JP2004505606A - 改変された特性を有する変異体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ポリペプチドの変異体（突然変異体）、具体的にはその変異体がαアミラーゼ活性を有し、かつ親のαアミラーゼと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ２＋依存性、比活性、ならびに特に生産条件下での溶解度のうちの少なくとも１つで変化を示すターマミル様αアミラーゼに関する。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、αアミラーゼ活性を有し、かつ親のαアミラーゼと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ２＋依存性、比活性、ならびに特に生産および使用条件下での溶解度のうちの少なくとも１つを変えた親ターマミル様αアミラーゼの変異体（突然変異体）に関する。
【０００２】
発明の背景
αアミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ． Ｃ． ３． ２． １． １）は、デンプンならびにその他の線状および分枝状１，４−グルコシドオリゴ糖および多糖の加水分解を触媒する１群の酵素を構成する。
【０００３】
最新の工業的バイオテクノロジーでは、発酵、精製、回収の間に、また製品の配合で高いタンパク質濃度が達成される。
【０００４】
発酵の間、タンパク質濃度は使用される宿主細胞に左右される。工業的プロセスにおいてはタンパク質濃度は一般に、発酵ブイヨン１ ｌ当たり０．１ｇを超えるところにある。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種中でのαアミラーゼの高収率組換え生産では、タンパク質濃度は発酵ブイヨン１ ｌ当たり２５０ｇもの高濃度であることができる。精製後にはタンパク質濃度は、１ ｌ当たり約１０００ｇのレベルに達する可能性がある。このような高濃度は、活性タンパク質の損失をもたらす望ましくない沈殿を起こす。最近の傾向は、重要性の増しつつある溶液中で酵素を維持する能力を持つ、より丈夫な製品に向っている。往々にしてタンパク質溶液の濃度上昇は、溶解して活性タンパク質にするのが困難なタンパク質の沈殿をもたらす。
【０００５】
したがって本出願の目的は、下記に定義される改変された特性を有する、具体的には高い溶解度を有するαアミラーゼを提供することである。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、対応する親αアミラーゼ、すなわち突然変異していないαアミラーゼと比較してその変異体がαアミラーゼ活性を有し、かつ上記親αアミラーゼと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ２＋依存性、比活性、ならびに溶解度、具体的には生産条件下での高い溶解度のうちの少なくとも１つで変化を示すターマミル様アミラーゼを提供することである。
【０００７】
命名法：
この記述および特許請求の範囲においては、アミノ酸残基の従来の１字および３字コードが用いられる。参照しやすいように本発明のαアミラーゼ変異体は次の命名法、すなわち元のアミノ酸：位置：置換されたアミノ酸を用いて記述される。
【０００８】
この命名法によれば、例えば３０位でのアラニンのアスパラギンへの置換は、
Ａｌａ３０ＡｓｎまたはＡ３０Ｎ
と示され、同じ位置におけるアラニンの欠失は、
Ａｌａ３０＊またはＡ３０＊
と示され、またリシンなどの付加アミノ酸残基の挿入は、
Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓまたはＡ３０ＡＫ
と示される。
【０００９】
アミノ酸残基３０〜３３位など、アミノ酸残基の連続的な区間の欠失は、（３０〜３３）＊またはＤＥＬＴＡ（Ａ３０〜Ｎ３３）と示される。
【００１０】
特定のαアミラーゼが他のαアミラーゼと比較して「欠失」を含み、挿入がそのような位置で行なわれる場合、３６位へのアスパラギン酸の挿入は、
＊３６Ａｓｐまたは＊３６Ｄ
と示される。多重突然変異はプラス記号によって分けられ、
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４ＳｅｒまたはＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
は、アラニンとグルタミン酸をそれぞれにアスパラギンとセリンに置換する３０および３４位における突然変異を表す。
【００１１】
所定の位置に１または複数の別のアミノ酸残基を挿入することができる場合、それは
Ａ３０Ｎ、Ｅあるいは
Ａ３０ＮまたはＡ３０Ｅ
と示される。
さらに、或る特定の修飾が示唆されることなしに修飾に適した位置が本明細書中で識別される場合、その位置に存在する任意のアミノ酸残基を任意のアミノ酸残基に換えることができることが理解されるはずである。したがって、例えば３０位でのアラニンの修飾について述べられ、しかし特定されない場合、アラニンを欠失するか、または任意の他のアミノ酸、すなわちＲ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか１つで置換することができることが理解されるはずである。さらに、「Ａ３０Ｘ」は次の置換、すなわちＡ３０Ｒ、Ａ３０Ｎ、Ａ３０Ｄ、Ａ３０Ｃ、Ａ３０Ｑ，Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｇ、Ａ３０Ｈ、Ａ３０Ｉ、Ａ３０Ｌ、Ａ３０Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ａ３０Ｓ、Ａ３０Ｔ、Ａ３０Ｗ、Ａ３０Ｙ、またはＡ３０Ｖ、また簡単に云えばＡ３０Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか１つを意味する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、酵素などのポリペプチド、具体的には親ポリペプチドと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ２＋依存性、比活性、ならびに溶解度、特に生産条件下での溶解度のうちの少なくとも１つを変えたαアミラーゼを提供することである。これらの特性はさらに下記に定義する。
【００１３】
ポリペプチド：
本発明によるポリペプチドには、生物活性、抗微生物活性、および酵素活性を有するタンパク質が含まれる。
【００１４】
検討された酵素活性には、プロテアーゼ、アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、グルコアミラーゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼが含まれる。
【００１５】
好ましい一実施形態において酵素は、αアミラーゼ、具体的にはＢａｃｉｌｌｕｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓαアミラーゼである。好ましい実施形態においてＢａｃｉｌｌｕｓαアミラーゼは、ターマミル様アミラーゼである。
【００１６】
生物活性を有するポリペプチドには、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、調節ペプチド、血液凝固因子、抗体などが含まれる。
【００１７】
改変された溶解度を有するポリペプチド：
タンパク質（ポリペプチド）の結晶は、三次元に密に詰め込まれた体系的な規則正しい同一単位に組み立てられている。単位格子は、１または複数のタンパク質分子とかなりの量の水を含有することができる。また、イオン様のカルシウム、ナトリウム、塩化物、硫酸塩、ならびに界面活性剤および基質などの大きな分子（結晶の成長の間存在する）を三次構造中に識別することができる。単一分子および単一原子はきわめて小さいが、同一単位の反復配列はＸ線散乱を容易にし、したがってタンパク質工学の目的に使用することができる構造情報を提供する。
【００１８】
結晶に比べて沈殿および凝集塊は小さな単位であり、また単一分子は結晶よりも無秩序である。それにもかかわらず分子間の相互作用の幾つかは規則正しい結晶中に見出されるものと同じであり、したがって特性の変わった、特に沈殿傾向の少ない、タンパク質工学的に創られるαアミラーゼの変異体、すなわち溶解度の大きい変異体を設計するためにこの三次構造（３Ｄ構造）および分子間情報を使用することができる。
【００１９】
タンパク質の球形、また往々にして不規則な表面構造により、単位格子中には水などのより無秩序な溶媒によって占められている大きな孔が存在する。実際にはタンパク質表面の大部分は水の層で覆われており、これがＸ線結晶学によって解明されたタンパク質構造が溶液中のタンパク質構造と同一である理由の一つである。タンパク質分子はわずかな領域で直接互いに接しているが、溶媒が介在する接触もまた結晶を互いに結合する「接着剤」として働いている。
【００２０】
一般にタンパク質の溶解度は、有機溶剤、硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ、およびＣａＣｌ２などの塩により、また分子の表面電荷を変えるｐＨの変化により影響を受ける。これらの要因は、酵素の生産では溶液中の酵素を維持すること、また結晶学的実験では有用な結晶を成長させることの両者への影響が考えられる。大きな対称性の結晶は、タンパク質濃度をゆっくり上昇することによって、またはタンパク質表面を変質し、それによって分子間の接触を増大させることによって成長する。すべてのタンパク質がＸ線結晶学的な判定法にとって有用な形態に結晶化するわけではないが、鋳型の分子と考察の対象になっている分子との間の相同性が十分に大きい場合は現存する三次構造に基づいて正確なモデルを組み立てることができる。
【００２１】
酵素などの相同ポリペプチド、具体的にはターマミル様αアミラーゼ（下記に定義される）を三次構造に基づいて比較すると、違いの多くは分子の表面に見出される。
【００２２】
それにもかかわらず本発明者等は、ターマミル様アミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で開示されるＳＰ７２２）の結晶形成に関係している（直接的に、または水分子を介して間接的に）ことが確認されている表面残留物が他のターマミル様アミラーゼ（下記に定義される）の結晶化においてもまた重要な役割を果たしていることを見出した。
【００２３】
或るターマミル様αアミラーゼの三次構造を別のターマミル様αアミラーゼの三次構造（添付資料１に開示したＳＰ７２２構造）からモデル化する一例を下記に記述する。
【００２４】
本発明の概念および下記に記載の本発明によるモデル化の方法は、一般にすべてのポリペプチド、αアミラーゼなどのタンパク質、特に酵素に外挿することができることが理解されよう。
【００２５】
ＳＰ７２２三次構造ならびに別のターマミル様αアミラーゼ三次構造のモデル化：
本発明のαアミラーゼの突然変異体は、ＳＰ７２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の添付資料１に示した三次構造に基づいて見出された。別のポリペプチドの突然変異体は、別の三次構造に基づいて見出すことができる。アルカリ性ターマミル様αアミラーゼ（ＳＰ７２２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示され、また米国特許第５，８２４，５３１号に開示されている）の結晶は懸滴培養法（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｍｅｔｈｏｄ）（当業界でよく知られている）によって得られ、またその三次構造（３Ｄ構造）は本明細書の添付資料１に開示されている。
【００２６】
単位格子は４個の酵素分子を含有していることが分かり、各分子は８個の相互作用する帯域を有している（図２および３参照）。２つの帯域は活性部位を取巻く酵素の側面で識別され、また１つの大きな領域が活性部位に対してαアミラーゼの裏側に見出される。さらに側面に２つの相互作用帯域、および上部から底部まで相互作用を行なう分子の底部の相互作用面と上部の相互作用面がある。
【００２７】
図２から分かるように活性部位を取巻く２つの相互作用帯域は、逆平行の隣りの分子上の同じ２つの領域と相互作用している。同様に裏側の帯域は第三の逆平行アミラーゼ分子上の裏側の帯域と接している。ただしここですべての接触には水が介在している。相互作用する領域が分子全体に広がることもまた図２および３から分かる。
【００２８】
添付資料１に開示したＳＰ７２２三次構造に基づいて別のアルカリ性ターマミル様アミラーゼＡＡ５６０のモデルを組み立てた。ＡＡ５６０ αアミラーゼは、鋳型のアミラーゼ（ＳＰ７２２）と約８７％同一であり、その配列には挿入または欠失を何も含んでいない。高い相同性（同一性）、同じ対称性、および同じ結晶相互作用によりタンパク質表面の相互作用帯域が、生産すなわち発酵段階から始まり精製段階までの間に到達する高いタンパク質濃度で結晶化および沈殿と関係する（背景の項参照）。
【００２９】
これら相互作用帯域中の突然変異を構築し、その酵素を発現し精製し、そのタンパク質の溶解度を「材料および方法」の項に記載の方法を用いて実施例８および９に記載のように異なる条件下で測定した。
【００３０】
本発明の発見は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示したターマミル様αアミラーゼと少なくとも６０％同一の、好ましくは少なくとも７０％同一の、より好ましくは８０％同一の、一層好ましくは８５％同一の、一層好ましくは９０％同一の、一層好ましくは９５％同一の、一層好ましくは９７％同一の、一層好ましくは９９％同一のターマミル様アミラーゼに応用することができる。好ましくはこの発見は、ＳＰ７２２（図１のアラインメントで番号１として示されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）と比べてアライニングされた一次構造中に追加のアミノ酸残基または間隙のないアルカリ性ターマミル様αアミラーゼ、特に同じ長さのアルカリ性αアミラーゼの場合に使用することができる。特にこの発見は、次のアルカリ性ターマミル様αアミラーゼ、すなわちＳＰ６９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＳＰ７２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＡＡ５６０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、＃７０７ αアミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、国際公開特許第９７／００３２４号に記載されているＫＳＭ ＡＰ１３７８ αアミラーゼ中に開示されたＫＳＭ ＡＰＥ １３７８ αアミラーゼ、あるいはそれらの断片または端を切取った形態の場合に使用することができる。これらアルカリ性αアミラーゼは、上記相互作用帯域の周囲にきわめて類似の三次結晶構造を有し、かつアミノ酸４８５個の長さの同一の一次構造を有する。
【００３１】
これとは逆に、例えばターマミル（図１のアラインメントで配列番号４として示されている）は２個のアミノ酸残基（１および２位）を欠き、１７４および１８１〜１８２位に間隙を有し、かつＳＰ７２２とアライニングした場合、３７８〜３８１位に３個の追加のアミノ酸残基を有する。ＢＡＮ（図１のアラインメントで配列番号３として示されている）は、５個のアミノ酸残基（１〜４および４８８位）を欠き、１７４および１８１〜１８２位に間隙を有し、かつＳＰ７２２とアライニングした場合、３７８〜３８１位に３個の追加のアミノ酸残基を有する。ＢＳＧ（図１のアラインメントで配列番号５として示されている）は、１個のアミノ酸残基（１位）を欠き、かつＳＰ７２２ｔ位置合わした場合、４８９〜５１９位に３１個の追加のアミノ酸残基を有する。
【００３２】
ＫＳＭ−Ｋ３６およびＫＳＭ−Ｋ３８（欧州特許公開第１，０２２，３３４−Ａ号）は、５個のアミノ酸残基（１および２位）を欠き、かつＳＰ７２２とアライニングした場合、１７４および１８１〜１８２位に間隙を有する。ＡＡ１８０、ＡＡ２０、およびＡｍｒｋ３８５（デンマーク特許出願第ＰＡ２０００ ００３４７号または国際特許公開第ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１３３号）は、ＳＰ７２２とアライニングした場合、２６１位に１個の追加のアミノ酸を有する。
【００３３】
どのようにして別のαアミラーゼからターマミル様αアミラーゼをモデル化するかを下記に記述する。実施例４においてはＳＰ７２２からのＡＡ５６０のモデル化について記述する。この方法は、例えば上記のように別のポリペプチドにも外挿することができる。
【００３４】
ターマミル様αアミラーゼのモデル化：
国際特許公開第９６／２３８７４号は、Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼ（ＢＡＮ（商標））のＮ終末部の３００個のアミノ酸残基およびＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼのＣ終末部末端のアミノ酸３０１〜４８３位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）からなるターマミル様αアミラーゼの三次構造（３Ｄ構造）、Ｘ線結晶構造データを提供する。国際特許公開第９６／２３８７４号はさらに、親ターマミル様αアミラーゼ、また親と比べて改変された特性を示す親ターマミル様αアミラーゼ変異体の構造解析に基づく設計（モデル化）の方法論について記述している。
【００３５】
国際特許公開第９６／２３８７４号によればその他のターマミル様構造もモデル化することができ、これは参照により本明細書に合体されている。
【００３６】
本発明の変異体を得ることに関しては、実施例１に記載のようにＳＰ７２２三次構造（添付資料１に開示されている）に基づいてＡＡ５６０三次構造が設計（モデル化）された。他のターマミル様αアミラーゼ（例えば本明細書中に開示されているもの）の構造も同様に組み立てることができる。
【００３７】
ターマミル様αアミラーゼ：
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．によって生成された幾つかのαアミラーゼは、アミノ酸レベルに関して高度に相同（同一）である。幾つかのＢａｃｉｌｌｕｓ αアミラーゼの同一性は、下記の表１に見出すことができる。
【００３８】
【表１】
【００３９】
例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されたアミノ酸配列を含むＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）として市販されている）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されたアミノ酸配列を含むＢ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼと約８１％相同であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されたアミノ酸配列を含むＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αアミラーゼとは約６５％相同であることが分かった。さらに、相同のαアミラーゼには、国際特許公開第９５／２６３９７号に開示され、またさらに本明細書中でそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２および ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で表されるＳＰ６９０およびＳＰ７２２が含まれる。その他のアミラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．から得られ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＡＡ５６０ αアミラーゼと、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． から得られ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される＃７０７ αアミラーゼがあり、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ等の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， １５１， ｐｐ．２５〜３１ （１９８８） に記載されている。
【００４０】
ＫＳＭ ＡＰ１３７８ αアミラーゼは、国際特許公開第９７／００３２４号（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから出願されている）に開示されている。また、欧州特許公開１，０２２，３３４号に開示されているＫ３６およびＫ３８ αアミラーゼが本発明により考察されている。
【００４１】
さらに、相同のαアミラーゼには、欧州特許公開０２５２６６６号に記載のＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株（ＡＴＣＣ ２７８１１）によって産生されたαアミラーゼと、国際特許公開第９１／００３５３号および第９４／１８３１４号で同定されているαアミラーゼがある。その他の市販のターマミル様αアミラーゼは、Ｏｐｔｉｔｈｅｒｍ（商標）およびＴａｋａｔｈｅｒｍ（商標）（Ｓｏｌｖａｙから入手できる）、Ｍａｘａｍｙｌ（商標）（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手できる）、Ｓｐｅｚｙｍ ＡＡ（商標）およびＳｐｅｚｙｍｅ Ｄｅｌｔａ ＡＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手できる）、Ｋｅｉｓｔａｓｅ（商標）（Ｄａｉｗａから入手できる）、Ｐｕｒａｓｔａｒ （商標）ＳＴ ５０００Ｅ、ＰＵＲＡＳＴＲＡ（商標） ＨＰＡＭ Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔ．から入手できる）の商標名で販売されている製品中に含まれている。
【００４２】
これらαアミラーゼの間に見出される実質上の相同性のために、これらはαアミラーゼの同じクラス、すなわち「ターマミル様αアミラーゼ」のクラスに属すると考えられる。
【００４３】
したがって、本明細書の文脈においては用語「ターマミル様αアミラーゼ」は、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、すなわち本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼとアミノ酸レベルでほぼ同一性を示すαアミラーゼを指すことを意図している。
【００４４】
換言すれば、本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、および１３で示されるアミノ酸配列を有するすべてのαアミラーゼが「ターマミル様αアミラーゼ」であると考えられる。その他のターマミル様αアミラーゼは、ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、および１３で示される上記アミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも７０％など少なくとも６０％、例えば少なくとも７５％、すなわち少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の相同性を示すαアミラーゼ、および／またはｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、３、５、７、９で識別され、かつ本明細書の上記の特定されたαアミラーゼをコードするＤＮＡ配列（そのコード配列はそれぞれ本明細書のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、および１２に示されるアミノ酸配列をコードする）にハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされるαアミラーゼである。
【００４５】
特性ｉ）に関して相同性は、第一配列が第二配列から派生したことを示す２つの配列の間の同一性の度合として決定することができる。相同性は適切には、ＧＣＧプログラムパッケージとして提供されるＧＡＰなどの当業界で周知のコンピュータプログラムにより決定することができる（前述）。したがってＧａｐ ＧＣＧｖ８は、次のデフォルトパラメータ、すなわちＧＡＰ生成（ｃｒｅａｔｉｏｎ）ペナルティ５．０およびＧＡＰ拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティ０．３、また核酸配列については３．０、タンパク質配列については０．１それぞれのデフォルトのスコアリングマトリックスを用いて使用することができる。ＧＡＰは、アラインメントにＮｅｅｄｌｅｍａｎ／Ｗｕｎｓｃｈ／Ｓｅｌｌｅｒｓの方法を用いる。
【００４６】
ターマミル（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）と別のターマミル様αアミラーゼの間の構造的アラインメントを用いて他のターマミル様αアミラーゼ中の等価の／対応する位置を識別することができる。上記の構造的アラインメントを得るための１つの方法は、ＧＡＰペナルティのデフォルト値、すなわちＧＡＰ生成ペナルティ３．０およびＧＡＰ拡張ペナルティ０．１を用いたＧＣＧパッケージの積み重ねプログラムを使用することである。その他の構造的アラインメントの方法には、疎水性クラスター分析（Ｇａｂｏｒｉａｕｄ等の論文、ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ２２４， ｐｐ． １４９￣１５５ （１９８７））および逆ねじ切り法（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）（Ｈｕｂｅｒ， ＴおよびＴｏｒｄａ， ＡＥの論文、ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｖｏｌ． ７， Ｎｏ． １， ｐｐ． １４２￣１４９ （１９９８））がある。
【００４７】
ハイブリダイゼーション：
上記の特性ｉｉ）に合致するターマミル様αアミラーゼなどのポリペプチドの特徴描写に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは適切には、検討対象になっているαアミラーゼの完全または部分ヌクレオチドあるいはアミノ酸の配列に基づいて調製することができる。
【００４８】
ハイブリダイゼーションを試験するための適切な条件は、５ＸＳＳＣ中に予備浸漬し、２０％ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、および変性し音波処理された子ウシ胸腺のＤＮＡ ５０ｍｇからなる溶液中で〜４０℃で１時間予備ハイブリダイズさせ、続いて１００ｍＭ ＡＴＰを追加した同じ溶液中で〜４０℃で１８時間ハイブリダイズさせ、続いて２ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で３回のフィルタ洗浄を、４０℃（低ストリンジェンシー）、好ましくは５０℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは６５℃（高ストリンジェンシー）、さらに好ましくは〜７５℃（超高ストリンジェンシー）で３０分間行なうものである。ハイブリダイゼーション法に関してより詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の著書、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９中に見ることができる。
【００４９】
本明細書の文脈中で「から得られる」とは、検討対象になっている生物株によって産生された、または産生可能なαアミラーゼを指すだけでなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によってコードされ、そのＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物中で産生されるαアミラーゼを指すことを意図している。結局、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、検討対象になっているαアミラーゼを識別する特徴を有するαアミラーゼを指すことを意図している。この用語はまた、親αアミラーゼが天然に産するαアミラーゼの変異体、すなわち天然に産するαアミラーゼの１または複数のアミノ酸残基の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体であってもよいことを指すことを意図している。
【００５０】
親ターマミル様αアミラーゼ：
本発明によれば、上記で定義した通りすべてのターマミル様αアミラーゼは、親αアミラーゼ（すなわち、骨格）として使用することができる。本発明の好ましい実施形態において親αアミラーゼは、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼなどの上記で言及されたものの１つから得られる。特に好ましい親αアミラーゼは、ＳＰ７２２ αアミラーゼおよびＡＡ５６０ αアミラーゼである。一実施形態において親αアミラーゼは、１または複数の次の突然変異／置換、すなわちＤＥＬＴＡ（Ｒ８１〜Ｇ１８２）、ＤＥＬＴＡ（Ｒ１８３〜Ｇ１８４）、ＤＥＬＴＡ（Ｒ１８３〜Ｇ１８４）＋Ｎ１９５Ｆ、ＲＲ１８１Ｑ＋Ｎ４４５Ｑ＋Ｋ４４６Ｎ、ＤＥＬＴＡ（Ｒ１８３〜Ｇ１８４）＋Ｒ１８１Ｑを有する。
