JP2006068016A - 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】新規ポリペプチド及びこれらペプチドをコードする核酸分子を対象としている。また、ここにおいて提供されるのは、これら核酸配列を含んでなるベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合したポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド分子、ポリペプチドと結合する抗体、並びにポリペプチドを製造する。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般的に、新規なDNAの同定及び単離、及び新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
細胞外タンパク質は、特に、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直近の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、翻って多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。また、膜タンパク質であるこれらレセプターは、治療又は診断薬剤としての潜在力を有する。新規な未変性分泌タンパク質を同定する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Kleinら, Proc. Natl. Acad. Sci. 93;7108-7113(1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター-リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
新規な天然のレセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプター又は膜結合タンパク質のコード配列を同定するために、哺乳動物の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
一実施態様では、本発明は、PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一側面では、単離された核酸分子は、(a)ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するPROポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
或る側面では、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つPROポリペプチドに対して少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失又は膜貫通ドメインが不活性化のいずれかの単離されたPROポリペプチドを提供する。これを製造する方法もここに記載され、その方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をPROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からPROポリペプチドを回収することを含む。
さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含む。好ましくは、PROポリペプチドは天然PROポリペプチドである。
またさらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチド、又はここに記載するPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体を担体と組み合わせて含む組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載の任意のポリペプチドをコードするDNAを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例としては、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母であってもよい。ここに記載の任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供されており、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
その他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びcDNAヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
さらに他の実施態様では、本発明は、下記の実施例に示される機能的生物学的アッセイデータに基づく種々の利用についての本発明のPROポリペプチドの利用方法に関する。
I.定義
ここで使用される際の「PROポリペプチド」及び「PRO」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号(例えば、PRO/番号)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」がここで使用される実際の数値符号である、ここで使用される「PRO/番号ポリペプチド」及び「PRO/番号」という用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体(ここで更に詳細に定義する)を含む。ここで記載されているPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。「PROポリペプチド」という用語は、ここで開示されている各個々のPRO/番号ポリペプチドに指す。「PROポリペプチド」を指すこの明細書中の全ての開示は、各ポリペプチドを個別にも組み合わせとしても言及する。例えば、調製の、精製の、誘導の、抗体の形成、投与の、含有する組成物、疾患の治療、などの記述は、本発明の各ポリペプチドに個別に関係する。また、「PROポリペプチド」という用語は、ここに開示されているPRO/番号ポリペプチドの変異体を含む。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例として、「PRO」が対象となる仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となる「比較」タンパク質が比較されているアミノ酸配列を表し、そして「X」、「Y」及び「Z」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表2及び3は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN-2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。核酸配列Cの長さがアミノ酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%核酸配列同一性の計算の例として、「PRO−DNA」が対象となる仮説的PROコード化核酸配列を表し、「比較DNA」が対象となる「PRO−DNA」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「N」、「L」及び「V」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表4及び5が「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO−DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示す。
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、PROポリペプチドの自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-PROポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗-PRO抗体組成物、一本鎖抗-PRO抗体、及び抗-PRO抗体の断片を包含している(下記参照)。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPROポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするPROポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜約20の残基)を有する。
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生PROポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するPROの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生PROによって生ずる(阻害性又は刺激性の)生物学的機能であって、天然又は天然発生PROが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生PROが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
1つ又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab’)2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した1本の重鎖と1本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの3つのCDRが相互作用してVH−VLに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、6つのCDRが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分)でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2に分類される。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH−VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP404,097;WO93/11161;及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
「特異的に結合する」抗体、又は特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ特異的な抗体とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(PROポリペプチド又はその抗体など)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
ここで開示されたポリペプチドの「有効量」、或いはそのアゴニスト又はアンタゴニストとは、特別に言及された目的を実行するために十分な量のことである。「有効量」とは、言及された目的に関連して、経験的及び常套的方法によって決定することができる。
A.全長PROポリペプチド
本発明は、本出願でPROポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のPROポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるPRO番号が与えられるが、UNQ番号は全ての与えられたDNA及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のPROの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「PRO/番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のcDNAクローンがATCCに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したPROポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
ここに記載した全長天然配列PROポリペプチドに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PROポリペプチドDNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
PRO断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによるPRO断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5’及び3’プライマーで用いられる。好ましくは、PROポリペプチド断片は、ここに開示した天然PROポリペプチドと少なくとも1つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表6に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表6に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発[Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)]、制限的選択突然変異誘発[Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたDNAに実施してPRO変異体DNAを作成することもできる。
PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の1つの型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROポリペプチドの選択された側鎖又はN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-PRO抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3’-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
本発明の範囲内に含まれるPROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列PROに見られる1又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び/又は天然配列PROに存在しない1又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
PROポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
本発明のPROの共有結合的修飾の他の型は、PROポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のPROポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPROポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
以下の説明は、主として、PRO核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPROを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROを調製することができると考えられる。例えば、PRO配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照]。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスター シティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PROの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長PROを生産してもよい。
PROをコードするDNAは、PROmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得ることができる。従って、ヒトPRODNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。またPRO-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(PROに対する抗体又は少なくとも約20−80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のPROポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はPCR法を使用するものである[Sambrookら,上掲;Dieffenbachら, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbankら,の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての(アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの)配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されていないmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookら,に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。
宿主細胞を、ここに記載したPRO生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
PROポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、1つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、1つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の1つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
発現及びクローニングベクターは、通常、PRO-コード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Changら, Nature, 275:615 (1978); Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]を含む。細菌系で使用するプロモータもまたPROポリペプチドをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
より高等の真核生物による所望のPROポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PROコード化配列の5’又は3’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5’位に位置している。
組換え脊椎動物細胞培養でのPROポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979);EP117,060;及びEP117,058に記載されている。
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA-RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRO DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
PROポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PROポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
PROポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPROポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methodes in Enzymology, 182(1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROの性質に依存する。
PROをコードする核酸配列(又はそれらの補体)は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及びDNAの生成において種々の用途を有している。また、PRO核酸も、ここに記載される組換え技術によるPROポリペプチドの調製に有用である。
PRO核酸の他の有用な断片は、標的PRO mRNA(センス)又はPRO DNA(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、PRO DNAのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14から30ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするcDNA配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び van der Krolら,(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(L-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
アンチセンスRNA又はDNA分子は一般に少なくとも約5塩基長、約10塩基長、約15塩基長、約20塩基長、約25塩基長、約30塩基長、約35塩基長、約40塩基長、約45塩基長、約50塩基長、約55塩基長、約60塩基長、約65塩基長、約70塩基長、約75塩基長、約80塩基長、約85塩基長、約90塩基長、約95塩基長、約100塩基長、あるいはそれ以上である。
また、プローブは、PCR技術に用いて、密接に関連したPROコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、PROをコードするヌクレオチド配列は、そのPROをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
ここに記載したPROポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要である。本発明の各PRO核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のPROポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のPROポリペプチドは、好ましくは同じ型の正常組織に比較して疾患性組織において、一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。PRO核酸分子には、PCR、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
PROポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でPROポリペプチドの持続放出が望まれる場合、PROポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(rhGH)、インターフェロン-(rhIFN-)、インターロイキン-2、及びMN rgp120で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p.439-462; WO97/03692,WO96/40072,WO96/07399;及び米国特許第5,564,010号。
本発明は、PROポリペプチドに類似する(アゴニスト)又はPROポリペプチドの効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるPROポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPROポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識PROポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとPROポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってPROポリペプチドの作用を競合的に阻害するPROポリペプチドの変異形態であってもよい。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びPCT公報、番号WO97/33551(1997年9月18日公開)を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの1つ又は複数の任意のものにより及び/又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
また、ここで開示されている分子の診断的及び治療的利用は、下記に開示及び記載のポジティブ機能アッセイヒットに基づいている。
本発明は、さらに抗-PRO抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
