischer und genetischer Information bekannt ist, daß es historisch für die meisten Konstruktionen, in denen Adenovirus als Vektor eingesetzt wurde, verwendet wurde und daß es nicht onkogen ist.
Dadurch, daß die Vektoren zur Verwendung in diesen Aspekten replikationsdefekt sind, weisen sie typischerweise keinen adenoviralen E1-Bereich auf. Somit ist es höchst zweckmäßig, das humanisierte gfp-Gen an derjenigen Position einzuführen, aus der die E1 codierenden Sequenzen entfernt wurden. Allerdings ist die Position der Insertion des humanisierten Gens innerhalb der Adenovirussequenzen nicht kritisch. Die humanisierte Transkriptionseinheit kann auch anstelle des deletierten E3-Bereichs in E3-Austauschvektoren inseriert werden, wie bereits von Karlsson et al. (1986) beschrieben.
15. Expressionskits
Humanisierte gfp-Gene umfassende Expressionskits bilden einen weiteren erfindungsgemäßen Aspekt. Derartige Kits enthalten im allgemeinen in geeigneten Behältnissen eine Formulierung eines humanisierten gfp-Gens oder eines zur Expression eines humanisierten gfp-Gens fähigen Vektors. Das Gen oder der Vektor kann in einer pharmazeutisch unbedenklichen Formulierung bereitgestellt werden.
Werden die Komponenten des Kits in einer oder mehreren flüssigen Lösungen bereitgestellt, so handelt es sich bei der flüssigen Lösung um eine wäßrige Lösung, wobei eine sterile wäßrige Lösung besonders bevorzugt ist. Das humanisiertes gfp-Gen bzw. der Vektor kann auch zu einer in eine Spritze aufnehmbare Zusammensetzung formuliert werden. In diesem Fall kann es sich bei dem Behältnis selbst um eine Spritze, Pipette, einen Augentropfer oder andere ähnliche Vorrichtungen, mit der die Formulierung einer Zelle oder einem Bereich des Körpers verabreicht oder in ein Tier injiziert oder mit anderen Komponenten eines Kits zusammengegeben und gemischt wird, handeln.
Die Komponenten des Kits können jedoch als Trockenpulver bereitgestellt werden. Werden Reagentien oder Komponenten in Form eines Trockenpulvers bereitgestellt, so läßt sich das Pulver durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels rekonstituieren. Dabei ist vorgesehen, daß das Lösungsmittel auch in anderen Behältnissen bereitgestellt werden kann.
Zu den Behältnissen gehören im allgemeinen mindestens ein Probenfläschchen, ein Teströhrchen, ein Kolben, eine Flasche, eine Spritze oder andere Behältnisse, in die das humanisierte gfp-Gen oder der Vektor, vorzugsweise in geeigneter Form verteilt, gegeben werden kann. Ebenso kann ein zweites humanisiertes gfp-Gen oder Vektorkonstrukt bereitgestellt werden, wobei der Kit ebenso im allgemeinen ein zweites Probenfläschchen oder einen anderen Behälter, in den dieses gegeben werden kann, enthält. Die Kits können ebenso ein zweites/drittes Behältnis zur Aufnahme eines sterilen, pharmazeutisch unbedenklichen Puffers oder anderen Verdünnungsmittels umfassen.
Die Kits der vorliegenden Erfindung enthalten typischerweise auch ein Behältnis, in dem die für Probenfläschchen für den kommerziellen Verkauf auf engem Raum untergebracht sind, wie beispielsweise Spritzguß- oder blasgeformte Kunststoffbehälter, in denen die gewünschten Probenfläschchen verwahrt werden.
Unabhängig von der Anzahl oder der Art der Behälter können die erfindungsgemäßen Kits auch ein oder mehrere weitere molekularbiologische Reagentien, wie z.B. Restriktionsenzyme, umfassen oder damit abgepackt werden.
16. Rekombinante Expression
Gewünschte Klone können in ein Expressionssystem mit humanisiertem gfp zur rekombinanten Expression eingebaut werden. Man nimmt an, daß auf diese Weise praktisch alle eukaryontischen Expressionssysteme eingesetzt werden können. Durch die Transformation von Wirtszellen mit ein ausgewähltes Protein sowie humanisiertes gfp codierenden DNA-Segmenten wird ein zweckmäßiges Mittel zur Überwachung der Expression bereitgestellt. Dabei eignen sich für die eukaryontische Expression sowohl cDNA- als auch genomische Sequenzen, da die Wirtszelle im allgemeinen die genomischen Transkripte unter Erhalt einer funktionsfähigen mRNA zur Translation in Protein prozessiert.
Allgemein gesagt, kann es zweckmäßiger sein, eine cDNA-Version des Gens als rekombinantes Gen einzusetzen. Dabei wird angenommen, daß die Verwendung einer cDNA-Version Vorteile bietet, und zwar dahingehend, daß die Größe des Gens im allgemeinen wesentlich geringer ist und leichter zur Transfektion der Zielzelle einzusetzen ist als ein genomisches Gen, das typischerweise um bis zu eine Größenordnung länger als das cDNA-Gen ist. Allerdings ist die Möglichkeit eines Einsatzes genomischer Versionen bestimmter Gene nicht ausgeschlossen.
Es wird vorgeschlagen, wie oben angemerkt, daß unterschiedliche Proteine koexprimiert und in der gleichen Zelle unter Verwendung unterschiedlich gefärbter humanisierter GFPs verfolgt werden können. Dies kann dadurch erreicht werden, daß die Zelle mit zwei verschiedenen rekombinanten Vektoren, die jeweils eine Kopie des humanisierten gfp in Verknüpfung mit einer bestimmten Protein codierenden DNA tragen, kotransfiziert wird. Als Alternative kann ein einzelner rekombinanter Vektor konstruiert werden, der beide derartige codierende Bereiche enthält, die dann in mit dem Einzelvektor transfizierten Zellen exprimiert werden könnten.
17. Rekombinante Wirtszellen
Die Begriffe „manipulierte" und „rekombinate" Zellen sollen sich auf eine Zelle beziehen, in die ein exogenes DNA-Segment oder Gen, das eine humanisierte gfp-Gensequenz enthält, eingeführt wurde. Daher sind manipulierte Zellen von natürlich vorkommenden Zellen, die kein rekombinant eingeführtes exogenes DNA-Segment oder Gen enthalten, unterscheidbar. Bei manipulierten Zellen handelt es sich somit um Zellen, die ein Gen oder Gene aufweisen, das bzw. die von menschlicher Hand eingeführt wurde bzw. wurden.
In Dauerkultur wachsende etablierte Zellinien bilden eine Gruppe von Zellen, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Zu solchen Säugerwirtszellinien, die besonders zur Verwendung vorgesehen sind, gehören beispielsweise VERO-Zellen, HeLa-Zellen, CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellinien, COS-Zellen, wie z.B. COS-7-Zellen, W138-, BHK-, HepG2-, 3T3-, RIN-, MDCK-, A549-, PC12-, K562- und 293-Zellen.
Ebenso sind zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung Primärzellinien vorgesehen. Bei Primärzellinien handelt es sich um diejenigen Zellen, die einem tierischen oder menschlichen Individuum entnommen wurden und die über einen beschränkten Zeitraum in Kultur überleben können. Derartige Zellen werden häufig manipuliert, beispielsweise um ein vorteilhaftes Gen einzuführen, und danach in das Tier, aus dem sie ursprünglich erhalten wurden, wiedereingeführt. Diese Technik wird häufig als ex-vivo-Gentherapie bezeichnet.
Zur Verwendung mit den hier offenbarten humanisierten gfp-Genen werden Primärzellen aus allen Wirbeltierspezies in Betracht gezogen, gleichgültig ob sie in den Körper eines Tiers wiedereingeführt werden oder nicht. Dazu gehören, lediglich als Beispiele genannt, Knochenmarkszellen, Nervenzellen, Lungenepithelzellen und Hepatozyten.
Im Körper vorhandene Zellen mit humanisiertem gfp, die zuvor manipuliert wurden, um therapeutische oder gewünschte Agentien zu exprimieren, sezernieren oder in anderer Weise einem tierischen oder menschlichen Individuum zuzuführen, sind ebenso innerhalb der erfindungsgemäßen Zellen umfaßt, gleichgültig ob sie ursprünglich aus dem Tier stammten oder nicht. Bei Zellen, die nicht auf diese Weise von dem letztendlichen Wirtstier gewonnen wurden, kann es sich um Zellen aus einem immunologisch kompatiblen Tier, um Zellen, die immunologisch modifiziert oder unfähig gemacht wurden, um Zellen, die innerhalb einer halbdurchlässigen Vorrichtung im Wirtstier geschützt sind, und selbst um weitgehend unmodifizierte Zellen, die eine vorübergehende Lebensdauer in dem Wirtstier besitzen sollen, handeln.
Selbstverständlich versteht es sich, daß, da sich die vorliegende Erfindung gut zur Verwendung bei direkteren gentherapeutischen Verfahren eignet, eine beliebige Zielzelle des Körpers ein wie in der vorliegenden Erfindung beschriebenes humanisiertes gfp-Gen enthalten kann. Es ist vorgesehen, daß alle diese Zellen unter die Beschreibung einer „rekombinanten Wirtszelle", wie sie hier verwendet wird, fallen. Dazu gehören alle Zellen in einem tierischen oder menschlichen Individuum, die eine oder mehrere Kopien eines humanisierten gfp-Gens oder Vektors, unabhängig von der Art und Weise, in der die Zelle das Gen erhält, beispielsweise durch Transfektion, Infektion und dergleichen, umfassen. Auf diese Weise sind erkrankte Zellen, Mängel aufweisende Zellen und gesunde Zellen allesamt erfindungsgemäß umfaßt.