【００５１】
親のハイブリッドターマミル様αアミラーゼ：
親αアミラーゼ（すなわち骨格αアミラーゼ）はまた、ハイブリッドαアミラーゼ、すなわち少なくとも２種類のαアミラーゼから得られる部分アミノ酸配列の組合せを含むαアミラーゼであってもよい。
【００５２】
親のハイブリッドαアミラーゼは、アミノ酸の相同性（同一性）および／またはＤＮＡハイブリダイゼーション（上記で定義される）に基づいてターマミル様αアミラーゼのファミリーに属することを決めることができるものである。この場合、ハイブリッドαアミラーゼは一般に、ターマミル様αアミラーゼが少なくとも一部分と、ターマミル様αアミラーゼあるいは微生物（細菌または真菌）および／または哺乳類起源の非ターマミル様αアミラーゼから選択される１または複数の別のαアミラーゼ部分とから構成される。
【００５３】
したがって親のハイブリッドαアミラーゼは、少なくとも２種類のターマミル様αアミラーゼから得られる、または少なくとも１種類のターマミル様αアミラーゼと少なくとも１種類の非ターマミル様の細菌性αアミラーゼとから得られる、または少なくとも１種類のターマミル様αアミラーゼと少なくとも１種類の真菌性αアミラーゼとから得られる部分アミノ酸配列の組合せを含むことができる。部分アミノ酸配列を導出するターマミル様αアミラーゼは、本明細書で言及したこれら特定のターマミル様αアミラーゼのいずれかであることができる。
【００５４】
例えば親αアミラーゼは、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株から得られるαアミラーゼのＣ終末部分と、Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株またはＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株から得られるαアミラーゼのＮ終末部分とを含むことができる。例えば親αアミラーゼは、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのＣ終末部分の少なくとも４３０個のアミノ酸残基を含むことができ、また例えば、ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼのＮ終末部の３７個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼのＣ終末部の４４５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントとを含んでもよく、またはターマミル配列すなわちＮ終末部の３５個のアミノ酸残基（成熟タンパク質の）が、ＢＡＮすなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるＢ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼのＮ終末部の３３個のアミノ酸残基（成熟タンパク質）により置き換えられていることを除けば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８で示されるＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼと同一のハイブリッドターマミル様αアミラーゼを含んでもよく、あるいはｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αアミラーゼのＮ終末部の６８個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼのＣ終末部の４１５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントとを含んでもよい。
【００５５】
別の好適な親のハイブリッドαアミラーゼは、ＢＡＮすなわちＢ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼのＮ終末部（成熟タンパク質のアミノ酸１〜３００位）と、ターマミル由来のＣ終末部（成熟タンパク質のアミノ酸３０１〜４８３位）を構成する、以前に国際特許公開第９６／２３８７４号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから出願されている）に記載されたものである。
【００５６】
改変される特性：
下記に本発明の変異体中に存在する突然変異と、それによりもたらされる特性の望ましい変化（親ターマミル様αアミラーゼの特性と比べて）との関係について考察する。
【００５７】
前述のように本発明は改変された特性、特に生産条件下で改変された特性を有するターマミル様αアミラーゼに関する。
【００５８】
特に意図する特性の変化を実現することと関連して特に検討された親ターマミル様αアミラーゼは、前述の親ターマミル様αアミラーゼおよび親のハイブリッドターマミル様αアミラーゼである。ＳＰ７２２ αアミラーゼを出発点として用いるが、例えばターマミル、ＢＳＧ、ＢＡＮ、ＡＡ５６０、ＳＰ６９０、ＡＡ１８０、ＫＳＭ ＡＰ１３７８、および＃７０７、Ｋ３８、Ｋ３６中の対応する位置もまた開示されたものと理解されるべきである。
【００５９】
好ましい実施形態において本発明の変異体は、特に洗濯およびクリーニング条件下で高い溶解度を有する。
【００６０】
一態様において本発明は、前述のように改変された特性を有する変異体に関する。
【００６１】
第一の態様において親ターマミル様αアミラーゼの変異体は、
【００６２】
【表２】
【００６３】
の群から選択される１または複数の位置（アミノ酸ナンバリングではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いる）に変化を含む変異体であって、
【００６４】
（ａ）その変化は独立に、
（ｉ）その位置を占めるアミノ酸の下流に向ってアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占めるアミノ酸の欠失、または
（ｉｉｉ）異なるアミノ酸によるその位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）その変異体はαアミラーゼ活性を有し、かつ
（ｃ）各位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２で示されるＡＡ５６０のアミノ酸配列を有する親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する。
【００６５】
ＳＰ７２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）ではそのような対応位置は、Ｒ２８、Ｎ９４、Ｌ１１８、Ｎ１２５、Ｑ１７４、Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｄ１８３、Ｇ１８４、Ａ１８６、Ｗ１８９、Ｎ１９５、Ｍ２０２、Ｙ２９８、Ｎ２９９、Ｎ３０２、Ｓ３０３、Ｎ３０６、Ａ３１０、Ｎ３１４、Ｋ３２０、Ｈ３２４、Ｑ３４５、Ｆ３９６、Ｔ４００、Ｗ４３９、Ｑ４４４、Ｎ４４５、Ｋ４４６、Ｑ４４９、Ｋ４５８、Ｎ４７１、Ｋ４８４である。
【００６６】
好ましい実施形態において本発明の変異体（ナンバリングではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いる）は、次の１または複数の突然変異／置換、すなわち
【００６７】
【表３】
【００６８】
を有する。
【００６９】
好ましい二重、三重、および多重突然変異（ナンバリングの基準としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いた）には、
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
がある。
【００７３】
検討された変異体には、実施例で記述した特定のもの、およびさらに１または複数の突然変異／置換、すなわちＤＥＬＴＡ（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）；Ｎ１９５Ｆ；Ｒ１８１Ｑ；Ｇ１８６Ｒ；Ｍ２０２Ｌ；Ｖ２０６Ｆ、Ｌ、Ｍ；Ｎ１９３Ｓ、Ｔ、Ｐと組み合わせた前述の突然変異が含まれる。
【００７４】
高い溶解度：
前述の突然変異はすべて、上記の定義のようにターマミル様αアミラーゼのグループ内の任意のαアミラーゼで用いられた場合、改変された溶解度を有するターマミル様αアミラーゼ変異体をもたらす。
【００７５】
したがって好ましい実施形態において本発明の変異体は、
【００７６】
【表６】
【００７７】
の群から選択される１または複数の位置（アミノ酸のナンバリングではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いる）における変化を含む、親ターマミル様αアミラーゼと比べて高い溶解度（さきに定義した）を有する親ターマミル様αアミラーゼの変異体であって、
【００７８】
（ａ）その変化は独立に、
（ｉ）その位置を占めるアミノ酸の下流に向ってアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占めるアミノ酸の欠失、または
（ｉｉｉ）異なるアミノ酸によるその位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）その変異体はαアミラーゼ活性を有し、かつ
（ｃ）各位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２で示されるＡＡ５６０のアミノ酸配列を有する親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する。
【００７９】
好ましい実施形態において、親αアミラーゼと比べて高い溶解度を有する本発明の変異体は、次の置換、すなわち
【００８０】
【表７】
【００８１】
を有する。
【００８２】
好ましい実施形態において高い溶解度（「材料および方法」の項に記載の方法の一つを用いて決定される）を有する本発明の変異体（ナンバリングの基準としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いた）には、
【００８３】
【表８】
【００８４】
【表９】
【００８５】
【表１０】
【００８６】
が含まれる。
【００８７】
本発明による別の組合せには、実施例中に記述されている特定の組合せ、および次の置換、すなわちＮ１９５Ｆ；Ｒ１８１Ｑ；Ｇ１８６Ｒ；Ｍ２０２Ｌ；Ｖ２０６Ｆ、Ｌ、Ｍ；Ｎ１９３Ｐの１または複数が含まれる。
【００８８】
安定性：
本発明の文脈において改変された安定性、具体的には改良された安定性（すなわち、より高いまたはより低い）、特に高ｐＨ（すなわちｐＨ ８ ￣１０．５）における安定性に関して重要な突然変異には、「改変された特性」の項でリストアップした突然変異のいずれかが含まれる。
【００８９】
Ｃａ２＋安定性：
改変されたＣａ２＋安定性とは、Ｃａ２＋が消耗したときの酵素の安定性、すなわちより高いまたはより低い安定性が改良されたことを意味する。本発明の文脈において改変されたＣａ２＋安定性、具体的には改良されたＣａ２＋安定性、すなわち特に高ｐＨ（すなわちｐＨ ８ 〜１０．５）における高いまたはより低い安定性を達成することに関して重要な突然変異（アミノ酸の置換および欠失を含む）には、「改変された特性」の項でリストアップした突然変異のいずれかが含まれる。
【００９０】
比活性：
本発明の更なる態様において、改変された比活性、具体的には特に温度１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、特に３０〜４０℃における比活性の増加または減少を示す変異体を得ることに関して重要な突然変異（アミノ酸の置換および欠失を含む）には、「改変された特性」の項でリストアップした突然変異のいずれかが含まれる。
【００９１】
本発明の変異体における一般的な突然変異：
特に興味深い突然変異（アミノ酸の置換および欠失を含む）は、酵素の活性部位のまわりの動きやすさを増加させる突然変異である。これは活性部位の近傍、すなわち活性部位を構成する残基のいずれかから好ましくは１０Åまたは８Åまたは６Åまたは４Å以内で安定化をもたらす相互作用を乱す変化によって達成される。
【００９２】
例には、ＡｌａからＧｌｙ；ＶａｌからＡｌａまたはＧｌｙ；ＩｌｅまたはＬｅｕからＶａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙ；ＴｈｒからＳｅｒなどの側鎖のサイズを減少させる突然変異がある。
【００９３】
このような突然変異は空洞の導入、または突然変異によって残った空間を充たす構造的再配列のいずれかにより活性部位領域の柔軟性の増加を引き起こすと考えられる。
【００９４】
本発明の変異体は上記で略述したものに加えて１または複数の修飾を含むことが好ましい。したがって有利には修飾されるαアミラーゼの変異体の一部に存在する１または複数のプロリン残基を非プロリン残基で置換することができ、この非プロリン残基は考えられる天然に産する非プロリン残基のいずれであってもよく、また好ましくはアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、またはロイシンである。
【００９５】
同様に、親αアミラーゼを修飾するアミノ酸残基中に存在する１または複数のシステイン残基をセリン、アラニン、スレオニン、グリシン、バリン、またはロイシンなどの非システイン残基で置換することが好ましい。
【００９６】
さらに本発明の変異体は、単独の修飾として、または上記に略述した修飾のいずれかと組み合わせて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸断片１８５〜２０９位に対応するアミノ酸断片中に存在する１または複数のＡｓｐおよび／またはＧｌｕがそれぞれＡｓｎおよび／またはＧｌｎに置換されるように修飾してもよい。また、ターマミル様αアミラーゼ中で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸断片１８５〜２０９位に対応するアミノ酸断片中に存在するＬｙｓ残基の１または複数をＡｒｇに置換することも興味深い。
【００９７】
本発明が上記に略述した修飾の２つ以上を組み込んだ変異体を包含することが理解されよう。
【００９８】
さらに、有利には下記の１または複数の位置（ナンバリングではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標））を用いる）に突然変異を導入することができる。すなわち、
【００９９】
Ｍ１５、Ｖ１２８、Ａ１１１、Ｈ１３３、Ｗ１３８、Ｔ１４９、Ｍ１９７、Ｎ１８８、Ａ２０９、Ａ２１０、Ｈ４０５、Ｔ４１２、特に下記の単一、二重、または三重もしくは多重突然変異：
【０１００】
Ｍ１５Ｘ、特にＭ１５Ｔ、Ｌ；
Ｖ１２８Ｘ、特にＶ１２８Ｅ；
Ｈ１３３Ｘ、特にＨ１３３Ｙ；
Ｎ１８８Ｘ、特にＮ１８８Ｓ、Ｔ、Ｐ；
Ｍ１９７Ｘ、特にＭ１９７Ｔ、Ｌ；
Ａ２０９Ｘ、特にＡ２０９Ｖ；
Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｆ；Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｙ；Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；
【０１０１】
Ｍ１５／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ；Ｄ１２４Ｃ／Ｒ１２７Ｃ；Ｈ１３３Ｙ／Ｔ１４９Ｉ；Ｇ４７５Ｒ、Ｈ１３３Ｙ／Ｓ１８７Ｄ；Ｈ１３３Ｙ／Ａ２０９Ｖ；
【０１０２】
ＡＡ５６０ではこれは、Ｌ１７Ｘ、特にＬ１７Ｔ；
Ｅ１３０Ｘ；
Ｙ１３５Ｘ；
Ｗ１４０Ｘ、特にＷ１４０Ｆ、Ｙ；
Ｔ１９３Ｘ、特にＴ１９３Ｓ、Ｐ；
Ｍ２０２Ｘ、特にＭ２０２Ｔ、Ｌ；
Ｖ２１４Ｘに対応し；
検討されたこれらの組合せには、
Ｍ２０２Ｔ／Ｗ１４０Ｆ；Ｍ２０２Ｔ／Ｗ１４０Ｙ；Ｌ１７Ｔ／Ｔ１９３Ｓ；Ｌ１７Ｔ／Ｎ１９３Ｐ；Ｅ１２１Ｃ／Ｓ１３２Ｃ；Ｎ１２６Ｃ／Ｑ１２９Ｃ；Ｔ１５１Ｉ；Ｇ４８０Ｒが含まれる。
【０１０３】
本発明のαアミラーゼ変異体の調製方法：
遺伝子中に突然変異を導入するには幾つかの方法が当業界で知られている。αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングについて簡単な考察の後、αアミラーゼをコードする配列内の特定の部位で突然変異を生じさせる方法について考察することにする。
【０１０４】
αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング：
親αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、当業界でよく知られているさまざまな方法を用いて検討対象になっているαアミラーゼを産生する任意の細胞または微生物から単離することができる。まず、試験されるαアミラーゼを産生する生物由来の染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを用いてゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡのライブラリーを構築する。次いで、αアミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合は、相同の標識したオリゴヌクレオチドプローブを合成し、使用して検討対象になっている生物から調製されたゲノムライブラリーからαアミラーゼをコードするクローンを識別することができる。別法では、知られているαアミラーゼの遺伝子と相同の配列を含む標識したオリゴヌクレオチドプローブを、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いたαアミラーゼをコードするクローンを識別するためのプローブとして使用することができる。
【０１０５】
αアミラーゼをコードするクローンを識別するためのさらに別の方法は、プラスミドなどの発現ベクターにゲノムＤＮＡの断片を導入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーでαアミラーゼ陰性細菌を形質転換し、次いで形質転換された細菌をαアミラーゼ用の基質を含有する寒天上で培養し、それによってクローンが識別すべきαアミラーゼを発現するのを可能にするものである。
【０１０６】
別法では、酵素をコードするＤＮＡ配列を確立されている標準的な方法、例えばＳ．Ｌ．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの論文、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２， １９８１， ｐｐ．１８５９￣１８６９に記載されているホスホロアミダイト法、またはＭａｔｔｅｓ等の論文、Ｔｈｅ ＲＭＢＯ Ｊ． ３， １９８４， ｐｐ．８０１￣８０５に記載されている方法により合成的に調製することができる。ホスホロアミダイト法ではオリゴヌクレオチドを、例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成し、精製し、アニールし、連結反応させ、適切なベクター中でクローン化する。
【０１０７】
結局ＤＮＡ配列は標準的な技術に従って、合成、ゲノム、またはｃＤＮＡ由来の断片（適宜、ＤＮＡ配列全体のさまざまな部分に対応する断片）を連結反応させることによって調製される、ゲノムと合成由来の混合配列、合成とｃＤＮＡ由来の混合配列、またはゲノムとｃＤＮＡ由来の混合配列であってもよい。ＤＮＡ配列はまた、例えば米国特許第４，６８３，２０２号またはＲ． Ｋ． Ｓａｉｋｉ等の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， １９８８， ｐｐ．４８７￣４９１に記載されているように特異的プライマーを用いた重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することもできる。
【０１０８】
αアミラーゼ変異体の発現：
本発明によれば、前述の方法によって、または当業界で知られている任意の別の方法によって生成される変異体をコードするＤＮＡ配列は、一般にプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始信号、および任意選択でリプレッサー遺伝子またはさまざまなアクチベータ−遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを用いて酵素の形態で発現させることができる。
【０１０９】
本発明のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を担持する組換え発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ手順に従わせることができる任意のベクターであり、ベクターの選択はそれが導入されることになる宿主細胞に左右されることが多い。したがってこのベクターは、自己複製ベクターすなわち染色体外の存在物として存在するベクター；染色体複製物とは無関係の複製物、例えばプラスミド、バクテリオファージ、または染色体外の構成分子；ミニクロモソーム；あるいは人工の染色体であってもよい。別法ではこのベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞のゲノム中に取り込まれ、それを取り込んだ染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【０１１０】
このベクター中でＤＮＡ配列は、適切なプロモーター配列と作動可能に結合することになる。このプロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示し、宿主細胞と相同または非相同いずれかの、遺伝子をコードするタンパク質から得ることができる任意のＤＮＡ配列であってよい。特に細菌性の宿主中で本発明のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写に向わせるのに好適なプロモーターの例には、Ｅ．ｃｏｌｉのＬａｃオペロンのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡのプロモーター群、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター群、Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター群、Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター群、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター群などがある。真菌性の宿主中での転写の場合、有用なプロモーターの例には、Ａ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ アミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ中性αアミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ 酸安定性αアミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａ． ｏｒｙｚａｅアルカリ性プロテアーゼ、Ａ． ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、またはＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼがある。
【０１１１】
本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター、また真核生物では本発明のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列と作動可能に結合したポリアデニル化配列を含むことができる。終結およびポリアデニル化配列は、適切にはプロモーターと同じ供給源から得ることができる。
【０１１２】
ベクターはさらに、検討対象になっている宿主細胞中でベクターが複製を行なうのを可能にするＤＮＡ配列を含むことができる。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、およびｐＩＪ７０２の複製開始点である。
【０１１３】
ベクターはまた、選択可能な遺伝標識、例えばＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ またはＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子など、その生成物が宿主細胞中の欠損を補完する遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリン耐性など抗生物質耐性を付与する遺伝子を含むことができる。さらにベクターは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、およびｓＣなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ選択マーカー、ヒグロマイシン耐性を生じさせるマーカーを含んでもよく、あるいはその選択は、例えば国際特許公開第９１／１７２４３号に記載のように同時形質転換によって達成することもできる。
【０１１４】
細胞内発現は、例えば宿主細胞として或る種の細菌を用いる場合には幾つかの点で有利であるかも知れないが、一般には発現は細胞外であることが好ましい。一般に、本明細書に記述されたＢａｃｉｌｌｕｓ αアミラーゼは、発現したプロテアーゼの培地中への分泌を可能にする予備領域を具備している。望むならばこの予備領域は別の予備領域またはシグナル配列で置き換えることができ、便利にはそれぞれの予備領域をコードするＤＮＡ配列の置換によって達成される。
【０１１５】
αアミラーゼ変異体、そのプロモーター、ターミネーター、およびその他の構成分子をそれぞれコードする本発明のＤＮＡ構築物を連結反応させるために、またそれらを複製に必要な情報を含有する適切なベクター中に挿入するために使用される手順は、当業技術者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の著書、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９を参照されたい）。
【０１１６】
さきに定義したように本発明のＤＮＡ構築物または発現ベクターのいずれかを含む本発明の細胞は、本発明のαアミラーゼ変異体の組換え産物の宿主細胞として使用するのが有利である。この細胞は、便利には宿主の染色体にそのＤＮＡ構築物を組み込む（１または複数のコピーに）ことにより、変異体をコードする本発明のＤＮＡ構築物で形質転換することができる。この組込みは、細胞中の方がＤＮＡ配列がより安定に保たれやすいので有利であると一般に考えられている。ＤＮＡ構築物の宿主染色体中への組込みは、従来の方法に従って、例えば相同的または非相同的組換えによって行なうことができる。別法では細胞は、異なる種類の宿主細胞と結びつけて前述のように発現ベクターで形質転換することができる。
【０１１７】
本発明の細胞は、哺乳類または昆虫などのより高度の生物の細胞であってもよいが、好ましくは微生物の細胞、例えば細菌または真菌（酵母を含む）の細胞である。
【０１１８】
好適な細菌の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓとＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓなどのグラム陽性菌、あるいはＥ． ｃｏｌｉなどのグラム陰性菌である。細菌の形質転換は、例えば原形質体の形質転換により、または公知のやり方でコンピテント細胞を用いることにより行なうことができる。
【０１１９】
酵母生物は、好都合にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択することができる。糸状菌は、有利にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに属することができる。真菌細胞は、原形質体の形成および原形質体の形質転換、続いて細胞壁の再生を含むプロセスによって公知の方法で形質転換することができる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主細胞の形質転換の適切な手順は、欧州特許公開第２３８ ０２３号に記載されている。
【０１２０】
更なる態様において本発明は、変異体の生産に役立つ条件下で前述のように宿主細胞を培養すること、ならびに細胞および／または培地からその変異体を回収することを含む、本発明のαアミラーゼ変異体の生産方法に関する。
【０１２１】
細胞を培養するために使用される培地は、検討対象になっている宿主細胞を増殖させ、本発明のαアミラーゼ変異体を発現させるのに適した任意の従来の培地であってよい。好適な培地は営利目的の供給業者から入手可能であり、あるいは出版物に掲載されている処方（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載されている）に従って調製することができる。
【０１２２】