抗-PRO抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するのであればアジュバントを、1つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
あるいは、抗-PRO抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
本発明の抗-PRO抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合においては、結合特異性の一方はPROに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく[Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)]。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
WO96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの1つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
大腸菌からFab’フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab’)2分子の製造を記述している。各Fab’フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトT細胞及びErbB2レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO91/00360;WO92/200373;EP03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されたものが含まれる。
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を有する可能性がある。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolffら, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
また、本発明は、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reが含まれる。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985);Hwangら, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
ここで同定されるPROポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
PROポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えDNA技術によって生成できる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に1つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸及びγ-エチル-L-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(D)-3-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S−S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
本発明の抗-PRO抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-PRO抗体は、PROの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature 144:945 (1962);Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974);Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981);及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
Swiss-Prot公的データベースからの約950の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ECD)配列(必要ならな、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデータベースの検索に使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えば、Dayhoff、GenBank)及び独自に開発したデータベース(例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、ECDタンパク質配列のEST配列の6フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Blastスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington,Seattle,WA)で集団化してコンセンサスDNA配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスDNA配列を、しばしば(全てではない)BLAST又はBLAST-2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego,CAなどの市販試薬を用いる標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を有するオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断してゲル電気泳動で適切なサイズに分類し、そして適合するクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmesら, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)の唯一のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
1.オリゴdTプライムcDNAライブラリの調製
Invitrogen, San Diego, CAの試薬及びプロトコールを用いて、対象とするヒト組織からmRNAを単離した(Fast Track 2)。このRNAを、Life Technologies, Gaithersburg, MD(Super Script Plasmid system)の試薬及びプロトコールを利用するベクターpRK5DでのオリゴdTプライム化cDNAライブラリの生成に用いた。この方法においては、二本鎖cDNAを1000bpを越えるサイズに分類し、SalI/NotIリンカー化cDNAをXhoI/NotI切断化ベクターへクローニングした。pRK5Dは、XhiI/NotIcDNAクローニング部位の前に位置するSfiI制限酵素部位が後に続くsp6転写開始部位を有するクローニングベクターである。
一次cDNAクローンの5’末端を好ましく表現するために、二次cDNAライブラリを作成した。Sp6RNAを(上記の)一次ライブラリから生成し、このRNAを、Life Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを利用するベクターpSST-AMY.0でのランダムプライム化cDNAライブラリの生成に用いた。この方法においては、二本鎖cDNAを500−1000bpへサイズ分類し、平滑末端でNotIアダプターに結合させ、SfiI部位で切断し、そしてSfiI/NotI切断化ベクターへクローニングした。pSST-AMY.0は、cDNAクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、並びにアルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区が後に続くマウスアミラーゼ配列(分泌シグナルを持たない成熟配列)をクローニング部位の後に有するクローニングベクターである。従って、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターへクローニングされたcDNAは、適切に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導く。
上記のパラグラフ2に記載したライブラリのDNAを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントDH10B細菌(Life Technoligies、20ml)を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、SOC培地(Life Technologies、1ml)を添加し、この混合物を37℃で30分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む20標準150mmLBプレートに蒔き、16時間インキュベートした(37℃)。ポジティブコロニーをプレートからこすり取り、この細菌ペレットから標準的な方法、例えばCsCl-勾配を用いてDNAを単離した。次に、、以下の酵母プロトコールを精製DNAへ適用した。
酵母方法は3つの範疇に分けられる:(1)酵母のプラスミド/cDNA結合ベクターでの形質転換;(2)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離;及び(3)酵母コロニーからの直接的な挿入物のPCR増幅、並びに配列決定及びさらなる分析のためのDNAの精製。
形質転換は、Gietzら, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)によって概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からYEPD複合培地ブロス(100ml)に播種し、30℃で終夜成長させた。YEPDブロスは、Kaiserら, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載のように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なYEPDブロス(500ml)中におよそ2x106細胞/ml(約OD600=0.1)に希釈し、1x107細胞/ml(約OD600=0.4−0.5)まで再成長させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞(100μl)を新鮮な変性一本鎖サケ精子DNA(Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD)及び形質転換DNA(1μg vol.<10μl)と混合することにより開始した。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%PEG/TE(600μl,40%のポリエチレングリコール-4000, 10mMのトリス−HCl,1mMのEDTA,100mMのLiOOCCH3,pH7.5)を添加した。この混合物を緩く撹拌し、30℃で撹拌しながら30分間インキュベートした。次いで細胞に42℃で15分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5−10秒間遠心分離し、デカントし、そしてTE(500μl,10mMのトリス−HCl,1mMのEDTA,pH7.5)への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をTE(1ml)中に希釈し、一定分量(200μl)を150mm成長プレート(VWR)に予め調製した選択培地に広げた。
用いた選択培地は、Kaiserら, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(SCD-Ura)であった。形質転換体を30℃で2−3日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地に赤色デンプンを包含することによって実施した。Bielyら, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料(反応性 Red-120, Sigma)に結合させた。結合したデンプンをSCD-Ura寒天プレートへ最終濃度0.15%(w/v)で組み入れ、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝化した(最終濃度50−100mM)。
十分に単離されていて同定可能な単一コロニーを得るために、ポジティブコロニーを拾い、これを新鮮な選択培地(150mmプレート)に画線した。アミラーゼ分泌についてポジティブであり、十分に単離されたコロニーの検出は、緩衝化SCD-Ura寒天への赤色デンプンの直接組み入れによっておこなった。コロニーのデンプンを分解することでポジティブコロニーの周囲に直接目視できる明瞭なハローを形成する能力によって、ポジティブコロニーを決定した。
ポジティブコロニーが単離された場合には、その一部を楊枝でひろい、96ウェルプレートで無菌水(30μl)によって希釈した。この時点では、ポジティブコロニーを凍結して次の分析のために保存するか、或いは即座に増幅するかのいずれかである。細胞の一定分量 (5μl)を、0.5μlのKlentaq(Clontech, Palo Alto, CA); 4.0μlの10mMdNTP(Perkin Elmer-Cetus);2.5μlのKentaqバッファー(Clontech);0.25μlの正方向オリゴ1;0.25μlの逆方向オリゴ2;12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量でのPCR反応のテンプレートとして使用した。
正方向オリゴヌクレオチド1の配列は:
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'
(配列番号:553)
逆方向オリゴヌクレオチド2の配列は:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT -3'
(配列番号:554)
であった。
次いで、PCRは以下の通り実施した:
a. 変性 92℃、 5分間
b.次の3サイクル 変性 92℃、30秒間
アニール 59℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
c.次の3サイクル 変性 92℃、30秒間
アニール 57℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
d.次の25サイクル 変性 92℃、30秒間
アニール 55℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
e. 保持 4℃
PCRに続いて、反応の一定分量(5μl)を、上記のSambrook等に記載されているように1%アガロースゲル中でトリス−ホウ酸塩−EDTA(TBE)緩衝系を用いたアガロースゲル電気泳動によって検討した。400bpより大きな単一で強いPCR産物を生じるクローンを、96 Qiaquick PCR 清浄化カラム(Quagen Inc., Chatsworth, CA)での精製の後にDNA配列によってさらに分析した。
ジェネンテク,インク(サウス サンフランシスコ,カリフォルニア)が独自に開発した配列発見アルゴリズムを、公的(例えば、GenBank)及び/又は個人の(LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc.,Palo Alto, CA)データベースから集団化及び組み立てられたEST断片だけでなくESTsへ適用することで、種々のポリペプチド-コード化核酸配列を同定した。このシグナル配列アルゴリズムは、検討中の配列又は配列断片の5’末端にある第1、あるいは第2のメチオニンコドン(ATG)を取り囲むDNAヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第1のATGに続くヌクレオチドには、停止コドンを持たない少なくとも35の明白なアミノ酸がコードされていなければならない。第1のATGが必須のアミノ酸を有する場合、第2のものは検討しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。EST配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ATGコドンを取り囲むDNA及び対応するアミノ酸配列に、分泌シグナルに関連することが知られている7つのセンサー(評価パラメータ)の一組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムを利用することで、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。
上記の実施例1から3に記載されている技術を用いて、ここに開示されているように、多くの全長cDNAクローンがPROポリペプチドをコードしているものと同定された。そして、これらのcDNAは、下記の表7示してあるように、ブダペスト条約の条項に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア 20110−2209米国(ATCC)へ寄託した。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
以下の方法は、PROをコードする核酸配列のハイブリダイゼーションプローブとしての利用を示している。
ここに開示されている全長又は成熟PROをコード化配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの同種DNA(PROの天然発生変異体をコードするもの等)のスクリーニングのためのプローブとして用いられ得る。
ハイブリダイゼーション及びいずれかのライブラリDNAを含むフィルターの洗浄を、次の高緊縮性条件下において実施する。放射標識PRO誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションを、50%ホルムアミド、5xSSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中において42℃で20時間実施する。フィルターの洗浄は、0.1xSSC及び0.1%SDS水溶液中において42℃で実施する。
次いで、全長天然配列をコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAは、この分野で知られている標準的技術を用いて同定することができる。
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるPROの非グリコシル化型の調製を例証する。
DNA配列コード化は選択されたPCRプライマーを利用して最初に増幅される。このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来;Bolivarら, Gene, 2:95 (1997)を参照のこと)がある。ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、PCR増幅配列をベクターにライゲーションする。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリHisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリHisリーダー、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PROコード領域、ラムダ転写集結因子及びargU遺伝子をコードする配列を含む。
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたLBブロスのような液体培地で一晩かけて成長させることができる。この一晩の培養を、次により大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。そして、細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したPROタンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
ここで開示された多くのPROポリペプチドは、上記の方法によって成功裏に発現した。
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のPROの調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP307,247参照)を用いた。場合によっては、PRO DNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上記のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてPRODNAを挿入させる。得られたベクターは、pRK5-PROと呼ばれる。
他の実施態様では、PROをCHO細胞で発現させることができる。pRK5-PROは、CaPO4又はDEAE−デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(のみ)又は35S-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。PROポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたPROを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
またPROは、一過性発現法によりCHO及び/又はCOS細胞で、他の安定な発現方法によりCHO細胞で発現させてもよい。
CHO細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列(例えば、細胞外ドメイン)がIgG1のヒンジ、CH2及びCH2ドメインを含む定常領域配列に融合したIgG作成物(イムノアドヘシン)、又はポリ-Hisタグ形態として発現された。
所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)(Boehringer Mannheim)約1千万のCHO細胞に導入する。細胞は、上記のLucas等に記載されているように成長させた。約3x10−7細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
イムノアドヘシン(Fc含有)作成物を、以下通りに条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー,pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)へポンプ注入した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸,pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μLの1Mトリスバッファー,pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルとエドマン(Edman)分解によるN−末端アミノ酸配列決定により評価した。
ここに開示したPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
以下の方法は、酵母菌中でのPROの組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。PROをコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPROの細胞内発現を指示する。分泌のために、PROをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然PROシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)PROの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
続いて組換えPROは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。PROを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示したPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるPROの組換え発現を記載する。
PROコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。pVL1393(Navagen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、PRO又はPROコード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、5’及び3’領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4−5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PROの精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示したPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
