JP2002527052A

JP2002527052A - 改善された生物活性と生体適合性のためのタンパク質の部位特異的二重ポリエチレングリコール化

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Publication number: JP2002527052A
Application number: JP2000575546A
Authority: JP
Inventors: ゲツグ，コリン; キンストラー，オーラフ
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1998-10-14
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2002-08-27
Anticipated expiration: 2019-10-13
Also published as: AU1447500A; EP1121155B1; CA2345027C; EP1121155A2; US6420339B1; WO2000021574A3; JP4854851B2; WO2000021574A2; AU757860B2; CA2345027A1; ATE463260T1; DE69942231D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に生物学的に活性な物質の化学修飾に関する。より明細には、本発明は、変異誘発と部位特異的化学結合を通して、２個の特異的に規定されたアミノ酸残基においてタンパク質に化学的に複合した２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）高分子から成る、特異的で十分に定義された二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートを構築するための新規アプローチに関する。前記二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートは、実質的に改善された生体効果と生体適合性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、変異誘発と部位特異的化学複合を通して、２つの特異的に規定され
たアミノ酸残基においてタンパク質に化学的に複合された２個のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）高分子から成る、特異的で十分に定義された二重ポリエチレ
ングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートを構築するための新規なアプロ
ーチに関する。上述した二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオコンジ
ュゲートは実質的に改善された生体効果と生体適合性を示す。

【０００２】発明の背景遺伝子工学および細胞工学テクノロジーの最近の進歩により、ｉｎｖｉｖｏ
で様々な薬理作用を示すことが知られているタンパク質を医薬適用のために大量
に生産することができる。そのようなタンパク質は、エリトロポイエチン（ＥＰ
Ｏ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン（α、β、γ
、コンセンサス）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイ
キン−１レセプタ拮抗物質（ＩＬ−１ｒａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）
、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球成長分化
因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、グリア細胞系由来神経栄
養因子（ＧＤＮＦ）ならびに肥満タンパク質（ＯＢタンパク質）を含む。ＯＢタ
ンパク質は本文中でレプチンとも称されうる。

【０００３】レプチンは、ｏｂ／ｏｂ変異マウス（ＯＢ遺伝子産物の産生欠損による肥満マ
ウス）ならびに正常な野生型マウスの両方においてｉｎｖｉｖｏで活性である
。その生物活性は、特に体重減少として表れる。一般に、Ｂａｒｉｎａｇａ、「
「肥満」タンパク質はマウスを減量させる」（“Ｏｂｅｓｅ” Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳｌｉｍｓＭｉｃｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：４７５−４７６（１９９
５）およびＦｒｉｅｄｍａｎ、「体重管理のアルファベット」（ＴｈｅＡｌｐ
ｈａｂｅｔｏｆＷｅｉｇｈｔＣｏｎｔｒｏｌ）、Ｎａｔｕｒｅ，３８５：
１１９−１２０（１９９７）参照。たとえば、ｏｂ／ｏｂ変異マウスにおいて、
レプチンの投与は血清インスリンレベルおよび血清グルコースレベルの低下をも
たらすことが知られている。また、レプチンの投与が体脂肪の減少を生じさせる
ことも知られている。これはｏｂ／ｏｂ変異マウスならびに非肥満正常マウスの
両方で認められた。Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：
５４０−５４３（１９９５）；Ｈａｌａａｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：５４
３−５４６（１９９５）。同様に、Ｃａｍｐｆｉｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
６９：５４６−５４９（１９９５）（マイクログラム用量のレプチンの末梢およ
び中心投与はｏｂ／ｏｂマウスおよび食餌誘発性肥満マウスの食餌摂取と体重を
低下させたが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスにおいては低下を生じなかった。）も参照
のこと。哺乳類およびヒトを含めた動物の体重および肥満の制御のためのモジュ
レーターとしてのＯＢタンパク質、アナログ、誘導体およびそれらの使用は、Ｗ
Ｏ９６／０５３０９号、前出に詳細に開示されている。また、ＰＣＴ国際特許
公開ＷＯ９６／４０９１２号、ＷＯ９７／０６８１６号、ＷＯ９７／１８
８３３号、ＷＯ９７／３８０１４号、ＷＯ９８／０８５１２号およびＷＯ
９８／２８４２７号も参照のこと。ＯＢタンパク質あるいはここで称されるレプ
チンは、ヒトにおいて体重減少を生じさせる；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、「痩せた
被験者と肥満被験者において皮下注射によって投与した組換えメチオニルヒトレ
プチン（ｒＬ）の予備的安全性と効果」（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓａｆｅｔ
ｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｅｔｈｉｏ
ｎｙｌｈｕｍａｎｌｅｐｔｉｎ（ｒＬ）ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｂｙ
ＳＣｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｌｅａｎａｎｄｏｂｅｓｅｓｕｂｊ
ｅｃｔｓ）。イリノイ州シカゴで１９９８年６月１４日に開かれたアメリカ糖尿
病学会の第５８回年次総会および学術セッションで発表されたポスター。これら
の報告のいずれにおいても、最高用量でも毒性は認められていない。