宿主細胞から分泌されたαアミラーゼ変異体は、細胞を遠心分離または濾過によって培地から分離すること、硫酸アンモニウムなどの塩によって培地のタンパク質成分を沈殿させること、続いてイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどのクロマトグラフの手順を用いることなどを含む周知の手順により培地から回収するのが便利である。
【０１２３】
産業面への応用：
本発明のαアミラーゼ変異体は、さまざまな産業面の応用を可能にする有用な特性を持っている。具体的には本発明の酵素の変異体は、洗濯、皿洗い、および硬い表面のクリーニング用洗剤組成物の成分として応用できる。改変された特性を有する本発明の変異体は、デンプンの製造プロセス、具体的にはデンプンの転化、特にデンプンの液化に用いることができる（例えば、米国特許第３，９１２，５９０号、欧州特許公開第２５２ ７３０号および第６３ ９０９号、国際特許公開第９９／１９４６７号を参照されたい）。
【０１２４】
さらに、本発明の変異体はまた、特にデンプンからの甘味料およびエタノールの生産、および／または繊維の糊抜きに有用である。
【０１２５】
組成物：
一態様において本発明は、本発明の変異体を含む組成物に関する。一実施形態において本発明の組成物は１または複数の別の酵素を含み、それにはリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グルコアミラーゼ、ペルオキシダーゼ、もしくはラッカーゼ、および／または別のαアミラーゼなどの群から選択される１または複数の酵素がある。
【０１２６】
洗剤組成物：
前述のように本発明の変異体は、洗剤組成物に配合するのに適している。洗剤組成物（洗濯または皿洗い用洗剤など）の関連する成分、このような洗剤組成物中に変異体を配合する適切な方法、および関連性のある洗剤組成物の種類の例に関してさらに詳細には、例えば国際特許公開第９６／２３８７４号および第９７／０７２０２号に参照されている。
【０１２７】
本発明の変異体を含む洗剤組成物は、追加してリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グルコアミラーゼ、ペルオキシダーゼ、もしくはラッカーゼ、および／または別のαアミラーゼなどの１または複数の別の酵素を含むことができる。
【０１２８】
本発明のαアミラーゼ変異体は、従来採用している濃度で洗剤中に配合することができる。本発明の変異体は、洗剤の従来の用量レベルを用いた洗濯／皿洗い液１リットル当たりαアミラーゼ０．００００１￣１０ ｍｇ（純粋な活性酵素タンパク質として計算）に相当する量を配合することが現在検討されている。
【０１２９】
本発明はまた、親αアミラーゼと比べて改変された特性、具体的には溶解度、特に高い溶解度、基質特異性、基質結合、基質切断パターン、温度安定性、酵素活性のｐＨ依存、安定性のｐＨ依存、酸化に対する安定性、ＣＡ２＋依存性、および比活性の改変された特性を有するαアミラーゼを提供する方法に関するもので、その方法は
【０１３０】
（ａ）親αアミラーゼの三次元構造を描くために添付資料１に表されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の三次元構造に倣って親αアミラーゼをモデル化するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた三次元構造において、その構造の一部分の変化が上記改変された特性をもたらすと予想される、親の構造の少なくとも一部分を識別するステップ、
（ｃ）親αアミラーゼをコードする核酸の配列を修飾して、上記構造の一部分に対応する位置で１または複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換をコードする核酸を生成するステップ、および
（ｄ）修飾された核酸を宿主細胞中で発現させて、αアミラーゼ酵素活性を有し、かつ親と比べて少なくとも１つの改変された特性を有する変異体αアミラーゼを産生するステップ、を含む。
【０１３１】
一実施形態においてこの方法は、親と比べて改変された特性を有する親αアミラーゼの変異体を構築する方法であり、この親αアミラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、または１３の配列を持つか、あるいは上記配列と少なくとも６０％同一の配列（前述のように決定された）を持ち、この方法は
（ａ）親αアミラーゼの三次元構造を描くために添付資料１に表されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の三次元構造に倣って親αアミラーゼをモデル化するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた三次元構造を、上記特性が親αアミラーゼと異なった関連のないαアミラーゼの三次元構造と比較するステップ、
（ｃ）その関連のないαアミラーゼの三次元構造とは異なり、かつ上記特性と関連性があると予想される、ステップ（ａ）で得られた三次元構造の構造の一部分を識別するステップ、
（ｄ）親αアミラーゼをコードする核酸の配列を修飾して、上記構造の一部分に対応する位置で１または複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換をコードする核酸を生成するステップ、および
（ｅ）修飾された核酸を宿主細胞中で発現させて、αアミラーゼ活性を有し、かつ親と比べて１または複数の改変された特性を有する変異体αアミラーゼを産生するステップ、を含む。
【０１３２】
検討されたターマミル様αアミラーゼは上記のものである。
ポリペプチドの溶解度を増加させる方法：
本発明はまた、酵素などのポリペプチド、具体的にはターマミル様αアミラーゼの溶解度を増加させる方法に関する。
【０１３３】
本発明の方法は、タンパク質の結晶中に配置された隣りのポリペプチド分子に近接した位置を占める１または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失を含む。本発明の文脈において隣りの分子に近接した位置を占めるポリペプチドのアミノ酸残基とは、それが結晶または沈殿中の隣りの酵素分子に配置されているアミノ酸残基から潜在的に分子間で相互作用する距離内にあるというやり方でポリペプチド中に配置されたアミノ酸残基を指す。
【０１３４】
潜在的な分子間相互作用の例には、水素結合、塩架橋の形成、極性相互作用、および芳香族相互作用があるがこれらには限定されない。
【０１３５】
本発明の文脈で用語「隣り」とは、例えば「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ａｎｄ Ｔｉｐｓ」（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｔｅｒｅｓｅ Ｍ． Ｂｅｒｇｆｏｒｓ著）、またはインターネットサイト：ｗｗｗ．ｈａｍｐｔｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ． の記述のように調製されている結晶構造中の２つの位置の間の最も近い距離を意味する。
【０１３６】
したがってこの態様において本発明は、酵素の結晶の溶解度を増加させる方法に関するもので、その方法は
【０１３７】
１）三次結晶構造中の隣りのポリペプチド分子の６．０Åの距離内に位置し、かつ
２）その隣りのポリペプチド分子と相互作用する
１または複数のアミノ酸残基を、例えば置換または欠失によって突然変異させる。
【０１３８】
好ましい実施形態においては、突然変異されるアミノ酸残基は隣りのポリペプチド分子の３．５Åに位置する。
【０１３９】
検討されたポリペプチドには、抗菌性ポリペプチド、およびインスリン、成長ホルモン、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子などの生物活性を有するポリペプチドが含まれる。
【０１４０】
検討された酵素活性には、プロテアーゼ、アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼ、セルラーゼ、クチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチンリアーゼの活性が含まれる。
【０１４１】
好ましい実施形態において酵素は、アミラーゼ、好ましくはαアミラーゼ、特に下記にさらに記述することになるターマミル様αアミラーゼである。
【０１４２】
基質に「近接」したアミノ酸位置とは、単一水分子が介在するタンパク質−タンパク質相互作用に対応する６Å未満の距離を指す。好ましい実施形態において、基質に近接したアミノ酸位置とは、直接のタンパク質−タンパク質相互作用に対応する３．５Å未満の距離を指す。
【０１４３】
ターマミル様αアミラーゼの溶解度を増加させる方法：
この態様において本発明は、ターマミル様αアミラーゼ結晶の溶解度を増加させる方法に関するもので、その方法は
【０１４４】
１）三次結晶構造中の隣り合うターマミル様αアミラーゼ分子が６Åの距離内に配置され、かつ
２）その隣り合うターマミル様αアミラーゼ分子と相互作用する、
１または複数のアミノ酸残基を、例えば置換または欠失によって突然変異する。
好ましい実施形態においては、突然変異されるアミノ酸残基は、隣りのターマミル様αアミラーゼから３．５Åに位置する。添付資料１に表されているＳＰ７２２の結晶構造は、隣り合うターマミル様αアミラーゼの間の距離を決定するための基準（固定点）として用いることができる。
【０１４５】
しかしながら、基準（固定点）の結晶が添付資料１に表されているＳＰ７２２からモデル化（上記、または国際特許公開第９６／２３８７４号に記載されている）される構造であるということは、本発明の範囲内にある。
【０１４６】
好ましいターマミル様αアミラーゼには、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種のＮＣＩＢ １２２８９、ＮＣＩＢ １２５１２、ＮＣＩＢ １２５１３、またはＤＳＭ ９３７５、あるいはＤＳＭＺ ｎｏ．１２６４９、ＫＳＭ ＡＰ１３７８の株から得られるαアミラーゼからなる群から選択されたＢａｃｉｌｌｕｓ αアミラーゼがある。ターマミル様αアミラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、および１３で表される群から選択されたαアミラーゼのいずれか、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４との同一性の度合いが少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９７％、一層好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有するターマミル様αアミラーゼ、あるいは低い、好ましくは中位の、好ましくは高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列を備えた核酸配列によってコードされるターマミル様αアミラーゼであることができる。この条件は上記でさらに詳細に記述されている。
【０１４７】
直近のアミラーゼ分子から６Å未満のところに存在するターマミル様αアミラーゼのアミノ酸残基は、下記のものである（ＳＰ７２２のナンバリングを用いた）。
【０１４８】
【表１１】
【０１４９】
直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するターマミル様αアミラーゼのアミノ酸残基は下記のもの（ＳＰ７２２のナンバリングを用いた）、すなわち
【０１５０】
【表１２】
【０１５１】
直近のアミラーゼ分子から６．０Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、ＳＰ７２２アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０１５２】
【表１３】
【０１５３】
直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、ＳＰ７２２アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０１５４】
【表１４】
【０１５５】
直近のアミラーゼ分子から６．０Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、ＡＡ５６０アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０１５６】
【表１５】
【０１５７】
直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、ＡＡ５６０アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０１５８】
【表１６】
【０１５９】
高い溶解度したがって高性能をもたらすαアミラーゼ中の置換
一般に何らかのタンパク質−タンパク質相互作用を妨害または消失させる任意の置換は高い溶解度、したがって特定の用途で高い性能をもたらす。したがってタンパク質−タンパク質相互作用に加担するアミノ酸残基を、より高い溶解度をもたらす荷電または非荷電アミノ酸になるように、より大きい、より小さい、より疎水性、より親水性のものに変えることができる。
【０１６０】
より大きいアミノ酸残基は、相互作用に対する立体障害になることができ、またより小さいアミノ酸残基は、相互作用する残基の間の距離を広げて相互作用を弱める。極性の相互作用、特に塩架橋は、関係する残基の少なくとも１つを疎水性の残基に変えることにより、関係する残基の少なくとも１つを、距離を広げて強い相互作用にする小さい残基に変えることにより、あるいは関係する残基の少なくとも１つを、立体障害になる大きい残基に変えることにより消失する。疎水性の相互作用は、相互作用するアミノ酸の１つを親水性のアミノ酸残基に変えることによって効果的に消失するが、より小さい、またはより大きい疎水性の残基もまたこの種の相互作用を消失させることができる。芳香族の相互作用は、親水性の残基または小さい疎水性の残基に変えることによって防ぐことができる。
【０１６１】
材料および方法
酵素：
ＳＰ７２２： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから入手可能で国際特許公開第９５／２６３９７号に開示されている。
【０１６２】
ＡＡ５６０： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２は、国際特許公開第００／６００６０号に開示されＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから入手可能；デンマーク特許出願第ＰＡ １９９９ ００４９０号に開示されている；ＤＳＭＺで１９９９年１月２５日に寄託され、ＤＳＭＺ Ｎｏ． １２６４９が割り当てられている。
【０１６３】
ＡＡ５６０は、Ｄｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ＤＥにおける特許手続きのための微生物供託の国際承認に関するブタペスト条約の合意の下に本発明者等によって供託された。
【０１６４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＡ２７３については、国際特許公開第９５／１０６０３号を参照されたい。
【０１６５】
プラスミド：
ｐＪＥ１は、ＳＰ７２２αアミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）の変異体、すなわち成熟タンパク質中のアミノ酸Ｄ１８３〜Ｇ１８４に対応する６個のヌクレオチドの欠失をコードする遺伝子を含有する。ＪＥ１遺伝子の転写はａｍｙＬプロモーターから指示される。プラスミドはさらにまた、複製開始点、およびプラスミドｐＵＢ１１０（ｇｒｙｃｚａｎ， ＴＪ等の論文、Ｊ． Ｂａｃｔ． ３４： ３１８〜３２９ （１９７８））から得られる、カナマイシン耐性を付与するｃａｔ遺伝子を含有する。
【０１６６】
「方法」
モデルの組立て：
「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ （ＰＤＢ） （＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｂｎｌ．ｇｏｖ／＞）」または「Ｔｈｅ Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ｄａｔａｂａｎｋ ａｔ Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＵＳ」などのタンパク質構造データベースが、モデルを組み立てようとしている検討対象になっている分子と似たタンパク質を探すために検索される。アミノ酸配列は構造的に保存される領域を考慮に入れてアライニングされ、座標は基準タンパク質から主題のタンパク質にコピーされる。挿入および欠失を有する領域の座標は、似たアミノ酸配列を有する別のタンパク質からか、または大部分の３Ｄソフトウェアパッケージ、例えばＨｏｍｏｌｏｇｙ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｓｙｍ， ＭＳＩ中に見出されるランダム構造生成機能を用いることによるかのいずれかで割り当てられる。
【０１６７】
例えばＢｉｏｓｙｍ， ＭＳＩのディスカバープログラム中のコマンドＥＮＤ ＲＥＰＡＩＲおよびＳＰＬＩＣＥ ＲＥＰＡＩＲによって座標が主題のタンパク質のすべてのアミノ酸に割り当てられ、断片がつなぎ合わされたとき、モデルは精巧なものになる。モデルのエネルギーは、まず分子を弛緩させる（ディスカバープログラム中のＲＥＬＡＸコマンド）ことによってできるだけ少なくし、次に分子動力学によってできるだけ少なくする。参考資料は、相同組立て用ソフトウェアのマニュアル、例えばＨｏｍｏｌｏｇｙ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｓｙｍ， ＭＳＩ中に見出すことができる。
【０１６８】
ライブラリーベクターｐＤｏｒＫ１０１の構築：
Ｅ．ｃｏｌｉ ／ ＢａｃｉｌｌｕｓシャトルベクターｐＤｏｒＫ１０１（下記に記述する）を用いてＥ．ｃｏｌｉ中でαアミラーゼを発現させることなく突然変異を導入し、次いでαアミラーゼがＢａｃｉｌｌｕｓ中で活性であるような方法で修飾することができる。ベクターは次のように構築された。すなわち、ＪＥ１をコードする遺伝子（Ｄ１８３〜Ｇ１８４の欠失をもつＳＰ７２２）を、Ｅ．ｃｏｌｉ複製開始点を含有する１．２ｋｂ断片によるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４ ： ＳＰ７２２の５′コード化領域中のＰｓｔＩ部位での遺伝子切断によってｐＪＥ１中で不活性化した。この断片をフォワードプライマー：５′−ｇａｃｃｔｇｃａｇｔｃａｇｇｃａａｃｔａ−３′およびリバースプライマー：５′−ｔａｇａｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇｃａｔ−３′を用いてｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃： Ｘ０２５１４）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲアンプリコンおよびｐＪＥ１ベクターをＰｓｔＩで３７℃で２時間消化した。ｐＪＥ１ベクター断片およびＰＣＲ断片を室温で１時間連結反応させ、Ｅ．ｃｏｌｉ中で電気形質転換法により形質転換した。得られたベクターをｐＤｏｒＫ１０１と呼ぶ。
【０１６９】
フィルタースクリーニング検定：
この検定は、親酵素と比べて高ｐＨで安定性の改良されたターマミル様αアミラーゼ変異体、およびスクリーニング温度の設定次第では親酵素と比べて高ｐＨかつ中位の温度で安定性の改良されたターマミル様αアミラーゼ変異体のスクリーニングに用いることができる。
【０１７０】
高ｐＨフィルター検定：
Ｂａｃｉｌｌｕｓライブラリーを、ＴＹ寒天プレート上の酢酸セルロース（ＯＥ ６７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とニトロセルロースフィルター（Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のサンドイッチ上で、カナマイシン １０μｇ／ｍｌとともに３７℃で少なくとも２１時間培養する。酢酸セルロース層はＴＹ寒天プレート上に配置される。
【０１７１】
各フィルターのサンドイッチにはフィルター上の陽性変異体の位置を突きとめるために培養後、インキュベーション前に針で特定の標識を付け、結合した変異体を含むニトロセルロースフィルターをグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６〜１０．６）を含む容器に移し、室温（１０〜６０℃まで変えることができる）で１５分間インキュベートする。コロニーを含む酢酸セルロースフィルターは、使用するまでＴＹプレート上に室温で保管される。インキュベーション後、グリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６〜１０．６）中にアガロース１％、デンプン０．２％を含むプレート上で残留活性を検出する。ニトロセルロースフィルターを備えた検定プレートをフィルターサンドイッチと同じ方法で標識し、室温で２時間インキュベートする。フィルターを除去した後、検定プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプンを分解する変異体は、紺青色の背景上に白い斑点として検出され、次いで保存プレート上で同定される。陽性変異体を最初のスクリーニングと同じ条件で２回再スクリーニングする。
【０１７２】
低カルシウム検定：
Ｂａｃｉｌｌｕｓライブラリーを、ＴＹ寒天プレート上の酢酸セルロース（ＯＥ ６７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とニトロセルロースフィルター（Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のサンドイッチ上で、関連性のある抗生物質、例えばカナマイシンまたはクロラムフェニコールとともに３７℃で少なくとも２１時間培養する。酢酸セルロース層はＴＹ寒天プレート上に配置される。
【０１７３】
各フィルターのサンドイッチにはフィルター上の陽性変異体の位置を突きとめるために培養後、インキュベーション前に針で特定の標識を付け、結合した変異体を含むニトロセルロースフィルターを炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．５〜１０）を含み、さまざまなＥＤＴＡ濃度（０．００１〜１００ｍＭ）を有する容器に移す。フィルターを室温で１時間インキュベートする。コロニーを含む酢酸セルロースフィルターは、使用するまでＴＹプレート上に室温で保管される。インキュベーション後、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．５〜１０）中にアガロース１％、デンプン０．２％を含有するプレート上で残留活性を検出する。ニトロセルロースフィルターを備えた検定プレートをフィルターサンドイッチと同じ方法で標識し、室温で２時間インキュベートする。フィルターを除去した後、検定プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプンを分解する変異体は、紺青色の背景上に白い斑点として検出され、次いで保存プレート上で同定される。陽性変異体を最初のスクリーニングと同じ条件で２回再スクリーニングする。
【０１７４】
考察の対象となっている領域を得る方法：
細菌性αアミラーゼには３つのよく知られた３Ｄ構造がある。その２つはＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓαアミラーゼ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ｄａｔａｂａｓｅ １ＢＰＬ（Ｍａｃｈｉｕｓ等の論文、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４６， ｐ．５４５￣５５９ （１９９５））および１ＶＪＳ（Ｓｏｎｇ等の著書、Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ １６３ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖ １２ （１９９６）））である。これらの２つの構造は、２個のカルシウムイオンと１個のナトリウムイオンの結合部位周辺の領域で、いわゆるＢドメインから構造の重要な一片を欠いている。したがって本発明者等は、ＢＡＮ（商標）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）とＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓαアミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）の間の雑種であるαアミラーゼＢＡ２（国際特許公開第９６／２３８７４号）の３Ｄ構造を用いた。この構造に基づいてＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓαアミラーゼおよびＳＰ７２２αアミラーゼのモデルを組み立てた。
【０１７５】
αアミラーゼ変異体の発酵および精製：
発酵および精製は、当業界でよく知られいる方法によって行なうことができる。
【０１７６】
安定性の決定：
すべての安定性試験は、同一の装置を用いて行なう。方法は下記のとおりである。酵素を関連する条件（１〜４）下でインキュベートする。試料をさまざまな時点で、例えば０、５、１０、１５、および３０分後に採取し、検定緩衝液（５０ｍＭブリトン緩衝液０．１ｍｌ、ｐＨ７．３）中で２５倍に希釈（採取したすべての試料について同じ希釈）し、ｐＨ７．３、３７℃の標準条件下でＰｈａｄｅｂａｓ検定法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて活性を測定する。
【０１７７】
インキュベーションの前（０分）に測定した活性を基準（１００％）として使用する。低下％をインキュベーション時間の関数として計算する。表は、インキュベーションの例えば３０分後の残留活性を示いている。
【０１７８】
比活性の決定：
比活性は、Ｐｈａｄｅｂａｓ検定法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて酵素１ｍｇ当たりの活性として決定される。製造業者の指示は下記のとおりである（また、下記の「αアミラーゼ活性の検定」も参照されたい）。
【０１７９】
溶解度の決定Ｉ：
精製した酵素を選択された緩衝液に対して夜通し透析する。標準条件は、０．０２ＭトリスＨＣｌおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、室温である。ミリポア限外濾過膜、ＹＭ１０、ＮＭＷＬ：１０，０００を用いて酵素約４０ｍｇを含有する配合物をアミコンセル上で濃縮する。酵素の濃縮に続いて、そのプロセスの前およびその間Ａ２８０を測定する。沈殿が起こり始めたら濃縮のステップを停止する。沈殿物が実際にアミラーゼであることを確かめるために上澄み中の活性の測定を行なう。次いで緩衝液を加えることによって室温で沈殿物を再度溶解し、タンパク質濃度を測定する。
【０１８０】
溶解度の決定ＩＩ：
精製した酵素を再度、選択された緩衝液に対して夜通し透析する。標準条件は、０．０１Ｍホウ酸、０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．００２Ｍ ＣａＣｌ２、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５である。ミリポア限外濾過膜、ＹＭ１０、ＮＭＷＬ：１０，０００を用いて酵素約４０ｍｇを含有する配合物をアミコンセル上で濃縮する。酵素の濃縮に続いて、そのプロセスの前およびその間Ａ２８０を測定する。沈殿が起こり始めたら濃縮のステップを停止する。沈殿物が実際にアミラーゼであることを確かめるために上澄み中の活性の測定を行なう。次いで緩衝液を加えることによって室温で沈殿物を再度溶解し、タンパク質濃度を測定する。
【０１８１】
αアミラーゼ活性の検定法：
１．Ｐｈａｄｅｂａｓ検定法
αアミラーゼ活性は、基質としてＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）錠剤を使用する方法によって決定される。Ｐｈａｄｅｂａｓ錠剤（Ｐｈａｄｅｂａｓ（登録商標）アミラーゼ試験、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃにより提供される）は、架橋した不溶性の青色デンプンポリマーを含有しており、ウシ血清アルブミンおよび緩衝物質と混合して錠剤にしたものである。
【０１８２】
一測定ごとに１個の錠剤を、５０ｍＭブリトン−ロビンソン緩衝液５ ｍｌ （５０ｍＭ酢酸、５０ｍＭリン酸、５０ｍＭホウ酸、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨはＮａＯＨで検討の対象となっている値に調整）を含む管中で懸濁させる。試験は水浴中で検討の対象となっている温度で行なう。試験されるαアミラーゼは５０ｍＭブリトン−ロビンソン緩衝液ｘ ｍｌ中で希釈する。このαアミラーゼ溶液１ ｍｌを５０ｍＭブリトン−ロビンソン５ ｍｌに加える。デンプンを、可溶性の青色断片を生ずるαアミラーゼによって加水分解する。６２０ｎｍで分光光度的に測定される得られた青色溶液の吸光度は、６２０ｎｍで分光光度的に測定され、αアミラーゼ活性の関数である。
【０１８３】