この実施例は、PROに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製PRO、PROを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えPROを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1−100マイクログラムで注入したPRO免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, ハミルトン, モンタナ)に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗PRO抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
ハイブリドーマ細胞は、PROに対する反応性についてのELISAでスクリーニングされる。PROに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗PROモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
天然又は組換えPROポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-PROポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-PROポリペプチドは、対象とするPROポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗PROポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインA(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインAでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr-活性化セファロース(商品名)(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
可溶化PROポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはPROポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。次いで、カラムは、抗体/PROポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約2−3といった低pH、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、PROポリペプチドが回収される。
本発明は、PROポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングとって特に有用である。そのような試験に用いられるPROポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの1つの方法では、PROポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、PROポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるPROポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、PROポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をPROポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とPROポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)PROポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、PROポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なPROポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がPROポリペプチドに結合する又はPROポリペプチド/細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
また、本発明は、PROポリペプチドに結合可能な中和抗体がPROポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、PROポリペプチドで、1つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド(例えば、PROポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、PROポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでPROポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991))。
本発明によって、X線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のPROポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したPROポリペプチドアミノ酸配列の知識は、X線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
このアッセイは、本発明のあるPROポリペプチドが、ヒト血液におけるTNF−αの放出を刺激することを示している。このアッセイでポジティブ(陽性)と検定されたPROポリペプチドは、他の事例を含めて、TNF-αの放出を刺激が所望されている研究目的、及びTNF-αの放出の増加が有益である症状の治療上の処置にとって有用である。特に、50mM Hepesバッファー(pH7.2)で補充した200μlのヒト血液を、96ウェルテストプレートのウェルへ等分して配する。次いで、各ウェルへは、50mM Hepesバッファーに含まれる試験PROポリペプチド(種々の濃度)又は50mM Hepesバッファーのみ(ネガティブ(負)のコントロール)のいずれかを300μl添加し、このプレートを37℃で6時間インキュベートした。次に、試料を遠心分離し、各ウェルから50μlの血漿を収集し、ELISAアッセイによってTNF-αの存在を試験した。アッセイでのポジティブ(陽性)とは、ネガティブ(負)のコントロール試料と比較して、PROポリペプチド処理試料中により多量のTNF-αがあることである。
以下のPROポリペプチドが、このアッセイにおいてポジティブ(陽性)であった:PRO195、PRO202、PRO215、PRO221、PRO217、PRO222、PRO198、PRO245、PRO172、PRO265、PRO266、PRO344、PRO337、PRO322、PRO1286、PRO1279、PRO1338及びPRO1343。
このアッセイは、PROポリペプチドが骨格筋のグルコース又はFFA取り込に影響を及ぼす能力を示すかどうかを決定するために設計されている。このアッセイにおいてポジティブと評価されたPROポリペプチドは、例えば糖尿病或いは高又は低インシュリン血症を含む骨格筋によるグルコース取り込みの刺激又は阻害である疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
96ウェルフォーマットにおいて、アッセイされるPROポリペプチドは初期ラット分化型骨格筋へ加えられ、そして一晩インキュベートされる。ついで、PROポリペプチド及び+/−インシュリンを含む新鮮な培地がウェルに加えられる。その後、試料培地は、骨格筋によるグルコース又はFFA取り込みを測定するために監視される。イシュリンは、骨格筋によるグルコース又はFFA取り込みを刺激し、PROポリペプチドを含まないインシュリンを含む培地を、ポジティブの基準コントロール及びスコーリング制限として使用する。試験されるPROポリペプチドがグルコース又はFFA取り込みを刺激或いは阻害した場合、インシュリンのコントロールより1.5倍より高い又は0.5倍より低いと、結果はポジティブと記録される。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び/又はFAAの取り込みの刺激剤又は阻害剤としてポジティブであった:PRO182、PRO336、PRO198、PRO172及びPRO719。
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが軟骨細胞の再分化を誘導する働きをし、それ故に例えばスポーツ障害や関節炎のような様々な骨及び/又は軟骨の障害の治療に役立つことが期待されていることを示す。このアッセイは次のように実施される。ブタの軟骨細胞を、4−6月齢の雌ブタの中手指節関節の関節軟骨を一晩コラゲナーゼ消化することによって単離する。次いで、この単離された細胞を、10%FBS及び4μg/mlゲンタマイシンを含むヘムF-12へ25,000細胞/cm2で播種する。この培地を3日ごとに交換し、次いで細胞を血清を含まない100μlの同培地の96ウェルに5,000細胞/ウェルで播種し、そして100μl試験PROポリペプチド、5nMのスタウロスポリン(ポジティブコントロール)又は培地のみ(ネガティブコントロール)を加えて最終的な総量が200μl/ウェルとなるようにする。37℃での5日間のインキュベーションの後、各々のウェルの写真を撮り、軟骨細胞の分化状態を判定するする。軟骨細胞の再分化がネガティブコントロールよりもポジティブのコントロールに類似していると判定された場合には、このアッセイにおけるポジティブの結果が生じたものとする。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブと検定された:PRO182、PRO366、PRO198及びPRO1868。
このアッセイは、培養において、本発明のPROポリペプチドが軟骨細胞の増殖を阻害する能力を示すか否かを測定するために設計されている。このアッセイにおいてポジティブと試験されたポリペプチドは、例えばスポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び/又は軟骨組織疾患の治療上の処置に対して有用であると期待されうる。
ブタ軟骨細胞を、4−6ヶ月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨から、一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離する。そして、この単離した細胞を、25,000細胞/cm2の割合で、10%FBS及び4μg/mlゲンタマイシンを含むハムF−12へ播種する。培地を3日ごとに交換し、25,000細胞/cm2となるように細胞を5日ごとに再播種する。12日目に、この細胞を血清を含まない100μlの同じ培地の96ウェルプレートへ5,000細胞/ウェルで播種し、無血清培地(ネガティブコントロール)、スタウロスポリン(最終濃度5nM;ポジティブのコントロール)又は試験PROポリペプチドのいずれかを添加して最終容量が200μl/ウェルとなるようにする。37℃で5日間の後、20μlのアラマーブルー(Alamar blue)を各ウェルへ添加し、プレートをさらに3時間に渡って37℃でインキュベートする。そして、各ウェルの蛍光を測定する(Ex:530nm;Em:590nm)。バックグラウンドを得るために、200μlの無血清培地を含むプレートの蛍光を測定する。このアッセイでのポジティブの結果は、PROポリペプチド処理試料の蛍光が、ネガティブコントロールのそれよりもポジティブのコントロールのそれに類似する場合に得られる。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO202、PRO224、PRO172及びPRO1312。
このアッセイは、PROポリペプチドが脂肪細胞によるグルコース又はFFA取りみに影響を及ぼす能力を示すかどうかを確定するために設計されている。このアッセイでポジティブと評価されたPROポリペプチドは、例えば肥満、糖尿病或いは高又は低インシュリン血症を含む、脂肪細胞によるグルコース取り込みの刺激又は阻害いずれかが有益である疾患の治療にとって有用であると期待される。
96ウェルフォーマットで、アッセイされるPROポリペプチドを初期ラット脂肪細胞へ加え、そして一晩インキュベートした。グリセロール、グルコース及びFFA取り込みのアッセイのための試料を、4及び16時間目に採取する。16時間のイキュベーション後、イシュリンを培地へ加え、4時間のインキュベートをおこなう。この時、試料が採取されて、グリセロール、グルコース及びFAAの取り込みを測定する。ポジティブの基準コントロールとしては、PROポリペプチドが無くインシュリンを含む培地を使用する。試験されるPROポリペプチドがグルコース又はFFA取り込みを刺激又は阻害し、インシュリンのコントロールより1.5倍より高い又は0.5倍より低いと、結果はポジティブであると記録される。
以下のPROポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び/又はFAAの取り込みへ作用するとしてポジティブと評価された:PRO202、PRO211、PRO344及びPRO1338。
このアッセイは、周皮細胞における遺伝子発現を活性化するPROポリペプチドを同定するために設定されている。このようなポリペプチドは、成長因子として及び/又は遺伝子発現が所望されるか有益である症状にとって有用であると期待される。1週間に渡って、ウシ周皮細胞を成長培地の60mm培養皿に配した。1日目に、種々のPROポリペプチドを希釈(1%)し、周皮細胞と1,4,24時間のタイムポイントでインキュベートした。この細胞を収集し、そして指示書に従ってTRI-試薬を用いてRNAを単離した。次いで、分光光度計を利用して260/280 ODを読みとることによって、このRNAを定量化した。遺伝子発現の分析は、Perkin Elmer試薬及び特別に設計されたウシプローブ及びプライマーを用いてTaqMan反応によっておこなった。次の遺伝子の発現を分析した:GAPDH、ベータ-インテグリン、結合組織成長因子(CTGF)、ICAM-1、単球走化性タンパク質1(MCP-1)、オステオポンチン、トランスフォーミング成長因子-ベータ(TGF-ベータ)、TGF-ベータレセプター、メタロプロテイナーゼ(TIMP)の組織インヒビター、組織因子(TF)、VEGF-α、トロンボスポンジン、VEGF-β、アンジオポエチン-2及びコラゲナーゼ。次いで、複製物を平均化し、SDを測定した。そして、遺伝子発現レベルをGAPDHへ標準化した。次に、これらを、未処理コントロールと比較した場合に、ウシ周皮細胞において遺伝子発現を顕著に誘導しないタンパク質(PIN32)によって得られた発現レベルに対して標準化した。PIN32コントロールより2倍又はより高い遺伝子発現レベルを示す任意のPROポリペプチドを、ポジティブヒットとした。
この試験では、次のPROポリペプチドがポジティブだと評価した:PRO366。
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが周皮細胞の増殖を活性化するように作用し、それ故に、特定の種類の周皮細胞に関連する腫瘍の診断用マーカーとして有用であるばかりでなく、周皮細胞に関連する腫瘍の治療上の処置に有用であると期待されるアンタゴニストを誘発することにも有用であることを示す。また、このようなPROポリペプチドは、成長因子として及び/又は細胞増殖が所望されるか有益である症状にとって有用であると期待される。周皮細胞増殖の活性化は血管新生の誘導にも関連しており、よって周皮細胞増殖を誘導することができるPROポリペプチドは、例えば創傷治癒のような場合を含む誘導された血管新生が有益である症状の治療にとって有用であると期待できる。特に1日目には、周皮細胞をVEC Technologiesから得て、5mlの培地以外のすべてをフラスコから取り出した。2日目には、周皮細胞をトリプシン処理し、洗浄し、スピンにかけて96ウェルプレートに蒔いた。7日目には、培地を取り除き、周皮細胞を100μlの特定のPROポリペプチド又はコントロール処理(ポジティブコントロール=DEM+5%+/−PDGF@500ng/μl;ネガティブコントロール=PIN32、周皮細胞に対して顕著な作用を有しないものと確かめられたポリペプチド)のいずれかによって処理した。次いで、C-fos及びGAPDH遺伝子発現レベルを測定し、複製を平均化してSD/CVを確定した。c-fos値をGAPDHに対して標準化し、この結果をPIN32に対する倍数増加で表した。ネガティブコントロールと比較して、少なくとも2倍又はより高い反応を示した任意のものを、このアッセイではポジティブであるとした。
このアッセイでは、次のPROポリペプチドがポジティブだと評価した:PRO366。
軟骨組織からのプロテオグリカンの放出を刺激する種々のPROポリペプチドの能力を以下のようにして試験した。
4-6月齢のブタの手指節関節を無菌で切除し、関節軟骨を下の骨を注意深く避けたフリーハンドスライスによって取り除いた。軟骨を細かく切り刻み、0.1%BSA及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを添加した無血清(SF)培地(DME/F12 1:1)中、95%空気、5%CO2雰囲気においてバルクで24時間培養した。3回洗浄した後、約100mgの関節軟骨をミクロニクス(micronics)管に分け、上記SF培地中でさらに24時間インキュベートした。次いで、PROポリペプチドの1%を、単独あるいは公知の軟骨組織からのプロテオグリカン放出刺激剤であるインターロイキン-1αの18ng/mlとともに添加した。次いで上清を回収し、1,9-ジメチル-メチレンブルー(DMB)比色アッセイ(FarndaleおよびButtle, Biochem. Biophys. Acta 883: 173-177 (1985))を用いてプロテオグリカンの量を検定した。このアッセイにおけるポジティブな結果は、試験ポリペプチドには、例えば、運動に関連する関節の問題、関節軟骨障害、変形性関節症又は慢性関節リウマチの治療においての利用が見出されることを示している。
上記のアッセイによって種々のPROポリペプチドを試験したとき、ポリペプチドは、根本的におよびインターロイキン-1αでの刺激後および処理後24および72時間に軟骨組織からのプロテオグリカン放出を刺激する顕著な能力を示し、これによって、これらPROポリペプチドは軟骨組織からのプロテオグリカンの放出刺激に有用であるをこと示している。従って、PROポリペプチドは運動に関連する関節の問題、関節軟骨障害、変形性関節症又は慢性関節リウマチの治療において有用である。このアッセイにおいて、ポジティブだと評価されたポリペプチドはPRO216である。
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが聴覚毛細胞前駆体である内耳支持細胞の有糸分裂促進剤として作用し、よって哺乳動物における聴覚毛細胞の再生誘発と軟調の治療に利用できることを示す。アッセイは次のように実施する。ラットUEC−4小嚢上皮細胞を33℃、200μlの血清添加培地で密度3000細胞/ウェルで96ウェルプレートに等分する。細胞を一晩培養し、ついで37℃で無血清培地に移す。ついで様々な希釈率のPROポリペプチド(又はコントロールには不含有)が培地に加えられ、ついで細胞を24時間に渡ってインキュベートする。24時間のインキュベーションの後、3H−チミジン(1μCi/ウェル)を加えられ、次いでさらに24時間培養する。次に組み込まれなかった放射能標識を取り除くために培地を洗浄し、細胞を取り出し、1ウェルあたりのCpmを決定する。コントロール培地と比較しPROポリペプチドで処置した培地において少なくとも30%又はそれ以上のCpmであった場合には、アッセイにおいてポジティブと判断する。
このアッセイでは、次のポリペプチドがポジティブであると評価された:PRO172。
この実施例は、本発明の所定のペプチドが、刺激されたT-リンパ球の増殖の刺激剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫応答の増強が有益な場合、治療的に有用である。治療剤は、本発明のポリペプチドのアンタゴニストの形をとり、例えば、ポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体である。このアッセイの基本的プロトコールは、Current Protocols in Immunology, unit3.12;J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版に記載されている。
さらに具体的には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(PBMC)を個々の哺乳類、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する)。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びDMSO中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5%CO2)で一晩解凍し、ついで洗浄し、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸塩)で3x106細胞/mlに再懸濁する。刺激物PBMCは、細胞を照射する(約300ラド)ことによって調製される。
このアッセイは混合物:
100:1の1%又は0.1%に希釈された試験試料、
50:1の照射を受けた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーPBMC細胞、
を三重ウェルに蒔くことによって調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地或いは100マイクロタイターのCD4-IgGをコントロールとして使用する。ついで、ウェルを37℃、5%CO2で4日間インキュベートする。5日目には、各ウェルへトリチウム化チミジン(1.0 mC/ウェル;Amersham)を適用する。6時間後に細胞を3回洗浄し、次いで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、PBMCをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンパライトM(Lympholyte M)(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりPMBCを単離し、2000rpmで20分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1x107細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、このアッセイは上記のように行われる。
コントロールに対する増加がポジティブであると考えられ、好ましくは180%以上又は180%と同等の増加が好ましい。しかしながら、コントロールより大きい全ての値は、試験用タンパク質に関して刺激効果を示す。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO344。
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが周皮細胞におけるc-fosの発現を誘発するように作用し、よって特定の種類の周皮細胞結合腫瘍の診断用マーカーとして有用であるばかりでなく、周皮細胞結合腫瘍の治療上の処置に有用であると予期されるアンタゴニストを生じせしめることを示す。また、周皮細胞でのc-fosの誘導は血管新生そのものの誘導を示し、そしてc-fosの発現を誘導することができるPROポリペプチドは、例えば創傷治癒及びそれに同じような、誘導された血管新生が有益である症状の治療に有用である。特に1日目に、周皮細胞をVEC Technologiesから得て、5mlの培地以外をフラスコから取り出した。2日目に周皮細胞をトリプシン処理し、洗浄し、スピンにかけ、次いで96ウェルプレートに蒔いた。7日目に培地を取り出し、周皮細胞を100μlのPROポリペプチドテスト用試料及びコントロール(ポジティブコントロール=DME+5%血清+/−500ng/mlのPDGF;ネガティブコントロール=プロテイン32)で処理した。複製を平均化し、SD/CVを確定した。蛍光ルミネセンス単位(RLU)照度計リーディングバース頻度により示されたプロテイン32値を越える倍数増加(バッファーコントロール)をヒストグラム上にプロットし、上記のプロテイン32値を2倍は、アッセイについてポジティブであると考えられる。ASYマトリックス:成長培地=低グルコースDMEM=20%FBS+1Xペンストレップ(pen strep)+1Xフンギゾン(fungizone)。アッセイ用培地=低グルコースDMEM+5%FBS。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった:PRO301、PRO619、PRO1066及びPRO1265。
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが末梢血単核細胞(PBMC)からのサイトカインの放出を誘発することができる否かを確定するために設計されている。PBMCからのサイトカインの放出を誘発することのできるPROポリペプチドは、サイトカイン放出の増加によって益を得る症状の治療にとって有用である。具体的には、1x106細胞/mlの末梢血単核細胞(PBMC)を、3日間に渡って1%のPROポリペプチドで完全RPMI培地によって培養する。次いで、その上清を収集し、ヒトIgGで処理されたコントロールとの比較によるELISAによって、種々のサイトカインの増加濃度について試験する。このアッセイにおけるポジティブとは、ヒトIgG処理試料と比較して、PROポリペプチド処理試料中でのサイトカイン濃度の10倍又はより大きな増加である。