【０００４】動物モデルでの予備的なレプチン誘発体重減少実験は、ヒトの肥満を有効に治
療するために、高濃度のレプチン製剤と長期投与の必要性を予測する。０．５あ
るいは１．０ｍｇ／ｋｇ／日のような体重キログラム当りミリグラムタンパク質
の範囲の用量が、ヒトなどの大型哺乳類に治療上有効な量を注入するために望ま
しい。従って、患者にとって不快であったり、あるいは場合によって痛みを伴う
こともある、大容量の注入を避けるためには、タンパク質濃度の上昇が必要であ
る。

【０００５】残念ながら、ヒトへの注入のための医薬組成物の調製にあたって、レプチンの
アミノ酸配列は、活性タンパク質約２ｍｇ／液体ミリリットルを越えるような比
較的高い濃度では生理的ｐＨで不溶性である。生理的条件下でレプチンの溶解度
が低いことは、低いｐＨの製剤中で高用量を投与したとき、注射部位における濃
度依存的なレプチン沈着物の形成に寄与すると思われる。認められるレプチン沈
着物は、好酸球、マクロファージおよび巨細胞の存在を特徴とする混合細胞浸潤
を含む、注射部位における炎症反応に伴うものである。

【０００６】現在まで、生理的ｐＨにおいて少なくとも約２ｍｇ／ｍｌの濃度で安定なヒト
ＯＢタンパク質製剤についての報告はなく、さらに、少なくとも約５０ｍｇ／ｍ
ｌ又はそれ以上の活性ヒトＯＢタンパク質の安定な濃度は報告されてない。上述
した問題を伴わずに高用量を可能にするレプチン形態の開発は大きな恩恵をもた
らすであろう。それ故、タンパク質の部位特異的化学修飾によって改善された形
態のレプチンを提供することが本発明の一つの目的である。

【０００７】有用な治療タンパク質の化学修飾のいくつかの方法が報告されている。たとえ
ば、改善された薬理特性を示す、ポリエチレングリコールで化学修飾されたタン
パク質は長い歴史を持つ。それらの特性の中でも特に、長い血清半減期、溶解度
の改善および免疫原性の低下が挙げられる。レプチンのＮ末端での１個の２０ｋ
Ｄａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーによる化学修飾は、非修飾天然
タンパク質に比べて実質的な用量低下と高い溶解度を示す極めて有効な分子を生
じる；Ｎ末端での誘導体化レプチン（その中ではＯＢタンパク質と称されている
）の説明については、たとえばＰＣＴＷＯ９６／４０９１２号、前出の８ペ
ージ以下参照。ＰＥＧポリマーはバイオコンジュゲートの循環半減期を延長させ
、免疫原性のある程度の低下をもたらすと考えられるが、高用量（１０ｍｇ／ｋ
ｇ）で定期的に投与したとき腎空胞に蓄積することも認められた。この現象は他
のポリエチレングリコール化タンパク質製剤に関しても報告されている；たとえ
ば、Ｃｏｎｏｖｅｒら、ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＯｒｇａｎｓ，２１（５）：３
６９−３７８（１９９７）；Ｂｅｎｄｅｌｅら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４２：１５２（１９９７）参照。そのような空胞が個体の健
康に有害であるかどうかは不明であるが、薬剤の投与は付随する解剖学的異常が
ないことが好ましい。