18. Klonierung weiterer gfp-Gene
Ebenso ist vorgesehen, daß gfp-Gene aus anderen Organismen kloniert werden können. Diese können verbesserte oder sonstwie wünschenswerte Spektraleigenschaften aufweisen und können dann gemäß der vorliegenden Erfindung humanisiert werden.
Die Klonierung eines für ein GFP-ähnliches Protein aus einem anderen Organismus codierenden DNA-Moleküls würde einfach ein Screening einer DNA-Bibliothek, um ein spezifisches DNA-Molekül zu erhalten, sowie dessen Reinigung, um es von anderen DNA-Anteilen unterscheidbar zu machen, erfordern. Der erste Schritt in derartigen Klonierungsverfahren besteht im Screening einer geeigneten DNA-Bibliothek. Bei dem Screening-Verfahren kann es sich um eine Expressionsscreening-Vorschrift, wobei beispielsweise gegen das GFP-Protein gerichtete Antikörper eingesetzt werden, oder um auf Fluoreszenz basierende Aktivitätstests handeln.
Alternativ kann das Screening auf der Hybridisierung von Oligonukleotidsonden, die aus einer Betrachtung von Anteilen der bekannten gfp-DNA-Sequenzen konstruiert werden, beruhen. Die Ausführung solcher Screening-Vorschriften sind dem Fachmann allgemein bekannt und ausführlich in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben, beispielsweise bei Sambrook et al. (1989), hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen zu demonstrieren. Dabei sollte dem Fachmann ersichtlich sein, daß es sich bei den in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken um Techniken handelt, bei denen von den Erfindern festgestellt wurde, daß sie bei der Praktizierung der Erfindung gut funktionieren und somit als bevorzugte Moden für ihre Praktizierung betrachtet werden können. Allerdings sollte dem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung ersichtlich sein, daß in den spezifischen offenbarten Ausführungsformen viele Änderungen vorgenommen werden können und dennoch ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erzielt werden kann, ohne daß dabei vom Geist und Umfang der Erfindung abgewichen wird.
BEISPIEL I
Geringe Expression von Qualle-GFP in 293-Zellen
In diesem Beispiel werden Versuche zur Verwendung von rekombinantem AAV (rAAV), das ein Qualle-gfp10-Reportergen exprimiert, bei der Transfektion und Expression in 293-Zellen beschrieben.
Erzeugung von AAV-Vektoren und Wildtyp gfp exprimierendem rAAV
Adeno-assoziiertes Virus (AAV) findet heute als Vektor zur Zuführung von Genen in unterschiedliche Zellarten breite Verwendung. Die Verwendung von AAV weist viele Vorteile auf, einschließlich dem offensichtlichen Fehlen von Pathogenität, der hohen Lebensfähigkeit des Virions, der stellenspezifischen Integration, der Langzeitexpression des zugeführten Gens und der relativen Unabhängigkeit der Infektiösität von der Replikation des Wirtschromosoms und dem Zellzyklus.
Ein Nachteil von AAV besteht in einer beschränkten Verpackungsgröße der viralen DNA, die nicht mehr als 5000 Nukleotide betragen kann. Die meisten zur Zeit erhältlichen AAV-Vektoren tragen das eine oder andere Reportergen, nämlich E. coli-β-Galactosidase und Neomycinphosphotransferase. Diese Reportergene sind beide ziemlich sperrig und beanspruchen einen zu großen Teil des beschränkten Platzes des AAV-Genoms. Die Nachweisvorschriften für die Genprodukte sind umständlich und mühselig.
Dieser Abschnitt beschreibt die Konstruktion eines rekombinanten AAV-Vektorplasmids, pTR_BS-UF (2A), das sowohl das Qualle-gfp10-Gen als auch das neoR-Gen trug. Das Plasmid TU#65 (Ward et al., 1994) wurde als Quelle für die gfp10 codierende Sequenz verwendet, wobei das Gen unter die Kontrolle des „immediate early" CMV-Promotors gestellt wurde. Ein schematisches Diagramm zur Herstellung des Vektors ist in 2B gezeigt.
Kurz gesagt, wurde die gfp10-Sequenz nach Verdauen des Ausgangsplasmids TU#65 (Chalfie et al., 1994) mit AgeI und EcoRI, Auffüllen der Enden mit Klenow-Fragment und Hinzugeben von NotI-Linkern in die NotI-Stelle von pCMVβ (Clontech) subkloniert. Das erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pCMVgreen wurde dann als Matrize in einer PCR-Reaktion zur Amplifikation der den CMV-Promotor, das SV40-Intron, die gfp10-cDNA sowie das SV40-Polyadenylierungssignal enthaltenden Transkriptionskassette verwendet.
Der stromaufwärts liegende, zum CMV-Promotor komplementäre PCR-Primer enthielt ebenso einen Überhang, der die BglII-, EcoRI- und KpnI-Stellen enthielt. Der stromabwärts liegende PCR-Primer, der zum Polyadenylierungssignal komplementär ist, enthielt einen Überhang mit einer SalI-Stelle. In einer weiteren PCR-Reaktion wurde unter Verwendung des Plasmids pRc/CMV (Invitrogen) als Matrize das Polyadenylierungssignal des Gens für Rinderwachstumshormon (bovine Growth Hormone, bGH) amplifiziert. Der stromaufwärts liegende Primer in dieser Reaktion enthielt einen Sequenzüberhang mit einer SalI-Stelle und der stromabwärts liegende Primer eine BglII-Stelle.
Nach Reinigung der PCR-Produkte auf einem 1%igen Agarosegel wurden die jeweiligen Fragmente mit SalI verdaut und über die freiliegenden SalI-Enden miteinander ligiert. Das Ligationsprodukt wurde über ein Gel gereinigt und mit BglII verdaut. Das 160 Bp große BglII-PstI-Fragment, das die terminale AAV-Wiederholungssequenz enthielt, wurde durch Gelreinigung aus dem Plasmid pTRBR (+) (Ryan et al., 1995) isoliert. Dieses Fragment war aus dem bereits beschriebenen Plasmid dl3-94 (McLaughlin et al., 1988) in pTR_BR(+) subkloniert worden. Es wurde dann mit beiden Enden der mit BglII verdauten Kassette, die den CMV-Promotor, das SV40-Intron, die gfp10-cDNA, SV40-Poly(A) und bPH-Poly(A) enthielt, ligiert.
Das Ligationsprodukt wurde dann mit PstI geschnitten und in das Plasmid pBS(+) (Stratagene), das durch Umwandeln der PvuII-Stellen bei 766 und 1148 in PstI-Stellen durch Addition von PstI-Linkern und Deletion des internen 382 Bp großen Fragments, das den Polylinkerbereich enthielt, modifiziert worden war, subkloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pTRgreen bezeichnet.
Die vom HSV-Thymidinkinase-Genpromotor und dem Enhancer aus Polyomavirus gesteuerte neo-Resistenzgenkassette wurde aus dem Plasmid pMClneo (Stratagene) erhalten, indem das Plasmid mit XhoI geschnitten, das Ende mit Klenow aufgefüllt, eine Addition mit SalI-Linkern durchgeführt und mit SalI verdaut wurde. Das die neo-Kassette enthaltende DNA-Fragment wurde über ein Gel gereinigt und in die SalI-Stelle des mit SalI verdauten pTRgreen subkloniert. Das erhaltene Konstrukt pTR_BS-UF ist in 2A gezeigt.
Zur Erzeugung von rekombinantem AAV (rAAV)-Virus wurden 293-Zellen mit PTR_BS-UF sowie dem Helferplasmid pIM45, das das wt-AAV-Genom ohne terminale Wiederholungssequenzen trägt (McCarty et al., 1991), kotransfiziert. Die gleichen Zellen wurden auch mit Adenovirus bei einem m.o.i. (multiplicity of infection)-Wert von 10 infiziert.
Rekombinantes AAV wurde nach 60 h durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen der Zellen, 30-minütige Hitzeinaktivierung von Ad bei 56°C, Herunterzentrifugieren der Zelltrümmer sowie Reinigung des Virus über einen CsCl-Gradienten (1,40 g/ml), der sich bei 200000 g über 48 Std. in einem SW41- Rotor ausbildete, geerntet. Der Gradient wurde fraktioniert und die Dichte durch Refraktometrie bestimmt. Fraktionen mit Dichten zwischen 1,38 und 1,4 g/cm³ wurden vereinigt und gegen DMEM-Medium 4 h dialysiert. Der AAV-Titer wurde mit dem „Infectious Center"-Test bestimmt (McLaughlin et al., 1988).
Wildtyp-gfp-Expression auf niedrigem Niveau
Bei der Transfektion von pTR_BS-UF-Plasmid-DNA in 293-Zellen betrug die durchschnittliche Anzahl an GFP exprimierenden Zellen üblicherweise weniger als 5% (3). Weiterhin wurden mit dem rekombinanten, die gleiche GFP-Expressionskassette tragenden AAV infizierte 293-Zellen wiederholt als GFP-Negative registriert. Der einzige Unterschied zwischen diesen beiden Untersuchungen bestand offensichtlich in der Anzahl der jeder Zelle jeweils zugeführten GFP-cDNAs. Während der Transfektion werden Hunderte oder sogar Tausende von Plasmidkopien zugeführt, während eine Infektion unter den Bedingungen eines niedrigen m.o.i.-Werts (weniger als 1) nur eine einzige Kopie eines Gens zuführt.
