ES2724803T3 - Polipéptidos opsinas y métodos de utilización de los mismos - Google Patents

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ES2724803T3 ES12858055T ES12858055T ES2724803T3 ES 2724803 T3 ES2724803 T3 ES 2724803T3 ES 12858055 T ES12858055 T ES 12858055T ES 12858055 T ES12858055 T ES 12858055T ES 2724803 T3 ES2724803 T3 ES 2724803T3
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Abstract

Un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la secuencia de aminoacidos que se expone en la SEQ ID NO: 22, y que tiene una funcion de opsina.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos opsinas y métodos de utilización de los mismos
Referencia cruzada
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N.° 61/576.858 presentada el 16 de diciembre de 2011.
Antecedentes
Mecanismos diversos y elegantes han evolucionado para hacer posibles que los organismos recolecten luz para varias funciones de supervivencia, incluyendo la generación de energía y la identificación de entornos adecuados para la supervivencia. Una clase principal de proteína sensible a la luz consiste en 7 rodopsinas transmembrana que pueden encontrarse a lo largo de todos los reinos vitales y sirven para un diverso intervalo de funciones. Muchas procariotas emplean estas proteínas para controlar los gradientes protónicos y para mantener el potencial de membrana y la homeostasia iónica, y muchos microorganismos móviles han evolucionado fotorreceptores basados en opsina para modular el pulso flagelar y por lo tanto la fototaxia hacia los entornos con intensidades de luz óptimas para la fotosíntesis.
Debido a su simplicidad estructural (tanto los dominios de sensación lumínica como efectores están codificados en un único gen) y la cinética rápida, las opsinas microbianas se pueden tratar como componentes precisos y modulares de la fotosensibilización para la introducción en células no sensibles a la luz para hacer posible un control óptico rápido de los procesos celulares específicos. En los últimos años, el desarrollo de herramientas de perturbación celular basadas en estas y otras proteínas sensibles a la luz ha dado como resultado una tecnología llamada optogenética, que se refiere a la integración de un control genético y óptico para conseguir una ganancia o pérdida de función de eventos definidos con precisión en células específicas de tejido vivo.
Existe la necesidad en la técnica de herramientas optogenéticas despolarizantes e hiperpolarizantes, por ejemplo, para su uso en el control de la actividad neuronal. El documento WO 2011/116238 describe polinucleótidos y métodos para la expresión de proteínas activadas por la luz en células animales y la alteración de un potencial de acción de las células por estimulación óptica. El documento US 2011/165681 describe una bomba de protones que puede ser una rodopsina microbiana, en particular derivada del género Halorubrum de arqueobacterias, o se deriva de Leptosphaeria maculans, P. triticirepentis, y S. scelorotrorium. Ihara et al, Journal of Molecular Biology vol. 285, n° 1. páginas 163-174 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de 25 rodopsinas de arqueas de 13 cepas de cinco géneros de arqueas extremadamente halófilas.
Sumario
La presente divulgación describe opsinas, incluyendo variantes de opsinas con un aumento de actividad y/o un aumento de tráfico por la membrana plasmática. Las opsinas son útiles en aplicaciones terapéuticas y de cribado, que también se describen. La presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 22.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-F representan las propiedades de las herramientas hiperpolarizantes.
La Figuras 2A-F representan la actuación de las herramientas hiperpolarizantes.
Las Figuras 3A-F representan la caracterización de una ChR de Dunaliella salina. Para la Figura 3B: DChR1 (SEQ ID NO: 15), CChR1 (SEQ ID NO: 16), CChR2 (SEQ ID NO: 17), VChR1 (SEQ ID NO: 18), y VChR2 (SEQ ID NO: 19).
La Figura 4 representa una secuencia de nucleótidos que codifica una ChR de Dunaliella salina (SEQ ID NO: 20).
La Figura 5 representa una secuencia de nucleótidos que codifica una ChR de Dunaliella salina, con el codón optimizado para la expresión en células de mamífero (SEQ ID NO: 21).
La Figura 6 representa una secuencia de aminoácidos de ChR de Dunaliella salina (SEQ ID NO: 22).
Las Figuras 7A-7E representan las secuencias de aminoácidos de variantes de opsinas a modo de ejemplo: Figura 7A (SEQ ID NO: 23); Figura 7B (SEQ ID NO: 24); Figura 7C (SEQ ID NO: 25); Figura 7D (SEQ ID NO: 26), y Figura 7E (SEQ ID NO: 27).
Las Figuras 8A-8C representan la secuencia de aminoácidos de la arqueorrodopsina-3 de Halorubrum sodomense; y las secuencias de nucleótidos que codifican la misma; Figura 8A (SEQ ID NO: 28); Figura 8B (SEQ ID NO: 29), y Figura 8C (SEQ ID NO: 30).
Las Figuras 9A y 9B representan una secuencia de aminoácidos de la opsina de la cepa TP009 de Halorubrum sodomense; y una secuencia de nucleótidos que codifica la misma: Figura 9A (SEQ ID NO: 31), y Figura 9B (SEQ ID NO: 32).
Las Figuras 10A-10C representan una secuencia de aminoácidos de la opsina de Leptosphaeria maculans y las secuencias de nucleótidos que codifican la misma: Figura 10A (SEQ ID NO: 33); Figura 10B (SEQ ID NO: 34), y Figura 10C (SEQ ID NO: 35).
Definiciones
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína”, que se utilizan en el presente documento de manera intercambiable, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, modificados química o bioquímicamente o aminoácidos derivados, y polipéptidos que tiene armazones peptídicos modificados. El término incluye las proteínas de fusión, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin restos metionina en el extremo N; proteínas marcadas inmunológicamente; y similares. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. Siguiendo la nomenclatura convencional de polipéptidos, J. Biol. Chem., 243 (1969) 3552-59
Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico”, que se utiliza de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, sea de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, este término incluye, pero no se limita a, ADN o ARN de cadena sencilla, doble o múltiple, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN, o un polímero que comprende bases purínicas y pirimidínicas u otras bases de nucleotídicas naturales, modificadas química o bioquímicamente, no naturales o derivadas.
El ácido nucleico puede ser de doble cadena, de cadena sencilla, o contener partes de secuencia de cadena doble o cadena sencilla. Como apreciarán los expertos en la técnica, la representación de una cadena sencilla (“Watson”) también define la secuencia de la otra cadena (“Crick”). La expresión "ácido nucleico recombinante" en el presente documento significa un ácido nucleico formado originalmente in vitro, en general, mediante la modificación de un ácido nucleico por endonucleasas, de una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado, en forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro por ligadura de moléculas de ADN que no están unidas normalmente, se consideran ambos recombinantes para los fines de la presente invención. Se entiende que una vez que se produce un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula u organismo huésped. Se replicará de manera no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped más que las modificaciones in vivo; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez que se producen recombinantemente, aunque posteriormente se repliquen de manera no recombinante se sigue considerando recombinante para los fines de la invención.
Identidad de secuencia de ácidos nucleicos (así como identidad de secuencia de aminoácidos) se calcula basándose en una secuencia de referencia, que puede ser un subconjunto de una secuencia más larga, tal como un motivo conservado, región codificante, región flanqueante, etc. Una secuencia de referencia tendrá al menos aproximadamente 18 restos de longitud, más habitualmente al menos aproximadamente 30 restos de longitud, y puede extenderse hasta la secuencia completa que se va a comparar. Se conocen algoritmos para el análisis de secuencia tales como BLAST, descrito en Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215; 403-10 (utilizando los ajustes por defecto, es decir, los parámetros w = 4 y T = 17).
La expresión "modificación genética" se refiere a un cambio genético permanente o transitorio inducido en una célula después de la introducción en la célula de un nuevo ácido nucleico (es decir, un ácido nucleico exógeno a la célula). Se puede conseguir un cambio genético ("modificación") mediante la incorporación del nuevo ácido nucleico en el genoma de la célula huésped, o mediante el mantenimiento transitorio o estable del nuevo ácido nucleico como un elemento extracromosómico. Cuando la célula es una célula eucariota, se puede conseguir un cambio genético permanente mediante la introducción del ácido nucleico en el genoma de la célula. Los métodos adecuados para la modificación genética incluyen la infección vírica, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, tecnología de pistola de partículas, precipitación en fosfato cálcico, microinyección directa, y similares.
Como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" pretende describir un polinucleótido, un polipéptido, o una célula que está en un entorno diferente del que se encuentra naturalmente el polinucleótido, polipéptido, o la célula. Una célula modificada genéticamente aislada puede estar presente en una población mixta de células huésped genéticamente modificadas. Un polipéptido aislado será sintético en algunas realizaciones. Los "polipéptidos sintéticos" se ensamblan a partir de aminoácidos, y se sintetizan químicamente in vitro, por ejemplo, por síntesis química libre de células, utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
"Purificado" quiere decir un compuesto de interés (por ejemplo, un polipéptido) que se ha separado de los componentes que lo acompañan en la naturaleza. También se puede utilizar "purificado" para referirse a un compuesto de interés separado de los componentes que pueden acompañarlo durante la fabricación (por ejemplo, en la síntesis química). En algunas realizaciones, un compuesto es sustancialmente puro cuando está libre en al menos un 50 % a un 60 % por peso, de moléculas orgánicas con las que se asocia naturalmente o con las que está asociado durante la fabricación. En algunas realizaciones, la preparación es al menos un 75 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 %, por peso, del compuesto de interés. Se puede obtener un polipéptido sustancialmente puro, por ejemplo, sintetizando químicamente el polipéptido, o mediante una combinación de purificación y modificación química. También se puede obtener un polipéptido sustancialmente puro mediante, Por ejemplo, cromatografía de afinidad. La pureza se puede medir por cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía, espectroscopia de masas, análisis de cromatografía líquida de altas prestaciones, etc.
Los términos "individual", "sujeto", "huésped", y "paciente", que se utiliza en el presente documento, se refiere a un mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, murinos (ratas, ratones), primates no humanos, seres humanos, caninos, felinos, ungulados (por ejemplo, equinos, bovinos, ovinos, porcinos, caprinos), etc. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, el individuo es un murino.
Los términos "tratamiento", "tratar", "tratar", y similares se utilizan en el presente documento para referirse en general a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de evitar completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización o cura parcial o completa de una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento" como se utiliza en el presente documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye (a) prevenir que ocurra una enfermedad o síntomas en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero que aún no se ha diagnosticado que lo tenga; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, la detención de su desarrollo o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, producir la regresión de la enfermedad o síntoma.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" significa la cantidad de un agente que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratarle de una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del agente, la enfermedad o afección y su gravedad y la edad, peso, etc., del sujeto que se va a tratar.
Antes de describir más la presente invención, se tiene que entender que la presente invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, que como tales pueden, por supuesto variar. También se tiene que entender que la terminología utilizada tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no se pretende que sean limitantes, ya que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas. Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor que interviene, hasta la décima de la unidad del límite inferior a menos de que el contexto dicte claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de un intervalo y cualquier otro valor establecido o que intervenga, están englobados en la invención. Los límites superior e inferior de estos pequeños intervalos pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están incluidos en la invención sometido a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando un intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que incluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención.
A menos de que se defina otra cosa, todos los términos técnicos o científicos tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque también se pueden utilizar cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora. Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento desvelan y describen los métodos y/o materiales en cuya conexión se cita la publicación.
Se tiene que señalar que como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen los referentes en plural a menos de que el contexto dicte claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una variante de polipéptido opsina" incluye una pluralidad de dichos polipéptidos y la referencia a "la señal de tráfico" incluye la referencia a una o más señales de tráfico y los equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la técnica, etc. Se señala adicionalmente que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta afirmación pretende servir como base antecedente para el uso de dicha terminología exclusiva como "solo", "solamente" y similares en conexión con la mención de elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen, por claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación con una realización única. Por el contrario, distintas realizaciones de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier sub-combinación adecuada. Todas las combinaciones de realizaciones que pertenecen a la invención están englobadas específicamente en la presente invención y se desvelan en el presente documento. Además, todas las sub-combinaciones de las distintas realizaciones y elementos de las mismas también están englobadas específicamente en la presente invención y se desvelan en el presente documento como si cada una de dichas sub-combinaciones se desvelara individual y explícitamente en el presente documento.
Las publicaciones expuestas en el presente documento se proporcionan solamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No se debe considerar nada del presente documento como una admisión de que la presente invención no esté legitimada para antedatar dicha publicación a modo de invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de la publicación actual que puede ser necesario que sean confirmadas independientemente.
Descripción detallada
La presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 22. Se describen en el presente documento opsinas, incluyendo variantes de opsinas con un aumento de actividad y/o un aumento de tráfico por la membrana plasmática. Las opsinas son útiles en aplicaciones terapéuticas y de cribado, que también se describen posteriormente en el presente documento.
OPSINAS
Se describen en el presente documento polipéptidos opsinas, y ácidos nucleicos ("ácidos nucleicos de opsinas") que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos opsinas. La presente divulgación también proporciona células huésped modificadas que comprenden un ácido nucleico de opsina. También se hace referencia a un polipéptido opsina en el presente documento como una "herramienta".
Se describe en el presente documento un polipéptido opsina aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 500 aminoácidos a aproximadamente 550 aminoácidos, desde aproximadamente 550 aminoácidos a aproximadamente 600 aminoácidos, desde aproximadamente 600 aminoácidos a aproximadamente 650 aminoácidos, desde aproximadamente 650 aminoácidos a aproximadamente 700 aminoácidos, o desde aproximadamente 700 aminoácidos a 720 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representados en la Figura 6. Se puede hacer referencia a dicha opsina como "DChR1".
Se describe en el presente documento un polipéptido opsina aislado que puede tener una longitud de desde aproximadamente 500 aminoácidos a aproximadamente 550 aminoácidos, desde aproximadamente 550 aminoácidos a aproximadamente 600 aminoácidos, desde aproximadamente 600 aminoácidos a aproximadamente 650 aminoácidos, desde aproximadamente 650 aminoácidos a aproximadamente 700 aminoácidos, o desde aproximadamente 700 aminoácidos a 720 aminoácidos.
Un polipéptido opsina aislado de la presente divulgación se puede codificar por una secuencia de nucleótidos que tenga al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de nucleótidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 1800 nucleótidos a aproximadamente 1900 nucleótidos, desde aproximadamente 1900 nucleótidos a aproximadamente 2000 nucleótidos, desde aproximadamente 2000 nucleótidos a aproximadamente 2100 nucleótidos, o desde aproximadamente 2100 nucleótidos a aproximadamente 2163 nucleótidos, de la secuencia de nucleótidos que se representa en la Figura 4 o la Figura 5.
Un polipéptido opsina aislado de la presente divulgación funciona como un canal de protones activado por la luz, por ejemplo, una opsina aislada en cuestión funciona como una bomba de protones.
En algunas realizaciones, una opsina DChR1 en cuestión se modifica para que incluya una secuencia de exportación ER y/o una secuencia de tráfico, como se describe con detalle posteriormente. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una opsina DChR1 en cuestión comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo, una opsina DChR1, y una secuencia de exportación ER. En algunas realizaciones, una opsina DChR1 en cuestión comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo, una opsina DChR1; una secuencia de tráfico; y una secuencia de exportación ER. En algunas realizaciones, una opsina DChR1 en cuestión comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo, una opsina DChR1; una secuencia de tráfico; una secuencia intercalada; y una secuencia de exportación ER. Las secuencias de exportación ER, secuencias de tráfico, y secuencias intercaladas adecuadas se describen con más detalle posteriormente.
La presente divulgación proporciona una composición que comprende un polipéptido opsina descrito en el presente documento. Una composición en cuestión de polipéptido opsina puede comprender, además de un polipéptido opsina descrito en el presente documento, uno o más de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCh, KCl, MgSO4, etc.; un agente tampón, por ejemplo, un tampón Tris, ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES), sal sódica del ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico (MOPS), ácido N-tris [hidroximetilmetil [-3-aminopropanosulfónico (TAPS), etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasa, glicerol, y similares.
Ácidos nucleicos
La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una opsina descrita en el presente documento. Una secuencia de nucleótidos que codifica una opsina descrita en el presente documento puede estar unida operativamente a uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y un amplificador, que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos en las células diana que se pretenda (por ejemplo, una célula que se haya modificado genéticamente para sintetizar la opsina codificada).
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifique una DChR1 tiene al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de nucleótidos con un tramo contiguo de desde aproximadamente 1800 nucleótidos a aproximadamente 1900 nucleótidos, desde aproximadamente 1900 nucleótidos a aproximadamente 2000 nucleótidos, desde aproximadamente 2000 nucleótidos a aproximadamente 2100 nucleótidos, o desde aproximadamente 2100 nucleótidos a aproximadamente 2163 nucleótidos, de la secuencia de nucleótidos que se representa en la Figura 4. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos tiene el codón optimizado para la expresión en una célula de mamífero.
Los elementos promotores y amplificadores se conocen en la técnica. Para la expresión en una célula bacteriana, los promotores adecuados, incluyen, pero no se limitan a, lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P y trc. Para la expresión en una célula eucariota, los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotores genéticos de cadenas ligeras y/o pesadas de inmunoglobulinas y elementos amplificadores; promotor temprano inmediato de citomegalovirus, promotor timidina cinasa del virus del herpes simple, promotores de SV40 tempranos y tardíos; el promotor presente en las repeticiones terminales largas de un retrovirus; promotor metalotioneína-I del ratón, y distintos promotores específicos de tejido conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, por ejemplo, para la expresión en una célula de levadura, un promotor adecuado es un promotor constitutivo tal como un promotor ADH1, un promotor PGK1, un promotor ENO, un promotor PYK1, y similares, o un promotor regulable tal como un promotor GAL1, un promotor GAL10, un promotor ADH2, un promotor PHO5, un promotor CUP1, un promotor GAL7, un promotor MET25, un promotor MET 3, un promotor CYC1, un promotor HIS3, un promotor ADH1, un promotor PGK, un promotor GAPDH, un promotor ADC1, un promotor TRP1, un promotor URA3, un promotor LEU2, un promotor ENO, un promotor TP1, y AOX1 (por ejemplo, para su uso en Pichia). La selección del vector y promotor adecuados está en el nivel del experto habituado en la técnica.
Los promotores adecuados para su uso en células huésped procariotas incluyen, pero no se limitan a, un promotor de ARN polimerasa T7 de bacteriófago, un promotor trp, un promotor de operón Iac, un promotor híbrido, por ejemplo, un promotor híbrido Iac/tac, un promotor híbrido tac/trc, un promotor trp/Iac, un promotor T7/Iac, un promotor trc, un promotor tac, y similares; un promotor araBAD, promotores regulados in vivo tal como un promotor ssaG o un promotor relacionado (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE. UU. N.° 20040131637), un promotor apagC (Pulkkinen y Miller, J. Bacteriol, 1991: 173(1): 86-93.; Alpuche-Aranda et al, PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), un promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), y similares (véase, por ejemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; y Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); un promotor sigma70, por ejemplo un promotor sigma70 de consenso (véase, por ejemplo, los N.° de registro en GenBank AX798980, AX798961, y AX798183); un promotor de fase estacionaria, por ejemplo un promotor dps, un promotor spv, y similares; un promotor derivado de la isla de patogenicidad SPI-2 (véase, por ejemplo el documento WO 96/17951); un promotor actA (véase, por ejemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); un promotor rpsM (véase, por ejemplo, Valdivia y Falkow (1996). Mol. Microbiol.
22:367); un promotor tet (véase, por ejemplo, Hillen, W. y Wissmann, A. (1989) en Saenger, W. y Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162); un promotor SP6 (véase, por ejemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035); y similares. Los promotores fuertes adecuados para su uso en procariotas tales como Escherichia coli incluyen, pero no se limitan a Trc, Tac, T5 y PLambda. Ejemplos no limitantes de operadores para su uso en células huésped bacterianas incluyen un operador de promotor de lactosa (la conformación de la proteína represora Lad cambia cuando se pone en contacto con lactosa, evitando de esta manera que la proteína represora Lad se una al operador), un operador de promotor de triptófano, la proteína represora TrpR tiene una conformación que se une al operador, en ausencia de triptófano, la proteína TrpR represora tiene una conformación que no se une al operador), y el operador del promotor tac (véase, por ejemplo, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25).
Una secuencia de nucleótidos que codifica una opsina descrita en el presente documento puede estar presente en un vector de expresión y/o un vector de clonación. Un vector de expresión puede incluir un marcador genético, un origen de replicación, y otras características que se proporcionan para la replicación y/o el mantenimiento del vector. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados; muchos están disponibles en el mercado para generar las construcciones recombinantes en cuestión. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif, USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucarióticos: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia).
