JP2003521888A5

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Publication number: JP2003521888A5
Application number: JP2001512892A
Authority: JP
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2020-07-21

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】Ｌ−アミノ酸を生成する方法であって、非改変細菌細胞と比較してＮＡＤＰＨが増量している改変細菌細胞を培養する工程を包含する方法であって、該改変細菌細胞からのＬ−アミノ酸収率が非改変細菌細胞からの収率よりも高い、方法。
【請求項２】前記改変細菌細胞が、ペントースリン酸経路の酸化分岐を通した炭素フラックスの増加を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】請求項２に記載の方法であって、ここで、前記改変細菌細胞がグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼおよび６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを包含する群から選択される増量された１つ以上の酵素を有する、方法。
【請求項４】前記改変細菌細胞が解糖系を通した炭素フラックスの減少を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記改変細菌細胞が減量された６−ホスホグルコースイソメラーゼ酵素活性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記改変細菌細胞からの前記Ｌ−アミノ酸収率が前記非改変細菌細胞からの収率よりも約１％〜約１００％高い、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記改変細菌細胞が変異体ｐｇｉ遺伝子を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】請求項１に記載の方法であって、前記改変細菌細胞が以下：
（ａ）ｐｇｉ遺伝子の内部領域をサブクローニングする工程、および
（ｂ）工程（ａ）から生じるベクターを相同組換えを介して細菌ゲノムへ挿入する工程、
によって生成される、方法。
【請求項９】前記改変細菌細胞が増量されたリンゴ酸酵素を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記改変細菌細胞が増量されたイソクエン酸デヒドロゲナーゼを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記改変細菌細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞が、変異したｐｇｉ遺伝子からなる群より選択された遺伝子を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】ｐＤＰＴｐｇｉ２を含有するベクター。
【請求項１５】変異したｐｇｉ遺伝子を有する細菌細胞の生成方法であって、以下：
（ａ）ｐｇｉ遺伝子の内部領域を自殺ベクターにサブクローニングする工程、および
（ｂ）工程（ａ）から生じるベクターを細菌ゲノムへ挿入し、それによって改変されたｐｇｉ遺伝子を有する細菌細胞を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】前記自殺ベクターが、選択可能なマーカーを有するｐＢＧＳ１３１ベースのレプリコンおよび選択可能なマーカーを有するＣｏｌＥ１ベースのレプリコンを包含する群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】請求項１５に記載の方法によって生成された、改変細菌細胞。
【請求項１８】Ｌ−アミノ酸を生成する方法であって、以下：
非改変細菌細胞と比較して減量された６−ホスホグルコースイソメラーゼ酵素活性を有する改変細菌細胞を培養する工程であって、該改変細菌細胞からのＬ−アミノ酸収率が非改変細菌細胞からの収率よりも高い工程、を包含する、方法。
【請求項１９】前記改変細菌細胞からの前記Ｌ−アミノ酸収率が、前記非改変細菌細胞からの収率よりも約１％〜約１００％高い、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】前記改変細菌細胞が変異体ｐｇｉ遺伝子を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】請求項１８に記載の方法であって、前記改変細菌細胞が以下：
（ａ）ｐｇｉ遺伝子の内部領域をサブクローニングする工程、および
（ｂ）工程（ａ）から生じるベクターを相同組換えを介して細菌ゲノムへ挿入する工程、
によって生成される、方法。
【請求項２２】前記改変細菌細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２におけるアミノ酸約１〜約５４０を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４に含まれるＤＮＡクローンによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体；
（ｄ）（ａ）のポリヌクレオチドを変更することによって作製されたポリヌクレオチド改変体であって、ここで
（１）該変更が、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み；そして
（２）変更数が（ａ）に存在するヌクレオチドの総数の５％以下である、ポリヌクレオチド改変体；
（ｅ）（ｂ）のポリヌクレオチドを変更することによって作製されたポリヌクレオチド改変体であって、ここで、
（１）該変更が、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み；そして
（２）変更数が（ｂ）に存在するヌクレオチドの総数の５％以下である、ポリヌクレオチド改変体；および
（ｆ）（ｃ）のポリヌクレオチドを変更することによって作製されたポリヌクレオチド改変体であって、ここで、
（１）該変更が、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み；そして
（２）変更数が（ｃ）に存在するヌクレオチドの総数の５％以下である、ポリヌクレオチド改変体
からなる群より選択される、核酸分子。
【請求項２５】請求項２４に記載の核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１における完全なヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
【請求項２６】請求項２４に記載の核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号２における完全なアミノ酸配列を有するホスホグルコイソメラーゼ（Ｐｇｉ）ポリペプチドをコードする配列番号１におけるヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
【請求項２７】請求項２４に記載の核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４において含まれるＤＮＡクローンによってコードされるＰｇｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
【請求項２８】請求項２４に記載の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）におけるヌクレオチド配列と同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、ここで、ハイブリダイズする該ポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみ、またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズしない、核酸分子。
【請求項２９】組換えベクターを作製する方法であって、該方法は、請求項２４に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する、方法。
【請求項３０】請求項２４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３１】組換え宿主細胞を作製する方法であって、該方法は、請求項３０に記載のベクターを、宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項３２】請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】Ｐｇｉポリペプチドを生成する方法であって、該方法は、請求項３２に記載の組換え宿主細胞を、該ポリペプチドが発現されるような条件下で培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
【請求項３４】単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ末端欠失を含むポリペプチド；
（ｂ）ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４に含まれるＤＮＡクローンによってコードされるホスホグルコイソメラーゼアミノ酸配列のアミノ末端欠失を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を変更することによって作製されたポリペプチド改変体であって、ここで
（１）該変更が、挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み、該欠失が、アミノ末端アミノ酸とカルボキシ末端アミノ酸との間であり；そして
（２）変更数が配列番号２に存在するアミノ酸の総数の５％以下である、ポリペプチド改変体；
（ｄ）ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４に含まれるＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を変更することによって作製されたポリペプチド改変体であって、ここで、
（１）該変更が、挿入、欠失、もしくは置換、またはその任意の組み合わせを含み、該欠失が、アミノ末端アミノ酸とカルボキシ末端アミノ酸との間であり；そして
（２）変更数がＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４に含まれるホスホグルコイソメラーゼポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の総数の５％以下である、ポリペプチド改変体；
（ｅ）配列番号２のカルボキシ末端欠失を含むポリペプチド；
（ｆ）ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１７４に含まれるＤＮＡクローンによってコードされるホスホグルコイソメラーゼアミノ酸配列のカルボキシ末端欠失を含むポリペプチドからなる群より選択され、ホスホグルコイソメラーゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項３５】請求項３４に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが（ａ）である、ポリペプチド。
【請求項３６】請求項３４に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが（ｂ）である、ポリペプチド。
【請求項３７】請求項３４に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが（ｃ）である、ポリペプチド。
【請求項３８】請求項３４に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが（ｄ）である、ポリペプチド。
【請求項３９】請求項３４に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが（ｅ）である、ポリペプチド。
【請求項４０】請求項３４に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが（ｆ）である、ポリペプチド。