JP2008161190A

JP2008161190A - 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸

Info

Publication number: JP2008161190A
Application number: JP2007326613A
Authority: JP
Inventors: Kevin P Baker; ベーカー，ケヴィン，ピー．; Maureen Beresini; ベレシーニ，モーリン; Laura Deforge; デフォージ，ローラ; Luc Desnoyers; デスノイヤース，ルーク; Ellen Filvaroff; フィルヴァロフ，エレン; Wei-Qiang Gao; ガオ，ウェイ−キャン; Mary E Gerritsen; ゲリッツェン，マリー，イー．; Audrey Goddard; ゴッダード，オードリー; Paul J Godowski; ゴドウスキー，ポール，ジェー．; Austin L Gurney; ガーニー，オースティン，エル．
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-12-01
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2008-07-17
Also published as: EP1666494A1; CA2491258A1; EP1690872A3; EP2228446A1; CA2490909A1; CA2709291A1; EP1686134A3; CA2491610A1; CA2490853A1; EP1250426A2; CA2492070A1; JP2008148699A; JP2006068016A; AU2055401A; EP1669371A3; EP1669371A2; EP1672070A2; EP1690873A2; EP1690872A2; CA2491433A1

Abstract

【課題】ヒトにおける、新規細胞外タンパク質の存在及び機能の同定、及び上記タンパク質をコードする核酸分子配列を提供する。
【解決手段】新規細胞外タンパク質（ＰＲＯポリペプチド）、特に膜結合ドメインが欠失または不活性のもの、及びこれらペプチドをコードする核酸分子。また、これら核酸配列を含んでなるベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合したポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド分子、ポリペプチドと結合する抗体、並びにポリペプチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般的に、新規なＤＮＡの同定及び単離、及び新規なポリペプチドの組換え生
産に関する。

細胞外タンパク質は、特に、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っ
ている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は
、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る情報に支配される。この情報
は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分
化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、翻って多様な細胞レセ
プター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又
はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に
到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産
業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリス
ロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な
大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。また、膜タンパク質であるこれらレセプ
ターは、治療又は診断薬剤としての潜在力を有する。新規な未変性分泌タンパク質を同定
する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タン
パク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニング
に注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Kle
inら, Proc. Natl. Acad. Sci. 93;7108-7113(1996)；米国特許第５，５３６，６３７号
を参照されたい]。

膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役
割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相
互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直近の環境から受け取られる情報に支配される
。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害
性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細
胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タン
パク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプ
ター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞間相互作用に関与す
るレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、
細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化によ
り部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼ
はまた成長因子レセプターとしても作用する。具体例には、繊維芽細胞増殖因子及び神経
成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性
を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター-リガンド間相互作用
を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセ
プター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリー
ニングするために使用することもできる。
新規な天然のレセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の
双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプター又は膜結合タンパク質のコ
ード配列を同定するために、哺乳動物の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注
がれている。

一実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで
なる単離された核酸分子を提供する。
一側面では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに
開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないこ
こに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン又はここに開示された全長アミノ酸配列
の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、
又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、
あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列
同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の
核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約
８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少な
くとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、ある
いは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一
性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸
配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５
％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくと
も約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは
少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

他の側面では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド
ｃＤＮＡのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチドＤ
ＮＡのコード配列、又はシグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通ＰＲＯ
ポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列又はここに開示された全長アミノ酸配列の任
意の他の特に定められた断片のコード配列を含むＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ
分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１
％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくと
も約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは
少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、
あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列
同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の
核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約
９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少な
くとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、ある
いは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一
性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸
配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。

さらなる側面では、本発明は、（ａ）ここに開示されたＡＴＴＣに寄託した任意のヒトタ
ンパク質ｃＤＮＡによってコードされている同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分
子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一
性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸
配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４
％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくと
も約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは
少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、
あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列
同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の
核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約
９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少な
くとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、ある
いは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単
離された核酸分子に関する。

本発明の他の側面は、膜貫通ドメインが欠失又は膜貫通ドメインが不活性化のいずれかの
ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、或いはそのようなコード化ヌクレオ
チド配列に相補的なＰＲＯポリペプチドを含んでなる単離された核酸分子を提供し、その
ようなポリペプチドの膜貫通ドメインはここで開示される。従って、ここで記載されたＰ
ＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。

他の実施態様はＰＲＯポリペプチドコード化配列の断片、又はその補体に向けられ、それ
らは、例えば、場合によっては抗-ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコ
ードするＰＲＯポリペプチドのコード化断片のハイブリダイゼーションプローブとして、
又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。このような
核酸断片は、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３０ヌクレ
オチド長、あるいは少なくとも約４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５０ヌクレ
オチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７０ヌクレ
オチド長、あるいは少なくとも約８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレ
オチド長、あるいは少なくとも約１００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１１０ヌ
クレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１３
０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約
１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、あるいは少なくと
も約１７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少な
くとも約１９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２００ヌクレオチド長、あるいは
少なくとも約２５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、ある
いは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４００ヌクレオチド長、
あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５００ヌクレオチド
長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７００ヌクレオ
チド長、あるいは少なくとも約８００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌク
レオチド長、あるいは少なくとも約１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」という
語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス１０％のヌクレオチド配列長を指すことを
意味する。ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知
られた配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてＰＲＯポリペプチドコード化
ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのＰＲＯポリペプ
チドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法
で同定してもよい。このようなＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は、全てこ
こで考慮される。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗-ＰＲＯ抗体に対
する結合部位を含むＰＲＯポリペプチド断片によってコードされるＰＲＯポリペプチド断
片も考慮される。

その他の実施態様では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列の任意のものに
コードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
或る側面では、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列、ここに開示されてい
るシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチド有又は
無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の
特に同定された他の断片を持つＰＲＯポリペプチドに対して少なくとも約８０％のアミノ
酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも
約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あ
るいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ
酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも
約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あ
るいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ
酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも
約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あ
るいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ
酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも
約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そ
して、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んで
なる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。

さらなる態様では、本発明は、ここに開示されているＡＴＣＣに寄託した任意のヒトタン
パク質ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ
酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも
約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あ
るいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ
酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも
約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あ
るいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ
酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも
約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あ
るいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ
酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも
約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そ
して、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んで
なる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。

特別な側面では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たず、
上記したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる単離さ
れたＰＲＯポリペプチドを提供する。これらを製造する方法もここに記載され、これらの
方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯポリペプチドの
発現に適した条件下で培養し、培養培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失又は膜貫通ドメインが不活性化のいずれかの
単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。これを製造する方法もここに記載され、その
方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯポリペプチドの
発現に適した条件下で培養し、培養培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含む。

さらに他の実施態様では、本発明は、ここで同定される天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニ
スト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニスト
は抗-ＰＲＯ抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト
を同定する方法に関し、それは、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯ
ポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含む。好ましくは、
ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに記載するＰＲＯ
ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-ＰＲＯ抗体を担体と組み合わせ
て含む組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。

本発明のその他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト
又はアンタゴニスト、又は抗-ＰＲＯ抗体の、ＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又は
アンタゴニスト又は抗-ＰＲＯ抗体に反応性のある症状の治療に有用な医薬の調製のため
の使用に向けられる。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載の任意のポリペプチドをコードす
るＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供さ
れる。例としては、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母であってもよい。ここに記
載の任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供されており、それは、宿主細胞を所望の
ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収す
ることを含む。

他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記
載の任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例
は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したここに記載の任意のポ
リペプチドを含む。
その他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に
結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗
体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列又はアンチセ
ンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは
上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
さらに他の実施態様では、本発明は、下記の実施例に示される機能的生物学的アッセイデ
ータに基づく種々の利用についての本発明のＰＲＯポリペプチドの利用方法に関する。

Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値
符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、ＰＲＯ／番号）は、
ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」がここで使用される実際の
数値符号である、ここで使用される「ＰＲＯ／番号ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／番号」
という用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。
ここで記載されているＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の
供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。「ＰＲＯポリ
ペプチド」という用語は、ここで開示されている各個々のＰＲＯ／番号ポリペプチドに指
す。「ＰＲＯポリペプチド」を指すこの明細書中の全ての開示は、各ポリペプチドを個別
にも組み合わせとしても言及する。例えば、調製の、精製の、誘導の、抗体の形成、投与
の、含有する組成物、疾患の治療、などの記述は、本発明の各ポリペプチドに個別に関係
する。また、「ＰＲＯポリペプチド」という用語は、ここに開示されているＰＲＯ／番号
ポリペプチドの変異体を含む。

「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチド
は、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる
。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの
自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(
例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立
遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然
配列ＰＲＯポリペプチドは、関連する図に示されている全長アミノ酸配列を含有する成熟
又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは、太い書体及び下線で図中
に示さている。しかし、関連する図に開示されているＰＲＯポリペプチドがメチオニン残
基で開始すると図のアミノ酸位置１において示されている一方で、図のアミノ酸位置１よ
り上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、ＰＲＯポリペプチドの開始
アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。

ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを
実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣ
Ｄは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメ
インを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意
の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的
に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な
境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越
えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、
実施例又明細書おいてに同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約５を越えない
アミノ酸を含みうるし、付着のシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペ
プチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。

ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明
細書と添付の図面に示される。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ-末端境
界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれ
かの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境界は
、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定
しうる（例えば、Nielsenら, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinjeら, Nucl. Acid
s. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからの
シグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、１つ以上の分泌種をもたらすことも認め
られる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れか
の側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコード
するポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。

「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示され
る全長天然配列ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然
配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外
ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０
％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯ
ポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において１つ
又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通
常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示
されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド
を有する又は有しないここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全
長ＰＲＯポリペプチドの特に同定された他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列
同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２
％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは
少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列
同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７
％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは
少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列
同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２
％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは
少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列
同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７
％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、
あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体
ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０アミノ酸長、
あるいは少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは
少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは少なくと
も約７０アミノ酸長、あるいは少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９０
アミノ酸長、あるいは少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１５０アミ
ノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸
長、又はそれ以上である。

ここに定義されるＰＲＯポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(％)ア
ミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要
ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯ
ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして
定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、
当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNAS
TAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することによ
り達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメン
トを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための
適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ
酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供され
ている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コ
ンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコ
ードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米
国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウス
サンフランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表１に提供され
たソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オ
ペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標） V4.0Dでの使用のために
コンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され
変動しない。

アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与え
られたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えら
れたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含
む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによっ
て同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数で
ある。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％ア
ミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解される
であろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ」が対象
となる仮説的ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象とな
る「比較」タンパク質が比較されているアミノ酸配列を表し、そして「Ｘ」、「Ｙ」及び
「Ｚ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表２及び３は、「比較タンパク質」
と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同
一性の計算方法を示す。

特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配
列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性
値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschulら, Methods in Enzymology 266: 4
60-480(1996)）を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初
期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定
する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾
値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST2が用いられた場合
には、、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列
を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列
（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であって
もよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、
（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例え
ば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持って
いるアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象
である比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象であるＰＲＯポリペプチドのアミ
ノ酸配列である。

また、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic
Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プ
ログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国
国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つか
の検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、
unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ
-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ
＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。

アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、
与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与
えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又
は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントに
よって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基
数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する
％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解さ
れるであろう。

「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」とは、下記に定義され
るように、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天
然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列
ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＰＲＯ
ポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の
任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくはあ
るいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同
一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核
酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８
６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なく
とも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるい
は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性
、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配
列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％
の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも
約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あ
るいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド
配列を含まない。

通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは
少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは
少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、ある
いは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、
あるいは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２７０ヌクレオチド
長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオ
チド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌク
レオチド長、又はそれ以上である。

ここで同定されるＰＲＯコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は
、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、
ＰＲＯ配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定
義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者
の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフ
トウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可
能である。ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用
の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラALIGN-2を使用す
ることによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社に
よって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所,ワシントン D.C.
，20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録され
ている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウスサンフランシスコ, カリフォルニアから好
適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。
ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタ
ルUNIX（登録商標） V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメー
タは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。

核酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核
酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列
Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列
Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによっ
て同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核
酸配列Ｃの長さがアミノ酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性
は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を
用いた％核酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」が対象となる仮説的ＰＲ
Ｏコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が
比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮説
的アミノ酸残基を表し、表４及び５が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−Ｄ
ＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。

特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示した
ようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核
酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschulら, Methods in Enzym
ology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU-BLAST-2検索
パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは
以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１
２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST-2が
用いられた場合、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核
酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配
列と、対象とする比較核酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子
が比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によ
って決定した一致する同一核酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドコード
化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂ
に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでな
るポリペプチド」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配
列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。

また、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschulら, Nucleic Aci
ds Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログ
ラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立
衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検
索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unma
sk＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値
＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２
５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。

核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられ
た核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列
Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列
Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントに
よって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である
。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性
は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。

他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチド
をコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示す
る全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする
核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコード
されるものであってもよい。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用すると
きは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意
味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型
的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様
溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシ
ークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ
酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染
色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される
。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分
が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、
通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。

「単離された」ＰＲＯポリペプチドコード化核酸は、同定され、ＰＲＯポリペプチドをコ
ードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された
核酸分子である。単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される
形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核
酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子とは区別される
。しかし、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然
細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯポリペプチドを通常発現する細胞に含ま
れるＰＲＯポリペプチド核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード
配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配
列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。
真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用する
ことが知られている。

核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば
、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパ
ク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；
プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用
可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位
置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合して
いる」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて
読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要
はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が
存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリ
ンカーが使用される。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-ＰＲＯポリペ
プチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピ
トープ特異性を持つ抗-ＰＲＯ抗体組成物、一本鎖抗-ＰＲＯ抗体、及び抗-ＰＲＯ抗体の
断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語
は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然
に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。

ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的に
プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが
長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低
くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低
い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブと
ハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用でき
る相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが
、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリダイ
ゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubelら, Current Protocols in Mo
lecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。

ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イ
オン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００
１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）
ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（
ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％の
ポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５
０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃にお
ける５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸
ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナト
リウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％Ｓ
ＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウ
ム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃に
おけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定さ
れる。

「中程度の緊縮性条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Ne
w York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮
性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％
ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０
ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ
７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断
サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中
３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長な
どの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを
認識する。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合
したＰＲＯポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを
指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬
によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは
対象とするＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプ
チドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独
特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約
８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。

ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）
の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には
、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外であ
る（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含
む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリ
ガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定
常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ
（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブ
リンから得ることができる。
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチド
の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯの形態を意味し、「生物学的」活性
とは、天然又は天然発生ＰＲＯによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であ
って、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を
除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピ
トープに対して抗体を生成する能力を意味する。

「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリ
ペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニ
スト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生
物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特
に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又
はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。ＰＲＯポリペプチドのアゴ
ニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯポリペプチドを候補アンタゴニスト又は
アゴニストと接触させ、ＰＲＯポリペプチドに通常は関連している１つ又は複数の生物学
的活性の変化を測定することを含みうる。

ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し
、患者は標的とする病理学的状態又はしっかんを防止又は低下（減少）させられる。治療
が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が
防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果
（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的
になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又
はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類
に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
１つ又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での
連続した投与を含む。

ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み
、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である
。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容
されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコル
ビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例え
ば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニル
ピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリ
シン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化
物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリ
ウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商品名)、
ポリエチレングリコール（PEG）、及びPLURONICS(商品名)を含む。

「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含
む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；ダイアボディ
(diabodies)；直鎖状抗体（Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本
鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、
その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」
断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）_２断片を生じ、それは２つの抗原結合部
位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密
接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置にお
いて各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌに量体の表面に抗原結合部位を
決定する。正しくは、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしなが
ら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分
）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。

またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む
。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメ
インのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ’断片と相違す
る。ここで、Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持
つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され
、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインの
アミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に
分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに
分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及
びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びIｇＡ２に分類される。

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含む抗体断片
を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペ
プチドは、ｓＦｖが抗原結合とって望ましい構造の形成を可能にする、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメ
イン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology
of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New
York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し
、その断片は同じポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ）内で軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に結合し
た重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎ
るリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成し
て二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ
９３／１１１６１；及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (19
93)により十分に記載されている。

「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたもの
である。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質
であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好
ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体
、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使
用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充
分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あ
るいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体に
は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイ
ツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工
程により調製される。
「特異的に結合する」抗体、又は特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピト
ープへ特異的な抗体とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結
合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するもので
ある。

「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直
接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身
検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能
な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する
。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、
多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコー
ル及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固
相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばア
フィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特
許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞
であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である
。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
ここで開示されたポリペプチドの「有効量」、或いはそのアゴニスト又はアンタゴニスト
とは、特別に言及された目的を実行するために十分な量のことである。「有効量」とは、
言及された目的に関連して、経験的及び常套的方法によって決定することができる。

ＩＩ. 本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定
され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、
種々のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウ
ンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての
与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記して
おく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸
分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯの定義に含まれるさらなる天然相同体
及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ／番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。
これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託さ
れたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ
酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯ
ポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最
も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。

Ｂ．ＰＲＯポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると
考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導
入することにより、あるいは所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる
。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミ
ノ酸変化がＰＲＯポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。

天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの種々のドメインにおける変
異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変
異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配
列ＰＲＯと比較してＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯポリペプチドを
コードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、
変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯポリペプチドの１つ又は複数のドメインの任意
の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与える
ことなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯポリペプチドの配列を相同性の知
られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化
を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造
及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即
ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１か
ら５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸
の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するイン
ビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。

ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タン
パク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いて
いてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではない
アミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片
は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって
決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理すること
により、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰ
ＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
り、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮ
Ａ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマー
で用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯポリ
ペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表６に示す。
このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた
又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物が
スクリーニングされる。

ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド
骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）
側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することに
より達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができ
る：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。

非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とする
であろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（
非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング
、及びＰＣＲ突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら,
Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34: 3
15 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA
, 317: 415 (1986)］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知
られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ変異体ＤＮＡを作成することもで
きる。

また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸
分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のア
ミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを
含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくい
ので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWe
lls, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸で
あるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られ
ることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. M
ol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソ
テリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。

Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の１
つの型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯポリペプチドの選択
された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである
。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-
ＰＲＯ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常
用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グ
ルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸
とのエステル、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシ
ンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オ
クタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピ
オイミダート等の試薬を含む。

他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパ
ルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニ
ル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-ア
ミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W
.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化
、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチ
ドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは
、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（
存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の
削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない１又は複数のグリコシ
ル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及
び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。

ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。
この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ（Ｏ-結
合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列
は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成
させることを通して変更されてもよい。
ＰＲＯポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペ
プチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例
えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ８７／０５３３０、及びAplin及びWriston
, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。

ＰＲＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいは
グルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によ
ってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば
、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal.
Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵
素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種
々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリぺプチドの、種々の非タンパク
質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオ
キシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号
；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４
，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合し
たＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。

一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープ
を提供するタグポリペプチドとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、
一般的にはＰＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰ
ＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用い
て検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタ
グに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯポリペ
プチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体は
この分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-his）又はポリ−ヒ
スチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２Ｃ
Ａ５［Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する
８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evanら, Molecular and Cell
ular Biology, 5:3610-3616(1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）
タグ及びその抗体［Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。
他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210(198
8)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinら, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チュ
ーブリンエピトープペプチド［Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］
；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87:6393-6397(1990)］を含む。

それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの
特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも
呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合
体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの
可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免
疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１
、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６
月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。

Ｄ．ＰＲＯの調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞
を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく
知られている他の方法を用いてＰＲＯを調製することができると考えられる。例えば、Ｐ
ＲＯ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい
［例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サンフラ
ンシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (196
3)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成
は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスターシティー,
カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯの種々の部分は
、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯを生産
してもよい。

１．ＰＲＯをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯをコードするＤＮＡは、ＰＲＯｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで
発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従
って、ヒトＰＲＯＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤ
ＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯ-コード化遺伝子は、ゲノムラ
イブラリから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同
定するために設計されたプローブ(ＰＲＯに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基
のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃ
ＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記
載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯポリペプチド
をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,
上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, 1995)］。

下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブ
として選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう
充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラ
リ内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていること
が好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、^３２Ｐ標識されたＡＴ
Ｐのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性
及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら，に示されて
いる。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbankら，の公
共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知
の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に
渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた
、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使
用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物
質を検出する上掲のSambrookら，に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用
して選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られ
る。

２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移
入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコー
ドする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、
例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。
一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ma
mmalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及
びSambrookら, 上掲に見出すことができる。

原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ_２、ＣａＰＯ
_４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿
主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前
掲のSambrookら，に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポ
レーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファ
シエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開のＷ
Ｏ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる
。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology
, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質
転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への
形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、
ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロ
ポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を
用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換する
ための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及
び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。

ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は
、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するもので
はないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸
内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ
２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌
株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である
。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エ
ルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例
えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans
) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルススブチルス(B. subtilis)及びバチルスリ
チェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６
，７１０に記載されたバチルスリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑
膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示で
ある。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特
に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素
を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子にお
ける遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝
子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３を
有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｒｔ３ｐｈｏＡＥ１５
（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｄｅｇＰｏｍｐＴｋａｎ^rを有する大腸菌Ｗ３１１０株２
７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡＥ１５
(ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９ｄｅｇＰｏｍｐＴｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎ^rを有する大腸
菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である
大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日
発行米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大
腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリ
メラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯポリペプチドコード
化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィ
シアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プ
ロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １
９８５年５月２日発行のＥＰ１３９，３８３）；クルベロミセス宿主(Kluveromyces host
s)（米国特許第４，９４３，５２９号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）
、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt
ら, J. Bacteriol.154(2): 737-742 [1983]）、クルベロミセス・フラギリス(K. fragili
s)（ＡＴＣＣ１２，４２４）、クルベロミセスブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ
１６，０４５）、クルベロミセスウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４,１７８
）、クルベロミセスワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６，５００）、クルベロミセスド
ロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６，９０６； Van den Bergら, Bio/Te
chnology, 8: 135 (1990)）、クルベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及び
クルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（ＥＰ４０２
，２２６）；ピチア・パストリス(Pichia pastoris)（ＥＰ１８３，０７０； Sreekrish
naら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(T
richoderma reesia)（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ（Caseら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えば
シュワニオマイセスオクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０
月３１日発行のＥＰ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシ
リウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日発行のＷＯ９１／０
０３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルスニダランス（Ballanceら,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-22
1 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペ
ルギルスニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好
ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られな
いが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サ
ッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属か
ら選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種
のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載され
ている。

グリコシル化ＰＲＯの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物
細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植
物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル
腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養
での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (197
7)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Repro
d., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (Ｗ１３８，ＡＴＣＣＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (
ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５); 及びマウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴ
ＣＣＣＣＬ５１)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。

３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニ
ング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクタ
ーが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子
、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベク
ターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌ
クレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるもの
ではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子
、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１
つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション
技術を用いる。

ＰＲＯポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配
列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他
のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に
、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ-コード化ＤＮ
Ａの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、
ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナ
ル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリー
ダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(K
luyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載さ
れている)、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンス（C.albicans)グルコ
アミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９)、又は１９９０年１１
月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳
動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポ
リペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分
泌に使用してもよい。

発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクタ
ーの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルス
に対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグ
ラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス
開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞にお
けるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子
を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあ
るいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求
性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのよう
な、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのよう
にＰＲＯ-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるもので
ある。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaubらにより Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦ
Ｒ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母
プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(
1979)；Kingsmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒ
ｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプト
ファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jo
nes, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ-コード化核酸配列に作用可能に結合し
、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される
好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-
ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Changら, Nature, 275:615 (1978)； Goed
delら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プ
ロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイ
ブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer ら, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯポリペプチ
ドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。

酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキ
ナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess
ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、
例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、
ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメ
ラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメ
ラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する
誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォ
スファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド
-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素の
プロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥ
Ｐ７３，６５７に更に記載されている。

哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯポリペプチド転写は、例えば、ポリオ
ーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０
４)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィル
ス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(
ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモ
ーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロ
モーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適
合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常
は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス
作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グ
ロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしなが
ら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例として
は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウ
ィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及び
アデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード化配列の５’又
は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位
に位置している。

また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来
の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配
列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’
、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯポリペプチドをコー
ドするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメ
ントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法
、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Natur
e, 281:40-46 (1979)；ＥＰ１１７，０６０；及びＥＰ１１７，０５８に記載されている
。

４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプロ
ーブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザ
ンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブ
ロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試
料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮ
Ａハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識すること
ができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することが
でき、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその
二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例え
ば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測
定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、
モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。
簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ
配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯＤＮＡに融合し特異的抗体エピ
トープをコードする外因性配列に対して調製され得る。

５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜
結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて
膜から引き離すことができる。ＰＲＯポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解
サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段
によって破壊することができる。
ＰＲＯポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望まし
い。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラム
での分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡ
Ｅによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモ
ニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除
くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結
合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methode
s in Enzymology, 182(1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practic
e, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いる
ことができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特
定のＰＲＯの性質に依存する。

Ｅ．ＰＲＯの用途
ＰＲＯをコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリダイゼーションプローブ
としての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、
及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲ
Ｏ核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯポリペプチドの調製に有用である。

全長天然配列ＰＲＯ遺伝子又はその一部は、全長ＰＲＯｃＤＮＡの単離又はここに開示し
たＰＲＯ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯの天然発
生変異体又は他の種からのＰＲＯをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ
用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長
さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的
に全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の
実験をすることなく、天然配列ＰＲＯのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロン
を含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯポリペプチド
遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプロ
ーブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、^３２Ｐ又は^３５Ｓ等の
放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアル
カリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯポリ
ペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバ
ーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーショ
ン技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。

本出願で開示する任意のＥＳＴはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることが
できる。
ＰＲＯ核酸の他の有用な断片は、標的ＰＲＯｍＲＮＡ（センス）又はＰＲＯＤＮＡ（ア
ンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むア
ンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレ
オチドは、本発明によると、ＰＲＯＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断
片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチ
ドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又は
センスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res.
48: 2659: 1988）及び van der Krolら,（BioTechniques 6: 958, 1988）に記載されてい
る。

アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をも
たらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一
つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、ＰＲＯタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス
又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、Ｗ
Ｏ９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのよ
うな糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレ
オチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド
配列に結合できる配列特異性は保持している。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ９０／１００４８に記載さ
れているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を
向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む
。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチ
センスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標
的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。

アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ_４-媒介ＤＮＡ形質移
入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バ
ーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導
入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレ
トロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビ
ボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、こ
れらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-
ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃ
と命名されたダブルコピーベクター（ＷＯ９０／１３６４１参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に記載され
ているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入して
もよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長
因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ま
しくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレ
セプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合
体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。

あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に記載
されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に
導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましく
は内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は一般に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１
５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、
約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基
長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１０
０塩基長、あるいはそれ以上である。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯコード化配列の同定のた
めの配列のプールを作成することができる。
また、ＰＲＯをコードするヌクレオチド配列は、そのＰＲＯをコードする遺伝子のマッピ
ングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプ
ローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイ
ツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリー
でのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体
の特定領域にマッピングすることができる。

ＰＲＯのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば
、ＰＲＯがレセプターである場合）、ＰＲＯは、そのリガンドを同定するアッセイに用い
ることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤
を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド
又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができ
る。また、レセプターＰＲＯは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニング
アッセイは、天然ＰＲＯ又はＰＲＯのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発
見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高
スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとす
る。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く
知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニン
グアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。

また、ＰＲＯ又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「
ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、これらは治療的に有用な試薬
の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラッ
ト)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝
子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する
細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＰＲＯをコードするｃＤＮ
Ａは、ＰＲＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製す
るために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ＰＲＯをコードするゲノム
ＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマ
ウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており
、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。
典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯ導入遺伝子の導入の標的に
する。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯコード化導入遺伝子のコピーを含むト
ランスジェニック動物はＰＲＯをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために
使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護を
もたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては
、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が
低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。

あるいは、ＰＲＯの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯをコードする変
更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、Ｐ
ＲＯをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＰＲＯ「ノックアウト」動物を作成するた
めに使用できる。例えば、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲ
ＯをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯをコードするゲノムＤ
ＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコー
ドする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化の
フランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換え
ベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクター
は胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内
在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択された［例えば、Liら, Cell, 69:915(199
2)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて
集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells
: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参
照のこと］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノ
ックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準
的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡ
を含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドの欠乏
によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付け
られる。

また、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用
途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ
合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続
的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は
繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは
、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアン
チセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内
濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示され
ている（Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌ
クレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによ
って取り込みを促進するように修飾してもよい。

生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が
培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるか
に応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソ
ーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキ
ストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は
、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパ
ク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzauら, Trends in Biotechnology 11, 205-210(1
993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的
な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤ととも
に提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表
面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク
質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局
在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促
進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wuら, J. Biol.
Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-
3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説
については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。

ここに記載したＰＲＯポリペプチドをタンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用
いてもよく、単離された核酸配列を、これらのマーカーを組み換え発現に用いてもよい。
ここに記載したＰＲＯポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定
に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可
能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要である。本発明の各ＰＲＯ核酸分子
は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のＰＲＯポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明の
ＰＲＯポリペプチドは、好ましくは同じ型の正常組織に比較して疾患性組織において、一
方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＰＲＯ核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分
析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。

ここに記載したＰＲＯポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＰＲＯポリペ
プチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これに
より、このＰＲＯ生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍
結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又
は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharm
aceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980])、調製され保管される。許
容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無
毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化
剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロ
ブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン
、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキ
ストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、マンニトール又は
ソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(商品名)、PLU
RONICS(商品名)又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。

インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び
再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、
皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣
内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化す
る。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は
、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の
種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Perga
mon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of
interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。

ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる
場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋ
ｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日で
ある。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，
６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる
製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織
を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であるこ
とが予想される。
ＰＲＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持
つ製剤でＰＲＯポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのマイクロ
カプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、
ヒト成長ホルモン（rhGH）、インターフェロン-（rhIFN-）、インターロイキン-２、及び
MN rgp120で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasu
da, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (199
0); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polya
ctide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvan
t Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p.439-462; Ｗ
Ｏ９７／０３６９２，ＷＯ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５
，５６４，０１０号。

これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマー
を用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解
生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、この
ポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis,
「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. C
hasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marce
l Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
本発明は、ＰＲＯポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はＰＲＯポリペプチドの効果
を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含
する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコー
ドされるＰＲＯポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペ
プチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計され
る。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したもの
にする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む
。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ
、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の
方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸に
コードされるＰＲＯポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下
及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。

結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は
反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされ
るＰＲＯポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイ
タープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＰＲＯポリペプチドの
溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯポリペプ
チドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させる
ために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に
、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される
。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合
体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化さ
れた標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たな
い場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によ
って検出できる。

候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯポリペプ
チに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作
用を検出するために良く知られている方法によってアッセイすることができる。そのよう
なアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精
製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及び
Nathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように
、Fields及び共同研究者ら［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chi
enら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母ベースの遺
伝子系を用いることによってモニターすることができる。酵母ＧＡＬ４などの多くの転写
活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメ
インとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前出の文献に記載された
酵母発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用し、
並びに２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮ
Ａ結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合
している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下
での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する
。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産
性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパ
ク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clo
ntechから商業的に入手可能である。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含ま
れるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残
基の特定へ拡大適用することができる。

ここで同定されたＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相
互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常、反応混合物は、遺伝子産物と
細胞外又は細胞内成分を、これら２つの生成物の相互作用及び結合が可能な条件下及び時
間に渡って含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、
反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混
合物に添加してポジティブコトロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物
と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターされる。試験化
合物を含有する反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、試験化
合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。

アンタゴニストをアッセイするためには、特定の活性についてスクリーニングされる化合
物とともにＰＲＯポリペプチドを細胞へ添加してもよく、ＰＲＯポリペプチド存在下にお
ける対象活性を阻害する化合物の能力は、化合物がＰＲＯポリペプチドのアンタゴニスト
であることを示す。あるいは、ＰＲＯポリペプチドと膜結合ＰＲＯポリペプチドレセプタ
ー又は組換えレセプターを有する潜在的アンタゴニストを競合的阻害アッセイに適した条
件下で結合させることによって、アンタゴニストを検出してもよい。放射活性などでＰＲ
Ｏポリペプチドを標識することが可能であり、潜在的アンタゴニストの有効性を判断する
ためにレセプターに結合したＰＲＯポリペプチドの数を利用することができる。レセプタ
ーをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及び
FACSソートによって同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): 第５
章(1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポ
リペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリ
がプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移
入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したＰＲＯポリペプ
チドで暴露する。このＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナー
ゼの認識部位の封入を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、
スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブ
プール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的
に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。

レセプター同定の代替的方法として、標識下ＰＲＯポリペプチドをレセプター分子を発現
する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで溶
解させ、Ｘ線フィルムへ暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片
へ分解し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得た
アミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをス
クリーニングする縮重オリゴヌクレオチドプローブの一組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候
補化合物の存在下で標識ＰＲＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この
相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯポリペプチドとの融
合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクロ
ーナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は
断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あ
るいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認
識するが効果を与えず、従ってＰＲＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯポリ
ペプチドの変異形態であってもよい。

他の潜在的なＰＲＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製され
たアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ
は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡ
の翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又
はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの
方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば
、ここでの成熟ＰＲＯポリペプチドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列の５’コ
ード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計
に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であ
るように設計され（トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Co
oneyら, Science, 241: 456 (1988); Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照）、そ
れによりＰＲＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチ
ドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeox
ynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (SRS Press: Boca Raton,
FL, 1988)）。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又は
ＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯポリペプチドの生産を阻害することもできる。ア
ンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列
の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい
。

潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成
長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯポリペプチドの正常な生物学的
活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又は
ペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を
含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは
、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断
により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定
できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ
公報、番号ＷＯ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。

転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌク
レオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を
介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の
鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例
えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ９７／３３５５１、上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの１つ又は複数の任意のもの
により及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる
。
また、ここで開示されている分子の診断的及び治療的利用は、下記に開示及び記載のポジ
ティブ機能アッセイヒットに基づいている。

Ｆ．抗-ＰＲＯ抗体
本発明は、さらに抗-ＰＲＯ抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクロー
ナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。

１．ポリクローナル抗体
抗-ＰＲＯ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に
知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するの
であればアジュバントを、１つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型
的には、免疫剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に
注射する。免疫剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を
免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用
である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペ
ットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビ
ターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及び
MPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が
含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。

２．モノクローナル抗体
あるいは、抗-ＰＲＯ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は
、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ
法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター
又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に
結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球を
インビトロで免疫化することもできる。

免疫剤は、典型的には対象とするＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一
般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬｓ」)が使用され、ある
いは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。
次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と
融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principle
s and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、
形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通
常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましく
は、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培
地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典
型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物
質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。

好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高
レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好まし
い不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴ
のSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生
成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor,
J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniq
ues and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯに対するモノクローナル抗体
の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクロ
ーナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測
定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッ
セイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMuns
on及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によっ
て測定することができる。

所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニン
グし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当
な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含ま
れる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させ
ることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロ
ース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はア
フィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又
は腹水液から単離又は精製される。

また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号
に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードす
るＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺
伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列
決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給
源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが
宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは
免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞
内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス
配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特
許第４，８１６，５６７号；Morrisonら, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免
疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾す
ることができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメ
インに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき
、キメラ性二価抗体を生成する。

抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる
。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般
的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連す
るシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特に
Ｆａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。

３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス
)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例え
ばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であ
って、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピ
エントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特
異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換された
ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンの
Ｆｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化
抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出
されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての
ＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領
域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２
つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領
域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［
Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及
びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。