Somit wurde von den Erfindern festgestellt, daß die gfp10-cDNA, wie sie ursprünglich von Chalfie et al. (1994) beschrieben wurde, bei Expression in Primaten- und menschlichen Zellen einen schlechten Reporter darstellte. Es war klar, daß neue Techniken erforderlich waren, durch die die Expression von gfp10 in Säuger- und menschlichen Zellen verbessert werden könnte.
BEISPIEL II
Versuche zur Erhöhung der GFP-Expression in menschlichen Zellen
Das vorliegende Beispiel beschreibt verschiedene Verfahren, die in einem Versuch, die Expression von gfp10 in Säuger- und menschlichen Zellen zu erhöhen, verwendet werden könnten.
Es gibt mehrere mögliche Wege, die Menge an gewünschtem Genprodukt, das unter der Kontrolle eines gegebenen Promotors steht, zu erhöhen. Eines dieser Verfahren besteht darin, daß man versucht, die Stabilität von mRNA durch Einführung einer Intronsequenz, die die prä-mRNA über Protein/RNA-Wechselwirkungen und -Transport in den Prozessierungs-/Spleißweg steuert, zu erhöhen.
Die GFP-Expressionskassette der Erfinder der vorliegenden Anmeldung enthielt die Sequenz des 16S/19S-Spleißdonor/Spleißakzeptor-Signals des späten SV40-Gens (1B). Diese Sequenz wird zwar häufig in der Literatur verwendet, doch können ihre Wirkungen variabel und genspezifisch sein. Die Erfinder kamen somit zu dem Schluß, daß diese Technik allein nicht zu einem signifikanten Anstieg der „OFF"-Expression in menschlichen Zellen führen würde.
Es ist ebenso vorstellbar, die Stabilität eines Fremdproteins zu erhöhen, indem es mit einer weiteren Protein- oder Polypeptiddomäne fusioniert wird. Diesbezüglich sind Vektoren erhältlich, die die Fusion der Qualle-Sequenz an einen zweiten codierenden Bereich gestatten. Es wurde jedoch von den Erfindern nicht angenommen, daß dies die Defekte der gfp-Sequenz angemessen kompensieren würde.
Ein weiterer möglicher Weg zur Erhöhung der Proteinausbeute besteht in der Maximierung der Translationseffizienz durch Einführung von Sequenzen, die die Translationsinitiation eukaryontischer mRNA erleichtern. Eine solche Sequenz, die unmittelbar vor dem AUG-Startcodon liegt, ist die Kozak-Konsensussequenz (GCC)GCCA/GCCATG (SEQ ID NO: 8; Kozak, 1987)). Darüber hinaus könnte eine optimal positionierte, etwa 14 Nukleotide stromabwärts des AUG-Codons lokalisierte, „Stem-Loop"-Haarnadelstruktur verwendet werden (Kozak, 1990).
Allerdings sind Untersuchungen bekannt, bei denen eine stromaufwärts von gfp10 plazierte Kozak-Sequenz zu keiner signifikanten Änderung der Expressionseffizienz führte. Daher scheint, trotz der allgemeinen Eignung der Kozak-Sequenz sowie der spezifischen Vorschläge aus dem Stand der Technik zur Verwendung der Kozak-Sequenz in Verbindung mit gfp (siehe z.B. PCT-Anmeldung WO 95/07463), die Einführung der Kozak-Sequenz stromaufwärts von gfp10 nicht besonders erfolgreich gewesen zu sein.
Die Erfinder kamen zu dem Schluß, daß jegliche Erhöhung der Initiation, die von der Kozak-Sequenz geboten werden könnte, zu keiner signifikanten Erhöhung der gfp10-Expression führen würde, da die Translation immer noch eingeschränkt wäre. Man nahm an, daß dieser Nachteil die Eignung der Kozak-Sequenz allein stark einschränken würde, obwohl in Betracht gezogen wurde, daß sich aus einer Kombination der Kozak-Sequenz mit einem weiteren, auf die Lösung des Translationseffizienzproblems gerichteten Verfahren Vorteile ergeben könnten.
BEISPIEL III
Konstruktion von humanisiertem GFP
Angesichts des Versagens der oben genannten allgemein verwendeten Techniken bei der Verbesserung der GFP-Expression in Säugerzellen, wurde von den Erfindern die Hypothese aufgestellt, daß einer der wichtigen Gründe für die niedrige GFP-Expression in solchen Zellen in der schlechten Translationseffizienz der mRNA im Zellmilieu bestand. Das vorliegende Beispiel beschreibt die Konstruktion eines humanisierten GFP zur Verwendung beim Erzielen einer erhöhten GFP-Expression in Säuger- und menschlichen Zellen.
Die niedrige Expression von Proteinen kann das Ergebnis einer schlechten Translationseffizienz einer mRNA-Spezies in bestimmten Zellen sein. So ist beispielsweise das menschliche Zellmilieu durch einen bestimmten Satz von Isoakzeptor-tRNAs gekennzeichnet, die in anderen Spezies unterschiedlich sind. Es ist in der Tat allgemein bekannt, daß die Wahl synonymer Codons sowohl in prokaryontischen als auch eukaryontischen Genen eine starke Tendenz zeigt. Außerdem gibt es deutliche Unterschiede bei der Codonverwendung zwischen verschiedenen Genen der gleichen oder taxonomisch verwandter Organismen, unabhängig von den Funktionen der Gene oder den Unterschieden zwischen den Genen (selbst zwischen solchen, die einander entsprechende Proteine codieren) taxonomisch entfernter Organismen (Grantham et al., 1991; Ikemura, 1980; Ikemura et al., 1981).
Die Unterschiede in den Codonwahlmustern zwischen den Organismen wurden Unterschieden in den eigentlichen Populationen der Isoakzeptor-tRNAs sowie Unterschieden in modifizierten Nukleotiden in der Anticodon-„Wobble"-Position zugeschrieben (Ikemura et al., 1981; Ikemura et al., 1982). Die gewählten synonymen Codons haben keinen Einfluß auf die Beschaffenheit des synthetisierten Proteins, können aber mit der Expressivität des Gens in Verbindung stehen (Bennetzen und Hall, 1982; Ikemura et al., 1981; Ikemura et al., 1981; Ikemura et al., 1982). Das Ausmaß der Korrelation zwischen der Codonverwendung und dem tRNA-Gehalt steht, wie festgestellt wurde, mit den Produktionsniveaus individueller Gene in Verbindung.
Daher wurde von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung die Häufigkeit der verwendeten Codons des Qualle-gfp10 untersucht und mit dem Durchschnittsmittel der addierten Werte für 1490 menschliche Gene verglichen (Wada et al., 1990). Eine Analyse der Sequenz der gfp10-cDNA zeigte, daß die Häufigkeit der in diesem Qualle-Gen verwendeten Codons sich von den im menschlichen Genom vorherrschenden Häufigkeiten ziemlich deutlich unterscheidet. So werden beispielsweise Leu-Aminosäurereste in den Positionen 18, 53, 125, 178, 195 und 236; Ser in Position 208; und Val in Positionen 93, 150 und 224 des Qualle-GFP (SEQ ID NO: 2) von Triplets codiert, die fast nie in menschlichen Genen verwendet werden (Codons in SEQ ID NO: 1). Der Rest der Aminosäuren zeigt ebenfalls eine Tendenz, die sich von den menschlichen Aminosäuren unterscheidet, obwohl dies nicht so dramatisch ist.
Daher wurde von den Erfindern aufgrund ihrer Schlußfolgerung, daß die für das Qualle-GFP codierende mRNA mit niedriger Effizienz in einem menschlichen Zellsystem translatiert wird, was zu unzureichenden Mengen des Proteins für den optischen Fluoreszenznachweis führt, eine synthetische Version des Qualle-gfp10 konstruiert. Bei dieser synthetischen, oder humanisierten, gfp10-Version wurden im menschlichen Genom bevorzugt verwendete Codons eingefügt, um diejenigen im ursprünglichen gfp10 vorhandenen Codons, die selten oder weniger häufig verwendet werden, zu ersetzen.
BEISPIEL IV
Konstruktion des humanisierten GFP-Gens und von Vektoren
Dieses Beispiel beschreibt die Produktion eines humanisierten GFP zur Verwendung bei der erhöhten Expression in Säuger- und menschlichen Zellen, wobei die Ergebnisse der in Beispiel III beschriebenen Analysen verwendet werden.
Insgesamt 92 Basensubstitutionen wurden in 88 Codons durchgeführt, ohne daß dabei die Aminosäuresequenz geändert wurde (1). Darüber hinaus wurde die in pTR_BS-UF1 unmittelbar vor dem Startcodon für das GFP-Protein liegende Sequenz unter Erhalt einer Kozak-Konsensussequenz modifiziert. Ebenso wurde das Codon 80 in einen Wildtyp-Glutaminrest (Prasher et al., 1992), im Vergleich zu Arginin, wie von Chalfie et al. (1994) beschrieben, zurückverwandelt. Dieses Konstrukt mit der Bezeichnung pTR_BS-UF1 wurde wie folgt hergestellt.