Los vectores de expresión tienen en general sitios de restricción convenientes localizados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de interés (por ejemplo, una opsina). Puede estar presente un marcador genético en el huésped de expresión. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos (por ejemplo, vectores víricos basados en virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, por ejemplo, Li et al, Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; Borras et al, Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al, H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociados (véase, por ejemplo, Ali et al, Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al, PNAS 94:69166921, 1997; Bennett et al, Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et al, Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al, Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al, Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en el documento WO 93/09239, Samulski et al, J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al, Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et al, PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de la inmunodeficiencia humana (véase, por ejemplo, Miyoshi et al, PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:78127816, 1999); un vector retrovírico (por ejemplo, del virus de leucemia murina, virus de la necrosis esplénica, y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del Sarcoma de Rous, virus del Sarcoma de Harvey, virus de leucosis aviar, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo, y virus de tumor mamario), y similares
También se describe en el presente documento un vector recombinante que comprende un polinucleótido en cuestión que codifica una opsina descrita en el presente documento o cualquier variante de la misma. Un vector recombinante en cuestión también incluye los vectores que comprenden un polinucleótido que codifica un ARN (por ejemplo, un ARNm) que cuando se transcribe a partir de los polinucleótidos del vector dará como resultado la acumulación de una opsina descrita en el presente documento en las membranas plasmáticas de las células animales diana. Los vectores que se pueden utilizar incluyen, sin limitación, vectores lentivíricos, HSV, adenovíricos, y víricos adenoasociados (AAV). Los lentivirus incluyen, pero no se limitan a VIH-1, VIH-2, SIV, FIV y EIAV. Los lentivirus pueden seudotiparse con las proteínas de envoltura de otros virus, incluyendo, pero sin limitarse a, VSV, rabia, Mo-MLV, baculovirus y Ébola. Dichos vectores pueden prepararse utilizando métodos convencionales en la técnica.
En algunas realizaciones, el vector es un vector AAV recombinante. Los vectores AAV son virus ADN de tamaño relativamente pequeño que pueden integrarse, de manera estable y específica del sitio, en el genoma de las células que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento celular, morfología o diferenciación, y no parecen estar implicados en patologías humanas. El genoma de los AAV se ha clonado, secuenciado y caracterizado. Engloba aproximadamente 4700 bases y contiene una región terminal repetida invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que sirve como origen de replicación para el virus. El resto del genoma se divide en dos regiones esenciales que tienen las funciones de encapsidación: la parte de la izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación vírica y la expresión de los genes víricos; y la parte de la derecha del genoma que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápside del virus.
Los vectores AAV se pueden preparar utilizando métodos convencionales en la técnica. Son adecuados los virus adenoasociados de cualquier serotipo (véase, por ejemplo, Blacklow, pp. 165-174 of “Parvoviruses and Human Disease” J. R. Pattison, ed. (1988); Rose, Comprehensive Virology 3:1, 1974; P. Tattersall “The Evolution of Parvovirus Taxonomy” en Parvoviruses (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) p5-14, Hudder Arnold, London, UK (2006); y DE Bowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski “The Genus Dependovirus” (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, r M Linden, CR Parrish, Eds.) pl5-23, Hudder Arnold, London, UK (2006)). Los métodos para la purificación de vectores se pueden encontrar, por ejemplo, en las Pat. de EE. UU. N.° 6566118, 6989264, y 6995006 y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO/1999/011764 titulada “Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors”. La preparación de vectores híbridos se describe, por ejemplo, en la Solicitud de PCT N.° PCT/US2005/027091. El uso de vectores derivados de AAV para la transferencia de genes in vitro e in vivo se ha descrito (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 91/18088 y WO 93/09239; Patentes de EE. UU. N.° 4.797.368, 6.596.535, y 5.139.941 y Patente Europea N.° 0488528). Estas publicaciones describen distintas construcciones derivadas de a Av en las que los genes rep y cap se han eliminado y remplazado por un gen de interés, y el uso de estas construcciones para la transferencia del gen de interés in vitro (en células cultivadas) o in vivo (directamente en un organismo). Se puede preparar un AVV recombinante deficiente en replicación mediante la co-transfección de un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico de interés flanqueada por dos regiones terminales repetidas invertidas (ITR) de AAV, y un plásmido que tiene los genes de encapsidación de AAV (genes rep y cap), en una línea celular que está infectada por un virus humano auxiliar (por ejemplo, un adenovirus). Los AAV recombinantes que se producen se purifican entonces por técnicas convencionales.
En algunas realizaciones un vector recombinante en cuestión está encapsidado en una partícula vírica (Por ejemplo, partículas víricas de AAV que incluyen, pero no se limitan a AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, y AAV16). En consecuencia, la presente divulgación incluye una partícula vírica recombinante (recombinante debido a que contiene un polinucleótido recombinante) que comprende cualquiera de los vectores descritos en el presente documento. Los métodos de producción de dichas partículas se conocen en la técnica y se describen en la Patente de EE. UU. N.° 6.596.535.
En algunos casos, un ácido nucleico que codifica una opsina descrita en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la opsina, donde la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control de transcripción específico de neuronas.
Los promotores específicos de neuronas y otros elementos de control (por ejemplo, amplificadores) se conocen en la técnica. Las secuencias de control específicas de neuronas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, el promotor enolasa específico de neuronas (NSE) (véase, por ejemplo, NSE EMBL, X51956; véase también por ejemplo, la Pat. de EE. u U. N.° 6.649.811, Pat. de EE. UU. N.° 5.387.742); un promotor de descarboxilasa de aminoácidos aromáticos (AADC), un promotor de neurofilamento (véase, por ejemplo, GenBank HUMNFL L04147); un promotor de sinapsina (véase, por ejemplo, GenBank HUMSYNIB M55301); un promotor thy-1 (véase, por ejemplo, Chen et al. (1987) Cell 51:7-19; y Llewellyn et al. (2010) Nat. Med. 16: 1161); un promotor de receptor de serotonina (véase, por ejemplo, GenBank S62283); un promotor de hidroxilasa de tirosina (TH) (véase, por ejemplo, Nucl. Acids. Res.
15:2363-2384 (1987) y Neuron 6:583-594 (1991)); un promotor de GnRH (véase, por ejemplo, Radovick et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406 (1991)); un promotor L7 (véase, por ejemplo, Oberdick et al, Science 248:223-226 (1990)); un promotor DNMT (véase, por ejemplo, Bartge et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652 (1988)); un promotor de encefalina (véase, por ejemplo, Comb et al, EMBO J. 17:3793-3805 (1988)); un promotor de proteína mielínica básica (MBP); un amplificador de CMV/promotor del factor-p de crecimiento derivado de plaquetas (véase, por ejemplo, Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60); un promotor del gen Hb9 específico de neurona motora (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 7.632.679; y Lee et al. (2004) Development 131:3295-3306); y una subunidad alfa del promotor de la proteína cinasa II dependiente de la calmodulina-Ca(2+) (CaMKIIa) (véase, por ejemplo, Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250).
Células huésped
Se describen en el presente documento células huésped modificadas genéticamente (por ejemplo, células in vitro) que están modificadas genéticamente con un ácido nucleico en cuestión. En algunas realizaciones, una célula huésped modificada genéticamente aislada en cuestión puede producir una opsina de la presente divulgación. Las células huésped adecuadas incluyen células huésped eucariotas, tal como una célula de mamífero, una célula huésped de insecto, una célula de levadura; y células procariotas, tal como una célula bacteriana. La introducción de un ácido nucleico en cuestión en la célula huésped se puede efectuar, por ejemplo, mediante precipitación en fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE dextrano, transfección mediada por liposomas, electroporación, u otro método conocido.
Las células de mamífero adecuadas incluyen células primarias y líneas celulares inmortalizadas. En algunos casos, la célula de mamífero es una neurona, por ejemplo, una neurona no inmortalizada (primaria). En otros casos, la célula de mamífero es una línea celular inmortalizada
Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares humanas, líneas celulares de primates no humanos, líneas celulares de roedores (por ejemplo, de ratón o rata), y similares. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células HeLa (por ejemplo, de la colección americana de cultivos tipo (ATCC) N.° CCL-2), células CHO (por ejemplo, ATCC N.° CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por ejemplo, ATCC N.° CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por ejemplo, ATCC N.° CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por ejemplo, ATCC N.° CCL10), células PC12 (ATCC N.° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC N.° CRL1651), células RATI, células L de ratón (ATCC N.° CCLI.3), células de riñón embrionario humano (h Ek ) (ATCC N.° CRL1573), células HLHepG2, y similares.
En algunas realizaciones, la célula es una célula neuronal o una célula tipo neuronal. Las células pueden ser de origen humano, primate no humano, ratón o rata, o se derivan de otros mamíferos diferentes de un ser humano, primate no humano, rata o ratón. Las líneas celulares adecuadas incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares del glioma humano, por ejemplo, SVGpl2 (ATCC CRL-8621), CCF-STTG1 (ATCC CRL-1718), SW 1088 (ATCC HTB-12), SW 1783 (ATCC HTB-13), LLN-18 (ATCC CRL-2610), LNZTA3WT4 (ATCC CRL-11543), LNZTA3WT11 (ATCC CRL-11544), U-138 MG (ATCC HTB-16), U-87 MG (ATCC HTB-14), H4 (ATCC HTB-148), y LN-229 (ATCC CRL-2611); una línea celular derivada del meduloblastoma humano, por ejemplo, D342 Med (ATCC HTB-187), Daoy (ATCC HTB-186), D283 Med (ATCC HTB-185); una línea celular tipo neuronal derivada de tumor humano, por ejemplo, PFSK-1 (ATCC CRL-2060), SK-N-DZ (ATCCCRL-2149), SK-N-AS (ATCC CRL-2137), SK-N-FI (ATCC CRL-2142), IMR-32 (ATCC CCL-127), etc.; un línea celular neuronal de ratón, por ejemplo, BC3H1 (ATCC CRL-1443), EOC1 (ATCC CRL-2467), C8-D30 (ATCC CRL-2534), C8-S (ATCC CRL-2535), Neuro-2a (ATCC CCL-131), NB41A3 (ATCC CCL-147), SW10 (ATCC CRL-2766), NG108-15 (ATCC HB-12317); una línea celular neuronal de rata, por ejemplo, PC-12 (ATCC CRL-1721), CTX TNA2 (ATCC CRL-2006), C6 (ATCC CCL-107), F98 (ATCC CRL-2397), RG2 (ATCC CRL-2433), B35 (ATCC CRL-2754), R3 (ATCC CRL-2764), SCP (ATCC CRL-1700), OA1 (ATCC CRL-6538).
Las células de levadura adecuadas incluyen pero no se limitan a, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii, y similares.
Las células procariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de varias cepas de laboratorio de Escherichia coli, Lactobacillus sp., Salmonella sp., Shigella sp., y similares. Véase, por ejemplo, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 48:1176-1181; Patente de EE. UU. N.° 6.447.784; y Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302. Ejemplos de cepas de Salmonella que se pueden emplear en la presente invención incluye, pero no se limitan a, Salmonella typhi y S. typhimurium. Las cepas de Shigella adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Shigella flexneri, Shigella sonnei, y Shigella disenteriae. Normalmente, la cepa de laboratorio es una que no sea patógena. Ejemplos no limitantes de otras bacterias adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus subtilis, Pseudomonas pudita, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Rhodococcus sp., y similares En algunas realizaciones, la célula huésped es Escherichia coli.
VARIANTES DE OPSINA CON AUMENTO DEL TRÁFICO DE MEMBRANA
Se describen en el presente documento opsinas con propiedades de tráfico de membrana aumentadas. Se describen en el presente documento ácidos nucleicos que codifican las variantes de opsina. En particular, una variante de opsina descrita en el presente documento es una opsina hiperpolarizante que incluye una secuencia de exportación del retículo endoplásmico (ER), una secuencia de tráfico (TS), o ambas, una secuencia de exportación ER y una TS. La presencia de la secuencia de exportación del ER y/o la TS proporciona un aumento de localización en la membrana (Por ejemplo, la membrana plasmática y la exportación del ER. En algunos casos, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende uno o más aminoácidos adicionales, que se pueden disponer entre la TS y la ER y/o entre la opsina y la TS.
Por lo tanto, en algunos casos, una variante de opsina comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo, un polipéptido opsina; una secuencia de tráfico; y una secuencia de exportación ER.
Opsinas hiperpolarizantes
Las secuencias de aminoácidos de opsinas que son adecuadas para la inclusión en una variante de opsina descrita en el presente documento incluye, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 220 aminoácidos, desde aproximadamente 220 aminoácidos a aproximadamente 230 aminoácidos, desde aproximadamente 230 aminoácidos a aproximadamente 240 aminoácidos, o desde aproximadamente 240 aminoácidos a aproximadamente 257 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 8A (arqueorrodopsina-3 de Halorubrum sodomense).
Las secuencias de aminoácidos de opsinas que son adecuadas para la inclusión en una variante de opsina descrita en el presente documento incluye, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 220 aminoácidos, desde aproximadamente 220 aminoácidos a aproximadamente 230 aminoácidos, desde aproximadamente 230 aminoácidos a aproximadamente 240 aminoácidos, o desde aproximadamente 240 aminoácidos a aproximadamente 257 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9A (arqueorrodopsina de la cepa TP009 de Halorubrum sodomense).
Las secuencias de aminoácidos de opsina que son adecuadas para la inclusión en una variante de opsina descrita en el presente documento incluye, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 225 aminoácidos, desde aproximadamente 225 aminoácidos a aproximadamente 250 aminoácidos, desde aproximadamente 250 aminoácidos a aproximadamente 275 aminoácidos, desde aproximadamente 275 aminoácidos a aproximadamente 300 aminoácidos, o desde aproximadamente 300 aminoácidos a aproximadamente 313 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 10A (opsina de Leptosphaeria maculans).
Secuencias de exportación del retículo endoplásmico
Las secuencias de exportación del retículo endoplásmico (ER) que son adecuadas para su uso en una opsina modificada de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: 1); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3), FXYENE (SeQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5); y similares. Una secuencia de exportación de ER puede tener una longitud de desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos, por ejemplo, desde aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 10 aminoácidos, desde aproximadamente 10 aminoácidos a aproximadamente 15 aminoácidos, desde aproximadamente 15 aminoácidos a aproximadamente 20 aminoácidos, o desde aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos.
Secuencias de tráfico
Las secuencias de tráfico que son adecuadas para su uso en una opsina modificada de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos, tal como una de las siguientes:
1) el péptido de señal de hChR2 (por ejemplo, MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS (SEQ ID NO: 6)) 2) la subunidad p2 del receptor nicotínico de acetilcolina neuronal (por ejemplo, MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF (SEQ ID NO: 7));
3) una secuencia de señal del receptor nicotínico de acetilcolina (por ejemplo, MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG (SEQ ID NO: 8));
4) una secuencia de señal del receptor nicotínico de acetilcolina (por ejemplo, MRGTPLLLVVSLFSLLQD (SEQ ID NO: 9));
5) Una secuencia de señal del rectificador hacia dentro del canal de potasio Kir2.1 humano (por ejemplo, KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO: 10)).
Una secuencia de tráfico que puede tener una longitud de desde aproximadamente 10 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, por ejemplo, desde aproximadamente 10 aminoácidos a aproximadamente 20 aminoácidos, desde aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 30 aminoácidos, desde aproximadamente 30 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos, o desde aproximadamente 40 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos.
Secuencias adicionales
Como se ha señalado anteriormente, en algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende uno o más aminoácidos además de la opsina, la TS, y la secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: una opsina; una TS; una secuencia de aminoácidos intercalada; y una secuencia de señal de exportación del ER.
Las secuencias de aminoácidos intercaladas adecuadas incluyen, por ejemplo, enlazadores; marcadores epitópicos, proteínas fluorescentes; péptidos que proporcionan facilidad de purificación; péptidos enlazadores escindibles, y similares.
Las proteínas fluorescentes adecuadas que se pueden incluir en una variante de opsina descrita en el presente documento incluyen pero no se limitan a, una proteína fluorescente verde de Aequoria victoria o un mutante o derivado de la misma, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE. UU. N.° 6.066.476; 6.020.192; 5.985.577; 5.976.796; 5.968.750; 5.968.738; 5.958.713; 5.919.445; 5.874.304; por ejemplo, la GFP aumentada, muchas de dichas GFP que están disponibles en el mercado, por ejemplo, en Clontech, Inc.; una proteína fluorescente roja; una proteína fluorescente amarilla; mCherry; cualquiera de varias proteínas fluorescentes y coloreadas de especies de Antozoanos, como se describe, por ejemplo, en Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973; y similares.
Variantes de opsina a modo de ejemplo
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 220 aminoácidos, desde aproximadamente 220 aminoácidos a aproximadamente 230 aminoácidos, desde aproximadamente 230 aminoácidos a aproximadamente 240 aminoácidos, o desde aproximadamente 240 aminoácidos a aproximadamente 257 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 8A (arqueorrodopsina-3 de Halorubrum sodomense); y b) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: l); VLGSL (SEQ ID NO: 2); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SEQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 220 aminoácidos, desde aproximadamente 220 aminoácidos a aproximadamente 230 aminoácidos, desde aproximadamente 230 aminoácidos a aproximadamente 240 aminoácidos, o desde aproximadamente 240 aminoácidos a aproximadamente 257 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 8A (arqueorrodopsina-3 de Halorubrum sodomense); b) una proteína fluorescente y c) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: 1); VLGSL (SEQ ID NO: 2); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SEQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 7A.
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 220 aminoácidos, desde aproximadamente 220 aminoácidos a aproximadamente 230 aminoácidos, desde aproximadamente 230 aminoácidos a aproximadamente 240 aminoácidos, o desde aproximadamente 240 aminoácidos a aproximadamente 257 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 8A (arqueorrodopsina-3 de Halorubrum sodomense); b) una secuencia TS y c) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, una secuencia TS puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS (SEQ ID NO: 6); MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF (SEQ ID NO: 7); MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG (SEQ ID NO: 8); MRGTPLLLVVSLFSLLQD (SEQ ID NO: 9); y KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO: 10). Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: l); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SEQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 220 aminoácidos, desde aproximadamente 220 aminoácidos a aproximadamente 230 aminoácidos, desde aproximadamente 230 aminoácidos a aproximadamente 240 aminoácidos, o desde aproximadamente 240 aminoácidos a aproximadamente 257 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 8A (arqueorrodopsina-3 de Halorubrum sodomense); b) una secuencia TS; c) una proteína fluorescente y d) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, una secuencia TS puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS (SEQ ID NO: 6); MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF (SEQ ID NO: 7); MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG (SEQ ID NO: 8); MRGTPLLLVVSLFSLLQD (SEQ ID NO: 9); y KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO: 10). Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: 1); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SEQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 7B.
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 220 aminoácidos, desde aproximadamente 220 aminoácidos a aproximadamente 230 aminoácidos, desde aproximadamente 230 aminoácidos a aproximadamente 240 aminoácidos, o desde aproximadamente 240 aminoácidos a aproximadamente 257 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9A (la opsina de la cepa TP009 de Halorubrum sodomense); b) una secuencia TS y c) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, una secuencia TS puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS (SEQ ID NO: 6); MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF (SEQ ID NO: 7); MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG (SEQ ID NO: 8); MRGTPLLLVVSLFSLLQD (SEQ ID NO: 9); y KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO: 10). Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: l); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SEQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 220 aminoácidos, desde aproximadamente 220 aminoácidos a aproximadamente 230 aminoácidos, desde aproximadamente 230 aminoácidos a aproximadamente 240 aminoácidos, o desde aproximadamente 240 aminoácidos a aproximadamente 257 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9A (la opsina de la cepa TP009 de Halorubrum sodomense); b) una secuencia TS; c) una proteína fluorescente y d) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, una secuencia TS puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS (SEQ ID NO: 6); MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF (SEQ ID NO: 7); MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG (SEQ ID NO: 8); MRGTPLLLVVSLFSLLQD (SEQ ID NO: 9); y KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO: 10). Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: 1); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SEQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 7C.