【０００８】そこで、腎による糸球体濾過を免れるのに十分な大きさの、従って腎の空胞形
成を誘発する傾向がほとんどあるいは全くない、レプチンコンジュゲートを生成
することが本発明のひとつの目的である。そのようなコンジュゲートの生成は、
適切な大きさのポリマーによるレプチンの部位特異的二重ポリエチレングリコー
ル化と組み合わせた一連の合理的変異誘発を用いて達成される。重要な点として
、タンパク質のポリポリエチレングリコール化のための現在の戦略は、分離する
ことが困難であり、内因性生物活性に変動がある位置アイソフォームの不均質な
混合物を生じるが、それと異なって本発明の二重ポリエチレングリコール化タン
パク質バイオコンジュゲートは、ポリエチレングリコール化タンパク質コンジュ
ゲートの薬物動態上の利点を生かしながらコンジュゲートの内因性生物活性を維
持する均質な製剤を提供するように設計された、特異的複合部位を含む。

【０００９】

【発明の要旨】

本発明は、化学修飾されたタンパク質、たとえばレプチンの実質的に均質な製
剤およびそのための方法に関する。意外にも、レプチンの部位特異的化学修飾は
、他のレプチン種では見られない生物学的利用能と生体適合性における利点を明
らかにした。重要な点として、ここで述べる方法は他のタンパク質（あるいはそ
のアナログ）ならびにレプチンに広く適用できる。それ故、下記に詳細に述べる
ように、本発明はタンパク質（あるいはそのアナログ）の化学修飾ならびに特異
的タンパク質の特異的修飾に関する多くの態様を持つ。

【００１０】ひとつの態様では、本発明は、二重ポリエチレングリコール化レプチン（ある
いはそのアナログ）の実質的に均質な製剤および関連する方法に関する。重要な
点として、ここで述べる方法は、もっぱら２つの規定部位で修飾された二重ポリ
エチレングリコール化タンパク質の高い収量をもたらし、それによって、ランダ
ムな修飾を含む他の種に比べて加工上の利点を提供する。本発明は、未変性天然
組換えヒトレプチンと比較して、二重ポリエチレングリコール化組換えヒトレプ
チンが実質的に改善された生物活性と生体適合性を持つという所見に由来する。

【００１１】驚くべきことに、そして重要なことに、２０ｋＤａ、３０ｋＤａおよび４０ｋ
ＤａのＰＥＧポリマーから調製した二重ポリエチレングリコール化レプチンバイ
オコンジュゲートは極めて有効であることを明らかにし、腎空胞形成の傾向をほ
とんどあるいは全く示さないことが認められた。重要な点として、二重ポリエチ
レングリコール化レプチンバイオコンジュゲートを単回投与したとき、体重減少
が、等しい用量の非修飾レプチンを１日１回７日間投与したときの２倍のレベル
で７日間にわたって維持された。以下の作用実施例で使用される組換えヒトレプ
チンは、最初に選択システイン変異がレプチンタンパク質配列に導入されるよう
に修飾される。得られた組換えヒトレプチンアナログは高収率で回収でき、つい
で二重ポリエチレングリコール化バイオコンジュゲートを調製するのに使用され
る。そこで、ひとつの態様では、本発明は、レプチンタンパク質配列の７２位又
は７８位に導入されたシステイン変異を有するヒトレプチンに関する。

【００１２】本発明はまた、ＰＥＧがレプチンタンパク質配列のＮ末端と７８位で複合され
ている二重ポリエチレングリコール化ヒトレプチンバイオコンジュゲートに関す
る。好ましくはＰＥＧは約１０ｋＤａから約１００ｋＤａの分子量を持つ。特に
好ましくは、ＰＥＧは各々のポリマー鎖について約２０ｋＤａである。