非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には
非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、
しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト
化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換すること
によりウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Rie
chmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)
］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換するこ
とにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインよ
り実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第
４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基
及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置
換されたヒト抗体である。

また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 2
27:381(1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:381 (1991)］を含むこの分野で知られた種
々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモ
ノクローナル抗体の調製に利用することができる［Coleら, Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-9
5(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例
えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入するこ
とにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリ
ーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産
が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５
４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３
３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Marksら, Bio/Technolog
y 10, 779-783 (1992); Lonbergら, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368
, 812-13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger,
Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13
65-93 (1995)に記載されている。

また、抗体は、上記に記載のような既知の選択及び／又は突然変異誘発法を利用して親和
的に成熟している。好ましい親和性成熟抗体は、５倍、より好ましくは１０倍、さらによ
り好ましくは２０又は３０倍も成熟抗体の調製の元である出発抗体（一般的には、マウス
、ヒト化又はヒト）より高い親和性を有する。

４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクロー
ナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合においては、結合特
異性の一方はＰＲＯに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパ
ク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特
異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／
軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫
グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドロー
マ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重
特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によ
って通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、
及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。

所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常
ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３
領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融
合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望まし
い。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽
鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗
体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 1
21:210(1986)を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作し
て組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界
面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分
子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又
はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キ
ャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き
換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような
不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される
。

二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ’)_２二重特異性抗体）とし
て調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている
。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Sci
ence, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ’)_２断片を産生
する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存
在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生
されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａ
ｂ’-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’-チオ
ールに再転換し、他のＦａｂ’-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形
成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することがで
きる。
大腸菌からＦａｂ’フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗
体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒ
ト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ’)_２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’フラグメ
ントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体
を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂ
Ｂ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障
害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。

組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述
されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Ko
stelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロ
イシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合さ
せる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗
体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用する
ことができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記
述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供し
た。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカー
により軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)に重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を結合してなる。従って、一つ
の断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは他の断片の相補的Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインと強制的に対形
成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二
重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152
:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt
ら J.Immunol. 147:60(1991)。

例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯポリペプチドの２つの異なるエピト
ープに結合しうる。あるいは、抗-ＰＲＯポリペプチドのアームは、特定のＰＲＯポリペ
プチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例え
ばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲI(Ｃ
Ｄ６４)、ＦｃγＲII(ＣＤ３２)及びＦｃγＲIII(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対す
るＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯ
ポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これら
の抗体はＰＲＯ結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA
、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。興味の対象となる他の二重特異性抗体はＰ
ＲＯポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。

５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２
つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に
対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の
治療のために［ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］提案
されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の
方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィ
ド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成す
ることができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-
４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６７，９８０号に開示さ
れたものが含まれる。

６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を
向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、
この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成され
た同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗
体−依存性細胞性細胞毒性（ADCC）を有する可能性がある。Caronら, J. Exp. Med. 176:
1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向
上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolffら, Cancer research 53: 2560-2565 (
1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗
体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を
向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参
照。

７．免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性
毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュ
ゲート）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵
素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑
膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アル
ファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(
dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PA
PI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビ
ター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonari
a oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリク
トシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリ
コテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射
性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９
^０Ｙ及び^１８６Ｒｅが含まれる。

抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ
-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラ
ン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートHCL等）、活性
エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、
ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニ
ウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネ
ート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジ
フルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は
、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる
。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五
酢酸（MX-DTPA）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である
。ＷＯ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレ
プトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次い
で清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌ
クレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。

８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソ
ームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwangら, Proc. n
atl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４
，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上し
た循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホス
ファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成さ
れる。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリ
ポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257
: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに
抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含
される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。

９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したス
クリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬
組成物の形態で投与することができる。
ＰＲＯポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める
抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞
に導入するのために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメ
インに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づい
て、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このよう
なペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、
Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。ここでの製剤は、
治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を
及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は
、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には
、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。

また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製された
マイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカ
プセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例
えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル
）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remingto
n's Pharmaceutical Science, 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した
濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリ
マーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又
はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（
例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、
ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-
グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール
酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸
コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-
グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種
のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体
内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その
結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、
含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ
−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はス
ルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の
付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。

Ｇ．抗-ＰＲＯ抗体の用途
本発明の抗-ＰＲＯ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-ＰＲＯ抗体は、ＰＲＯ
の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競
合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われ
る免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Pre
ss, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用
される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部
位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可
能な部位は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ又は^１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセ
インイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あ
るいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキ
シダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知
られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature 144:945 (1962)；Davidら, Bi
ochemistry, 13: 1014 (1974)；Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981)；及びNygre
n, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。

また、抗-ＰＲＯ抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯのアフィニティー
精製にも有用である。この方法においては、ＰＲＯに対する抗体を、当該分野でよく知ら
れている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する
。次に、固定化された抗体を精製するＰＲＯを含む試料と接触させた後、固定化された抗
体に結合したＰＲＯ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗
浄する。最後に、ＰＲＯを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定
することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。

実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い
使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている
細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニ
アである。

実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ド
メイン相同性スクリーニング
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイ
ン（ＥＣＤ）配列（必要ならな、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検
索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、Dayhoff、GenBank）
及び独自に開発したデータベース（例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals
、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2（Altschu
lら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ＥＣＤタンパク質配列の
ＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、
Blastスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap
」（Phil Green, University of Washington，Seattle，WA）で集団化してコンセンサス
ＤＮＡ配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたＥＳ
Ｔ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮ
Ａ配列を、しばしば（全てではない）BLAST又はBLAST-2及びphrapの繰り返しサイクルを
用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り
伸長させた。

上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し
、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯポ
リペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用し
た。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であ
り、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プロー
ブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１−
１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローン
について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、
Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対
でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリ
ゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローン
を単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego，CAな
どの市販試薬を用いる標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、NotI部位を有するオ
リゴｄＴでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断
してゲル電気泳動で適切なサイズに分類し、そして適合するクローニングベクター（ｐＲ
ＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはSfiI部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holm
esら, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）の唯一のXhoI及びNotI部位において、所定
の方向でクローニングした。

実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリの調製
Invitrogen, San Diego, CAの試薬及びプロトコールを用いて、対象とするヒト組織から
ｍＲＮＡを単離した（Fast Track 2）。このＲＮＡを、Life Technologies, Gaithersbur
g, MD(Super Script Plasmid system)の試薬及びプロトコールを利用するベクターｐＲＫ
５ＤでのオリゴｄＴプライム化ｃＤＮＡライブラリの生成に用いた。この方法においては
、二本鎖ｃＤＮＡを１０００ｂｐを越えるサイズに分類し、SalI／NotIリンカー化ｃＤＮ
ＡをXhoI／NotI切断化ベクターへクローニングした。ｐＲＫ５Ｄは、XhiI／NotIｃＤＮＡ
クローニング部位の前に位置するSfiI制限酵素部位が後に続くsp6転写開始部位を有する
クローニングベクターである。

２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を好ましく表現するために、二次ｃＤＮＡライブラリを
作成した。Sp6ＲＮＡを（上記の）一次ライブラリから生成し、このＲＮＡを、Life Tech
nologies (上で参照したSuper Script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを利
用するベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０でのランダムプライム化ｃＤＮＡライブラリの生成
に用いた。この方法においては、二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００ｂｐへサイズ分類し
、平滑末端でNotIアダプターに結合させ、SfiI部位で切断し、そしてSfiI／NotI切断化ベ
クターへクローニングした。ｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に
酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、並びにアルコールデヒドロゲナーゼ転写終
結区が後に続くマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）をクローニン
グ部位の後に有するクローニングベクターである。従って、アミラーゼ配列でフレームに
融合するこのベクターへクローニングされたｃＤＮＡは、適切に形質移入された酵母コロ
ニーからのアミラーゼの分泌を導く。

３．形質転換及び検出
上記のパラグラフ２に記載したライブラリのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコ
ンピテントＤＨ１０Ｂ細菌（Life Technoligies、２０ｍｌ）を添加した。細菌及びベク
ターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、ＳＯＣ培
地（Life Technologies、１ｍｌ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベ
ートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに
蒔き、１６時間インキュベートした（３７℃）。ポジティブコロニーをプレートからこす
り取り、この細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｓＣｌ-勾配を用いてＤＮＡを単
離した。次に、、以下の酵母プロトコールを精製ＤＮＡへ適用した。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターで
の形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母
コロニーからの直接的な挿入物のＰＣＲ増幅、並びに配列決定及びさらなる分析のための
ＤＮＡの精製。

用いた酵母菌株はＨＤ５６-５Ａ（ＡＴＣＣ−９０７８５）であった。この株は以下の遺
伝子型：MATアルファ、ｕｒａ３-５２、ｌｅｕ２-３、ｌｅｕ２-１１２、ｈｉｓ３-１１
、ｈｉｓ３-１５、ＭＡＬ^＋、ＳＵＣ^＋、ＧＡＬ^＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳
後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅ
ｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好まし
い。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌ
クレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例
えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ、ＳＳＡ
１ｐ-４ｐ）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせ
て好まれて用いられる。
形質転換は、Gietzら, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)によって概略が記されたプロ
トコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロ
ス（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Kaiserら, Me
thods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 20
7 (1994)に記載のように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス（５００ｍ
ｌ）中におよそ２ｘ１０^６細胞／ｍｌ（約ＯＤ_６００＝０．１）に希釈し、１ｘ１０^７細
胞／ｍｌ（約ＯＤ^６００＝０．４−０．５）まで再成長させた。

次いで細胞を収穫し、５，０００ｒｐｍで５分間のSorval GS3 ローターのＧＳ３ロータ
ーボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することで形質転換のために調製し
、そして次に５０ｍｌのファルコン管でBeckman GS-6ＫＲ遠心機において３，５００ｒｐ
ｍで再度遠心分離した。その上清を捨て、続いて細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（１０ｍｌ，１０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ７．５，１００ｍＭのＬｉ_２ＯＯＣＣＨ
_３）で洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（２．５ｍｌ）中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞（１００μｌ）を新鮮な変性一本鎖サ
ケ精子ＤＮＡ（Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD）及び形質転換ＤＮＡ（１μｇｖｏ
ｌ．＜１０μｌ）と混合することにより開始した。混合物はボルテックスにより簡単に混
合し、次いで４０％ＰＥＧ／ＴＥ（６００μｌ，４０％のポリエチレングリコール-４０
００, １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，１００ｍＭのＬｉＯＯＣＣＨ_３，
ｐＨ７．５）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、３０℃で撹拌しながら３０分間イン
キュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチュー
ブ内で１２，０００ｒｐｍで５−１０秒間遠心分離し、デカントし、そしてＴＥ（５００
μｌ，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）への再懸濁に次いで
遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（１ｍｌ）中に希釈し、一定分量（２００μｌ）を１
５０ｍｍ成長プレート（ＶＷＲ）に予め調製した選択培地に広げた。

もう１つの方法として、複数の少量反応に代わって、試薬の量はしかるべくスケールアッ
プし、形質転換を１回の大規模反応で実施した。
用いた選択培地は、Kaiserら, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Ｐress
, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているように調製したウラシ
ルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ-Ｕｒａ）であった。形質転換体を３０℃
で２−３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地に赤色デンプンを包含することに
よって実施した。Bielyら, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載された方法に従
って、デンプンを赤色染料（反応性 Red-120, Sigma）に結合させた。結合したデンプン
をＳＣＤ-Ｕｒａ寒天プレートへ最終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）で組み入れ、リン酸カリ
ウムでｐＨ７．０に緩衝化した（最終濃度５０−１００ｍＭ）。
十分に単離されていて同定可能な単一コロニーを得るために、ポジティブコロニーを拾い
、これを新鮮な選択培地（１５０ｍｍプレート）に画線した。アミラーゼ分泌についてポ
ジティブであり、十分に単離されたコロニーの検出は、緩衝化ＳＣＤ-Ｕｒａ寒天への赤
色デンプンの直接組み入れによっておこなった。コロニーのデンプンを分解することでポ
ジティブコロニーの周囲に直接目視できる明瞭なハローを形成する能力によって、ポジテ
ィブコロニーを決定した。

４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合には、その一部を楊枝でひろい、９６ウェルプレー
トで無菌水（３０μｌ）によって希釈した。この時点では、ポジティブコロニーを凍結し
て次の分析のために保存するか、或いは即座に増幅するかのいずれかである。細胞の一定
分量（５μｌ）を、０．５μｌのKlentaq（Clontech, Palo Alto, CA）; ４．０μｌの
１０ｍＭdNTP（Perkin Elmer-Cetus）；２．５μｌのKentaqバッファー(Clontech)；０．
２５μｌの正方向オリゴ１；０．２５μｌの逆方向オリゴ２；１２．５μｌの蒸留水を含
有する２５μｌ容量でのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。
正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'
（配列番号：553）
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT -3'
（配列番号：554）
であった。
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：
ａ．変性 92℃、 5分間
ｂ．次の３サイクル変性 92℃、30秒間
アニール 59℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
ｃ．次の３サイクル変性 92℃、30秒間
アニール 57℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
ｄ．次の２５サイクル変性 92℃、30秒間
アニール 55℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
ｅ．保持 4℃

下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングし
、挿入物が存在しない場合はベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０の３０７ｂｐ領域を増幅する
。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドは、配
列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。従って、空のベクターからのＰＣＲ反応
の全生成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かなり
長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、反応の一定分量（５μｌ）を、上記のSambrook等に記載されているよう
に１％アガロースゲル中でトリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用いたアガロ
ースゲル電気泳動によって検討した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣＲ産物を生じ
るクローンを、９６ Qiaquick PCR 清浄化カラム（Quagen Inc., Chatsworth, CA）での
精製の後にＤＮＡ配列によってさらに分析した。

実施例３：シグナルアルゴリズム分析を用いたｃＤＮＡクローンの単離
ジェネンテク，インク（サウスサンフランシスコ，カリフォルニア）が独自に開発した
配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は個人の（LIFESEQ(登録商
標), Incyte Pharmaceuticals, Inc.，Palo Alto, CA）データベースから集団化及び組み
立てられたＥＳＴ断片だけでなくＥＳＴｓへ適用することで、種々のポリペプチド-コー
ド化核酸配列を同定した。このシグナル配列アルゴリズムは、検討中の配列又は配列断片
の５’末端にある第１、あるいは第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌ
クレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオ
チドには、停止コドンを持たない少なくとも３５の明白なアミノ酸がコードされていなけ
ればならない。第１のＡＴＧが必須のアミノ酸を有する場合、第２のものは検討しない。
何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。ＥＳＴ配列が真正のシグナ
ル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミ
ノ酸配列に、分泌シグナルに関連することが知られている７つのセンサー（評価パラメー
タ）の一組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムを利用することで、多くのポリペ
プチド-コード化核酸配列の同定がなされた。

実施例４：ヒトＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例１から３に記載されている技術を用いて、ここに開示されているように、多
くの全長ｃＤＮＡクローンがＰＲＯポリペプチドをコードしているものと同定された。そ
して、これらのｃＤＮＡは、下記の表７示してあるように、ブダペスト条約の条項に従っ
てアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ユニバーシティ・ブル
バード、マナッサス、バージニア２０１１０−２２０９米国(ＡＴＣＣ)へ寄託した。

これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及び
その規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、
寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約
の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手す
ることができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の
米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とす
ることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８
８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長
官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしく
は損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに
同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権
利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。

実施例５：ハイブリダイゼーションプローブとしてのＰＲＯの利用
以下の方法は、ＰＲＯをコードする核酸配列のハイブリダイゼーションプローブとしての
利用を示している。
ここに開示されている全長又は成熟ＰＲＯをコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤ
ＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの同種ＤＮＡ（ＰＲＯの天然発生変異体を
コードするもの等）のスクリーニングのためのプローブとして用いられ得る。
ハイブリダイゼーション及びいずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターの洗浄を、次
の高緊縮性条件下において実施する。放射標識ＰＲＯ誘導プローブのフィルターへのハイ
ブリダイゼーションを、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピ
ロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び
１０％デキストラン硫酸の溶液中において４２℃で２０時間実施する。フィルターの洗浄
は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ水溶液中において４２℃で実施する。
次いで、全長天然配列をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分
野で知られている標準的技術を用いて同定することができる。

実施例６：大腸菌におけるＰＲＯの発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるＰＲＯの非グリコシル化型の調製を
例証する。
ＤＮＡ配列コード化は選択されたＰＣＲプライマーを利用して最初に増幅される。このプ
ライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まな
ければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例とし
ては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むｐＢＲ３２２(大腸
菌由来；Bolivarら, Gene, 2:95 (1997)を参照のこと)がある。ベクターは制限酵素によ
って消化され、脱リン酸化される。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターにライゲーション
する。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリＨｉｓリー
ダー（最初の６つのSTIIコドン、ポリHisリーダー、及びエンテロキナーゼ切断部位を含
む）、ＰＲＯコード領域、ラムダ転写集結因子及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含
む。

次いで、Sambrookら, 上記に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換
するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をＬＢ部レート上でのそ
の成長能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡ
を単離し、それを制限分析及びＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたＬＢブロスのような液体培地で一晩かけて
成長させることができる。この一晩の培養を、次により大きなスケールでの培養を播種す
るために使用してもよい。そして、細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に
発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。
遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶
化でき、次いで、この溶解したＰＲＯタンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にす
る条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。

以下の手法を用いて、ポリ−Ｈｉｓタグ形態でＰＲＯを大腸菌で発現させてもよい。ＰＲ
ＯをコードするＤＮＡを、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。このプラ
イマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的
で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼで
のタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、ＰＣＲ増幅されたポリ
-Hisタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rp
oHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、
最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で、３０℃で振盪しながら３−
５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培養液をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇ
の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ_２Ｏ、１．０７ｇのＫＣ
ｌ、５．３６ｇのDifco酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのSheffield hycase SF
、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７
ｍMのＭｇＳＯ_４の混合で調製）中にて５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪によって約
２０−３０時間成長させた。ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより発現を確認するために試料を取り出
し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。精製及びリフォールディン
グ（再折りたたみ）まで、細胞ペレットを凍結させた。