このアッセイにおいては、次のポリペプチドがポジティブであると評価された:PRO526及びPRO1343。
このアッセイは、A-ペプチドの因子VIIAへの結合を阻害し、それによって血液強固カスケードに作用することすることができるPROポリペプチドを同定するために設計されている。このアッセイでポジティブと評価されるPROポリペプチドは、例えば、発作、心臓発作及び種々の凝固疾患を含む、血液凝固カスケードの改変が有益であろう症状の治療のために有用であると期待される。また、これらのPROポリペプチドは、これら症状の治療のためにも有用であるアゴニスト及びアンタゴニストの同定のために有用である。
具体的には、384ウェルプレートを可溶性因子VIIAでコートし、4℃で一晩に渡ってインキュベーションする。次いで、このウェルデカントし、0.5%BSAを添加して1時間に渡ってブロックする。次に、ウェルを洗浄し、各ウェルへ20μlのビオチン化A-ペプチドを加え、それに種々の濃度のPROポリペプチド(試験)か何も加えない(ネガティブコントロール)。次いで、このプレートを室温で1時間に渡ってインキュベーションする。ウェルを再び洗浄し、そして各ウェルへ40μlのストレプトアビジン-ユーロピウムを添加する。次いで、このプレートを室温で30分に渡ってインキュベーションして洗浄する。次いで、各ウェルへ40μlの蛍光増進溶液を添加してプレートを室温で5分間インキュベーションし、次いでユーロピウム遅延蛍光設定の下で、各ウェルをWallac Vivtor readerで読みとる。そして、アッセイにおけるポジティブが30%又はそれ以上のパーセント阻害として、A-ペプチドの因子VLLAへの結合のパーセント阻害を測定する(ネガティブコントロールと比較し)。
このアッセイでは、次のPROポリペプチドがポジティブであると評価された:PRO182。
このアッセイは、脂肪細胞のインシュリン誘発分化を阻害することが可能であるPROポリペプチドを同定するために設計されている。このアッセイでポジティブと評価されたPROポリペプチドは、肥満、糖尿病などに関連する症状の治療のために有用であると期待される。
具体的には、3T3-L1細胞を、6x104細胞/ウェルで96ウェルプレートへ播種し、7日間に渡って集密化するまで生育させた。7日目には、1μg/mlインシュリン、0.25x10−6M デキサメタゾン及び0.5mM IBMXの存在下で、種々の濃度のPROポリペプチド(或いはネガテティブコントロールとして加えない)によって細胞を処理する。次いで、この試料を2日間に渡って、7%CO2中において37℃でインキュベートする。このインキュベーションの後、吸引によって培地を取り除き、細胞をPBSで洗浄し、PROポリペプチド(或いはネガティブコントロールとして加えず)及び1μg/mlインシュリンへ再曝露する。5日後には、細胞を溶菌し、細胞溶解物をシグマのトリグリセリド[INT]キット(Sigma procedure#336)でアッセイする。このアッセイにおけるポジティブとは、ネガティブコントロールと比較して、PROポリペプチド処理試料において20%より高い脂肪細胞分化の阻害である。
このアッセイでは、次のPROポリペプチドがポジティブであると評価された:PRO185及びPRO198。
このアッセイは、HUVEC細胞の増殖を刺激することができるPROポリペプチドを同定するために設計されている。このアッセイにおいてポジティブと評価されるPROポリペプチドは、例えば創傷治癒のようなものを含む、血管新生が有益である症状の治療ための血管新生を誘発することにとって有用であると期待される。これらPROポリペプチドのアンタゴニストは、例えば腫瘍のような症状の治療のための血管新生の阻害において有用であると期待される。
具体的には、COSTAR(登録商標)フラットボトムブラックプレートをフィブロネクチンで20分間に渡って処理し、次いでPBSで二回洗浄する。そして、HUVEC細胞を、適切な成長培地の2000細胞/ウェルにプレートする。次いで、このプレートを一晩に渡ってインキュベートし、そしてPROポリペプチド(1%最終濃度)、無添加(ネゲティブコントロール)又はIL1β(3.3ng/ml最終濃度;ポジティブコントロール)を添加する。このアッセイにおけるポジティブとは、ポジティブコントロールと比較して、蛍光の2倍又はそれ以上の増加である。
このアッセイにおいて、次のPROポリペプチドがポジティブであると評価された:PRO222。
このアッセイは、本発明のPROペプチドが、培地で軟骨細胞の増殖及び/又は再分化を誘導する能力を示すか否かを確定するために設計されている。このアッセイにおいてポジティブと評価されるPROポリペプチドは、例えばスポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び/又は軟骨組織疾患の治療に有用であると期待される。ブタ軟骨細胞を、4−6ヶ月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨の一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離する。そして、この単離された細胞を、10%FBS及び4μg/mlゲンタマイシンを含むハムF-12へ25,000細胞/cm2の割合で播種する。培地を3日ごとに交換する。12日目には、細胞を血清を含まない100μlの同じ培地へ5,000細胞/ウェルで96ウェルプレートへ播種し、100μlの無血清培地(ネガティブコントロール)、スタウロスポリン(最終濃度が5nM;ポジティブコントロール)又は試験PROポリペプチドのいずれかを添加して最終容量を200μl/ウェルとする。37℃での5日間の後、100μg/ml Hoechst 33342及び50μg/ml 5-CFDAを含む22μlの培地を各ウェルへ添加し、さらに10分間に渡って37℃でインキュベートする。各ウェルの緑色蛍光を写真に取り、形態計測分析によって軟骨細胞の分化段階を計算する。>50%のPROポリペプチドで処理した細胞が分化している場合には(ネガティブコントロールによって得られたバックグラウンドと比較して)、このアッセイでポジティブな結果が得られていることになる。
このアッセイにおいて、次のPROポリペプチドがポジティブであると評価された:PRO301。
幾千もの遺伝子配列を殆ど場合において含む核酸マイクロアレイは、組織の正常な対応物と比較して、疾患組織において差次的に発現している遺伝子を同定するために有用である。核酸マイクロアッセイを用いると、試験及びコントロール組織試料からの試験及びコントロールmRNA試料が逆転写され、cDNAプローブを生成するために標識される。次いで、このcDNAプローブは、固体支持体上に固定化さた多くの核酸とハイブリダイズされる。このアレイは、アレイの各メンバーの配列と位置がわかるように構成されている。例えば、ある疾患段階で発現することが知られている遺伝子から選ばれたものを固体支持体上に整列してもよい。標識プローブとある特定のアレイのメンバーとのハイブリダイゼーションは、プローブが誘導された試料がその遺伝子を発現していることを示す。試験(疾患組織)からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロール(正常組織)試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルより大きい場合は、疾患組織において過剰発現している遺伝子又は複数遺伝子が同定される。この結果の意味は、疾患組織で過剰発現しているタンパク質は、疾患症状の存在のための診断的マーカーとしてだけではなく、疾患症状の治療のための治療上の標的としても有用であるということである。
核酸のハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ技術の方法論は、当業者には良く知られている。本実施例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ、スライドのための核酸の特別な調製、並びにハイブリダイゼーションの条件は、2000年3月31日に出願された米国仮出願一連番号 60/193,767にすべて詳述されており、ここにおいて文献として取り入れられている。
本実験では、ここに記載のPROポリペプチドコード化核酸配列から誘導された核酸プローブをマイクロアレイの作製に用い、上記に列挙した腫瘍組織のRNAをさらにハイブリダイゼーションに用いた。標準化比:実験比に基づく値は、「カットオフ」と命名された。このカットオフを上回る値のみを重要であると判定した。下記の表8は、これらの実験の結果を示しており、本発明の種々のPROポリペプチドが非癌牲ヒト組織コントロールと比べて種々のヒト腫瘍組織において著しく過剰発現していることを示している。上記にて記載のように、これらのデーターは、本発明のPROポリペプチドが一つ以上の癌牲腫瘍の存在を示す診断マーカーとしてだけではなく、これら腫瘍の治療のための治療上の標的としての機能も果たすことを示している。
本アッセイでは、レセプター/リガンド相互作用を同定する目的で、潜在的なレセプター又はリガンド分子の一団と結合する能力に関して、種々のPROポリペプチドを試験した。既知のレセプターに対するリガンド、既知のリガンドに対するレセプター、或いは新規のレセプター/リガンド対の同定は、例えばレセプター又はリガンドを発現することが知られている細胞へ生物活性分子(リガンド又はレセプター)を標的化すること、組成物がリガンド又はレセプターを発現すると思われる細胞を含んでなるであろう場合に、リガンド又はレセプターを含むと思われる組成物中からリガンド又はレセプターの存在を検出するためにリガンド又はレセプターを試薬として利用すること、レセプター又はリガンドを発現或いはそれらへ応答することが知られている細胞の成長、又はその他の生物学的又は免疫活性を調節すること、細胞の免疫応答、或いはレセプター又はリガンドを発現する細胞に対する免疫応答を調節すること、レセプター又はリガンドを発現している細胞の成長又は生物学的又は免疫活性を調節するレセプター又はリガンドに対する アゴニスト、アンタゴニスト及び/又は抗体の調製を可能にすること、並びに当業者にとって容易に明らかである種々の他の徴候を含む種々の徴候に対して有用である。
これらのアッセイを利用して、以下のレセプター/リガンド相互作用が同定されている:
(1)PRO1801はPRO1114及びPRO4978と結合。
(2)PRO100はPRO1114と結合。
Claims (71)
- Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:4)、Fig6(配列番号:6)、Fig8(配列番号:8)、Fig10(配列番号:10)、Fig12(配列番号:12)、Fig14(配列番号:14)、Fig16(配列番号:16)、Fig18(配列番号:18)、Fig20(配列番号:20)、Fig22(配列番号:22)、Fig24(配列番号:24)、Fig26(配列番号:26)、Fig28(配列番号:28)、Fig30(配列番号:30)、Fig32(配列番号:32)、Fig34(配列番号:34)、Fig36(配列番号:36)、Fig38(配列番号:38)、Fig40(配列番号:40)、Fig42(配列番号:42)、Fig44(配列番号:44)、Fig46(配列番号46)、Fig48(配列番号:48)、Fig50(配列番号:50)、Fig52(配列番号:52)、Fig54(配列番号:54)、Fig56(配列番号:56)、Fig58(配列番号:58)、Fig60(配列番号:60)、Fig62(配列番号:62)、Fig64(配列番号:64)、Fig66(配列番号:66)、Fig68(配列番号:68)、Fig72(配列番号:72)、Fig74(配列番号:74)、Fig76(配列番号:76)、Fig78(配列番号:78)、Fig80(配列番号:80)、Fig82(配列番号:82)、Fig84(配列番号:84)、Fig86(配列番号:86)、Fig88(配列番号:88)、Fig90(配列番号:90)、Fig92(配列番号:92)、Fig94(配列番号:94)、Fig96(配列番号:96)、Fig98(配列番号:98)、Fig100(配列番号:100)、Fig102(配列番号:102)、Fig104(配列番号:104)、Fig106(配列番号:106)、Fig108(配列番号:108)、Fig110(配列番号:110)、Fig112(配列番号:112)、Fig114(配列番号:114)、Fig116(配列番号:116)、Fig118(配列番号:118)、Fig120(配列番号:120)、Fig122(配列番号:122)、Fig124(配列番号:124)、Fig126(配列番号:126)、Fig128(配列番号:128)、Fig130(配列番号:130)、Fig132(配列番号:132)、Fig134(配列番号:134)、Fig136(配列番号:136)、Fig138(配列番号:138)、Fig140(配列番号:140)、Fig142(配列番号:142)、Fig144(配列番号:144)、Fig146(配列番号:146)、Fig148(配列番号:148)、Fig150(配列番号:150)、Fig152(配列番号:152)、Fig154(配列番号:154)、Fig156(配列番号:156)、Fig158(配列番号:158)、Fig160(配列番号:160)、Fig162(配列番号:162)、Fig164(配列番号:164)、Fig166(配列番号:166)、Fig168(配列番号:168)、Fig170(配列番号:170)、Fig172(配列番号:172)、Fig174(配列番号:174)、Fig176(配列番号:176)、Fig178(配列番号:178)、Fig180(配列番号:180)、Fig182(配列番号:182)、Fig184(配列番号:184)、Fig186(配列番号:186)、Fig188(配列番号:188)、Fig190(配列番号:190)、Fig192(配列番号:192)、Fig194(配列番号:194)、Fig196(配列番号:196)、Fig198(配列番号:198)、Fig200(配列番号:200)、Fig202(配列番号:202)、Fig204(配列番号:204)、Fig206(配列番号:206)、Fig208(配列番号:208)、Fig210(配列番号:210)、Fig212(配列番号:212)、Fig214(配列番号:214)、Fig216(配列番号:216)、Fig218(配列番号:218)、Fig220(配列番号:220)、Fig222(配列番号:222)、Fig224(配列番号:224)、Fig226(配列番号:226)、Fig228(配列番号:228)、Fig230(配列番号:230)、Fig232(配列番号:232)、Fig234(配列番号:234)、Fig236(配列番号:236)、Fig238(配列番号:238)、Fig240(配列番号:240)、Fig242(配列番号:242)、Fig244(配列番号:244)、Fig246(配列番号:246)、Fig248(配列番号:248)、Fig250(配列番号:250)、Fig252(配列番号:252)、Fig254(配列番号:254)、Fig256(配列番号:256)、Fig258(配列番号:258)、Fig260(配列番号:260)、Fig262(配列番号:262)、Fig264(配列番号:264)、Fig266(配列番号:266)、Fig268(配列番号:268)、Fig270(配列番号:270)、Fig272(配列番号:272)、Fig274(配列番号:274)、Fig276(配列番号:276)、Fig278(配列番号:278)、Fig280(配列番号:280)、Fig282(配列番号:282)、Fig284(配列番号:284)、Fig286(配列番号:286)、Fig288(配列番号:288)、Fig290(配列番号:290)、Fig292(配列番号:292)、Fig294(配列番号:294)、Fig296(配列番号:296)、Fig298(配列番号:298)、Fig300(配列番号:300)、Fig302(配列番号:302)、Fig304(配列番号:304)、Fig306(配列番号:306)、Fig308(配列番号:308)、Fig310(配列番号:310)、Fig312(配列番号:312)、Fig314(配列番号:314)、Fig316(配列番号:316)、Fig318(配列番号:318)、Fig320(配列番号:320)、Fig322(配列番号:322)、Fig324(配列番号:324)、Fig326(配列番号:326)、Fig328(配列番号:328)、Fig330(配列番号:330)、Fig332(配列番号:332)、Fig334(配列番号:334)、Fig336(配列番号:336)、Fig338(配列番号:338)、Fig340(配列番号:340)、Fig342(配列番号:342)、Fig344(配列番号:344)、Fig346(配列番号:346)、Fig348(配列番号:348)、Fig350(配列番号:350)、Fig352(配列番号:352)、Fig354(配列番号:354)、Fig356(配列番号:356)、Fig358(配列番号:358)、Fig360(配列番号:360)、Fig362(配列番号:362)、Fig364(配列番号:364)、Fig366(配列番号:366)、Fig368(配列番号:368)、Fig370(配列番号:370)、Fig372(配列番号:372)、Fig374(配列番号:374)、Fig376(配列番号:376)、Fig378(配列番号:378)、Fig380(配列番号:380)、Fig382(配列番号:382)、Fig384(配列番号:384)、Fig386(配列番号:386)、Fig388(配列番号:388)、Fig390(配列番号:390)、Fig392(配列番号:392)、Fig394(配列番号:394)、Fig396(配列番号:396)、Fig398(配列番号:398)、Fig400(配列番号:400)、Fig402(配列番号:402)、Fig404(配列番号:404)、Fig406(配列番号:406)、Fig408(配列番号:408)、Fig410(配列番号:410)、Fig412(配列番号:412)、Fig414(配列番号:414)、Fig416(配列番号:416)、Fig418(配列番号:418)、Fig420(配列番号:420)、Fig422(配列番号:422)、Fig424(配列番号:424)、Fig426(配列番号:426)、Fig428(配列番号:428)、Fig430(配列番号:430)、Fig432(配列番号:432)、Fig434(配列番号:434)、Fig436(配列番号:436)、Fig438(配列番号:438)、Fig440(配列番号:440)、Fig442(配列番号:442)、Fig444(配列番号:444)、Fig446(配列番号:446)、Fig448(配列番号:448)、Fig450(配列番号:450)、Fig452(配列番号:452)、Fig454(配列番号:454)、Fig456(配列番号:456)、Fig458(配列番号:458)、Fig460(配列番号:460)、Fig462(配列番号:462)、Fig464(配列番号:464)、Fig466(配列番号:466)、Fig468(配列番号:468)、Fig470(配列番号:470)、Fig472(配列番号:472)、Fig474(配列番号:474)、Fig476(配列番号:476)、Fig478(配列番号:478)、Fig480(配列番号:480)、Fig482(配列番号:482)、Fig484(配列番号:484)、Fig486(配列番号:486)、Fig488(配列番号:488)、Fig490(配列番号:490)、Fig492(配列番号:492)、Fig494(配列番号:494)、Fig496(配列番号:496)、Fig498(配列番号:498)、Fig500(配列番号:500)、Fig502(配列番号:502)、Fig504(配列番号:504)、Fig506(配列番号:506)、Fig508(配列番号:508)、Fig510(配列番号:510)、Fig512(配列番号:512)、Fig514(配列番号:514)、Fig516(配列番号:516)、Fig518(配列番号:518)、Fig520(配列番号:520)、Fig522(配列番号:522)、Fig524(配列番号:524)、Fig526(配列番号:526)、Fig528(配列番号:528)、Fig530(配列番号:530)、Fig532(配列番号:532)、Fig534(配列番号:534)、Fig536(配列番号:536)、Fig538(配列番号:538)、Fig540(配列番号:540)、Fig542(配列番号:542)、Fig544(配列番号:544)、Fig546(配列番号:546)、Fig548(配列番号:548)及びFig550(配列番号:550)に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- Fig1(配列番号:1)、Fig3(配列番号:3)、Fig5(配列番号:5)、Fig7(配列番号:7)、Fig9(配列番号:9)、Fig11(配列番号:11)、Fig13(配列番号:13)、Fig15(配列番号:15)、Fig17(配列番号:17)、Fig19(配列番号:19)、Fig21(配列番号:21)、Fig23(配列番号:23)、Fig25(配列番号:25)、Fig27(配列番号:27)、Fig29(配列番号:29)、Fig31(配列番号:31)、Fig33(配列番号:33)、Fig35(配列番号:35)、Fig37(配列番号:37)、Fig39(配列番号:39)、Fig41(配列番号:41)、Fig43(配列番号:43)、Fig45(配列番号:45)、Fig47(配列番号:47)、Fig49(配列番号:49)、Fig51(配列番号:51)、Fig53(配列番号:53)、Fig55(配列番号:55)、Fig57(配列番号:57)、Fig59(配列番号:59)、Fig61(配列番号:61)、Fig63(配列番号:63)、Fig65(配列番号:65)、Fig67(配列番号:67)、Fig71(配列番号:71)、Fig73(配列番号:73)、Fig75(配列番号:75)、Fig77(配列番号:77)、Fig79(配列番号:79)、Fig81(配列番号:81)、Fig83(配列番号:83)、Fig85(配列番号:85)、Fig87(配列番号:87)、Fig89(配列番号:89)、Fig91(配列番号:91)、Fig93(配列番号:93)、Fig95(配列番号:95)、Fig97(配列番号:97)、Fig99(配列番号:99)、Fig101(配列番号:101)、Fig103(配列番号:103)、Fig105(配列番号:105)、Fig107(配列番号:107)、Fig109(配列番号:109)、Fig111(配列番号:111)、Fig113(配列番号:113)、Fig115(配列番号:115)、Fig117(配列番号:117)、Fig119(配列番号:119)、Fig121(配列番号:121)、Fig123(配列番号:123)、Fig125(配列番号:125)、Fig127(配列番号:127)、Fig129(配列番号:129)、Fig131(配列番号:131)、Fig133(配列番号:133)、Fig135(配列番号:135)、Fig137(配列番号:137)、Fig139(配列番号:139)、Fig141(配列番号:141)、Fig143(配列番号:143)、Fig145(配列番号:145)、Fig147(配列番号:147)、Fig149(配列番号:149)、Fig151(配列番号:151)、Fig153(配列番号:153)、Fig155(配列番号:155)、Fig157(配列番号:157)、Fig159(配列番号:159)、Fig161(配列番号:161)、Fig163(配列番号:163)、Fig165(配列番号:165)、Fig167(配列番号:167)、Fig169(配列番号:169)、Fig171(配列番号:171)、Fig173(配列番号:173)、Fig175(配列番号:175)、Fig177(配列番号:177)、Fig179(配列番号:179)、Fig181(配列番号:181)、Fig183(配列番号:183)、Fig185(配列番号:185)、Fig187(配列番号:187)、Fig189(配列番号:189)、Fig191(配列番号:191)、Fig193(配列番号:193)、Fig195(配列番号:195)、Fig197(配列番号:197)、Fig199(配列番号:199)、Fig201(配列番号:201)、Fig203(配列番号:203)、Fig205(配列番号:205)、Fig207(配列番号:207)、Fig209(配列番号:209)、Fig211(配列番号:211)、Fig213(配列番号:213)、Fig215(配列番号:215)、Fig217(配列番号:217)、Fig219(配列番号:219)、Fig221(配列番号:221)、Fig223(配列番号:223)、Fig225(配列番号:225)、Fig227(配列番号:227)、Fig229(配列番号:229)、Fig231(配列番号:231)、Fig233(配列番号:233)、Fig235(配列番号:235)、Fig237(配列番号:237)、Fig239(配列番号:239)、Fig241(配列番号:241)、Fig243(配列番号:243)、Fig245(配列番号:245)、Fig247(配列番号:247)、Fig249(配列番号:249)、Fig251(配列番号:251)、Fig253(配列番号:253)、Fig255(配列番号:255)、Fig257(配列番号:257)、Fig259(配列番号:259)、Fig261(配列番号:261)、Fig263(配列番号:263)、Fig265(配列番号:265)、Fig267(配列番号:267)、Fig269(配列番号:269)、Fig271(配列番号:271)、Fig273(配列番号:273)、Fig275(配列番号:275)、Fig277(配列番号:277)、Fig279(配列番号:279)、Fig281(配列番号:281)、Fig283(配列番