【００１３】本発明はさらに、医薬上許容される担体中の、上記のようなすべての二重ポリ
エチレングリコール化ヒトレプチンバイオコンジュゲートに関する。

【００１４】本発明はさらに、上記のような二重ポリエチレングリコール化ヒトレプチンバ
イオコンジュゲートを調製するための工程に関する。二重ポリエチレングリコー
ル化タンパク質の実質的に均質な製剤を作製するための方法の主要な実施態様は
次の事柄を含む：（ａ）前記タンパク質のアミノ酸配列内の特定アミノ酸位置にシステイン残基
を導入して、前記タンパク質のアナログを提供する；（ｂ）前記システイン残基の位置でポリエチレングリコールを前記アナログに
複合し、モノポリエチレングリコール化タンパク質コンジュゲートを提供する；（ｃ）前記コンジュゲートのＮ末端に第二のポリエチレングリコールを複合し
、二重ポリエチレングリコール化バイオコンジュゲートを提供する；および（ｄ）前記二重ポリエチレングリコール化バイオコンジュゲートを分離する。

【００１５】本発明はまた、上記のような二重ポリエチレングリコール化ヒトレプチンバイ
オコンジュゲートを用いて個体を治療する方法に関する。

【００１６】図面の簡単な説明図１は、マウスに０．１−１０ｍｇ／ｋｇタンパク質を皮下投与により７日間
毎日投与したモデルでの様々なレプチン用量反応曲線を示すグラフである。曲線
は、１日１回７日間の多回投与アッセイからの各用量に関する３つの最大体重減
少値の平均を表わす。体重減少％を用量（ｍｇ／ｋｇ）に対してプロットし、体
重減少％を被験群と緩衝液対照群との差として算定している。

【００１７】図２は、マウスに各々の製剤１０ｍｇ／ｋｇを単回皮下注射によって投与した
モデルでの、種々のレプチン製剤が単回投与で誘発する体重減少パーセンテージ
を示すグラフである。体重減少％を日数に対してプロットし、体重減少％を被験
群と緩衝液対照群との差として算定している。

【００１８】図３は、３ｍｇ／ｋｇの単回用量を静脈内注射した後のマウスにおける２０ｋ
Ｄａ二重ポリエチレングリコール化レプチンについての薬物動態プロフィールを
示すグラフである。レプチン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を時間（時）に対してプロット
している。

【００１９】図４は、３ｍｇ／ｋｇの単回用量を皮下注射した後のマウスにおける２０ｋＤ
ａ二重ポリエチレングリコール化レプチンについての薬物動態プロフィールを示
すグラフである。レプチン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を時間（時）に対してプロットし
ている。

【００２０】図５は、種々のレプチン製剤に関する腎空胞スコアの比較を示す棒グラフであ
る。１＝２．５ｍｇ／ｋｇを毎日；２＝１０ｍｇ／ｋｇを毎日；３＝１０ｍｇ／
ｋｇ単回投与。^＊＝緩衝液と統計的な有意差なし。

【００２１】図６は、０、７、１４および２１（ｘ）日目に種々の用量の様々なレプチンコ
ンジュゲート製剤を用いて皮下投与したあとに得られた体重減少％を示すグラフ
である。緩衝液対照と比較した体重減少を４４日間にわたってモニターした。

【００２２】図７は、様々なレプチン製剤に関する腎空胞スコアの比較を示す棒グラフであ
る。１＝二重ポリエチレングリコール化（２５ｍ／ｋｇ）；２＝二重ポリエチレ
ングリコール化（１０ｍｇ／ｋｇ）；３＝二重ポリエチレングリコール化（２．
５ｍｇ／ｋｇ）；４＝モノポリエチレングリコール化（２５ｍｇ／ｋｇ）。腎空
胞スコアを各々の製剤について種々の時点で（日数）プロットしている。