Die gfp-cDNA wurde durch den Zusammenbau synthetischer Oligonukleotide mit gegenseitigem Priming synthetisiert (siehe 1). Das gfp10-Gen wurde in 8 Segmente von ungefähr gleicher Länge geteilt, und es wurden 4 Paar Oligonukleotide synthetisiert, wobei jedes Paar aus zwei überlappenden Oligos mit einem kurzen Überlappungsabschnitt (3, unterstrichen) bestand und ein Oligo für den Sense-Strang und das andere für den Antisense-Strang codierte. Nach dem Aneinanderfügen und der Verlängerung mit Sequenase wurden die Paare 1 und 2 mit EaeI verdaut, wohingegen die Paare 3 und 4 mit BamHI verdaut wurden. Die verdauten Produkte wurden dann in zwei getrennten Reaktionen ligiert: Oligo 1 mit Oligo 2 und Oligo 3 mit Oligo 4. Ligationsprodukte der gewünschten Länge wurden auf einem 5% Polyacrylamidgel unter nichtdenaturierenden Bedingungen gereinigt. Beide DNA-Fragmente wurden dann mit EcoRII verdaut und miteinander ligiert.
Das Endprodukt wurde in einer PCR^TM-Reaktion unter Verwendung eines Paars von Oligonukleotiden, die teilweise komplementär zur humanisierten gfp cDNA (siehe unten, fettgedruckte Buchstaben) sind und die Restriktionsstellen NotI, XbaI und HindIII (siehe unten, unterstrichen) zur Klonierung enthalten, amplifiziert. Die Sequenz des stromaufwärts liegenden Primers, die eine Kozak-Konsensussequenz enthielt (Kozak, 1987), bzw. die des stromabwärts liegenden Primers sind nachfolgend gezeigt:
5'-TGCTCTAGAGCGGCCGCCGCCACCATGAGCAAGGGCGAGGAACTG-3' (SEQ ID NO: 9);
5'-CGGAAGCTTGCGGCCGCTCACTTGTACAGCTCGTCCAT-3' (SEQ ID NO: 14).
Nach Verdauung des PCR-Produkts mit XbaI und HindIII, wurde das DNA-Fragment in pBS(+)(Stratagene) kloniert und sequenziert. Dabei wurden mehrere unabhängige Klone isoliert und sequenziert. Diese Klone wiesen Mutationen in der codierenden Sequenz auf, die vermutlich entweder während der PCR-Amplifikation stattgefunden hatten oder in den Oligonukleotiden vorhanden waren. Teile dieser Klone wurden dann unter Erhalt des endgültigen gfp_h-Gens, das eine Wildtyp-Aminosäuresequenz enthielt, zusammengespleißt. Die erhaltenen Konstrukte wurden mit pBS-GFP_H1 bezeichnet und enthielten die codierende Sequenz für Wildtyp-GFP.
Zur Konstruktion von pTR_BS-UF 1 wurde von den Erfindern das NotI-Fragment von pTR_BS-UF durch das NotI-Fragment von pBS-GFP_H1 (Wildtyp) substituiert (2A).
Zur Erzeugung von rekombinantem AAV (rAAV)-Virus wurden 293-Zellen mit pTR_BS-UF1 sowie dem Helferplasmid pIM45, das das wt-AAV-Genom ohne terminale Wiederholungssequenzen trägt (McCarty et al., 1991), kotransfiziert. Die gleichen Zellen wurden auch mit Adenovirus bei einem m.o.i. (multiplicity of infection)-Wert von 10 infiziert.
Rekombinantes AAV wurde nach 60 h durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen der Zellen, 30-minütige Hitzeinaktivierung von Ad bei 56°C, Herunterzentrifugieren der Zelltrümmer sowie Reinigung des Virus über einen CsCl-Gradienten (1,40 g/ml), der sich bei 200000 g über 48 Std. in einem SW41-Rotor ausbildete, geerntet. Der Gradient wurde fraktioniert und die Dichte durch Refraktometrie bestimmt. Fraktionen mit Dichten zwischen 1,38 und 1,4 g/cm³ wurden vereinigt und gegen DMEM-Medium 4 h dialysiert. Der AAV-Titer wurde mit dem „Infectious Center"-Test bestimmt (McLaughlin et al., 1988).
BEISPIEL V
Konstruktion humanisierter GFP-Varianten und rAAV-Vektoren
Dieses Beispiel beschreibt die Produktion weiterer humanisierter GFP-Sequenzen, die für GFP-Proteinvarianten mit gegenüber dem Wildtypprotein unterschiedlichen Eigenschaften codieren. Die Varianten weisen ebenso eine erhöhte Expression in Säuger- und menschlichen Zellen auf.
Zwei Mutanten wurden mittels stellengerichteter PCR^TM-Mutagenese in pBS-GFP_h-Hintergrund konstruiert. Eine erste humanisierte Mutante spiegelt die Proteinsequenz wider, die von Heim et al. (1995) bei ihrer Beschreibung einer Substitution von Ser65 zu Thr65, durch die sich die Fluoreszenzausbeute im Zusammenhang mit der ursprünglichen Qualle-Codonsequenz erhöhte, angegeben wurde. Von den Erfindern wurde der Schluß gezogen, daß diese Mutation im Zusammenhang mit der humanisierten pTR_BS-UF-Sequenz sogar noch effektiver sein könnte, und diese Punktmutation im pTR_BS-UF1-Hintergrund unter Erhalt des Plasmids TRS_BS-UF2 reproduziert.
Als weiterer Schritt zur Bereitstellung einer verbesserten Fluoreszenz wurde eine zusätzliche Mutation unter Erhalt einer „verbesserten" grünen Version von hGFP durchgeführt. Zusätzlich zur Substitution von Ser65 zu Thr65 wurde Phe64 durch Leu substituiert. Das verbesserte hGFP war somit mit Leu64 anstelle von Phe64 substituiert, wobei das Phe codierende TTC zu CTG umgewandelt und auch das durch TCT codierte Ser65 zum durch ACC codierten Thr umgewandelt wurde.
Eine weitere Punktmutation, Tyr66 zu His66, die zu einer blauen Fluoreszenz führte (Heim et al., 1994), wurde ebenso in den humanisierten Hintergrund von pTR_BS-UF1 unter Erhalt des Vektors pTR_BS-UFB eingebaut.
Durch die weitere Umwandlung von Tyr145 zu Phe145 zusätzlich zu der Mutation Tyr 66 zu His66 wurde eine „verbesserte" blaue Version erzeugt. Bei den Basenumwandlungen handelte es sich um TAT zu TTC bzw. TAT zu CAT.
Die modifizierten Versionen von bGFP weisen einen weiten Anwendungsbereich auf, insbesondere bei der Verwendung verbesserter Versionen der unterschiedlichen Farben. Mutiertes GFP und BFP (blau fluoreszierendes Protein) weisen unterschiedliche Exzitations- und Emissionsspektren ohne Überlappung auf, wodurch ein unabhängiger Nachweis gestattet ist. Das Doppel-Tag-Verfahren gestattet die schnelle und spezifische Identifizierung von Zellen, die eines der beiden oder eines von mehreren fluoreszenzmarkierten Proteinen exprimieren. Solche Verfahren sind beispielsweise beim Arzneistoff-Screening oder bei der Analyse von Agentien, die ein unter die Kontrolle eines konstitutiven Promotors gestelltes Zielgen beeinflussen, anwendbar. Zu den Anwendungen kann auch die Untersuchung der Genexpression unter verschiedenen Stimuli oder ihrer Beeinflussung durch Inhibitoren gehören.
Zur Erzeugung der Mutanten wurden PCR^TM-Reaktionen durchgeführt, wobei als Matrize pBS-GFP1 sowie ein wie unten definiertes Oligopaar verwendet wurden:
Für GFP2:

#1: Stromaufwärts-Primer; wie in Beispiel IV beschrieben;
#2: 5'-GCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGCAGTGCACGCCATACCAGAAGGTAG-3' (SEQ ID NO): 11);

Für GFPB:

#1: Stromaufwärts-Primer; wie in Beispiel IV beschrieben;
#2: 5'-GCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGCACTGCACGCCATGAGAGAAGGTAG-3' (SEQ ID NO: 12)

Zur Herstellung der Mutanten wurde das PCR^TM-Produkt mit NdeI und XbaI verdaut und zur Substitution des entsprechenden Fragments von pBS-GFP1 verwendet. Die Sequenz wurde durch Sequenzieren des die Mutante GFP-cDNA enthaltenden NotI-Fragments bestätigt, mit dem das NotI-Fragment in pTR-UF1 substituiert wurde.
Obwohl nicht angenommen wird, daß dadurch die Expression beeinflußt wird, wurde in den Mutanten des humanisierten GFP von den Erfindern wiederum das Codon 80 zurück in einen Wildtyp-Glutaminrest (Prasher et al., 1992), im Vergleich zu Arginin, wie es von Chalfie et al. (1994) beschrieben ist, zurückverwandelt.
Zur Konstruktion von pTR_BS-UF2 oder pTR_BS-UFB wurde von den Erfindern das NotI-Fragment von pTR_BS-UF (2a) durch das NotI-Fragment von pBS-GFP_H2 (Thr₆₅) bzw. pBS-GFP_HB (His₆₆) substituiert. Alle DNA-Fragmente, bei denen eine PCR-Amplifikation durchgeführt wurde, wurden zur Bestätigung der Identität der ursprünglichen Sequenz sequenziert.
Zur Konstruktion von pTR_BS-UF3, wurde die EcoRI-Stelle des Plasmids pSBC-1 (Dirks et al., 1993) nach Verdauung mit EcoRI, Auffüllen des 5'-Übergangs mit Klenow-Polymerase und Ligation von NotI-Linkern in eine NotI-Stelle umgewandelt. Das aus einem Polylinker und dem IRES (Internal Ribosome Entry Site)-Element des Typ-1-Poliovirus bestehende 680 Bp große NotI-Fragment wurde dann in eine der NotI-Stellen von pTR_BS-UF2 (2A) subkloniert.