号:283)、Fig285(配列番号:285)、Fig287(配列番号:287)、Fig289(配列番号:289)、Fig291(配列番号:291)、Fig293(配列番号:293)、Fig295(配列番号:295)、Fig297(配列番号:297)、Fig299(配列番号:299)、Fig301(配列番号:301)、Fig303(配列番号:303)、Fig305(配列番号:305)、Fig307(配列番号:307)、Fig309(配列番号:309)、Fig311(配列番号:311)、Fig313(配列番号:313)、Fig315(配列番号:315)、Fig317(配列番号:317)、Fig319(配列番号:319)、Fig321(配列番号:321)、Fig323(配列番号:323)、Fig325(配列番号:325)、Fig327(配列番号:327)、Fig329(配列番号:329)、Fig331(配列番号:331)、Fig333(配列番号:333)、Fig335(配列番号:335)、Fig337(配列番号:337)、Fig339(配列番号:339)、Fig341(配列番号:341)、Fig343(配列番号:343)、Fig345(配列番号:345)、Fig347(配列番号:347)、Fig349(配列番号:349)、Fig351(配列番号:351)、Fig353(配列番号:353)、Fig355(配列番号:355)、Fig357(配列番号:357)、Fig359(配列番号:359)、Fig361(配列番号:361)、Fig363(配列番号:363)、Fig365(配列番号:365)、Fig367(配列番号:367)、Fig369(配列番号:369)、Fig371(配列番号:371)、Fig373(配列番号:373)、Fig375(配列番号:375)、Fig377(配列番号:377)、Fig379(配列番号:379)、Fig381(配列番号:381)、Fig383(配列番号:383)、Fig385(配列番号:385)、Fig387(配列番号:387)、Fig389(配列番号:389)、Fig391(配列番号:391)、Fig393(配列番号:393)、Fig395(配列番号:395)、Fig397(配列番号:397)、Fig399(配列番号:399)、Fig401(配列番号:401)、Fig403(配列番号:403)、Fig405(配列番号:405)、Fig407(配列番号:407)、Fig409(配列番号:409)、Fig411(配列番号:411)、Fig413(配列番号:413)、Fig415(配列番号:415)、Fig417(配列番号:417)、Fig419(配列番号:419)、Fig421(配列番号:421)、Fig423(配列番号:423)、Fig425(配列番号:425)、Fig427(配列番号:427)、Fig429(配列番号:429)、Fig431(配列番号:431)、Fig433(配列番号:433)、Fig435(配列番号:435)、Fig437(配列番号:437)、Fig439(配列番号:439)、Fig441(配列番号:441)、Fig443(配列番号:443)、Fig445(配列番号:445)、Fig447(配列番号:447)、Fig449(配列番号:449)、Fig451(配列番号:451)、Fig453(配列番号:453)、Fig455(配列番号:455)、Fig457(配列番号:457)、Fig459(配列番号:459)、Fig461(配列番号:461)、Fig463(配列番号:463)、Fig465(配列番号:465)、Fig467(配列番号:467)、Fig469(配列番号:469)、Fig471(配列番号:471)、Fig473(配列番号:473)、Fig475(配列番号:475)、Fig477(配列番号:477)、Fig479(配列番号:479)、Fig481(配列番号:481)、Fig483(配列番号:483)、Fig485(配列番号:485)、Fig487(配列番号:487)、Fig489(配列番号:489)、Fig491(配列番号:491)、Fig493(配列番号:493)、Fig495(配列番号:495)、Fig497(配列番号:497)、Fig499(配列番号:499)、Fig501(配列番号:501)、Fig503(配列番号:503)、Fig505(配列番号:505)、Fig507(配列番号:507)、Fig509(配列番号:509)、Fig511(配列番号:511)、Fig513(配列番号:513)、Fig515(配列番号:515)、Fig517(配列番号:517)、Fig519(配列番号:519)、Fig521(配列番号:521)、Fig523(配列番号:523)、Fig525(配列番号:525)、Fig527(配列番号:527)、Fig529(配列番号:529)、Fig531(配列番号:531)、Fig533(配列番号:533)、Fig535(配列番号:535)、Fig537(配列番号:537)、Fig539(配列番号:539)、Fig541(配列番号:541)、Fig543(配列番号:543)、Fig545(配列番号:545)、Fig547(配列番号:547)及びFig549(配列番号:549)に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- Fig1(配列番号:1)、Fig3(配列番号:3)、Fig5(配列番号:5)、Fig7(配列番号:7)、Fig9(配列番号:9)、Fig11(配列番号:11)、Fig13(配列番号:13)、Fig15(配列番号:15)、Fig17(配列番号:17)、Fig19(配列番号:19)、Fig21(配列番号:21)、Fig23(配列番号:23)、Fig25(配列番号:25)、Fig27(配列番号:27)、Fig29(配列番号:29)、Fig31(配列番号:31)、Fig33(配列番号:33)、Fig35(配列番号:35)、Fig37(配列番号:37)、Fig39(配列番号:39)、Fig41(配列番号:41)、Fig43(配列番号:43)、Fig45(配列番号:45)、Fig47(配列番号:47)、Fig49(配列番号:49)、Fig51(配列番号:51)、Fig53(配列番号:53)、Fig55(配列番号:55)、Fig57(配列番号:57)、Fig59(配列番号:59)、Fig61(配列番号:61)、Fig63(配列番号:63)、Fig65(配列番号:65)、Fig67(配列番号:67)、Fig71(配列番号:71)、Fig73(配列番号:73)、Fig75(配列番号:75)、Fig77(配列番号:77)、Fig79(配列番号:79)、Fig81(配列番号:81)、Fig83(配列番号:83)、Fig85(配列番号:85)、Fig87(配列番号:87)、Fig89(配列番号:89)、Fig91(配列番号:91)、Fig93(配列番号:93)、Fig95(配列番号:95)、Fig97(配列番号:97)、Fig99(配列番号:99)、Fig101(配列番号:101)、Fig103(配列番号:103)、Fig105(配列番号:105)、Fig107(配列番号:107)、Fig109(配列番号:109)、Fig111(配列番号:111)、Fig113(配列番号:113)、Fig115(配列番号:115)、Fig117(配列番号:117)、Fig119(配列番号:119)、Fig121(配列番号:121)、Fig123(配列番号:123)、Fig125(配列番号:125)、Fig127(配列番号:127)、Fig129(配列番号:129)、Fig131(配列番号:131)、Fig133(配列番号:133)、Fig135(配列番号:135)、Fig137(配列番号:137)、Fig139(配列番号:139)、Fig141(配列番号:141)、Fig143(配列番号:143)、Fig145(配列番号:145)、Fig147(配列番号:147)、Fig149(配列番号:149)、Fig151(配列番号:151)、Fig153(配列番号:153)、Fig155(配列番号:155)、Fig157(配列番号:157)、Fig159(配列番号:159)、Fig161(配列番号:161)、Fig163(配列番号:163)、Fig165(配列番号:165)、Fig167(配列番号:167)、Fig169(配列番号:169)、Fig171(配列番号:171)、Fig173(配列番号:173)、Fig175(配列番号:175)、Fig177(配列番号:177)、Fig179(配列番号:179)、Fig181(配列番号:181)、Fig183(配列番号:183)、Fig185(配列番号:185)、Fig187(配列番号:187)、Fig189(配列番号:189)、Fig191(配列番号:191)、Fig193(配列番号:193)、Fig195(配列番号:195)、Fig197(配列番号:197)、Fig199(配列番号:199)、Fig201(配列番号:201)、Fig203(配列番号:203)、Fig205(配列番号:205)、Fig207(配列番号:207)、Fig209(配列番号:209)、Fig211(配列番号:211)、Fig213(配列番号:213)、Fig215(配列番号:215)、Fig217(配列番号:217)、Fig219(配列番号:219)、Fig221(配列番号:221)、Fig223(配列番号:223)、Fig225(配列番号:225)、Fig227(配列番号:227)、Fig229(配列番号:229)、Fig231(配列番号:231)、Fig233(配列番号:233)、Fig235(配列番号:235)、Fig237(配列番号:237)、Fig239(配列番号:239)、Fig241(配列番号:241)、Fig243(配列番号:243)、Fig245(配列番号:245)、Fig247(配列番号:247)、Fig249(配列番号:249)、Fig251(配列番号:251)、Fig253(配列番号:253)、Fig255(配列番号:255)、Fig257(配列番号:257)、Fig259(配列番号:259)、Fig261(配列番号:261)、Fig263(配列番号:263)、Fig265(配列番号:265)、Fig267(配列番号:267)、Fig269(配列番号:269)、Fig271(配列番号:271)、Fig273(配列番号:273)、Fig275(配列番号:275)、Fig277(配列番号:277)、Fig279(配列番号:279)、Fig281(配列番号:281)、Fig283(配列番号:283)、Fig285(配列番号:285)、Fig287(配列番号:287)、Fig289(配列番号:289)、Fig291(配列番号:291)、Fig293(配列番号:293)、Fig295(配列番号:295)、Fig297(配列番号:297)、Fig299(配列番号:299)、Fig301(配列番号:301)、Fig303(配列番号:303)、Fig305(配列番号:305)、Fig307(配列番号:307)、Fig309(配列番号:309)、Fig311(配列番号:311)、Fig313(配列番号:313)、Fig315(配列番号:315)、Fig317(配列番号:317)、Fig319(配列番号:319)、Fig321(配列番号:321)、Fig323(配列番号:323)、Fig325(配列番号:325)、Fig327(配列番号:327)、Fig329(配列番号:329)、Fig331(配列番号:331)、Fig333(配列番号:333)、Fig335(配列番号:335)、Fig337(配列番号:337)、Fig339(配列番号:339)、Fig341(配列番号:341)、Fig343(配列番号:343)、Fig345(配列番号:345)、Fig347(配列番号:347)、Fig349(配列番号:349)、Fig351(配列番号:351)、Fig353(配列番号:353)、Fig355(配列番号:355)、Fig357(配列番号:357)、Fig359(配列番号:359)、Fig361(配列番号:361)、Fig363(配列番号:363)、Fig365(配列番号:365)、Fig367(配列番号:367)、Fig369(配列番号:369)、Fig371(配列番号:371)、Fig373(配列番号:373)、Fig375(配列番号:375)、Fig377(配列番号:377)、Fig379(配列番号:379)、Fig381(配列番号:381)、Fig383(配列番号:383)、Fig385(配列番号:385)、Fig387(配列番号:387)、Fig389(配列番号:389)、Fig391(配列番号:391)、Fig393(配列番号:393)、Fig395(配列番号:395)、Fig397(配列番号:397)、Fig399(配列番号:399)、Fig401(配列番号:401)、Fig403(配列番号:403)、Fig405(配列番号:405)、Fig407(配列番号:407)、Fig409(配列番号:409)、Fig411(配列番号:411)、Fig413(配列番号:413)、Fig415(配列番号:415)、Fig417(配列番号:417)、Fig419(配列番号:419)、Fig421(配列番号:421)、Fig423(配列番号:423)、Fig425(配列番号:425)、Fig427(配列番号:427)、Fig429(配列番号:429)、Fig431(配列番号:431)、Fig433(配列番号:433)、Fig435(配列番号:435)、Fig437(配列番号:437)、Fig439(配列番号:439)、Fig441(配列番号:441)、Fig443(配列番号:443)、Fig445(配列番号:445)、Fig447(配列番号:447)、Fig449(配列番号:449)、Fig451(配列番号:451)、Fig453(配列番号:453)、Fig455(配列番号:455)、Fig457(配列番号:457)、Fig459(配列番号:459)、Fig461(配列番号:461)、Fig463(配列番号:463)、Fig465(配列番号:465)、Fig467(配列番号:467)、Fig469(配列番号:469)、Fig471(配列番号:471)、Fig473(配列番号:473)、Fig475(配列番号:475)、Fig477(配列番号:477)、Fig479(配列番号:479)、Fig481(配列番号:481)、Fig483(配列番号:483)、Fig485(配列番号:485)、Fig487(配列番号:487)、Fig489(配列番号:489)、Fig491(配列番号:491)、Fig493(配列番号:493)、Fig495(配列番号:495)、Fig497(配列番号:497)、Fig499(配列番号:499)、Fig501(配列番号:501)、Fig503(配列番号:503)、Fig505(配列番号:505)、Fig507(配列番号:507)、Fig509(配列番号:509)、Fig511(配列番号:511)、Fig513(配列番号:513)、Fig515(配列番号:515)、Fig517(配列番号:517)、Fig519(配列番号:519)、Fig521(配列番号:521)、Fig523(配列番号:523)、Fig525(配列番号:525)、Fig527(配列番号:527)、Fig529(配列番号:529)、Fig531(配列番号:531)、Fig533(配列番号:533)、Fig535(配列番号:535)、Fig537(配列番号:537)、Fig539(配列番号:539)、Fig541(配列番号:541)、Fig543(配列番号:543)、Fig545(配列番号:545)、Fig547(配列番号:547)及びFig549(配列番号:549)に示すヌクレオチド配列の全長コード化配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- 表7に示す任意のATCC登録番号で寄託したDNAの全長コード化配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- 請求項1に記載の核酸を含んでなるベクター。
- ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列と作用可能に結合した請求項5に記載のベクター。
- 請求項5に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- 前記細胞がCHO細胞である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が大腸菌である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が酵母細胞である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 請求項7に記載の宿主細胞をPROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物から前記PROポリペプチドを回収することを含んでなるPROポリペプチドの製造方法。
- Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:4)、Fig6(配列番号:6)、Fig8(配列番号:8)、Fig10(配列番号:10)、Fig12(配列番号:12)、Fig14(配列番号:14)、Fig16(配列番号:16)、Fig18(配列番号:18)、Fig20(配列番号:20)、Fig22(配列番号:22)、Fig24(配列番号:24)、Fig26(配列番号:26)、Fig28(配列番号:28)、Fig30(配列番号:30)、Fig32(配列番号:32)、Fig34(配列番号:34)、Fig36(配列番号:36)、Fig38(配列番号:38)、Fig40(配列番号:40)、Fig42(配列番号:42)、Fig44(配列番号:44)、Fig46(配列番号46)、Fig48(配列番号:48)、Fig50(配列番号:50)、Fig52(配列番号:52)、Fig54(配列番号:54)、Fig56(配列番号:56)、Fig58(配列番号:58)、Fig60(配列番号:60)、Fig62(配列番号:62)、Fig64(配列番号:64)、Fig66(配列番号:66)、Fig68(配列番号:68)、Fig72(配列番号:72)、Fig74(配列番号:74)、Fig76(配列番号:76)、Fig78(配列番号:78)、Fig80(配列番号:80)、Fig82(配列番号:82)、Fig84(配列番号:84)、Fig86(配列番号:86)、Fig88(配列番号:88)、Fig90(配列番号:90)、Fig92(配列番号:92)、Fig94(配列番号:94)、Fig96(配列番号:96)、Fig98(配列番号:98)、Fig100(配列番号:100)、Fig102(配列番号:102)、Fig104(配列番号:104)、Fig106(配列番号:106)、Fig108(配列番号:108)、Fig110(配列番号:110)、Fig112(配列番号:112)、Fig114(配列番号:114)、Fig116(配列番号:116)、Fig118(配列番号:118)、Fig120(配列番号:120)、Fig122(配列番号:122)、Fig124(配列番号:124)、Fig126(配列番号:126)、Fig128(配列番号:128)、Fig130(配列番号:130)、Fig132(配列番号:132)、Fig134(配列番号:134)、Fig136(配列番号:136)、Fig138(配列番号:138)、Fig140(配列番号:140)、Fig142(配列番号:142)、Fig144(配列番号:144)、Fig146(配列番号:146)、Fig148(配列番号:148)、Fig150(配列番号:150)、Fig152(配列番号:152)、Fig154(配列番号:154)、Fig156(配列番号:156)、Fig158(配列番号:158)、Fig160(配列番号:160)、Fig162(配列番号:162)、Fig164(配列番号:164)、Fig166(配列番号:166)、Fig168(配列番号:168)、Fig170(配列番号:170)、Fig172(配列番号:172)、Fig174(配列番号:174)、Fig176(配列番号:176)、Fig178(配列番号:178)、Fig180(配列番号:180)、Fig182(配列番号:182)、Fig184(配列番号:184)、Fig186(配列番号:186)、Fig188(配列番号:188)、Fig190(配列番号:190)、Fig192(配列番号:192)、Fig194(配列番号:194)、Fig196(配列番号:196)、Fig198(配列番号:198)、Fig200(配列番号:200)、Fig202(配列番号:202)、Fig204(配列番号:204)、Fig206(配列番号:206)、Fig208(配列番号:208)、Fig210(配列番号:210)、Fig212(配列番号:212)、Fig214(配列番号:214)、Fig216(配列番号:216)、Fig218(配列番号:218)、Fig220(配列番号:220)、Fig222(配列番号:222)、Fig224(配列番号:224)、Fig226(配列番号:226)、Fig228(配列番号:228)、Fig230(配列番号:230)、Fig232(配列番号:232)、Fig234(配列番号:234)、Fig236(配列番号:236)、Fig238(配列番号:238)、Fig240(配列番号:240)、Fig242(配列番号:242)、Fig244(配列番号:244)、Fig246(配列番号:246)、Fig248(配列番号:248)、Fig250(配列番号:250)、Fig252(配列番号:252)、Fig254(配列番号:254)、Fig256(配列番号:256)、Fig258(配列番号:258)、Fig260(配列番号:260)、Fig262(配列番号:262)、Fig264(配列番号:264)、Fig266(配列番号:266)、Fig268(配列番号:268)、Fig270(配列番号:270)、Fig272(配列番号:272)、Fig274(配列番号:274)、Fig276(配列番号:276)、Fig278(配列番号:278)、Fig280(配列番号:280)、Fig282(配列番号:282)、Fig284(配列番号:284)、Fig286(配列番号:286)、Fig288(配列番号:288)、Fig290(配列番号:290)、Fig292(配列番号:292)、Fig294(配列番号:294)、Fig296(配列番号:296)、Fig298(配列番号:298)、Fig300(配列番号:300)、Fig302(配列番号:302)、Fig304(配列番号:304)、Fig306(配列番号:306)、Fig308(配列番号:308)、Fig310(配列番号:310)、Fig312(配列番号:312)、Fig314(配列番号:314)、Fig316(配列番号:316)、Fig318(配列番号:318)、Fig320(配列番号:320)、Fig322(配列番号:322)、Fig324(配列番号:324)、Fig326(配列番号:326)、Fig328(配列番号:328)、Fig330(配列番号:330)、Fig332(配列番号:332)、Fig334(配列番号:334)、Fig336(配列番号:336)、Fig338(配列番号:338)、Fig340(配列番号:340)、Fig342(配列番号:342)、Fig344(配列番号:344)、Fig346(配列番号:346)、Fig348(配列番号:348)、Fig350(配列番号:350)、Fig352(配列番号:352)、Fig354(配列番号:354)、Fig356(配列番号:356)、Fig358(配列番号:358)、Fig360(配列番号:360)、Fig362(配列番号:362)、Fig364(配列番号:364)、Fig366(配列番号:366)、Fig368(配列番号:368)、Fig370(配列番号:370)、Fig372(配列番号:372)、Fig374(配列番号:374)、Fig376(配列番号:376)、Fig378(配列番号:378)、Fig380(配列番号:380)、Fig382(配列番号:382)、Fig384(配列番号:384)、Fig386(配列番号:386)、Fig388(配列番号:388)、Fig390(配列番号:390)、Fig392(配列番号:392)、Fig394(配列番号:394)、Fig396(配列番号:396)、Fig398(配列番号:398)、Fig400(配列番号:400)、Fig402(配列番号:402)、Fig404(配列番号:404)、Fig406(配列番号:406)、Fig408(配列番号:408)、Fig410(配列番号:410)、Fig412(配列番号:412)、Fig414(配列番号:414)、Fig416(配列番号:416)、Fig418(配列番号:418)、Fig420(配列番号:420)、Fig422(配列番号:422)、Fig424(配列番号:424)、Fig426(配列番号:426)、Fig428(配列番号:428)、Fig430(配列番号:430)、Fig432(配列番号:432)、Fig434(配列番号:434)、Fig436(配列番号:436)、Fig438(配列番号:438)、Fig440(配列番号:440)、Fig442(配列番号:442)、Fig444(配列番号:444)、Fig446(配列番号:446)、Fig448(配列番号:448)、Fig450(配列番号:450)、Fig452(配列番号:452)、Fig454(配列番号:454)、Fig456(配列番号:456)、Fig458(配列番号:458)、Fig460(配列番号:460)、Fig462(配列番号:462)、Fig464(配列番号:464)、Fig466(配列番号:466)、Fig468(配列番号:468)、Fig470(配列番号:470)、Fig472(配列番号:472)、Fig474(配列番号:474)、Fig476(配列番号:476)、Fig478(配列番号:478)、Fig480(配列番号:480)、Fig482(配列番号:482)、Fig484(配列番号:484)、Fig486(配列番号:486)、Fig488(配列番号:488)、Fig490(配列番号:490)、Fig492(配列番号:492)、Fig494(配列番号:494)、Fig496(配列番号:496)、Fig498(配列番号:498)、Fig500(配列番号:500)、Fig502(配列番号:502)、Fig504(配列番号:504)、Fig506(配列番号:506)、Fig508(配列番号:508)、Fig510(配列番号:510)、Fig512(配列番号:512)、Fig514(配列番号:514)、Fig516(配列番号:516)、Fig518(配列番号:518)、Fig520(配列番号:520)、Fig522(配列番号:522)、Fig524(配列番号:524)、Fig526(配列番号:526)、Fig528(配列番号:528)、Fig530(配列番号:530)、Fig532(配列番号:532)、Fig534(配列番号:534)、Fig536(配列番号:536)、Fig538(配列番号:538)、Fig540(配列番号:540)、Fig542(配列番号:542)、Fig544(配列番号:544)、Fig546(配列番号:546)、Fig548(配列番号:548)及びFig550(配列番号:550)に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