【００２３】発明の詳細な説明本発明は、化学修飾されたタンパク質の実質的に均質な製剤およびそのための
方法に関する。ここで使用する「実質的に均質な」とは、認められる化学修飾さ
れただけのタンパク質がひとつの「修飾因子」（たとえばＰＥＧ）部分を持つも
のであることを意味する。前記製剤は非反応性（すなわち修飾因子部分を欠く）
タンパク質を含みうる。ペプチドマッピングとＮ末端の配列決定によって確認さ
れるように、下記のひとつの実施例は少なくとも９０％の修飾タンパク質と多く
とも１０％の非修飾タンパク質を含む製剤を提供する。好ましくは、化学修飾さ
れた物質が製剤の少なくとも９５％であり、最も好ましくは化学修飾された物質
が製剤の９９％又はそれ以上である。

【００２４】化学修飾物質は生物活性を持つ。ここで提供する本発明の「実質的に均質な」
二重ポリエチレングリコール化レプチン製剤は、均質な製剤の利点、たとえばロ
ットごとの薬物動態が予測可能であることによる臨床適用の容易さを発揮するの
に十分なほどに均質な製剤である。

【００２５】本明細書で使用するとき、生物学的に活性な物質は、予防、治療あるいは診断
適用のために有用な、ヒトあるいは動物の、組換えあるいは天然に生じるタンパ
ク質をさす。生物活性物質は天然、合成、半合成あるいはそれらの誘導体のいず
れでもよい。さらに、本発明の生物活性物質は認知可能でありうる。広い範囲の
生物活性物質が想定される。それらは、ホルモン、サイトカイン、造血因子、成
長因子、抗肥満因子、栄養因子、抗炎症因子、および酵素を含むがこれらに限定
されない（有用な生物活性物質のさらなる例については米国特許第４，６９５，
４６３号も参照のこと）。当業者は、所望する生物活性物質を本発明の組成物に
容易に適合させることができるであろう。

【００２６】そのようなタンパク質は、インターフェロン（図面を含めて参照してここに組
み込まれる、米国特許第５，３７２，８０８号、同第５，５４１，２９３号、同
第４，８９７，４７１号、および同第４，６９５，６２３号参照）、インターロ
イキン（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，０７５，２
２２号参照）、エリトロポイエチン（図面を含めて参照してここに組み込まれる
米国特許第４，７０３，００８号、同第５，４４１，８６８号、同第５，６１８
，６９８号、同第５，５４７，９３３号、および同第５，６２１，０８０号参照
）、顆粒球コロニー刺激因子（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国
特許第４，８１０，６４３号、同第４，９９９，２９１号、同第５，５８１，４
７６号、同第５，５８２，８２３号、およびＰＣＴ特許公開第９４／１７１８５
号参照）、幹細胞因子（図面を含めて参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ特許
公開第９１／０５７９５号、９２／１７５０５号および９５／１７２０６号参照
）、オステオプロテゲリン（図面を含めて参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ
特許公開第９７／２３６１４号参照）、およびレプチン（ＯＢタンパク質）を含
むがこれらに限定されない。

【００２７】本発明の二重ポリエチレングリコール化レプチン製剤のために使用するレプチ
ンの種類は、上記に引用し、その全体が参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ国
際特許公開第ＷＯ９６／０５３０９号に記述されているものから選択されうる
。かかる特許公開の図３（その中では配列番号４として引用される）は、ヒトレ
プチン（ヒト「ＯＢ」タンパク質と称される）に関して誘導した完全な推定アミ
ノ酸配列を開示している。アミノ酸は１−１６７まで番号付けられている。シグ
ナル配列の開裂部位はアミノ酸２１（Ａｌａ）のあとに位置するので、成熟タン
パク質はアミノ酸２２（Ｖａｌ）からアミノ酸１６７（Ｃｙｓ）まで伸びる。本
発明の開示にあたって、ここでは異なる番号付けを使用しており、１位のアミノ
酸は成熟タンパク質の起点であるバリン残基である。ここでは成熟組換えメチオ
ニルヒトレプチンに関するアミノ酸配列を配列番号１として示し、その中では成
熟タンパク質の最初のアミノ酸はバリン（１位）であり、メチオニル残基は−１
位（下記の配列には含まれない）に位置する。