０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジ
ン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させた。固体
硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０
．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が
亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をBeckman Ultracentrifuge
中で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（６
Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、透明にするた
めに０．２２ミクロンフィルターを通して濾過する。透明抽出物を、金属キレートカラム
バッファーで平衡化させた５ｍｌのQiagen Ｎｉ-ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷した。
カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、
ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで
溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃
度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸
収により見積もった。

試料を２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭの
システイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッ
ファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。リフォールディング
容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択
した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールデ
ィング反応はＴＦＡを採取濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた
。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し
、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再生したタンパク質を、Poros R1／
H逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配
での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした
。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最もコンパクトであり
、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最
低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤
って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドト
キシンも除去する。

所望の再生したＰＲＯポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い
気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡
化したG25 Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの
塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのHepes、ｐＨ６．８に調製した
。
ここで開示された多くのＰＲＯポリペプチドは、上記の方法によって成功裏に発現した。

実施例７：哺乳動物細胞におけるＰＲＯの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態
のＰＲＯの調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開のＥＰ３０７，２４７
参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に
結合させ、上記のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯＤＮ
Ａを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５-ＰＲＯと呼ばれる。

一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞
（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を
添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１
０μｇのｐＲＫ５-ＰＲＯＤＮＡを約１μgのＶＡＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmap
payaら, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１
ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ_２に溶解させた。この混合物に、滴状の５００μ
ｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＮａＰ
Ｏ_４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加
えて３７℃で約４時間定着させた。培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロール
を３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、
細胞を約５日間インキュベートした。

形質移入の約２４時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ^３５Ｓ−
システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ^３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換した。１２時間
のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤ
Ｓゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択され
た時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュ
ベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。

これに換わる技術において、ＰＲＯは、Somparyacら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575
(1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２
９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５-ＰＲ
ＯＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢ
Ｓで洗浄した。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートし
た。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μｇ
／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラ
スコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除
去した。次いで発現されたＰＲＯを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグ
ラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-ＰＲＯは
、ＣａＰＯ_４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移
入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（
のみ）又は^３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲ
Ｏポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、
培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲ
Ｏを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。

また、エピトープタグＰＲＯは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯはｐ
ＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施し
てバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ
枠に融合できる。ポリ-hisタグＰＲＯ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のための
ＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後
に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認す
るために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-hisタグＰＲＯを含む培
地は、次いで濃縮し、Ｎｉ^２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択され
た方法により精製できる。
またＰＲＯは、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定な発現方法
によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞ
れのタンパク質の可溶化形態のコード配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒン
ジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアド
ヘシン）、又はポリ-Hisタグ形態として発現された。

ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ausubelら, Current Protocols of Molecular
Biology, Unit 3.26, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用い
てＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮ
Ａの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるよう
に作成される。ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記
載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレート
レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用
いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にす
る。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商
標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約１千
万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上記のLucas等に記載されているように成長させた
。約３ｘ１０^−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結さ
せた。

プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。
内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離
した。上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．
２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地
を含む１００ｍＬスピナーに分ける。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地を満たし
た２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、２５０
ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０^５細胞／ｍＬで播種した。細胞
培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ
培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２
２，４６９号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０^６細
胞／ｍＬで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプ
ルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に
変え、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５
％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）を
とった。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７
０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターを通して濾過
した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。

ポリ-Hisタグ作成物について、タンパク質はＮｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）を用いて精製
した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、
０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのHepes，ｐＨ７．４バッフ
ァーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムへ４−５ｍｌ／分の流速によって４℃でポ
ンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５
Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続い
て１０ｍＭのHepes、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール，ｐＨ６．８を含む
貯蔵バッファー中で２５ｍｌのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、−８０℃で
貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を、以下通りに条件培地から精製した。条件培地を
、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテイン
Ａカラム（Pharmacia）へポンプ注入した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄
した後、１００ｍＭのクエン酸，ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌ
の画分を２７５μＬの１Ｍトリスバッファー，ｐＨ９を含む管に回収することにより即座
に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質につ
いて上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエ
ドマン（Edman）分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定により評価した。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。

実施例８：酵母菌でのＰＲＯの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯの細胞内生産又は分泌のための
酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択した
プラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯの細胞内発現を指示する。分泌のため
に、ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモー
ターをコードするＤＮＡ、天然ＰＲＯシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチ
ド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（
必要ならば）ＰＲＯの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる
。

酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択され
た発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降
及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をす
ることができる。
続いて組換えＰＲＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択さ
れたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。
ＰＲＯを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製し
てもよい。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。

実施例９：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯの組換え発現を記載する
。
ＰＲＯコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上
流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-hisタグ及び免疫グロブリンタグ（
ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navagen）などの市販されているプラ
スミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単に
は、ＰＲＯ又はＰＲＯコード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン
をコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列
などが、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プラ
イマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次い
で、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（
Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１
１）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作
成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更な
る増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expre
ssion vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載
されているように実施した。

次に、発現されたポリ-hisタグＰＲＯは、例えばＮｉ^２＋-キレートアフィニティクロマ
トグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1
993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単
には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのHepes，ｐＨ７．９；
１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮ
Ｐ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音
波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ
のＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルタ
ーで濾過した。Ｎｉ^２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積
で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細
胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点である
Ａ_２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク
質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ
、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ_２８０のベースラインに再度到達し
た後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。
１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiage
n）に複合したＮｉ^２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ_１０
-タグＰＲＯを含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロ
テインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施で
きる。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。

実施例１０：ＰＲＯに結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のGo
dingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ、ＰＲＯを含む融合タンパク
質、細胞表面に組換えＰＲＯを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実
験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１
−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰ
Ｌ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, ハミルトン, モンタナ）に乳
化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に
、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マ
ウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＰＲＯ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッ
セイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取
してもよい。

適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＰＲＯ静脈内
注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り
出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番
号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細
胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き
、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングさ
れる。ＰＲＯに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイ
ブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＰＲＯモノクロ
ーナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラス
コ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗
体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行
うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくア
フィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。

実施例１１：特異的抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法に
よって精製できる。例えば、プロ-ＰＲＯポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-Ｐ
ＲＯポリペプチドは、対象とするＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性
クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＰＲＯポリペプ
チド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（
Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいずれかにより免疫血清
から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロ
テインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製され
た免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロース（商品名）（Pharmacia LKB Biotech
nology）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂が
ブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。

このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯポリペプチドを含有する細胞からの
画分を調製することによるＰＲＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は
、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又
は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯ
ポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯポ
リペプチドの好ましい吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッフ
ァー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合を分解する条件
下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオト
ロープ）で溶離され、ＰＲＯポリペプチドが回収される。

実施例１２：薬物スクリーニング
本発明は、ＰＲＯポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術におい
て使用することによる化合物のスクリーニングとって特に有用である。そのような試験に
用いられるＰＲＯポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定さ
れても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリ
ーニングの１つの方法では、ＰＲＯポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に
形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入
細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化
形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば
、ＰＲＯポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。
あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯポリペプチドとその標的細胞との間の複合
体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、ＰＲＯポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意
の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯポリペ
プチド又は断片に接触させ、(i)試薬とＰＲＯポリペプチド又は断片との間の複合体の存
在について、又は(ii)ＰＲＯポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について
、検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯポリペプチド又は断片が
典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＰＲＯポリペプチド又は
断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯポ
リペプチドに結合する又はＰＲＯポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる
。

薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ
化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開
されたＷＯ８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小
型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合
成される。ＰＲＯポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯポリペプチド
と反応して洗浄される。結合したＰＲＯポリペプチドはこの分野で良く知られた方法によ
り検出される。精製したＰＲＯポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用す
るためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕
捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯポリペプチド又はそ
の断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮す
る。この方法において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドで、１つ又は複数の抗原決定基を持
つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。

実施例１３：合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯポリペ
プチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はイ
ンヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯポ
リペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯポリペプチドに機能を促進又は
阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）
。

１つの方法において、ＰＲＯポリペプチド、又はＰＲＯポリペプチド-インヒビター複合
体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２
つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するために
は、ＰＲＯポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ない
が、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモ
デル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似Ｐ
ＲＯポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な
薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示さ
れているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthaudaら,J. Biochem., 113:
742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はア
ンタゴニストとして作用する分子を含む。

また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶
構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をお
くことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に
対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することにより、タンパク質結晶学をバ
イパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類
似物であると予測できる。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドの
バンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファー
マコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のＰＲＯポリペプ
チドが入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列の知識
は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダ
ンスを提供する。

実施例１４：ヒト血液でのＴＮＦ-αの放出を刺激するＰＲＯポリペプチドの同定（アッ
セイ１２８）
このアッセイは、本発明のあるＰＲＯポリペプチドが、ヒト血液におけるＴＮＦ−αの放
出を刺激することを示している。このアッセイでポジティブ（陽性）と検定されたＰＲＯ
ポリペプチドは、他の事例を含めて、ＴＮＦ-αの放出を刺激が所望されている研究目的
、及びＴＮＦ-αの放出の増加が有益である症状の治療上の処置にとって有用である。特
に、５０ｍＭ Hepesバッファー（ｐＨ７．２）で補充した２００μｌのヒト血液を、９６
ウェルテストプレートのウェルへ等分して配する。次いで、各ウェルへは、５０ｍＭ Hep
esバッファーに含まれる試験ＰＲＯポリペプチド（種々の濃度）又は５０ｍＭ Hepesバッ
ファーのみ（ネガティブ（負）のコントロール）のいずれかを３００μｌ添加し、このプ
レートを３７℃で６時間インキュベートした。次に、試料を遠心分離し、各ウェルから５
０μｌの血漿を収集し、ＥＬＩＳＡアッセイによってＴＮＦ-αの存在を試験した。アッ
セイでのポジティブ（陽性）とは、ネガティブ（負）のコントロール試料と比較して、Ｐ
ＲＯポリペプチド処理試料中により多量のＴＮＦ-αがあることである。
以下のＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいてポジティブ（陽性）であった：ＰＲ
Ｏ１９５、ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ２１５、ＰＲＯ２２１、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ２２２、
ＰＲＯ１９８、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２６５、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３４
４、ＰＲＯ３３７、ＰＲＯ３２２、ＰＲＯ１２８６、ＰＲＯ１２７９、ＰＲＯ１３３８及
びＰＲＯ１３４３。

実施例１５：骨格筋のグルコース又はＦＦＡ取り込みに影響を与えるポリペプチドの検出
(アッセイ１０６）
このアッセイは、ＰＲＯポリペプチドが骨格筋のグルコース又はＦＦＡ取り込に影響を及
ぼす能力を示すかどうかを決定するために設計されている。このアッセイにおいてポジテ
ィブと評価されたＰＲＯポリペプチドは、例えば糖尿病或いは高又は低インシュリン血症
を含む骨格筋によるグルコース取り込みの刺激又は阻害である疾患の治療上の処置にとっ
て有用であると期待される。
９６ウェルフォーマットにおいて、アッセイされるＰＲＯポリペプチドは初期ラット分化
型骨格筋へ加えられ、そして一晩インキュベートされる。ついで、ＰＲＯポリペプチド及
び＋／−インシュリンを含む新鮮な培地がウェルに加えられる。その後、試料培地は、骨
格筋によるグルコース又はＦＦＡ取り込みを測定するために監視される。イシュリンは、
骨格筋によるグルコース又はＦＦＡ取り込みを刺激し、ＰＲＯポリペプチドを含まないイ
ンシュリンを含む培地を、ポジティブの基準コントロール及びスコーリング制限として使
用する。試験されるＰＲＯポリペプチドがグルコース又はＦＦＡ取り込みを刺激或いは阻
害した場合、インシュリンのコントロールより１．５倍より高い又は０．５倍より低いと
、結果はポジティブと記録される。
以下の試験ＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び／又はＦＡＡの
取り込みの刺激剤又は阻害剤としてポジティブであった：ＰＲＯ１８２、ＰＲＯ３３６、
ＰＲＯ１９８、ＰＲＯ１７２及びＰＲＯ７１９。

実施例２１：軟骨細胞再分化アッセイ（アッセイ１１０）
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが軟骨細胞の再分化を誘導する働きをし、
それ故に例えばスポーツ障害や関節炎のような様々な骨及び／又は軟骨の障害の治療に役
立つことが期待されていることを示す。このアッセイは次のように実施される。ブタの軟
骨細胞を、４−６月齢の雌ブタの中手指節関節の関節軟骨を一晩コラゲナーゼ消化するこ
とによって単離する。次いで、この単離された細胞を、１０％ＦＢＳ及び４μｇ/mlゲン
タマイシンを含むヘムＦ-１２へ２５，０００細胞／ｃｍ^２で播種する。この培地を３日
ごとに交換し、次いで細胞を血清を含まない１００μｌの同培地の９６ウェルに５，００
０細胞／ウェルで播種し、そして１００μｌ試験ＰＲＯポリペプチド、５nMのスタウロス
ポリン（ポジティブコントロール）又は培地のみ（ネガティブコントロール）を加えて最
終的な総量が２００μｌ／ウェルとなるようにする。３７℃での５日間のインキュベーシ
ョンの後、各々のウェルの写真を撮り、軟骨細胞の分化状態を判定するする。軟骨細胞の
再分化がネガティブコントロールよりもポジティブのコントロールに類似していると判定
された場合には、このアッセイにおけるポジティブの結果が生じたものとする。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブと検定された：ＰＲＯ１８２、ＰＲ
Ｏ３６６、ＰＲＯ１９８及びＰＲＯ１８６８。

実施例１７：軟骨細胞増殖アッセイ（アッセイ１１１）
このアッセイは、培養において、本発明のＰＲＯポリペプチドが軟骨細胞の増殖を阻害す
る能力を示すか否かを測定するために設計されている。このアッセイにおいてポジティブ
と試験されたポリペプチドは、例えばスポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び／又は
軟骨組織疾患の治療上の処置に対して有用であると期待されうる。
ブタ軟骨細胞を、４−６ヶ月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨から、一晩に渡るコ
ラゲナーゼ消化によって単離する。そして、この単離した細胞を、２５，０００細胞／ｃ
ｍ^２の割合で、１０％ＦＢＳ及び４μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むハムＦ−１２へ播種
する。培地を３日ごとに交換し、２５，０００細胞／ｃｍ^２となるように細胞を５日ごと
に再播種する。１２日目に、この細胞を血清を含まない１００μｌの同じ培地の９６ウェ
ルプレートへ５，０００細胞／ウェルで播種し、無血清培地(ネガティブコントロール）
、スタウロスポリン(最終濃度５ｎＭ；ポジティブのコントロール）又は試験ＰＲＯポリ
ペプチドのいずれかを添加して最終容量が２００μｌ／ウェルとなるようにする。３７℃
で５日間の後、２０μｌのアラマーブルー(Alamar blue)を各ウェルへ添加し、プレート
をさらに３時間に渡って３７℃でインキュベートする。そして、各ウェルの蛍光を測定す
る(Ｅｘ：５３０ｎｍ；Ｅｍ：５９０ｎｍ）。バックグラウンドを得るために、２００μ
ｌの無血清培地を含むプレートの蛍光を測定する。このアッセイでのポジティブの結果は
、ＰＲＯポリペプチド処理試料の蛍光が、ネガティブコントロールのそれよりもポジティ
ブのコントロールのそれに類似する場合に得られる。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ２
２４、ＰＲＯ１７２及びＰＲＯ１３１２。

実施例１８：初期ラット脂肪細胞によるグルコース又はＦＦＡ取り込みに影響を与えるＰ
ＲＯポリペプチドの検出(アッセイ９４）
このアッセイは、ＰＲＯポリペプチドが脂肪細胞によるグルコース又はＦＦＡ取りみに影
響を及ぼす能力を示すかどうかを確定するために設計されている。このアッセイでポジテ
ィブと評価されたＰＲＯポリペプチドは、例えば肥満、糖尿病或いは高又は低インシュリ
ン血症を含む、脂肪細胞によるグルコース取り込みの刺激又は阻害いずれかが有益である
疾患の治療にとって有用であると期待される。
９６ウェルフォーマットで、アッセイされるＰＲＯポリペプチドを初期ラット脂肪細胞へ
加え、そして一晩インキュベートした。グリセロール、グルコース及びＦＦＡ取り込みの
アッセイのための試料を、４及び１６時間目に採取する。１６時間のイキュベーション後
、イシュリンを培地へ加え、４時間のインキュベートをおこなう。この時、試料が採取さ
れて、グリセロール、グルコース及びＦＡＡの取り込みを測定する。ポジティブの基準コ
ントロールとしては、ＰＲＯポリペプチドが無くインシュリンを含む培地を使用する。試
験されるＰＲＯポリペプチドがグルコース又はＦＦＡ取り込みを刺激又は阻害し、インシ
ュリンのコントロールより１．５倍より高い又は０．５倍より低いと、結果はポジティブ
であると記録される。
以下のＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び／又はＦＡＡの取り
込みへ作用するとしてポジティブと評価された：ＰＲＯ２０２、ＰＲＯ２１１、ＰＲＯ３
４４及びＰＲＯ１３３８。