１０または１５分間のインキュベーション（試験時間）後の測定された６２０ｎｍ吸光度が、６２０ｎｍで吸光度単位０．２〜２．０の範囲にあることが重要である。この吸光度の範囲で活性と吸光度の間には線形性がある（ランバート−ベールの法則）。したがって酵素の希釈は、この基準に合致するように調整されなければならない。特定の一組の条件（温度、ｐＨ、反応時間、緩衝液の条件）下で所与のαアミラーゼ１ ｍｇは、一定量の基質を加水分解し、青色を生ずることになる。色の強度は６２０ｎｍで測定する。測定された吸光度は、所与の一組の条件下での検討対象になっているαアミラーゼの比活性（純粋なαアミラーゼタンパク質１ ｍｇ当たりの活性）に正比例する。
【０１８４】
２．他の選択可能な方法
αアミラーゼ活性は、ＰＮＰ−Ｇ７基質を使用する方法によって決定される。ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−マルトヘプタオシドの省略形であるＰＮＰ−Ｇ７は、エンド−アミラーゼによって切断することができるブロック化したオリゴ糖である。切断に続いてキット中に含まれるαグルコシダーゼが基質を消化して自由なＰＮＰ分子を遊離し、それは黄色を有し、したがってλ＝４０５ｎｍ（４００￣４２０ｎｍ）で可視分光測定によって測定することができる。ＰＮＰ−Ｇ７基質およびαグルコシダーゼを含有するキットは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍによって製造されている（カタログ番号１０５４６３５）。
【０１８５】
基質を調製するには、基質（ＢＭ １４４２３０９）１瓶を緩衝液（ＢＭ １４４２３０９）５ ｍｌに加える。αグルコシダーゼを調製するには、αグルコシダーゼ（ＢＭ １４６２３０９）１瓶を緩衝液（ＢＭ １４４２３０９）４５ ｍｌに加える。作業用溶液は、αグルコシダーゼ溶液５ ｍｌを基質０．５ ｍｌと混合することによって作成する。
【０１８６】
検定は、酵素溶液２０μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移し、２５℃でインキュベートすることによって行なわれる。作業用溶液２００μｌを２５℃で加える。その溶液を混合し、１分間予備インキュベートし、吸収を３分間にわたって１５秒ごとにＯＤ ４０５ｎｍで測定する。
【０１８７】
この時間依存性吸収曲線の傾斜は、所与の一組の条件下における検討対象になっているαアミラーゼの比活性（酵素１ ｍｇ当たりの活性）に正比例する。
【０１８８】
ＤＯＰＥプログラムを用いたランダム突然変異誘発の一般的な方法：
ランダム突然変異誘発は下記のように行なうことができる。
１．親酵素中の修飾のために考察の対象となる領域を選択する。
２．選択された領域の突然変異部位と非突然変異部位を決める。
３．例えば、構築される変異体の所望の安定性および／または性能に関してどのような種類の突然変異を行なうべきかを決める。
４．構造的に妥当な突然変異を選択する。
５．ステップ３により選択された残基をステップ４に関して調整する。
６．ヌクレオチド分布を適切なドープ・アルゴリズムを使用して解析する。
７．必要ならば、求める残基を遺伝コードの現実に合わせる（例えば終止コドンの導入を避けるために、例えば遺伝コードに起因する制約を考慮にいれる）（幾つかのコドンの組合せは実際には使用できず、適応させる必要があることを当業者ならば気が付くはずである）。
８．プライマーを作成する。
９．プライマーを使用してランダム突然変異誘発を行なう。
１０．得られたαアミラーゼ変異体を所望の改良された特性に関してスクリーニングによって選択する。
【０１８９】
ステップ６で使用する好適なドープ・アルゴリズムは、当業界でよく知られている。一つのアルゴリズムが、Ｔｏｍａｎｄｌ， Ｄ． 等の論文、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ， １１ （１９９７）， ｐｐ．２９￣３８に記載されている。別のアルゴリズム、ＤＯＰＥを下記に記述する。
【０１９０】
ドープ・プログラム：
「ＤＯＰＥ」プログラムは、求めるアミノ酸分布に最も似たアミノ酸分布をコードするようなやり方でコドン三重項のヌクレオチド組成を最適化するのに有用なコンピュータアルゴリズムである。実現可能な分布のどれが求めるアミノ酸分布に最も似ているかを評価するには、スコアリング関数が必要である。「ＤＯＰＥ」プログラムには下記の関数がふさわしいことが分かった。
【数１】
【０１９１】
上式でｘｉ′は、プログラムによって計算されるアミノ酸の得られる量およびアミノ酸基であり、ｙｉ′は、プログラムのユーザーによって規定される、アミノ酸の求める量およびアミノ酸基である（例えば２０個のアミノ酸または停止コドンのどれを、例えば或る割合で（例えばＡｌａ ９０％、Ｉｌｅ ３％、Ｖａｌ ７％）導入したいかを指定する）。またｗｉ′は、プログラムのユーザーによって規定される重み付け係数である（例えば、特定のアミノ酸残基を考察の対象の位置に挿入することの重要性に左右される）。Ｎは、プログラムのユーザーによって規定される、２１プラスアミノ酸基の数である。この関数０ｏについては１と規定される。
【０１９２】
モンテカルロアルゴリズム（一例は「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ， Ｐａｒｔ Ａ」Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｂ． Ｊ． Ｂｅｒｎｅ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｐｌｅｎｕｍ （１９７７） 中のＶａｌｌｅａｕ， Ｊ． Ｐ．およびＷｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ， Ｓ． Ｇ．の記述；Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｔ Ｃａｒｌｏ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ： １ Ｈｉｇｈｗａｙｓに記載のものである）は、この関数の最大値を見つけるために用いられる。各繰り返しにおいて下記のステップが行なわれる。
【０１９３】
１．各ベースには新しいランダムヌクレオチド組成が選択され、現在の組成と新しい組成の間の絶対差はコドンのすべての３つの位置で４個のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの各々についてｄ以下である（ｄの定義については下記を参照）。
【０１９４】
２．現在の組成および新しい組成のスコアは、前述のように関数ｓを用いて比較される。もし新しいスコアが現在の組成のスコア以上ならば、新しい組成が保存され、現在の組成は新しい組成に代えられる。もし新しいスコアがそれより小さいならば、新しい組成を保存する確率は、ｅｘｐ （１０００ （ｎｅｗ ｓｃｏｒｅ − ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｃｏｒｅ））である。
【０１９５】
１サイクルは前述のとおり通常１０００回の繰り返しからなり、ｄは１から０まで直線的に減少する。最適化プロセスでは１００サイクル以上を行なう。最高スコアで得られるヌクレオチド組成が最終的に与えられる。
【０１９６】
実施例
実施例１．
改変された特性を有するＳＰ７２２αアミラーゼ変異体を識別するための重要な領域およびアミノ酸残基を引き出す方法：
【０１９７】
ＳＰ７２２αアミラーゼの三次構造はＵＮＩＸコンピュータステーションの実行用インサイト上に表示し、すべての水素および水分子は削除された。この最小化したαアミラーゼ構造について、ｐｄｂ構造ファイル（添付資料１）で決定された結晶パラメータおよび空間群に従ってすべての対称性に関係のあるアミラーゼ分子が表示された。母親のαアミラーゼ中の各原子から対称性に関係のあるアミラーゼ構造中の任意の原子までの距離を計算するために小規模のコンピュータプログラムが作成された。それぞれ３．５Åと６．０Åに距離制限を設定すると、下記のリストの結果となった。
【０１９８】
最も近い隣りのアミラーゼ分子から６．０Å未満に存在するアミノ酸残基は、ＳＰ７２２ アミラーゼのモデル構造中で識別される下記の位置である。
【０１９９】
【表１７】
【０２００】
最も近い隣りのアミラーゼ分子から３．５Å未満に存在するアミノ酸残基は、ＳＰ７２２ アミラーゼのモデル構造中で識別される下記の位置である。
【０２０１】
【表１８】
【０２０２】
実施例２．
改変された特性を有するＳＰ７２２αアミラーゼ変異体を識別するための重要な領域およびアミノ酸残基を引き出す別の方法：
ＳＰ７２２αアミラーゼの三次構造はＵＮＩＸコンピュータステーションの実行用インサイト上に表示し、すべての水素および水分子は削除された。この最小化したαアミラーゼ構造をＷＨＡＴ ＩＦソフトウェア（Ｇ． Ｖｒｉｅｎｄの論文、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈ．， ８， ５２￣５６ （１９９０））中にインポート（「ｇｅｔｍｏｌ」）し、６Å以内のすべての対称性に関係のあるアミラーゼ分子をスープ（「ｓｙｍｔｒｙ」、「ｓｙｍｓｐｇ」、「ｓｙｍｐａｒ ６」、「ｓｏｕｓｈｌ」、「ｓｏｕｐ」）に加えた。対称分子を含むＳＰ７２２用の新しい座標ファイルが書き込まれた（ｍａｋｍｏｌ， ｔｏｔ ０）。次いで中心のＳＰ７２２アミラーゼを構造ファイルから削除し、周囲の分子を含む新しいファイルを書き込んだ。母体αアミラーゼ（水分子および水素原子のない元のＳＰ７２２構造ファイル）中の各原子から対称性に関係のあるアミラーゼファイル中の任意の原子までの距離を計算するために小規模のコンピュータプログラムが作成された。それぞれ３．５Åと６．０Åに距離制限を設定すると、説明で参照した位置が確認された。
【０２０３】
Ｗｈａｔ Ｉｆ コマンド：
＞＞Ｗｈａｔｉｆ＜＜；ＷＨＡＴ ＩＦをスタートさせる
＞＞Ｇｅｔｍｏｌ ｓｐ７２２ ＨＯＨ．ｐｄｂ＜＜；水およびＨを削除したＳＰ７２２構造ファイルをＷＨＡＴ ＩＦソフトウェア中にインポートする
＞＞ｓｙｍｔｒｙ＜＜；対称メニューに進む
＞＞ｓｙｍｓｐｇ＜＜；構造ファイル中の対称性に関係のある情報を読み取る
＞＞ｓｙｍｐａｒ ６＜＜；６Åの距離以内に対称性に関係のある残基を組み立てる
＞＞ｓｏｕｓｈｌ＜＜；対称分子をスープに加える
＞＞ｓｏｕｐ＜＜；スープメニューに進む
＞＞ ｍａｋｍｏｌ，”ＳＰ７２２ ｗｉ６．ｐｄｂ， ｔｏｔ ０”＜＜は、スープ中のすべての原子（ＳＰ７２２および６Å以内の対称分子）を含む「ＳＰ７２２ ｗｉ６」ｐｄｂファイルを書き込む。
【０２０４】
実施例３．
ＳＰ７２２三次構造からＡＡ５６０を相同関係により組み立てること：
前述のようにＡＡ５６０αアミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のＳＰ７２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）に対する全体的な相同性は約８７％である。ＡＡ５６０ とＳＰ７２２の配列のアラインメントの結果、そこに挿入または欠失が何もないことを示され、これはまた図１にも見ることができる。ＡＡ５６０αアミラーゼの三次構造は、「材料および方法」の項に記載した方法「モデルの組立て」を用いて添付資料１に開示した構造上にモデルを組み立てた。
【０２０５】
ＳＰ７２２の構造は、ＵＮＩＸワークステーションの実行用インサイトおよびＢＩＯＳＹＭ、ＭＳＩから得たホモロジーソフトウェア上に表示した。アミノ酸配列をアライニングし、同調したＳＰ７２２をＡＡ５６０アミノ酸に割り当てた。ＳＰ７２２構造中に見つからないＡＡ５６０中の最初の４個のアミノ酸の座標は、「ＥＮＤ ＲＥＰＡＩＲ」関数によって割り当てた。ＡＡ５６０モデルは、「ＲＥＬＡＸ」コマンドを用いて始めにアミノ酸の側鎖を緩和させ、次いで分子動力学を実行して３Ｄモデルのエネルギーをできるだけ小さくすることによって精巧なものにした。Ｉｎｓｉｇｈｔ ９５、ＭＳＩのデフォルトパラメータは、両者の緩和分子動力学について選択された。最後に、空間群と単位格子の寸法が、ＳＰ７２２ ｐｄｂからＡＡ５６０モデルのファイルにコピーされる。
【０２０６】
実施例４．
改変された特性を有するＡＡ５６０αアミラーゼ変異体を識別するための重要な領域を引き出す方法：
【０２０７】
モデルとして組み立てられたＡＡ５６０の構造について実施例１のＳＰ７２２と同じ計算を行なった。２つのαアミラーゼの相同性が約８７％もの高い同一性であるために、ＡＡ５６０の結晶の相互作用はＳＰ７２２と同様であって、ＡＡ５６０はＳＰ７２２と同じ空間群中で、かつ同様の単一の細胞パラメータで結晶化すると予想される。
【０２０８】
ＡＡ５６０αアミラーゼの三次構造はＵＮＩＸコンピュータステーションの実行用インサイト上に表示し、すべての水素および水分子は削除された。この最小化されたαアミラーゼ構造に関して、ＳＰ７２２の結晶パラメータおよび空間群（添付資料１）に従ってすべての対称性に関係のあるアミラーゼ分子が表示された。「母親」αアミラーゼ中の各原子から対称性に関係のあるアミラーゼ構造中の任意の原子までの距離を計算するために小規模のコンピュータプログラムが作成された。それぞれ３．５Åと６．０Åに距離制限を設定すると、下記のリストの結果となった。
【０２０９】
最も近い隣りのアミラーゼ分子から６．０Å未満に存在するアミノ酸残基は、ＡＡ５６０ アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０２１０】
【表１９】
【０２１１】
直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満に存在するアミノ酸残基は、ＡＡ５６０ アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０２１２】
【表２０】
【０２１３】
実施例５．
局部ランダムドーピング突然変異誘発による、親酵素と比べて高い溶解度を有するＡＡ５６０αアミラーゼ変異体の構築：
【０２１４】
ＡＡ５６０αアミラーゼの溶解度を増加させるために、下記に記述するように予め選択した領域でランダム突然変異誘発を行なった。
【０２１５】
領域；残基
ＳＡＩ；Ｒ１８１〜Ｗ１８９
ＤＯＰＥソフトウェア（「材料と方法」参照）を用いて、停止コドンの量をできるだけ少なくするＳＡＩ領域の提案された各変化に対するスパイク性コドンを決定した（表１参照）。提案されたアミノ酸変化の集団を得るためにヌクレオチドの正確な分布をコドンの３つの位置で計算した。所望の残基を得る大きなチャンスがあるように、しかしさらに他の可能性も与えるようにド−プ領域は指示された位置で特定してドープされた。
【０２１６】
【表２１】
【０２１７】
得られたドープされたオリゴヌクレオチド鎖は、野生型ヌクレオチド、アミノ酸配列、およびドープされた各位置のヌクレオチド分布と一緒にセンス鎖として表２に示す。
【０２１８】
【表２２】
【０２１９】
ランダム突然変異誘発：
表２から明らかなスパイク性オリゴヌクレオチド（一般用語ではＦＳＡと呼ばれる）、ＳＡ１領域のリバースプライマーＲＳＡ、およびＳａｃＩＩ とＤｒａＩＩＩ 部位を有効範囲とする特異的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２： ＡＡ５６０プライマーは、２１塩基対の重複を有する、重なり伸長法（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｈｏｒｔｏｎ等の論文、Ｇｅｎｅ， ７７ （１９８９）， ｐｐ．６１〜６８）によるＰＣＲライブラリー断片を生むために使用される。プラスミドｐＪＥ１はポリメラーゼ連鎖反応用の鋳型である。ＰＣＲ断片は、Ｅ． ｃｏｌｉ ／ Ｂａｃｉｌｌｕｓ のシャトルベクターｐＤｏｒｋ１０１（「材料と方法」の項参照）中でクローン化され、Ｅ． ｃｏｌｉ 中のアミラーゼの致死的蓄積を防ぐＥ． ｃｏｌｉ中の突然変異誘発およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中の速やかな発現を可能にする。クローン化されたＰＣＲ断片をＥ． ｃｏｌｉ 中に樹立した後、修飾されたｐＵＣ１９断片をプラスミドおよびプロモーターの中から消化して除き、突然変異したターマミル遺伝子を物理的に結合させ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中で発現を起こすことができる。
【０２２０】
スクリーニング：
ライブラリーは、上記の「材料および方法」に記載した低カルシウムフィルター検定でスクリーニングすることができる。
【０２２１】
実施例６．
ＡＡ５６０ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の変異体の構築：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示したＡＡ５６０αアミラーゼをコードする遺伝子は、プラスミドｐＴＶＢ２２３中に位置付けられる。そのアミラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のこの構築物中でａｍｙＬプロモーターから発現する。
【０２２２】
ＤＥＬＴＡ（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）突然変異を有する本発明の変異体は、ＳａｒｋａｒおよびＳｏｍｍｅｒの論文、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ８： ４０４〜４０７ （１９９０） に記載のようにメガプライマーによって構築された。
【０２２３】
遺伝子特異的プライマーＢ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）および突然変異誘発プライマー１０１４５８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＡＡ５６０をコードするｐＴＶＢ２２３プラスミドからＰＣＲによって約６４５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するために用いられた。
【０２２４】
６４５ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製し、同じ鋳型上で行なわれる二回目のＰＣＲでプライマーＹ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）と一緒にメガプライマーとして用いた。
【０２２５】
得られた約１０８０ｂｐの断片を制限酵素ＢｓｔＥＩＩおよびＡｆｌＩＩＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＴＶＢ２２３プラスミドと連結反応させた。感応性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＡ２７３（低アミラーゼおよびプロテアーゼ）細胞を連結反応で形質転換し、クロラムフェニコール耐性形質転換細胞をＤＮＡ配列決定でチェックしてプラスミド上に正しい突然変異が存在していることを確かめた。
【０２２６】
【表２３】
【０２２７】
得られたＤＥＬＴＡ（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）＋Ｎ１９５Ｆを有するＡＡ５６０アミラーゼをコードするプラスミドはｐＴＶＢ２３２と命名した。
【０２２８】
本発明のその他の変異体の構築は同様の方法で行なわれた。
実施例７．
ＡＡ５６０およびＳＰ７２２変異体の溶解度の決定：
ＡＡ５６０変異体は上記のように構築した。溶解度は「材料および方法」の項で、溶解度の決定Ｉとして記述したように決定された。
【０２２９】
【表２４】
【０２３０】
濃縮ステップは、タンパク質の量４０ｍｇで開始され、一般に５０％のアミラーゼがプロセス中に失われた。このタンパク質の損失はプロセスの初期段階ですべての酵素について起こり、酵素の完全な回復は体積がきわめて限定されるようになる終了段階で得られた。酵素の損失は膜への吸着による。
【０２３１】
実施例８．
ＡＡ５６０変異体の溶解度の決定：
ＡＡ５６０変異体は、鋳型として野生型ＡＡ５６０を用いて上記のように構築した。溶解度は「材料および方法」の項で、溶解度の決定ＩＩとして記述したように決定された。
【０２３２】
【表２５】
【０２３３】
【表２６】
【０２３４】
【表２７】
【０２３５】
【表２８】
【０２３６】
【表２９】
【０２３７】
【表３０】
【０２３８】
【表３１】
【０２３９】
【表３２】
【０２４０】
【表３３】
【０２４１】
【表３４】
【０２４２】
【表３５】
【０２４３】
【表３６】
【０２４４】
【表３７】
【０２４５】
【表３８】
【０２４６】
【表３９】
【０２４７】
【表４０】
【０２４８】
【表４１】
【０２４９】
【表４２】
【０２５０】
【表４３】
【０２５１】
【表４４】
【０２５２】
【表４５】
【０２５３】
【表４６】
【０２５４】
【表４７】
【０２５５】
【表４８】
【０２５６】
【表４９】
【０２５７】
【表５０】
【０２５８】
【表５１】
【０２５９】
【表５２】
【０２６０】
【表５３】
【０２６１】
【表５４】
【０２６２】
【表５５】
【０２６３】
【表５６】
【０２６４】
【表５７】
【０２６５】
【表５８】
【０２６６】
【表５９】
【０２６７】
【表６０】
【０２６８】
【表６１】
【０２６９】
【表６２】
【０２７０】
【表６３】
【０２７１】
【表６４】
【０２７２】
【表６５】
【０２７３】
【表６６】
【０２７４】
【表６７】
【０２７５】
【表６８】
【０２７６】
【表６９】
【０２７７】
【表７０】
【０２７８】
【表７１】
【０２７９】
【表７２】
【０２８０】
【表７３】
【０２８１】
【表７４】
【０２８２】
【表７５】
【０２８３】
【表７６】
【０２８４】
【表７７】
【０２８５】
【表７８】
【０２８６】
【表７９】
【０２８７】
【表８０】
【０２８８】
【表８１】
【０２８９】
【表８２】
【図面の簡単な説明】
【図１】
５種類の親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す図であり、一番左の番号は下記のようにそれぞれのアミノ酸配列を示す。
１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＳＰ７２２）
２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＳＰ６９０）
３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＢＡＮ）
４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＢＬＡ）
５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＢＳＧ）
【図２】
各々の分子が８つの相互作用する帯域を有する、４個の酵素分子の単位格子の側面図である。
【図３】
４個の酵素分子の単位格子の上面図である。
発明の分野
本発明は、αアミラーゼ活性を有し、かつ親のαアミラーゼと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ２＋依存性、比活性、ならびに特に生産および使用条件下での溶解度のうちの少なくとも１つを変えた親ターマミル様αアミラーゼの変異体（突然変異体）に関する。
【０００２】
発明の背景
αアミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ． Ｃ． ３． ２． １． １）は、デンプンならびにその他の線状および分枝状１，４−グルコシドオリゴ糖および多糖の加水分解を触媒する１群の酵素を構成する。
【０００３】
最新の工業的バイオテクノロジーでは、発酵、精製、回収の間に、また製品の配合で高いタンパク質濃度が達成される。
【０００４】
発酵の間、タンパク質濃度は使用される宿主細胞に左右される。工業的プロセスにおいてはタンパク質濃度は一般に、発酵ブイヨン１ ｌ当たり０．１ｇを超えるところにある。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種中でのαアミラーゼの高収率組換え生産では、タンパク質濃度は発酵ブイヨン１ ｌ当たり２５０ｇもの高濃度であることができる。精製後にはタンパク質濃度は、１ ｌ当たり約１０００ｇのレベルに達する可能性がある。このような高濃度は、活性タンパク質の損失をもたらす望ましくない沈殿を起こす。最近の傾向は、重要性の増しつつある溶液中で酵素を維持する能力を持つ、より丈夫な製品に向っている。往々にしてタンパク質溶液の濃度上昇は、溶解して活性タンパク質にするのが困難なタンパク質の沈殿をもたらす。
【０００５】
したがって本出願の目的は、下記に定義される改変された特性を有する、具体的には高い溶解度を有するαアミラーゼを提供することである。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、対応する親αアミラーゼ、すなわち突然変異していないαアミラーゼと比較してその変異体がαアミラーゼ活性を有し、かつ上記親αアミラーゼと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ２＋依存性、比活性、ならびに溶解度、具体的には生産条件下での高い溶解度のうちの少なくとも１つで変化を示すターマミル様アミラーゼを提供することである。
【０００７】
命名法：
この記述および特許請求の範囲においては、アミノ酸残基の従来の１字および３字コードが用いられる。参照しやすいように本発明のαアミラーゼ変異体は次の命名法、すなわち元のアミノ酸：位置：置換されたアミノ酸を用いて記述される。
【０００８】
この命名法によれば、例えば３０位でのアラニンのアスパラギンへの置換は、
Ａｌａ３０ＡｓｎまたはＡ３０Ｎ
と示され、同じ位置におけるアラニンの欠失は、
Ａｌａ３０＊またはＡ３０＊
と示され、またリシンなどの付加アミノ酸残基の挿入は、
Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓまたはＡ３０ＡＫ
と示される。
【０００９】
アミノ酸残基３０〜３３位など、アミノ酸残基の連続的な区間の欠失は、（３０〜３３）＊またはＤＥＬＴＡ（Ａ３０〜Ｎ３３）と示される。
【００１０】
特定のαアミラーゼが他のαアミラーゼと比較して「欠失」を含み、挿入がそのような位置で行なわれる場合、３６位へのアスパラギン酸の挿入は、
＊３６Ａｓｐまたは＊３６Ｄ
と示される。多重突然変異はプラス記号によって分けられ、
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４ＳｅｒまたはＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
は、アラニンとグルタミン酸をそれぞれにアスパラギンとセリンに置換する３０および３４位における突然変異を表す。
【００１１】
所定の位置に１または複数の別のアミノ酸残基を挿入することができる場合、それは
Ａ３０Ｎ、Ｅあるいは
Ａ３０ＮまたはＡ３０Ｅ
と示される。
さらに、或る特定の修飾が示唆されることなしに修飾に適した位置が本明細書中で識別される場合、その位置に存在する任意のアミノ酸残基を任意のアミノ酸残基に換えることができることが理解されるはずである。したがって、例えば３０位でのアラニンの修飾について述べられ、しかし特定されない場合、アラニンを欠失するか、または任意の他のアミノ酸、すなわちＲ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか１つで置換することができることが理解されるはずである。さらに、「Ａ３０Ｘ」は次の置換、すなわちＡ３０Ｒ、Ａ３０Ｎ、Ａ３０Ｄ、Ａ３０Ｃ、Ａ３０Ｑ，Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｇ、Ａ３０Ｈ、Ａ３０Ｉ、Ａ３０Ｌ、Ａ３０Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ａ３０Ｓ、Ａ３０Ｔ、Ａ３０Ｗ、Ａ３０Ｙ、またはＡ３０Ｖ、また簡単に云えばＡ３０Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか１つを意味する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、酵素などのポリペプチド、具体的には親ポリペプチドと比べて次の特性、すなわち基質特異性、基質結合、基質切断パターン、熱安定性、ｐＨ／活性プロフィル、ｐＨ／安定性プロフィル、酸化に対する安定性、Ｃａ２＋依存性、比活性、ならびに溶解度、特に生産条件下での溶解度のうちの少なくとも１つを変えたαアミラーゼを提供することである。これらの特性はさらに下記に定義する。
【００１３】
ポリペプチド：
本発明によるポリペプチドには、生物活性、抗微生物活性、および酵素活性を有するタンパク質が含まれる。
【００１４】
検討された酵素活性には、プロテアーゼ、アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、グルコアミラーゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼが含まれる。
【００１５】
好ましい一実施形態において酵素は、αアミラーゼ、具体的にはＢａｃｉｌｌｕｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓαアミラーゼである。好ましい実施形態においてＢａｃｉｌｌｕｓαアミラーゼは、ターマミル様アミラーゼである。
【００１６】
生物活性を有するポリペプチドには、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、調節ペプチド、血液凝固因子、抗体などが含まれる。
【００１７】
改変された溶解度を有するポリペプチド：