- 表7に示す任意のATCC登録番号で寄託したDNAの全長コード化配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
- 異種アミノ酸配列に融合した請求項12に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
- 前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である、請求項14に記載のキメラ分子。
- 前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのFc領域である、請求項14に記載のキメラ分子。
- 請求項12に記載のポリペプチドへ特異的に結合する抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は単鎖抗体である、請求項17に記載の抗体。
- (a)その結合するシグナルペプチドを欠くFig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:4)、Fig6(配列番号:6)、Fig8(配列番号:8)、Fig10(配列番号:10)、Fig12(配列番号:12)、Fig14(配列番号:14)、Fig16(配列番号:16)、Fig18(配列番号:18)、Fig20(配列番号:20)、Fig22(配列番号:22)、Fig24(配列番号:24)、Fig26(配列番号:26)、Fig28(配列番号:28)、Fig30(配列番号:30)、Fig32(配列番号:32)、Fig34(配列番号:34)、Fig36(配列番号:36)、Fig38(配列番号:38)、Fig40(配列番号:40)、Fig42(配列番号:42)、Fig44(配列番号:44)、Fig46(配列番号46)、Fig48(配列番号:48)、Fig50(配列番号:50)、Fig52(配列番号:52)、Fig54(配列番号:54)、Fig56(配列番号:56)、Fig58(配列番号:58)、Fig60(配列番号:60)、Fig62(配列番号:62)、Fig64(配列番号:64)、Fig66(配列番号:66)、Fig68(配列番号:68)、Fig72(配列番号:72)、Fig74(配列番号:74)、Fig76(配列番号:76)、Fig78(配列番号:78)、Fig80(配列番号:80)、Fig82(配列番号:82)、Fig84(配列番号:84)、Fig86(配列番号:86)、Fig88(配列番号:88)、Fig90(配列番号:90)、Fig92(配列番号:92)、Fig94(配列番号:94)、Fig96(配列番号:96)、Fig98(配列番号:98)、Fig100(配列番号:100)、Fig102(配列番号:102)、Fig104(配列番号:104)、Fig106(配列番号:106)、Fig108(配列番号:108)、Fig110(配列番号:110)、Fig112(配列番号:112)、Fig114(配列番号:114)、Fig116(配列番号:116)、Fig118(配列番号:118)、Fig120(配列番号:120)、Fig122(配列番号:122)、Fig124(配列番号:124)、Fig126(配列番号:126)、Fig128(配列番号:128)、Fig130(配列番号:130)、Fig132(配列番号:132)、Fig134(配列番号:134)、Fig136(配列番号:136)、Fig138(配列番号:138)、Fig140(配列番号:140)、Fig142(配列番号:142)、Fig144(配列番号:144)、Fig146(配列番号:146)、Fig148(配列番号:148)、Fig150(配列番号:150)、Fig152(配列番号:152)、Fig154(配列番号:154)、Fig156(配列番号:156)、Fig158(配列番号:158)、Fig160(配列番号:160)、Fig162(配列番号:162)、Fig164(配列番号:164)、Fig166(配列番号:166)、Fig168(配列番号:168)、Fig170(配列番号:170)、Fig172(配列番号:172)、Fig174(配列番号:174)、Fig176(配列番号:176)、Fig178(配列番号:178)、Fig180(配列番号:180)、Fig182(配列番号:182)、Fig184(配列番号:184)、Fig186(配列番号:186)、Fig188(配列番号:188)、Fig190(配列番号:190)、Fig192(配列番号:192)、Fig194(配列番号:194)、Fig196(配列番号:196)、Fig198(配列番号:198)、Fig200(配列番号:200)、Fig202(配列番号:202)、Fig204(配列番号:204)、Fig206(配列番号:206)、Fig208(配列番号:208)、Fig210(配列番号:210)、Fig212(配列番号:212)、Fig214(配列番号:214)、Fig216(配列番号:216)、Fig218(配列番号:218)、Fig220(配列番号:220)、Fig222(配列番号:222)、Fig224(配列番号:224)、Fig226(配列番号:226)、Fig228(配列番号:228)、Fig230(配列番号:230)、Fig232(配列番号:232)、Fig234(配列番号:234)、Fig236(配列番号:236)、Fig238(配列番号:238)、Fig240(配列番号:240)、Fig242(配列番号:242)、Fig244(配列番号:244)、Fig246(配列番号:246)、Fig248(配列番号:248)、Fig250(配列番号:250)、Fig252(配列番号:252)、Fig254(配列番号:254)、Fig256(配列番号:256)、Fig258(配列番号:258)、Fig260(配列番号:260)、Fig262(配列番号:262)、Fig264(配列番号:264)、Fig266(配列番号:266)、Fig268(配列番号:268)、Fig270(配列番号:270)、Fig272(配列番号:272)、Fig274(配列番号:274)、Fig276(配列番号:276)、Fig278(配列番号:278)、Fig280(配列番号:280)、Fig282(配列番号:282)、Fig284(配列番号:284)、Fig286(配列番号:286)、Fig288(配列番号:288)、Fig290(配列番号:290)、Fig292(配列番号:292)、Fig294(配列番号:294)、Fig296(配列番号:296)、Fig298(配列番号:298)、Fig300(配列番号:300)、Fig302(配列番号:302)、Fig304(配列番号:304)、Fig306(配列番号:306)、Fig308(配列番号:308)、Fig310(配列番号:310)、Fig312(配列番号:312)、Fig314(配列番号:314)、Fig316(配列番号:316)、Fig318(配列番号:318)、Fig320(配列番号:320)、Fig322(配列番号:322)、Fig324(配列番号:324)、Fig326(配列番号:326)、Fig328(配列番号:328)、Fig330(配列番号:330)、Fig332(配列番号:332)、Fig334(配列番号:334)、Fig336(配列番号:336)、Fig338(配列番号:338)、Fig340(配列番号:340)、Fig342(配列番号:342)、Fig344(配列番号:344)、Fig346(配列番号:346)、Fig348(配列番号:348)、Fig350(配列番号:350)、Fig352(配列番号:352)、Fig354(配列番号:354)、Fig356(配列番号:356)、Fig358(配列番号:358)、Fig360(配列番号:360)、Fig362(配列番号:362)、Fig364(配列番号:364)、Fig366(配列番号:366)、Fig368(配列番号:368)、Fig370(配列番号:370)、Fig372(配列番号:372)、Fig374(配列番号:374)、Fig376(配列番号:376)、Fig378(配列番号:378)、Fig380(配列番号:380)、Fig382(配列番号:382)、Fig384(配列番号:384)、Fig386(配列番号:386)、Fig388(配列番号:388)、Fig390(配列番号:390)、Fig392(配列番号:392)、Fig394(配列番号:394)、Fig396(配列番号:396)、Fig398(配列番号:398)、Fig400(配列番号:400)、Fig402(配列番号:402)、Fig404(配列番号:404)、Fig406(配列番号:406)、Fig408(配列番号:408)、Fig410(配列番号:410)、Fig412(配列番号:412)、Fig414(配列番号:414)、Fig416(配列番号:416)、Fig418(配列番号:418)、Fig420(配列番号:420)、Fig422(配列番号:422)、Fig424(配列番号:424)、Fig426(配列番号:426)、Fig428(配列番号:428)、Fig430(配列番号:430)、Fig432(配列番号:432)、Fig434(配列番号:434)、Fig436(配列番号:436)、Fig438(配列番号:438)、Fig440(配列番号:440)、Fig442(配列番号:442)、Fig444(配列番号:444)、Fig446(配列番号:446)、Fig448(配列番号:448)、Fig450(配列番号:450)、Fig452(配列番号:452)、Fig454(配列番号:454)、Fig456(配列番号:456)、Fig458(配列番号:458)、Fig460(配列番号:460)、Fig462(配列番号:462)、Fig464(配列番号:464)、Fig466(配列番号:466)、Fig468(配列番号:468)、Fig470(配列番号:470)、Fig472(配列番号:472)、Fig474(配列番号:474)、Fig476(配列番号:476)、Fig478(配列番号:478)、Fig480(配列番号:480)、Fig482(配列番号:482)、Fig484(配列番号:484)、Fig486(配列番号:486)、Fig488(配列番号:488)、Fig490(配列番号:490)、Fig492(配列番号:492)、Fig494(配列番号:494)、Fig496(配列番号:496)、Fig498(配列番号:498)、Fig500(配列番号:500)、Fig502(配列番号:502)、Fig504(配列番号:504)、Fig506(配列番号:506)、Fig508(配列番号:508)、Fig510(配列番号:510)、Fig512(配列番号:512)、Fig514(配列番号:514)、Fig516(配列番号:516)、Fig518(配列番号:518)、Fig520(配列番号:520)、Fig522(配列番号:522)、Fig524(配列番号:524)、Fig526(配列番号:526)、Fig528(配列番号:528)、Fig530(配列番号:530)、Fig532(配列番号:532)、Fig534(配列番号:534)、Fig536(配列番号:536)、Fig538(配列番号:538)、Fig540(配列番号:540)、Fig542(配列番号:542)、Fig544(配列番号:544)、Fig546(配列番号:546)、Fig548(配列番号:548)及びFig550(配列番号:550)に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(b)その結合するシグナルペプチドを有するFig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:4)、Fig6(配列番号:6)、Fig8(配列番号:8)、Fig10(配列番号:10)、Fig12(配列番号:12)、Fig14(配列番号:14)、Fig16(配列番号:16)、Fig18(配列番号:18)、Fig20(配列番号:20)、Fig22(配列番号:22)、Fig24(配列番号:24)、Fig26(配列番号:26)、Fig28(配列番号:28)、Fig30(配列番号:30)、Fig32(配列番号:32)、Fig34(配列番号:34)、Fig36(配列番号:36)、Fig38(配列番号:38)、Fig40(配列番号:40)、Fig42(配列番号:42)、Fig44(配列番号:44)、Fig46(配列番号46)、Fig48(配列番号:48)、Fig50(配列番号:50)、Fig52(配列番号:52)、Fig54(配列番号:54)、Fig56(配列番号:56)、Fig58(配列番号:58)、Fig60(配列番号:60)、Fig62(配列番号:62)、Fig64(配列番号:64)、Fig66(配列番号:66)、Fig68(配列番号:68)、Fig72(配列番号:72)、Fig74(配列番号:74)、Fig76(配列番号:76)、Fig78(配列番号:78)、Fig80(配列番号:80)、Fig82(配列番号:82)、Fig84(配列番号:84)、Fig86(配列番号:86)、Fig88(配列番号:88)、Fig90(配列番号:90)、Fig92(配列番号:92)、Fig94(配列番号:94)、Fig96(配列番号:96)、Fig98(配列番号:98)、Fig100(配列番号:100)、Fig102(配列番号:102)、Fig104(配列番号:104)、Fig106(配列番号:106)、Fig108(配列番号:108)、Fig110(配列番号:110)、Fig112(配列番号:112)、Fig114(配列番号:114)、Fig116(配列番号:116)、Fig118(配列番号:118)、Fig120(配列番号:120)、Fig122(配列番号:122)、Fig124(配列番号:124)、Fig126(配列番号:126)、Fig128(配列番号:128)、Fig130(配列番号:130)、Fig132(配列番号:132)、Fig134(配列番号:134)、Fig136(配列番号:136)、Fig138(配列番号:138)、Fig140(配列番号:140)、Fig142(配列番号:142)、Fig144(配列番号:144)、Fig146(配列番号:146)、Fig148(配列番号:148)、Fig150(配列番号:150)、Fig152(配列番号:152)、Fig154(配列番号:154)、Fig156(配列番号:156)、Fig158(配列番号:158)、Fig160(配列番号:160)、Fig162(配列番号:162)、Fig164(配列番号:164)、Fig166(配列番号:166)、Fig168(配列番号:168)、Fig170(配列番号:170)、Fig172(配列番号:172)、Fig174(配列番号:174)、Fig176(配列番号:176)、Fig178(配列番号:178)、Fig180(配列番号:180)、Fig182(配列番号:182)、Fig184(配列番号:184)、Fig186(配列番号:186)、Fig188(配列番号:188)、Fig190(配列番号:190)、Fig192(配列番号:192)、Fig194(配列番号:194)、Fig196(配列番号:196)、Fig198(配列番号:198)、Fig200(配列番号:200)、Fig202(配列番号:202)、Fig204(配列番号:204)、Fig206(配列番号:206)、Fig208(配列番号:208)、Fig210(配列番号:210)、Fig212(配列番号:212)、Fig214(配列番号:214)、Fig216(配列番号:216)、Fig218(配列番号:218)、Fig220(配列番号:220)、Fig222(配列番号:222)、Fig224(配列番号:224)、Fig226(配列番号:226)、Fig228(配列番号:228)、Fig230(配列番号:230)、Fig232(配列番号:232)、Fig234(配列番号:234)、Fig236(配列番号:236)、Fig238(配列番号:238)、Fig240(配列番号:240)、Fig242(配列番号:242)、Fig244(配列番号:244)、Fig246(配列番号:246)、Fig248(配列番号:248)、Fig250(配列番号:250)、Fig252(配列番号:252)、Fig254(配列番号:254)、Fig256(配列番号:256)、Fig258(配列番号:258)、Fig260(配列番号:260)、Fig262(配列番号:262)、Fig264(配列番号:264)、Fig266(配列番号:266)、Fig268(配列番号:268)、Fig270(配列番号:270)、Fig272(配列番号:272)、Fig274(配列番号:274)、Fig276(配列番号:276)、Fig278(配列番号:278)、Fig280(配列番号:280)、Fig282(配列番号:282)、Fig284(配列番号:284)、Fig286(配列番号:286)、Fig288(配列番号:288)、Fig290(配列番号:290)、Fig292(配列番号:292)、Fig294(配列番号:294)、Fig296(配列番号:296)、Fig298(配列番号:298)、Fig300(配列番号:300)、Fig302(配列番号:302)、Fig304(配列番号:304)、Fig306(配列番号:306)、Fig308(配列番号:308)、Fig310(配列番号:310)、Fig312(配列番号:312)、Fig314(配列番号:314)、Fig316(配列番号:316)、Fig318(配列番号:318)、Fig320(配列番号:320)、Fig322(配列番号:322)、Fig324(配列番号:324)、Fig326(配列番号:326)、Fig328(配列番号:328)、Fig330(配列番号:330)、Fig332(配列番号:332)、Fig334(配列番号:334)、Fig336(配列番号:336)、Fig338(配列番号:338)、Fig340(配列番号:340)、Fig342(配列番号:342)、Fig344(配列番号:344)、Fig346(配列番号:346)、Fig348(配列番号:348)、Fig350(配列番号:350)、Fig352(配列番号:352)、Fig354(配列番号:354)、Fig356(配列番号:356)、Fig358(配列番号:358)、Fig360(配列番号:360)、Fig362(配列番号:362)、Fig364(配列番号:364)、Fig366(配列番号:366)、Fig368(配列番号:368)、Fig370(配列番号:370)、Fig372(配列番号:372)、Fig374(配列番号:374)、Fig376(配列番号:376)、Fig378(配列番号:378)、Fig380(配列番号:380)、Fig382(配列番号:382)、Fig384(配列番号:384)、Fig386(配列番号:386)、Fig388(配列番号:388)、Fig390(配列番号:390)、Fig392(配列番号:392)、Fig394(配列番号:394)、Fig396(配列番号:396)、Fig398(配列番号:398)、Fig400(配列番号:400)、Fig402(配列番号:402)、Fig404(配列番号:404)、Fig406(配列番号:406)、Fig408(配列番号:408)、Fig410(配列番号:410)、Fig412(配列番号:412)、Fig414(配列番号:414)、Fig416(配列番号:416)、Fig418(配列番号:418)、Fig420(配列番号:420)、Fig422(配列番号:422)、Fig424(配列番号:424)、Fig426(配列番号:426)、Fig428(配列番号:428)、Fig430(配列番号:430)、Fig432(配列番号:432)、Fig434(配列番号:434)、Fig436(配列番号:436)、Fig438(配列番号:438)、Fig440(配列番号:440)、Fig442(配列番号:442)、Fig444(配列番号:444)、Fig446(配列番号:446)、Fig448(配列番号:448)、Fig450(配列番号:450)、Fig452(配列番号:452)、Fig454(配列番号:454)、Fig456(配列番号:456)、Fig458(配列番号:458)、Fig460(配列番号:460)、Fig462(配列番号:462)、Fig464(配列番号:464)、Fig466(配列番号:466)、Fig468(配列番号:468)、Fig470(配列番号:470)、Fig472(配列番号:472)、Fig474(配列番号:474)、Fig476(配列番号:476)、Fig478(配列番号:478)、Fig480(配列番号:480)、Fig482(配列番号:482)、Fig484(配列番号:484)、Fig486(配列番号:486)、Fig488(配列番号:488)、Fig490(配列番号:490)、Fig492(配列番号:492)、Fig494(配列番号:494)、Fig496(配列番号:496)、Fig498(配列番号:498)、Fig500(配列番号:500)、Fig502(配列番号:502)、Fig504(配列番号:504)、Fig506(配列番号:506)、Fig508(配列番号:508)、Fig510(配列番号:510)、Fig512(配列番号:512)、Fig514(配列番号:514)、Fig516(配列番号:516)、Fig518(配列番号:518)、Fig520(配列番号:520)、Fig522(配列番号:522)、Fig524(配列番号:524)、Fig526(配列番号:526)、Fig528(配列番号:528)、Fig530(配列番号:530)、Fig532(配列番号:532)、Fig534(配列番号:534)、Fig536(配列番号:536)、Fig538(配列番号:538)、Fig540(配列番号:540)、Fig542(配列番号:542)、Fig544(配列番号:544)、Fig546(配列番号:546)、Fig548(配列番号:548)及びFig550(配列番号:550)に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列;或いは