実施例１９：ウシ周皮細胞における遺伝子発現（アッセイ１０５）
このアッセイは、周皮細胞における遺伝子発現を活性化するＰＲＯポリペプチドを同定す
るために設定されている。このようなポリペプチドは、成長因子として及び／又は遺伝子
発現が所望されるか有益である症状にとって有用であると期待される。１週間に渡って、
ウシ周皮細胞を成長培地の６０ｍｍ培養皿に配した。１日目に、種々のＰＲＯポリペプチ
ドを希釈（１％）し、周皮細胞と１，４，２４時間のタイムポイントでインキュベートし
た。この細胞を収集し、そして指示書に従ってＴＲＩ-試薬を用いてＲＮＡを単離した。
次いで、分光光度計を利用して２６０／２８０ＯＤを読みとることによって、このＲＮ
Ａを定量化した。遺伝子発現の分析は、Perkin Elmer試薬及び特別に設計されたウシプロ
ーブ及びプライマーを用いてTaqMan反応によっておこなった。次の遺伝子の発現を分析し
た：ＧＡＰＤＨ、ベータ-インテグリン、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ＩＣＡＭ-１、
単球走化性タンパク質1（ＭＣＰ-１）、オステオポンチン、トランスフォーミング成長因
子-ベータ（ＴＧＦ-ベータ）、ＴＧＦ-ベータレセプター、メタロプロテイナーゼ（ＴＩ
ＭＰ）の組織インヒビター、組織因子（ＴＦ）、ＶＥＧＦ-α、トロンボスポンジン、Ｖ
ＥＧＦ-β、アンジオポエチン-２及びコラゲナーゼ。次いで、複製物を平均化し、ＳＤを
測定した。そして、遺伝子発現レベルをＧＡＰＤＨへ標準化した。次に、これらを、未処
理コントロールと比較した場合に、ウシ周皮細胞において遺伝子発現を顕著に誘導しない
タンパク質（ＰＩＮ３２）によって得られた発現レベルに対して標準化した。ＰＩＮ３２
コントロールより２倍又はより高い遺伝子発現レベルを示す任意のＰＲＯポリペプチドを
、ポジティブヒットとした。
この試験では、次のＰＲＯポリペプチドがポジティブだと評価した：ＰＲＯ３６６。

実施例２０：周皮細胞を活性化するＰＲＯポリペプチドの同定(アッセイ１２５)
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが周皮細胞の増殖を活性化するように作用
し、それ故に、特定の種類の周皮細胞に関連する腫瘍の診断用マーカーとして有用である
ばかりでなく、周皮細胞に関連する腫瘍の治療上の処置に有用であると期待されるアンタ
ゴニストを誘発することにも有用であることを示す。また、このようなＰＲＯポリペプチ
ドは、成長因子として及び／又は細胞増殖が所望されるか有益である症状にとって有用で
あると期待される。周皮細胞増殖の活性化は血管新生の誘導にも関連しており、よって周
皮細胞増殖を誘導することができるＰＲＯポリペプチドは、例えば創傷治癒のような場合
を含む誘導された血管新生が有益である症状の治療にとって有用であると期待できる。特
に１日目には、周皮細胞をVEC Technologiesから得て、５mlの培地以外のすべてをフラス
コから取り出した。２日目には、周皮細胞をトリプシン処理し、洗浄し、スピンにかけて
９６ウェルプレートに蒔いた。７日目には、培地を取り除き、周皮細胞を１００μlの特
定のＰＲＯポリペプチド又はコントロール処理(ポジティブコントロール＝ＤＥＭ＋5%＋
／−ＰＤＧＦ＠５００ｎｇ／μｌ；ネガティブコントロール＝ＰＩＮ３２、周皮細胞に対
して顕著な作用を有しないものと確かめられたポリペプチド)のいずれかによって処理し
た。次いで、C-fos及びＧＡＰＤＨ遺伝子発現レベルを測定し、複製を平均化してＳＤ／
ＣＶを確定した。c-fos値をＧＡＰＤＨに対して標準化し、この結果をＰＩＮ３２に対す
る倍数増加で表した。ネガティブコントロールと比較して、少なくとも２倍又はより高い
反応を示した任意のものを、このアッセイではポジティブであるとした。
このアッセイでは、次のＰＲＯポリペプチドがポジティブだと評価した：ＰＲＯ３６６。

実施例２１：軟骨からのプロテオグリカン放出を刺激するＰＲＯポリペプチドの能力（ア
ッセイ９７）
軟骨組織からのプロテオグリカンの放出を刺激する種々のＰＲＯポリペプチドの能力を以
下のようにして試験した。
４-６月齢のブタの手指節関節を無菌で切除し、関節軟骨を下の骨を注意深く避けたフリ
ーハンドスライスによって取り除いた。軟骨を細かく切り刻み、０．１％ＢＳＡ及び１０
０Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した無血清（ＳＦ
）培地（ＤＭＥ／Ｆ１２１：１）中、９５%空気、５％ＣＯ_２雰囲気においてバルクで２
４時間培養した。３回洗浄した後、約１００ｍｇの関節軟骨をミクロニクス(micronics)
管に分け、上記ＳＦ培地中でさらに２４時間インキュベートした。次いで、ＰＲＯポリペ
プチドの１%を、単独あるいは公知の軟骨組織からのプロテオグリカン放出刺激剤である
インターロイキン-１αの１８ｎｇ／ｍｌとともに添加した。次いで上清を回収し、１，
９-ジメチル-メチレンブルー（ＤＭＢ）比色アッセイ（FarndaleおよびButtle, Biochem.
Biophys. Acta 883: 173-177 (1985)）を用いてプロテオグリカンの量を検定した。この
アッセイにおけるポジティブな結果は、試験ポリペプチドには、例えば、運動に関連する
関節の問題、関節軟骨障害、変形性関節症又は慢性関節リウマチの治療においての利用が
見出されることを示している。
上記のアッセイによって種々のＰＲＯポリペプチドを試験したとき、ポリペプチドは、根
本的におよびインターロイキン-１αでの刺激後および処理後２４および７２時間に軟骨
組織からのプロテオグリカン放出を刺激する顕著な能力を示し、これによって、これらＰ
ＲＯポリペプチドは軟骨組織からのプロテオグリカンの放出刺激に有用であるをこと示し
ている。従って、ＰＲＯポリペプチドは運動に関連する関節の問題、関節軟骨障害、変形
性関節症又は慢性関節リウマチの治療において有用である。このアッセイにおいて、ポジ
ティブだと評価されたポリペプチドはＰＲＯ２１６である。

実施例２２：ラット小嚢支持細胞の増殖（アッセイ５４）
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが聴覚毛細胞前駆体である内耳支持細胞の有糸
分裂促進剤として作用し、よって哺乳動物における聴覚毛細胞の再生誘発と軟調の治療に
利用できることを示す。アッセイは次のように実施する。ラットＵＥＣ−４小嚢上皮細胞
を３３℃、２００μｌの血清添加培地で密度３０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート
に等分する。細胞を一晩培養し、ついで３７℃で無血清培地に移す。ついで様々な希釈率
のＰＲＯポリペプチド（又はコントロールには不含有）が培地に加えられ、ついで細胞を
２４時間に渡ってインキュベートする。２４時間のインキュベーションの後、^３Ｈ−チミ
ジン（１μＣｉ/ウェル）を加えられ、次いでさらに２４時間培養する。次に組み込まれ
なかった放射能標識を取り除くために培地を洗浄し、細胞を取り出し、１ウェルあたりの
Ｃｐｍを決定する。コントロール培地と比較しＰＲＯポリペプチドで処置した培地におい
て少なくとも３０％又はそれ以上のＣｐｍであった場合には、アッセイにおいてポジティ
ブと判断する。
このアッセイでは、次のポリペプチドがポジティブであると評価された：ＰＲＯ１７２。

実施例２３：混合リンパ球反応(ＭＬＲ）アッセイにおける刺激性活性（アッセイ２４）
この実施例は、本発明の所定のペプチドが、刺激されたＴ-リンパ球の増殖の刺激剤とし
て活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫応答の増強が有益な
場合、治療的に有用である。治療剤は、本発明のポリペプチドのアンタゴニストの形をと
り、例えば、ポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体である。こ
のアッセイの基本的プロトコールは、Current Protocols in Immunology, unit3.12；J E
Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所,
John Wiley & Sons, Incから出版に記載されている。
さらに具体的には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を個々の
哺乳類、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナ
ーには刺激物ＰＢＭＣを供給し、他のドナーにはレスポンダーＰＢＭＣを供給する)。所
望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結する。凍結細胞をア
ッセイ用培地(３７℃、5％ＣＯ_２)で一晩解凍し、ついで洗浄し、アッセイ用培地(RPMI；
１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥ
ＰＥＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸塩)で３ｘ１０^６細胞／ｍｌに再懸濁する
。刺激物ＰＢＭＣは、細胞を照射する(約３００ラド)ことによって調製される。
このアッセイは混合物：
１００：１の１％又は０．１％に希釈された試験試料、
５０：１の照射を受けた刺激物細胞、及び
５０：１のレスポンダーＰＢＭＣ細胞、
を三重ウェルに蒔くことによって調製される。１００マイクロタイターの細胞培養培地或
いは１００マイクロタイターのＣＤ４-ＩｇＧをコントロールとして使用する。ついで、
ウェルを３７℃、５％ＣＯ_２で４日間インキュベートする。５日目には、各ウェルへトリ
チウム化チミジン（１．０ｍＣ／ウェル；Amersham）を適用する。６時間後に細胞を３
回洗浄し、次いで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、ＰＢＭＣをＢａｌｂ／ｃマウス及びＣ５７Ｂ６マウスの
脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地（RPMI；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリ
ン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％HEPES、１％非必須アミノ酸、１％ピル
バート）において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンパライト
Ｍ(Lympholyte M）（Organon Teknika）上にこれらの細胞をオーバーレイすることにより
ＰＭＢＣを単離し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地におけ
る単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に１ｘ１０^７細胞/mlになるように細胞を再懸濁
させる。ついで、このアッセイは上記のように行われる。
コントロールに対する増加がポジティブであると考えられ、好ましくは１８０％以上又は
１８０％と同等の増加が好ましい。しかしながら、コントロールより大きい全ての値は、
試験用タンパク質に関して刺激効果を示す。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ３４４。

実施例２４：周皮細胞ｃ−Ｆｏｓ誘発(アッセイ９３)
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが周皮細胞におけるc-fosの発現を誘発す
るように作用し、よって特定の種類の周皮細胞結合腫瘍の診断用マーカーとして有用であ
るばかりでなく、周皮細胞結合腫瘍の治療上の処置に有用であると予期されるアンタゴニ
ストを生じせしめることを示す。また、周皮細胞でのc-fosの誘導は血管新生そのものの
誘導を示し、そしてc-fosの発現を誘導することができるＰＲＯポリペプチドは、例えば
創傷治癒及びそれに同じような、誘導された血管新生が有益である症状の治療に有用であ
る。特に１日目に、周皮細胞をVEC Technologiesから得て、５mlの培地以外をフラスコか
ら取り出した。２日目に周皮細胞をトリプシン処理し、洗浄し、スピンにかけ、次いで９
６ウェルプレートに蒔いた。７日目に培地を取り出し、周皮細胞を１００μｌのＰＲＯポ
リペプチドテスト用試料及びコントロール(ポジティブコントロール＝ＤＭＥ＋５％血清
＋／−５００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ；ネガティブコントロール＝プロテイン３２)で処理
した。複製を平均化し、ＳＤ／ＣＶを確定した。蛍光ルミネセンス単位(ＲＬＵ)照度計リ
ーディングバース頻度により示されたプロテイン３２値を越える倍数増加(バッファーコ
ントロール)をヒストグラム上にプロットし、上記のプロテイン３２値を２倍は、アッセ
イについてポジティブであると考えられる。ＡＳＹマトリックス：成長培地＝低グルコー
スＤＭＥＭ＝２０％ＦＢＳ＋１Ｘペンストレップ(pen strep)＋１Ｘフンギゾン(fungizon
e)。アッセイ用培地＝低グルコースＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった：ＰＲＯ３０１、Ｐ
ＲＯ６１９、ＰＲＯ１０６６及びＰＲＯ１２６５。

実施例２５：サイトカイン放出アッセイ（アッセイ１２０）
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのサイ
トカインの放出を誘発することができる否かを確定するために設計されている。ＰＢＭＣ
からのサイトカインの放出を誘発することのできるＰＲＯポリペプチドは、サイトカイン
放出の増加によって益を得る症状の治療にとって有用である。具体的には、１ｘ１０^６細
胞／ｍｌの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、３日間に渡って１％のＰＲＯポリペプチドで
完全ＲＰＭＩ培地によって培養する。次いで、その上清を収集し、ヒトＩｇＧで処理され
たコントロールとの比較によるＥＬＩＳＡによって、種々のサイトカインの増加濃度につ
いて試験する。このアッセイにおけるポジティブとは、ヒトＩｇＧ処理試料と比較して、
ＰＲＯポリペプチド処理試料中でのサイトカイン濃度の１０倍又はより大きな増加である
。
このアッセイにおいては、次のポリペプチドがポジティブであると評価された：ＰＲＯ５
２６及びＰＲＯ１３４３。

実施例２６：因子VIIAへのＡ-ペプチド結合の阻害（アッセイ１１８）
このアッセイは、Ａ-ペプチドの因子VIIAへの結合を阻害し、それによって血液強固カス
ケードに作用することすることができるＰＲＯポリペプチドを同定するために設計されて
いる。このアッセイでポジティブと評価されるＰＲＯポリペプチドは、例えば、発作、心
臓発作及び種々の凝固疾患を含む、血液凝固カスケードの改変が有益であろう症状の治療
のために有用であると期待される。また、これらのＰＲＯポリペプチドは、これら症状の
治療のためにも有用であるアゴニスト及びアンタゴニストの同定のために有用である。
具体的には、３８４ウェルプレートを可溶性因子VIIAでコートし、４℃で一晩に渡ってイ
ンキュベーションする。次いで、このウェルデカントし、０．５％ＢＳＡを添加して１時
間に渡ってブロックする。次に、ウェルを洗浄し、各ウェルへ２０μｌのビオチン化Ａ-
ペプチドを加え、それに種々の濃度のＰＲＯポリペプチド（試験）か何も加えない（ネガ
ティブコントロール）。次いで、このプレートを室温で１時間に渡ってインキュベーショ
ンする。ウェルを再び洗浄し、そして各ウェルへ４０μｌのストレプトアビジン-ユーロ
ピウムを添加する。次いで、このプレートを室温で３０分に渡ってインキュベーションし
て洗浄する。次いで、各ウェルへ４０μｌの蛍光増進溶液を添加してプレートを室温で５
分間インキュベーションし、次いでユーロピウム遅延蛍光設定の下で、各ウェルをWallac
Vivtor readerで読みとる。そして、アッセイにおけるポジティブが３０％又はそれ以上
のパーセント阻害として、Ａ-ペプチドの因子VLLAへの結合のパーセント阻害を測定する
（ネガティブコントロールと比較し）。
このアッセイでは、次のＰＲＯポリペプチドがポジティブであると評価された：ＰＲＯ１
８２。

実施例２７：脂肪細胞分化の阻害アッセイ（アッセイ６６）
このアッセイは、脂肪細胞のインシュリン誘発分化を阻害することが可能であるＰＲＯポ
リペプチドを同定するために設計されている。このアッセイでポジティブと評価されたＰ
ＲＯポリペプチドは、肥満、糖尿病などに関連する症状の治療のために有用であると期待
される。
具体的には、３Ｔ３-Ｌ１細胞を、６ｘ１０^４細胞／ウェルで９６ウェルプレートへ播種
し、７日間に渡って集密化するまで生育させた。７日目には、１μｇ／ｍｌインシュリン
、０．２５ｘ１０^−６Ｍデキサメタゾン及び０．５ｍＭＩＢＭＸの存在下で、種々の濃
度のＰＲＯポリペプチド（或いはネガテティブコントロールとして加えない）によって細
胞を処理する。次いで、この試料を２日間に渡って、７％ＣＯ_２中において３７℃でイン
キュベートする。このインキュベーションの後、吸引によって培地を取り除き、細胞をＰ
ＢＳで洗浄し、ＰＲＯポリペプチド（或いはネガティブコントロールとして加えず）及び
１μｇ／ｍｌインシュリンへ再曝露する。５日後には、細胞を溶菌し、細胞溶解物をシグ
マのトリグリセリド[INT]キット（Sigma procedure#336）でアッセイする。このアッセイ
におけるポジティブとは、ネガティブコントロールと比較して、ＰＲＯポリペプチド処理
試料において２０％より高い脂肪細胞分化の阻害である。
このアッセイでは、次のＰＲＯポリペプチドがポジティブであると評価された：ＰＲＯ１
８５及びＰＲＯ１９８。

実施例２８：ＰＲＯポリペプチドによるＨＵＶＥＣ刺激（アッセイ１３１）
このアッセイは、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖を刺激することができるＰＲＯポリペプチドを同
定するために設計されている。このアッセイにおいてポジティブと評価されるＰＲＯポリ
ペプチドは、例えば創傷治癒のようなものを含む、血管新生が有益である症状の治療ため
の血管新生を誘発することにとって有用であると期待される。これらＰＲＯポリペプチド
のアンタゴニストは、例えば腫瘍のような症状の治療のための血管新生の阻害において有
用であると期待される。
具体的には、ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）フラットボトムブラックプレートをフィブロネク
チンで２０分間に渡って処理し、次いでＰＢＳで二回洗浄する。そして、ＨＵＶＥＣ細胞
を、適切な成長培地の２０００細胞／ウェルにプレートする。次いで、このプレートを一
晩に渡ってインキュベートし、そしてＰＲＯポリペプチド（１％最終濃度）、無添加（ネ
ゲティブコントロール）又はＩＬ１β（３．３ｎｇ／ｍｌ最終濃度；ポジティブコントロ
ール）を添加する。このアッセイにおけるポジティブとは、ポジティブコントロールと比
較して、蛍光の２倍又はそれ以上の増加である。
このアッセイにおいて、次のＰＲＯポリペプチドがポジティブであると評価された：ＰＲ
Ｏ２２２。