タンパク質（ポリペプチド）の結晶は、三次元に密に詰め込まれた体系的な規則正しい同一単位に組み立てられている。単位格子は、１または複数のタンパク質分子とかなりの量の水を含有することができる。また、イオン様のカルシウム、ナトリウム、塩化物、硫酸塩、ならびに界面活性剤および基質などの大きな分子（結晶の成長の間存在する）を三次構造中に識別することができる。単一分子および単一原子はきわめて小さいが、同一単位の反復配列はＸ線散乱を容易にし、したがってタンパク質工学の目的に使用することができる構造情報を提供する。
【００１８】
結晶に比べて沈殿および凝集塊は小さな単位であり、また単一分子は結晶よりも無秩序である。それにもかかわらず分子間の相互作用の幾つかは規則正しい結晶中に見出されるものと同じであり、したがって特性の変わった、特に沈殿傾向の少ない、タンパク質工学的に創られるαアミラーゼの変異体、すなわち溶解度の大きい変異体を設計するためにこの三次構造（３Ｄ構造）および分子間情報を使用することができる。
【００１９】
タンパク質の球形、また往々にして不規則な表面構造により、単位格子中には水などのより無秩序な溶媒によって占められている大きな孔が存在する。実際にはタンパク質表面の大部分は水の層で覆われており、これがＸ線結晶学によって解明されたタンパク質構造が溶液中のタンパク質構造と同一である理由の一つである。タンパク質分子はわずかな領域で直接互いに接しているが、溶媒が介在する接触もまた結晶を互いに結合する「接着剤」として働いている。
【００２０】
一般にタンパク質の溶解度は、有機溶剤、硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ、およびＣａＣｌ２などの塩により、また分子の表面電荷を変えるｐＨの変化により影響を受ける。これらの要因は、酵素の生産では溶液中の酵素を維持すること、また結晶学的実験では有用な結晶を成長させることの両者への影響が考えられる。大きな対称性の結晶は、タンパク質濃度をゆっくり上昇することによって、またはタンパク質表面を変質し、それによって分子間の接触を増大させることによって成長する。すべてのタンパク質がＸ線結晶学的な判定法にとって有用な形態に結晶化するわけではないが、鋳型の分子と考察の対象になっている分子との間の相同性が十分に大きい場合は現存する三次構造に基づいて正確なモデルを組み立てることができる。
【００２１】
酵素などの相同ポリペプチド、具体的にはターマミル様αアミラーゼ（下記に定義される）を三次構造に基づいて比較すると、違いの多くは分子の表面に見出される。
【００２２】
それにもかかわらず本発明者等は、ターマミル様アミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で開示されるＳＰ７２２）の結晶形成に関係している（直接的に、または水分子を介して間接的に）ことが確認されている表面残留物が他のターマミル様アミラーゼ（下記に定義される）の結晶化においてもまた重要な役割を果たしていることを見出した。
【００２３】
或るターマミル様αアミラーゼの三次構造を別のターマミル様αアミラーゼの三次構造（添付資料１に開示したＳＰ７２２構造）からモデル化する一例を下記に記述する。
【００２４】
本発明の概念および下記に記載の本発明によるモデル化の方法は、一般にすべてのポリペプチド、αアミラーゼなどのタンパク質、特に酵素に外挿することができることが理解されよう。
【００２５】
ＳＰ７２２三次構造ならびに別のターマミル様αアミラーゼ三次構造のモデル化：
本発明のαアミラーゼの突然変異体は、ＳＰ７２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の添付資料１に示した三次構造に基づいて見出された。別のポリペプチドの突然変異体は、別の三次構造に基づいて見出すことができる。アルカリ性ターマミル様αアミラーゼ（ＳＰ７２２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示され、また米国特許第５，８２４，５３１号に開示されている）の結晶は懸滴培養法（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｍｅｔｈｏｄ）（当業界でよく知られている）によって得られ、またその三次構造（３Ｄ構造）は本明細書の添付資料１に開示されている。
【００２６】
単位格子は４個の酵素分子を含有していることが分かり、各分子は８個の相互作用する帯域を有している（図２および３参照）。２つの帯域は活性部位を取巻く酵素の側面で識別され、また１つの大きな領域が活性部位に対してαアミラーゼの裏側に見出される。さらに側面に２つの相互作用帯域、および上部から底部まで相互作用を行なう分子の底部の相互作用面と上部の相互作用面がある。
【００２７】
図２から分かるように活性部位を取巻く２つの相互作用帯域は、逆平行の隣りの分子上の同じ２つの領域と相互作用している。同様に裏側の帯域は第三の逆平行アミラーゼ分子上の裏側の帯域と接している。ただしここですべての接触には水が介在している。相互作用する領域が分子全体に広がることもまた図２および３から分かる。
【００２８】
添付資料１に開示したＳＰ７２２三次構造に基づいて別のアルカリ性ターマミル様アミラーゼＡＡ５６０のモデルを組み立てた。ＡＡ５６０ αアミラーゼは、鋳型のアミラーゼ（ＳＰ７２２）と約８７％同一であり、その配列には挿入または欠失を何も含んでいない。高い相同性（同一性）、同じ対称性、および同じ結晶相互作用によりタンパク質表面の相互作用帯域が、生産すなわち発酵段階から始まり精製段階までの間に到達する高いタンパク質濃度で結晶化および沈殿と関係する（背景の項参照）。
【００２９】
これら相互作用帯域中の突然変異を構築し、その酵素を発現し精製し、そのタンパク質の溶解度を「材料および方法」の項に記載の方法を用いて実施例８および９に記載のように異なる条件下で測定した。
【００３０】
本発明の発見は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示したターマミル様αアミラーゼと少なくとも６０％同一の、好ましくは少なくとも７０％同一の、より好ましくは８０％同一の、一層好ましくは８５％同一の、一層好ましくは９０％同一の、一層好ましくは９５％同一の、一層好ましくは９７％同一の、一層好ましくは９９％同一のターマミル様アミラーゼに応用することができる。好ましくはこの発見は、ＳＰ７２２（図１のアラインメントで番号１として示されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）と比べてアライニングされた一次構造中に追加のアミノ酸残基または間隙のないアルカリ性ターマミル様αアミラーゼ、特に同じ長さのアルカリ性αアミラーゼの場合に使用することができる。特にこの発見は、次のアルカリ性ターマミル様αアミラーゼ、すなわちＳＰ６９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＳＰ７２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＡＡ５６０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、＃７０７ αアミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、国際公開特許第９７／００３２４号に記載されているＫＳＭ ＡＰ１３７８ αアミラーゼ中に開示されたＫＳＭ ＡＰＥ １３７８ αアミラーゼ、あるいはそれらの断片または端を切取った形態の場合に使用することができる。これらアルカリ性αアミラーゼは、上記相互作用帯域の周囲にきわめて類似の三次結晶構造を有し、かつアミノ酸４８５個の長さの同一の一次構造を有する。
【００３１】
これとは逆に、例えばターマミル（図１のアラインメントで配列番号４として示されている）は２個のアミノ酸残基（１および２位）を欠き、１７４および１８１〜１８２位に間隙を有し、かつＳＰ７２２とアライニングした場合、３７８〜３８１位に３個の追加のアミノ酸残基を有する。ＢＡＮ（図１のアラインメントで配列番号３として示されている）は、５個のアミノ酸残基（１〜４および４８８位）を欠き、１７４および１８１〜１８２位に間隙を有し、かつＳＰ７２２とアライニングした場合、３７８〜３８１位に３個の追加のアミノ酸残基を有する。ＢＳＧ（図１のアラインメントで配列番号５として示されている）は、１個のアミノ酸残基（１位）を欠き、かつＳＰ７２２ｔ位置合わした場合、４８９〜５１９位に３１個の追加のアミノ酸残基を有する。
【００３２】
ＫＳＭ−Ｋ３６およびＫＳＭ−Ｋ３８（欧州特許公開第１，０２２，３３４−Ａ号）は、５個のアミノ酸残基（１および２位）を欠き、かつＳＰ７２２とアライニングした場合、１７４および１８１〜１８２位に間隙を有する。ＡＡ１８０、ＡＡ２０、およびＡｍｒｋ３８５（デンマーク特許出願第ＰＡ２０００ ００３４７号または国際特許公開第ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１３３号）は、ＳＰ７２２とアライニングした場合、２６１位に１個の追加のアミノ酸を有する。
【００３３】
どのようにして別のαアミラーゼからターマミル様αアミラーゼをモデル化するかを下記に記述する。実施例４においてはＳＰ７２２からのＡＡ５６０のモデル化について記述する。この方法は、例えば上記のように別のポリペプチドにも外挿することができる。
【００３４】
ターマミル様αアミラーゼのモデル化：
国際特許公開第９６／２３８７４号は、Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼ（ＢＡＮ（商標））のＮ終末部の３００個のアミノ酸残基およびＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼのＣ終末部末端のアミノ酸３０１〜４８３位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）からなるターマミル様αアミラーゼの三次構造（３Ｄ構造）、Ｘ線結晶構造データを提供する。国際特許公開第９６／２３８７４号はさらに、親ターマミル様αアミラーゼ、また親と比べて改変された特性を示す親ターマミル様αアミラーゼ変異体の構造解析に基づく設計（モデル化）の方法論について記述している。
【００３５】
国際特許公開第９６／２３８７４号によればその他のターマミル様構造もモデル化することができ、これは参照により本明細書に合体されている。
【００３６】
本発明の変異体を得ることに関しては、実施例１に記載のようにＳＰ７２２三次構造（添付資料１に開示されている）に基づいてＡＡ５６０三次構造が設計（モデル化）された。他のターマミル様αアミラーゼ（例えば本明細書中に開示されているもの）の構造も同様に組み立てることができる。
【００３７】
ターマミル様αアミラーゼ：
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．によって生成された幾つかのαアミラーゼは、アミノ酸レベルに関して高度に相同（同一）である。幾つかのＢａｃｉｌｌｕｓ αアミラーゼの同一性は、下記の表１に見出すことができる。
【００３８】
【表１】
例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されたアミノ酸配列を含むＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）として市販されている）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されたアミノ酸配列を含むＢ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼと約８１％相同であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されたアミノ酸配列を含むＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αアミラーゼとは約６５％相同であることが分かった。さらに、相同のαアミラーゼには、国際特許公開第９５／２６３９７号に開示され、またさらに本明細書中でそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２および ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で表されるＳＰ６９０およびＳＰ７２２が含まれる。その他のアミラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．から得られ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＡＡ５６０ αアミラーゼと、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． から得られ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される＃７０７ αアミラーゼがあり、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ等の論文、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， １５１， ｐｐ．２５〜３１ （１９８８） に記載されている。
【００４０】
ＫＳＭ ＡＰ１３７８ αアミラーゼは、国際特許公開第９７／００３２４号（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから出願されている）に開示されている。また、欧州特許公開１，０２２，３３４号に開示されているＫ３６およびＫ３８ αアミラーゼが本発明により考察されている。
【００４１】
さらに、相同のαアミラーゼには、欧州特許公開０２５２６６６号に記載のＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株（ＡＴＣＣ ２７８１１）によって産生されたαアミラーゼと、国際特許公開第９１／００３５３号および第９４／１８３１４号で同定されているαアミラーゼがある。その他の市販のターマミル様αアミラーゼは、Ｏｐｔｉｔｈｅｒｍ（商標）およびＴａｋａｔｈｅｒｍ（商標）（Ｓｏｌｖａｙから入手できる）、Ｍａｘａｍｙｌ（商標）（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手できる）、Ｓｐｅｚｙｍ ＡＡ（商標）およびＳｐｅｚｙｍｅ Ｄｅｌｔａ ＡＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手できる）、Ｋｅｉｓｔａｓｅ（商標）（Ｄａｉｗａから入手できる）、Ｐｕｒａｓｔａｒ （商標）ＳＴ ５０００Ｅ、ＰＵＲＡＳＴＲＡ（商標） ＨＰＡＭ Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔ．から入手できる）の商標名で販売されている製品中に含まれている。
【００４２】
これらαアミラーゼの間に見出される実質上の相同性のために、これらはαアミラーゼの同じクラス、すなわち「ターマミル様αアミラーゼ」のクラスに属すると考えられる。
【００４３】
したがって、本明細書の文脈においては用語「ターマミル様αアミラーゼ」は、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、すなわち本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼとアミノ酸レベルでほぼ同一性を示すαアミラーゼを指すことを意図している。
【００４４】
換言すれば、本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、および１３で示されるアミノ酸配列を有するすべてのαアミラーゼが「ターマミル様αアミラーゼ」であると考えられる。その他のターマミル様αアミラーゼは、ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、および１３で示される上記アミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも７０％など少なくとも６０％、例えば少なくとも７５％、すなわち少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の相同性を示すαアミラーゼ、および／またはｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、３、５、７、９で識別され、かつ本明細書の上記の特定されたαアミラーゼをコードするＤＮＡ配列（そのコード配列はそれぞれ本明細書のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、および１２に示されるアミノ酸配列をコードする）にハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされるαアミラーゼである。
【００４５】
特性ｉ）に関して相同性は、第一配列が第二配列から派生したことを示す２つの配列の間の同一性の度合として決定することができる。相同性は適切には、ＧＣＧプログラムパッケージとして提供されるＧＡＰなどの当業界で周知のコンピュータプログラムにより決定することができる（前述）。したがってＧａｐ ＧＣＧｖ８は、次のデフォルトパラメータ、すなわちＧＡＰ生成（ｃｒｅａｔｉｏｎ）ペナルティ５．０およびＧＡＰ拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティ０．３、また核酸配列については３．０、タンパク質配列については０．１それぞれのデフォルトのスコアリングマトリックスを用いて使用することができる。ＧＡＰは、アラインメントにＮｅｅｄｌｅｍａｎ／Ｗｕｎｓｃｈ／Ｓｅｌｌｅｒｓの方法を用いる。
【００４６】
ターマミル（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）と別のターマミル様αアミラーゼの間の構造的アラインメントを用いて他のターマミル様αアミラーゼ中の等価の／対応する位置を識別することができる。上記の構造的アラインメントを得るための１つの方法は、ＧＡＰペナルティのデフォルト値、すなわちＧＡＰ生成ペナルティ３．０およびＧＡＰ拡張ペナルティ０．１を用いたＧＣＧパッケージの積み重ねプログラムを使用することである。その他の構造的アラインメントの方法には、疎水性クラスター分析（Ｇａｂｏｒｉａｕｄ等の論文、ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ２２４， ｐｐ． １４９￣１５５ （１９８７））および逆ねじ切り法（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）（Ｈｕｂｅｒ， ＴおよびＴｏｒｄａ， ＡＥの論文、ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｖｏｌ． ７， Ｎｏ． １， ｐｐ． １４２￣１４９ （１９９８））がある。
【００４７】
ハイブリダイゼーション：
上記の特性ｉｉ）に合致するターマミル様αアミラーゼなどのポリペプチドの特徴描写に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは適切には、検討対象になっているαアミラーゼの完全または部分ヌクレオチドあるいはアミノ酸の配列に基づいて調製することができる。
【００４８】
ハイブリダイゼーションを試験するための適切な条件は、５ＸＳＳＣ中に予備浸漬し、２０％ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、および変性し音波処理された子ウシ胸腺のＤＮＡ ５０ｍｇからなる溶液中で〜４０℃で１時間予備ハイブリダイズさせ、続いて１００ｍＭ ＡＴＰを追加した同じ溶液中で〜４０℃で１８時間ハイブリダイズさせ、続いて２ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で３回のフィルタ洗浄を、４０℃（低ストリンジェンシー）、好ましくは５０℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは６５℃（高ストリンジェンシー）、さらに好ましくは〜７５℃（超高ストリンジェンシー）で３０分間行なうものである。ハイブリダイゼーション法に関してより詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の著書、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９中に見ることができる。
【００４９】
本明細書の文脈中で「から得られる」とは、検討対象になっている生物株によって産生された、または産生可能なαアミラーゼを指すだけでなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によってコードされ、そのＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物中で産生されるαアミラーゼを指すことを意図している。結局、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、検討対象になっているαアミラーゼを識別する特徴を有するαアミラーゼを指すことを意図している。この用語はまた、親αアミラーゼが天然に産するαアミラーゼの変異体、すなわち天然に産するαアミラーゼの１または複数のアミノ酸残基の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体であってもよいことを指すことを意図している。
【００５０】
親ターマミル様αアミラーゼ：
本発明によれば、上記で定義した通りすべてのターマミル様αアミラーゼは、親αアミラーゼ（すなわち、骨格）として使用することができる。本発明の好ましい実施形態において親αアミラーゼは、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼなどの上記で言及されたものの１つから得られる。特に好ましい親αアミラーゼは、ＳＰ７２２ αアミラーゼおよびＡＡ５６０ αアミラーゼである。一実施形態において親αアミラーゼは、１または複数の次の突然変異／置換、すなわちＤＥＬＴＡ（Ｒ８１〜Ｇ１８２）、ＤＥＬＴＡ（Ｒ１８３〜Ｇ１８４）、ＤＥＬＴＡ（Ｒ１８３〜Ｇ１８４）＋Ｎ１９５Ｆ、ＲＲ１８１Ｑ＋Ｎ４４５Ｑ＋Ｋ４４６Ｎ、ＤＥＬＴＡ（Ｒ１８３〜Ｇ１８４）＋Ｒ１８１Ｑを有する。
【００５１】
親のハイブリッドターマミル様αアミラーゼ：
親αアミラーゼ（すなわち骨格αアミラーゼ）はまた、ハイブリッドαアミラーゼ、すなわち少なくとも２種類のαアミラーゼから得られる部分アミノ酸配列の組合せを含むαアミラーゼであってもよい。
【００５２】
親のハイブリッドαアミラーゼは、アミノ酸の相同性（同一性）および／またはＤＮＡハイブリダイゼーション（上記で定義される）に基づいてターマミル様αアミラーゼのファミリーに属することを決めることができるものである。この場合、ハイブリッドαアミラーゼは一般に、ターマミル様αアミラーゼが少なくとも一部分と、ターマミル様αアミラーゼあるいは微生物（細菌または真菌）および／または哺乳類起源の非ターマミル様αアミラーゼから選択される１または複数の別のαアミラーゼ部分とから構成される。
【００５３】
したがって親のハイブリッドαアミラーゼは、少なくとも２種類のターマミル様αアミラーゼから得られる、または少なくとも１種類のターマミル様αアミラーゼと少なくとも１種類の非ターマミル様の細菌性αアミラーゼとから得られる、または少なくとも１種類のターマミル様αアミラーゼと少なくとも１種類の真菌性αアミラーゼとから得られる部分アミノ酸配列の組合せを含むことができる。部分アミノ酸配列を導出するターマミル様αアミラーゼは、本明細書で言及したこれら特定のターマミル様αアミラーゼのいずれかであることができる。
【００５４】
例えば親αアミラーゼは、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株から得られるαアミラーゼのＣ終末部分と、Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株またはＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株から得られるαアミラーゼのＮ終末部分とを含むことができる。例えば親αアミラーゼは、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのＣ終末部分の少なくとも４３０個のアミノ酸残基を含むことができ、また例えば、ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼのＮ終末部の３７個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼのＣ終末部の４４５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントとを含んでもよく、またはターマミル配列すなわちＮ終末部の３５個のアミノ酸残基（成熟タンパク質の）が、ＢＡＮすなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるＢ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼのＮ終末部の３３個のアミノ酸残基（成熟タンパク質）により置き換えられていることを除けば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８で示されるＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼと同一のハイブリッドターマミル様αアミラーゼを含んでもよく、あるいはｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αアミラーゼのＮ終末部の６８個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８で示されるアミノ酸配列を有するＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼのＣ終末部の４１５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントとを含んでもよい。
【００５５】
別の好適な親のハイブリッドαアミラーゼは、ＢＡＮすなわちＢ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼのＮ終末部（成熟タンパク質のアミノ酸１〜３００位）と、ターマミル由来のＣ終末部（成熟タンパク質のアミノ酸３０１〜４８３位）を構成する、以前に国際特許公開第９６／２３８７４号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから出願されている）に記載されたものである。
【００５６】
改変される特性：
下記に本発明の変異体中に存在する突然変異と、それによりもたらされる特性の望ましい変化（親ターマミル様αアミラーゼの特性と比べて）との関係について考察する。
【００５７】
前述のように本発明は改変された特性、特に生産条件下で改変された特性を有するターマミル様αアミラーゼに関する。
【００５８】
特に意図する特性の変化を実現することと関連して特に検討された親ターマミル様αアミラーゼは、前述の親ターマミル様αアミラーゼおよび親のハイブリッドターマミル様αアミラーゼである。ＳＰ７２２ αアミラーゼを出発点として用いるが、例えばターマミル、ＢＳＧ、ＢＡＮ、ＡＡ５６０、ＳＰ６９０、ＡＡ１８０、ＫＳＭ ＡＰ１３７８、および＃７０７、Ｋ３８、Ｋ３６中の対応する位置もまた開示されたものと理解されるべきである。
【００５９】
好ましい実施形態において本発明の変異体は、特に洗濯およびクリーニング条件下で高い溶解度を有する。
【００６０】
一態様において本発明は、前述のように改変された特性を有する変異体に関する。
【００６１】
第一の態様において親ターマミル様αアミラーゼの変異体は、
【００６２】
【表２】
の群から選択される１または複数の位置（アミノ酸ナンバリングではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いる）に変化を含む変異体であって、
【００６４】
（ａ）その変化は独立に、
（ｉ）その位置を占めるアミノ酸の下流に向ってアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占めるアミノ酸の欠失、または
（ｉｉｉ）異なるアミノ酸によるその位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）その変異体はαアミラーゼ活性を有し、かつ
（ｃ）各位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２で示されるＡＡ５６０のアミノ酸配列を有する親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する。
【００６５】
ＳＰ７２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）ではそのような対応位置は、Ｒ２８、Ｎ９４、Ｌ１１８、Ｎ１２５、Ｑ１７４、Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｄ１８３、Ｇ１８４、Ａ１８６、Ｗ１８９、Ｎ１９５、Ｍ２０２、Ｙ２９８、Ｎ２９９、Ｎ３０２、Ｓ３０３、Ｎ３０６、Ａ３１０、Ｎ３１４、Ｋ３２０、Ｈ３２４、Ｑ３４５、Ｆ３９６、Ｔ４００、Ｗ４３９、Ｑ４４４、Ｎ４４５、Ｋ４４６、Ｑ４４９、Ｋ４５８、Ｎ４７１、Ｋ４８４である。
【００６６】
好ましい実施形態において本発明の変異体（ナンバリングではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いる）は、次の１または複数の突然変異／置換、すなわち