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 225 aminoácidos, desde aproximadamente 225 aminoácidos a aproximadamente 250 aminoácidos, desde aproximadamente 250 aminoácidos a aproximadamente 275 aminoácidos, desde aproximadamente 275 aminoácidos a aproximadamente 300 aminoácidos, o desde aproximadamente 300 aminoácidos a aproximadamente 313 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 10A (opsina de Leptosphaeria maculans); y b) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: 1); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SeQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 225 aminoácidos, desde aproximadamente 225 aminoácidos a aproximadamente 250 aminoácidos, desde aproximadamente 250 aminoácidos a aproximadamente 275 aminoácidos, desde aproximadamente 275 aminoácidos a aproximadamente 300 aminoácidos, o desde aproximadamente 300 aminoácidos a aproximadamente 313 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 10A (opsina de Leptosphaeria maculans); b) una proteína fluorescente y c) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: 1); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SEQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 7D.
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 225 aminoácidos, desde aproximadamente 225 aminoácidos a aproximadamente 250 aminoácidos, desde aproximadamente 250 aminoácidos a aproximadamente 275 aminoácidos, desde aproximadamente 275 aminoácidos a aproximadamente 300 aminoácidos, o desde aproximadamente 300 aminoácidos a aproximadamente 313 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 10A (opsina de Leptosphaeria maculans); b) una secuencia TS y c) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, una secuencia TS puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS (SEQ ID NO: 6); MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF (SEQ ID NO: 7); MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG (SEQ ID NO: 8); MRGTPLLLVVSLFSLLQD (SEQ ID NO: 9); y KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO: 10). Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: 1); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SEQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende, en orden desde el extremo amino al extremo carboxilo: a) una opsina hiperpolarizante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a un tramo contiguo de desde aproximadamente 200 aminoácidos a aproximadamente 225 aminoácidos, desde aproximadamente 225 aminoácidos a aproximadamente 250 aminoácidos, desde aproximadamente 250 aminoácidos a aproximadamente 275 aminoácidos, desde aproximadamente 275 aminoácidos a aproximadamente 300 aminoácidos, o desde aproximadamente 300 aminoácidos a aproximadamente 313 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 10A (opsina de Leptosphaeria maculans); b) una secuencia TS y c) una secuencia de exportación del ER. Por ejemplo, una secuencia TS puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS (SEQ ID NO: 6); MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF (SEQ ID NO: 7);
MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG (SEQ ID NO: 8); MRGTPLLLVVSLFSLLQD (SEQ ID NO: 9); y KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID No : 10). Por ejemplo, la secuencia de exportación del ER se selecciona de entre VXXSL (donde X es cualquier aminoácido) (por ejemplo, VKESL (SEQ ID NO: 1); VLGSL (SEQ ID NO: 2); etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO: 3); y FXYENE (SEQ ID NO: 4) (donde X es cualquier aminoácido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, una variante de opsina descrita en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 7E.
Ácidos nucleicos
Se describen en el presente documento ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de opsina descrita en el presente documento. Una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de opsina descrita en el presente documento puede estar unida operativamente a uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y un amplificador, que permitan la expresión de la secuencia de nucleótidos en las células diana que se pretenda (por ejemplo, una célula que se haya modificado genéticamente para sintetizar la variante de opsina codificada). En algunos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de opsina está unida operativamente a un elemento de control transcripcional que proporciona la expresión específica neuronal. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica una variante de opsina descrita en el presente documento tiene el codón optimizado para la expresión en una célula de mamífero.
Los elementos promotores y amplificadores se conocen en la técnica. Para la expresión en una célula bacteriana, los promotores adecuados, incluyen, pero no se limitan a, lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P y trc. Para la expresión en una célula eucariota, los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotores genéticos de cadenas ligeras y/o pesadas de inmunoglobulinas y elementos amplificadores; promotor temprano inmediato de citomegalovirus, promotor timidina cinasa del virus del herpes simple, promotores de SV40 tempranos y tardíos; el promotor presente en las repeticiones terminales largas de un retrovirus; promotor metalotioneína-I del ratón, y distintos promotores específicos de tejido conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, por ejemplo, para la expresión en una célula de levadura, un promotor adecuado es un promotor constitutivo tal como un promotor ADH1, un promotor PGK1, un promotor ENO, un promotor PYK1, y similares, o un promotor regulable tal como un promotor GAL1, un promotor GAL10, un promotor ADH2, un promotor PHO5, un promotor CUP1, un promotor GAL7, un promotor MET25, un promotor MET 3, un promotor CYC1, un promotor HIS3, un promotor ADH1, un promotor PGK, un promotor GAPDH, un promotor ADC1, un promotor TRP1, un promotor URA3, un promotor LEU2, un promotor ENO, un promotor TP1, y AOX1 (por ejemplo, para su uso en Pichia). La selección del vector y promotor adecuados está en el nivel del experto habituado en la técnica.
Los promotores adecuados para su uso en células huésped procariotas incluyen, pero no se limitan a, un promotor de ARN polimerasa T7 de bacteriófago, un promotor trp, un promotor de operón Iac, un promotor híbrido, por ejemplo, un promotor híbrido Iac/tac, un promotor híbrido tac/trc, un promotor trp/Iac, un promotor T7/Iac, un promotor trc, un promotor tac, y similares; un promotor araBAD, promotores regulados in vivo tal como un promotor ssaG o un promotor relacionado (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE. UU. N.° 20040131637), un promotor apagC (Pulkkinen y Miller, J. Bacteriol, 1991: 173(1): 86-93.; Alpuche-Aranda et al, PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), un promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), y similares (véase, por ejemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; y Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); un promotor sigma70, por ejemplo un promotor sigma70 de consenso (véase, por ejemplo, los N.° de registro en GenBank AX798980, AX798961, y AX798183); un promotor de fase estacionaria, por ejemplo un promotor dps, un promotor spv, y similares; un promotor derivado de la isla de patogenicidad SPI-2 (véase, por ejemplo el documento WO 96/17951); un promotor actA (véase, por ejemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); un promotor rpsM (véase, por ejemplo, Valdivia y Falkow (1996). Mol. Microbiol.
22:367); un promotor tet (véase, por ejemplo, Hillen, W. y Wissmann, A. (1989) en Saenger, W. y Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162); un promotor SP6 (véase, por ejemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035); y similares. Los promotores fuertes adecuados para su uso en procariotas tales como Escherichia coli incluyen, pero no se limitan a Trc, Tac, T5. T7 y PLambda. Ejemplos no limitantes de operadores para su uso en células huésped bacterianas incluyen un operador de promotor de lactosa (la conformación de la proteína represora Lad cambia cuando se pone en contacto con lactosa, evitando de esta manera que la proteína represora Lad se una al operador), un operador de promotor de triptófano, la proteína represora TrpR tiene una conformación que se une al operador, en ausencia de triptófano, la proteína TrpR represora tiene una conformación que no se une al operador), y el operador del promotor tac (véase, por ejemplo, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25).
Una secuencia de nucleótidos que codifica una opsina descrita en el presente documento puede estar presente en un vector de expresión y/o un vector de clonación. Un vector de expresión puede incluir un marcador genético, un origen de replicación, y otras características que se proporcionan para la replicación y/o el mantenimiento del vector.
Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados; muchos están disponibles en el mercado para generar las construcciones recombinantes en cuestión. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif, USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucarióticos: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia).
Los vectores de expresión tienen en general sitios de restricción convenientes localizados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de interés (por ejemplo, una variante de opsina). Puede estar presente un marcador genético en el huésped de expresión. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos (por ejemplo, vectores víricos basados en virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, por ejemplo, Li et al, Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al, Gene Ther 6:515524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:77007704, 1995; Sakamoto et al, H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociados (véase, por ejemplo, Ali et al, Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al, PNAS 94:69166921, 1997; Bennett et al, Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et al, Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al, Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al, Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en el documento WO 93/09239, Samulski et al, J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al, Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et al, PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de la inmunodeficiencia humana (véase, por ejemplo, Miyoshi et al, PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:78127816, 1999); un vector retrovírico (por ejemplo, del virus de leucemia murina, virus de la necrosis esplénica, y vectores derivados de retrovirus tal como el virus del Sarcoma de Rous, virus del Sarcoma de Harvey, virus de leucosis aviar, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo, y virus de tumor mamario), y similares
También se describe en el presente documento un vector recombinante que comprende un polinucleótido en cuestión que codifica una variante de opsina descrita en el presente documento o cualquier variante de la misma. Un vector recombinante en cuestión también incluye los vectores que comprenden un polinucleótido que codifica un ARN (por ejemplo, un ARNm) que cuando se transcribe a partir de los polinucleótidos del vector dará como resultado la acumulación de una opsina descrita en el presente documento en las membranas plasmáticas de las células animales diana. Los vectores que se pueden utilizar incluyen, sin limitación, vectores lentivíricos, HSV, adenovíricos, y víricos adenoasociados (AAV). Los lentivirus incluyen, pero no se limitan a VIH-1, VIH-2, SIV, FIV y EIAV. Los lentivirus pueden seudotiparse con las proteínas de envoltura de otros virus, incluyendo, pero sin limitarse a, VSV, rabia, Mo-MLV, baculovirus y Ébola. Dichos vectores pueden prepararse utilizando métodos convencionales en la técnica.
En algunas realizaciones, el vector es un vector AAV recombinante. Los vectores AAV son virus ADN de tamaño relativamente pequeño que pueden integrarse, de manera estable y específica del sitio, en el genoma de las células que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento celular, morfología o diferenciación, y no parecen estar implicados en patologías humanas. El genoma de los AAV se ha clonado, secuenciado y caracterizado. Engloba aproximadamente 4700 bases y contiene una región terminal repetida invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que sirve como origen de replicación para el virus. El resto del genoma se divide en dos regiones esenciales que tienen las funciones de encapsidación: la parte de la izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación vírica y la expresión de los genes víricos; y la parte de la derecha del genoma que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápside del virus.
Los vectores AAV se pueden preparar utilizando métodos convencionales en la técnica. Son adecuados los virus adenoasociados de cualquier serotipo (véase, por ejemplo, Blacklow, pp. 165-174 of “Parvoviruses and Human Disease” J. R. Pattison, ed. (1988); Rose, Comprehensive Virology 3:1, 1974; P. Tattersall “The Evolution of Parvovirus Taxonomy” en Parvoviruses (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) p5-14, Hudder Arnold, London, UK (2006); y DE Bowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski “The Genus Dependovirus” (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, r M Linden, CR Parrish, Eds.) pl5-23, Hudder Arnold, London, UK (2006)). Los métodos para la purificación de vectores se pueden encontrar, por ejemplo, en las Pat. de EE. UU. N.° 6566118, 6989264, y 6995006 y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO/1999/011764 titulada “Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors”. La preparación de vectores híbridos se describe, por ejemplo, en la Solicitud de PCT N.° PCT/US2005/027091. El uso de vectores derivados de AAV para la transferencia de genes in vitro e in vivo se ha descrito (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 91/18088 y WO 93/09239; Patentes de EE. UU. N.° 4.797.368, 6.596.535, y 5.139.941 y Patente Europea N.° 0488528). Estas publicaciones describen distintas construcciones derivadas de a Av en las que los genes rep y cap se han eliminado y remplazado por un gen de interés, y el uso de estas construcciones para la transferencia del gen de interés in vitro (en células cultivadas) o in vivo (directamente en un organismo). Se puede preparar un AVV recombinante deficiente en replicación mediante la co-transfección de un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico de interés flanqueada por dos regiones terminales repetidas invertidas (ITR) de AAV, y un plásmido que tiene los genes de encapsidación de AAV (genes rep y cap), en una línea celular que está infectada por un virus humano auxiliar (por ejemplo, un adenovirus). Los AAV recombinantes que se producen se purifican entonces por técnicas convencionales.
En algunas realizaciones un vector recombinante en cuestión está encapsidado en una partícula vírica (Por ejemplo, partículas víricas de AAV que incluyen, pero no se limitan a AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, y AAV16). En consecuencia, la presente divulgación incluye una partícula vírica recombinante (recombinante debido a que contiene un polinucleótido recombinante) que comprende cualquiera de los vectores descritos en el presente documento. Los métodos de producción de dichas partículas se conocen en la técnica y se describen en la Patente de EE. UU. N.° 6.596.535.
Como se ha señalado anteriormente, en algunos casos, una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de opsina en cuestión está unida operativamente a un promotor específico de neuronas. Los promotores específicos de neuronas y otros elementos de control (por ejemplo, amplificadores) se conocen en la técnica. Las secuencias de control específicas de neuronas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, el promotor enolasa específico de neuronas (NSE) (véase, por ejemplo, NSE EMBL, X51956; véase también por ejemplo, la Pat. de EE. UU. N.° 6.649.811, Pat. de EE. u U. N.° 5.387.742); un promotor de descarboxilasa de aminoácidos aromáticos (AADC), un promotor de neurofilamento (véase, por ejemplo, GenBank HUMNFL L04147); un promotor de sinapsina (véase, por ejemplo, GenBank HUMSYNIB M55301); un promotor thy-1 (véase, por ejemplo, Chen et al. (1987) Cell 51: 7-19); un promotor de receptor de serotonina (véase, por ejemplo, GenBank S62283); un promotor de hidroxilasa de tirosina (TH) (véase, por ejemplo, Nucl. Acids. Res. 15:2363-2384 (1987) y Neuron 6:583-594 (1991)); un promotor de GnRH (véase, por ejemplo, Radovick et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406 (1991)); un promotor L7 (véase, por ejemplo, Oberdick et al, Science 248:223-226 (1990)); un promotor DNMT (véase, por ejemplo, Bartge et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652 (1988)); un promotor de encefalina (véase, por ejemplo, Comb et al, EMBO J. 17:3793-3805 (1988)); un promotor de proteína mielínica básica (MBP); un amplificador de CMV/promotor del factor-p de crecimiento derivado de plaquetas (véase, por ejemplo, Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60); un promotor del gen Hb9 específico de neurona motora (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 7.632.679; y Lee et al. (2004) Development 131:3295-3306); y un promotor de la subunidad alfa de la proteína cinasa II dependiente de la calmodulina-Ca(2+) (CaMKIIa) (véase, por ejemplo, Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250). UTILIDAD
Una opsina descrita en el presente documento es útil para la modulación del potencial de tensión de una célula. Una opsina descrita en el presente documento es útil en aplicaciones terapéuticas y el cribado de fármacos. Una opsina descrita en el presente documento es útil en la generación de modelos de enfermedad.
Modulación del potencial de tensión en una célula
Por ejemplo, una opsina descrita en el presente documento es útil para la modulación del potencial de tensión de una célula, por ejemplo, una neurona. La célula puede estar in vitro o in vivo. Por lo tanto, por ejemplo, se describe en el presente documento un método para ajustar el potencial de tensión de células, regiones subcelulares o regiones extracelulares, implicando en general el método: la introducción de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una opsina descrita en el presente documento (por ejemplo, una bomba de protones dirigida por la luz) en al menos una célula diana, región subcelular, o región extracelular, operando la opsina para cambiar el potencial transmembrana en respuesta a una longitud de onda específica de luz; y producir la expresión del ácido nucleico exponiendo la células diana, región subcelular, o región extracelular a la longitud de onda específica de luz de una manera diseñada para producir que un potencial de tensión de la célula diana, región subcelular, o región extracelular aumente o disminuya.
En algunos casos, un método descrito en el presente documento implica adicionalmente la etapa de aumentar o disminuir el potencial de tensión de las células diana, región subcelular, o región extracelular hasta que esté hiperpolarizada. Cuando la célula diana, región subcelular, o región extracelular es una neurona, la hiperpolarización consigue el silenciamiento neuronal.
En algunos casos, un método descrito en el presente documento implica la etapa de utilización de una pluralidad de diferentes opsinas (por ejemplo, bombas de protones activadas por la luz) que responden a diferentes longitudes de onda de luz para conseguir un silenciamiento neural multicolor por las etapas de expresión de cada opsina (por ejemplo, una bomba de protones activada por la luz) en una población diferente de células, y la iluminación de las células con diferentes colores de luz.
Se describe en el presente documento un método para ajustar el pH de una célula, región subcelular, o región extracelular, implicando en general el método: introducir un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una opsina descrita en el presente documento (por ejemplo, una bomba de protones dirigida por la luz) en al menos una célula diana, región subcelular o región extracelular, operando la opsina para cambiar el pH en la célula, región subcelular, o región extracelular en respuesta a una longitud de onda específica de luz, y producir la expresión del ácido nucleico exponiendo la célula diana, región subcelular, o región extracelular a la longitud de onda específica de luz de una manera diseñada para producir que el pH de la célula diana, región subcelular, o región extracelular aumente o disminuya.
Se describe en el presente documento un método para hacer que las células, regiones subcelulares o regiones extracelulares, liberen protones como transmisores químicos, implicando en general el método:
la introducción de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una opsina descrita en el presente documento (por ejemplo, una bomba de protones dirigida por la luz) en al menos una célula diana, región subcelular, o región extracelular, operando la opsina para producir una liberación de protones en respuesta a una longitud de onda específica de luz; y producir la expresión del ácido nucleico exponiendo la célula diana, región subcelular, o región extracelular a la longitud de onda específica de luz de una manera diseñada para producir que la célula diana, región subcelular, o región extracelular libere protones. Aplicaciones de modulación de la célula diana
Se describe en el presente documento una célula diana modificada genéticamente con un ácido nucleico descrito en el presente documento (por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una opsina, por ejemplo, una variante de opsina). En algunos casos, las células diana son neuronas localizadas en el cerebro de un mamífero. Las células diana están modificadas genéticamente para que expresen una opsina fotosensible, por ejemplo, una opsina descrita en el presente documento (por ejemplo, una variante de opsina descrita en el presente documento), como se ha descrito anteriormente. La luz se puede utilizar entonces para estimular las neuronas. Dependiendo del número de factores, tales como la localización en el cerebro y la frecuencia y longitud de la estimulación, se pueden alcanzar diferentes objetivos. Por ejemplo, las técnicas actuales para el estímulo profundo del cerebro (DBS) usan electrodos para aplicar una corriente directamente en un área dirigida del cerebro. A veces se hace referencia a la frecuencia del estímulo eléctrico como DBS de baja frecuencia o DBS de alta frecuencia. Los estudios han sugerido que el DBS de alta frecuencia inhibe la generación de impulsos de las células estimuladas, mientras que la DBS de baja frecuencia facilita la generación de impulso de las células estimuladas. Las frecuencias que producen los efectos de DBS de alta frecuencia o baja frecuencia también han demostrado variar dependiendo del área específica del cerebro que se va a estimular. De acuerdo con un ejemplo de DBS de alta frecuencia, las neuronas se estimulan utilizando electrodos que suministran pulsos de corriente a frecuencias alrededor de 100 Hz o más. Dicha frecuencia ha demostrado ser eficaz en ciertas aplicaciones, como se expone posteriormente en el presente documento.
Un ejemplo específico de DBS se utiliza para la enfermedad de Parkinson. En esta aplicación, se aplica a menudo el DBS en el globus pallidus interno, o el núcleo subtalámico en el cerebro del paciente. Implantando una composición biológica que modifica las células para responder a la luz, una luz parpadeante, se puede utilizar la luz en lugar de electrodos. Por lo tanto, no es necesario aplicar directamente la señal eléctrica externa a las células neuronales dirigidas. Además, la luz puede viajar a menudo desde su punto de origen más allá que la electricidad, aumentando de esta manera el área eficaz con respecto a la fuente de estimulación y solamente las neuronas que se han fotosensibilizado se estimulan.
Como con los métodos de DBS basados en electrodos, un uso de la presente invención puede implementarse utilizando DBS de alta frecuencia para inhibir los impulsos neuronales generados. Mientras que se ha conseguido el DBS de alta frecuencia a frecuencias alrededor de 100 Hz, el DBS de alta frecuencia que se utiliza en distintas realizaciones de la presente divulgación puede que no deba tener necesariamente la misma frecuencia. Por ejemplo, puede ser posible reproducir los efectos inhibidores del DBS de alta frecuencia a bajas frecuencias (por ejemplo, de 50 Hz) cuando se utilizan técnicas activadas por la luz. Por ejemplo, la activación de una opsina hiperpolarizante puede dar como resultado la hiperpolarización y la resistencia a la generación de un potencial de acción. Se pueden utilizar distintas frecuencias dependiendo de la aplicación particular (por ejemplo, la parte del cerebro direccionada y el efecto deseado), y la modalidad de estimulación que se vaya a aplicar.