Zur Erzeugung von rekombinantem AAV (rAAV)-Virus wurden 293-Zellen mit pTR_BS-UF2 oder pTR_BS-UF3 transfiziert sowie mit dem Helferplasmid pIM45, das das wt-AAV-Genom ohne terminale Wiederholungssequenzen trägt (McCarty et al., 1991), kotransfiziert. Die gleichen Zellen wurden auch mit Adenovirus bei einem m.o.i. (multiplicity of infection)-Wert von 10 infiziert.
Rekombinantes AAV wurden nach 60 h durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen der Zellen, 30-minütige Hitzeinaktivierung von Ad bei 56°C, Herunterzentrifugieren der Zelltrümmer sowie Reinigung des Virus über einen CsCl-Gradienten (1,40 g/ml), der sich bei 200000 g über 48 Std. in einem SW41-Rotor ausbildete, geerntet. Der Gradient wurde fraktioniert und die Dichte durch Refraktometrie bestimmt. Fraktionen mit Dichten zwischen 1,38 und 1,4 g/cm³ wurden vereinigt und gegen DMEM-Medium 4 h dialysiert. Der AAV-Titer wurde mit dem „Infectious Center"-Test bestimmt (McLaughlin et al., 1988).
BEISPIEL VI
Erhöhte Expression von humanisiertem GFP
Das vorliegende Beispiel beschreibt die erhöhte GFP-Expression als Ergebnis der Expression des humanisierten GFP in 293-Zellen.
Um die Expressionseffizienz der humanisierten gfp-Konstrukte mit der ursprünglichen Qualle-Sequenz zu vergleichen, wurden von den Erfindern 293-Zellen mit verschiedenen DNA-Konzentrationen des Plasmids pTR_BS-UF, pTR_BS-UF1, oder pTR_BS-UF2 transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden dann 36 Std. nach der Transfektion mittels FACS analysiert (3).
Zur Verfolgung der Fluoreszenz wurden 293-Zellen mit CsCl-gereinigtem rAAV-GFP_H2 bei einem M. O. I.-Wert von 10 infiziert. 36 Std. nach der Infektion wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem CHROMA-Filter Cube #41014 GFP-HQ (Exzitation bei 450 +/– 25 nm) photographiert. Als Alternative wurde nach der Infektion mit einem M. O. I.-Wert von 1 und der Selektion mit G418 über zwei Wochen von drei unabhängigen Beobachtern die Anzahl an grün fluoreszierenden Zellen unter den G418-Kolonien mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Dabei wurde der Mittelwert der von den drei Beobachtern festgestellten Häufigkeiten berechnet. Für jede Viruspräparation, rAAV-GFP_J, rAAV-GFP_H1 und rAAV-GFP_H2 wurden jeweils mindestens 11500 Zellen in 150 separaten Kolonien gewertet.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, daß das die humanisierte gfp-Sequenz tragende pTR_BS-UF1 durchweg eine 5–10mal höhere Anzahl an als positiv für grüne Fluoreszenz gewerteten Zellen als die Qualle-Sequenz produzierte. Durch die Punktmutation in pTR_BS-UF2 stieg die Anzahl der fluoreszierenden Zellen gegenüber pTR_BS-UF1 um nochmal das 5–10fache.
Bei relativ geringen Plasmid-DNA-Konzentrationen bestand ein mehr als 70facher Unterschied zwischen pTR_BS-UF2 und pTR_BS-UF. Bei höheren Konzentrationen an transfizierter Plasmid-DNA war der Unterschied in der Anzahl der GFP exprimierenden Zellen geringer. Dieses Ergebnis stimmte mit dem Gedanken überein, daß die Unfähigkeit, die Qualle-gfp-Sequenz zu translatieren, teilweise durch Erhöhung der Genkopienzahl überwunden werden könnte.
Um zu bestimmen, ob die modifizierte gfp-cDNA nun zum Nachweis des Markergens bei einer niedrigen Genkopienzahl ausreichte, wurden von den Erfindern rekombinante AAV-Viren durch Verpacken und Verwendung der drei gfp-Konstrukte (UF, UF1 und UF2) isoliert und zur Transduktion des gfp-Markers in 293-Zellen mittels Virusinfektion verwendet. Während fast keine nachweisbare GFP-Expression von einem die gfp10-cDNA tragenden Virus (rAAV-GFP_J) vorlag, konnten mit einem das humanisierte gfp_h-Gen tragenden Virus (rAAV-GFP_H1 oder rAAV-GFP_H2) infizierte Zellen leicht entweder optisch (4A und 4B) oder mittels FACS-Analyse nachgewiesen werden. Die FACS-Analyse wurde ausgeführt, indem transfizierte 293-Zellen geerntet und in einem zum FITC-Nachweis bei einer Exzitationswellenlänge von 488 nm ausgerüsteten Durchflußzytometer (Becton-Dickinson) analysiert wurden. Bei einem hohen M. O. I.-Wert (ungefähr 20) wurde für rAAV-GFP_H2 ein Anteil infizierter Zellen, gewertet als Fluoreszenzpositiv mittels FACS, von 70% erreicht.
Um die relative Effizienz der unterschiedlichen gfp-Konstrukte genauer zu bestimmen, wurden bei niedriger Multiplizität (MOI: 1) mit rAAV-GFP_J, rAAV-GFP_H1 oder rAAV-GFP_H2 infizierte 293-Zellen zunächst auf die Expression des zweiten Reportergens neoR selektioniert. Von den Erfindern und in weiteren Arbeiten (Cheung et al., 1980; Laughlin et al., 1986; McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989) konnte gezeigt werden, daß durch ein rekombinantes AAV-neoR-Virus transduzierte G418-resistente Kolonien im Durchschnitt 2–3 Kopien des in die Wirts-DNA integrierten rekombinanten Virusgenoms enthalten.
293-Zellen wurden mit rAAV-GFP-Virus stabil transduziert und über zwei Wochen auf G418-Resistenz (200 mg/ml) selektioniert. Resistente Kolonien wurden trypsinisiert, vereinigt (jeweils mindestens 1000 Kolonien für rAAV-GFP_J, rAAV-GFP_H1 und rAAV-GFP_H2), in OPTI-MEM-Medium resuspendiert und mittels FACS wie oben analysiert.
Nichtinifizierte 293-Zellen weisen keinerlei grün fluoreszierende Zellen auf. Nach 2 Wochen Selektion wurde festgestellt, daß ungefähr 11% der mit UF1 transduzierten und 23% der mit UF2 transduzierten G418-resistenten Zellen auch GFP exprimierten, wie mittels Fluoreszenzmikroskopie beurteilt wurde. Das optische Muster der GFP-Expression war fleckig, wobei die Anzahl der grünen Zellen pro Kolonie von 1% bis etwa 100% reichte (5A, 5B, 5C und 5D). Im Gegensatz dazu waren lediglich 0,5% der das Qualle-GFP codierende rAAV-GFP_J-Provirus enthaltenden G418-resistenten Zellen fluoreszierend.
Somit wurde durch die Optimierung der Codonverwendung im gfp-Gen das Nachweisniveau bei geringer Kopienzahl um ungefähr das 22fache erhöht, wobei durch die Ser65Thr-Substitution das Nachweisniveau noch einmal verdoppelt und insgesamt um das 45fache erhöht wurde.
Die Analyse der G418-resistenten Zellen mittels FACS, die möglicherweise von Natur aus empfindlicher für das Expressionsniveau ist, zeigte ähnliche Unterschiede beim Nachweisniveau zwischen GFP_J, GFP_H1 und GFP_H2 (6A, 6B, 6C und 6D). Bei diesen Untersuchungen wurden 0,05% nichtinifizierte 293-Zellen als grüne Fluoreszenz zeigende Zellen gewertet (d.h. Hintergrund-Autofluoreszenz). Zwischen GFP_J und den nichtinfizierten 293-Ausgangszellen wurde kein Unterschied in der Anzahl der fluoreszierenden Zellen nachgewiesen.
Im Gegensatz zu GFP_J wurden ungefähr 1,6% der GFP_H1- sowie 10% der GFP_H2-Zellen als positiv für grüne Fluoreszenz gewertet. Da mit GFP_J keine positiven Zellen nachgewiesen wurden, war die genaue Beurteilung des Unterschieds in der Nachweishäufigkeit zwischen GFP_J und GFP_H2 schwierig. Allerdings waren konservative Schätzungen der Nachweishäufigkeit einer grün fluoreszierenden Zelle in den humanisierten Populationen mindestens 32mal (GFP_H1) bzw. 190mal. (GFP_H2) höher als die für GFP_J sowie nichtinfizierte 293-Ausgangszellen gefundene Hintergrundhäufigkeit (6A, 6B, 6C und 6D).
BEISPIEL VII
Expression einer humanisierten blauen GFP-Variante
Dieses Beispiel beschreibt die Expression einer humanisierten blauen GFP-Mutante, pTR_BS-UFB, in 293-Zellen.
Zur Verfolgung der Fluoreszenz der blauen Mutante wurden 293-Zellen auf einer 6-cm-Platte mit den Plasmiden pTR_BS-UF2 und pTR_BS-UFB unter Verwendung von Lipofectamine (GIBCO, Life Technologies) kotransfiziert. Der DNA-Liposomenkomplex wurde für jedes Plasmid jeweils getrennt gebildet und auf die gleiche Platte von Zellen gegeben. Nach 4 Tagen wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Nikon Filter Cube V-2B photographiert.