【００６７】
【表３】
を有する。
【００６９】
好ましい二重、三重、および多重突然変異（ナンバリングの基準としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いた）には、
【００７０】
【表４】
【表５】
がある。
【００７３】
検討された変異体には、実施例で記述した特定のもの、およびさらに１または複数の突然変異／置換、すなわちＤＥＬＴＡ（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）；Ｎ１９５Ｆ；Ｒ１８１Ｑ；Ｇ１８６Ｒ；Ｍ２０２Ｌ；Ｖ２０６Ｆ、Ｌ、Ｍ；Ｎ１９３Ｓ、Ｔ、Ｐと組み合わせた前述の突然変異が含まれる。
【００７４】
高い溶解度：
前述の突然変異はすべて、上記の定義のようにターマミル様αアミラーゼのグループ内の任意のαアミラーゼで用いられた場合、改変された溶解度を有するターマミル様αアミラーゼ変異体をもたらす。
【００７５】
したがって好ましい実施形態において本発明の変異体は、
【００７６】
【表６】
の群から選択される１または複数の位置（アミノ酸のナンバリングではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いる）における変化を含む、親ターマミル様αアミラーゼと比べて高い溶解度（さきに定義した）を有する親ターマミル様αアミラーゼの変異体であって、
【００７８】
（ａ）その変化は独立に、
（ｉ）その位置を占めるアミノ酸の下流に向ってアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占めるアミノ酸の欠失、または
（ｉｉｉ）異なるアミノ酸によるその位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）その変異体はαアミラーゼ活性を有し、かつ
（ｃ）各位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２で示されるＡＡ５６０のアミノ酸配列を有する親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する。
【００７９】
好ましい実施形態において、親αアミラーゼと比べて高い溶解度を有する本発明の変異体は、次の置換、すなわち
【００８０】
【表７】
を有する。
【００８２】
好ましい実施形態において高い溶解度（「材料および方法」の項に記載の方法の一つを用いて決定される）を有する本発明の変異体（ナンバリングの基準としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を用いた）には、
【００８３】
【表８】
【表９】
【表１０】
が含まれる。
【００８７】
本発明による別の組合せには、実施例中に記述されている特定の組合せ、および次の置換、すなわちＮ１９５Ｆ；Ｒ１８１Ｑ；Ｇ１８６Ｒ；Ｍ２０２Ｌ；Ｖ２０６Ｆ、Ｌ、Ｍ；Ｎ１９３Ｐの１または複数が含まれる。
【００８８】
安定性：
本発明の文脈において改変された安定性、具体的には改良された安定性（すなわち、より高いまたはより低い）、特に高ｐＨ（すなわちｐＨ ８ ￣１０．５）における安定性に関して重要な突然変異には、「改変された特性」の項でリストアップした突然変異のいずれかが含まれる。
【００８９】
Ｃａ２＋安定性：
改変されたＣａ２＋安定性とは、Ｃａ２＋が消耗したときの酵素の安定性、すなわちより高いまたはより低い安定性が改良されたことを意味する。本発明の文脈において改変されたＣａ２＋安定性、具体的には改良されたＣａ２＋安定性、すなわち特に高ｐＨ（すなわちｐＨ ８ 〜１０．５）における高いまたはより低い安定性を達成することに関して重要な突然変異（アミノ酸の置換および欠失を含む）には、「改変された特性」の項でリストアップした突然変異のいずれかが含まれる。
【００９０】
比活性：
本発明の更なる態様において、改変された比活性、具体的には特に温度１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、特に３０〜４０℃における比活性の増加または減少を示す変異体を得ることに関して重要な突然変異（アミノ酸の置換および欠失を含む）には、「改変された特性」の項でリストアップした突然変異のいずれかが含まれる。
【００９１】
本発明の変異体における一般的な突然変異：
特に興味深い突然変異（アミノ酸の置換および欠失を含む）は、酵素の活性部位のまわりの動きやすさを増加させる突然変異である。これは活性部位の近傍、すなわち活性部位を構成する残基のいずれかから好ましくは１０Åまたは８Åまたは６Åまたは４Å以内で安定化をもたらす相互作用を乱す変化によって達成される。
【００９２】
例には、ＡｌａからＧｌｙ；ＶａｌからＡｌａまたはＧｌｙ；ＩｌｅまたはＬｅｕからＶａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙ；ＴｈｒからＳｅｒなどの側鎖のサイズを減少させる突然変異がある。
【００９３】
このような突然変異は空洞の導入、または突然変異によって残った空間を充たす構造的再配列のいずれかにより活性部位領域の柔軟性の増加を引き起こすと考えられる。
【００９４】
本発明の変異体は上記で略述したものに加えて１または複数の修飾を含むことが好ましい。したがって有利には修飾されるαアミラーゼの変異体の一部に存在する１または複数のプロリン残基を非プロリン残基で置換することができ、この非プロリン残基は考えられる天然に産する非プロリン残基のいずれであってもよく、また好ましくはアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、またはロイシンである。
【００９５】
同様に、親αアミラーゼを修飾するアミノ酸残基中に存在する１または複数のシステイン残基をセリン、アラニン、スレオニン、グリシン、バリン、またはロイシンなどの非システイン残基で置換することが好ましい。
【００９６】
さらに本発明の変異体は、単独の修飾として、または上記に略述した修飾のいずれかと組み合わせて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸断片１８５〜２０９位に対応するアミノ酸断片中に存在する１または複数のＡｓｐおよび／またはＧｌｕがそれぞれＡｓｎおよび／またはＧｌｎに置換されるように修飾してもよい。また、ターマミル様αアミラーゼ中で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸断片１８５〜２０９位に対応するアミノ酸断片中に存在するＬｙｓ残基の１または複数をＡｒｇに置換することも興味深い。
【００９７】
本発明が上記に略述した修飾の２つ以上を組み込んだ変異体を包含することが理解されよう。
【００９８】
さらに、有利には下記の１または複数の位置（ナンバリングではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標））を用いる）に突然変異を導入することができる。すなわち、
【００９９】
Ｍ１５、Ｖ１２８、Ａ１１１、Ｈ１３３、Ｗ１３８、Ｔ１４９、Ｍ１９７、Ｎ１８８、Ａ２０９、Ａ２１０、Ｈ４０５、Ｔ４１２、特に下記の単一、二重、または三重もしくは多重突然変異：
【０１００】
Ｍ１５Ｘ、特にＭ１５Ｔ、Ｌ；
Ｖ１２８Ｘ、特にＶ１２８Ｅ；
Ｈ１３３Ｘ、特にＨ１３３Ｙ；
Ｎ１８８Ｘ、特にＮ１８８Ｓ、Ｔ、Ｐ；
Ｍ１９７Ｘ、特にＭ１９７Ｔ、Ｌ；
Ａ２０９Ｘ、特にＡ２０９Ｖ；
Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｆ；Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｙ；Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；
【０１０１】
Ｍ１５／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；Ｅ１１９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ；Ｄ１２４Ｃ／Ｒ１２７Ｃ；Ｈ１３３Ｙ／Ｔ１４９Ｉ；Ｇ４７５Ｒ、Ｈ１３３Ｙ／Ｓ１８７Ｄ；Ｈ１３３Ｙ／Ａ２０９Ｖ；
【０１０２】
ＡＡ５６０ではこれは、Ｌ１７Ｘ、特にＬ１７Ｔ；
Ｅ１３０Ｘ；
Ｙ１３５Ｘ；
Ｗ１４０Ｘ、特にＷ１４０Ｆ、Ｙ；
Ｔ１９３Ｘ、特にＴ１９３Ｓ、Ｐ；
Ｍ２０２Ｘ、特にＭ２０２Ｔ、Ｌ；
Ｖ２１４Ｘに対応し；
検討されたこれらの組合せには、
Ｍ２０２Ｔ／Ｗ１４０Ｆ；Ｍ２０２Ｔ／Ｗ１４０Ｙ；Ｌ１７Ｔ／Ｔ１９３Ｓ；Ｌ１７Ｔ／Ｎ１９３Ｐ；Ｅ１２１Ｃ／Ｓ１３２Ｃ；Ｎ１２６Ｃ／Ｑ１２９Ｃ；Ｔ１５１Ｉ；Ｇ４８０Ｒが含まれる。
【０１０３】
本発明のαアミラーゼ変異体の調製方法：
遺伝子中に突然変異を導入するには幾つかの方法が当業界で知られている。αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングについて簡単な考察の後、αアミラーゼをコードする配列内の特定の部位で突然変異を生じさせる方法について考察することにする。
【０１０４】
αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング：
親αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、当業界でよく知られているさまざまな方法を用いて検討対象になっているαアミラーゼを産生する任意の細胞または微生物から単離することができる。まず、試験されるαアミラーゼを産生する生物由来の染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを用いてゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡのライブラリーを構築する。次いで、αアミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合は、相同の標識したオリゴヌクレオチドプローブを合成し、使用して検討対象になっている生物から調製されたゲノムライブラリーからαアミラーゼをコードするクローンを識別することができる。別法では、知られているαアミラーゼの遺伝子と相同の配列を含む標識したオリゴヌクレオチドプローブを、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いたαアミラーゼをコードするクローンを識別するためのプローブとして使用することができる。
【０１０５】
αアミラーゼをコードするクローンを識別するためのさらに別の方法は、プラスミドなどの発現ベクターにゲノムＤＮＡの断片を導入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーでαアミラーゼ陰性細菌を形質転換し、次いで形質転換された細菌をαアミラーゼ用の基質を含有する寒天上で培養し、それによってクローンが識別すべきαアミラーゼを発現するのを可能にするものである。
【０１０６】
別法では、酵素をコードするＤＮＡ配列を確立されている標準的な方法、例えばＳ．Ｌ．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの論文、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２， １９８１， ｐｐ．１８５９￣１８６９に記載されているホスホロアミダイト法、またはＭａｔｔｅｓ等の論文、Ｔｈｅ ＲＭＢＯ Ｊ． ３， １９８４， ｐｐ．８０１￣８０５に記載されている方法により合成的に調製することができる。ホスホロアミダイト法ではオリゴヌクレオチドを、例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成し、精製し、アニールし、連結反応させ、適切なベクター中でクローン化する。
【０１０７】
結局ＤＮＡ配列は標準的な技術に従って、合成、ゲノム、またはｃＤＮＡ由来の断片（適宜、ＤＮＡ配列全体のさまざまな部分に対応する断片）を連結反応させることによって調製される、ゲノムと合成由来の混合配列、合成とｃＤＮＡ由来の混合配列、またはゲノムとｃＤＮＡ由来の混合配列であってもよい。ＤＮＡ配列はまた、例えば米国特許第４，６８３，２０２号またはＲ． Ｋ． Ｓａｉｋｉ等の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， １９８８， ｐｐ．４８７￣４９１に記載されているように特異的プライマーを用いた重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することもできる。
【０１０８】
αアミラーゼ変異体の発現：
本発明によれば、前述の方法によって、または当業界で知られている任意の別の方法によって生成される変異体をコードするＤＮＡ配列は、一般にプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始信号、および任意選択でリプレッサー遺伝子またはさまざまなアクチベータ−遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを用いて酵素の形態で発現させることができる。
【０１０９】
本発明のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を担持する組換え発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ手順に従わせることができる任意のベクターであり、ベクターの選択はそれが導入されることになる宿主細胞に左右されることが多い。したがってこのベクターは、自己複製ベクターすなわち染色体外の存在物として存在するベクター；染色体複製物とは無関係の複製物、例えばプラスミド、バクテリオファージ、または染色体外の構成分子；ミニクロモソーム；あるいは人工の染色体であってもよい。別法ではこのベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞のゲノム中に取り込まれ、それを取り込んだ染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【０１１０】
このベクター中でＤＮＡ配列は、適切なプロモーター配列と作動可能に結合することになる。このプロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示し、宿主細胞と相同または非相同いずれかの、遺伝子をコードするタンパク質から得ることができる任意のＤＮＡ配列であってよい。特に細菌性の宿主中で本発明のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写に向わせるのに好適なプロモーターの例には、Ｅ．ｃｏｌｉのＬａｃオペロンのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡのプロモーター群、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター群、Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター群、Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター群、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター群などがある。真菌性の宿主中での転写の場合、有用なプロモーターの例には、Ａ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ アミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ中性αアミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ 酸安定性αアミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａ． ｏｒｙｚａｅアルカリ性プロテアーゼ、Ａ． ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、またはＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼがある。
【０１１１】
本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター、また真核生物では本発明のαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列と作動可能に結合したポリアデニル化配列を含むことができる。終結およびポリアデニル化配列は、適切にはプロモーターと同じ供給源から得ることができる。
【０１１２】
ベクターはさらに、検討対象になっている宿主細胞中でベクターが複製を行なうのを可能にするＤＮＡ配列を含むことができる。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、およびｐＩＪ７０２の複製開始点である。
【０１１３】
ベクターはまた、選択可能な遺伝標識、例えばＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ またはＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子など、その生成物が宿主細胞中の欠損を補完する遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリン耐性など抗生物質耐性を付与する遺伝子を含むことができる。さらにベクターは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、およびｓＣなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ選択マーカー、ヒグロマイシン耐性を生じさせるマーカーを含んでもよく、あるいはその選択は、例えば国際特許公開第９１／１７２４３号に記載のように同時形質転換によって達成することもできる。
【０１１４】
細胞内発現は、例えば宿主細胞として或る種の細菌を用いる場合には幾つかの点で有利であるかも知れないが、一般には発現は細胞外であることが好ましい。一般に、本明細書に記述されたＢａｃｉｌｌｕｓ αアミラーゼは、発現したプロテアーゼの培地中への分泌を可能にする予備領域を具備している。望むならばこの予備領域は別の予備領域またはシグナル配列で置き換えることができ、便利にはそれぞれの予備領域をコードするＤＮＡ配列の置換によって達成される。
【０１１５】
αアミラーゼ変異体、そのプロモーター、ターミネーター、およびその他の構成分子をそれぞれコードする本発明のＤＮＡ構築物を連結反応させるために、またそれらを複製に必要な情報を含有する適切なベクター中に挿入するために使用される手順は、当業技術者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の著書、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９を参照されたい）。
【０１１６】
さきに定義したように本発明のＤＮＡ構築物または発現ベクターのいずれかを含む本発明の細胞は、本発明のαアミラーゼ変異体の組換え産物の宿主細胞として使用するのが有利である。この細胞は、便利には宿主の染色体にそのＤＮＡ構築物を組み込む（１または複数のコピーに）ことにより、変異体をコードする本発明のＤＮＡ構築物で形質転換することができる。この組込みは、細胞中の方がＤＮＡ配列がより安定に保たれやすいので有利であると一般に考えられている。ＤＮＡ構築物の宿主染色体中への組込みは、従来の方法に従って、例えば相同的または非相同的組換えによって行なうことができる。別法では細胞は、異なる種類の宿主細胞と結びつけて前述のように発現ベクターで形質転換することができる。
【０１１７】
本発明の細胞は、哺乳類または昆虫などのより高度の生物の細胞であってもよいが、好ましくは微生物の細胞、例えば細菌または真菌（酵母を含む）の細胞である。
【０１１８】
好適な細菌の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓとＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓなどのグラム陽性菌、あるいはＥ． ｃｏｌｉなどのグラム陰性菌である。細菌の形質転換は、例えば原形質体の形質転換により、または公知のやり方でコンピテント細胞を用いることにより行なうことができる。
【０１１９】
酵母生物は、好都合にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択することができる。糸状菌は、有利にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに属することができる。真菌細胞は、原形質体の形成および原形質体の形質転換、続いて細胞壁の再生を含むプロセスによって公知の方法で形質転換することができる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主細胞の形質転換の適切な手順は、欧州特許公開第２３８ ０２３号に記載されている。
【０１２０】
更なる態様において本発明は、変異体の生産に役立つ条件下で前述のように宿主細胞を培養すること、ならびに細胞および／または培地からその変異体を回収することを含む、本発明のαアミラーゼ変異体の生産方法に関する。
【０１２１】
細胞を培養するために使用される培地は、検討対象になっている宿主細胞を増殖させ、本発明のαアミラーゼ変異体を発現させるのに適した任意の従来の培地であってよい。好適な培地は営利目的の供給業者から入手可能であり、あるいは出版物に掲載されている処方（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載されている）に従って調製することができる。
【０１２２】
宿主細胞から分泌されたαアミラーゼ変異体は、細胞を遠心分離または濾過によって培地から分離すること、硫酸アンモニウムなどの塩によって培地のタンパク質成分を沈殿させること、続いてイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどのクロマトグラフの手順を用いることなどを含む周知の手順により培地から回収するのが便利である。
【０１２３】
産業面への応用：
本発明のαアミラーゼ変異体は、さまざまな産業面の応用を可能にする有用な特性を持っている。具体的には本発明の酵素の変異体は、洗濯、皿洗い、および硬い表面のクリーニング用洗剤組成物の成分として応用できる。改変された特性を有する本発明の変異体は、デンプンの製造プロセス、具体的にはデンプンの転化、特にデンプンの液化に用いることができる（例えば、米国特許第３，９１２，５９０号、欧州特許公開第２５２ ７３０号および第６３ ９０９号、国際特許公開第９９／１９４６７号を参照されたい）。
【０１２４】
さらに、本発明の変異体はまた、特にデンプンからの甘味料およびエタノールの生産、および／または繊維の糊抜きに有用である。
【０１２５】
組成物：
一態様において本発明は、本発明の変異体を含む組成物に関する。一実施形態において本発明の組成物は１または複数の別の酵素を含み、それにはリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グルコアミラーゼ、ペルオキシダーゼ、もしくはラッカーゼ、および／または別のαアミラーゼなどの群から選択される１または複数の酵素がある。
【０１２６】
洗剤組成物：
前述のように本発明の変異体は、洗剤組成物に配合するのに適している。洗剤組成物（洗濯または皿洗い用洗剤など）の関連する成分、このような洗剤組成物中に変異体を配合する適切な方法、および関連性のある洗剤組成物の種類の例に関してさらに詳細には、例えば国際特許公開第９６／２３８７４号および第９７／０７２０２号に参照されている。
【０１２７】
本発明の変異体を含む洗剤組成物は、追加してリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グルコアミラーゼ、ペルオキシダーゼ、もしくはラッカーゼ、および／または別のαアミラーゼなどの１または複数の別の酵素を含むことができる。
【０１２８】
本発明のαアミラーゼ変異体は、従来採用している濃度で洗剤中に配合することができる。本発明の変異体は、洗剤の従来の用量レベルを用いた洗濯／皿洗い液１リットル当たりαアミラーゼ０．００００１￣１０ ｍｇ（純粋な活性酵素タンパク質として計算）に相当する量を配合することが現在検討されている。
【０１２９】
本発明はまた、親αアミラーゼと比べて改変された特性、具体的には溶解度、特に高い溶解度、基質特異性、基質結合、基質切断パターン、温度安定性、酵素活性のｐＨ依存、安定性のｐＨ依存、酸化に対する安定性、ＣＡ２＋依存性、および比活性の改変された特性を有するαアミラーゼを提供する方法に関するもので、その方法は
【０１３０】
（ａ）親αアミラーゼの三次元構造を描くために添付資料１に表されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の三次元構造に倣って親αアミラーゼをモデル化するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた三次元構造において、その構造の一部分の変化が上記改変された特性をもたらすと予想される、親の構造の少なくとも一部分を識別するステップ、
（ｃ）親αアミラーゼをコードする核酸の配列を修飾して、上記構造の一部分に対応する位置で１または複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換をコードする核酸を生成するステップ、および
（ｄ）修飾された核酸を宿主細胞中で発現させて、αアミラーゼ酵素活性を有し、かつ親と比べて少なくとも１つの改変された特性を有する変異体αアミラーゼを産生するステップ、を含む。
【０１３１】
一実施形態においてこの方法は、親と比べて改変された特性を有する親αアミラーゼの変異体を構築する方法であり、この親αアミラーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、または１３の配列を持つか、あるいは上記配列と少なくとも６０％同一の配列（前述のように決定された）を持ち、この方法は
（ａ）親αアミラーゼの三次元構造を描くために添付資料１に表されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の三次元構造に倣って親αアミラーゼをモデル化するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた三次元構造を、上記特性が親αアミラーゼと異なった関連のないαアミラーゼの三次元構造と比較するステップ、
（ｃ）その関連のないαアミラーゼの三次元構造とは異なり、かつ上記特性と関連性があると予想される、ステップ（ａ）で得られた三次元構造の構造の一部分を識別するステップ、
（ｄ）親αアミラーゼをコードする核酸の配列を修飾して、上記構造の一部分に対応する位置で１または複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換をコードする核酸を生成するステップ、および
（ｅ）修飾された核酸を宿主細胞中で発現させて、αアミラーゼ活性を有し、かつ親と比べて１または複数の改変された特性を有する変異体αアミラーゼを産生するステップ、を含む。
【０１３２】
検討されたターマミル様αアミラーゼは上記のものである。
ポリペプチドの溶解度を増加させる方法：
本発明はまた、酵素などのポリペプチド、具体的にはターマミル様αアミラーゼの溶解度を増加させる方法に関する。
【０１３３】
本発明の方法は、タンパク質の結晶中に配置された隣りのポリペプチド分子に近接した位置を占める１または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失を含む。本発明の文脈において隣りの分子に近接した位置を占めるポリペプチドのアミノ酸残基とは、それが結晶または沈殿中の隣りの酵素分子に配置されているアミノ酸残基から潜在的に分子間で相互作用する距離内にあるというやり方でポリペプチド中に配置されたアミノ酸残基を指す。
【０１３４】
潜在的な分子間相互作用の例には、水素結合、塩架橋の形成、極性相互作用、および芳香族相互作用があるがこれらには限定されない。
【０１３５】
本発明の文脈で用語「隣り」とは、例えば「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ａｎｄ Ｔｉｐｓ」（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｔｅｒｅｓｅ Ｍ． Ｂｅｒｇｆｏｒｓ著）、またはインターネットサイト：ｗｗｗ．ｈａｍｐｔｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ． の記述のように調製されている結晶構造中の２つの位置の間の最も近い距離を意味する。
【０１３６】
したがってこの態様において本発明は、酵素の結晶の溶解度を増加させる方法に関するもので、その方法は
【０１３７】
１）三次結晶構造中の隣りのポリペプチド分子の６．０Åの距離内に位置し、かつ
２）その隣りのポリペプチド分子と相互作用する
１または複数のアミノ酸残基を、例えば置換または欠失によって突然変異させる。
【０１３８】
好ましい実施形態においては、突然変異されるアミノ酸残基は隣りのポリペプチド分子の３．５Åに位置する。
【０１３９】