En consonancia con otro ejemplo del uso de la presente invención, se utilizan vectores de transferencia genética que inducen la expresión de biomoléculas fotosensibles para dirigirse a un tipo específico de célula. Por ejemplo, se pueden crear proteínas basadas en virus (por ejemplo, de lentivirus, virus adenoasociados o retrovirus) para que se dirijan a tipos específicos de células, basándose en las proteínas que solamente expresan ellas. Las células dirigidas se infectan entonces mediante las proteínas de transferencia genética basadas en virus y comienzan a producir el nuevo tipo de canal iónico (por ejemplo, una opsina descrita en el presente documento, una variante de opsina descrita en el presente documento) volviéndolas de esta manera fotosensibles. Esto puede ser particularmente útil para la estimulación de las células dirigidas sin estimular otras células que estén en proximidad de las células dirigidas. Por ejemplo, neuronas de diferente longitud, diámetro, cronaxia, otras propiedades de membrana, aislamiento eléctrico, liberación de neurotransmisor, y función general, que se encuentran en estrecha proximidad entre ellas, y por lo tanto pueden ser estimuladas sin querer cuando se utilizan electrodos para proporcionar la estimulación de las neuronas. Véase, por ejemplo, Gradinaru et al. (2007), J. Neurosci. 27(52): 14231-14238; Zhang et al. (2007) Nature 446: 633-639, Zhang et al. (2007) Nature Reviews Neuroscience Vol. 8: 577-581.
Se describe en el presente documento una composición implantable para su uso in vivo. Se incluye un diodo emisor de luz, láser o fuente de luz similar para la generación de luz. Una parte biológica que modifica las células diana para incluir moléculas de respuesta a la luz que facilitan la estimulación de las células diana en respuesta a la luz generada por la fuente de luz.
Otra realización de la presente divulgación emplea una composición para estimular células diana utilizando una proteína fotosensible que permite estimular a las células diana en respuesta a la luz. se utiliza un dispositivo de suministro biológico para implantar vectores que modifican las células diana para incluir la proteína fotosensible. Se utiliza un componente de implante (por ejemplo, un componente implantable que comprende un vector de expresión recombinante que codifica una opsina descrita en el presente documento), para el implante de un dispositivo generador de luz cerca de las células diana. Se utiliza un dispositivo de control para activar el dispositivo generador de luz para generar la luz que van a recibir las células diana, estimulando de esta manera las células diana en respuesta a la luz generada.
Por ejemplo, la luz se puede suministrar en un sitio interno de un organismo (por ejemplo, un mamífero). Se utiliza, un generador de luz, tal como un dispositivo implantable que genera luz in vivo. Una opsina descrita en el presente documento (por ejemplo, una variante de opsina descrita en el presente documento) que está presente en las células diana en el sitio proporciona la estimulación de las células diana en respuesta a la luz generada por el generador de luz, cuya luz incide sobre las células diana. El generador de luz puede ser un pequeño dispositivo electrónico del orden de unos pocos milímetros de tamaño. El pequeño tamaño es particularmente útil para minimizar la intrusión del dispositivo y el procedimiento de implante asociado. En otro ejemplo, el generador de luz puede incluir un dispositivo de fibra óptica que se puede utilizar para transmitir luz desde una fuente externa a las células diana. Por ejemplo, las células diana se modifican para que contengan proteínas del canal/bomba de protones activadas por la luz.
Se puede implantar una proteína sensible a la luz en cuestión utilizando varios métodos diferentes. Ejemplos de métodos incluyen, pero no se limitan al uso de distintos dispositivos de suministro, tal como cápsulas de gelatina, inyecciones líquidas, y similares. Dichos métodos también incluyen el uso de técnicas quirúrgicas estereotácticas tal como marcos o sistemas de navegación quirúrgica computarizadas para el implante o el acceso a otras áreas del cuerpo.
A modo de ejemplo, las células diana que se han modificado para que sean fotosensibles, por ejemplo, que se modifican para producir una opsina descrita en el presente documento (por ejemplo, una variante de opsina descrita en el presente documento). Las células diana son por lo tanto fotosensibles. La estimulación de las células diana se puede controlar mediante el dispositivo implantable. Por ejemplo, se puede disponer un circuito de control para que responda a una señal externa activando o desactivando la fuente de luz o cargando la batería que alimenta la fuente de luz. En un ejemplo, la señal externa es de radiación electromagnética que es recibida por el circuito de control. Por ejemplo, se pueden transmitir señales de radiofrecuencia (RF) mediante un transmisor de radiofrecuencia (RF) externo y son recibidas por un circuito de control. En otro ejemplo, se puede utilizar un campo magnético para activar y/o alimentar el circuito de control.
Se puede implementar un circuito de control que utilice varios grados de complejidad. En un ejemplo, el circuito es una simple bobina que cuando se expone a un campo magnético genera una corriente. La corriente se utiliza entonces para alimentar la fuente de luz. Dicha implementación puede ser particularmente útil para limitar el tamaño y complejidad, así como para aumentar la longevidad del dispositivo. En otro ejemplo, un circuito de control puede incluir una antena de RF. Opcionalmente, se puede utilizar una batería o fuente de energía similar, tal como un elemento capacitivo, por un circuito de control. Mientras se carga, la fuente de energía permite que el circuito continúe operando sin necesidad de un suministro de energía concurrente desde el exterior del cuerpo. Esto puede ser particularmente útil para proporcionar un control preciso sobre la luz emitida por una fuente de luz y para aumentar la intensidad de la luz emitida. En una realización, la fuente de luz está implementada utilizando un diodo emisor de luz (LED). Los LED han demostrado ser útiles para aplicaciones a baja potencia y también tiene una respuesta relativamente rápida a las señales eléctricas.
En otra realización, se puede utilizar una matriz (por ejemplo, que pueda incluir una gelatina o sustancia similar) que contiene los vectores de expresión recombinantes que codifican una opsina descrita en el presente documento (por ejemplo, una variante de opsina descrita en el presente documento), cuyos vectores de expresión recombinantes entran en las células diana y proporcionan la fotosensibilidad a la célula diana. En un ejemplo, los vectores se liberan una vez implantados en el cuerpo. Esto se puede conseguir, por ejemplo, utilizando un material de contención que permita que los vectores se liberen en una solución acuosa (por ejemplo, utilizando materiales deshidratados o solubles en agua tales como gelatinas). La liberación de los vectores da como resultado que se modifiquen las células diana de manera que se estimulen en respuesta a la luz de una fuente de luz.
En otra realización, se utiliza una malla sintética que contiene las células fotosensibles. En un ejemplo, las células son neuronas que se han modificado para que sean fotosensibles (por ejemplo, se modifican para que incluyan una opsina descrita en el presente documento, por ejemplo, una variante de opsina descrita en el presente documento. La malla sintética se puede construir de manera que permita que las dendritas y axones pasen a través de la malla sin permitir que pase la neurona completa (por ejemplo, el cuerpo celular). Un ejemplo de dicha malla atiene poros que son del orden de 3-7 micrómetros de diámetro y se fabrican con tereftalato de polietileno. En otra realización a modo de ejemplo, se utiliza un mecanismo de inyección para suministrar una opsina descrita en el presente documento (por ejemplo, una variante de opsina descrita en el presente documento), por ejemplo, un vector de expresión recombinante que codifica una opsina descrita en el presente documento.
Por ejemplo, un dispositivo implantable puede responder a un campo magnético. Por ejemplo, un inductor genera una corriente/tensión en respuesta a un campo magnético. La corriente se pasa a un circuito de control a través de una vía conductora. En respuesta, el circuito de control activa una fuente de luz utilizando una vía conductora. Una fuente de luz ilumina una parte biológica con el fin de estimular las células diana. En un ejemplo, la parte biológica incluye una gelatina, malla sintética, o mecanismo de inyección como se ha expuesto anteriormente.
En una realización, la parte de control puede ser una simple conexión eléctrica, un elemento de resistencia, y se puede eliminar completamente. En dicha realización, la intensidad, duración, y frecuencia de la luz generada estaría controlada directamente por la corriente generada partir del campo magnético. Esto puede ser particularmente útil para la creación de dispositivos baratos, de larga duración y pequeños.
En otra realización, la parte de control se puede implementar como un circuito más complejo. Por ejemplo, el circuito de control puede incluir e implementar de otra manera diferentes circuitos rectificadores, baterías, tiempos de pulso, circuitos comparadores y similares. En un ejemplo particular, el circuito de control incluye un circuito integrado (IC) producido utilizando CMOS u otros procedimientos. La tecnología de circuitos integrados permite el uso de un gran número de elementos de circuito en un área muy pequeña, y, por lo tanto, se puede implementar un circuito de control relativamente complejo para algunas aplicaciones.
A modo de ejemplo, un inductor es un inductor montado en una superficie, tal como un inductor de 100 uH, pieza número CF1008-103K, suministrado por Gowanda Electronics Corp. La parte generadora de luz es un LED azul de tamaño de paquete 0603 o 0805. Un ejemplo particular es un LED azul montado en la superficie que tiene el número de pieza SML0805 disponible en LEDtronics, Inc (Torrance, CA). Las vías conectoras pueden implementarse utilizando distintos conductores eléctricos, tales como los conductores de epoxi, cintas, soldadores y otros materiales adhesivos. Los LED emisores de luz en el espectro apropiado (como es aplicable a una opsina descrita en el presente documento) están disponibles mediante fuentes comerciales, incluyendo este mismo fabricante.
Se describe en el presente documento un método para la modificación de neuronas genéticamente para que expresen una opsina sensible a la luz descrita en el presente documento. Por ejemplo, se puede utilizar una opsina descrita en el presente documento para otorgar fotosensibilidad a las células nerviosas de mamíferos, utilizando un vector de expresión para suministrar un ácido nucleico que codifique una opsina descrita en el presente documento en las células nerviosas direccionadas, que posteriormente producen la opsina codificada. La estimulación de las células diana con la luz da como resultado la hiperpolarización de las células diana.
Se describen en el presente documento métodos para la generación de un flujo de corriente neuronal inhibidora en una neurona, los métodos implican la modificación de la neurona para que exprese una opsina descrita en el presente documento, y exponiendo la neurona a un estímulo lumínico. La presente divulgación proporciona métodos para el control del potencial de acción de una neurona, implicando los métodos la modificación de la neurona para que exprese una opsina descrita en el presente documento; y exponiendo la neurona a un estímulo lumínico. Se describen en el presente documento métodos para el control de un nivel de tensión a través de una membrana celular de una célula, implicando los métodos la modificación de la célula para que exprese una opsina descrita en el presente documento; y exponiendo la neurona a un estímulo lumínico.
Se describe en el presentes documento un sistema para el control de un potencial de acción de una neurona in vivo. El sistema incluye un dispositivo de suministro, una fuente de luz, y un dispositivo de control. El dispositivo de suministro introduce una proteína que responde a la luz (una opsina descrita en el presente documento) en la neurona, produciendo la proteína que responde a la luz una corriente inhibidora. La fuente de luz genera luz para la estimulación de la proteína que responde a la luz, y el dispositivo de control controla la generación de luz por la fuente de luz.
Se describen en el presente documento métodos de tratamiento de un trastorno. El método se dirige a un grupo de neuronas asociadas con el trastorno; las neuronas diana se modifican para que expresen una opsina descrita en el presente documento, las neuronas diana modificadas producen una corriente de inhibición que reduce la despolarización de las neuronas, las neuronas modificadas se exponen a un estímulo lumínico, reduciendo de esta manera la despolarización de las neuronas.
Cribado de fármacos
Ciertos usos de la presente invención pueden ser útiles en el cribado de fármacos. Las distintas proteínas sensibles a la luz, que sirven para regular la tensión de membrana que utilizan interruptores iónicos que, cuando se activan (o desactivan) en respuesta a la luz, funcionan como canales o bombas y se les hace referencia de aquí en adelante como interruptores iónicos que responden a la luz o interruptores de potencial de membrana activado por la luz (LAMPS).
Por ejemplo, se describe en el presente documento un sistema para el cribado de compuestos que afectan la bomba de iones y el canal iónico. El sistema introduce uno o más fármacos candidatos que podrían bloquear o aumentar la actividad de una opsina descrita en el presente documento en una célula modificada para que sintetice una opsina descrita en el presente documento. La luz desencadenada los canales iónicos que responden a la luz en las células produciendo un cambio en la tensión que se ve a través de la membrana celular. El cambio de tensión estimula los canales iónicos regulados por la tensión en las células que entonces producirá un cambio en las concentraciones de iones que puede leerse como un resultado óptico. Estas señales ópticas se detectan y utilizan para determinar qué efecto, si hay alguno, tiene el fármaco candidato sobre los canales iónicos regulados por la tensión. En una realización más específica, se introduce una proteína que expresa una bomba de protones en la célula.
En un ejemplo, el sistema permite que los diferentes fármacos candidatos se exploren sin necesidad de un montaje extenso entre exploraciones. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un ensayo que utiliza la óptica para estimular las células que responden ópticamente y para detectar la eficacia del fármaco. El uso de la óptica en vez de contactos manuales, por ejemplo, un pinzamiento zonal de célula completa puede ser particularmente útil para aumentar el resultado el procedimiento del ensayo de cribado. Por ejemplo, el tiempo entre exploraciones se puede reducir minimizando o eliminando la manipulación física necesaria de otra manera para estimular o detectar el flujo iónico en las células diana. Las células también se pueden preparar antes del procedimiento de cribado debido a que el equipo de ensayo solamente necesita estar acoplado ópticamente a las células preparadas. En otro ejemplo, el resultado se puede aumentar explorando varios fármacos diferentes simultáneamente utilizando, por ejemplo, una matriz de fotodetectores y una matriz correspondiente de células modificadas expuestas a diferentes fármacos. La estimulación óptica de las células modificadas se puede alterar para determinar propiedades específicas de un fármaco candidato introducido. Por ejemplo, la intensidad del estímulo óptico se puede modificar para cambiar el nivel correspondiente de despolarización. El nivel deseado de despolarización se puede ajustar para caracterizar adicionalmente la eficacia del fármaco que se ensaya. En otro ejemplo, el estímulo óptico puede incluir el pulsado rápido de la luz. Correlacionando la relación temporal entre el estímulo óptico y la fluorescencia resultante detectada, el fármaco se puede caracterizar adicionalmente en términos de una respuesta cinética. Por lo tanto, el fármaco se puede caracterizar por varios diferentes aspectos que incluyen, pero no se limitan a, el efecto del estado en equilibrio de las concentraciones de iones, un cambio en el nivel de despolarización necesario para abrir los canales iónicos regulados por la tensión, y el efecto sobre la despolarización repetida.
En una realización, el sistema permite la calibración simple de la estimulación y/o detección óptica. Las células modificadas pueden estimularse ópticamente antes de la introducción del fármaco candidato. La respuesta del canal iónico se detecta y se registra. Los valores registrados se pueden utilizar como la línea base de comparación para la respuesta del canal iónico de las mismas células modificadas después de la introducción del fármaco que se ensaya. Los valores registrados también se pueden utilizar para modificar el estímulo óptico o la sensibilidad del detector óptico. Dichas modificaciones pueden aplicarse a una muestra de ensayo individual o una matriz de muestras de ensayo. Para dicha matriz de muestras de ensayo, cada muestra de ensayo puede calibrarse individualmente ajustando el correspondiente estímulo óptico. De manera similar, cada fotodetector correspondiente puede ajustarse individualmente.
La cantidad de tiempo asignada para el suministro de luz puede variar, y depende de factores que incluyen el nivel de expresión de la bomba/canal iónico de protón regulado por la luz, y la densidad y caracterización de otras características del canal iónico/protónico de esa población celular. La cantidad de tiempo asignada para la recepción de la luz puede variar y depende de factores que incluyen el grado de precisión necesario para la sesión de cribado. La cantidad de tiempo asignada para el cambio de placas de pocillos (bandeja) puede variar y depende de factores que incluyen la velocidad mecánica del aparato automático. Si se utilizan neuronas rápidas como las células que se van a ensayar, la estimulación celular y el procedimiento LEIA de detección se puede conseguir en segundos.
El proceso anterior se puede repetir en condiciones variables. Por ejemplo, un conjunto determinado de células se puede ensayar sin el fármaco presente, y posteriormente con uno o más fármacos presentes. La respuesta de las células excitables eléctricamente en esas condiciones se puede documentar, comparar y estudiar de esta manera, Si el procedimiento se implementa con al menos un emisor/detector para cada pocillo en una bandeja y al menos dos dispositivos que operen concurrentemente, se puede mantener la operación de manera continua durante extensos periodos de tiempo.
Los métodos de cribado a modo de ejemplo podrían incluir la colección de múltiples puntos de datos sin tener que cambiar muestras. Debido a que el control sobre las muestras es reversible en la misma preparación de muestra simplemente encendiendo y apagando la luz activadora con obturadores rápidos, se pueden reutilizar las mismas muestras. Adicionalmente, se puede proporcionar un intervalo de patrones de estimulación a la misma muestra celular de manera que se pueda llevar a cabo el ensayo del efecto de los fármacos sin preocuparse con respecto a las diferencias entre las diferentes preparaciones de muestras. Modulando el nivel de excitación (por ejemplo, elevando gradualmente el nivel desde sin luz a una intensidad alta o máxima), se puede ensayar el efecto del fármaco a lo largo de un intervalo de potenciales de membrana. Esto permite la identificación de fármacos que son eficaces durante potenciales de membrana hiperpolarizada, natural, o despolarizada.
Las líneas celulares descritas en el presente documento pueden ser particularmente útiles para la caracterización detallada de fármacos candidatos de una manera de alto rendimiento. El control óptico es relativamente rápido, permitiendo de esta manera ensayar la actividad del fármaco bajo formas de activación más fisiológicas. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes frecuencias de despolarización y/o hiperpolarización para determinar cómo interactúa un fármaco con el canal en formas fisiológicas de actividad neural. En algunos ejemplos, el procedimiento se puede conseguir sin la aplicación de colorantes químicos caros para las líneas celulares.
En conjunción con distintas propiedades expuestas en el presente documento, el uso de distintas realizaciones de la invención puede ser particularmente para mejorar el resultado del cribado eliminando la necesidad de una manipulación mecánica engorrosa y manejo de líquidos. Distintas realizaciones pueden ser útiles también para el ensayo de cribado repetible utilizando las mismas muestras, reduciendo el coste de cribado eliminando la necesidad de informes de informes de fluorescencia basado químicamente, produciendo una precisión temporal alta y baja señal de artefactos (debido a la naturaleza óptica de la manipulación de la tensión), modulando el nivel de despolarización atenuando la intensidad de la luz utilizada para la estimulación, y verificando la cinética de la modulación en el canal iónico mediante el uso de patrones de luz pulsada.
La existencia de múltiples proteínas de excitación y proteínas de inhibición controlables independientemente abre la puerta de varias aplicaciones que incluyen, pero no se limitan a, aplicaciones para el tratamiento de varios trastornos y el uso de una pluralidad de proteínas que respondan a la luz que se puedan seleccionar de manera que respondan a una pluralidad de longitudes de onda respectivas. Aunque no siempre se establezca expresamente se puede utilizar una inhibición en combinación con, además de, o en lugar de excitación en las aplicaciones. La familia de proteínas de un único componente ha demostrado responder a múltiples longitudes de onda e intensidades de luz. Los aspectos de la divulgación permiten mutaciones adicionales y/o búsquedas de secuencias que permitan longitudes de onda óptica adicionales y/o canales proteicos controlables individualmente. También se pueden utilizar variaciones del estímulo óptico (por ejemplo, un perfil de longitud de onda, intensidad o duración) Por ejemplo, los perfiles de estimulación pueden aprovechar solapamientos en las longitudes de onda de excitación o dos proteínas del canal iónico diferentes para permitir la excitación de ambas proteínas al mismo tiempo. En uno de dichos ejemplos, puede haber niveles de respuesta diferentes. Por lo tanto, en una aplicación neural, un conjunto de canales iónicos puede producir picos con porcentajes de éxito diferentes con respecto a un segundo conjunto de canales iónicos. De manera similar, los solapamientos en las longitudes de onda de inhibición de dos canales iónicos (o bombas) diferentes permite la inhibición de ambas proteínas al mismo tiempo.
De manera alternativa, se pueden utilizar múltiples fuentes de luz que permitan la estimulación de las proteínas que responden a la luz en la combinación deseada, mientras se dejan otras proteínas sin estimular.
Aplicaciones terapéuticas
Se describen en el presente documento distintos métodos terapéuticos.
Se asocia la adicción con varias funciones cerebrales, que incluyen una recompensa y expectativas. Adicionalmente, la causa que dirige la adicción puede variar entre individuos. De acuerdo con una realización, la adicción, por ejemplo, la adicción a la nicotina se puede tratar con estabilización optogenética de pequeñas áreas de la ínsula. Opcionalmente, se puede utilizar la creación de imágenes cerebrales, por ejemplo, PET en estado indicador o fMRI, se puede utilizar para localizar un foco hipermetabólico con el fin de determinar un punto diana preciso para la intervención en la superficie de la ínsula.