(c)その結合するシグナルペプチドを欠くFig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:4)、Fig6(配列番号:6)、Fig8(配列番号:8)、Fig10(配列番号:10)、Fig12(配列番号:12)、Fig14(配列番号:14)、Fig16(配列番号:16)、Fig18(配列番号:18)、Fig20(配列番号:20)、Fig22(配列番号:22)、Fig24(配列番号:24)、Fig26(配列番号:26)、Fig28(配列番号:28)、Fig30(配列番号:30)、Fig32(配列番号:32)、Fig34(配列番号:34)、Fig36(配列番号:36)、Fig38(配列番号:38)、Fig40(配列番号:40)、Fig42(配列番号:42)、Fig44(配列番号:44)、Fig46(配列番号46)、Fig48(配列番号:48)、Fig50(配列番号:50)、Fig52(配列番号:52)、Fig54(配列番号:54)、Fig56(配列番号:56)、Fig58(配列番号:58)、Fig60(配列番号:60)、Fig62(配列番号:62)、Fig64(配列番号:64)、Fig66(配列番号:66)、Fig68(配列番号:68)、Fig72(配列番号:72)、Fig74(配列番号:74)、Fig76(配列番号:76)、Fig78(配列番号:78)、Fig80(配列番号:80)、Fig82(配列番号:82)、Fig84(配列番号:84)、Fig86(配列番号:86)、Fig88(配列番号:88)、Fig90(配列番号:90)、Fig92(配列番号:92)、Fig94(配列番号:94)、Fig96(配列番号:96)、Fig98(配列番号:98)、Fig100(配列番号:100)、Fig102(配列番号:102)、Fig104(配列番号:104)、Fig106(配列番号:106)、Fig108(配列番号:108)、Fig110(配列番号:110)、Fig112(配列番号:112)、Fig114(配列番号:114)、Fig116(配列番号:116)、Fig118(配列番号:118)、Fig120(配列番号:120)、Fig122(配列番号:122)、Fig124(配列番号:124)、Fig126(配列番号:126)、Fig128(配列番号:128)、Fig130(配列番号:130)、Fig132(配列番号:132)、Fig134(配列番号:134)、Fig136(配列番号:136)、Fig138(配列番号:138)、Fig140(配列番号:140)、Fig142(配列番号:142)、Fig144(配列番号:144)、Fig146(配列番号:146)、Fig148(配列番号:148)、Fig150(配列番号:150)、Fig152(配列番号:152)、Fig154(配列番号:154)、Fig156(配列番号:156)、Fig158(配列番号:158)、Fig160(配列番号:160)、Fig162(配列番号:162)、Fig164(配列番号:164)、Fig166(配列番号:166)、Fig168(配列番号:168)、Fig170(配列番号:170)、Fig172(配列番号:172)、Fig174(配列番号:174)、Fig176(配列番号:176)、Fig178(配列番号:178)、Fig180(配列番号:180)、Fig182(配列番号:182)、Fig184(配列番号:184)、Fig186(配列番号:186)、Fig188(配列番号:188)、Fig190(配列番号:190)、Fig192(配列番号:192)、Fig194(配列番号:194)、Fig196(配列番号:196)、Fig198(配列番号:198)、Fig200(配列番号:200)、Fig202(配列番号:202)、Fig204(配列番号:204)、Fig206(配列番号:206)、Fig208(配列番号:208)、Fig210(配列番号:210)、Fig212(配列番号:212)、Fig214(配列番号:214)、Fig216(配列番号:216)、Fig218(配列番号:218)、Fig220(配列番号:220)、Fig222(配列番号:222)、Fig224(配列番号:224)、Fig226(配列番号:226)、Fig228(配列番号:228)、Fig230(配列番号:230)、Fig232(配列番号:232)、Fig234(配列番号:234)、Fig236(配列番号:236)、Fig238(配列番号:238)、Fig240(配列番号:240)、Fig242(配列番号:242)、Fig244(配列番号:244)、Fig246(配列番号:246)、Fig248(配列番号:248)、Fig250(配列番号:250)、Fig252(配列番号:252)、Fig254(配列番号:254)、Fig256(配列番号:256)、Fig258(配列番号:258)、Fig260(配列番号:260)、Fig262(配列番号:262)、Fig264(配列番号:264)、Fig266(配列番号:266)、Fig268(配列番号:268)、Fig270(配列番号:270)、Fig272(配列番号:272)、Fig274(配列番号:274)、Fig276(配列番号:276)、Fig278(配列番号:278)、Fig280(配列番号:280)、Fig282(配列番号:282)、Fig284(配列番号:284)、Fig286(配列番号:286)、Fig288(配列番号:288)、Fig290(配列番号:290)、Fig292(配列番号:292)、Fig294(配列番号:294)、Fig296(配列番号:296)、Fig298(配列番号:298)、Fig300(配列番号:300)、Fig302(配列番号:302)、Fig304(配列番号:304)、Fig306(配列番号:306)、Fig308(配列番号:308)、Fig310(配列番号:310)、Fig312(配列番号:312)、Fig314(配列番号:314)、Fig316(配列番号:316)、Fig318(配列番号:318)、Fig320(配列番号:320)、Fig322(配列番号:322)、Fig324(配列番号:324)、Fig326(配列番号:326)、Fig328(配列番号:328)、Fig330(配列番号:330)、Fig332(配列番号:332)、Fig334(配列番号:334)、Fig336(配列番号:336)、Fig338(配列番号:338)、Fig340(配列番号:340)、Fig342(配列番号:342)、Fig344(配列番号:344)、Fig346(配列番号:346)、Fig348(配列番号:348)、Fig350(配列番号:350)、Fig352(配列番号:352)、Fig354(配列番号:354)、Fig356(配列番号:356)、Fig358(配列番号:358)、Fig360(配列番号:360)、Fig362(配列番号:362)、Fig364(配列番号:364)、Fig366(配列番号:366)、Fig368(配列番号:368)、Fig370(配列番号:370)、Fig372(配列番号:372)、Fig374(配列番号:374)、Fig376(配列番号:376)、Fig378(配列番号:378)、Fig380(配列番号:380)、Fig382(配列番号:382)、Fig384(配列番号:384)、Fig386(配列番号:386)、Fig388(配列番号:388)、Fig390(配列番号:390)、Fig392(配列番号:392)、Fig394(配列番号:394)、Fig396(配列番号:396)、Fig398(配列番号:398)、Fig400(配列番号:400)、Fig402(配列番号:402)、Fig404(配列番号:404)、Fig406(配列番号:406)、Fig408(配列番号:408)、Fig410(配列番号:410)、Fig412(配列番号:412)、Fig414(配列番号:414)、Fig416(配列番号:416)、Fig418(配列番号:418)、Fig420(配列番号:420)、Fig422(配列番号:422)、Fig424(配列番号:424)、Fig426(配列番号:426)、Fig428(配列番号:428)、Fig430(配列番号:430)、Fig432(配列番号:432)、Fig434(配列番号:434)、Fig436(配列番号:436)、Fig438(配列番号:438)、Fig440(配列番号:440)、Fig442(配列番号:442)、Fig444(配列番号:444)、Fig446(配列番号:446)、Fig448(配列番号:448)、Fig450(配列番号:450)、Fig452(配列番号:452)、Fig454(配列番号:454)、Fig456(配列番号:456)、Fig458(配列番号:458)、Fig460(配列番号:460)、Fig462(配列番号:462)、Fig464(配列番号:464)、Fig466(配列番号:466)、Fig468(配列番号:468)、Fig470(配列番号:470)、Fig472(配列番号:472)、Fig474(配列番号:474)、Fig476(配列番号:476)、Fig478(配列番号:478)、Fig480(配列番号:480)、Fig482(配列番号:482)、Fig484(配列番号:484)、Fig486(配列番号:486)、Fig488(配列番号:488)、Fig490(配列番号:490)、Fig492(配列番号:492)、Fig494(配列番号:494)、Fig496(配列番号:496)、Fig498(配列番号:498)、Fig500(配列番号:500)、Fig502(配列番号:502)、Fig504(配列番号:504)、Fig506(配列番号:506)、Fig508(配列番号:508)、Fig510(配列番号:510)、Fig512(配列番号:512)、Fig514(配列番号:514)、Fig516(配列番号:516)、Fig518(配列番号:518)、Fig520(配列番号:520)、Fig522(配列番号:522)、Fig524(配列番号:524)、Fig526(配列番号:526)、Fig528(配列番号:528)、Fig530(配列番号:530)、Fig532(配列番号:532)、Fig534(配列番号:534)、Fig536(配列番号:536)、Fig538(配列番号:538)、Fig540(配列番号:540)、Fig542(配列番号:542)、Fig544(配列番号:544)、Fig546(配列番号:546)、Fig548(配列番号:548)及びFig550(配列番号:550)に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 - (a)その結合するシグナルペプチドを欠くFig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:4)、Fig6(配列番号:6)、Fig8(配列番号:8)、Fig10(配列番号:10)、Fig12(配列番号:12)、Fig14(配列番号:14)、Fig16(配列番号:16)、Fig18(配列番号:18)、Fig20(配列番号:20)、Fig22(配列番号:22)、Fig24(配列番号:24)、Fig26(配列番号:26)、Fig28(配列番号:28)、Fig30(配列番号:30)、Fig32(配列番号:32)、Fig34(配列番号:34)、Fig36(配列番号:36)、Fig38(配列番号:38)、Fig40(配列番号:40)、Fig42(配列番号:42)、Fig44(配列番号:44)、Fig46(配列番号46)、Fig48(配列番号:48)、Fig50(配列番号:50)、Fig52(配列番号:52)、Fig54(配列番号:54)、Fig56(配列番号:56)、Fig58(配列番号:58)、Fig60(配列番号:60)、Fig62(配列番号:62)、Fig64(配列番号:64)、Fig66(配列番号:66)、Fig68(配列番号:68)、Fig72(配列番号:72)、Fig74(配列番号:74)、Fig76(配列番号:76)、Fig78(配列番号:78)、Fig80(配列番号:80)、Fig82(配列番号:82)、Fig84(配列番号:84)、Fig86(配列番号:86)、Fig88(配列番号:88)、Fig90(配列番号:90)、Fig92(配列番号:92)、Fig94(配列番号:94)、Fig96(配列番号:96)、Fig98(配列番号:98)、Fig100(配列番号:100)、Fig102(配列番号:102)、Fig104(配列番号:104)、Fig106(配列番号:106)、Fig108(配列番号:108)、Fig110(配列番号:110)、Fig112(配列番号:112)、Fig114(配列番号:114)、Fig116(配列番号:116)、Fig118(配列番号:118)、Fig120(配列番号:120)、Fig122(配列番号:122)、Fig124(配列番号:124)、Fig126(配列番号:126)、Fig128(配列番号:128)、Fig130(配列番号:130)、Fig132(配列番号:132)、Fig134(配列番号:134)、Fig136(配列番号:136)、Fig138(配列番号:138)、Fig140(配列番号:140)、Fig142(配列番号:142)、Fig144(配列番号:144)、Fig146(配列番号:146)、Fig148(配列番号:148)、Fig150(配列番号:150)、Fig152(配列番号:152)、Fig154(配列番号:154)、Fig156(配列番号:156)、Fig158(配列番号:158)、Fig160(配列番号:160)、Fig162(配列番号:162)、Fig164(配列番号:164)、Fig166(配列番号:166)、Fig168(配列番号:168)、Fig170(配列番号:170)、Fig172(配列番号:172)、Fig174(配列番号:174)、Fig176(配列番号:176)、Fig178(配列番号:178)、Fig180(配列番号:180)、Fig182(配列番号:182)、Fig184(配列番号:184)、Fig186(配列番号:186)、Fig188(配列番号:188)、Fig190(配列番号:190)、Fig192(配列番号:192)、Fig194(配列番号:194)、Fig196(配列番号:196)、Fig198(配列番号:198)、Fig200(配列番号:200)、Fig202(配列番号:202)、Fig204(配列番号:204)、Fig206(配列番号:206)、Fig208(配列番号:208)、Fig210(配列番号:210)、Fig212(配列番号:212)、Fig214(配列番号:214)、Fig216(配列番号:216)、Fig218(配列番号:218)、Fig220(配列番号:220)、Fig222(配列番号:222)、Fig224(配列番号:224)、Fig226(配列番号:226)、Fig228(配列番号:228)、Fig230(配列番号:230)、Fig232(配列番号:232)、Fig234(配列番号:234)、Fig236(配列番号:236)、Fig238(配列番号:238)、Fig240(配列番号:240)、Fig242(配列番号:242)、Fig244(配列番号:244)、Fig246(配列番号:246)、Fig248(配列番号:248)、Fig250(配列番号:250)、Fig252(配列番号:252)、Fig254(配列番号:254)、Fig256(配列番号:256)、Fig258(配列番号:258)、Fig260(配列番号:260)、Fig262(配列番号:262)、Fig264(配列番号:264)、Fig266(配列番号:266)、Fig268(配列番号:268)、Fig270(配列番号:270)、Fig272(配列番号:272)、Fig274(配列番号:274)、Fig276(配列番号:276)、Fig278(配列番号:278)、Fig280(配列番号:280)、Fig282(配列番号:282)、Fig284(配列番号:284)、Fig286(配列番号:286)、Fig288(配列番号:288)、Fig290(配列番号:290)、Fig292(配列番号:292)、Fig294(配列番号:294)、Fig296(配列番号:296)、Fig298(配列番号:298)、Fig300(配列番号:300)、Fig302(配列番号:302)、Fig304(配列番号:304)、Fig306(配列番号:306)、Fig308(配列番号:308)、Fig310(配列番号:310)、Fig312(配列番号:312)、Fig314(配列番号:314)、Fig316(配列番号:316)、Fig318(配列番号:318)、Fig320(配列番号:320)、Fig322(配列番号:322)、Fig324(配列番号:324)、Fig326(配列番号:326)、Fig328(配列番号:328)、Fig330(配列番号:330)、Fig332(配列番号:332)、Fig334(配列番号:334)、Fig336(配列番号:336)、Fig338(配列番号:338)、Fig340(配列番号:340)、Fig342(配列番号:342)、Fig344(配列番号:344)、Fig346(配列番号:346)、Fig348(配列番号:348)、Fig350(配列番号:350)、Fig352(配列番号:352)、Fig354(配列番号:354)、Fig356(配列番号:356)、Fig358(配列番号:358)、Fig360(配列番号:360)、Fig362(配列番号:362)、Fig364(配列番号:364)、Fig366(配列番号:366)、Fig368(配列番号:368)、Fig370(配列番号:370)、Fig372(配列番号:372)、Fig374(配列番号:374)、Fig376(配列番号:376)、Fig378(配列番号:378)、Fig380(配列番号:380)、Fig382(配列番号:382)、Fig384(配列番号:384)、Fig386(配列番号:386)、Fig388(配列番号:388)、Fig390(配列番号:390)、Fig392(配列番号:392)、Fig394(配列番号:394)、Fig396(配列番号:396)、Fig398(配列番号:398)、Fig400(配列番号:400)、Fig402(配列番号:402)、Fig404(配列番号:404)、Fig406(配列番号:406)、Fig408(配列番号:408)、Fig410(配列番号:410)、Fig412(配列番号:412)、Fig414(配列番号:414)、Fig416(配列番号:416)、Fig418(配列番号:418)、Fig420(配列番号:420)、Fig422(配列番号:422)、Fig424(配列番号:424)、Fig426(配列番号:426)、Fig428(配列番号:428)、Fig430(配列番号:430)、Fig432(配列番号:432)、Fig434(配列番号:434)、Fig436(配列番号:436)、Fig438(配列番号:438)、Fig440(配列番号:440)、Fig442(配列番号:442)、Fig444(配列番号:444)、Fig446(配列番号:446)、Fig448(配列番号:448)、Fig450(配列番号:450)、Fig452(配列番号:452)、Fig454(配列番号:454)、Fig456(配列番号:456)、Fig458(配列番号:458)、Fig460(配列番号:460)、Fig462(配列番号:462)、Fig464(配列番号:464)、Fig466(配列番号:466)、Fig468(配列番号:468)、Fig470(配列番号:470)、Fig472(配列番号:472)、Fig474(配列番号:474)、Fig476(配列番号:476)、Fig478(配列番号:478)、Fig480(配列番号:480)、Fig482(配列番号:482)、Fig484(配列番号:484)、Fig486(配列番号:486)、Fig488(配列番号:488)、Fig490(配列番号:490)、Fig492(配列番号:492)、Fig494(配列番号:494)、Fig496(配列番号:496)、Fig498(配列番号:498)、Fig500(配列番号:500)、Fig502(配列番号:502)、Fig504(配列番号:504)、Fig506(配列番号:506)、Fig508(配列番号:508)、Fig510(配列番号:510)、Fig512(配列番号:512)、Fig514(配列番号:514)、Fig516(配列番号:516)、Fig518(配列番号:518)、Fig520(配列番号:520)、Fig522(配列番号:522)、Fig524(配列番号:524)、Fig526(配列番号:526)、Fig528(配列番号:528)、Fig530(配列番号:530)、Fig532(配列番号:532)、Fig534(配列番号:534)、Fig536(配列番号:536)、Fig538(配列番号:538)、Fig540(配列番号:540)、Fig542(配列番号:542)、Fig544(配列番号:544)、Fig546(配列番号:546)、Fig548(配列番号:548)及びFig550(配列番号:550)に示すポリペプチドのアミノ酸配列;
(b)その結合するシグナルペプチドを有するFig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:4)、Fig6(配列番号:6)、Fig8(配列番号:8)、Fig10(配列番号:10)、Fig12(配列番号:12)、Fig14(配列番号:14)、Fig16(配列番号:16)、Fig18(配列番号:18)、Fig20(配列番号:20)、Fig22(配列番号:22)、Fig24(配列番号:24)、Fig26(配列番号:26)、Fig28(配列番号:28)、Fig30(配列番号:30)、Fig32(配列番号:32)、Fig34(配列番号:34)、Fig36(配列番号:36)、Fig38(配列番号:38)、Fig40(配列番号:40)、Fig42(配列番号:42)、Fig44(配列番号:44)、Fig46(配列番号46)、Fig48(配列番号:48)、Fig50(配列番号:50)、Fig52(配列番号:52)、Fig54(配列番号:54)、Fig56(配列番号:56)、Fig58(配列番号:58)、Fig60(配列番号:60)、Fig62(配列番号:62)、Fig64(配列番号:64)、Fig66(配列番号:66)、Fig68(配列番号:68)、Fig72(配列番号:72)、Fig74(配列番号:74)、Fig76(配列番号:76)、Fig78(配列番号:78)、Fig80(配列番号:80)、Fig82(配列番号:82)、Fig84(配列番号:84)、Fig86(配列番号:86)、Fig88(配列番号:88)、Fig90(配列番号:90)、Fig92(配列番号:92)、Fig94(配列番号:94)、Fig96(配列番号:96)、Fig98(配列番号:98)、Fig100(配列番号:100)、Fig102(配列番号:102)、Fig104(配列番号:104)、Fig106(配列番号:106)、Fig108(配列番号:108)、Fig110(配列番号:110)、Fig112(配列番号:112)、Fig114(配列番号:114)、Fig116(配列番号:116)、Fig118(配列番号:118)、Fig120(配列番号:120)、Fig122(配列番号:122)、Fig124(配列番号:124)、Fig126(配列番号:126)、Fig128(配列番号:128)、Fig130(配列番号:130)、Fig132(配列番号:132)、Fig134(配列番号:134)、Fig136(配列番号:136)、Fig138(配列番号:138)、Fig140(配列番号:140)、Fig142(配列番号:142)、Fig144(配列番号:144)、Fig146(配列番号:146)、Fig148(配列番号:148)、Fig150(配列番号:150)、Fig152(配列番号:152)、Fig154(配列番号:154)、Fig156(配列番号:156)、Fig158(配列番号:158)、Fig160(配列番号:160)、Fig162(配列番号:162)、Fig164(配列番号:164)、Fig166(配列番号:166)、Fig168(配列番号:168)、Fig170(配列番号:170)、Fig172(配列番号:172)、Fig174(配列番号:174)、Fig176(配列番号:176)、Fig178(配列番号:178)、Fig180(配列番号:180)、Fig182(配列番号:182)、Fig184(配列番号:184)、Fig186(配列番号:186)、Fig188(配列番号:188)、Fig190(配列番号:190)、Fig192(配列番号:192)、Fig194(配列番号:194)、Fig196(配列番号:196)、Fig198(配列番号:198)、Fig200(配列番号:200)、Fig202(配列番号:202)、Fig204(配列番号:204)、Fig206(配列番号:206)、Fig208(配列番号:208)、Fig210(配列番号:210)、Fig212(配列番号:212)、Fig214(配列番号:214)、Fig216(配列番号:216)、Fig218(配列番号:218)、Fig220(配列番号:220)、Fig222(配列番号:222)、Fig224(配列番号:224)、Fig226(配列番号:226)、Fig228(配列番号:228)、Fig230(配列番号:230)、Fig232(配列番号:232)、Fig234(配列番号:234)、Fig236(配列番号:236)、Fig238(配列番号:238)、Fig240(配列番号:240)、Fig242(配列番号:242)、Fig244(配列番号:244)、Fig246(配列番号:246)、Fig248(配列番号:248)、Fig250(配列番号:250)、Fig252(配列番号:252)、Fig254(配列番号:254)、Fig256(配列番号:256)、Fig258(配列番号:258)、Fig260(配列番号:260)、Fig262(配列番号:262)、Fig264(配列番号:264)、Fig266(配列番号:266)、Fig268(配列番号:268)、Fig270(配列番号:270)、Fig272(配列番号:272)、Fig274(配列番号:274)、Fig276(配列番号:276)、Fig278(配列番号:278)、Fig280(配列番号:280)、Fig282(配列番号:282)、Fig284(配列番号:284)、Fig286(配列番号:286)、Fig288(配列番号:288)、Fig290(配列番号:290)、Fig292(配列番号:292)、Fig294(配列番号:294)、Fig296(配列番号:296)、Fig298(配列番号:298)、Fig300(配列番号:300)、Fig302(配列番号:302)、Fig304(配列番号:304)、Fig306(配列番号:306)、Fig308(配列番号:308)、Fig310(配列番号:310)、Fig312(配列番号:312)、Fig314(配列番号:314)、Fig316(配列番号:316)、Fig318(配列番号:318)、Fig320(配列番号:320)、Fig322(配列番号:322)、Fig324(配列番号:324)、Fig326(配列番号:326)、Fig328(配列番号:328)、Fig330(配列番号:330)、Fig332(配列番号:332)、Fig334(配列番号:334)、Fig336(配列番号:336)、Fig338(配列番号:338)、Fig340(配列番号:340)、Fig342(配列番号:342)、Fig344(配列番号:344)、Fig346(配列番号:346)、Fig348(配列番号:348)、Fig350(配列番号:350)、Fig352(配列番号:352)、Fig354(配列番号:354)、Fig356(配列番号:356)、Fig358(配列番号:358)、Fig360(配列番号:360)、Fig362(配列番号:362)、Fig364(配列番号:364)、Fig366(配列番号:366)、Fig368(配列番号:368)、Fig370(配列番号:370)、Fig372(配列番号:372)、Fig374(配列番号:374)、Fig376(配列番号:376)、Fig378(配列番号:378)、Fig380(配列番号:380)、Fig382(配列番号:382)、Fig384(配列番号:384)、Fig386(配列番号:386)、Fig388(配列番号:388)、Fig390(配列番号:390)、Fig392(配列番号:392)、Fig394(配列番号:394)、Fig396(配列番号:396)、Fig398(配列番号:398)、Fig400(配列番号:400)、Fig402(配列番号:402)、Fig404(配列番号:404)、Fig406(配列番号:406)、Fig408(配列番号:408)、Fig410(配列番号:410)、Fig412(配列番号:412)、Fig414(配列番号:414)、Fig416(配列番号:416)、Fig418(配列番号:418)、Fig420(配列番号:420)、Fig422(配列番号:422)、Fig424(配列番号:424)、Fig426(配列番号:426)、Fig428(配列番号:428)、Fig430(配列番号:430)、Fig432(配列番号:432)、Fig434(配列番号:434)、Fig436(配列番号:436)、Fig438(配列番号:438)、Fig440(配列番号:440)、Fig442(配列番号:442)、Fig444(配列番号:444)、Fig446(配列番号:446)、Fig448(配列番号:448)、Fig450(配列番号:450)、Fig452(配列番号:452)、Fig454(配列番号:454)、Fig456(配列番号:456)、Fig458(配列番号:458)、Fig460(配列番号:460)、Fig462(配列番号:462)、Fig464(配列番号:464)、Fig466(配列番号:466)、Fig468(配列番号:468)、Fig470(配列番号:470)、Fig472(配列番号:472)、Fig474(配列番号:474)、Fig476(配列番号:476)、Fig478(配列番号:478)、Fig480(配列番号:480)、Fig482(配列番号:482)、Fig484(配列番号:484)、Fig486(配列番号:486)、Fig488(配列番号:488)、Fig490(配列番号:490)、Fig492(配列番号:492)、Fig494(配列番号:494)、Fig496(配列番号:496)、Fig498(配列番号:498)、Fig500(配列番号:500)、Fig502(配列番号:502)、Fig504(配列番号:504)、Fig506(配列番号:506)、Fig508(配列番号:508)、Fig510(配列番号:510)、Fig512(配列番号:512)、Fig514(配列番号:514)、Fig516(配列番号:516)、Fig518(配列番号:518)、Fig520(配列番号:520)、Fig522(配列番号:522)、Fig524(配列番号:524)、Fig526(配列番号:526)、Fig528(配列番号:528)、Fig530(配列番号:530)、Fig532(配列番号:532)、Fig534(配列番号:534)、Fig536(配列番号:536)、Fig538(配列番号:538)、Fig540(配列番号:540)、Fig542(配列番号:542)、Fig544(配列番号:544)、Fig546(配列番号:546)、Fig548(配列番号:548)及びFig550(配列番号:550)に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列;或いは