検討されたポリペプチドには、抗菌性ポリペプチド、およびインスリン、成長ホルモン、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子などの生物活性を有するポリペプチドが含まれる。
【０１４０】
検討された酵素活性には、プロテアーゼ、アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼ、セルラーゼ、クチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチンリアーゼの活性が含まれる。
【０１４１】
好ましい実施形態において酵素は、アミラーゼ、好ましくはαアミラーゼ、特に下記にさらに記述することになるターマミル様αアミラーゼである。
【０１４２】
基質に「近接」したアミノ酸位置とは、単一水分子が介在するタンパク質−タンパク質相互作用に対応する６Å未満の距離を指す。好ましい実施形態において、基質に近接したアミノ酸位置とは、直接のタンパク質−タンパク質相互作用に対応する３．５Å未満の距離を指す。
【０１４３】
ターマミル様αアミラーゼの溶解度を増加させる方法：
この態様において本発明は、ターマミル様αアミラーゼ結晶の溶解度を増加させる方法に関するもので、その方法は
【０１４４】
１）三次結晶構造中の隣り合うターマミル様αアミラーゼ分子が６Åの距離内に配置され、かつ
２）その隣り合うターマミル様αアミラーゼ分子と相互作用する、
１または複数のアミノ酸残基を、例えば置換または欠失によって突然変異する。
好ましい実施形態においては、突然変異されるアミノ酸残基は、隣りのターマミル様αアミラーゼから３．５Åに位置する。添付資料１に表されているＳＰ７２２の結晶構造は、隣り合うターマミル様αアミラーゼの間の距離を決定するための基準（固定点）として用いることができる。
【０１４５】
しかしながら、基準（固定点）の結晶が添付資料１に表されているＳＰ７２２からモデル化（上記、または国際特許公開第９６／２３８７４号に記載されている）される構造であるということは、本発明の範囲内にある。
【０１４６】
好ましいターマミル様αアミラーゼには、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種のＮＣＩＢ １２２８９、ＮＣＩＢ １２５１２、ＮＣＩＢ １２５１３、またはＤＳＭ ９３７５、あるいはＤＳＭＺ ｎｏ．１２６４９、ＫＳＭ ＡＰ１３７８の株から得られるαアミラーゼからなる群から選択されたＢａｃｉｌｌｕｓ αアミラーゼがある。ターマミル様αアミラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、および１３で表される群から選択されたαアミラーゼのいずれか、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４との同一性の度合いが少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９７％、一層好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有するターマミル様αアミラーゼ、あるいは低い、好ましくは中位の、好ましくは高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列を備えた核酸配列によってコードされるターマミル様αアミラーゼであることができる。この条件は上記でさらに詳細に記述されている。
【０１４７】
直近のアミラーゼ分子から６Å未満のところに存在するターマミル様αアミラーゼのアミノ酸残基は、下記のものである（ＳＰ７２２のナンバリングを用いた）。
【０１４８】
【表１１】
直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するターマミル様αアミラーゼのアミノ酸残基は下記のもの（ＳＰ７２２のナンバリングを用いた）、すなわち
【０１５０】
【表１２】
直近のアミラーゼ分子から６．０Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、ＳＰ７２２アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０１５２】
【表１３】
直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、ＳＰ７２２アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０１５４】
【表１４】
直近のアミラーゼ分子から６．０Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、ＡＡ５６０アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０１５６】
【表１５】
直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するアミノ酸残基は、ＡＡ５６０アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０１５８】
【表１６】
高い溶解度したがって高性能をもたらすαアミラーゼ中の置換
一般に何らかのタンパク質−タンパク質相互作用を妨害または消失させる任意の置換は高い溶解度、したがって特定の用途で高い性能をもたらす。したがってタンパク質−タンパク質相互作用に加担するアミノ酸残基を、より高い溶解度をもたらす荷電または非荷電アミノ酸になるように、より大きい、より小さい、より疎水性、より親水性のものに変えることができる。
【０１６０】
より大きいアミノ酸残基は、相互作用に対する立体障害になることができ、またより小さいアミノ酸残基は、相互作用する残基の間の距離を広げて相互作用を弱める。極性の相互作用、特に塩架橋は、関係する残基の少なくとも１つを疎水性の残基に変えることにより、関係する残基の少なくとも１つを、距離を広げて強い相互作用にする小さい残基に変えることにより、あるいは関係する残基の少なくとも１つを、立体障害になる大きい残基に変えることにより消失する。疎水性の相互作用は、相互作用するアミノ酸の１つを親水性のアミノ酸残基に変えることによって効果的に消失するが、より小さい、またはより大きい疎水性の残基もまたこの種の相互作用を消失させることができる。芳香族の相互作用は、親水性の残基または小さい疎水性の残基に変えることによって防ぐことができる。
【０１６１】
材料および方法
酵素：
ＳＰ７２２： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから入手可能で国際特許公開第９５／２６３９７号に開示されている。
【０１６２】
ＡＡ５６０： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２は、国際特許公開第００／６００６０号に開示されＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから入手可能；デンマーク特許出願第ＰＡ １９９９ ００４９０号に開示されている；ＤＳＭＺで１９９９年１月２５日に寄託され、ＤＳＭＺ Ｎｏ． １２６４９が割り当てられている。
【０１６３】
ＡＡ５６０は、Ｄｅｕｔｓｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ＤＥにおける特許手続きのための微生物供託の国際承認に関するブタペスト条約の合意の下に本発明者等によって供託された。
【０１６４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＡ２７３については、国際特許公開第９５／１０６０３号を参照されたい。
【０１６５】
プラスミド：
ｐＪＥ１は、ＳＰ７２２αアミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）の変異体、すなわち成熟タンパク質中のアミノ酸Ｄ１８３〜Ｇ１８４に対応する６個のヌクレオチドの欠失をコードする遺伝子を含有する。ＪＥ１遺伝子の転写はａｍｙＬプロモーターから指示される。プラスミドはさらにまた、複製開始点、およびプラスミドｐＵＢ１１０（ｇｒｙｃｚａｎ， ＴＪ等の論文、Ｊ． Ｂａｃｔ． ３４： ３１８〜３２９ （１９７８））から得られる、カナマイシン耐性を付与するｃａｔ遺伝子を含有する。
【０１６６】
「方法」
モデルの組立て：
「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ （ＰＤＢ） （＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｂｎｌ．ｇｏｖ／＞）」または「Ｔｈｅ Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ｄａｔａｂａｎｋ ａｔ Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＵＳ」などのタンパク質構造データベースが、モデルを組み立てようとしている検討対象になっている分子と似たタンパク質を探すために検索される。アミノ酸配列は構造的に保存される領域を考慮に入れてアライニングされ、座標は基準タンパク質から主題のタンパク質にコピーされる。挿入および欠失を有する領域の座標は、似たアミノ酸配列を有する別のタンパク質からか、または大部分の３Ｄソフトウェアパッケージ、例えばＨｏｍｏｌｏｇｙ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｓｙｍ， ＭＳＩ中に見出されるランダム構造生成機能を用いることによるかのいずれかで割り当てられる。
【０１６７】
例えばＢｉｏｓｙｍ， ＭＳＩのディスカバープログラム中のコマンドＥＮＤ ＲＥＰＡＩＲおよびＳＰＬＩＣＥ ＲＥＰＡＩＲによって座標が主題のタンパク質のすべてのアミノ酸に割り当てられ、断片がつなぎ合わされたとき、モデルは精巧なものになる。モデルのエネルギーは、まず分子を弛緩させる（ディスカバープログラム中のＲＥＬＡＸコマンド）ことによってできるだけ少なくし、次に分子動力学によってできるだけ少なくする。参考資料は、相同組立て用ソフトウェアのマニュアル、例えばＨｏｍｏｌｏｇｙ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｓｙｍ， ＭＳＩ中に見出すことができる。
【０１６８】
ライブラリーベクターｐＤｏｒＫ１０１の構築：
Ｅ．ｃｏｌｉ ／ ＢａｃｉｌｌｕｓシャトルベクターｐＤｏｒＫ１０１（下記に記述する）を用いてＥ．ｃｏｌｉ中でαアミラーゼを発現させることなく突然変異を導入し、次いでαアミラーゼがＢａｃｉｌｌｕｓ中で活性であるような方法で修飾することができる。ベクターは次のように構築された。すなわち、ＪＥ１をコードする遺伝子（Ｄ１８３〜Ｇ１８４の欠失をもつＳＰ７２２）を、Ｅ．ｃｏｌｉ複製開始点を含有する１．２ｋｂ断片によるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４ ： ＳＰ７２２の５′コード化領域中のＰｓｔＩ部位での遺伝子切断によってｐＪＥ１中で不活性化した。この断片をフォワードプライマー：５′−ｇａｃｃｔｇｃａｇｔｃａｇｇｃａａｃｔａ−３′およびリバースプライマー：５′−ｔａｇａｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇｃａｔ−３′を用いてｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃： Ｘ０２５１４）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲアンプリコンおよびｐＪＥ１ベクターをＰｓｔＩで３７℃で２時間消化した。ｐＪＥ１ベクター断片およびＰＣＲ断片を室温で１時間連結反応させ、Ｅ．ｃｏｌｉ中で電気形質転換法により形質転換した。得られたベクターをｐＤｏｒＫ１０１と呼ぶ。
【０１６９】
フィルタースクリーニング検定：
この検定は、親酵素と比べて高ｐＨで安定性の改良されたターマミル様αアミラーゼ変異体、およびスクリーニング温度の設定次第では親酵素と比べて高ｐＨかつ中位の温度で安定性の改良されたターマミル様αアミラーゼ変異体のスクリーニングに用いることができる。
【０１７０】
高ｐＨフィルター検定：
Ｂａｃｉｌｌｕｓライブラリーを、ＴＹ寒天プレート上の酢酸セルロース（ＯＥ ６７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とニトロセルロースフィルター（Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のサンドイッチ上で、カナマイシン １０μｇ／ｍｌとともに３７℃で少なくとも２１時間培養する。酢酸セルロース層はＴＹ寒天プレート上に配置される。
【０１７１】
各フィルターのサンドイッチにはフィルター上の陽性変異体の位置を突きとめるために培養後、インキュベーション前に針で特定の標識を付け、結合した変異体を含むニトロセルロースフィルターをグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６〜１０．６）を含む容器に移し、室温（１０〜６０℃まで変えることができる）で１５分間インキュベートする。コロニーを含む酢酸セルロースフィルターは、使用するまでＴＹプレート上に室温で保管される。インキュベーション後、グリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６〜１０．６）中にアガロース１％、デンプン０．２％を含むプレート上で残留活性を検出する。ニトロセルロースフィルターを備えた検定プレートをフィルターサンドイッチと同じ方法で標識し、室温で２時間インキュベートする。フィルターを除去した後、検定プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプンを分解する変異体は、紺青色の背景上に白い斑点として検出され、次いで保存プレート上で同定される。陽性変異体を最初のスクリーニングと同じ条件で２回再スクリーニングする。
【０１７２】
低カルシウム検定：
Ｂａｃｉｌｌｕｓライブラリーを、ＴＹ寒天プレート上の酢酸セルロース（ＯＥ ６７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とニトロセルロースフィルター（Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のサンドイッチ上で、関連性のある抗生物質、例えばカナマイシンまたはクロラムフェニコールとともに３７℃で少なくとも２１時間培養する。酢酸セルロース層はＴＹ寒天プレート上に配置される。
【０１７３】
各フィルターのサンドイッチにはフィルター上の陽性変異体の位置を突きとめるために培養後、インキュベーション前に針で特定の標識を付け、結合した変異体を含むニトロセルロースフィルターを炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．５〜１０）を含み、さまざまなＥＤＴＡ濃度（０．００１〜１００ｍＭ）を有する容器に移す。フィルターを室温で１時間インキュベートする。コロニーを含む酢酸セルロースフィルターは、使用するまでＴＹプレート上に室温で保管される。インキュベーション後、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．５〜１０）中にアガロース１％、デンプン０．２％を含有するプレート上で残留活性を検出する。ニトロセルロースフィルターを備えた検定プレートをフィルターサンドイッチと同じ方法で標識し、室温で２時間インキュベートする。フィルターを除去した後、検定プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプンを分解する変異体は、紺青色の背景上に白い斑点として検出され、次いで保存プレート上で同定される。陽性変異体を最初のスクリーニングと同じ条件で２回再スクリーニングする。
【０１７４】
考察の対象となっている領域を得る方法：
細菌性αアミラーゼには３つのよく知られた３Ｄ構造がある。その２つはＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓαアミラーゼ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ｄａｔａｂａｓｅ １ＢＰＬ（Ｍａｃｈｉｕｓ等の論文、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４６， ｐ．５４５￣５５９ （１９９５））および１ＶＪＳ（Ｓｏｎｇ等の著書、Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ １６３ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖ １２ （１９９６）））である。これらの２つの構造は、２個のカルシウムイオンと１個のナトリウムイオンの結合部位周辺の領域で、いわゆるＢドメインから構造の重要な一片を欠いている。したがって本発明者等は、ＢＡＮ（商標）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）とＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓαアミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）の間の雑種であるαアミラーゼＢＡ２（国際特許公開第９６／２３８７４号）の３Ｄ構造を用いた。この構造に基づいてＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓαアミラーゼおよびＳＰ７２２αアミラーゼのモデルを組み立てた。
【０１７５】
αアミラーゼ変異体の発酵および精製：
発酵および精製は、当業界でよく知られいる方法によって行なうことができる。
【０１７６】
安定性の決定：
すべての安定性試験は、同一の装置を用いて行なう。方法は下記のとおりである。酵素を関連する条件（１〜４）下でインキュベートする。試料をさまざまな時点で、例えば０、５、１０、１５、および３０分後に採取し、検定緩衝液（５０ｍＭブリトン緩衝液０．１ｍｌ、ｐＨ７．３）中で２５倍に希釈（採取したすべての試料について同じ希釈）し、ｐＨ７．３、３７℃の標準条件下でＰｈａｄｅｂａｓ検定法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて活性を測定する。
【０１７７】
インキュベーションの前（０分）に測定した活性を基準（１００％）として使用する。低下％をインキュベーション時間の関数として計算する。表は、インキュベーションの例えば３０分後の残留活性を示いている。
【０１７８】
比活性の決定：
比活性は、Ｐｈａｄｅｂａｓ検定法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて酵素１ｍｇ当たりの活性として決定される。製造業者の指示は下記のとおりである（また、下記の「αアミラーゼ活性の検定」も参照されたい）。
【０１７９】
溶解度の決定Ｉ：
精製した酵素を選択された緩衝液に対して夜通し透析する。標準条件は、０．０２ＭトリスＨＣｌおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、室温である。ミリポア限外濾過膜、ＹＭ１０、ＮＭＷＬ：１０，０００を用いて酵素約４０ｍｇを含有する配合物をアミコンセル上で濃縮する。酵素の濃縮に続いて、そのプロセスの前およびその間Ａ２８０を測定する。沈殿が起こり始めたら濃縮のステップを停止する。沈殿物が実際にアミラーゼであることを確かめるために上澄み中の活性の測定を行なう。次いで緩衝液を加えることによって室温で沈殿物を再度溶解し、タンパク質濃度を測定する。
【０１８０】
溶解度の決定ＩＩ：
精製した酵素を再度、選択された緩衝液に対して夜通し透析する。標準条件は、０．０１Ｍホウ酸、０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．００２Ｍ ＣａＣｌ２、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５である。ミリポア限外濾過膜、ＹＭ１０、ＮＭＷＬ：１０，０００を用いて酵素約４０ｍｇを含有する配合物をアミコンセル上で濃縮する。酵素の濃縮に続いて、そのプロセスの前およびその間Ａ２８０を測定する。沈殿が起こり始めたら濃縮のステップを停止する。沈殿物が実際にアミラーゼであることを確かめるために上澄み中の活性の測定を行なう。次いで緩衝液を加えることによって室温で沈殿物を再度溶解し、タンパク質濃度を測定する。
【０１８１】
αアミラーゼ活性の検定法：
１．Ｐｈａｄｅｂａｓ検定法
αアミラーゼ活性は、基質としてＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）錠剤を使用する方法によって決定される。Ｐｈａｄｅｂａｓ錠剤（Ｐｈａｄｅｂａｓ（登録商標）アミラーゼ試験、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃにより提供される）は、架橋した不溶性の青色デンプンポリマーを含有しており、ウシ血清アルブミンおよび緩衝物質と混合して錠剤にしたものである。
【０１８２】
一測定ごとに１個の錠剤を、５０ｍＭブリトン−ロビンソン緩衝液５ ｍｌ （５０ｍＭ酢酸、５０ｍＭリン酸、５０ｍＭホウ酸、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨはＮａＯＨで検討の対象となっている値に調整）を含む管中で懸濁させる。試験は水浴中で検討の対象となっている温度で行なう。試験されるαアミラーゼは５０ｍＭブリトン−ロビンソン緩衝液ｘ ｍｌ中で希釈する。このαアミラーゼ溶液１ ｍｌを５０ｍＭブリトン−ロビンソン５ ｍｌに加える。デンプンを、可溶性の青色断片を生ずるαアミラーゼによって加水分解する。６２０ｎｍで分光光度的に測定される得られた青色溶液の吸光度は、６２０ｎｍで分光光度的に測定され、αアミラーゼ活性の関数である。
【０１８３】
１０または１５分間のインキュベーション（試験時間）後の測定された６２０ｎｍ吸光度が、６２０ｎｍで吸光度単位０．２〜２．０の範囲にあることが重要である。この吸光度の範囲で活性と吸光度の間には線形性がある（ランバート−ベールの法則）。したがって酵素の希釈は、この基準に合致するように調整されなければならない。特定の一組の条件（温度、ｐＨ、反応時間、緩衝液の条件）下で所与のαアミラーゼ１ ｍｇは、一定量の基質を加水分解し、青色を生ずることになる。色の強度は６２０ｎｍで測定する。測定された吸光度は、所与の一組の条件下での検討対象になっているαアミラーゼの比活性（純粋なαアミラーゼタンパク質１ ｍｇ当たりの活性）に正比例する。
【０１８４】
２．他の選択可能な方法
αアミラーゼ活性は、ＰＮＰ−Ｇ７基質を使用する方法によって決定される。ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−マルトヘプタオシドの省略形であるＰＮＰ−Ｇ７は、エンド−アミラーゼによって切断することができるブロック化したオリゴ糖である。切断に続いてキット中に含まれるαグルコシダーゼが基質を消化して自由なＰＮＰ分子を遊離し、それは黄色を有し、したがってλ＝４０５ｎｍ（４００￣４２０ｎｍ）で可視分光測定によって測定することができる。ＰＮＰ−Ｇ７基質およびαグルコシダーゼを含有するキットは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍによって製造されている（カタログ番号１０５４６３５）。
【０１８５】
基質を調製するには、基質（ＢＭ １４４２３０９）１瓶を緩衝液（ＢＭ １４４２３０９）５ ｍｌに加える。αグルコシダーゼを調製するには、αグルコシダーゼ（ＢＭ １４６２３０９）１瓶を緩衝液（ＢＭ １４４２３０９）４５ ｍｌに加える。作業用溶液は、αグルコシダーゼ溶液５ ｍｌを基質０．５ ｍｌと混合することによって作成する。
【０１８６】
検定は、酵素溶液２０μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移し、２５℃でインキュベートすることによって行なわれる。作業用溶液２００μｌを２５℃で加える。その溶液を混合し、１分間予備インキュベートし、吸収を３分間にわたって１５秒ごとにＯＤ ４０５ｎｍで測定する。
【０１８７】
この時間依存性吸収曲線の傾斜は、所与の一組の条件下における検討対象になっているαアミラーゼの比活性（酵素１ ｍｇ当たりの活性）に正比例する。
【０１８８】
ＤＯＰＥプログラムを用いたランダム突然変異誘発の一般的な方法：
ランダム突然変異誘発は下記のように行なうことができる。
１．親酵素中の修飾のために考察の対象となる領域を選択する。
２．選択された領域の突然変異部位と非突然変異部位を決める。
３．例えば、構築される変異体の所望の安定性および／または性能に関してどのような種類の突然変異を行なうべきかを決める。
４．構造的に妥当な突然変異を選択する。
５．ステップ３により選択された残基をステップ４に関して調整する。
６．ヌクレオチド分布を適切なドープ・アルゴリズムを使用して解析する。
７．必要ならば、求める残基を遺伝コードの現実に合わせる（例えば終止コドンの導入を避けるために、例えば遺伝コードに起因する制約を考慮にいれる）（幾つかのコドンの組合せは実際には使用できず、適応させる必要があることを当業者ならば気が付くはずである）。
８．プライマーを作成する。
９．プライマーを使用してランダム突然変異誘発を行なう。
１０．得られたαアミラーゼ変異体を所望の改良された特性に関してスクリーニングによって選択する。
【０１８９】
ステップ６で使用する好適なドープ・アルゴリズムは、当業界でよく知られている。一つのアルゴリズムが、Ｔｏｍａｎｄｌ， Ｄ． 等の論文、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ， １１ （１９９７）， ｐｐ．２９￣３８に記載されている。別のアルゴリズム、ＤＯＰＥを下記に記述する。
【０１９０】
ドープ・プログラム：
「ＤＯＰＥ」プログラムは、求めるアミノ酸分布に最も似たアミノ酸分布をコードするようなやり方でコドン三重項のヌクレオチド組成を最適化するのに有用なコンピュータアルゴリズムである。実現可能な分布のどれが求めるアミノ酸分布に最も似ているかを評価するには、スコアリング関数が必要である。「ＤＯＰＥ」プログラムには下記の関数がふさわしいことが分かった。
【数１】
上式でｘｉ′は、プログラムによって計算されるアミノ酸の得られる量およびアミノ酸基であり、ｙｉ′は、プログラムのユーザーによって規定される、アミノ酸の求める量およびアミノ酸基である（例えば２０個のアミノ酸または停止コドンのどれを、例えば或る割合で（例えばＡｌａ ９０％、Ｉｌｅ ３％、Ｖａｌ ７％）導入したいかを指定する）。またｗｉ′は、プログラムのユーザーによって規定される重み付け係数である（例えば、特定のアミノ酸残基を考察の対象の位置に挿入することの重要性に左右される）。Ｎは、プログラムのユーザーによって規定される、２１プラスアミノ酸基の数である。この関数０ｏについては１と規定される。
【０１９２】
モンテカルロアルゴリズム（一例は「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ， Ｐａｒｔ Ａ」Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｂ． Ｊ． Ｂｅｒｎｅ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｐｌｅｎｕｍ （１９７７） 中のＶａｌｌｅａｕ， Ｊ． Ｐ．およびＷｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ， Ｓ． Ｇ．の記述；Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｔ Ｃａｒｌｏ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ： １ Ｈｉｇｈｗａｙｓに記載のものである）は、この関数の最大値を見つけるために用いられる。各繰り返しにおいて下記のステップが行なわれる。
【０１９３】
１．各ベースには新しいランダムヌクレオチド組成が選択され、現在の組成と新しい組成の間の絶対差はコドンのすべての３つの位置で４個のヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの各々についてｄ以下である（ｄの定義については下記を参照）。
【０１９４】
２．現在の組成および新しい組成のスコアは、前述のように関数ｓを用いて比較される。もし新しいスコアが現在の組成のスコア以上ならば、新しい組成が保存され、現在の組成は新しい組成に代えられる。もし新しいスコアがそれより小さいならば、新しい組成を保存する確率は、ｅｘｐ （１０００ （ｎｅｗ ｓｃｏｒｅ − ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｃｏｒｅ））である。
【０１９５】
１サイクルは前述のとおり通常１０００回の繰り返しからなり、ｄは１から０まで直線的に減少する。最適化プロセスでは１００サイクル以上を行なう。最高スコアで得られるヌクレオチド組成が最終的に与えられる。
【０１９６】
実施例
実施例１．
改変された特性を有するＳＰ７２２αアミラーゼ変異体を識別するための重要な領域およびアミノ酸残基を引き出す方法：
【０１９７】
ＳＰ７２２αアミラーゼの三次構造はＵＮＩＸコンピュータステーションの実行用インサイト上に表示し、すべての水素および水分子は削除された。この最小化したαアミラーゼ構造について、ｐｄｂ構造ファイル（添付資料１）で決定された結晶パラメータおよび空間群に従ってすべての対称性に関係のあるアミラーゼ分子が表示された。母親のαアミラーゼ中の各原子から対称性に関係のあるアミラーゼ構造中の任意の原子までの距離を計算するために小規模のコンピュータプログラムが作成された。それぞれ３．５Åと６．０Åに距離制限を設定すると、下記のリストの結果となった。