La excitación optogenética del núcleo accumbens y el septo puede proporcionar una recompensa y placer a un paciente sin necesidad de recurrir al uso de sustancias, y por lo tanto puede mantener la clave del tratamiento de la adicción. Por el contrario, la estabilización optogenética del núcleo accumbens y el septo se puede utilizar para disminuir el síndrome de abstinencia en el contexto de la adicción. En una realización alternativa, se puede utilizar la estabilización optogenética de actividad metabólica observada en el genu del cingulado anterior (BA32) para disminuir el síndrome de abstinencia. La estabilización optogenética de células del núcleo arcuato del hipotálamo medial que contiene transcripciones de productos peptídicos reguladores de pro-opiomelanocortina (POMC) y cocaína y anfetaminas (CART) y también se puede utilizar para disminuir el comportamiento de adicción a las drogas.
La estimulación optogenética de neuronas neuroendocrinas del núcleo periventricular hipotalámico que secreta somatostatina se puede utilizar para inhibir la secreción de la hormona de crecimiento desde la hipófisis anterior, ejemplo, en la acromegalia. La estabilización optogenética de neuronas neuroendocrinas que secretan somatostatina o la hormona de crecimiento se puede utilizar para aumentar el crecimiento y el desarrollo físico. Entre los cambios que acompañan el envejecimiento "normal", hay un fuerte declive de los niveles de hormona de crecimiento en el suero después de la 4a y 5a décadas. En consecuencia, el deterioro físico asociado con el envejecimiento puede disminuirse mediante la estabilización optogenética del núcleo periventricular.
La estabilización optogenética del núcleo ventromedial del hipotálamo, particularmente, la transcripción que regula la pro-opiomelanocortina (POMC) y cocaína-anfetamina (CART) del núcleo arcuato, se puede utilizar para aumentar el apetito, y por lo tanto tratar la anorexia nerviosa. De manera alternativa, la estimulación optogenética de los núcleos laterales del hipotálamo se puede utilizar para aumentar el apetito y los hábitos de comida.
La excitación optogenética en las células colinérgicas de áreas afectadas que incluyen el lóbulo temporal, los NBM (núcleos basales de Meynert) y el giro cingulado posterior (BA,31) proporciona una estimulación, y por lo tanto la dirección neurotrófica a áreas deterioradas.
Debido a que las áreas afectadas están dispersas en el cerebro, un tratamiento análogo con electrodos implantados puede ser menos factibles que una estrategia optogenética.
Los trastornos de ansiedad se asocian normalmente con un aumento de la actividad de la corteza temporal y frontal, que tiende a la normalidad según se resuelve la ansiedad. En consecuencia, las regiones temporal y frontal izquierdas afectadas y la amígala pueden tratarse con una estabilización optogenética, para disminuir la actividad en estas regiones.
En la fisiología normal, las células neurales fotosensibles de la retina, que se despolarizan en respuesta a la luz que reciben, crean un mapa visual del patrón de luz recibido. Los canales iónicos optogenéticos se pueden utilizar para imitar este proceso en muchas partes del cuerpo, y los ojos no son una excepción. En el caso de discapacidad visual o ceguera debido a una retina dañada, puede desarrollarse una nueva retina funcional, que utiliza la luz ambiente natural más que los patrones de luz intermitente a partir del dispositivo implantado. El desarrollo de una retina artificial se puede colocar en la localización de la retina original (lo que puede tener la ventaja de que el nervio óptico sirva como un conducto hacia la corteza visual). De manera alternativa, la retina artificial puede colocarse en otra localización, tal como la frente, a condición de que haya un conducto para que se transmitan las señales de despolarización al tejido cortical capaz de descifrar la información codificada a partir de la matriz del sensor optogenético. La ceguera cortical también se podría tratar simulando las rutas visuales corriente debajo de la corteza visual. La estimulación se basaría en los datos visuales producidos corriente arriba de la corteza visual o mediante un sensor de luz artificial.
El tratamiento de la taquicardia se puede conseguir con la estimulación de las fibras del sistema nervioso parasimpático que incluyen CN X o el Nervio Vago. Esto produce una disminución de la velocidad del nodo SA, disminuyendo de esta manera la frecuencia cardíaca y fuerza de contracción. De manera similar, la estabilización de las fibras del sistema nervioso simpático en los nervios espinales de T1 a T4 sirve para enlentecer el corazón. Para el tratamiento de la bradicardia patológica la estabilización optogenética del nervio vago, o la estimulación optogenética de las fibras simpáticas desde T1 a T4 servirá para aumentar la frecuencia cardíaca. Las disritmias cardíacas que resultan de focos eléctricos aberrantes que superan el nodo sinusal se pueden suprimir tratando el foco eléctrico aberrante con estabilización optogenética moderada. Esto disminuye la tasa intrínseca de activación en el tejido tratado y permite que el nodo sinusal vuelva a tener el protagonismo del ritmo del sistema eléctrico cardíaco. De manera similar, se podría tratar cualquier tipo de arritmia cardíaca. La degeneración de tejido cardíaco que se produce en la cardiomiopatía o fallo cardíaco congestivo también se podría tratar utilizando la presente invención, el tejido restante se podría excitar utilizando distintas realizaciones de la invención.
La estimulación por excitación optogenética de las regiones del cerebro que incluyen el lóbulo frontal, lóbulos parietales e hipocampo, pueden aumentar la velocidad de procesamiento, mejorar la memoria, y estimular el crecimiento y la interconexión de neuronas, incluyendo el desarrollo de brotes de células progenitoras. A modo de ejemplo, una de dichas aplicaciones de la presente invención se refiere a la estimulación por excitación optogenética de neuronas direccionadas en el tálamo con el fin de llevar al paciente a un estado casi vegetativo (apenas consciente). Se afecta el desarrollo de canales o bombas iónicas reguladas por la luz en la membrana de neuronas talámicas direccionadas. Estas neuronas modificadas se estimulan entonces (por ejemplo, mediante una óptica que puede acceder por la misma ruta) dirigiendo un fogonazo de luz inmediatamente para de esta manera modular la función de las neuronas dirigidas y/o las células que las rodean.
En una realización alternativa, la excitación optogenética se puede utilizar para tratar el músculo cardíaco debilitado en afecciones tales como el fallo cardíaco congestivo. La asistencia eléctrica al músculo cardíaco que falla en CHF no es práctica en general, debido a la delgadez y el estado frágil de la pared cardíaca y la dificultad para proporcionar un acoplamiento eléctrico distribuido uniformemente entre los electrodos y el músculo. Por esta razón, los métodos hasta ahora para aumentar la contractilidad cardíaca implican métodos farmacológicos tales como los beta agonistas y estrategias mecánicas tales como los dispositivos de asistencia ventriculares. En esta realización de un uso de la presente invención, se suministra una excitación optogenética en el músculo cardíaco debilitado mediante elementos emisores de luz en la superficie interna de una chaqueta que rodea el corazón o de otra manera contra la pared cardíaca afectada. La luz puede difundirse por medios bien conocidos en la técnica, para cubrir perfectamente grandes áreas de músculo, produciendo una contracción con cada pulso de luz.
Para la estabilización optogenética en la parte subgenual del giro cingulado (Cg25), se puede aplicar una luz amarilla con un dispositivo implantado. El objetivo sería tratar la depresión suprimiendo la actividad dirigida de una manera análoga a la que enseña Mayberg Hs et al, “Deep Brain Stimulation for Treatment-Resistant Depression”, Neuron, Vol. 45, 651-660, 3 de marzo de 2005, pp. 651-660. En una realización alternativa, un método de estimulación por excitación optogenética es para aumentar la actividad en esa región de una manera análoga a la que enseña Schlaepfer et al., “Deep Brain stimulation to Reward Circuitry Alleviates Anhedonia in Refractory Major Depression”, Neuropsychopharmacology 2007, pp. 1-10.
En otra realización más, la corteza prefrontal dorsolateral (LDPFC) se direcciona con un método de estimulación por excitación optogenética. La aplicación de un rimo en la LDLPFC a 5-20 Hz sirve para aumentar el nivel metabólico basal de esta estructura, que mediante un circuito de conexión sirve para disminuir la actividad en el Cg 25 mejorando la depresión en el proceso. La supresión de la corteza prefrontal dorsolateral derecha (RDLPFC) también es una estrategia de tratamiento de la depresión eficaz. Esto se puede conseguir por estabilización optogenética de la RDLPFC o la supresión se puede conseguir también utilizando la estimulación por excitación optogenética, y pulsando con una frecuencia baja (por ejemplo, 1 Hz o menos) mejorando la depresión en el proceso. La estimulación del nervio vago (VNS) puede mejorarse utilizando una estrategia optogenética. El uso de la excitación optogenética puede utilizarse con el fin de estimular solamente las aferentes del vago hacia el cerebro, tal como el ganglio nodoso y el ganglio yugular.
Las eferentes desde el cerebro no recibirían estimulación mediante esta estrategia, eliminando de esta manera algunos de los efectos secundarios del VNS incluyendo las molestias en la garganta, la tos, dificultad al tragar y la voz ronca. En una realización alternativa, se puede excitar optogenéticamente el hipocampo, dando lugar a un aumento de brotes dendríticos y axonales, y un desarrollo total del hipocampo. Otras regiones cerebrales implicadas en la depresión que se pueden tratar utilizando la presente invención incluyen la amígdala, accumbens, corteza orbitofrontal y orbitomedial, hipocampo, corteza olfatoria, y proyecciones serotonérgicas y noradrenérgicas. Las estrategias optogenéticas se podrían utilizar para controlar la diseminación de la actividad a través de estructuras tales como el hipocampo para controlar los síntomas depresivos.
Siempre y cuando haya poblaciones de células alfa y beta viables en los islotes pancreáticos de Langerhans, los islotes pueden direccionarse para el tratamiento de la diabetes. Por ejemplo, cuando la glucosa del suero sea alta (según se determine manualmente o por un sistema de detección de glucosa de bucle cerrado), se puede utilizar la excitación optogenética para producir la liberación de insulina por las células beta de los islotes de Langerhans en el páncreas, mientras que se puede utilizar la estabilización optogenética para evitar la liberación de glucagón por las células alfa de los islotes de Langerhans del páncreas. Por el contrario, cuando los azúcares sanguíneos son demasiado bajos (según se determine manualmente o por un sistema de detección de bucle cerrado), se puede utilizar la estabilización optogenética para parar la secreción de insulina por las células beta, y la excitación optogenética se puede utilizar para aumentar la secreción de glucagón por las células alfa.
Para el tratamiento de la epilepsia, la inactivación o bloqueo de la actividad epileptogénica es posible con las estrategias optogenéticas. La mayoría de los pacientes de epilepsia tienen un patrón estereotipado de diseminación de la actividad a partir de un foco epileptogénico. Se podría utilizar la estabilización optogenética para suprimir la actividad anormal antes de que se disemine o truncarla precozmente en su curso. De manera alternativa, la activación del tejido que se excita mediante la excitación por estimulación optogenética se podría suministrar en una serie de patrones asíncronos deliberados para alterar la aparición de la actividad convulsiva. Otra alternativa implica la activación de la excitación por estimulación optogenética en las neuronas GABAérgicas para proporcionar un resultado similar. Los reguladores talámicos se pueden direccionar con una estabilización optogenética que se desencadene cuando se detecte un patrón del EEG anormal.
Otra realización implica el tratamiento de trastornos gastrointestinales. El sistema digestivo tiene su propio sistema nervioso semi-autónomo que contiene neuronas sensitivas, neuronas motoras e interneuronas. Estas neuronas controlan en movimiento del tracto GI, así como activan células específicas del intestino para que liberen ácidos, enzimas digestivas, y hormonas, que incluyen gastrina, colecistoquinina y secretina. Los síndromes que incluyen la secreción inadecuada de cualquiera de estos productos celulares se pueden tratar con estimulación optogenética de los tipos celulares productores, o neuronas que provocan su actividad.
Por el contrario, se puede utilizar la estabilización optogenética para tratar síndromes en los que se producen excesivos productos endocrinos y exocrinos. Los trastornos con disminución de la motilidad intestinal, que varían desde el estreñimiento (particularmente en pacientes con lesión de la médula espinal) al megacolon, se pueden tratar con excitación optogenética de las neuronas motoras del intestino.
Los trastornos de hipermotilidad intestinal, incluyendo algunas formas de síndrome de colon irritable se pueden tratar con estabilización optogenética de las neuronas que controlan la motilidad.
Las obstrucciones de salida gástrica neurogénicas se pueden tratar con estabilización optogenética de las neuronas y la musculatura del píloro. Una estrategia alternativa a los síndromes de hipomotilidad seria proporcionar una excitación optogenética a las neuronas sensibles de tramo de las paredes del intestino, aumentando la señal de que el intestino está vacío, y no con necesidad de vaciarse.
En este mismo paradigma, una estrategia para los síndromes de hipermotilidad del intestino sería proporcionar una estabilización optogenética a las neuronas receptoras por tramos en el tracto GI inferior proporcionando de esta manera la "falsa sensación" de que el intestino está vacío y no tiene necesidad de vaciarse. En el caso de una franca incontinencia fecal, puede ser preferible tener un control mejorado de los esfínteres interno y externo que enlentecer la motilidad del tracto completo. Durante los periodos de tiempo en los que un paciente necesite mantener las heces dentro la excitación optogenética del esfínter anal interno proporcionará la retención. La provisión de una estimulación optogenética en el esfínter externo se puede utilizar para proporcionar una retención adicional. Cuando el paciente necesita defecar, el esfínter anal interno, y luego el esfínter anal externo se deberían relajar, sea pausando la estimulación optogenética o mediante la adición de estabilización optogenética.
La pérdida de audición conductiva se puede tratar mediante el uso de implantes cocleares ópticos. Una vez que la cóclea se ha preparado para la estimulación optogenética, se puede utilizar un implante coclear que haga parpadear la luz. La pérdida de audición sensorial neural se puede tratar mediante estimulación óptica de las dianas corriente abajo en la ruta auditiva.
Otro uso de la presente invención se refiere al tratamiento de los trastornos de la presión sanguínea, tales como la hipertensión. Los barorreceptores y quimiorreceptores de las regiones tales como la aorta (cuerpos aórticos y cuerpos paraórticos) y las arterias carótidas ("cuerpos carotídeos") participan en la regulación de la presión sanguínea y la respiración mandando aferentes mediante el nervio vago (CN X) y otras rutas a la médula y puente, particularmente al tracto y el núcleo solitarios. Se puede utilizar la excitación optogenética de los cuerpos carotídeos, cuerpos aórticos, cuerpos paraórticos, para enviar un falso mensaje de "hipertensión" al núcleo y el tracto solitarios produciendo que estos comuniquen que debería disminuir la presión sanguínea. La excitación o estabilización optogenética directamente en las partes apropiadas del tallo cerebral también se puede utilizar para disminuir la presión sanguínea. La modalidad opuesta produce que la estrategia optogenética sirva como presor, aumentando la presión sanguínea. Un efecto similar también se puede conseguir mediante excitación optogenética del nervio vago, o por estabilización optogenética de las fibras simpáticas en los nervios espinales T1-T4. En una realización alternativa, la hipertensión se puede tratar con estabilización optogenética del corazón, dando como resultado una disminución del gasto cardíaco y diminución de la presión sanguínea. De acuerdo con otra realización, la estabilización optogenética de las células productoras de aldosterona en la corteza adrenal, se puede utilizar para disminuir la presión sanguínea. En otra realización alternativa más, la hipertensión se puede tratar mediante estabilización optogenética del musculo liso vascular. La luz activadora se puede pasar por vía transcutánea hacia el lecho vascular periférico.
Otra realización a modo de ejemplo se refiere al tratamiento de los trastornos del eje hipotalámico-hipofisario-adrenal En el tratamiento del hipotiroidismo, la excitación optogenética de las neuronas neuroendocrinas parvocelulares de los núcleos hipotalámicos anterior y paraventricular se puede utilizar para aumentar la secreción de hormona liberadora de tirotropina. (TRH). La TRH a su vez, estimula la hipófisis anterior para secretar TSH. Por el contrario, el hipertiroidismo se puede tratar con estabilización optogenética de las neuronas neuroendocrinas parvocelulares. Para el tratamiento de la insuficiencia adrenal, o la enfermedad de Addison, se puede utilizar la excitación optogenética de las neuronas neuroendocrinas parvocelulares de los núcleos supraóptico y para ventricular para aumentar la secreción de vasopresina, que con ayuda de la liberación de hormona corticotropina (CRH) estimulan la hipófisis anterior para secretar ACTH. El síndrome de Cushing, que se produce frecuentemente por una secreción excesiva de ACTH, se puede tratar con estabilización optogenética de las neuronas neuroendocrinas parvocelulares del núcleo supraóptico mediante la misma cadena fisiológica de efectos descritos anteriormente. Las neuronas neuroendocrinas del núcleo arcuato producen dopamina que inhibe la secreción de prolactina por la hipófisis anterior. La hiperprolactinemia puede tratarse por lo tanto mediante excitación optogenética, mientras que la hipoprolactinemia se puede tratar con estabilización optogenética de las células neuroendocrinas del núcleo arcuato. En el tratamiento de estados hiperautonómicos, por ejemplo, los trastornos de ansiedad, se puede utilizar la estabilización optogenética de la médula adrenal para reducir la liberación de norepinefrina. De manera similar, se puede utilizar la estimulación optogenética de la médula adrenal en personas que necesiten una descarga de adrenalina, por ejemplo, los que tengan asma grave o trastornos que se manifiestan con adormecimiento crónico. La estimulación optogenética de la corteza adrenal producirá la liberación de agentes químicos que incluyen cortisol, testosterona y aldosterona. A diferencia de la médula adrenal, la corteza adrenal recibe sus instrucciones de hormonas neuroendocrinas secretadas por la hipófisis y el hipotálamo, los pulmones y los riñones. Independientemente, la corteza adrenal se presta a la estimulación optogenética. La estimulación optogenética de las células productoras de cortisol en la corteza adrenal se puede utilizar para tratar la enfermedad de Addison. La estabilización optogenética de las células productoras de cortisol en la corteza adrenal se puede utilizar para tratar la enfermedad de Cushing. La estimulación optogenética de las células productoras de testosterona se puede utilizar para tratar trastornos de interés sexual en las mujeres. La estabilización optogenética de estas mismas células se puede utilizar para disminuir el vello facial en las mujeres. La estabilización optogenética de las células productoras de aldosterona en la corteza adrenal, se puede utilizar para disminuir la presión sanguínea. La excitación optogenética de las células productoras de aldosterona en la corteza adrenal, se puede utilizar para aumentar la presión sanguínea.
La estimulación por excitación optogenética de las regiones cerebrales específicas afectadas se puede utilizar para aumentar la velocidad de procesamiento y estimular el desarrollo e interconexión de neuronas, incluyendo la estimulación de la maduración de las células progenitoras neurales. Dichos usos pueden ser particularmente útiles para el tratamiento del retraso mental.
De acuerdo con otra realización, se pueden tratar distintas enfermedades y lesiones musculares. La parálisis relacionada con el daño muscular, daño de nervios periféricos y enfermedades distróficas se pueden tratar con excitación optogenética para producir la contracción, y la estabilización optogenética para producir relajación. Esta última relajación mediante la estrategia de estabilización optogenética también se puede utilizar para evitar el debilitamiento muscular, mantener el tono, y permitir el movimiento coordinado según se contraen los grupos musculares opuestos. De la misma manera, la espasticidad pura se puede tratar mediante estabilización optogenética.
En áreas tan diversas como de truncamiento de nervios periféricos, ictus, lesión cerebral traumática y lesión de la médula espinal, existe la necesidad de promoción del crecimiento de nuevas neuronas, y de ayudar en su integración en una red funcional con otras neuronas y con su tejido diana. El crecimiento de nuevos tractos neuronales puede estimularse mediante excitación optogenética, que sirve de señal para que a las células madre les broten axones y dendritas, y para integrarse en la red. El uso de una técnica optogenética (en oposición a los electrodos) evita la recepción de señales por el tejido intacto, y sirve para asegurar que el nuevo tejido diana crezca gracias a una comunicación establecida con las neuronas en desarrollo, y no con una señal artificial de la corriente que emana de un electrodo.