Wie erwartet induzierte die blaue GFP-Mutante pTR_BS-UFB bei ihrer Reproduktion in einem humanisierten Hintergrund 293-Zellen zu einer Fluoreszenz in einer echten blauen Farbe. Im Vergleich mit GFP_H2 war jedoch die Fluoreszenzintensität beträchtlich reduziert. So zeigt beispielsweise 7 mit pTR_BS-UF2 und pTR_BS-UFB kotransfizierte und unter Bedingungen, die die blaue Fluoreszenz begünstigen, beobachtete 293-Zellen. Von den Erfindern wurde ebenso eine ziemlich schnelle (10–15 s) Bleichung der blauen Fluoreszenz festgestellt, wenn die Beobachtung ohne einen neutralen Dichtefilter durchgeführt wurde, was mit GFP_H2 nur selten auftrat.
Es ist vorgesehen, daß die Addition eines nukleären Lokalisierungssignals innerhalb des Gens der blauen Mutante zur Lokalisierung des GFP in dem wesentlich kleineren Zellkernraum die Fluoreszenzintensität verstärkt, in ähnlicher Weise wie beim mitochondrialen Targetting nach Rizzuto et al. (1995). Zur Erzeugung der Nukleäre-Lokalisierung-GFPB-Mutante wurden die folgenden Primer hergestellt:

#1: 5'-TGCTCTAGAGCGGCCGCCGCCACCATGGTGCCCAAGAAGAAGAGGAA GGTGATGAGCAAGGGCGAG-3'; (SEQ ID NQ: 13);
#2: #2: Primer #2 wie für die GFPB-PCR^TM, wie oben beschrieben.

BEISPIEL VIII
Konstruktion des AAV-Vektors mit IRES-GFP-Kassette
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des AAV-Vektors mit IRES-GFP-Kassette, bei dem die Translation des GFP von einem IRES-Element aus dem Typ-1-Poliovirus gesteuert wird.
Oftmals ist die Expression des interessierenden transduzierten Gens aus verschiedenen technischen Gründen schwer zu verfolgen. Bei diesen Situationen ist das Verfolgen eines vom gleichen Vektor zugeführten Markergens wenig hilfreich, da es normalerweise von einem separaten Promotor transkribiert wird. Allerdings läßt sich eine koordinierte Expression sowohl des Reportergens als auch des untersuchten Gens erreichen, wenn diese Gene innerhalb einer dicistronischen Transkriptionseinheit plaziert werden. Die cap-unabhängige Translationsinitiation des zweiten Cistrons in dieser Anordnung wird von einer nichttranslatierten RNA-Sequenz vermittelt, die als interne ribosomale Eintrittsstelle funktioniert (Jackson et al., 1990; Jang et al., 1988; Macejak und Sarnow, 1991).
Um dieses Merkmal in die erfindungsgemäßen AAV-Vektoren einzubauen, wurde von den Erfindern das Plasmid pTR_BS-UF3 konstruiert, bei dem die Translation des GFP durch ein IRES-Element aus dem Typ-1-Poliovirus gesteuert wird (Dirks et al., 1993). Ebenso wurde eine Restriktionsstellen-Polylinkersequenz stromaufwärts des IRES-Elements eingefügt, um die Insertion des interessierenden Gens zu erleichtern, wobei die dicistronische Messenger-RNA unter der Kontrolle des CMV-Promotors stand (2B und 2A).
Das Niveau der IRES-gesteuerten GFP-Expression mit dem pTR_BS-UF3-Vektor war, nach Beurteilung der Fluoreszenzintensität, geringer als die mit dem Ausgangsplasma pTR_BS-UF2 beobachtete und mit der des pTR_BS-UF1-Vektors vergleichbar. Wurde jedoch ein anderes offenes Leseraster (cDNA der B-Kette des menschlichen Insulins) stromaufwärts vom IRES-Element eingefügt, so stieg die GFP-Expression an und war von der des Ausgangsvektors pTR_BS-UF2 nicht zu unterscheiden.
BEISPIEL IX
Konstruktion und Verwendung von rekombinantem GFP-Adenovirus
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus-Shuttle-Plasmids sowie die Konstruktion von humanisiertes gfp-Gen exprimierendem rekombinanten Adenovirus. Damit wird beispielhaft die Verwendung unterschiedlicher Vektorsysteme bei der Expression von humanisiertem GFP dargestellt.
Zur Konstruktion des Adenovirus-Shuttle-Vektors (pΔE1GFP) (2B), wurde das Ausgangsplasmid pTR-UF3 teilweise mit SalI und danach vollständig mit BglII verdaut. Die aus dem CMV-Promotor, Intron, IRES-Element, GFP_H-cDNA und Poly(A)-Stelle bestehende Transkriptionskassette wurde aus einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde in pΔ-E1sp1A (Bett et al., 1994), das mit BamHI und SalI verdaut worden war, subkloniert.
Zur Erzeugung des rekombinanten Adenovirus wurden der Shuttle-Vektor pΔE IGFP (Bett et al., 1994) sowie der Ad-Vektor pJM17 (McGrory et al., 1988) in 293-Zellen kotransfiziert, wobei die vom Zulieferer (Microbix Biosystems Inc) empfohlene Vorgehensweise verwendet wurde. Rekombinantes Ad enthaltende Plaques wurden einem Screening mittels optischer Selektion unter Epifluoreszenz auf eine Gruppe leuchtend grüner Zellen, die den typischen zytopathischen Effekt (CPE) zeigten, unterzogen. Das rekombinante Ad wurde mit AdΔE1GFP und unter Verwendung von Standardtechniken vermehrt.
Bei der in-vivo-Rekombination von pΔE1gfp mit einem den Rest des Adenovirusgenoms enthaltenden Plasmid, pJM17 (Snyder et al., 1993), wurde ein rekombinantes Adenovirus erhalten, das GFP trug und exprimierte (8). Das GFP-Reportergen gestattete eine einfache Selektion rekombinanter Ad-Plaques. Bei der Untersuchung mittels Fluoreszenzmikroskopie bestand ein echter rekombinanter Plaque aus einer kompakten Gruppe leuchtend grüner Zellen, die den typischen Adenovirus-CPE zeigten, wohingegen ein falscher rekombinanter Plaque keine grünen Zellen enthielt. Das Verhältnis von echten zu falschen Plaques betrug etwa 1:2 bei Verwendung der Kombination aus pΔE1gfp-Shuttleplasmid und pJM17-Donorplasmid. Somit wurde das Screening-Verfahren durch Verwendung der GFP-Selektion in signifikanter Weise vereinfacht.
BEISPIEL X
Infektion von Photorezeptorzellen des Meerschweinchens
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Expression der humanisierten gfp_h-cDNA sowie ihre Verwendung als Reportergen in differenzierten Säugerzellen.
rAAV-GFP_H1 wurde zur Infektion einer Retina eines Meerschweinchens verwendet. Dabei wurden Meerschweinchen durch intramuskuläre Injektion eines Gemischs aus Ketamin (35 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (8 mg/kg) betäubt. Die Augen wurden jeweils mit 2,5% Phenylephrin (Neo-Synephrin) und 0,5% Tropicamid dilatiert, und ein topisches Anästhetikum (Proparacain-HCl) wurde auf die Hornhaut appliziert. Der Augendruck wurde durch Parazentese der vorderen Kammer erniedrigt. Danach wurde an der Pars plana eine 30er Nadel unter optischer Führung durch ein indirektes Ophthalmoskop in den Glaskörper eingeführt und 25 ml rAAV-GFP_H2 (2,5 × 10⁷ infektiöse Partikel) zugeführt. Die Augen wurden mittels Ophthalmoskopie auf Fluoreszenz und entzündete Stellen untersucht.
28 Tage nach der Injektion wurden die Tiere mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin-HCl und anschließender intraperitonealer Verabreichung einer Pentobarbital Natrium-Überdosis betäubt und getötet. Die Tiere wurden dann mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS perfundiert. Die Augen wurden herauspräpariert und die Linse und Hornhaut entfernt. Retina und Augenbecher wurden zusätzlich über Nacht bei 4°C fixiert. Die Retina wurde dann mit 7,5%, 15% und 30% Sucrose infiltriert, und es wurden Gefrierschnitte mit einer Dicke von 20–25 mm präpariert. Gewebepräparate wurden unter einem konfokalen Mikroskop von Brorad mit Fluorescein-Exzitations-/Emissionsfiltern beobachtet.
Zum Testen der Verwendbarkeit von GFP_H-cDNA als Reportergen in einem in-vivo-System wurde von den Erfindern rAAV-GFP_H2-Virus jeweils in den Glaskörper des rechten Auges von zwei Stamm-13-Meerschweinchen injiziert. Gewebeschnitte des Auges zeigten eine vorwiegend in Zellen der Ganglienzellschicht (die der Glaskörperinjektionsstelle am nächsten liegende Schicht) vorhandene schwache GFP_H2-Fluoreszenz. Darüber hinaus zeigten einige wenige horizontale Zellen GFP_H2-Fluoreszenz. Die größte GFP_H2-Intensität wurde in Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) beobachtet (9A, 9B, 9C und 9D).