【００２８】

【化１】しかし、本発明のレプチン成分のいずれについても同様であるように、−１位
のメチオニル残基は存在しないと考えられる。

【００２９】その代わりに、１４５個のアミノ酸を持ち、且つ、配列番号１のｒｍｅｔＨｕ
−レプチンと比較して、２８位にグルタミンがない、ヒトレプチンの天然変異体
を使用してもよい。

【００３０】一般に、本文中の人体医薬用途のためのレプチン部分は、人体において治療に
使用することができるであろう（下記の動物レプチンも参照のこと）。それ故、
いずれのレプチン成分が使用できるかを判定するために活性を実験的に試験して
もよい。ＷＯ９６／０５３０９号に述べられているように、その天然形態のレ
プチンタンパク質、あるいは断片（酵素開裂産物のような）あるいは他のトラン
ケートされた形態およびアナログは、すべて生物活性を保持しうる。そのような
形態のいずれもが本発明の二重ポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲー
トのためのレプチン成分として使用しうるが、そのような変化した形態は所望す
る特性を調べるために試験すべきである。その全体が参照してここに組み込まれ
る、ＰＣＴ国際特許公開ＷＯ９６／４０９１２号、ＷＯ９７／０６８１６号
、９７／１８８３３号、ＷＯ９７／３８０１４号、ＷＯ９８／０８５１２号
およびＷＯ９８／２８４２７号も参照のこと。

【００３１】マウス配列と異なるアミノ酸に置換することのような、組換えヒト配列中のア
ミノ酸残基を変化させることによって組換えヒトレプチンのアナログを調製する
ことができる。マウスレプチンは、特に成熟タンパク質として、そしてさらには
特にＮ末端において、ヒトレプチンと実質的に相同である。組換えヒトタンパク
質はマウスにおいて生物活性を持つことから、そのようなアナログはヒトにおい
て活性であると考えられる。たとえば、配列番号１に示すような天然ヒトレプチ
ンのアミノ酸配列において、３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７
、８９、９７、１００、１０１、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１
１８、１３６、１３８、１４２および１４５位のアミノ酸の１つ又はそれ以上を
もうひとつ別のアミノ酸で置換することができる。マウスタンパク質の対応する
位置のアミノ酸（Ｚｈａｎｇら、１９９４、前出参照）あるいはもうひとつ別の
アミノ酸を選択することができる。

【００３２】さらにラットＯＢタンパク質配列に基づき「コンセンサス」分子を調製するこ
とができる。参照してここに組み込まれる、Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０９：９４４−５２（１９９５）
参照。ラットＯＢタンパク質は次の位置でヒトＯＢタンパク質と異なる（配列番
号１の番号付けを使用する）：４、３２、３３、３５、５０、６８、７１、７４
、７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７
、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８および１４５。これらの相違する位
置のアミノ酸の１つ又はそれ以上をもうひとつ別のアミノ酸で置換することがで
きる。下線を付した位置は、マウスＯＢタンパク質ならびにラットＯＢタンパク
質がヒトＯＢタンパク質と異なる位置であり、従って変更に特に適している。１
つ又はそれ以上の位置で、対応するラットＯＢタンパク質からのアミノ酸あるい
はもうひとつ別のアミノ酸に置換することができる。

【００３３】成熟ヒトＯＢタンパク質と異なるラットおよびマウスの両方のＯＢタンパク質
からの位置は、４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、
７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８
、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５である。対応するラッ
トあるいはマウス配列において認められるアミノ酸のような、もうひとつ別のア
ミノ酸で置換された上記アミノ酸の１つ又はそれ以上を持つ配列番号１に従った
ＯＢタンパク質も有効であると考えられる。