La obesidad se puede tratar con excitación optogenética del núcleo ventromedial del hipotálamo, particularmente la transcripción que regula la pro-opiomelanocortina (POMC) y cocaína y anfetamina (CART) del núcleo arcuato. En una realización alternativa, la obesidad puede tratarse mediante estabilización optogenética de los núcleos laterales del hipotálamo. En otra realización, se puede utilizar la estimulación optogenética de las células productoras de leptinas o las células con receptores de leptinas en el hipotálamo para disminuir el apetito y, por lo tanto, tratar la obesidad.
Las lesiones destructoras de la cápsula anterior y DBS análogos de esa región son medios establecidos para tratar el trastorno obsesivo-compulsivo grave intratable 48 (OCD48). Dichas estrategias se pueden emular utilizando la estabilización optogenética en el borde anterior de la cápsula interna, o regiones tales como BA32 y Cg24, que presentan una disminución metabólica según remite el CCD.
El dolor crónico se puede tratar utilizando otra realización de la presente divulgación. Los métodos de estimulación eléctrica incluyen la estimulación local de nervios periféricos, la estimulación local de nervios craneales y la estimulación de "sub-umbral" de la corteza motora. Las estrategias autogénicas razonables incluyen la estabilización optogenética en sitios dolorosos locales. El cuidado en la selección del promotor aseguraría que no se afecten otras fibras sensoriales y motoras.
La excitación optogenética selectiva de interneuronas en la corteza motora primaria también puede proporcionar un alivio del dolor eficaz. También, se puede utilizar la estabilización optogenética en el tálamo sensorial (particularmente los núcleos talámicos mediales), materia gris periventricular, y núcleos ventrales del rafe, para producir un alivio del dolor. En una realización alternativa, se puede utilizar la estabilización optogenética del direccionamiento de células que expresan parvalbúmina como estrategia de direccionamiento, para tratar el dolor disminuyendo la producción de Sustancia P. La liberación de opioides endógenos se puede conseguir utilizando la excitación optogenética para aumentar la actividad en el núcleo accumbens. En una realización alternativa, cuando las neuronas POMC del núcleo arcuato del hipotálamo medial se excitan optogenéticamente, aumentan las betaendorfinas, proporcionando estrategias de tratamiento viables para la depresión y el dolor crónico.
Ciertos trastornos de la personalidad, incluyendo los tipos limítrofes y antisociales, demuestran déficits focales en trastornos cerebrales incluyendo la "hipofrontalidad". La excitación optogenética directa o indirecta de estas regiones se anticipó que producían una mejora de los síntomas. Las explosiones anormales de actividad en la amígdala también se conocen por la precipitación de accesos de rabia espontáneos, repentinos, un síntoma de trastorno de personalidad limítrofe, así como otras afecciones, que pueden beneficiarse de la estabilización optogenética de la amígdala. Las estrategias optogenéticas pudrían mejorar la comunicación y sincronización entre diferentes partes del cerebro, incluyendo la amígdala, cuerpo estriado, y corteza frontal, que podría ayudar a reducir la impulsividad y mejorar la percepción.
El modelo amigdalocéntrico de trastorno de estrés postraumático (PTSD) propone que se asocia con la hiperexcitación de la amígdala y un control insuficiente de arriba abajo por la corteza prefrontal medial y el hipocampo. En consecuencia, el PTSD se puede tratar con estabilización optogenética de la amígdala o el hipocampo.
La esquizofrenia se caracteriza por anormalidades que incluyen alucinaciones auditivas. Esto se puede tatar mediante supresión de la corteza auditiva utilizando estabilización optogenética. La hipofrontalidad asociada con la esquizofrenia se podría tratar con excitación optogenética en las regiones frontales afectadas. Las estrategias optogenéticas podrían mejorar la comunicación y sincronización entre diferentes partes del cerebro que podría ayudar a reducir la mala atribución de estímulos autogenerados como ajenos.
La estabilización optogenética de células del núcleo arcuato del hipotálamo medial que contiene productos peptídicos de transcripción reguladores de pro-opiomelanocortina (POMC) y de cocaína y anfetaminas (CART) se puede utilizar para disminuir el comportamiento sexual compulsivo. La excitación optogenética de células del núcleo arcuato del hipotálamo medial que contiene productos peptídicos de transcripción reguladores de proopiomelanocortina (POMC) y cocaína y anfetaminas (CART) y también se puede utilizar para aumentar el interés sexual en el tratamiento de trastornos de trastornos del deseo sexual. En el tratamiento de trastorno de deseo sexual hipoactivo se puede aumentar la producción de testosterona por los testículos y las glándulas adrenales mediante excitación optogenética de la glándula hipófisis. La excitación optogenética del núcleo accumbens se puede utilizar para el tratamiento de la anorgasmia.
El núcleo supraquiasmático secreta melatonina, que sirve para regular los ciclos de sueño/vigilia. La excitación optogenética del núcleo supraquiasmático se puede utilizar para aumentar la producción de melatonina, induciendo el sueño, y por lo tanto para tratar el insomnio. Las neuronas de orexina (hipocretina) excitan fuertemente numerosos núcleos cerebrales con el fin de promover la vigilia. La excitación optogenéticas de poblaciones celulares que producen orexina se pueden utilizar para tratar la narcolepsia, y la somnolencia diurna crónica.
La estimulación optogenética del núcleo supraóptico se puede utilizar para inducir la secreción de oxitocina, se puede utilizar para ayudar en el parto durante el nacimiento del bebé, y se puede utilizar para tratar trastornos de integración social.
Al igual que en las parálisis musculares, las funciones motoras que se han desaferentado por una lesión de la médula espinal se pueden tratar con excitación optogenética para producir contracción, y la estabilización optogenética para producir relajación. Esta última relajación mediante la estrategia de estabilización optogenética también se puede utilizar para evitar el debilitamiento muscular, mantener el tono, y permitir el movimiento coordinado según se contraen los grupos musculares opuestos. De la misma manera, la espasticidad pura se puede tratar mediante estabilización optogenética. El crecimiento de nuevos tractos neuronales espinales puede estimularse mediante excitación optogenética, que sirve de señal para que a las células madre les broten axones y dendritas, y para integrarse en la red.
Los déficits del ictus incluyen cambios de personalidad, deficiencias motoras, deficiencias sensoriales, pérdida cognitiva, e inestabilidad emocional. Una estrategia para el tratamiento de los déficits del ictus es proporcionar una estimulación optogenética del cerebro y las estructuras corporales que se han desaferentado de las conexiones excitadoras. De manera similar, se pueden impartir capacidades de estabilización en el cerebro y otras estructuras corporales que se han desaferentado de las conexiones inhibidoras.
Las investigaciones indican que la patología subyacente en el síndrome de Tourette es una disfunción fásica de transmisión de dopamina en las regiones corticales y subcorticales, el tálamo, los ganglios basales y la corteza frontal. Con el fin de proporcionar una terapia, las áreas afectadas preferentemente se identifican primero utilizando técnicas que incluyen la creación de imágenes del cerebro funcional y magnetoencefalografía (MEG). Tanto si se identifica específicamente o no, se puede utilizar la estabilización optogenética para suprimir los tics motores. Tras la implantación empírica el ensayo de los parámetros del dispositivo revela los sitios de estabilización optogenética, y en los que no es necesario continuar.
Con el fin de excitar/inhibir selectivamente una determinada población de neuronas, por ejemplo, las implicadas en el estado de enfermedad de una afección, se pueden utilizar varias estrategias para dirigir las proteínas/moléculas a las poblaciones específicas.
Para distintas realizaciones de los usos de la presente invención, se puede utilizar el direccionamiento genético para expresar las distintas proteínas o moléculas optogenéticas. Dicho direccionamiento implica la expresión dirigida de las proteínas/moléculas optogenéticas mediante elementos de control genéticos tal como promotores (por ejemplo, parvalbúmina, somatostatina, colecistoquinina, GFAP), amplificadores/silenciadores (por ejemplo, amplificador temprano inmediato de citomegalovirus), y otros elementos reguladores transcripcionales y traduccionales (por ejemplo, el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck). Las permutaciones de combinaciones de elementos reguladores+promotor+amplificador se pueden utilizar para restringir la expresión de sondas optogenética para poblaciones definidas genéticamente.
Distintas realizaciones de usos de la presente invención se pueden implementar utilizando el direccionamiento espacial/anatómico. Dicho direccionamiento se aprovecha del hecho de que los patrones de proyección de las neuronas, virus u otros reactivos contiene información genética (ADN plasmídico, fragmentos, etc.) que se pueden suministrar focalmente en un área donde se proyecta una determinada población de neuronas. El material genético se transportará entonces de vuelta en los cuerpos de las neuronas para mediar la expresión de las sondas optogenéticas. De manera alternativa, si se desea marcar las células en una región focal, los virus o el material genético se puede suministrar focalmente en la región interesada para mediar la expresión localizada.
Sistemas de suministro genético
Distintos sistemas de suministro genético son útiles para la implementación de una o más realizaciones de la presente divulgación. Uno de dichos sistemas de suministro es un virus adenoasociado (AAV). El AAV se puede utilizar para suministrar un casete de promotor+sonda optogenética (opsina) a una región específica de interés. Como se utiliza en el presente documento, "sonda optogenética" se refiere a una opsina, por ejemplo, una opsina o una variante de opsina, de la presente divulgación. La elección del promotor dirigirá la expresión en una población específica de neuronas. Por ejemplo, utilizando el promotor CaMKIIa se dirigirá la expresión específica de neurona de excitación de sondas optogenéticas. El AAV mediará la expresión a largo plazo de la sonda optogenética (opsina) durante al menos un año o más. Para conseguir más especificidad, el AAV puede seudotiparse con serotipos específicos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8 teniendo cada uno un tropismo diferente para diferentes tipos celulares. Por ejemplo, los serotipos 2 y 5 se conocen por tener un bien tropismo específico de neuronas.
Otro mecanismo de suministro genético es el uso de un retrovirus. El VIH u otros vectores retrovíricos basados en lentivirus se pueden utilizar para suministrar un casete de promotor+sonda optogenética a una región específica de interés. Los retrovirus también se pueden seudotipar con la glicoproteína de la envoltura del virus de la rabia para conseguir el transporte retrógrado para marcar las células basadas en sus patrones de proyección axonal. Los retrovirus se integran en el genoma de la célula huésped, por lo tanto, son capaces de mediar la expresión permanente de sondas optogenéticas. Los vectores retrovíricos no basados en lentivirus se pueden utilizar para marcar selectivamente las células en división.
Los adenovirus de Gutless y el virus del herpes simple (HSV) son dos virus basados en ADN que también se pueden utilizar para suministrar el casete de promotor+sonda optogenética en regiones específicas del cerebro. E1HSV y adenovirus tienen muchas más capacidades de empaquetamiento y por lo tanto pueden acomodar elementos promotores mucho mayores y también pueden utilizarse para suministrar múltiples sondas optogenéticas u otros genes terapéuticos junto con las sondas optogenéticas.
También se pueden utilizar la electroporación focal para transfectar transitoriamente las neuronas. Los ADN plasmídicos o fragmentos pueden suministrarse focalmente en una región específica del cerebro. Aplicando una corriente eléctrica suave, las células locales de alrededor recibirán material de ADN y la expresión de sondas optogenéticas.
En otro ejemplo, se puede utilizar la lipofección mezclando material genético con reactivos lipídicos y entonces posteriormente se inyectan en el cerebro para mediar la transfección de las células locales.
Distintas realizaciones implican el uso de distintos elementos de control. Además de los elementos de control genético, se pueden utilizar otros elementos de control (particularmente promotores (particularmente promotores y amplificadores cuyas actividades son sensibles a agentes químicos, estimulación magnética o radiación infrarroja) para mediar la expresión controlada temporalmente de las sondas optogenéticas. Por ejemplo, un promotor cuya actividad de transcripción está sometida a radiación infrarroja permite que se utiliza radiación enfocada para ajustar con precisión la expresión de sondas optogenéticas en una región focal solo el tiempo deseado.
La enfermedad de Parkinson se puede tratar mediante la expresión de estabilización optogenética en las neuronas glutamatérgicas en el núcleo subtalámico (STN) o el globo pálido interno (GPI) utilizando un promotor específico de excitación tal como CaMKIIa, y aplicar la estabilización optogenética. A diferencia de la modulación eléctrica en la que todos los tipos celulares están afectados, solamente se suprimirían las neuronas glutamatérgicas (STN).
Modelos de enfermedad
Aspectos de la presente divulgación proporcionan un modelo de ensayo de un circuito neural o enfermedad. El modelo puede definir la respuesta de salida del circuito en función de las señales de entrada. La respuesta de salida se puede evaluar utilizando varias características medibles diferentes. Por ejemplo, las características pueden incluir una respuesta eléctrica de neuronas corriente abajo y/o la respuesta del comportamiento de un paciente. Para ensayar el modelo, se expresan sondas optogenéticas en una posición de entrada para el modelo. Las sondas optogenéticas se estimulan y se controlan las características del resultado y se comparan con el resultado previsto por el modelo.
En ciertas implementaciones, el uso de sondas optogenéticas permiten ajustar con precisión los modelos definidos utilizando sondas eléctricas. Como las sondas eléctricas solo tienen una capacidad limitada para dirigir el estímulo y por lo tanto no son bien adecuadas para el estímulo de ciertas áreas sin estimular directamente áreas cercanas. Las sondas optogenéticas desveladas en el presente documento proporcionan un mecanismo para la selección más precisa de la localización del estímulo. Por ejemplo, el estímulo de las sondas optogenéticas se puede dirigir a tipos muy específicos de circuitos/células, tal como las fibras aferentes. La siguiente descripción proporciona un ejemplo de implementación consistente con dicha realización y significa que muestra la fiabilidad y la aplicabilidad de amplio espectro para los aspectos de la presente invención.
De acuerdo con una realización de la presente divulgación, la invención se puede utilizar en modelos animales de DBS, por ejemplo, en ratas Parkinsonianas, para identificar los tipos celulares diana responsables de los efectos terapéuticos (un área de intenso debate y de inmensa importancia clínica). Este conocimiento solo puede dar lugar al desarrollo de estrategias farmacológicas y quirúrgicas mejoradas para el tratamiento de la enfermedad humana. Una de dichas aplicaciones implica la potenciación a largo plazo (LTP) y/o la depresión a largo plazo (LTD) entre dos grupos neurales. Dirigiendo la expresión de una opsina descrita en el presente documento para diferentes poblaciones neurales y estimulando cada una con una frecuencia diferente de luz, se puede conseguir la LTP o LTD entre los dos grupos. Cada grupo se puede controlar individualmente utilizando la respectiva longitud de onda de luz. Esto puede ser particularmente útil para aplicaciones en las que la disposición espacial de los dos grupos presenta problemas con el control individual utilizando la misma longitud de onda de luz. Por lo tanto, los dispositivos de suministro de luz son menos susceptibles a la excitación de un grupo neural erróneo y pueden ser menos dependientes de la localización espacial precisa del estímulo óptico.
El suministro de las proteínas a las células in vivo se puede conseguir utilizando varios dispositivos de suministro, métodos y sistemas diferentes. Sobre dicho dispositivo de suministro es un dispositivo implantable que suministra una secuencia de nucleótidos para la modificación de células in vivo, tal como un vector vírico. El dispositivo implantable también puede incluir un mecanismo de suministro de luz. El suministro de luz se puede conseguir utilizando, por ejemplo, diodos emisores de luz (LED), fibras ópticas y/o láseres.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar al experto habituado en la técnica una divulgación completa y la descripción de cómo hacer y utilizar la presente invención, y no se pretende limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni pretenden que represente que los experimentos posteriores son todos o los únicos experimentos que se llevaron a cabo. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deberían tener en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A menos de que se indique otra cosa, las partes son partes por peso, el peso molecular es el peso molecular medio, la temperatura es en grados Celsius, y la presión es o está cerca de la atmosférica. Se pueden utilizar abreviaciones convencionales, por ejemplo, pb, pares de bases; kb (kilobases); pl, picolitros; s o seg, segundos; min, minutos; h o hr horas; aa, aminoácidos; kb, kilobases; pb, pares de bases; nt, nucleótidos, i.m., intramuscular; i.p., intraperitoneal; s.c. Subcutánea, y similares.
Ejemplo 1: Opsinas hiperpolarizantes
MATERIALES Y MÉTODOS
Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo los protocolos aprobados por el Panel Administrativo Stanford en Cuidado de Animales de Laboratorio.
Clonación molecular
Las construcciones lentivíricas contenían BamHI entre el promotor y la opsina, NotI entre la opsina y el fluoróforo, y EcoRI entre el fluoróforo y el WPRE. Los fragmentos de Opsina-eYPF se amplificaron con una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para añadir AscI y NheI, utilizando gtggcgcgccctattacttgtacagctcgtccatg (SEQ ID NO 11) (para todas las opsinas), tatgctagccaccatggactatggcggcgc (SEQ ID NO: 12) (para los mutantes de ChR2) y gttatgctagcgccaccatgtcgcggaggccatggc (SEQ ID NO 13) (para ChIEF), y entonces se ligaron en un armazón AAV-Efla-DIO cortado en esos sitios.
Se obtuvieron Mac y Arch en Addigene como genes de fusión de proteína fluorescente verde (GFP) y se cambiaron a una proteína fluorescente amarilla (eYFP) mejorada por consistencia. Se sintetizó ArchT humanizado mediante DNA2.0. Mac, Arch y ArchT se aumentaron a las versiones 2.0 utilizando solo el elemento de exportación del retículo endoplásmico (ER) y a las versiones 3.0 con el motivo de exportación del ER y la señal de tráfico como se ha descrito anteriormente.
Todas las construcciones se secuenciaron completamente para comprobar la precisión y todos los vectores AAV se ensayaron en cuanto a la expresión in vitro antes de la producción vírica. La información de la secuencia completa está en el sitio de internet: www.optogenetics.org.
Cultivo de neuronas del hipocampo v transfecciones con fosfato cálcico
Las neuronas primarias del hipocampo cultivadas se prepararon a partir de crías de rata Sprague-Dawley P0 (Charles River). Se aislaron CA1 y CA3, se digirieron con 0,4 mg/ml de papaína (Worthington), y se colocaron en placa sobre cubreobjetos de cristal revestidos previamente con Matrigel 1:30 (Beckton Dickinson Lab ware). Los cultivos se mantuvieron en una incubadora húmeda con un 5 % de CO2 con medio Neurobasal-A (Invitrogen) que contenía un 1,25 % de suero fetal bovino (FBS) (Hyclone), un 4 % de suplemento B-27 (Gibco), 2 mM de Glutamax (Gibco), y 2 mg/ml de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDr ) (Sigma), y se cultivaron en los cubreobjetos en una placa de 24 pocillos a una densidad de 65.000 células por pocillo.
Para cada pocillo se preparó una mezcla de ADN/CaCh con 2 |jg de ADN (preparación Qiagen libre de endotoxinas) y 1,875 j l de CaCl2 (concentración final de Ca2+ 250 mM) en 15 j l H2O. Al ADN/CaCl2 se le añadió 15 j l de solución salina tamponada con HEPES 2x (pH 7,05). Tras 20 min a temperatura ambiente (TA) la mezcla se añadió gota a gota en cada pocillo (en el cual se había retirado el medio de cultivo y se había remplazado con MEM calentado previamente) y se llevó a cabo la transfección durante 45-60 minutos a 37 °C, tras lo cual cada pocillo se lavó con 3 x 1 ml de MEM caliente antes de volver a poner el medio de cultivo original.
Invecciones estereotácticas
Se produjo el virus adenoasociado (AAV) serotipo 2/5 en la Universidad de Carolina Chape1Hill Vector Core. Los títulos genómicos fueron 1,5 x 1012 ufc ml'1 para ChETAA, ChETATR, y ChlEF, y 4 x 1012 ufc ml'1 para eYFP, eNpHR3.0, y eArch3.0. Se inyectó estereotácticamente 1 j l de virus bilateralmente en la corteza prefrontal medial de ratones de 3-4 semanas de edad a 1,7 anteroposterior, 0,4 mediolateral, y 2,5 dorsoventral (en mm desde el bregma).