実施例２９：軟骨細胞再分化の促進（アッセイ１２９）
このアッセイは、本発明のＰＲＯペプチドが、培地で軟骨細胞の増殖及び／又は再分化を
誘導する能力を示すか否かを確定するために設計されている。このアッセイにおいてポジ
ティブと評価されるＰＲＯポリペプチドは、例えばスポーツ傷害及び関節炎などの種々の
骨及び／又は軟骨組織疾患の治療に有用であると期待される。ブタ軟骨細胞を、４−６ヶ
月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨の一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離す
る。そして、この単離された細胞を、１０％ＦＢＳ及び４μg/mlゲンタマイシンを含むハ
ムＦ-１２へ２５，０００細胞／ｃｍ^２の割合で播種する。培地を３日ごとに交換する。
１２日目には、細胞を血清を含まない１００μlの同じ培地へ５，０００細胞／ウェルで
９６ウェルプレートへ播種し、１００μlの無血清培地（ネガティブコントロール）、ス
タウロスポリン（最終濃度が５nM；ポジティブコントロール）又は試験ＰＲＯポリペプチ
ドのいずれかを添加して最終容量を２００μl/ウェルとする。３７℃での５日間の後、１
００μｇ／ｍｌ Hoechst 33342及び５０μｇ／ｍｌ５-ＣＦＤＡを含む２２μｌの培地を
各ウェルへ添加し、さらに１０分間に渡って３７℃でインキュベートする。各ウェルの緑
色蛍光を写真に取り、形態計測分析によって軟骨細胞の分化段階を計算する。＞５０％の
ＰＲＯポリペプチドで処理した細胞が分化している場合には（ネガティブコントロールに
よって得られたバックグラウンドと比較して）、このアッセイでポジティブな結果が得ら
れていることになる。
このアッセイにおいて、次のＰＲＯポリペプチドがポジティブであると評価された：ＰＲ
Ｏ３０１。

実施例３０：癌牲腫瘍でのＰＲＯポリペプチドの過剰発現を検出するためのマイクロアレ
イ分析
幾千もの遺伝子配列を殆ど場合において含む核酸マイクロアレイは、組織の正常な対応物
と比較して、疾患組織において差次的に発現している遺伝子を同定するために有用である
。核酸マイクロアッセイを用いると、試験及びコントロール組織試料からの試験及びコン
トロールｍＲＮＡ試料が逆転写され、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識される。次
いで、このｃＤＮＡプローブは、固体支持体上に固定化さた多くの核酸とハイブリダイズ
される。このアレイは、アレイの各メンバーの配列と位置がわかるように構成されている
。例えば、ある疾患段階で発現することが知られている遺伝子から選ばれたものを固体支
持体上に整列してもよい。標識プローブとある特定のアレイのメンバーとのハイブリダイ
ゼーションは、プローブが誘導された試料がその遺伝子を発現していることを示す。試験
（疾患組織）からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロール（正常
組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルより大きい場合は、疾患組
織において過剰発現している遺伝子又は複数遺伝子が同定される。この結果の意味は、疾
患組織で過剰発現しているタンパク質は、疾患症状の存在のための診断的マーカーとして
だけではなく、疾患症状の治療のための治療上の標的としても有用であるということであ
る。
核酸のハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ技術の方法論は、当業者には良く知ら
れている。本実施例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ、スライドのための核酸
の特別な調製、並びにハイブリダイゼーションの条件は、２０００年３月３１日に出願さ
れた米国仮出願一連番号６０／１９３，７６７にすべて詳述されており、ここにおいて
文献として取り入れられている。

本実施例では、癌牲腫瘍で過剰発現しているＰＲＯポリペプチドを同定するための試みと
して、非癌牲ヒト組織に関連するＰＲＯポリペプチドコード化遺伝子発現のために、種々
のヒト組織から誘導された癌牲腫瘍が研究された。２セットの実験データーが作成された
。１つのセットでは、同じ患者からの癌牲ヒト結腸腫瘍組織、及び適合した非癌牲ヒト結
腸腫瘍組織（「適合した直腸コントロール」）を得て、そして上記で記載したマイクロア
レイ技術を用いてＰＲＯポリペプチド発現について分析した。二番目のセットのデーター
では、任意の種々の異なるヒト腫瘍を得て、肝臓、腎臓、及び肺を含む上皮由来の非癌牲
ヒト組織をプールすることによって調製される「普遍的」上皮コントロール試料と比較し
た。プールされた組織から単離されたｍＲＮＡは、これら異なる組織での発現遺伝子産物
の混合物を示す。プールされたコントロール試料を用いたマイクロアレイハイブリダイゼ
ーション実験は、二色分析において直線的なプロットを生じた。次いで、二色分析におい
て生じたこの線の傾斜を、各実験の（試験：コントロール検出）の比率を標準化するため
に用いた。次いで、種々の実験の標準化された比率を比較し、そして遺伝子発現の集積牲
を同定するために用いた。従って、プール化された「普遍的なコントロール」試料は、単
純な二つの試料の比較における有効で相対的遺伝子発現の判定を可能にするだけではなく
、幾つかの実験に渡る複数の試料の比較をも可能にする。
本実験では、ここに記載のＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列から誘導された核酸プロ
ーブをマイクロアレイの作製に用い、上記に列挙した腫瘍組織のＲＮＡをさらにハイブリ
ダイゼーションに用いた。標準化比：実験比に基づく値は、「カットオフ」と命名された
。このカットオフを上回る値のみを重要であると判定した。下記の表８は、これらの実験
の結果を示しており、本発明の種々のＰＲＯポリペプチドが非癌牲ヒト組織コントロール
と比べて種々のヒト腫瘍組織において著しく過剰発現していることを示している。上記に
て記載のように、これらのデーターは、本発明のＰＲＯポリペプチドが一つ以上の癌牲腫
瘍の存在を示す診断マーカーとしてだけではなく、これら腫瘍の治療のための治療上の標
的としての機能も果たすことを示している。

実施例３１：レセプター／リガンド相互作用の同定
本アッセイでは、レセプター／リガンド相互作用を同定する目的で、潜在的なレセプター
又はリガンド分子の一団と結合する能力に関して、種々のＰＲＯポリペプチドを試験した
。既知のレセプターに対するリガンド、既知のリガンドに対するレセプター、或いは新規
のレセプター／リガンド対の同定は、例えばレセプター又はリガンドを発現することが知
られている細胞へ生物活性分子（リガンド又はレセプター）を標的化すること、組成物が
リガンド又はレセプターを発現すると思われる細胞を含んでなるであろう場合に、リガン
ド又はレセプターを含むと思われる組成物中からリガンド又はレセプターの存在を検出す
るためにリガンド又はレセプターを試薬として利用すること、レセプター又はリガンドを
発現或いはそれらへ応答することが知られている細胞の成長、又はその他の生物学的又は
免疫活性を調節すること、細胞の免疫応答、或いはレセプター又はリガンドを発現する細
胞に対する免疫応答を調節すること、レセプター又はリガンドを発現している細胞の成長
又は生物学的又は免疫活性を調節するレセプター又はリガンドに対するアゴニスト、ア
ンタゴニスト及び／又は抗体の調製を可能にすること、並びに当業者にとって容易に明ら
かである種々の他の徴候を含む種々の徴候に対して有用である。

このアッセイは、次のようにして行われた。レセプターに対するリガンドであると思われ
る本発明のＰＲＯポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃドメイン（イムノアドへシン）を含
有する融合タンパク質として発現される。レセプター-リガンド結合は、候補ＰＲＯポリ
ペプチドレセプターを発現する細胞（例えばＣｏｓ細胞）とイムノアドへシンポリペプチ
ドの相互作用、Ｆｃ融合ドメインに対する蛍光試薬による結合イムノアドへシンの視覚化
、そして顕微鏡による検査を可能にすることによって検出される。候補レセプターを発現
する細胞は、同時に、レセプター分子として機能することができるＰＲＯポリペプチドを
をコードするｃＤＮＡ発現ベクターのライブラリの確定したサブセットの一過性トランス
フェクション（形質移入）によって生産される。次いで、可能なレセプター結合に関して
試験したＰＲＯポリペプチドイムノアドへシンの存在下で、細胞を１時間に渡ってインキ
ュベートする。そして、この細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定化する。次いで
、この細胞を、ＰＲＯポリペプチドイムノアドへシンのＦｃ部分に対する蛍光コンジュゲ
ート抗体（ＦＩＴＣコンジュゲート抗体(ヤギ抗-ヒト-Ｆｃ抗体）とインキュベートする
。そして、この細胞を再び洗浄し、顕微鏡で検査した。ポジティブの相互作用は、蛍光ラ
ベルされた特定のＰＲＯポリペプチドレセプター又はレセプターのプールをコードするｃ
ＤＮＡで形質移入された細胞の存在、同じように蛍光ラベルされた他のｃＤＮＡ又はｃＤ
ＮＡのプールで形質移入されている同じように調製された細胞が存在しないことによって
判定される。ＰＲＯポリペプチドイムノアドへシンとの相互作用において、ｃＤＮＡ発現
ベクターの確定されたプールがポジティブと判定されたならば、ＰＲＯポリペプチドイム
ノアドへシンと相互作用することが可能なレセプターをコードする特定のｃＤＮＡを確定
するために、プールを構成する個々のｃＤＮＡ種が別々に試験される（プールは「分解」
される）。

本アッセイのその他の実施態様では、エピトープタッグの潜在的ＰＲＯポリペプチド（例
えば、８ヒスチジン「His」タッグ）が、ヒトＩｇＧのＦｃドメイン（イムノアドへシン
）と融合して発現する潜在的なレセプターＰＲＯポリペプチド分子の一団と相互作用する
ことが許容されている。１時間に渡るエピトープタッグＰＲＯポリペプチドとの同時イン
キュベーションに続いて、各々の候補レセプターをプロテインＡビーズによって免疫沈降
し、ビーズを洗浄した。潜在的なリガンド相互作用は、エピトープタッグに対する抗体に
よる免疫沈降複合体のウェスタンブロット分析によって測定される。候補化合物によるウ
ェスタンブロト分析において、エピトープタッグタンパク質の期待される分子量のバンド
が観察されるが、潜在的レセプターの一団の他のメンバーによっては起こらないことが観
察されるならば、相互作用は起こるものと判断される。
これらのアッセイを利用して、以下のレセプター／リガンド相互作用が同定されている：
（１）ＰＲＯ１８０１はＰＲＯ１１１４及びＰＲＯ４９７８と結合。
（２）ＰＲＯ１００はＰＲＯ１１１４と結合。

上記に記述された明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると
考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機
能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、
本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そ
のベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であること
を認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解
釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変す
ることは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に
入るものである。