(c)その結合するシグナルペプチドを欠くFig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:4)、Fig6(配列番号:6)、Fig8(配列番号:8)、Fig10(配列番号:10)、Fig12(配列番号:12)、Fig14(配列番号:14)、Fig16(配列番号:16)、Fig18(配列番号:18)、Fig20(配列番号:20)、Fig22(配列番号:22)、Fig24(配列番号:24)、Fig26(配列番号:26)、Fig28(配列番号:28)、Fig30(配列番号:30)、Fig32(配列番号:32)、Fig34(配列番号:34)、Fig36(配列番号:36)、Fig38(配列番号:38)、Fig40(配列番号:40)、Fig42(配列番号:42)、Fig44(配列番号:44)、Fig46(配列番号46)、Fig48(配列番号:48)、Fig50(配列番号:50)、Fig52(配列番号:52)、Fig54(配列番号:54)、Fig56(配列番号:56)、Fig58(配列番号:58)、Fig60(配列番号:60)、Fig62(配列番号:62)、Fig64(配列番号:64)、Fig66(配列番号:66)、Fig68(配列番号:68)、Fig72(配列番号:72)、Fig74(配列番号:74)、Fig76(配列番号:76)、Fig78(配列番号:78)、Fig80(配列番号:80)、Fig82(配列番号:82)、Fig84(配列番号:84)、Fig86(配列番号:86)、Fig88(配列番号:88)、Fig90(配列番号:90)、Fig92(配列番号:92)、Fig94(配列番号:94)、Fig96(配列番号:96)、Fig98(配列番号:98)、Fig100(配列番号:100)、Fig102(配列番号:102)、Fig104(配列番号:104)、Fig106(配列番号:106)、Fig108(配列番号:108)、Fig110(配列番号:110)、Fig112(配列番号:112)、Fig114(配列番号:114)、Fig116(配列番号:116)、Fig118(配列番号:118)、Fig120(配列番号:120)、Fig122(配列番号:122)、Fig124(配列番号:124)、Fig126(配列番号:126)、Fig128(配列番号:128)、Fig130(配列番号:130)、Fig132(配列番号:132)、Fig134(配列番号:134)、Fig136(配列番号:136)、Fig138(配列番号:138)、Fig140(配列番号:140)、Fig142(配列番号:142)、Fig144(配列番号:144)、Fig146(配列番号:146)、Fig148(配列番号:148)、Fig150(配列番号:150)、Fig152(配列番号:152)、Fig154(配列番号:154)、Fig156(配列番号:156)、Fig158(配列番号:158)、Fig160(配列番号:160)、Fig162(配列番号:162)、Fig164(配列番号:164)、Fig166(配列番号:166)、Fig168(配列番号:168)、Fig170(配列番号:170)、Fig172(配列番号:172)、Fig174(配列番号:174)、Fig176(配列番号:176)、Fig178(配列番号:178)、Fig180(配列番号:180)、Fig182(配列番号:182)、Fig184(配列番号:184)、Fig186(配列番号:186)、Fig188(配列番号:188)、Fig190(配列番号:190)、Fig192(配列番号:192)、Fig194(配列番号:194)、Fig196(配列番号:196)、Fig198(配列番号:198)、Fig200(配列番号:200)、Fig202(配列番号:202)、Fig204(配列番号:204)、Fig206(配列番号:206)、Fig208(配列番号:208)、Fig210(配列番号:210)、Fig212(配列番号:212)、Fig214(配列番号:214)、Fig216(配列番号:216)、Fig218(配列番号:218)、Fig220(配列番号:220)、Fig222(配列番号:222)、Fig224(配列番号:224)、Fig226(配列番号:226)、Fig228(配列番号:228)、Fig230(配列番号:230)、Fig232(配列番号:232)、Fig234(配列番号:234)、Fig236(配列番号:236)、Fig238(配列番号:238)、Fig240(配列番号:240)、Fig242(配列番号:242)、Fig244(配列番号:244)、Fig246(配列番号:246)、Fig248(配列番号:248)、Fig250(配列番号:250)、Fig252(配列番号:252)、Fig254(配列番号:254)、Fig256(配列番号:256)、Fig258(配列番号:258)、Fig260(配列番号:260)、Fig262(配列番号:262)、Fig264(配列番号:264)、Fig266(配列番号:266)、Fig268(配列番号:268)、Fig270(配列番号:270)、Fig272(配列番号:272)、Fig274(配列番号:274)、Fig276(配列番号:276)、Fig278(配列番号:278)、Fig280(配列番号:280)、Fig282(配列番号:282)、Fig284(配列番号:284)、Fig286(配列番号:286)、Fig288(配列番号:288)、Fig290(配列番号:290)、Fig292(配列番号:292)、Fig294(配列番号:294)、Fig296(配列番号:296)、Fig298(配列番号:298)、Fig300(配列番号:300)、Fig302(配列番号:302)、Fig304(配列番号:304)、Fig306(配列番号:306)、Fig308(配列番号:308)、Fig310(配列番号:310)、Fig312(配列番号:312)、Fig314(配列番号:314)、Fig316(配列番号:316)、Fig318(配列番号:318)、Fig320(配列番号:320)、Fig322(配列番号:322)、Fig324(配列番号:324)、Fig326(配列番号:326)、Fig328(配列番号:328)、Fig330(配列番号:330)、Fig332(配列番号:332)、Fig334(配列番号:334)、Fig336(配列番号:336)、Fig338(配列番号:338)、Fig340(配列番号:340)、Fig342(配列番号:342)、Fig344(配列番号:344)、Fig346(配列番号:346)、Fig348(配列番号:348)、Fig350(配列番号:350)、Fig352(配列番号:352)、Fig354(配列番号:354)、Fig356(配列番号:356)、Fig358(配列番号:358)、Fig360(配列番号:360)、Fig362(配列番号:362)、Fig364(配列番号:364)、Fig366(配列番号:366)、Fig368(配列番号:368)、Fig370(配列番号:370)、Fig372(配列番号:372)、Fig374(配列番号:374)、Fig376(配列番号:376)、Fig378(配列番号:378)、Fig380(配列番号:380)、Fig382(配列番号:382)、Fig384(配列番号:384)、Fig386(配列番号:386)、Fig388(配列番号:388)、Fig390(配列番号:390)、Fig392(配列番号:392)、Fig394(配列番号:394)、Fig396(配列番号:396)、Fig398(配列番号:398)、Fig400(配列番号:400)、Fig402(配列番号:402)、Fig404(配列番号:404)、Fig406(配列番号:406)、Fig408(配列番号:408)、Fig410(配列番号:410)、Fig412(配列番号:412)、Fig414(配列番号:414)、Fig416(配列番号:416)、Fig418(配列番号:418)、Fig420(配列番号:420)、Fig422(配列番号:422)、Fig424(配列番号:424)、Fig426(配列番号:426)、Fig428(配列番号:428)、Fig430(配列番号:430)、Fig432(配列番号:432)、Fig434(配列番号:434)、Fig436(配列番号:436)、Fig438(配列番号:438)、Fig440(配列番号:440)、Fig442(配列番号:442)、Fig444(配列番号:444)、Fig446(配列番号:446)、Fig448(配列番号:448)、Fig450(配列番号:450)、Fig452(配列番号:452)、Fig454(配列番号:454)、Fig456(配列番号:456)、Fig458(配列番号:458)、Fig460(配列番号:460)、Fig462(配列番号:462)、Fig464(配列番号:464)、Fig466(配列番号:466)、Fig468(配列番号:468)、Fig470(配列番号:470)、Fig472(配列番号:472)、Fig474(配列番号:474)、Fig476(配列番号:476)、Fig478(配列番号:478)、Fig480(配列番号:480)、Fig482(配列番号:482)、Fig484(配列番号:484)、Fig486(配列番号:486)、Fig488(配列番号:488)、Fig490(配列番号:490)、Fig492(配列番号:492)、Fig494(配列番号:494)、Fig496(配列番号:496)、Fig498(配列番号:498)、Fig500(配列番号:500)、Fig502(配列番号:502)、Fig504(配列番号:504)、Fig506(配列番号:506)、Fig508(配列番号:508)、Fig510(配列番号:510)、Fig512(配列番号:512)、Fig514(配列番号:514)、Fig516(配列番号:516)、Fig518(配列番号:518)、Fig520(配列番号:520)、Fig522(配列番号:522)、Fig524(配列番号:524)、Fig526(配列番号:526)、Fig528(配列番号:528)、Fig530(配列番号:530)、Fig532(配列番号:532)、Fig534(配列番号:534)、Fig536(配列番号:536)、Fig538(配列番号:538)、Fig540(配列番号:540)、Fig542(配列番号:542)、Fig544(配列番号:544)、Fig546(配列番号:546)、Fig548(配列番号:548)及びFig550(配列番号:550)に示すポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%のアミノ配列同一性を有する単離されたポリペプチド。 - PRO1801ポリペプチドを含有すると思われる試料におけるPRO1801ポリペプチドを検出する方法であって、前記試料をPRO1114又はPRO4978ポリペプチドと接触させ、前記試料中におけるPRO1801/PRO1114ポリペプチド又はPRO1801/PRO4978ポリペプチドコンジュゲートの形成を測定することを含んでなる、前記コンジュゲートの形成が前記試料中におけるPRO1801ポリペプチドの存在を示す方法。
- 前記試料が前記PRO1801ポリペプチドを発現すると思われる細胞を含んでなる、請求項21に記載の方法。
- 前記PRO1114又はPRO4978ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項21に記載の方法。
- 前記PRO1114又はPRO4978ポリペプチドが固体支持体に付着している、請求項21に記載の方法。
- PRO1114又はPRO4978ポリペプチドを含有すると思われる試料におけるPRO1114又はPRO4978ポリペプチドを検出する方法であって、前記試料をPRO1801ポリペプチドと接触させ、前記試料中におけるPRO1801/PRO1114又はPRO1801/PRO4978ポリペプチドコンジュゲートの形成を測定することを含んでなる、前記コンジュゲートの形成が前記試料中におけるPRO1114又はPRO4978ポリペプチドの存在を示す方法。
- 前記試料が前記PRO1114又はPRO4978ポリペプチドを発現すると思われる細胞を含んでなる、請求項25に記載の方法。
- 前記PRO1801ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項25に記載の方法。
- 前記PRO1801ポリペプチドが固体支持体に付着している、請求項25に記載の方法。
- PRO1801ポリペプチドを発現する細胞へ生物活性分子を結合させる方法であって、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているPRO1114又はPRO4978ポリペプチドと接触させ、前記PRO1801と前記PRO1114又はPRO4978ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなる、これによって前記生物活性分子を前記細胞へ結合させる方法。
- 前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項29に記載の方法。
- 前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項29に記載の方法。
- PRO1114又はPRO4978ポリペプチドを発現する細胞へ生物活性分子を結合させる方法であって、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているPRO1801ポリペプチドと接触させ、前記PRO1801と前記PRO1114又はPRO4978ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなる、これによって前記生物活性分子を前記細胞へ結合させる方法。
- 前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項32に記載の方法。
- 前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項32に記載の方法。
- PRO1801ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法であって、前記細胞とPRO1114又はPRO4978ポリペプチド又は抗-PRO1801ポリペプチド抗体を接触させることを含んでなる、これにより前記PRO1114又はPRO4978ポリペプチド又は抗-PRO1801ポリペプチド抗体が前記PRO1801ポリペプチドと結合し、それによって前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
- 前記細胞が死滅せしめられる、請求項35に記載の方法。
- PRO1114又はPRO4978ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法であって、前記細胞とPRO1801ポリペプチド又は抗-PRO1114ポリペプチド又は抗-PRO4978ポリペプチド抗体を接触させることを含んでなる、これにより前記PRO1801ポリペプチド又は抗-PRO1114ポリペプチド又は抗-PRO4978ポリペプチド抗体が前記PRO1114又はPRO4978ポリペプチドと結合し、それによって前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
- 前記細胞が死滅せしめられる、請求項37に記載の方法。
- PRO1114ポリペプチドを含有すると思われる試料におけるPRO1114ポリペプチドを検出する方法であって、前記試料をPRO100ポリペプチドと接触させ、前記試料中におけるPRO100/PRO1114ポリペプチドコンジュゲートの形成を測定することを含んでなる、前記コンジュゲートの形成が前記試料中におけるPRO1114ポリペプチドの存在を示す方法。
- 前記試料が前記PRO1114ポリペプチドを発現すると思われる細胞を含んでなる、請求項39に記載の方法。
- 前記PRO100ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項39に記載の方法。
- 前記PRO100ポリペプチドが固体支持体に付着している、請求項39に記載の方法。
- PRO100ポリペプチドを含有すると思われる試料におけるPRO100ポリペプチドを検出する方法であって、前記試料をPRO1114ポリペプチドと接触させ、前記試料中におけるPRO100/PRO1114ポリペプチドコンジュゲートの形成を測定することを含んでなる、前記コンジュゲートの形成が前記試料中におけるPRO100ポリペプチドの存在を示す前記方法。
- 前記試料が前記PRO100ポリペプチドを発現すると思われる細胞を含んでなる、請求項43に記載の方法。
- 前記PRO1114ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項43に記載の方法。
- 前記PRO1114ポリペプチドが固体支持体に付着している、請求項43に記載の方法。
- PRO100ポリペプチドを発現する細胞へ生物活性分子を結合させる方法であって、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているPRO1114ポリペプチドと接触させ、前記PRO100と前記PRO1114ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなる、これによって前記生物活性分子を前記細胞へ結合させる方法。
- 前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項47に記載の方法。
- 前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項47に記載の方法。
- PRO1114ポリペプチドを発現する細胞へ生物活性分子を結合させる方法であって、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているPRO100ポリペプチドと接触させ、前記PRO100と前記PRO1114ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなる、これによって前記生物活性分子を前記細胞へ結合させる方法。
- 前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項50に記載の方法。
- 前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項50に記載の方法。
- PRO100ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法であって、前記細胞とPRO1114ポリペプチド又は抗-PRO100ポリペプチド抗体を接触させることを含んでなる、これにより前記PRO1114ポリペプチド又は抗-PRO100ポリペプチド抗体が前記PRO100ポリペプチドと結合し、それによって前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
- 前記細胞が死滅せしめられる、請求項53に記載の方法。
- PRO1114ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法であって、前記細胞とPRO100ポリペプチド又は抗-PRO1114ポリペプチド抗体を接触させることを含んでなる、これにより前記PRO100ポリペプチド又は抗-PRO1114ポリペプチド抗体が前記PRO1114ポリペプチドと結合し、それによって前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
- 前記細胞が死滅せしめられる、請求項55に記載の方法。
- ヒト血液からTNF-αの放出を刺激する方法であって、前記血液とPRO195、PRO202、PRO215、PRO221、PRO217、PRO222、PRO198、PRO245、PRO172、PRO265、PRO266、PRO344、PRO337、PRO322、PRO1286、PRO1279、PRO1338又はPRO1343ポリペプチドと接触させることを含んでなる、前記血液からのTNF-αの放出が刺激される方法。
- 骨格筋細胞によるグルコース又はFFAの取り込みを調節する方法であって、前記細胞とPRO182、PRO366、PRO198、PRO172又はPRO719ポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記細胞によるグルコース又はFFAの取り込みが調節される方法。
- 軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する方法であって、前記細胞とPRO182、PRO366、PRO198、PRO1868、PRO202、PRO224、PRO172、PRO301又はPRO1312ポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記細胞の増殖又は分化が刺激される方法。
- 脂肪細胞によるグルコース又はFFAの取り込み調節する方法であって、前記細胞によるグルコース又はFFAの取り込みが調節され、前記細胞とPRO202、PRO211、PRO344又はPRO1338ポリペプチドを接触させることを含んでなる前記方法。
- 周皮細胞における増殖又は遺伝子発現を刺激する方法であって、前記細胞とPRO366ポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記細胞における増殖又は遺伝子発現が刺激される方法。
- 軟骨組織からのプロテオグリカンの放出を刺激する方法であって、前記軟骨組織とPRO216ポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記軟骨組織からのプロテオグリカンの放出が刺激される方法。
- 内耳小嚢支持細胞の増殖を刺激する方法であって、前記細胞とPRO172ポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記細胞の増殖が刺激される方法。
- T-リンパ球細胞の増殖を刺激する方法であって、前記細胞とPRO344ポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記細胞の増殖が刺激される前記方法。
- PBMC細胞からのサイトカインの放出を刺激する方法であって、前記細胞とPRO526又はPRO1343ポリペプチドを接触させることを含んでなる、 前記細胞からのサイトカインの放出が刺激される前記方法。
- 因子VIIAへのA-ペプチドの結合を阻害する方法であって、前記A-ペプチド及び前記因子VIIAを含んでなる組成物とPRO182ポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記因子VIIAへの前記A-ペプチドの結合が阻害される方法。
- 脂肪細胞の分化を阻害する方法であって、前記細胞とPRO185又はPRO198ポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記細胞の分化が阻害される方法。
- 内皮細胞の増殖を刺激する方法であって、前記細胞とPRO222ポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記細胞の増殖が阻害される方法。
- 哺乳動物における腫瘍の存在を検出する方法であって、表8の(a)前記哺乳動物から細胞の試験試料、並びに(b)同じ細胞型の正常細胞のコントロール試料に示された任意のPROポリペプチドの発現レベルを比較することを含んでなる、コントロール試料と比較して試験試料における前記PROポリペプチドの発現のレベルが高いことが前記哺乳動物での腫瘍の存在を示す方法。
- 前記腫瘍が肺腫瘍、結腸腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、直腸腫瘍、頚部腫瘤又は肝臓腫瘍である、請求項69の方法。
- 添付図面に示した任意のヌクレオチド配列から誘導されるオリゴヌクレオチドプローブ。
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