Registros electrofisiológicos de célula completa
Los registros de las neuronas cultivadas se llevaron a cabo 4-6 días después de la transfección en solución de Tyrode (320 mOsm): 125 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCh, 30 mM de glucosa, y 25 mM de HEPES, titulados a un pH de 7,3-7,4 con NaOH. Se perfundió la solución de Tyrode a una velocidad de 1-2 ml min-1 y se mantuvo a temperatura ambiente (20-22 °C). La solución intracelular (300 mOsm) contenía 130 mM de K-gluconato, 10 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 10 mM de EGTA y 2 mM de MgCh, titulado a un pH de 7,3 con KOH. La caracterización de las opsinas excitadoras se hizo con tetrodotoxina (TTX) aplicada en un baño (1 pM; Sigma-Aldrich) y cloruro intracelular QX-314 (1 mM; Tocris Bioscience). El parche in vitro de opsinas hiperpolarizantes y los registros con la pinza de corriente para las opsinas despolarizantes se llevaron a cabo en presencia de bloqueantes de la transmisión sináptica 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX, 10 pM; Sigma-Aldrich) y ácido D(-)-2-amino-5-fosfonovalérico (APV; 25 pM, Sigma-Aldrich) así como gabazina para los experimentos de la pinza de corriente (10 pM; Sigma-Aldrich). Todos los registros de las neuronas cultivadas se llevaron a cabo en un microscopio vertical Leica DM-LFSA.
Los registros de células piramidales que expresaban eYPF, eNpHR3.0, y eArch3.0 se llevaron a cabo en cortes agudos de ratones C57BL/6 de 6-7 semanas después de la inyección del virus. ACSF contenía CNQX, APV y garbazina. La solución intracelular (280 mOsm) contenía 135 mM de K-gluconato, 5 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,1 mM de EGTA, 2 mM de MgCh, 2 mM de Mg-ATP, y 0,2 mM de Na2-GTP, titulados a un de pH 7,4 con KOH. Las células piramidales se identificaron por la morfología y las propiedades electrofisiológicas características. Los registros se llevaron a cabo en un microscopio vertical Olympus BX51. Para todos los experimentos de parcheo, las resistencias de pipeta de cristal de borosilicato (Sutter Instruments) eran 3-6 MQ Para los registros de electrofisiología unidos a la célula, con la obtención de sellos GQ, el potencial de mantenimiento se fijó de manera que ninguna corriente neta fluyera a través de la membrana; el mismo protocolo de estimulación se utilizó para los experimentos de pinchado de células completas. Después de llevar a cabo el registro unidos a la célula, los inventores aplicaron succión a la pipeta para romper la célula y se repitieron los mismos experimentos en la célula completa para proporcionar una comparación directa en la célula. No se añadió un cofactor retinal exógeno a las neuronas en ninguna preparación.
Suministro de luz
Todos los experimentos se llevaron a cabo utilizando la activación de un solo fotón. Para las neuronas cultivadas, la luz se emitió a partir de una lámpara 300 W DG-4 (Sutter Instruments, Novato, CA) y se suministraron a partir de un objetivo de inmersión en agua de 40x, 0,8 NA. Las señales pulsadas de entrada se suministraron al DG-4 a partir de pClamp (Axon Instruments) mediante una conexión BNC. El retraso desde la señal de disparo de DG-4 hasta la salida de luz completa se midió utilizando un fotodetector amplificado (Thorlabs) como ~1 ms, con un tiempo de aumento de 200 ps. Todas las mediciones de tiempo hasta el pico y latencia se corrigieron con este retraso.
Para las mediciones de la sensibilidad a la luz, la luz se pasó a través de un filtro de 470/40 nm (para las opsinas excitadoras sensibles a la luz azul) o un filtro de 562/40 nm (para C1V1 y todas las opsinas inhibidoras) y luego por una serie de filtros de densidad neutra (ND) para conseguir densidades de energía que variaban desde -0,1 a 20 mW mm-2. Otras propiedades se estudiaron a ~5 mW mm-2. Para estos experimentos, la luz se pasó a través de un filtro circular Lambda 10-3 (Sutter Instruments) con una rueda de 10 posiciones para filtros de diferentes longitudes de onda, se normalizaron a ND para generar densidades de energía estrechamente coincidentes. Los filtros eran: 406/15; 427/20; 445/20; 470/20; 494/20; 520/15; 542/20; 560/25; 590/20. También se utilizó un filtro 607/45 para el espectro inhibidor. Se utilizó un filtro de 470/40 nm para la actuación funcional de las herramientas despolarizantes en cultivo (para las herramientas excitadoras sensibles a la luz azul) o un filtro de 562/40 nm (para C1VT), y luego filtros ND para conseguir las densidades de energía de 3, 6 y 20 mW mm-2.
Para los experimentos que investigaban las herramientas de despolarización rápida en cortes, la luz se emitía desde la misma lámpara 300W DG-4 (Sutter Instruments) y se suministraba a través de un objetivo de inmersión en agua de 40x 0,8 NA. La luz se pasaba a través de un filtro de 470/40 nm y se ajustó para conseguir una densidad de energía lumínica de 5.1 mW mirr2 Para los experimentos que investigaban las herramientas de hiperpolarización en cortes, se utilizó un objetivo 40X/0.8 NA LUMPlanFL/IR (Olympus), con fuente de luz alógena XCite (EXPO). La luz se pasó a través de un filtro 589/15 o un filtro 560/14 (eArch3.0). Para los experimentos que comparaban las magnitudes de fotocorriente e hiperpolarización en condiciones coincidentes, la densidad de energía lumínica se ajustó a ~5 mW mm-2. Para el resto de los experimentos la luz se ajustó a lo largo de un intervalo de densidades de energía lumínica (5-10 mW mirr2 para eNpHR3.0; 0,25-5 mW mm-2 para eArch3.0) con el fin de conseguir un intervalo comparable de fotocorrientes para ambas opsinas.
Todos los experimentos contenían al menos 30 s de oscuridad entre los barridos con el fin de recuperar la línea basal. Todos los filtros se dan aquí como longitudes de onda en nm/ ancho de banda en nm. Todas las densidades de energía lumínica se midieron de salida del objetivo de 40x, a aproximadamente la distancia de muestra.
Análisis de datos
Los análisis de los resultados fisiológicos se llevaron a cabo utilizando el software ClampFit (Axon Instruments) o un software a medida escrito en MATLAB (Mathworks).
La resistencia de acceso (Ra) y resistencia de entrada (Rin) se controlaban continuamente y los datos solo se incluían cuando Ra era < 30 MQ y Rin era > 90 MQ. Cualquier traza que contuviera picos de escape se excluyó del análisis de pico de fotocorriente o de cinética, pero las fotocorrientes en reposo se seguían midiendo cuando era posible. Para los registros de pinza de corriente en cultivo, solamente las células que cumplían los criterios y tenían corrientes de escape > -150 pA (mantenidas a -65 mV) se incluyeron para el análisis. Para los registros de pinza de corriente en cortes agudos, solamente las células que cumplían los criterios y tenían potenciales de reposo < -55 mV) se incluyeron para el análisis.
Para identificar el pico de fotocorriente, las trazas se suavizaron utilizando el método robusto de Loess con un ancho de filtro de 2 ms y el pico se definió como el extremo desde la aparición del láser a 200 ms después de la aparición de láser, menos la corriente basal (a partir de la media sobre 500 ms antes de la aparición del láser) La inspección visual aseguraba que no se producían picos de escape ni otras anormalidades. El tiempo al pico se midió desde la aparición del láser hasta este tiempo de pico marcado. La fotocorriente de estado estacionario se determinó ajustando una curva monoexponencial a la forma de onda suavizada de 2 ms después del pico hasta el tiempo de salida del láser. La corriente en estado estacionario se tomó a partir de los parámetros de este ajuste. Se calcularon Toff y Tdes utilizando ClampFit. La traza se suavizó primero utilizando un filtro Gaussiano de paso bajo con un corte de -3 dB a 1.000 Hz; luego se ajustó una curva monoexponencial en la forma de onda suavizada. Todas las curvas se inspeccionaron por si estaban bien ajustadas.
Las propiedades de la fotocorriente de las herramientas despolarizantes ChR2, ChETAA, y ChlEF se caracterizaron in vitro utilizando tanto las construcciones lentivíricas como de virus adenoasociados (AAV). Para los parámetros que dependen de propiedades de única molécula (estado estacionario: relación del pico, espectro de acción, sensibilidad a la luz, y cinética), se agruparon los valores a lo largo de los experimentos después de confirmar los conjuntos de datos no eran estadísticamente diferentes. Las propiedades de la fotocorriente de las herramientas hiperpolarizantes se evaluaron en dos rondas diferentes de experimentos. Las magnitudes de fotocorriente de eNpHR3.0 eran estadísticamente diferentes entre los dos conjuntos de datos cuando se consideraban los valores normalizados, o propiedades intrínsecas de única molécula (espectro de acción, sensibilidad a la luz, y cinética) después de confirmar que eNpHR3.0 actuaba de manera similar a lo largo de los conjuntos de datos.
Los picos de célula completa se definieron como un aumento por encima de un umbral superior (-20 mV para la comparación de opsinas de despolarización rápida en cortes; 0 mV para todas las demás comparaciones) y entonces cae por debajo de un umbral inferior (-30 mV). Los picos posteriores que se producían en 2 ms de un pico anterior se ignoraban. Para detectar los picos provocados por la luz, se definió una ventana de tiempo desde 1-50 ms después de la aparición del pulso. Por encima de 20 Hz, esta ventana se truncaba a 1 ms después de la aparición del pulso de corriente, a 1 ms después de la aparición del pulso posterior. La ventana alrededor del último pulso de luz se truncó a la misma longitud. Los picos de células unidas se identificaron utilizando la función de umbral en ClampFit. Los eventos amplios, muy pequeños no se incluyeron como picos. Cuando los datos de picos eran ambiguos, la traza se inspeccionó manualmente. Para cada tren de pulsos de célula completa los inventores calcularon la proporción de pulso de luz que provocaba > 1 pico (eficacia de pulso) y que provocaba > 1 pico (probabilidad de pico múltiple).
Los potenciales planos se definieron como la salida de la forma en onda del pico a partir de la línea basal. Para las herramientas despolarizantes in vitro, todas las células que se dispararon con > un pico se incluyeron para el análisis. Para las células de pico rápido en cortes, solo las trazas que tenían un 100 % de eficacia de pulso se incluyeron para el análisis. La estacionalidad temporal, la extensión hasta que el pico se sostiene y la misma fiabilidad a lo largo del tiempo, se calculó dividiendo los pulsos de luz en cuartiles y computando la eficacia del pulso de cada cuartil. La latencia y diseminación de latencia a lo largo de los trenes de pulso se determinaron de la siguiente manera: Para cada pulso de luz, los inventores midieron la delta de tiempo desde la aparición del pulso de luz hasta el tiempo de pico. La latencia es la media de estos deltas de tiempo, y la diseminación de latencia la desviación típica de estos deltas de tiempo. Nótese que la diseminación de latencia por lo tanto es una medida de cómo de variables son las latencias en cada célula, mientras que las barras de error en la latencia son el error típico de las latencias medias a lo largo de las células. Las trazas en las que las células disparaban < 5 potenciales de acción se excluyeron de los análisis.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el Graphpad Prism 5.04 para Windows (Software Graphpad, www.graphpad.com) Para las comparaciones de dos muestras de una única variable (tal como la cinética de ChETAA vs. ChlEF en cortes) se ensayó primero si los datos seguían una distribución Gaussiana (ensayo de normalidad de Shapiro-Wilk). Si los datos eran detectablemente no Gaussianos, se llevó a cabo un ensayo no paramétrico de Mann-Whitney. Si los datos se aproximaban bien a Gaussianos, se llevó a cabo un ensayo t de dos muestras independiente (varianza igual). En el caso de una varianza desigual (determinada por un ensayo F), se aplicó una corrección de Welch. Todos los ensayos eran de dos colas con niveles de confianza del 95 %.
Para las comparaciones de vía múltiple de una única variable (tal como la cinética de todas las opsinas despolarizantes en cultivo) se ensayó primero si los datos seguían una distribución Gaussiana (ensayo de normalidad de Shapiro-Wilk). En los casos en los que las distribuciones eran detectablemente no Gaussianas, se utilizó una transformación de raíz cuadrada para estabilizar la varianza y hacer los datos aproximadamente normales, todos los datos se compararon entonces contra un "control" especificado, corrigiendo el error de tipo familiar utilizando el ensayo de Dunnett. Si los datos transformados no eran aún Gaussianos, los inventores utilizaron el ensayo de Dunn no paramétrico. En todos los casos, se mantuvieron niveles de significancia totales de alfa = 0,05 (intervalo de confianza del 95 %). La comparación entre grandes números de opsinas tendrá, por lo tanto, una alfa más conservadora (un requisito más riguroso para la significancia). Esto puede también dar como resultado valores de significancia diferentes asignados a la misma comparación, dependiendo de cuantas comparaciones se vayan a llevar a cabo en paralelo. En particular, como algunos de los mismos datos de ChR2 y ChETAA se incluían en dos comparaciones, las discrepancias en los valores de significancia expuestos se podían atribuir al número total de opsinas incluidas en cada conjunto de comparaciones.
Para las comparaciones a lo largo de múltiples variables (tales como la actuación de pico a través de frecuencias), se llevó a cabo los ANOVA de dos vías, seguido por ensayos posteriores entre pares o contra un "control" especificado. Se utilizó una corrección conservadora de Bonferron para controlar la tasa de falsos positivos. Para ensayar la relación entre las propiedades de las dos opsinas (tal como Toff vs. EPD50), se llevó a cabo una correlación de Spearman de dos colas no paramétrica con un nivel de confianza del 95 %. Para estimar la pendiente, se llevó a cabo, una regresión de mínimos cuadrados (sea lineal o linear sobre datos transformados log-log), minimizando la distancia cuadrada relativa (1/Y“2).
Para ensayar la dependencia de una propiedad de opsina en una condición experimental (por ejemplo, fotocorriente vs. densidad de energía lumínica), se llevaron a cabo las regresiones, de la siguiente manera: Primero, para el análisis de tiempo al pico vs. densidad de energía lumínica, los inventores llevaron a cabo la regresión lineal sobre datos transformados log-log, y se comparó sí, para cada opsina, la pendiente de mejor ajuste se diferencia significativamente de 0. Segundo, para el análisis de recuperación de la desensibilización, se utilizó una regresión no lineal para ajustar la recuperación de fotocorriente media con una curva de asociación de dos fases, constricción Yo = 0 y meseta =1. Este ajuste se utilizó para generar las curvas y los valores de R-cuadrado. En un análisis separado, los inventores fijaron los datos de cada célula individual, para calcular el tiempo necesario para el 50 % de recuperación. Tercero, para el análisis de las sensibilidades a la luz, se ajustaron las medias de la población en bruto con una curva de unión específica de un sitio.: Y = Bmax*X/(Kd X). En un análisis separado, se normalizaron las fotocorrientes para cada célula, y se graficaron las medias de población y errores típicos para cada opsina. Estos datos de población se ajustaron de la misma manera para generar las curvas y los valores de R-cuadrado. Para cada célula individual, se obtuvo una Kd (constante de unión en equilibrio), a la que los inventores se refirieron como EPD50 (el 50 % de densidad de energía lumínica efectiva).
Los umbrales de significancia de la población se fijaron siempre a una P < 0,05 (*), P < 0,01 (**), y P < 0,001 (***), para la familia completa de comparaciones. Todos los gráficos se muestran como la media error típico de la media (s.e.m.).
Inmunohistoquímica
A las 6 o 4 semanas después de la inyección, los ratones se perfundieron por vía transcardíaca con PBS seguido por un 4 % de paraformaldehído (PFA). Después de una noche tras la fijación en PFA, los cerebros se equilibraron en un 30 % de sacarosa en PBS durante al menos 24 horas. Se obtuvieron secciones de 40 |jM utilizando un microtomo congelado, se tiñeron con DAPI (1:50.000), y se cubrió con un cubreobjetos con PVA-DABCO (Sigma-Aldrich). Los cultivos de hipocampo primarios transfectados se fijaron durante 15 min con un 4 % de PFA. Para la tinción con KDEL (SEQ ID NO: 14), se permeabilizaron entonces los cultivos durante 30 min con un 0,4 % de saponina en un 2 % de suero normal de burro (NDS). Las incubaciones con los anticuerpos primarios se llevaron a cabo durante una noche a 4 °C utilizando un anticuerpo monoclonal que marcaba las proteínas residentes en ER endógenas que contenían la señal de retención de KDEL (SEQ ID NO: 14) (anti-KDEL, 1:200, Abeam). Se aplicaron los anticuerpos secundarios (Jackson Laboratories) en un 2 % de NDS durante 1 hora a temperatura ambiente. Equipamiento y ajustes
Todas las imágenes se obtuvieron en un microscopio confocal Leica (DM600B) con una resolución de 1024x1024 (dimensiones de pixel = 3,03 j M2). Las imágenes se adquirieron utilizando los siguientes objetivos: 10X/0,40 NA (aire), 40X/1,25 NA (aceite), y 63X/1,4 NA (aceite). Las longitudes de onda de excitación y emisión eran las siguientes: eYFP en la Fig. 5b, 514 nm / 512-600 nm; eYFP para todas las otras figuras, 488 nm / 500-545 nm; GFP, 488 nm / 500-600 nm; Cy5, 633 nm / 650 - 750 nm. Las siguientes figuras usaban un promedio lineal: Fig. 3e, h (2), Fig. 5b (4), Fig. 6a (3). Se utilizaron ajustes consistentes para todas las imágenes en cada panel de figura determinado. El brillo y el contraste de todas las imágenes de eYPF para la Fig. 5b se modificaron uniforme e idénticamente con Photoshop (Adobe). Todas las demás imágenes se dejaron sin procesar después de la adquisición.
Cuantificación de los niveles de fluorescencia en células transfectadas
Las imágenes de fluorescencia se adquirieron de las mismas células que se parcharon para hacer posible la cuantificación de los niveles de expresión y las relaciones entre fotocorriente/fluorescencia. Las imágenes se adquirieron con Metamorph, se mantuvieron constantes los ajustes, y se procesaron fuera de línea utilizando Image J. Los ROI dibujados a mano englobaban el soma y las dendritas proximales.
RESULTADOS
Herramientas hiperpolarizantes y propiedades
Se compararon cara a cara distintas herramientas optogenéticas hiperpolarizantes. Aunque cada experimento tendrá su propio conjunto de requisitos únicos para las propiedades de fotocorriente hiperpolarizante, algunos principios de guía comunes parecen inicialmente claros. Primero, en la mayoría de las aplicaciones experimentales, las fotocorrientes hiperpolarizantes necesitarán ser lo suficientemente grandes para inhibir con seguridad el pico incluso en presencia de entradas excitadoras. Segundo, la mayor sensibilidad a la luz hará posible probablemente la modulación de volúmenes mayores de tejido, el uso de energías lumínicas menores, y/o un suministro de luz menos invasivo. Tercero, la inhibición de bloqueo en el tiempo, precisa, necesitará presumiblemente fotocorrientes con aparición y desaparición rápida, mientras que la inhibición a largo plazo necesitará fotocorrientes que sean estables, con una desensibilización mínima. Finalmente, la naturaleza del espectro de acción dictará la fiabilidad de la combinación con otros reactivos activados por la luz en la misma preparación3233.
La primera herramienta de hiperpolarización que demostraba ser eficaz en neuronas era la halorrodopsina de N. pharaonis (NpHR), una bomba de cloro activada por la luz amarilla que se ha utilizado ahora en preparaciones que varían a lo largo de los cortes de cerebro en mamíferos 32, gusanos de vida libre32, neuronas cultivadas3234, y comportamiento de mamíferos35-38. Se han expuesto dos versiones modificadas para un direccionamiento de membrana mejorado en neuronas de mamífero, llamadas eNpHR2.039 y eNpHR3.033 También se ha demostrado recientemente que las bombas de protones hacia fuera Arch40 (de Halorubrum sodomense), ArchT41 (cepa TP009 de Halorubrum), eBR33 (de Halobacterium) y Mac40 (de Leptosphaeria maculans) consiguen una inhibición neuronal satisfactoria. eNpHR3.0 tiene fotocorrientes mayores que eNpHR2.0, y ARch tienen mayores fotocorrientes que eNpHR2.0, pero aún no se ha informado de una comparación directa entre eNpHR3.0 y Arch o cualquiera de las bombas de protones. Posteriormente se presenta una comparación directa de las más potentes opsinas hiperpolarizantes (Fig. 1A), incluyendo las nuevas versiones de tráfico de membrana aumentado de bombas de protones que resultan en los niveles de expresión más altos y fotocorrientes inhibidoras ya descritas. Se caracterizaron las propiedades in vitro, entonces se ensayó la actuación funcional de dos de los candidatos más prometedores en cortes agudos.