配列番号：１がここにおいて「ＤＮＡ１６４３８−１３８７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１７７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）。図１に示された配列番号：１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）。配列番号：３がここにおいて「ＤＮＡ１９３６０−２５５２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３５７４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）。図３に示された配列番号：３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４）。配列番号：５がここにおいて「ＤＮＡ３３４５５−１５８４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２８０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５）。図５に示された配列番号：５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６）。配列番号：７がここにおいて「ＤＮＡ３７１５５−２６５１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９８４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７）。図７に示された配列番号：７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８）。配列番号：９がここにおいて「ＤＮＡ３８２６９−２６５４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９）。図９に示された配列番号：９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０）。配列番号：１１がここにおいて「ＤＮＡ４０６１９−１２２０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３０５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１）。図１１に示された配列番号：１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２）。配列番号：１３がここにおいて「ＤＮＡ４４１７４−２５１３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８６６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３）。図１３に示された配列番号：１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４）。配列番号：１５がここにおいて「ＤＮＡ４４６７５−２６６２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９９６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５）。図１５に示された配列番号：１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６）。配列番号：１７がここにおいて「ＤＮＡ４５４０８−２６１５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４４０６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７）。図１７に示された配列番号：１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８）。配列番号：１９がここにおいて「ＤＮＡ４８６０６−１４７９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１２０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９）。図１９に示された配列番号：１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０）。配列番号：２１がここにおいて「ＤＮＡ５２７５３−２６５６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９９０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１）。図２１に示された配列番号：２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２）。配列番号：２３がここにおいて「ＤＮＡ５３９１５−１２５８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７３８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３）。図２３に示された配列番号：２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４）。配列番号：２５がここにおいて「ＤＮＡ５３９９１−２５５３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３５７７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５）。図２５に示された配列番号：２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６）。配列番号：２７がここにおいて「ＤＮＡ５４００９−２５１７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７）。図２７に示された配列番号：２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８）。配列番号：２９がここにおいて「ＤＮＡ５６０５５−１６４３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１４７１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９）。図２９に示された配列番号：２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０）。配列番号：３１がここにおいて「ＤＮＡ５７０３３−１４０３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１１４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１）。図３１に示された配列番号：３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２）。配列番号：３３がここにおいて「ＤＮＡ５７２５２−１４５３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０７６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３）。図３３に示された配列番号：３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４）。配列番号：３５がここにおいて「ＤＮＡ５８７９９−１６５２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１４８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５）。図３５に示された配列番号：３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６）。配列番号：３７がここにおいて「ＤＮＡ５９７７０−２６５２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７）。図３７に示された配列番号：３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８）。配列番号：３９がここにおいて「ＤＮＡ５９７７４−２６６５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５０００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９）。図３９に示された配列番号：３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０）。配列番号：４１がここにおいて「ＤＮＡ６０２８１−２５１８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８８１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１）。図４１に示された配列番号：４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２）。配列番号：４３がここにおいて「ＤＮＡ６０７３６−２５５９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３１４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３）。図４３に示された配列番号：４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４）。配列番号：４５がここにおいて「ＤＮＡ６１８７５−２６５３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５）。図４５に示された配列番号：４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６）。配列番号：４７がここにおいて「ＤＮＡ６２３１２−２５５８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３１３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７）。図４７に示された配列番号：４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８）。配列番号：４９がここにおいて「ＤＮＡ６２８４９−１６０４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４７９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９）。図４９に示された配列番号：４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０）。配列番号：５１がここにおいて「ＤＮＡ６６３０７−２６６１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９９５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１）。図５１に示された配列番号：５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２）。配列番号：５３がここにおいて「ＤＮＡ６６６７７−２５３５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３）。図５３に示された配列番号：５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４）。配列番号：５５がここにおいて「ＤＮＡ７１２３５−１７０６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１７７７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５）。図５５に示された配列番号：５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５６）。配列番号：５７がここにおいて「ＤＮＡ７１２８９−２５４７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３５８０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５７）。図５７に示された配列番号：５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５８）。配列番号：５９がここにおいて「ＤＮＡ７３７７５−１７０７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１７７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５９）。図５９に示された配列番号：５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６０）。配列番号：６１がここにおいて「ＤＮＡ７６３８５−１６９２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１７５４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６１）。図６１に示された配列番号：６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６２）。配列番号：６３がここにおいて「ＤＮＡ７６３９５−２５２７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１９０６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６３）。図６３に示された配列番号：６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６４）。配列番号：６５がここにおいて「ＤＮＡ７７６２２−２５１６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８７０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６５）。図６５に示された配列番号：６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６６）。配列番号：６７がここにおいて「ＤＮＡ７７６２９−２５７３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３２９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６７）。図６７に示された配列番号：６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６８）。配列番号：６９がここにおいて「ＤＮＡ７７６４５−２６４８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６９）。図６９に示された配列番号：６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７０）。配列番号：７１がここにおいて「ＤＮＡ７９３０２−２５２１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７１）。図７１に示された配列番号：７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７２）。配列番号：７３がここにおいて「ＤＮＡ７９８６５−２５１９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７３）。図７３に示された配列番号：７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７４）。配列番号：７５がここにおいて「ＤＮＡ８０１３５−２６５５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９８９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７５）。図７５に示された配列番号：７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７６）。配列番号：７７がここにおいて「ＤＮＡ８０７９４−２５６８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３２３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７７）。図７７に示された配列番号：７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７８）。配列番号：７９がここにおいて「ＤＮＡ８０７９６−２５２３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８８６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７９）。図７９に示された配列番号：７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８０）。配列番号：８１がここにおいて「ＤＮＡ８０８４０−２６０５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３９５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８１）。図８１に示された配列番号：８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８２）。配列番号：８３がここにおいて「ＤＮＡ８０８９９−２５０１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１７８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８３）。図８３に示された配列番号：８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８４）。配列番号：８５がここにおいて「ＤＮＡ８１２２８−２５８０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３３８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８５）。図８５に示された配列番号：８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８６）。配列番号：８７がここにおいて「ＤＮＡ８１７６１−２５８３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８７）。図８７に示された配列番号：８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８８）。配列番号：８９がここにおいて「ＤＮＡ９６０４２−２６８２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５９９０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８９）。図８９に示された配列番号：８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９０）。配列番号：９１がここにおいて「ＤＮＡ８２３６４−２５３８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３４３８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９１）。図９１に示された配列番号：９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９２）。配列番号：９３がここにおいて「ＤＮＡ８２４２４−２５６６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３２１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９３）。図９３に示された配列番号：９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９４）。配列番号：９５がここにおいて「ＤＮＡ８２４３０−２５５７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３０４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９５）。図９５に示された配列番号：９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９６）。配列番号：９７がここにおいて「ＤＮＡ８３５００−２５０６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９７）。図９７に示された配列番号：９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９８）。配列番号：９９がここにおいて「ＤＮＡ８３５０９−２６１２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４４０３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９９）。図９９に示された配列番号：９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１００）。配列番号：１０１がここにおいて「ＤＮＡ８３５６０−２５６９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３２４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０１）。図１０１に示された配列番号：１０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０２）。配列番号：１０３がここにおいて「ＤＮＡ８４１３９−２５５５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３０３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０３）。図１０３に示された配列番号：１０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０４）。配列番号：１０５がここにおいて「ＤＮＡ８４１４１−２５５６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３０５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０５）。図１０５に示された配列番号：１０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０６）。配列番号：１０７がここにおいて「ＤＮＡ８４１４２−２６１３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４４０４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０７）。図１０７に示された配列番号：１０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０８）。配列番号：１０９がここにおいて「ＤＮＡ８４３１８−２５２０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８８４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０９）。図１０９に示された配列番号：１０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１０）。配列番号：１１１がここにおいて「ＤＮＡ８４９０９−２５９０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３４９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１１）。図１１１に示された配列番号：１１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１２）。配列番号：１１３がここにおいて「ＤＮＡ８４９１２−２６１０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４４０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１３）。図１１３に示された配列番号：１１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１４）。配列番号：１１５がここにおいて「ＤＮＡ８４９２５−２５１４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８６７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１５）。図１１５に示された配列番号：１１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１６）。配列番号：１１７がここにおいて「ＤＮＡ８４９２８−２５６４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３１９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１７）。図１１７に示された配列番号：１１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１８）。配列番号：１１９がここにおいて「ＤＮＡ８４９３２−２６５７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９９１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１９）。図１１９に示された配列番号：１１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２０）。配列番号：１２１がここにおいて「ＤＮＡ８６５９２−２６０７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３９８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２１）。図１２１に示された配列番号：１２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２２）。配列番号：１２３がここにおいて「ＤＮＡ８６５９４−２５８７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２３）。図１２３に示された配列番号：１２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２４）。配列番号：１２５がここにおいて「ＤＮＡ８６６４７−２５９１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３５０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２５）。図１２５に示された配列番号：１２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２６）。配列番号：１２７がここにおいて「ＤＮＡ８７１８５−２５６３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２７）。図１２７に示された配列番号：１２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２８）。配列番号：１２９がここにおいて「ＤＮＡ８７６５６−２５８２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２９）。図１２９に示された配列番号：１２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３０）。配列番号：１３１がここにおいて「ＤＮＡ８７９７４−２６０９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４４００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３１）。図１３１に示された配列番号：１３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３２）。配列番号：１３３がここにおいて「ＤＮＡ８８００１−２５６５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３２０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３３）。図１３３に示された配列番号：１３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３４）。配列番号：１３５がここにおいて「ＤＮＡ８８００４−２５７５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４４０９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３５）。図１３５に示された配列番号：１３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３６）。配列番号：１３７がここにおいて「ＤＮＡ８９２２０−２６０８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３７）。図１３７に示された配列番号：１３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３８）。配列番号：１３９がここにおいて「ＤＮＡ８９９４７−２６１８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４４１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３９）。図１３９に示された配列番号：１３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４０）。配列番号：１４１がここにおいて「ＤＮＡ９０８４２−２５７４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３３０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４１）。図１４１に示された配列番号：１４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４２）。配列番号：１４３がここにおいて「ＤＮＡ９１７７５−２５８１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３３９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４３）。図１４３に示された配列番号：１４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４４）。配列番号：１４５がここにおいて「ＤＮＡ９１７７９−２５７１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４５）。図１４５に示された配列番号：１４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４６）。配列番号：１４７がここにおいて「ＤＮＡ９２２１７−２６９７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０１４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４７）。図１４７に示された配列番号：１４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４８）。配列番号：１４９がここにおいて「ＤＮＡ９２２１９−２５４１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３４４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４９）。図１４９に示された配列番号：１４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５０）。配列番号：１５１がここにおいて「ＤＮＡ９２２２３−２５６７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３２２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５１）。図１５１に示された配列番号：１５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５２）。配列番号：１５３がここにおいて「ＤＮＡ９２２２５−２６０３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３８１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５３）。図１５３に示された配列番号：１５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５４）。配列番号：１５５がここにおいて「ＤＮＡ９２２３２−２５８９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３４８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５５）。図１５５に示された配列番号：１５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５６）。配列番号：１５７がここにおいて「ＤＮＡ９２２３３−２５９９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３７１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５７）。図１５７に示された配列番号：１５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５８）。配列番号：１５９がここにおいて「ＤＮＡ９２２４３−２５４９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３７４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５９）。図１５９に示された配列番号：１５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６０）。配列番号：１６１がここにおいて「ＤＮＡ９２２５３−２６７１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５７７３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６１）。図１６１に示された配列番号：１６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６２）。配列番号：１６３がここにおいて「ＤＮＡ９２２５４−２６７２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５７７４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６３）。図１６３に示された配列番号：１６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６４）。配列番号：１６５がここにおいて「ＤＮＡ９２２５５−２５８４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３４３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６５）。図１６５に示された配列番号：１６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６６）。配列番号：１６７がここにおいて「ＤＮＡ９２２６９−２５７０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３２５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６７）。図１６７に示された配列番号：１６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６８）。配列番号：１６９がここにおいて「ＤＮＡ９２２８８−２５８８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３４７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６９）。図１６９に示された配列番号：１６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７０）。配列番号：１７１がここにおいて「ＤＮＡ９２２９０−２５５０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３７４３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７１）。図１７１に示された配列番号：１７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７２）。配列番号：１７３がここにおいて「ＤＮＡ９３０１２−２６２２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４４２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７３）。図１７３に示された配列番号：１７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７４）。配列番号：１７５がここにおいて「ＤＮＡ９３０２０−２６４２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４５００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７５）。図１７５に示された配列番号：１７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７６）。配列番号：１７７がここにおいて「ＤＮＡ９４８３０−２６０４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３８９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７７）。図１７７に示された配列番号：１７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７８）。配列番号：１７９がここにおいて「ＤＮＡ９４８３３−２５７９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３３７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７９）。図１７９に示された配列番号：１７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８０）。配列番号：１８１がここにおいて「ＤＮＡ９４８３８−２６５８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９９２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８１）。図１８１に示された配列番号：１８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８２）。配列番号：１８３がここにおいて「ＤＮＡ９４８４４−２６８６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５９９６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８３）。図１８３に示された配列番号：１８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８４）。配列番号：１８５がここにおいて「ＤＮＡ９４８５４−２５８６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３４５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８５）。図１８５に示された配列番号：１８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８６）。配列番号：１８７がここにおいて「ＤＮＡ９５９３０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９７８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８７）。図１８７に示された配列番号：１８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８８）。配列番号：１８９がここにおいて「ＤＮＡ９６８６８−２６７７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５７８０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８９）。図１８９に示された配列番号：１８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９０）。配列番号：１９１がここにおいて「ＤＮＡ９６８７１−２６８３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５９９２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９１）。図１９１に示された配列番号：１９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９２）。配列番号：１９３がここにおいて「ＤＮＡ９６８８０−２６２４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４４２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９３）。図１９３に示された配列番号：１９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９４）。配列番号：１９５がここにおいて「ＤＮＡ９６９８６−２６６０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９９４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９５）。図１９５に示された配列番号：１９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９６）。配列番号：１９７がここにおいて「ＤＮＡ９６９８８−２６８５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５９９５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９７）。図１９７に示された配列番号：１９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９８）。配列番号：１９９がここにおいて「ＤＮＡ９６９９５−２７０９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０９４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９９）。図１９９に示された配列番号：１９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２００）。配列番号：２０１がここにおいて「ＤＮＡ９７００４−２５６２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３１７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０１）。図２０１に示された配列番号：２０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０２）。配列番号：２０３がここにおいて「ＤＮＡ９７００５−２６８７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５９９７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０３）。図２０３に示された配列番号：２０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０４）。配列番号：２０５がここにおいて「ＤＮＡ９７００９−２６６８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５００５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０５）。図２０５に示された配列番号：２０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０６）。配列番号：２０７がここにおいて「ＤＮＡ９７０１３−２６６７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５００４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０７）。図２０７に示された配列番号：２０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０８）。配列番号：２０９がここにおいて「ＤＮＡ９８３８０−２６９０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６００１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０９）。図２０９に示された配列番号：２０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１０）。配列番号：２１１がここにおいて「ＤＮＡ９８５６１−２６９６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０１３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１１）。図２１１に示された配列番号：２１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１２）。配列番号：２１３がここにおいて「ＤＮＡ９８５７５−２６４４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４５０２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１３）。図２１３に示された配列番号：２１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１４）。配列番号：２１５がここにおいて「ＤＮＡ９８５９３−２６９４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６００７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１５）。図２１５に示された配列番号：２１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１６）。配列番号：２１７がここにおいて「ＤＮＡ９８６００−２７０３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１７）。図２１７に示された配列番号：２１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１８）。配列番号：２１９がここにおいて「ＤＮＡ９９３３３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１９）。図２１９に示された配列番号：２１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２０）。配列番号：２２１がここにおいて「ＤＮＡ９９３９１−２５７２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２１）。図２２１に示された配列番号：２２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２２）。配列番号：２２３がここにおいて「ＤＮＡ９９３９３−２５６０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３１５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２３）。図２２３に示された配列番号：２２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２４）。配列番号：２２５がここにおいて「ＤＮＡ１００２７６−２６８４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５９９３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２５）。図２２５に示された配列番号：２２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２６）。配列番号：２２７がここにおいて「ＤＮＡ１００３１２−２６４５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４５０３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２７）。図２２７に示された配列番号：２２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２８）。配列番号：２２９がここにおいて「ＤＮＡ１００９０２−２６４６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４９７６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２９）。図２２９に示された配列番号：２２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３０）。配列番号：２３１がここにおいて「ＤＮＡ１０２８９９−２６７９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５７９８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３１）。図２３１に示された配列番号：２３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３２）。配列番号：２３３がここにおいて「ＤＮＡ１０４８７５−２７２０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６２４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３３）。図２３３に示された配列番号：２３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３４）。配列番号：２３５がここにおいて「ＤＮＡ１０５６８０−２７１０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０９５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３５）。図２３５に示された配列番号：２３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３６）。配列番号：２３７がここにおいて「ＤＮＡ１０５７７９−２７０８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０９３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３７）。図２３７に示された配列番号：２３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３８）。配列番号：２３９がここにおいて「ＤＮＡ１０５７９４−２６９５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０１２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３９）。図２３９に示された配列番号：２３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４０）。配列番号：２４１がここにおいて「ＤＮＡ１０５８３８−２７０２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４１）。図２４１に示された配列番号：２４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４２）。配列番号：２４３がここにおいて「ＤＮＡ１０７６９８−２７１５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６１８１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４３）。図２４３に示された配列番号：２４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４４）。配列番号：２４５がここにおいて「ＤＮＡ１０７７０１−２７１１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０９７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４５）。図２４５に示された配列番号：２４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４６）。配列番号：２４７がここにおいて「ＤＮＡ１０７７８１−２７０７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０９０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４７）。図２４７に示された配列番号：２４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４８）。配列番号：２４９がここにおいて「ＤＮＡ１０８６７０−２７４４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７１７１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４９）。図２４９に示された配列番号：２４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５０）。配列番号：２５１がここにおいて「ＤＮＡ１０８６８８−２７２５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６２５８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５１）。図２５１に示された配列番号：２５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５２）。配列番号：２５３がここにおいて「ＤＮＡ１０８７６９−２７６５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ９８２０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５３）。図２５３に示された配列番号：２５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５４）。配列番号：２５５がここにおいて「ＤＮＡ１０８９３５−２７２１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６２４３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５５）。図２５５に示された配列番号：２５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５２）。配列番号：２５７がここにおいて「ＤＮＡ１１０７００−２７１６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６１８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５７）。図２５７に示された配列番号：２５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５８）。配列番号：２５９がここにおいて「ＤＮＡ１１１７５０−２７０６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６０７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５９）。図２５９に示された配列番号：２５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６０）。配列番号：２６１がここにおいて「ＤＮＡ１２３４３０−２７５５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７４３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６１）。図２６１に示された配列番号：２６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６２）。配列番号：２６３がここにおいて「ＤＮＡ１２５１５４−２７８５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ９８６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６３）。図２６３に示された配列番号：２６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６４）。配列番号：２６５がここにおいて「ＤＮＡ１４２２３８−２７６８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ９８２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６５）。図２６５に示された配列番号：２６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６６）。配列番号：２６７がここにおいて「ＤＮＡ２２７７９−１１３０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１９６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６７）。図２６７に示された配列番号：２６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６８）。配列番号：２６９がここにおいて「ＤＮＡ２２７８０−１０７８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１９７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６９）。図２６９に示された配列番号：２６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７０）。配列番号：２７１がここにおいて「ＤＮＡ２６８４７−１３９５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１９５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７１）。図２７１に示された配列番号：２７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７２）。配列番号：２７３がここにおいて「ＤＮＡ２７８６４−１１５５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７３）。図２７３に示された配列番号：２７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７４）。配列番号：２７５がここにおいて「ＤＮＡ２７８６５−１０９１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７５）。図２７５に示された配列番号：２７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７６）。配列番号：２７７がここにおいて「ＤＮＡ２８４９７−１１３０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７７）。図２７７に示された配列番号：２７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７８）。配列番号：２７９がここにおいて「ＤＮＡ２８４９８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７９）。図２７９に示された配列番号：２７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８０）。配列番号：２８１がここにおいて「ＤＮＡ２８５００」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８１）。図２８１に示された配列番号：２８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８２）。配列番号：２８３がここにおいて「ＤＮＡ２８５０３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８３）。図２８３に示された配列番号：２８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８４）。配列番号：２８５がここにおいて「ＤＮＡ２９１０１−１１２２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８５）。図２８５に示された配列番号：２８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８６）。配列番号：２８７がここにおいて「ＤＮＡ３０８６９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２０２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８７）。図２８７に示された配列番号：２８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８８）。配列番号：２８９がここにおいて「ＤＮＡ３２２８６−１１９１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２１４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８９）。図２８９に示された配列番号：２８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９０）。配列番号：２９１がここにおいて「ＤＮＡ３２２８８−１１３２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２１５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９１）。図２９１に示された配列番号：２９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９２）。配列番号：２９３がここにおいて「ＤＮＡ３２２９０−１１６４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２１９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９３）。図２９３に示された配列番号：２９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９４）。配列番号：２９５がここにおいて「ＤＮＡ３２２９２−１１３１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２１１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９５）。図２９５に示された配列番号：２９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９６）。配列番号：２９７がここにおいて「ＤＮＡ３２２９８−１１３２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２２０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９７）。図２９７に示された配列番号：２９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９８）。配列番号：２９９がここにおいて「ＤＮＡ３３０８５−１１１０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３６６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９９）。図２９９に示された配列番号：２９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３００）。配列番号：３０１がここにおいて「ＤＮＡ３３０８７−１１５８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２１６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０１）。図３０１に示された配列番号：３０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０２）。配列番号：３０３がここにおいて「ＤＮＡ３３０８９−１１３２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２２１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０３）。図３０３に示された配列番号：３０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０４）。配列番号：３０５がここにおいて「ＤＮＡ３３０９２−１２０２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０５）。図３０５に示された配列番号：３０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０６）。配列番号：３０７がここにおいて「ＤＮＡ３３０９４−１１３１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２１７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０７）。図３０７に示された配列番号：３０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０８）。配列番号：３０９がここにおいて「ＤＮＡ３３１０７−１１３５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２２２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０９）。図３０９に示された配列番号：３０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１０）。配列番号：３１１がここにおいて「ＤＮＡ３３２２１−１１３３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２２４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１１）。図３１１に示された配列番号：３１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１２）。配列番号：３１３がここにおいて「ＤＮＡ３３２２３−１１３６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２３０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１３）。図３１３に示された配列番号：３１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１４）。配列番号：３１５がここにおいて「ＤＮＡ３３４５７−１０７８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１９８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１５）。図３１５に示された配列番号：３１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１６）。配列番号：３１７がここにおいて「ＤＮＡ３３４６０−１１６６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１７）。図３１７に示された配列番号：３１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１８）。配列番号：３１９がここにおいて「ＤＮＡ３３４７３−１１７６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１９）。図３１９に示された配列番号：３１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２０）。配列番号：３２１がここにおいて「ＤＮＡ３３７８５−１１４３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２１）。図３２１に示された配列番号：３２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２２）。配列番号：３２３がここにおいて「ＤＮＡ３３７８６−１１３２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２２７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２３）。図３２３に示された配列番号：３２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２４）。配列番号：３２５がここにおいて「ＤＮＡ３４３５３−１４２８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２３７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２５）。図３２５に示された配列番号：３２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２６）。配列番号：３２７がここにおいて「ＤＮＡ３４３９２−１１７０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２７）。図３２７に示された配列番号：３２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２８）。配列番号：３２９がここにおいて「ＤＮＡ３４４３４−１１３９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２３１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２９）。図３２９に示された配列番号：３２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３０）。配列番号：３３１がここにおいて「ＤＮＡ３５５５８−１１６７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２３５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３１）。図３３１に示された配列番号：３３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３２）。配列番号：３３３がここにおいて「ＤＮＡ３５５９５−１２２８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３２３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３３）。図３３３に示された配列番号：３３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３４）。配列番号：３３５がここにおいて「ＤＮＡ３５６３８−１２１６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２４５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３５）。図３３５に示された配列番号：３３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３６）。配列番号：３３７がここにおいて「ＤＮＡ３５６３９−１１７２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３７）。図３３７に示された配列番号：３３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３８）。配列番号：３３９がここにおいて「ＤＮＡ３５６６３−１１２９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３９）。図３３９に示された配列番号：３３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４０）。配列番号：３４１がここにおいて「ＤＮＡ３５６７４−１１４２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２４８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４１）。図３４１に示された配列番号：３４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４２）。配列番号：３４３がここにおいて「ＤＮＡ３５８４１−１１７３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４３）。図３４３に示された配列番号：３４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４４）。配列番号：３４５がここにおいて「ＤＮＡ３５９１６−１１６１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４５）。図３４５に示された配列番号：３４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４６）。配列番号：３４７がここにおいて「ＤＮＡ３５９１８−１１７４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２５８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４７）。図３４７に示された配列番号：３４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４８）。配列番号：３４９がここにおいて「ＤＮＡ３６３５０−１１５８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４９）。図３４９に示された配列番号：３４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５０）。配列番号：３５１がここにおいて「ＤＮＡ３７１４０−１２３４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５１）。図３５１に示された配列番号：３５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５２）。配列番号：３５３がここにおいて「ＤＮＡ３７１５０−１１７８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２６６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５３）。図３５３に示された配列番号：３５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５４）。配列番号：３５５がここにおいて「ＤＮＡ３８２６０−１１８０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２６９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５５）。図３５５に示された配列番号：３５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５６）。配列番号：３５７がここにおいて「ＤＮＡ４００２１−１１５４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５７）。図３５７に示された配列番号：３５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５８）。配列番号：３５９がここにおいて「ＤＮＡ４０５８７−１２３１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５９）。図３５９に示された配列番号：３５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６０）。配列番号：３６１がここにおいて「ＤＮＡ４０５９２−１２４２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６１）。図３６１に示された配列番号：３６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６２）。配列番号：３６３がここにおいて「ＤＮＡ４０６２０−１１８３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ２７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６３）。図３６３に示された配列番号：３６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６４）。配列番号：３６５がここにおいて「ＤＮＡ４０６２８−１２１６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６５）。図３６５に示された配列番号：３６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６６）。配列番号：３６７がここにおいて「ＤＮＡ４０９８１−１２３４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３３１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６７）。図３６７に示された配列番号：３６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６８）。配列番号：３６９がここにおいて「ＤＮＡ４０９８２−１２３５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３３２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６９）。図３６９に示された配列番号：３６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７０）。配列番号：３７１がここにおいて「ＤＮＡ４１２３４−１２４２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３５３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７１）。図３７１に示された配列番号：３７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７２）。配列番号：３７３がここにおいて「ＤＮＡ４３０４６−１２２５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３１０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７３）。図３７３に示された配列番号：３７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７４）。配列番号：３７５がここにおいて「ＤＮＡ４３３１６−１２３７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３３７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７５）。図３７５に示された配列番号：３７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７６）。配列番号：３７７がここにおいて「ＤＮＡ４４１６７−１２４３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７７）。図３７７に示された配列番号：３７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７８）。配列番号：３７９がここにおいて「ＤＮＡ４４１７５−１３１４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３５０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７９）。図３７９に示された配列番号：３７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８０）。配列番号：３８１がここにおいて「ＤＮＡ４４１８４−１３１９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８１）。図３８１に示された配列番号：３８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８２）。配列番号：３８３がここにおいて「ＤＮＡ４４１９４−１３１７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３８１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８３）。図３８３に示された配列番号：３８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８４）。配列番号：３８５がここにおいて「ＤＮＡ４４１９６−１３５３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ８４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８５）。図３８５に示された配列番号：３８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８６）。配列番号：３８７がここにおいて「ＤＮＡ４５４１９−１２５２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３６３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８７）。図３８７に示された配列番号：３８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８８）。配列番号：３８９がここにおいて「ＤＮＡ４６７７７−１２５３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８９）。図３８９に示された配列番号：３８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９０）。配列番号：３９１がここにおいて「ＤＮＡ４７３９４−１５７２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３１０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９１）。図３９１に示された配列番号：３９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９２）。配列番号：３９３がここにおいて「ＤＮＡ４８３３１−１３２９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７３１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９３）。図３９３に示された配列番号：３９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９４）。配列番号：３９５がここにおいて「ＤＮＡ４８３３６−１３０９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ３２２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９５）。図３９５に示された配列番号：３９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９６）。配列番号：３９７がここにおいて「ＤＮＡ４９１４２−１４３０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ５３６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９７）。図３９７に示された配列番号：３９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９８）。配列番号：３９９がここにおいて「ＤＮＡ４９６４６−１３２７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７１９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９９）。図３９９に示された配列番号：３９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４００）。配列番号：４０１がここにおいて「ＤＮＡ４９８２１−１５６２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ６１９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０１）。図４０１に示された配列番号：４０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０２）。配列番号：４０３がここにおいて「ＤＮＡ４９８２９−１３４６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７７１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０３）。図４０３に示された配列番号：４０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０４）。配列番号：４０５がここにおいて「ＤＮＡ５０９２１−１４５８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０５）。図４０５に示された配列番号：４０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０６）。配列番号：４０７がここにおいて「ＤＮＡ５２１８７−１３５４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ８６２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０７）。図４０７に示された配列番号：４０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０８）。配列番号：４０９がここにおいて「ＤＮＡ５２１９６−１３４８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０９）。図４０９に示された配列番号：４０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１０）。配列番号：４１１がここにおいて「ＤＮＡ５２５９８−１５１８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１１）。図４１１に示された配列番号：４１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１２）。配列番号：４１３がここにおいて「ＤＮＡ５４２２８−１３６６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７７０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１３）。図４１３に示された配列番号：４１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１４）。配列番号：４１５がここにおいて「ＤＮＡ５６０４７−１４５６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０８０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１５）。図４１５に示された配列番号：４１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１６）。配列番号：４１７がここにおいて「ＤＮＡ５６１１２−１３７９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０１７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１７）。図４１７に示された配列番号：４１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１８）。配列番号：４１９がここにおいて「ＤＮＡ５６１１３−１３７８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０１６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１９）。図４１９に示された配列番号：４１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２０）。配列番号：４２１がここにおいて「ＤＮＡ５６３５２−１３５８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７９２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２１）。図４２１に示された配列番号：４２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２２）。配列番号：４２３がここにおいて「ＤＮＡ５６４３３−１４０６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ９３８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２３）。図４２３に示された配列番号：４２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２４）。配列番号：４２５がここにおいて「ＤＮＡ５６４３９−１３７６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０１２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２５）。図４２５に示された配列番号：４２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２６）。配列番号：４２７がここにおいて「ＤＮＡ５７５３０−１３７５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１００８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２７）。図４２７に示された配列番号：４２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２８）。配列番号：４２９がここにおいて「ＤＮＡ５７６８９−１３８５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０７５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２９）。図４２９に示された配列番号：４２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３０）。配列番号：４３１がここにおいて「ＤＮＡ５７６９０−１３７４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１００７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３１）。図４３１に示された配列番号：４３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３２）。配列番号：４３３がここにおいて「ＤＮＡ５７６９３−１４２４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０５６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３３）。図４３３に示された配列番号：４３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３４）。配列番号：４３５がここにおいて「ＤＮＡ５７８３８−１３３７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ７９１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３５）。図４３５に示された配列番号：４３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３６）。配列番号：４３７がここにおいて「ＤＮＡ５８７２１−１４７５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１１１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３７）。図４３７に示された配列番号：４３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４３８）。配列番号：４３９がここにおいて「ＤＮＡ５９２０５−１４２１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ８１２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４３９）。図４３９に示された配列番号：４３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４０）。配列番号：４４１がここにおいて「ＤＮＡ５９２１５−１４２５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０６６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４１）。図４４１に示された配列番号：４４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４２）。配列番号：４４３がここにおいて「ＤＮＡ５９２２０−１５１４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４３）。図４４３に示された配列番号：４４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４４）。配列番号：４４５がここにおいて「ＤＮＡ５９２４９−１３８１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１０３１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４５）。図４４５に示された配列番号：４４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４６）。配列番号：４４７がここにおいて「ＤＮＡ５９４８８−１６０３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３６０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４７）。図４４７に示された配列番号：４４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４４８）。配列番号：４４９がここにおいて「ＤＮＡ５９５８８−１５７１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３０９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４４９）。図４４９に示された配列番号：４４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５０）。配列番号：４５１がここにおいて「ＤＮＡ５９６０６−１４７１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１０７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５１）。図４５１に示された配列番号：４５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５２）。配列番号：４５３がここにおいて「ＤＮＡ５９６２０−１４６３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ８３６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５３）。図４５３に示された配列番号：４５３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５４）。配列番号：４５５がここにおいて「ＤＮＡ５９７６７−１４８９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１３２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５５）。図４５５に示された配列番号：４５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５６）。配列番号：４５７がここにおいて「ＤＮＡ５９７７７−１４８０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１３１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５７）。図４５７に示された配列番号：４５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４５８）。配列番号：４５９がここにおいて「ＤＮＡ５９８１４−１４８６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１３０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４５９）。図４５９に示された配列番号：４５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６０）。配列番号：４６１がここにおいて「ＤＮＡ５９８３９−１４６１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ８４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６１）。図４６１に示された配列番号：４６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６２）。配列番号：４６３がここにおいて「ＤＮＡ５９８４６−１５０３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１５４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６３）。図４６３に示された配列番号：４６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６４）。配列番号：４６５がここにおいて「ＤＮＡ５９８４７−１５１１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１８１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６５）。図４６５に示された配列番号：４６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６６）。配列番号：４６７がここにおいて「ＤＮＡ６０６１５−１４８３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６７）。図４６７に示された配列番号：４６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４６８）。配列番号：４６９がここにおいて「ＤＮＡ６０６２１−１５１６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１８６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６９）。図４６９に示された配列番号：４６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７０）。配列番号：４７１がここにおいて「ＤＮＡ６０６２２−１５２５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１９８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７１）。図４７１に示された配列番号：４７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７２）。配列番号：４７３がここにおいて「ＤＮＡ６０６２７−１５０８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１５９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７３）。図４７３に示された配列番号：４７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７４）。配列番号：４７５がここにおいて「ＤＮＡ６０７６４−１５３３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７５）。図４７５に示された配列番号：４７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７６）。配列番号：４７７がここにおいて「ＤＮＡ６０７７５−１５３２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２５０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７７）。図４７７に示された配列番号：４７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７８）。配列番号：４７９がここにおいて「ＤＮＡ６１１８５−１６４６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１４７５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４７９）。図４７９に示された配列番号：４７９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８０）。配列番号：４８１がここにおいて「ＤＮＡ６１８７３−１５７４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３１２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８１）。図４８１に示された配列番号：４８１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８２）。配列番号：４８３がここにおいて「ＤＮＡ６２３０６−１５７０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３０８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８３）。図４８３に示された配列番号：４８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８４）。配列番号：４８５がここにおいて「ＤＮＡ６２８０８−１５８２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８５）。図４８５に示された配列番号：４８５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８６）。配列番号：４８７がここにおいて「ＤＮＡ６２８１４−１５２１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１９２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８７）。図４８７に示された配列番号：４８７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４８８）。配列番号：４８９がここにおいて「ＤＮＡ６４８８５−１５２９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４８９）。図４８９に示された配列番号：４８９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９０）。配列番号：４９１がここにおいて「ＤＮＡ６４８８６−１６０１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３５６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９１）。図４９１に示された配列番号：４９１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９２）。配列番号：４９３がここにおいて「ＤＮＡ６４８８８−１５４２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２７５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９３）。図４９３に示された配列番号：４９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９４）。配列番号：４９５がここにおいて「ＤＮＡ６４８８９−１５４１」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２７４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９５）。図４９５に示された配列番号：４９５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９６）。配列番号：４９７がここにおいて「ＤＮＡ６４８９０−１６１２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３５８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９７）。図４９７に示された配列番号：４９７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９８）。配列番号：４９９がここにおいて「ＤＮＡ６４９０３−１５５３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２８６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９９）。図４９９に示された配列番号：４９９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５００）。配列番号：５０１がここにおいて「ＤＮＡ６４９０５−１５５８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２９４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０１）。図５０１に示された配列番号：５０１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０２）。配列番号：５０３がここにおいて「ＤＮＡ６５４０２−１５４０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２７３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０３）。図５０３に示された配列番号：５０３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０４）。配列番号：５０５がここにおいて「ＤＮＡ６５４０５−１５４７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２７９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０５）。図５０５に示された配列番号：５０５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０６）。配列番号：５０７がここにおいて「ＤＮＡ６５４１２−１５２３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１１９５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０７）。図５０７に示された配列番号：５０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０８）。配列番号：５０９がここにおいて「ＤＮＡ６６３０９−１５３８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１２７１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０９）。図５０９に示された配列番号：５０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１０）。配列番号：５１１がここにおいて「ＤＮＡ６６６６７−１５９６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３３８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１１）。図５１１に示された配列番号：５１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１２）。配列番号：５１３がここにおいて「ＤＮＡ６６６７５−１５８７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３４３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１３）。図５１３に示された配列番号：５１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１４）。配列番号：５１５がここにおいて「ＤＮＡ６８８１８−２５３６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１４３４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１５）。図５１５に示された配列番号：５１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１６）。配列番号：５１７がここにおいて「ＤＮＡ６８８６４−１６２９」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１４１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１７）。図５１７に示された配列番号：５１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１８）。配列番号：５１９がここにおいて「ＤＮＡ６８８７２−１６２０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１９）。図５１９に示された配列番号：５１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２０）。配列番号：５２１がここにおいて「ＤＮＡ７１１５９−１６１７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１３８４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２１）。図５２１に示された配列番号：５２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２２）。配列番号：５２３がここにおいて「ＤＮＡ７３７２７−１６７３」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１５６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２３）。図５２３に示された配列番号：５２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２４）。配列番号：５２５がここにおいて「ＤＮＡ７３７３９−１６４５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１４７４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２５）。図５２５に示された配列番号：５２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２６）。配列番号：５２７がここにおいて「ＤＮＡ７６４００−２５２８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１９１７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２７）。図５２７に示された配列番号：５２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２８）。配列番号：５２９がここにおいて「ＤＮＡ７６５１０−２５０４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１７８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５２９）。図５２９に示された配列番号：５２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３０）。配列番号：５３１がここにおいて「ＤＮＡ７６５２９−１６６６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１５５６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３１）。図５３１に示された配列番号：５３１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３２）。配列番号：５３３がここにおいて「ＤＮＡ７６５３８−１６７０」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１５６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３３）。図５３３に示された配列番号：５３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３４）。配列番号：５３５がここにおいて「ＤＮＡ７７３０１−１７０８」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１６９３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３５）。図５３５に示された配列番号：５３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３６）。配列番号：５３７がここにおいて「ＤＮＡ７７６２４−２５１５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８６８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３７）。図５３７に示された配列番号：５３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５３８）。配列番号：５３９がここにおいて「ＤＮＡ７９２３０−２５２５」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８９０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５３９）。図５３９に示された配列番号：５３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４０）。配列番号：５４１がここにおいて「ＤＮＡ７９８６２−２５２２」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４１）。図５４１に示された配列番号：５４１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４２）。配列番号：５４３がここにおいて「ＤＮＡ８０１４５−２５９４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３５３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４３）。図５４３に示された配列番号：５４３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４４）。配列番号：５４５がここにおいて「ＤＮＡ８３５００−２５０６」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ１８０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４５）。図５４５に示された配列番号：５４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４６）。配列番号：５４７がここにおいて「ＤＮＡ８４９１７−２５９７」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３５７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４７）。図５４７に示された配列番号：５４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５４８）。配列番号：５４９がここにおいて「ＤＮＡ９２２１８−２５５４」と命名されたクローンである、天然配列ＰＲＯ４３０２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５４９）。図５４９に示された配列番号：５４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５５０）。