【００３４】さらに、成熟ヒトＯＢタンパク質とは異なる、アカゲザルＯＢタンパク質にお
いて認められるアミノ酸は次の通りである（括弧内にアミノ酸の略語を１文字で
示している）：８（Ｓ）、３５（Ｒ）、４８（Ｖ）、５３（Ｑ）、６０（Ｉ）、
６６（Ｉ）、６７（Ｎ）、６８（Ｌ）、８９（Ｌ）、１００（Ｌ）、１０８（Ｅ
）、１１２（Ｄ）および１１８（Ｌ）。組換えヒトＯＢタンパク質はヒヒ（ｃｙ
ｎｏｍｏｌｏｇｕｓｍｏｎｋｅｙ）において活性であるので、括弧内のアミノ
酸のようなもうひとつ別のアミノ酸で置換されたアカゲザルの相違アミノ酸の１
つ又はそれ以上を持つ、配列番号１に従ったヒトＯＢタンパク質は有効であると
考えられる。一部のアカゲザル相違アミノ酸が上記のマウスおよびラット種でも
認められる（３５、６８、８９、１００、１０８および１１８位）ことに留意し
なければならない。そこで、次の位置でもうひとつ別のアミノ酸によって置換さ
れたアミノ酸の１つ又はそれ以上を持つ、マウス／ラット／アカゲザル／ヒトコ
ンセンサス分子（配列番号１の番号付けを使用する）を調製することができる：
４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８
、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１
０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５
。下線を付した位置は、３つの種すべてがヒトＯＢタンパク質と異なる位置であ
る。特に好ましいヒトレプチンアナログは、１００位（Ｔｒｐ）あるいは１３８
位（Ｔｒｐ）のアミノ酸、より好ましくは両方の位置のアミノ酸がもうひとつ別
のアミノ酸、好ましくはＧｌｎで置換されているものである。

【００３５】タンパク質アミノ酸配列の一部を欠失させることによって他のアナログを調製
することができる。たとえば、成熟タンパク質はリーダー配列（−２２から−１
）を欠く。次のようなヒトＯＢタンパク質分子のトランケートされた形態を調製
することができる（配列番号１の番号付けを使用する）：（ｉ）アミノ酸９８−１４６；（ｉｉ）アミノ酸１−９９および１１２−１４６（に連結する）；（ｉｉｉ）アミノ酸９９から１１２の間に連続的に位置するアミノ酸１００−
１１１の１つ又はそれ以上を持つアミノ酸１−９９および１１２−１４６（に連
結する）。

【００３６】さらに、トランケートされた形態はまた、ヒトＯＢタンパク質とは異なる（マ
ウス、ラットあるいはアカゲザルＯＢタンパク質において）変化した１つ又はそ
れ以上のアミノ酸を有していてもよい。さらに、変化は、ペプチドミメティック
あるいはＤアミノ酸のような変化したアミノ酸の形態であってもよい。

【００３７】酸性、電荷、疎水性、極性、サイズあるいは前記技術において既知の他の何ら
かの特性に従って「保存的」であるアミノ酸置換を有する、上述したようなタン
パク質も含まれる。それらを下記の表１に示す。一般には、参照してここに組み
込まれる、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、タンパク質、各所（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８４）；Ｆｏｒｄら、「タンパク質の
発現と精製」（ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ）２：９５−１０７（１９９１）。

【００３８】

【表１】

【００３９】それ故、本発明の二重ポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートは（ａ）任意に２８位のグルタミニル残基を欠き、さらに任意にＮ末端にメチオ
ニル残基を持つ、配列番号１のアミノ酸配列；（ｂ）４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６
７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１
０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２およ
び１４５の位置の１つ又はそれ以上において置換された異なるアミノ酸を持つ（
ａ）項のアミノ酸配列；（ｃ）１００および１３８位のアミノ酸がＧｌｎで置換されている（ｂ）項の
アミノ酸配列；（ｄ）（ｉ）アミノ酸９８−１４６（ｉｉ）アミノ酸１−９９および１１２−１４６（ｉｉｉ）アミノ酸９９から１１２の間に連続的に位置するアミノ酸１００
−１１１の１つ又はそれ以上を持つアミノ酸１−９９および１１２−１４６；（ｉｖ）もうひとつ別のアミノ酸で置換されたアミノ酸１００、１０２、１
０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１
４２および１４５の１つ又はそれ以上を持つ（ｉ）項のトランケートされたレプ
チンアナログ；（ｖ）もうひとつ別のアミノ酸で置換されたアミノ酸４、８、３２、３３、
３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、
７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１
つ又はそれ以上を持つ（ｉｉｉ）項のトランケートされたレプチンアナログ；（ｖｉ）もうひとつ別のアミノ酸で置換されたアミノ酸４、８、３２、３３
、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７
、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１
１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１つ又はそれ以上
を持つ（ｉｖ）項のトランケートされたレプチンアナログ；（ｖｉｉ）Ｎ末端にメチオニル残基を持つ（ｉ）−（ｖｉ）項のいずれかの
トランケートされたレプチンアナログ；の中から選択される、トランケートされたレプチンタンパク質アナログ；（ｅ）１つ又はそれ以上の保存されたアミノ酸置換を持つ（ａ）−（ｄ）項の
いずれかのレプチンタンパク質の中から（本文中配列番号１に示すアミノ酸配列に従って）選択されうる。