【０１９８】
最も近い隣りのアミラーゼ分子から６．０Å未満に存在するアミノ酸残基は、ＳＰ７２２ アミラーゼのモデル構造中で識別される下記の位置である。
【０１９９】
【表１７】
最も近い隣りのアミラーゼ分子から３．５Å未満に存在するアミノ酸残基は、ＳＰ７２２ アミラーゼのモデル構造中で識別される下記の位置である。
【０２０１】
【表１８】
実施例２．
改変された特性を有するＳＰ７２２αアミラーゼ変異体を識別するための重要な領域およびアミノ酸残基を引き出す別の方法：
ＳＰ７２２αアミラーゼの三次構造はＵＮＩＸコンピュータステーションの実行用インサイト上に表示し、すべての水素および水分子は削除された。この最小化したαアミラーゼ構造をＷＨＡＴ ＩＦソフトウェア（Ｇ． Ｖｒｉｅｎｄの論文、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈ．， ８， ５２￣５６ （１９９０））中にインポート（「ｇｅｔｍｏｌ」）し、６Å以内のすべての対称性に関係のあるアミラーゼ分子をスープ（「ｓｙｍｔｒｙ」、「ｓｙｍｓｐｇ」、「ｓｙｍｐａｒ ６」、「ｓｏｕｓｈｌ」、「ｓｏｕｐ」）に加えた。対称分子を含むＳＰ７２２用の新しい座標ファイルが書き込まれた（ｍａｋｍｏｌ， ｔｏｔ ０）。次いで中心のＳＰ７２２アミラーゼを構造ファイルから削除し、周囲の分子を含む新しいファイルを書き込んだ。母体αアミラーゼ（水分子および水素原子のない元のＳＰ７２２構造ファイル）中の各原子から対称性に関係のあるアミラーゼファイル中の任意の原子までの距離を計算するために小規模のコンピュータプログラムが作成された。それぞれ３．５Åと６．０Åに距離制限を設定すると、説明で参照した位置が確認された。
【０２０３】
Ｗｈａｔ Ｉｆ コマンド：
＞＞Ｗｈａｔｉｆ＜＜；ＷＨＡＴ ＩＦをスタートさせる
＞＞Ｇｅｔｍｏｌ ｓｐ７２２ ＨＯＨ．ｐｄｂ＜＜；水およびＨを削除したＳＰ７２２構造ファイルをＷＨＡＴ ＩＦソフトウェア中にインポートする
＞＞ｓｙｍｔｒｙ＜＜；対称メニューに進む
＞＞ｓｙｍｓｐｇ＜＜；構造ファイル中の対称性に関係のある情報を読み取る
＞＞ｓｙｍｐａｒ ６＜＜；６Åの距離以内に対称性に関係のある残基を組み立てる
＞＞ｓｏｕｓｈｌ＜＜；対称分子をスープに加える
＞＞ｓｏｕｐ＜＜；スープメニューに進む
＞＞ ｍａｋｍｏｌ，”ＳＰ７２２ ｗｉ６．ｐｄｂ， ｔｏｔ ０”＜＜は、スープ中のすべての原子（ＳＰ７２２および６Å以内の対称分子）を含む「ＳＰ７２２ ｗｉ６」ｐｄｂファイルを書き込む。
【０２０４】
実施例３．
ＳＰ７２２三次構造からＡＡ５６０を相同関係により組み立てること：
前述のようにＡＡ５６０αアミラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のＳＰ７２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）に対する全体的な相同性は約８７％である。ＡＡ５６０ とＳＰ７２２の配列のアラインメントの結果、そこに挿入または欠失が何もないことを示され、これはまた図１にも見ることができる。ＡＡ５６０αアミラーゼの三次構造は、「材料および方法」の項に記載した方法「モデルの組立て」を用いて添付資料１に開示した構造上にモデルを組み立てた。
【０２０５】
ＳＰ７２２の構造は、ＵＮＩＸワークステーションの実行用インサイトおよびＢＩＯＳＹＭ、ＭＳＩから得たホモロジーソフトウェア上に表示した。アミノ酸配列をアライニングし、同調したＳＰ７２２をＡＡ５６０アミノ酸に割り当てた。ＳＰ７２２構造中に見つからないＡＡ５６０中の最初の４個のアミノ酸の座標は、「ＥＮＤ ＲＥＰＡＩＲ」関数によって割り当てた。ＡＡ５６０モデルは、「ＲＥＬＡＸ」コマンドを用いて始めにアミノ酸の側鎖を緩和させ、次いで分子動力学を実行して３Ｄモデルのエネルギーをできるだけ小さくすることによって精巧なものにした。Ｉｎｓｉｇｈｔ ９５、ＭＳＩのデフォルトパラメータは、両者の緩和分子動力学について選択された。最後に、空間群と単位格子の寸法が、ＳＰ７２２ ｐｄｂからＡＡ５６０モデルのファイルにコピーされる。
【０２０６】
実施例４．
改変された特性を有するＡＡ５６０αアミラーゼ変異体を識別するための重要な領域を引き出す方法：
【０２０７】
モデルとして組み立てられたＡＡ５６０の構造について実施例１のＳＰ７２２と同じ計算を行なった。２つのαアミラーゼの相同性が約８７％もの高い同一性であるために、ＡＡ５６０の結晶の相互作用はＳＰ７２２と同様であって、ＡＡ５６０はＳＰ７２２と同じ空間群中で、かつ同様の単一の細胞パラメータで結晶化すると予想される。
【０２０８】
ＡＡ５６０αアミラーゼの三次構造はＵＮＩＸコンピュータステーションの実行用インサイト上に表示し、すべての水素および水分子は削除された。この最小化されたαアミラーゼ構造に関して、ＳＰ７２２の結晶パラメータおよび空間群（添付資料１）に従ってすべての対称性に関係のあるアミラーゼ分子が表示された。「母親」αアミラーゼ中の各原子から対称性に関係のあるアミラーゼ構造中の任意の原子までの距離を計算するために小規模のコンピュータプログラムが作成された。それぞれ３．５Åと６．０Åに距離制限を設定すると、下記のリストの結果となった。
【０２０９】
最も近い隣りのアミラーゼ分子から６．０Å未満に存在するアミノ酸残基は、ＡＡ５６０ アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０２１０】
【表１９】
直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満に存在するアミノ酸残基は、ＡＡ５６０ アミラーゼのモデル構造中に識別される下記の位置である。
【０２１２】
【表２０】
実施例５．
局部ランダムドーピング突然変異誘発による、親酵素と比べて高い溶解度を有するＡＡ５６０αアミラーゼ変異体の構築：
【０２１４】
ＡＡ５６０αアミラーゼの溶解度を増加させるために、下記に記述するように予め選択した領域でランダム突然変異誘発を行なった。
【０２１５】
領域；残基
ＳＡＩ；Ｒ１８１〜Ｗ１８９
ＤＯＰＥソフトウェア（「材料と方法」参照）を用いて、停止コドンの量をできるだけ少なくするＳＡＩ領域の提案された各変化に対するスパイク性コドンを決定した（表１参照）。提案されたアミノ酸変化の集団を得るためにヌクレオチドの正確な分布をコドンの３つの位置で計算した。所望の残基を得る大きなチャンスがあるように、しかしさらに他の可能性も与えるようにド−プ領域は指示された位置で特定してドープされた。
【０２１６】
【表２１】
得られたドープされたオリゴヌクレオチド鎖は、野生型ヌクレオチド、アミノ酸配列、およびドープされた各位置のヌクレオチド分布と一緒にセンス鎖として表２に示す。
【０２１８】
【表２２】
ランダム突然変異誘発：
表２から明らかなスパイク性オリゴヌクレオチド（一般用語ではＦＳＡと呼ばれる）、ＳＡ１領域のリバースプライマーＲＳＡ、およびＳａｃＩＩ とＤｒａＩＩＩ 部位を有効範囲とする特異的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２： ＡＡ５６０プライマーは、２１塩基対の重複を有する、重なり伸長法（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｈｏｒｔｏｎ等の論文、Ｇｅｎｅ， ７７ （１９８９）， ｐｐ．６１〜６８）によるＰＣＲライブラリー断片を生むために使用される。プラスミドｐＪＥ１はポリメラーゼ連鎖反応用の鋳型である。ＰＣＲ断片は、Ｅ． ｃｏｌｉ ／ Ｂａｃｉｌｌｕｓ のシャトルベクターｐＤｏｒｋ１０１（「材料と方法」の項参照）中でクローン化され、Ｅ． ｃｏｌｉ 中のアミラーゼの致死的蓄積を防ぐＥ． ｃｏｌｉ中の突然変異誘発およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中の速やかな発現を可能にする。クローン化されたＰＣＲ断片をＥ． ｃｏｌｉ 中に樹立した後、修飾されたｐＵＣ１９断片をプラスミドおよびプロモーターの中から消化して除き、突然変異したターマミル遺伝子を物理的に結合させ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中で発現を起こすことができる。
【０２２０】
スクリーニング：
ライブラリーは、上記の「材料および方法」に記載した低カルシウムフィルター検定でスクリーニングすることができる。
【０２２１】
実施例６．
ＡＡ５６０ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の変異体の構築：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示したＡＡ５６０αアミラーゼをコードする遺伝子は、プラスミドｐＴＶＢ２２３中に位置付けられる。そのアミラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のこの構築物中でａｍｙＬプロモーターから発現する。
【０２２２】
ＤＥＬＴＡ（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）突然変異を有する本発明の変異体は、ＳａｒｋａｒおよびＳｏｍｍｅｒの論文、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ８： ４０４〜４０７ （１９９０） に記載のようにメガプライマーによって構築された。
【０２２３】
遺伝子特異的プライマーＢ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）および突然変異誘発プライマー１０１４５８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＡＡ５６０をコードするｐＴＶＢ２２３プラスミドからＰＣＲによって約６４５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するために用いられた。
【０２２４】
６４５ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製し、同じ鋳型上で行なわれる二回目のＰＣＲでプライマーＹ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）と一緒にメガプライマーとして用いた。
【０２２５】
得られた約１０８０ｂｐの断片を制限酵素ＢｓｔＥＩＩおよびＡｆｌＩＩＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＴＶＢ２２３プラスミドと連結反応させた。感応性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＡ２７３（低アミラーゼおよびプロテアーゼ）細胞を連結反応で形質転換し、クロラムフェニコール耐性形質転換細胞をＤＮＡ配列決定でチェックしてプラスミド上に正しい突然変異が存在していることを確かめた。
【０２２６】
【表２３】
得られたＤＥＬＴＡ（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）＋Ｎ１９５Ｆを有するＡＡ５６０アミラーゼをコードするプラスミドはｐＴＶＢ２３２と命名した。
【０２２８】
本発明のその他の変異体の構築は同様の方法で行なわれた。
実施例７．
ＡＡ５６０およびＳＰ７２２変異体の溶解度の決定：
ＡＡ５６０変異体は上記のように構築した。溶解度は「材料および方法」の項で、溶解度の決定Ｉとして記述したように決定された。
【０２２９】
【表２４】
濃縮ステップは、タンパク質の量４０ｍｇで開始され、一般に５０％のアミラーゼがプロセス中に失われた。このタンパク質の損失はプロセスの初期段階ですべての酵素について起こり、酵素の完全な回復は体積がきわめて限定されるようになる終了段階で得られた。酵素の損失は膜への吸着による。
【０２３１】
実施例８．
ＡＡ５６０変異体の溶解度の決定：
ＡＡ５６０変異体は、鋳型として野生型ＡＡ５６０を用いて上記のように構築した。溶解度は「材料および方法」の項で、溶解度の決定ＩＩとして記述したように決定された。
【０２３２】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【表５５】
【表５６】
【表５７】
【表５８】
【表５９】
【表６０】
【表６１】
【表６２】
【表６３】
【表６４】
【表６５】
【表６６】
【表６７】
【表６８】
【表６９】
【表７０】
【表７１】
【表７２】
【表７３】
【表７４】
【表７５】
【表７６】
【表７７】
【表７８】
【表７９】
【表８０】
【表８１】
【表８２】
【図面の簡単な説明】
【図１】
５種類の親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す図であり、一番左の番号は下記のようにそれぞれのアミノ酸配列を示す。
１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＳＰ７２２）
２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＳＰ６９０）
３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＢＡＮ）
４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＢＬＡ）
５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＢＳＧ）
【図２】
各々の分子が８つの相互作用する帯域を有する、４個の酵素分子の単位格子の側面図である。
【図３】
４個の酵素分子の単位格子の上面図である。
Claims (49)
- Ｒ２８、Ｒ１１８、Ｎ１７４；Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｄ１８３、Ｇ１８４、Ｇ１８６、Ｗ１８９、Ｎ１９５、Ｍ２０２、Ｙ２９８、Ｎ２９９、Ｋ３０２、Ｓ３０３、Ｎ３０６、Ｒ３１０、Ｎ３１４；Ｒ３２０、Ｈ３２４、Ｅ３４５、Ｙ３９６、Ｒ４００、Ｗ４３９、Ｒ４４４、Ｎ４４５、Ｋ４４６、Ｑ４４９、Ｒ４５８、Ｎ４７１、Ｎ４８４の群から選択される１または複数の位置に変化を含む親ターマミル様αアミラーゼの変異体であって、
（ａ）その変化が独立に、
（ｉ）その位置を占めるアミノ酸の下流に向ってアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占めるアミノ酸の欠失、または
（ｉｉｉ）異なるアミノ酸によるその位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）その変異体がアミラーゼ活性を有し、かつ
（ｃ）各位置がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２で表されるＡＡ５６０のアミノ酸配列を有する親ターマミル様αアミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する、変異体。 - 変異体が、ＤｅｌｔａＧ１８４；Ｄｅｌｔａ（Ｒ１８１〜Ｇ１８２）；Ｄｅｌｔａ（Ｄ１８３〜Ｇ１８４）；Ｒ２８Ｎ、Ｋ；Ｓ９４Ｋ；Ｒ１１８Ｋ；Ｎ１２５Ａ、Ｒ、Ｋ；Ｎ１７４Ｄ；Ｒ１８１Ｑ、Ｅ、Ｋ；Ｇ１８６Ｒ；Ｗ１８９Ｒ、Ｋ；Ｎ１９５Ｆ；Ｍ２０２Ｌ；Ｙ２９８Ｈ、Ｆ；Ｎ２９９Ａ；Ｋ３０２Ｒ；Ｓ３０３Ｑ；Ｎ３０６Ｇ、Ｄ、Ｒ、Ｋ；Ｒ３１０Ａ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｄ、Ｎ；Ｎ３１４Ｄ；Ｒ３２０Ｋ；Ｈ３２４Ｋ；Ｅ３４５Ｒ、Ｄ、Ｋ、Ｎ；Ｙ３９６Ｆ；Ｒ４００Ｔ、Ｋ；Ｗ４３９Ｒ；Ｒ４４４Ｋ；Ｎ４４５Ｋ、Ｑ；Ｋ４４６Ｎ；Ｑ４４９Ｅ；Ｒ４５８Ｋ；Ｎ４７１Ｅ；Ｎ４８４Ｑの１または複数の突然変異を有する、請求項１に記載の変異体。
- 変異体がさらにＭ２０２における突然変異、特にＭ２０２Ｌ、Ｔを含む、請求項１〜２に記載の変異体。
- 変異体がさらにＮ１９５における突然変異、特にＮ１９５Ｆを含む、請求項１〜３に記載の変異体。
- 変異体がさらにＧ１８６における突然変異、特にＧ１８６Ｒを含む、請求項１〜４に記載の変異体。
- 変異体がさらにＲ１８１における突然変異、特にＲ１８１Ｑを含む、請求項１〜５に記載の変異体。
- 親ターマミル様αアミラーゼが、バチルス・リシェニフォルキス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のＮＣＩＢ １２２８９、ＮＣＩＢ １２５１２、ＮＣＩＢ １２５１３、もしくはＤＳＭ ９３７５、またはＤＳＭＺ ｎｏ．１２６４９、ＫＳＭ ＡＰ１３７８、またはＫＳＭ Ｋ３６もしくはＫＳＭ Ｋ３８の株から誘導される、請求項１〜６のいずれかに記載の変異体。
- 親ターマミル様αアミラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、および１３で表される群から選択されるαアミラーゼのいずれかである、請求項１〜７に記載の変異体。
- 親ターマミル様αアミラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４との同一性の度合いが少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９７％、一層好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の変異体。
- 親ターマミル様αアミラーゼが、低、好ましくは中、好ましくは高ストリンジェンシー条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、請求項１〜９のいずれかに記載の変異体。
- 変異体が、特に洗濯、皿洗い、および硬い表面のクリーニング条件下で改変された溶解度、好ましくは高い溶解度を有する、請求項１〜１０に記載の変異体。
- 請求項１〜１１のいずれ一項によるαアミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
- 請求項１２によるＤＮＡ構築物を担持する組換え発現ベクター。
- 請求項９記載のＤＮＡ構築物または請求項１０記載のベクターで形質転換された細胞。
- 微生物、好ましくは細菌または真菌、具体的にはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、またはバチルス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）などのグラム陽性細菌である、請求項１４に記載の細胞。
- 請求項１〜１１のαアミラーゼ変異体を含む組成物。
- 任意的に非粉塵性の顆粒、安定化した液体、または保護化した酵素の形態の請求項１〜１１のいずれか一項によるαアミラーゼ変異体を含む洗剤添加物。
- 添加物１ｇ当たり酵素タンパク質０．０２〜２００ｍｇを含有する、請求項１７に記載の洗剤添加物。
- プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、アミラーゼなどの別の酵素、あるいはグルコアミラーゼおよび／またはセルラーゼなどの別のデンプン加水分解酵素（ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を追加して含む、請求項１７に記載の洗剤添加物。
- 請求項１〜１１のいずれかに記載のαアミラーゼ変異体を含む洗剤添加物。
- プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、別のデンプン加水分解酵素、および／またはセルラーゼなど、別の酵素を追加して含む、請求項２０に記載の洗剤組成物。
- 請求項１〜１１のいずれかに記載のαアミラーゼ変異体を含む手動または自動皿洗い用の洗剤組成物。
- プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、アミラーゼなどの別の酵素、あるいはグルコアミラーゼおよび／またはセルラーゼなどの別のデンプン加水分解酵素を追加して含む、請求項２２に記載の皿洗い用の洗剤組成物。
- 請求項１〜１１のいずれかに記載のαアミラーゼ変異体を含む手動または自動洗濯用組成物。
- プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、アミラーゼなどの別の酵素、および／またはグルコアミラーゼおよび／またはセルラーゼなどの別のデンプン加水分解酵素を追加して含む、請求項２４に記載の洗濯用組成物。
- 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のαアミラーゼ変異体または請求項１６〜２５に記載の組成物を洗濯および／または皿洗いに使用すること。
- 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のαアミラーゼ変異体または請求項１６〜２５に記載の組成物の繊維の糊抜きへの使用。
- 請求項１〜１１のいずれかに記載のαアミラーゼ変異体または請求項１６〜２５に記載の組成物のデンプンの液化への使用。
- 親αアミラーゼがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、または１３の配列を有するか、あるいは前記配列と少なくとも６０％同一の配列を有する、親と比べて改変された特性を持った親αアミラーゼの変異体を生産する方法であって、前記方法が、
（ａ）親αアミラーゼの三次元構造を造るために添付資料１に表されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の三次元構造に基づき親αアミラーゼをモデル化するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた三次元構造において、その構造の一部分の変化が前記改変された特性をもたらすと予想される、親の構造の少なくとも一部分を識別するステップと、
（ｃ）親αアミラーゼをコードする核酸の配列を修飾して、前記構造の一部分に対応する位置において１または複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換をコードする核酸を生成するステップと、
（ｄ）修飾された核酸を宿主細胞中で発現させて、αアミラーゼ酵素活性を有し、かつ親と比べて少なくとも１つの改変された特性を有する変異体αアミラーゼを産生するステップ、とを含む方法。 - 改変された特性が、基質特異性、基質結合、基質切断パターン、温度安定性、酵素活性のｐＨ依存、安定性のｐＨ依存、酸化に対する安定性、Ｃａ２＋依存性、比活性、または改変された溶解度、好ましくは高い溶解度からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
- 親αアミラーゼがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、もしくは１３の配列を有するか、または前記配列と少なくとも６０％同一の配列を有する、親と比べて改変された特性を持った親αアミラーゼの変異体を生産する方法であって、前記方法が
（ａ）親αアミラーゼの三次元構造を造るために添付資料１に表されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の三次元構造に基づき親αアミラーゼをモデル化するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた三次元構造を、前記特性が親αアミラーゼと異なった関連のないαアミラーゼの三次元構造と比較するステップと、
（ｃ）その関連のないαアミラーゼの三次元構造とは異なり、かつ前記特性と関連性があると予想されるステップ（ａ）で得られた三次元構造の構造の一部分を識別するステップと、
（ｄ）親αアミラーゼをコードする核酸の配列を修飾して、前記構造の一部分に対応する位置で１または複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換をコードする核酸を生成するステップと、
（ｅ）修飾された核酸を宿主細胞中で発現させて、αアミラーゼ活性を有し、かつ親と比べて１または複数の改変された特性を有する変異体αアミラーゼを産生するステップ、とを含む方法。 - ステップ（ｄ）において、変異体の構造の一部分が関連のないαアミラーゼの構造の一部分と対応するように、前記修飾が親αアミラーゼ中の１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、または挿入である、請求項３１に記載の方法。
- ポリペプチドの結晶、特に酵素の結晶の溶解度を増大させる方法であって、
１）三次結晶構造中の隣りの酵素分子の６．０Å以内の距離に位置し、かつ
２）前記隣りの酵素分子と相互作用する、
１または複数のアミノ酸残基を突然変異させる、方法。 - 突然変異されるアミノ酸残基が隣りの酵素分子の３．５Åに位置する、請求項３３に記載の方法。
- 酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、マンナナーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、グルコアミラーゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼの活性を有する、請求項３３または３４に記載の方法。
- アミラーゼがターマミル様αアミラーゼなどのαアミラーゼである、請求項３２に記載の方法。
- ポリペプチドが生物活性を有するタンパク質である、請求項３３〜３６に記載の方法。
- ポリペプチドが抗微生物活性を有する、請求項３３〜３７記載の方法。
- ポリペプチドが、インスリン、成長ホルモン、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子を含む群から選択される、請求項３３〜３８記載の方法。
- ターマミル様αアミラーゼの結晶の溶解度を増加させる方法であって、
１）三次結晶構造中の隣りのターマミル様αアミラーゼ分子の６．０Å以内の距離に位置し、かつ
２）前記隣りのターマミル様αアミラーゼ分子と相互作用する、
１または複数のアミノ酸残基を突然変異させる、方法。 - 突然変異されるアミノ酸残基が隣り合うターマミル様αアミラーゼ分子の３．５Åに位置する、請求項４０に記載の方法。
- 添付資料１に表されているＳＰ７２２の結晶構造が、隣り合うαアミラーゼの間の距離を決定するための基準として用いられる、請求項４０または４１に記載の方法。
- 添付資料１に表されているＳＰ７２２の構造から請求項２６〜２９のいずれかに従ってモデル化される構造である結晶構造が、隣り合うαアミラーゼの間の距離を決定するための基準として用いられる、請求項４０〜４２に記載の方法。
- ターマミル様αアミラーゼが、バチルス・リシェニフォルキス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のＮＣＩＢ １２２８９、ＮＣＩＢ １２５１２、ＮＣＩＢ １２５１３、もしくはＤＳＭ ９３７５、またはＤＳＭＺ ｎｏ．１２６４９、ＫＳＭ ＡＰ１３７８、またはＫＳＭ Ｋ３８もしくはＫ３６の株から誘導されたαアミラーゼの群から選択されるアミラーゼを含む、請求項４０〜４３に記載の方法。
- ターマミル様αアミラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、および１３で表される群から選択されるαアミラーゼのいずれかである、請求項４４に記載の方法。
- ターマミル様αアミラーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４との同一性の度合いが少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９７％、一層好ましくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を有する、請求項４０〜４５のいずれかに記載の方法。
- ターマミル様αアミラーゼが、低、好ましくは中、好ましくは高ストリンジェンシー条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、請求項４０〜４６のいずれかに記載の方法。
- 直近のアミラーゼ分子から６．０Å未満のところに存在するターマミル様αアミラーゼのアミノ酸残基（ＳＰ７２２のナンバリングを用いた）が、
１９、２０、２１、２２、２５、２８、２９、５３、７６、８４、８７、９０、９３、９４、１２４、１２５、１２６、１２８、１４２、１４４、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９３、１９５、１９６、１９７、２０９、２１２、２２６、２２９、２５６、２５７、２５８、２５９、２８０、２８１、２９８、２９９、３００、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３１０、３１１、３１４、３１９、３２０、３２１、３２２、３４１、３４５、４０５、４０６、４０８、４４４、４４７、４４８、４４９、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７である、請求項４０〜４７に記載の方法。 - 直近のアミラーゼ分子から３．５Å未満のところに存在するターマミル様αアミラーゼのアミノ酸残基（ＳＰ７２２のナンバリングを用いた）が、
２２、２５、２８、７６、９４、１２５、１２８、１５８、１６０、１７１、１７３、１７４、１８４、１８９、２０９、２２６、２２９、２９８、２９９、３０２、３０６、３１０、３１４、３２０、３４５、４０５、４４７、４６６である、請求項４０〜４７に記載の方法。
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