Cada herramienta hiperpolarizante se fusionó en fase con la proteína fluorescente amarilla mejorada (eYPF), se clonaron las opsinas en un armazón lentivírico idéntico con el promotor de excitación CaMKIIa (Fig. 1a); y las opsinas se expresaron en neuronas cultivadas (Fig. 1). eNpHR3.0 se dirigió bien a la membrana, pero Arch, ArchT, y Mac mostraban acumulaciones intracelulares reminiscentes de agregados en el retículo endoplásmico (ER) observados con NpHR1.039 También se observaron las mismas acumulaciones en las versiones con GFP de las construcciones, las versiones de GFP e YFP 1.0 tienen fotocorrientes similares. La agregación en ER se confirmó co-tiñendo con el marcador KDEL del ER (SEQ ID NO: 14) (Fig. 1b). Las modificaciones en el tráfico aplicadas a eNpHR3.0 se aplicaron a Arch, ArchT, y Mac. Estas versiones nuevas con el tráfico mejorado, que se denominan (por analogía con la progresión de la versión NpHR) eArch3.0, eArchT3.0, y eMac3.0, tenían un marcado intracelular marcadamente reducido y localización en la membrana mejorada con marcado de procesos celulares (Fig. 1b). Las versiones "2.0" intermedias eran potentes, pero no tan satisfactorias como las versiones 3.0.
Debido a que solo las proteínas expresadas en la membrana pueden contribuir a la fotocorriente medida, se anticipaba que esta mejora del tráfico de la opsina debería aumentar el tamaño de la fotocorriente. Además, las tres bombas de protones mejoradas tienen las fotocorrientes drásticamente aumentadas (P < 0,001; Fig. 1c). Mientras que las versiones 1.0 de las bombas de protones tenían fotocorrientes significativamente más pequeñas que las fotocorrientes de eNpHR3.0, eArch3.0 y eArchT3.0 eran significativamente mayores (P < 0,001 para cada comparación; Fig. 1c). Las células que expresan eNpHR3.0 tenían la fluorescencia más débil, pero la mayor fotocorriente por fluorescencia, de estas herramientas.
Aunque las máximas fotocorrientes de eMac3.0 eran las más pequeñas entre las opsinas mejoradas (y significativamente más pequeñas que las de eNpHR3.0; P < 0,05), Se ha informado de que Mac tiene un espectro de activación que cambia suficientemente a azul para permitir una inhibición doble en combinación con eNpHR3.064 Después de verificar que el tráfico de membrana no cambiaba el espectro, se comparó el espectro de las bombas mejoradas, y se representaron con ChR2 como referencia ((Fig. 1d). eNpHR3.0 cambiaba a rojo (con un pico a 450­ 590 nm) con respecto a las tres bombas de protones (con picos a 520-560 nm), presentando al menos un solapamiento con ChR2; no se verían diferencias funcionalmente relevantes entre las bombas de protones.
La precisión temporal de fotocorrientes de hiperpolarización se investigó cuantificando las cinéticas de asociación (Ton) y las cinéticas de disociación (Toff) al principio y el final de un pulso de luz de 1 s. Todas las bombas se activaban rápidamente, activando las bombas de protones significativamente más rápidamente que eNpHR3.0 (todas en el intervalo de 1,5-3 ms, Fig. 1e). Ambas variantes Mac tenían cinéticas de disociación mucho más lentas en comparación con las otras bombas (P < 0,001; Fig. 1e).
La sensibilidad a la luz de las bombas hiperpolarizantes se evaluó midiendo las fotocorrientes a lo largo de un intervalo de densidades de energía lumínica que varían desde -0,05 to -20 mW mm-2 (Fig. 1f); debido a la pequeña fotocorriente, se eliminó la Mac 1.0 de este y posteriores análisis). Como se esperaba, las bombas 3.0 tenían una sensibilidad operacional a la luz mayor (es decir, por magnitud de corriente absoluta) que los equivalentes 1.0, aunque la mejora del tráfico no afectaba la sensibilidad de la población (magnitudes de corriente normalizadas o EPD50). La eMac3.0 era la más sensible (EPD50 = 1,9 ± 0,4 mW mirr2 vs. 5,4 0,2 mW mirr2 for eNpHR3.0; P < 0,001). Las cinéticas de disociación y la sensibilidad a la luz de la población por lo tanto se correlacionaban inversamente para las herramientas hiperpolarizantes, como reminiscencia del patrón observado en las herramientas despolarizantes.
Dado que muchos experimentos de neurociencia de la conducta pueden necesitar una inhibición prolongada del orden de minutos, se investigó la estabilidad de las fotocorrientes hiperpolarizantes. Mientras que tos las fotocorrientes de las bombas decaían a lo largo de 60 s de luz continua, las corrientes de eNpHR3.0 eran las más persistentes y las grandes corrientes de las bombas de protones 3.0 (eArch3.0 y eArchT3.0) tenían la caída de disociación más grande in vitro. Todas las bombas recuperaban las fotocorrientes con eficacia similar en estas condiciones de neuronas cultivadas.
Figura 1: Propiedades de las herramientas de hiperpolarización, (a) NpHR es una bomba de cloro hacia dentro (tipo halorrodopsina; HR), mientras que Arch, ArchT, y Mac son bombas de protones hacia dentro (tipo bacteriorrodopsina; BR). Las versiones 3.0 incluyen una secuencia de tráfico (TS) entre la opsina y el fluoróforo y las de tipo 2.0 una secuencia de exportación del retículo endoplásmico (ER) después del fluoróforo. (b) Imágenes confocales de las versiones 1.0 y 3.0 (en verde) expresadas en el cultivo e inmunomarcadas con un marcador ER (anti-KDEL (SEQ ID NO: 14); en rojo). La barra de escala horizontal representa 25 |jM. (c) Trazas representativas y fotocorrientes brutas en respuestas a 1 s de luz para 1.0 (barras huecas) vs. Versiones 3.0 (barras sólidas) para Arch (n = 15-19), ArchT (n = 14-16), y Mac (n = 8-12). Las barras de escala horizontal y vertical representan 500 pA y 500 ms, respectivamente. Las fotocorrientes se normalizaron a los valores de eNpHR3.0 del mismo experimento para hacer posible las comparaciones directas a lo largo de las opsinas (n = 8-35). (d) Espectro de acción para las versiones 3.0 (n = 7-20) junto con ChR2 (en negro), (e) Ton y Toff (n = 7-35). Las barras de escala horizontal y vertical representan 200 pA y 5 ms, respectivamente. (f) EPD50 para todas las opsinas hiperpolarizantes (n = 5-14). Fotocorriente bruta vs. densidad de energía lumínica representada junto con el experimento de eNpHR3.0 (n = 5­ 14). Todos los datos de la población se grafican como la media s.e.m. Las estrellas indican el nivel de significancia. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. A menos de que se indique otra cosa, eNpHR3.0 se activaba con 590 nm de luz, mientras que las otras herramientas se activaban con 560 nm de luz, ambas a ~5 mW mm-2.
Herramientas hiperpolarizantes: picos de inhibición en cortes agudos
Para investigar adicionalmente las características de las fotocorrientes prolongadas en condiciones más relevantes para los experimentos in vivo, y para ensayar la capacidad funcional de hiperpolarización para inhibir establemente los picos, se utilizaron preparaciones de cortes agudos. Para este análisis, se compararon una de cada clase general de herramientas hiperpolarizantes (a saber, la bomba de cloro eNpHR3.0 contra una de las bombas de protones). Se utilizó la equivalente mejorada de las bombas de protones mejor establecidas (Arch 1,0) hasta la fecha, a saber, eArch3.0. Para expresar eNpHR3.0 y eArch3.0 in vivo, se inyectó de manera estereotáctica un vector vírico adenoasociado (AAV, serotipo 2/5), con el gen de fusión opsina-eYPF bajo el control del promotor CaMKIIa. En condiciones coincidentes, eArch3.0 se expresaba mucho más fuertemente basándose en la fluorescencia, ambas en el sitio de inyección y en los axones en las dianas corriente abajo tal como en la amígdala basolateral (BLA; Fig.
2a). En comparación con los controles transducidos de eYPF, las células que expresaban ambas opsinas tenían resistencias de entrada (Fig. 2b) y potenciales de reposo basales similares, pero una capacitancia ligeramente mayor, como se había observado previamente para las células HEK42 que expresaban opsinas También como se esperaba por los trabajos in vitro (Fig. 1), a densidades de energía lumínica coincidentes (5 mW mirr2) eArch3.0 tenía fotocorrientes significativamente mayores (P = 0,01), con un promedio de 1680 ± 360 pA vs. 450 ± 70 pA para eNpHR3.0 (Fig. 2c). Bajo la pinza de corriente, la hiperpolarización mediada por eArch3.0 también era significativamente mayor (-94 ± 12 mV vs. -41 ± 4 mV, P = 0,005; Fig. 2d); las diferencias más pequeñas en la hiperpolarización en comparación con la fotocorriente se podrían deber al enlentecimiento dependiente del voltaje de la vuelta del fotociclo en las bombas de protones.
Debido a que la estabilidad de la fotocorriente y las respuestas celulares a la hiperpolarización pueden depender de las magnitudes de la fotocorriente, se llevó a cabo un conjunto de experimentos utilizando densidades de energía lumínica no coincidentes (5-10 mW mirr2 para eNpHR3.0; 0,25-5 mW mm-2 para eArch3.0) para obtener un intervalo de fotocorrientes similar en las dos herramientas. Las células se iluminaron durante 60 s con una pinza de voltaje y se midió la fotocorriente inicial y final de cada célula. Estos datos estaban bien ajustados por la regresión lineal (eNpHR3.0 R2 = 0,68, eArch3.0 R2 = 0,88), teniendo eArch3.0 una pendiente significativamente más alta (F136 = 22,2, P < 0,001), lo que reflejaba el hecho de que, para las células con fotocorrientes de aparición similar, las células que expresaban eArch3.0 tenían más fotocorriente remanente al final del pulso de luz en estas condiciones de cortes, como se ve en las trazas ilustrativas y al contrario que con el patrón de estabilidad observado in vitro.
Se evaluó la capacidad de eArch3.0 y eNpHR3.0 para inhibir el pico en la pinza de corriente. Se provocó el pico con inyecciones de corriente modestamente por encima del umbral a 5 Hz con una base de 30 s (pre-lumínica), 6 s de luz, y 30 s post-lumínica. Ambas bombas bloquearon satisfactoriamente los picos a lo largo de la duración de la estimulación lumínica prolongada (Fig. 2e). Los inventores observaron que en ambos grupos algunas células se volvían inestables después de una hiperpolarización prolongada especialmente por >50 mV, fallando en los picos al inyectar la corriente o rebotando a un potencial de reposo más despolarizado después de la salida de la luz. Estos factores se cuantificaron para cada célula y se graficó cada uno contra el grado de hiperpolarización (Fig. 2f). En hiperpolarizaciones más moderadas (>50 mV), no se observaron efectos consistentes o duraderos sobre la excitabilidad o la resistencia de la membrana.
Figura 2: Actuación de las herramientas hiperpolarizantes (a) imágenes confocales de la expresión de eNpHR3.0 y eArch3.0 en el sitio de inyección en la corteza prefrontal medial (mPFC) y corriente abajo en la amígdala basolateral (BLA). Las barras de escala representan 250 |jM y 25 |jM. La tinción con DAPI (en blanco) delinea los cuerpos celulares, (b) resistencias de entrada medias para las células que expresan opsina y controles eYPF (n = 10-22). (c) Trazos representativos y media de aparición de fotocorrientes para eArch3.0 y eNpHR3.0 en respuesta a pulsos de luz de 60 s 5 mW mirr2 (n = 8-10). Las barras de escala vertical y horizontal representan 400 pA y 10 s, respectivamente, (d) Pico de hiperpolarización medio generado por eArch3.0 y eNpHR3.0 con pulsos de luz de 60 s 5 mW mm-2 (n = 6-10). (e) Supresión de picos evocados por inyección de corriente en células disparadas fiablemente mediante 60 s de luz continua en células que expresan eNpHR3.0 o eArch3.0. Las células se iluminaron con densidades de energía lumínica fijadas para conseguir aproximadamente una hiperpolarización coincidente. Las barras de escala horizontal y vertical representan 40 mV y 20 s, respectivamente, (f) Relación entre la magnitud de hiperpolarización y la estabilidad celular. La recuperación post-lumínica de los picos evocados (con respecto a la actuación pre-lumínica) y el cambio del potencial de reposo representado contra la hiperpolarización evocada por la luz. Todos los datos de la población se grafican como la media s.e.m. Las estrellas indican el nivel de significancia. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. eNpHR3.0 se activaba con 590 nm de luz, mientras que eArch3.0 se activaba con 560 nm de luz.
Ejemplo 2: Clonación y caracterización de la opsina de Dunaliella salina
Normalmente se encuentra en entornos hipersalinos tal como las salinas por evaporación, el alga verde unicelular (oval con dos flagelos) Dunaliella salina es tolerante a la sal. A pesar de pertenecer al mismo orden que el alga verde Chlamydomonas reinhardtii y Volvox carteri, la Dunaliella puede aparecer rojiza debido a la acumulación de altos niveles de moléculas de carotenoides (Figura 3A). Los inventores hicieron la hipótesis de que la ChR de Dunaliella podía tener propiedades inusuales e hicieron esfuerzos para clonar las ChR de esta especie de alga flagelada.
A pesar de la alta homología con otras ChR conocidas, la secuencia de DChR1 contenía varias características notables (Figura 3B). Primero uno de los restos que se pensaba que contribuía al contraión complejo del RSB, El23 en ChR2 como se ha expuesto anteriormente, estaba remplazado por Ala en el DChR1 TM3 (Figure 3B,C); a partir del modelo estructural (Fig. 3C), Se esperaba que la función de contraión se asumiría por E309 en DChR1, una posición que tiene solo un papel menor en BR (D212) o rodopsina sensible de Anabaena (ASR) (Vogeley et al., 2004). Incluso más extraordinariamente, las fotocorrientes de DChR1 eran transportadas exclusivamente por protones, a diferencia de otras ChR conocidas, y no la afectaba de ninguna manera el cambio en la composición catiónica extracelular (Figura 3D). En consecuencia, la fotocorriente era altamente sensible a cambios en el pH ambiental y se desvanecía completamente a pH alto (Figure 3E).
El entendimiento completo de las relaciones estructura-función necesitará estructuras cristalinas de alta resolución en múltiples estados del fotociclo. Sin embargo, los estudios de mutagénesis dirigida al sitio demuestran aquí que DChR1 tiene una disposición de contraión y selectividad de iones diferentes en comparación con otras ChR conocidas. La estricta selectividad de H+ de DChR1 no estaba mediada por el contraión inusual del base de Schiff retinal protonada (RSBH), como sustitución de A178 con el supuesto contraión más típico Glu como se encuentra en ChR2 solo el espectro de activación cambiado a rojo (Figura 3F, de 475 a 510 nm) con un mínimo efecto sobre la amplitud de corriente o la cinética. De manera similar, la sustitución de E309 con Asp producía un ligero cambio espectral y un ligero aumento de la corriente, mientras que remplazando el E309 cambiado por Ala hacía que la proteína fuera casi totalmente inactiva (Fig. 3F).
Dados los gradientes de protón electroquímicos típicos, la dirección de la corriente de DChR1 H+ es opuesta a la dirección de la corriente H+ generada por la actividad de las bombas de bacteriorrodopsinas (BR), por lo tanto, la DChR1 y BR hacen posible la intervención tal como el control bidireccional del pH celular, por ejemplo, en la manipulación del pH de los compartimentos intracelulares (mitocondrias y vesículas sinápticas). Por lo tanto, DChRI define una nueva clase de opsina microbiana - un canal de protones activado por la luz - a diferencia de otras opsinas microbianas que incluyen la ChR1, y la ChR2. Estos hallazgos ilustran la diversidad de funciones que están presentes probablemente en la vasta matriz de genomas de opsinas microbianas.
Figura 3. Caracterización de una rodopsina de canal de Dunaliella salina
A. El alga unicelular halófila Dunaliella salina. B. Homología de secuencia entre las rodopsinas del canal de algas y BR con la tercera hélice transmembrana. La posición E123 normalmente conservada se ha sustituido con una Ala en DChR1 (y se muestra con fondo amarillo), los restos conservados se muestran en un fondo azul, y los aminoácidos que probablemente interactúan con el cromóforo se muestran en rojo. C. Falta de un receptor de protones en DChR1, en comparación con las BR y de Chlamydomonas ChR2 (CChR2). La ASR (rodopsina sensorial de Anabaena) se ha cristalizado con una mezcla de retinales todos trans que se ven como un recubrimiento (Vogeley et al., 2004). D. Las fotocorrientes de DChR1 no se afectan por cambios en la composición de cationes extracelular (el único catión presente en cada condición se muestra en la categoría del eje X). El intercambio de cationes se llevó a cabo en 5 mM de Mops-NMG, 0,1 mM de MgCh con 100 mM de LiCl, KCl, NaCl, cloruro de guanidio o cloruro de NMG (pH 7,5). Los inventores utilizaron una secuencia de DChR adaptada al codón humano (restos de aminoácidos 1-339) como matriz para la síntesis de ARN protegido mediante la ARN polimerasa T7 (mMessage mMachine, Ambion). La preparación de oocitos, la inyección del ARN protegido se llevó a cabo como se había descrito anteriormente (Berthold et al. 2008), y la pinza de tensión de dos electrodos se llevó a cabo con un amplificador Turbo Tec-05 (NPI Electronic) o un GeneClamp 500 (Molecular Devices) en un oocito después de 3-7 días de la inyección del ARN protegido. Se proporcionó luz continua mediante una lámpara de 75-W Xenon (Jena Instruments) y se suministró a los oocitos mediante una guía de luz de 3 mm. La luz pasaba a través de un filtro de banda ancha de 50025 nm (Balzers) con una intensidad de 46 mW/cm2 E. Por el contrario, la fotocorriente es altamente sensible a cambios en el pH ambiental. Las soluciones contenían 100 mM de cloruro de NMG, 0,1 mM de MgCh, 0,1 mM de CaCl2 con 5 mM de glicina (pH 9,0), 5 mM de Mops-NMG (pH 7,5), 5 mM de citrato (pH 6, 5,5, 5,0, 4,6, 4,2). F. La introducción o alteración de un receptor de protones (A178E o E309D) en el bolsillo de unión retinal de DChR1 producía un pronunciado cambio a rojo en el espectro de absorción. Los inventores aplicaron fogonazos de láser de 10 ns como se había descrito anteriormente (Berthold et al. 2008); las soluciones para el registro del espectro de acción contenían 100 mM de NaCl, 0,1 mM de MgCh, 0,1 mM de CaCl2 y 5 mM de citrato (pH 4,2).
Una secuencia de nucleótidos que codifica la DChR1 de D. salina se presenta en la Figura 4. La secuencia de nucleótidos que codifica DChR1 tenía el codón optimizado para la expresión en mamíferos, la secuencia con el codón optimizado se representa en la Figura 5. La Figura 6 proporciona una secuencia de aminoácidos de la DChR1 de D. salina.
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO:
22, y que tiene una función de opsina.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que la función de opsina es como un canal de protones activado por la luz.
3. El polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 22.
4. El polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 22.
5. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una secuencia de exportación del retículo endoplásmico (ER) y/o una secuencia de tráfico.
6. El polipéptido de la reivindicación 5, en el que la secuencia de exportación del ER comprende la secuencia de aminoácidos VKESL (SEQ ID NO: 1), VLGSL (SEQ ID NO: 2), o FCYENE (SEQ ID NO: 5).
7. El polipéptido de la reivindicación 5, en el que la secuencia de tráfico comprende la secuencia de aminoácidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO: 10).
8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. El polinucleótido de la reivindicación 8, en el que el polinucleótido tiene el codón optimizado para la expresión en una célula de mamífero.
10. El polinucleótido de la reivindicación 8, en el que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un promotor.
11. El polinucleótido de la reivindicación 8, en el que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control de la transcripción específica de neuronas.
12. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11.
13. El vector recombinante de la reivindicación 12, en el que el vector recombinante es un vector lentivírico, un vector adenovírico, o un vector vírico adenoasociado.
14. Una célula modificada genéticamente in vitro que comprende el vector recombinante de las reivindicaciones 12 o 13.
15. Una célula de mamífero modificada genéticamente in vitro que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 o el vector recombinante de las reivindicaciones 12 o 13.
16. La célula modificada genéticamente in vitro de la reivindicación 15, en donde la célula es una neurona.
17. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 o el vector de las reivindicaciones 12 o 13, para su uso en un método de terapia de un sujeto mamífero.
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