Bei rAAV-GFP_H2 wiesen alle untersuchten Gewebeschnitte fluoreszierende RPE-Zellen auf. Diese Präferenz für eine CMV-Promotor-gesteuerte Expression in RPE-Zellen wurde bereits früher festgestellt (Bennett et al., 1994; Li et al., 1994). Die Untersuchung von Gewebepräparaten aus den linken Kontrollaugen ergab keine zellspezifische Emission außer einer Autofluoreszenz in Pigmentgranula des RPE. Die Tatsache, daß eine Inokulation von AAV in dem Glaskörper des Meerschweinchens zur GFP-Expression in RPE-Zellen führte, zeigte, daß AAV die neurale Retina mit 100–200 μm Dicke durchqueren kann. Diese Eigenschaft kann mit dem kleinen Durchmesser der AAV-Partikel zusammenhängen.
BEISPIEL XI
pGREENLANTERN^TM-Vektor
Dieses Beispiel beschreibt die Erzeugung eines besonders geeigneten Vektors mit der Bezeichnung pGREENLANTERN^TM.
Zur Erzeugung von pCMVSPORT 2.1 wurde die folgende Vorschrift verwendet. pSPORT2 (erhältlich von Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) wurde mit PvuII und BssHI verdaut. Die Enden wurden mittels Klenow-Fragment stumpfendig gemacht. Das große Fragment wurde über ein Gel gereinigt.
pSVSPORT (erhältlich von Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA), wurde dann mit EarI und HaeII verdaut. Die Enden wurden mit T4DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Das kleinere Fragment wurde über ein Gel gereinigt. Die beiden Fragmente wurden ligiert und das erhaltene Plasmid mit pRAD-TEMP bezeichnet.
pRAD-TEMP wurde mit BamHI teilverdaut und mit Klenow behandelt. Die DNA wurde mit sich selbst ligiert, wobei das erhaltene Plasmid lediglich eine BamHI-Stelle in der Mehrfachklonierungsstelle (Multiple Cloning Site, MCS) aufwies. Die MCS wurde durch Schneiden der DNA mit XbaI und MluI sowie Ligation eines neuen Oligos, das die folgenden Restriktionsstellen aufwies (XbaI-BamHI-XhoI-ApaI-HindII und MluI), geändert. Dieses Plasmid wurde pSVSPORT-BI genannt.
pSVSPORT-BI wurde mit ClaI und StuI verdaut und mit Klenow-Fragment behandelt. Der CMV-Promotor stammte aus pCMVβgal. Der Promotor befand sich auf einem SfcI-XbaI-Fragment, das mit Klenow-Fragment stumpfendig gemacht wurde. Die DNAs wurden ligiert und das erhaltene Plasmid pCMVSPORT 2.1 genannt.
Für die Erzeugung von pGREENLANTERN wurde pCMVSPORT 2.1 verwendet. pCMVSPORT 2.1 wurde mit NotI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt. Die DNA wurde mit dem NotI-Fragment des humanisierten LTF2 ligiert. Dabei wurde die Orientierung bestätigt. Der Vektor wurde pCMVSPORT-UF2 genannt.
Der T7-DNA-Polymerasebereich wurde durch Verdauung mit XbaI-NheI sowie Selbstligation des größeren Vektorfragments deletiert. Bei dieser DNA handelt es sich um den pGREENLANTERN-1-Vektor (10). Die vollständige Sequenz von pGREENLANTERN-1 ist in SEQ ID NO: 14 angegeben.
Alle hier offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren lassen sich ohne übermäßiges Experimentieren angesichts der vorliegenden Offenbarung herstellen und ausführen.
LITERATURANGABEN
Die folgenden Literaturangaben sind hiermit dahingehend, daß durch sie beispielhafte verfahrensmäßige oder weitere Einzelheiten zusätzlich zu den hier angeführten bereitgestellt werden, ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Humanisiertes Gen für GFP (grün fluoreszierendes Protein), wobei das Gen für ein grün fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert und wobei das Gen mindestens sieben, vorzugsweise mindestens acht, stärker bevorzugt mindestens neun, humanisierte Codons von den 10 sich an den Codonpositionen 18, 53, 93, 125, 150, 178, 195, 208, 236 und 224 der GFP-Gensequenz befindenden Codons umfaßt.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen für ein grün fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert, in der Serin in Position 65 durch Threonin ersetzt wurde.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen für ein grün fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert, in der Tyrosin in Position 66 durch Histidin ersetzt wurde.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen für ein grün fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codiert, in der die Chromophorsequenz Phe Ser Tyr Gly Val Gln (SEQ ID NO: 4) zwischen den Positionen 64 und 69 durch die Sequenz Met Gly Tyr Gly Val Leu (SEQ ID NO: 5) ersetzt wurde.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei mindestens etwa 10%, vorzugsweise mindestens etwa 15%, stärker bevorzugt mindestens etwa 20%, stärker bevorzugt mindestens etwa 25%, stärker bevorzugt mindestens etwa 30%, stärker bevorzugt mindestens etwa 35%, stärker bevorzugt mindestens etwa 50%, der Codonpositionen ein humanisiertes Codon enthalten.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen an den Codonpositionen 18, 53, 93, 125, 150, 178, 195, 208, 236 und 224 der GFP-Gensequenz jeweils ein humanisiertes Codon umfaßt.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen an den Codonpositionen 18, 53, 125, 178, 195 und 236 der GFP-Gensequenz eines der humanisierten Leucin-Codons CTG, CTC und TTG umfaßt.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen an den Codonpositionen 92, 150 und 224 der GFP-Gensequenz das humanisierte Valin-Codon GTG umfaßt.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen an der Codonposition 208 der GFP-Gensequenz das humanisierte Serin-Codon TCT umfaßt.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen im Vergleich zur Qualle-Wildtypgensequenz der SEQ ID NO: 1 innerhalb des codierenden Bereichs eine erhöhte Anzahl an Codons, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: – für Alanin codierenden GCC- oder GCT-Codons – für Cystein codierenden TGC-Codons – für Aspartat codierenden GAC-Codons – für Glutamat codierenden GAG-Codons – für Phenylalanin codierenden TTC-Codons – für Glycin codierenden GGC-Codons – für Histidin codierenden CAC-Codons – für Isoleucin codierenden ATC-Codons – für Lysin codierenden AAG-Codons – für Leucin codierenden CTG- oder CTC-Codons – für Asparagin codierenden AAC-Codons – für Prolin codierenden CCC- oder CCT-Codons – für Glutamin codierenden CAG-Codons – für Arginin codierenden CGC-, AGG- oder CGG-Codons – für Serin codierenden AGC- oder TCC-Codons - für Threonin codierenden ACC-Codons – für Valin codierenden GTG- oder GTC-Codons – für Tyrosin codierenden TAC-Codons, umfaßt.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen ein TGA-Terminationscodon umfaßt.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen im Vergleich zur Qualle-Wildtypgensequenz der SEQ ID NO: 1 innerhalb des codierenden Bereichs eine reduzierte Anzahl an Codons, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: – für Alanin codierenden GCA-Codons – für Glycin codierenden GGT-Codons – für Leucin codierenden CTT-, CTA- oder TTA-Codons – für Arginin codierenden AGA-Codons – für Serin codierenden AGT-, TCA- oder TCG-Codons – für Valin codierenden GTT- oder GTA-Codons, umfaßt.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen stromabwärts von einer Kozak-Konsensussequenz operativ positioniert ist.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3 umfaßt.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen mit für Protein codierender Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft ist.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen unter die Transkriptionskontrolle eines in einer Säurgerzelle wirksamen Promotors gestellt wird.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 16, ferner als rekombinanter Vektor definiert.
Expressionsvektor, umfassend das stromabwärts von einem Promotor operativ positionierte humanisierte GFP-Reportergen nach Anspruch 1, wobei der Promotor die Expression des humanisierten GFP-Gens in einer Säugerzelle steuert.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Promotor um einen konstitutiven Promotor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Promotor um einen viralen Promotor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Promotor um einen HSV-, TK-, RSV-, SV40-, CMV- oder β-Actin-Promotor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem Promotor um einen CMV-Promotor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Promotor um einen induzierbaren Promotor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 23, wobei es sich bei dem Promotor um einen Cytochrom-P450-, Hitzeschockprotein-, Metallothionein- oder Östrogen-Genpromotor, einen radioaktiv induzierbaren oder einen tetVP16-Promotor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Promotor um einen gewebespezifischen Promotor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem Promotor um einen FAB-, Insulin-, Transphyretin-, α1-Antitrypsin-, PAI-1-, Apolipoprotein-A1-, LDL-Rezeptor-, MBP-, GFAP-, OPSIN- oder NSE-Genpromotor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei der Expressionsvektor ferner eine Mehrfachklonierungsstelle umfaßt.
Expressionsvektor nach Anspruch 27, wobei der Expressionsvektor eine zwischen dem Promotor und dem humanisierten GFP-Gen operativ positionierte Mehrfachklonierungsstelle umfaßt.
Expressionsvektor nach Anspruch 27, wobei der Expressionsvektor eine stromabwärts von dem humanisierten GFP-Gen operativ positionierte Mehrfachklonierungsstelle umfaßt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei der Expressionsvektor ferner ein IRES-Element umfaßt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei der Expressionsvektor ferner ein zweites Reportergen umfaßt.