Claims

以下の（a）又は（b）のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸：
（a）配列番号：６８に示すアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、及び
（b）配列番号：６８に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加された、配列番号：６８に示すアミノ酸配列から由来するポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列であって、かつ前記ヌクレオチド配列からなる核酸が大腸癌
に過剰発現するヌクレオチド配列。
以下の（a）又は（b）のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸：
（a）配列番号：６７に示されるヌクレオチド配列、及び
（b）配列番号：６７に示されるヌクレオチド配列の核酸に対し相補的なヌクレオチド配
列からなる核酸と高度の緊縮性条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、
かつ前記ヌクレオチド配列からなる核酸が大腸癌に過剰発現するヌクレオチド配列。
以下の（a）又は（b）のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。
（a）配列番号：６７に示されるヌクレオチド配列の全長コード配列、及び
（b）配列番号：６７に示されるヌクレオチド配列の核酸に対し相補的なヌクレオチド配
列からなる核酸と高度の緊縮性条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、
かつ前記ヌクレオチド配列からなる核酸が大腸癌に過剰発現するヌクレオチド配列。
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の核酸に対し相補的なヌクレオチド配列を含んで
なる単離された核酸。
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸を含んでなるベクター。
ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列と作用可能に結
合した請求項５に記載のベクター。
請求項５又は６に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
前記細胞がCHO細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
前記細胞が大腸菌である、請求項７に記載の宿主細胞。
前記細胞が酵母細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件
下で培養し、細胞培養物から前記ポリペプチドを回収することを含んでなる、前記ポリペ
プチドの製造方法。
以下の（a）又は（b）のアミノ酸配列を含む単離された天然配列ポリペプチド：
（a）配列番号：６８に示すアミノ酸配列、及び
（b）アミノ酸配列（a）において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れた、（a）から由来するアミノ酸配列であって、かつ前記アミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードする核酸が大腸癌に過剰発現するアミノ酸配列。
異種アミノ酸配列に融合した、請求項１２に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子
。
前記異種アミノ酸配列がエピトープダグ配列である、請求項１３に記載のキメラ分子。
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのFc領域である、請求項１３に記載のキメラ分子
。
請求項１２に記載のポリペプチドへ特異的に結合する抗体。
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体または単鎖抗体である、請求項１
６に記載の抗体。
哺乳類被験者の身体から分離された試験生物学的試料中の配列番号：６８のポリペプチド
をコードする核酸のレベルを、対応する正常生物学的試料中の前記核酸のレベルと比較し
て決定することを含んでなる、前記試験生物学的試料中の前記核酸のレベルの増加が試験
生物学的試料中に癌細胞を含むことを示す診断方法。
試験生物学的試料または正常生物学的試料が組織試料である、請求項１８に記載の方法。
試験組織試料を大腸組織から採取する、請求項１９に記載の方法。
試験生物学的試料又は正常生物学的試料から得られた核酸のレベルを、配列番号：６８の
ポリペプチドをコードする核酸に特異的なプローブを１つもしくはそれ以上用いてハイブ
リダイゼーションすることにより決定する請求項１８に記載の方法。
ハイブリダイゼーションが高度の緊縮性条件下で行われる、請求項２１に記載の方法。
試験生物学的試料又は正常生物学的試料から得られた核酸がcDNAである、請求項２１に記
載の方法。
試験生物学的試料又は正常生物学的試料から得られた核酸がマイクロアレイに置かれる、
請求項２３に記載の方法。
正常生物学的試料と比較して、哺乳類被験者の身体から分離された試験生物学的試料中の
配列番号：６８のポリペプチドの発現レベルを決定することを含んでなる、前記試験生物
学的試料中の前記ポリペプチドの過剰発現が試験生物学的試料中に癌細胞を含むことを示
す診断方法。
配列番号：６８のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて過剰発現を検出する請求
項２５に記載の方法。
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体または単鎖抗体である、請求項２
６に記載の方法。
前記抗体が抗体断片である、請求項２６に記載の方法。
前記抗体が標識されている、請求項２６に記載の方法。