Expressionsvektor nach Anspruch 31, wobei das zweite Reportergen in einer zweiten Transkriptionseinheit enthalten ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 31, wobei das zweite Reportergen eine Resistenz gegenüber Neomycin, Hygromycin, Puromycin, Zeocin, Mycophenolsäure, Histidinol oder Methotrexat verleiht.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei der Expressionsvektor ferner ein Polyadenylierungssignal umfaßt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem exprimierenden Vektor um einen rekombinanten adenoviralen Vektor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Expressionsvektor um einen rekombinanten adeno-assoziierten viralen (AAV-)Vektor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Expressionsvektor um einen rekombinanten retroviralen Vektor handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei der Expressionsvektor ein humanisiertes GFP-Reportergen mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3 umfaßt.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei der Expressionsvektor ein verstärkt grün oder verstärkt blau fluoreszierendes Protein exprimiert.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 40, wobei das humanisierte GFP-Gen mittels eines rekombinanten Vektors in die Zelle eingeführt wird.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 40, wobei die Zelle das humanisierte GFP-Gen unter Erhalt des codierten GFP-Proteins exprimiert.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 40, wobei es sich bei der Zelle um eine Säugerzelle handelt.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 40, wobei es sich bei der Zelle um eine menschliche Zelle handelt.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 40, wobei es sich bei der Zelle um eine VERO-, HeLa-, CHO-, COS-, W138-, BHK-, HepG2-, 3T3-, RIN-, MDCK-, A549-, PC12-, K562- oder 293-Zelle handelt.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 40, wobei es sich bei der Zelle um eine Zelle einer Primärzellinie handelt.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 40, wobei die Zelle in einem Säuger lokalisiert ist.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 40, wobei die Zelle ein die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3 umfassendes humanisiertes GFP-Gen umfaßt.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 40, wobei die Zelle ferner ein ein gewünschtes Protein exprimierendes rekombinantes Gen umfaßt.
Reportergen-Expressionskit, umfassend, in geeigneten Behältnissen, einen das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1 umfassenden Vektor.
In-vitro-Verfahren zur Markierung einer Säugerzelle, bei dem man das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1 in der Zelle exprimiert.
In-vitro-Verfahren zur Identifizierung einer Säugerzelle in einer Zellpopulation, bei dem man: a) das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1 in der Zelle exprimiert; b) die Zelle mit einer Population von Zellen versetzt, die kein GFP exprimieren; und c) die Zelle durch Identifizieren einer Zelle mit GFP-Fluoreszenz identifiziert.
In-vitro-Verfahren zur Identifizierung einer ein exogenes DNA-Segment enthaltenden Säugerzelle, bei dem man: a) einen das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1 in operativer Verknüpfung mit einem exogenen DNA-Segment umfassenden Expressionsvektor in die Zelle einführt; und b) eine das exogene DNA-Segment enthaltende Zelle durch Identifizieren einer Zelle mit GFP-Fluoreszenz identifiziert.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei der Expressionsvektor einen GFP codierenden ersten codierenden Bereich und einen das exogene DNA-Segment umfassenden zweiten codierenden Bereich umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei das exogene DNA-Segment für ein nicht translatiertes Produkt codiert.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei das exogene DNA-Segment für ein ausgewähltes Protein oder Peptid codiert.
Verfahren nach Anspruch 56, wobei der Expressionsvektor einen für ein GFP in operativer Verknüpfung mit dem ausgewählten Protein oder Peptid umfassendes Fusionsprotein codierenden ersten codierenden Bereich umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 57, wobei das Fusionsprotein GFP in operativer Verknüpfung mit einem ein subzelluläres Lokalisierungssignal umfassenden Peptid umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Fusionsprotein GFP in operativer Verknüpfung mit einem ausgewählten Protein sowie mit einem ein subzelluläres Lokalisierungssignal umfassenden Peptid umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Fusionsprotein mit einem nukleären Zielpeptid oder einem mitochondrialen Zielpeptid verknüpftes GFP umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei die Zelle ein erstes und ein zweites humanisiertes GFP-Gen umfaßt, die jeweils ein GFP-Protein mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei es sich bei der Zelle um eine menschliche Zelle handelt.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei eine Zelle mit GFP-Fluoreszenz durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung identifiziert wird.
In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der Lokalisation eines ausgewählten Proteins in einer Säugerzelle, wobei man bei dem Verfahren: a) einen eine das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1 in operativer Verknüpfung mit einem für das ausgewählte Protein codierenden Gen umfassende zusammenhängende DNA-Sequenz umfassenden Expressionsvektor in die Zelle einführt; und b) die Lokalisation des ausgewählten Proteins in der Zelle durch Identifizieren der Lokalisation der GFP-Fluoreszenz identifiziert.
Verfahren nach Anspruch 64, wobei die Lokalisation des ausgewählten Proteins in der Zelle von externen Stimuli oder vom Zellzyklus abhängt.
In-vitro-Verfahren zum Abzielen eines Proteins auf eine ausgewählte Lokalisation in einer Säugerzelle, wobei man in dem Verfahren a) einen eine eine für ein Zielpeptid codierende Sequenz in operativer Verknüpfung mit dem humanisierten GFP-Gen nach Anspruch 1 und einem für Protein codierenden Gen umfassende zusammenhängende DNA-Sequenz umfassenden Expressionsvektor in die Zelle einführt; und b) die ausgewählte Lokalisation des Proteins in der Zelle durch Identifizieren der Lokalisation der GFP-Fluoreszenz bestätigt.
In-vitro-Verfahren zum Testen eines Kandidatenpromotors in einer Säugerzelle, wobei man in dem Verfahren a) einen das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1 unter der Kontrolle des Kandidatenpromotors umfassenden Expressionsvektor in die Zelle einführt; b) die Zelle unter Bedingungen hält, die auf wirksame Weise und über einen ausreichenden Zeitraum die Expression des humanisierten GFP-Gens durch den Kandidatenpromotor gestatten; und c) eine Zelle mit GFP-Fluoreszenz identifiziert, wobei das Vorhandensein einer Zelle mit GFP-Fluoreszenz einen aktiven Promotor anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 67, wobei es sich bei dem Kandidatenpromotor um einen gewebespezifischen Kandidatenpromotor oder um einen induzierbaren Kandidatenpromotor handelt.
Verfahren nach Anspruch 67, wobei der Kandidatenpromotor natürlicherweise mit einem Kandidatengen, das auf Expression in einer Säugerzelle getestet wird, assoziiert ist.
Verfahren nach Anspruch 67, wobei die Zelle in einem Säuger lokalisiert ist.
In-vitro-Verfahren zum Nachweis einer die Transkription von einem ausgewählten Promotor in einer Säugerzelle stimulierenden Substanz, wobei man in dem Verfahren a) einen das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1 unter der Kontrolle des ausgewählten Promotors umfassenden Expressionsvektor in eine Säugerzelle einführt; b) die Zelle einer Zusammensetzung aussetzt, von der vermutet wird, daß sie die Substanz enthält; und c) eine Zelle mit GFP-Fluoreszenz identifiziert, wobei das Vorhandensein einer Zelle mit GFP-Fluoreszenz das Vorhandensein einer die Transkription von dem ausgewählten Promotor stimulierenden Substanz anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 71, wobei es sich bei der Substanz um ein Toxin oder einen Umweltschadstoff handelt.
In-vitro-Verfahren zur Bestimmung des Expressionsniveaus eines ausgewählten Gens in einem Säuger, wobei man in dem Verfahren a) einen das humanisierte GFP-Gen nach Anspruch 1 in operativer Verknüpfung mit einem ausgewählten Gen umfassenden Expressionsvektor in den Zellen des Säugers exprimiert; und b) die GFP-Fluoreszenz in den Zellen des Säugers bestimmt, wobei das Niveau der GFP-Fluoreszenz das Expressionsniveau des ausgewählten Gens anzeigt.
In-vitro-Verfahren zur Analyse der Expression eines ausgewählten Gens in unterschiedlichen Geweben eines Säugers, wobei man in dem Verfahren a) einen das ausgewählte Gen unter der Kontrolle des natürlichen Genpromotors umfassenden Expressionsvektor in vitro in die Zellen des Säugers einführt, wobei das Gen mit dem humanisierten GFP-Gen nach Anspruch 1 operativ verknüpft ist; b) die Gewebe des Säugers in vitro unter Bedingungen hält, die auf wirksame Weise und über einen ausreichenden Zeitraum die Expression des Gens gestatten; und c) Zellen der Gewebe des Säugers analysiert, wobei das Vorhandensein von Zellen mit GFP-Fluoreszenz in einem gegebenen Gewebe Genexpression in dem Gewebe anzeigt.
In-vitro-Verfahren zur Verwendung des humanisierten GFP-Gens nach Anspruch 1, wobei man das humanisierte GFP-Gen in einer Säugerwirtszelle exprimiert und das von der Zelle exprimierte GFP sammelt.
Verfahren nach Anspruch 75, wobei das humanisierte GFP-Gen mit einer für ein Protein oder Peptid mit bekanntem Molekulargewicht codierenden DNA-Sequenz fusioniert wird und wobei die Wirtszelle ein GFP-Fusionsprotein exprimiert.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 3, wobei das Gen für ein blau fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, in der Tyrosin in Position 145 durch Phenylalanin ersetzt ist, codiert.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das für Tyrosin in Position 66 der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 codierende TAT durch CAT und das für Tyrosin in Position 145 der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 codierende TAT durch TTC ersetzt ist.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen für ein grün fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, in der Phenylalanin in Position 64 durch Leucin und Serin in Position 65 durch Threonin ersetzt ist, codiert.
Humanisiertes GFP-Gen nach Anspruch 1, wobei das für Phenylalanin in Position 64 der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 codierende TTC durch CTG und das für Serin in Position 65 codierende TCT durch AAC ersetzt ist.