【００４０】レプチンタンパク質、アナログおよび関連分子は次の公表文献においても報告
されている：しかし、報告されているいずれの組成物についても活性に関する記
述は為されていない：米国特許第５，５２１，２８３号；同第５，５２５，７０５号；同第５，５３２
，３３６号；同第５，５５２，５２２号；同第５，５５２，５２３号；同第５，
５５２，５２４号；同第５，５５４，７２７号；同第５，５５９，２０８号；同
第５，５６３，２４３号；同第５，５６３，２４４号；同第５，５６３，２４５
号；同第５，５６７，６７８号；同第５，５６７，８０３号；同第５，５６９，
７４３号；同第５，５６９，７４４号；同第５，５７４，１３３号；同第５，５
８０，９５４号；同第５，５９４，１０１号；同第５，５９４，１０４号；同第
５，６０５，８８６号；同第５，６１４，３７９号；同第５，６９１，３０９号
；同第５，７１９，２６６号（ＥｌｉＬｉｌｙａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）；
ＰＣＴＷＯ９６／２３５１３号；ＷＯ９６／２３５１４号；ＷＯ９６／２３５
１５号；ＷＯ９６／２３５１６号；ＷＯ９６／２３５１７号；ＷＯ９６／２３５
１８号；ＷＯ９６／２３５１９号；ＷＯ９６／２３５２０号；ＷＯ９６／２３８
１５号；ＷＯ９６／２７３８５号；ＷＯ９６／３４１１１号；ＷＯ９６／３７５
１７号；ＷＯ９７／００８８６号；ＥＰ７２５０７９号；ＥＰ７４４４０８
号；ＥＰ７４５６１０号；ＥＰ７２５０７８号；ＥＰ８３５８７９号（Ｅ
ｌｉＬｉｌｌｙａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）；ＰＣＴＷＯ９６／２２３０８号（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）；ＰＣＴＷＯ９６／３１５２６号（ＡｍｙｌｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＴＷＯ９６／３４８８５号；ＷＯ９７／４６５８５号（Ｓｍｉｔｈｋｌｉ
ｎｅＢｅｅｃｈａｍＰＬＣ）；ＰＣＴＷＯ９６／３５７８７号（ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；
ＰＣＴＷＯ９７／１６５５０号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ
）；ＰＣＴＷＯ９７／２０９３３号（ＳｃｈｅｒｉｎｇＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
）ＥＰ７３６５９９号（Ｔａｋｅｄａ）；ＥＰ７４１１８７号（Ｆ．ＨｏｆｆｍａｎＬａＲｏｃｈｅ）。

【００４１】これらの参考文献が有用なレプチンタンパク質又はアナログ、あるいは関連す
る組成物又は方法が提供するかぎりにおいて、そのような組成物および／あるい
は方法は、同時投与（選択される投与スケジュールで、一緒に又は別個に）のた
めなどに、本発明の二重ポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートと組
み合わせて使用しうる。上記を条件として、これらの公表文献は参照してここに
組み込まれる。

【００４２】さらに、生物学的に活性な物質は、インスリン、ガストリン、プロラクチン、
副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体化ホ
ルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ｈ
ＣＧ）、モチリン、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ
−１からＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子結合タンパク質
（ＴＮＦ−ｂｐ）、脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）、グリア細胞由来神経栄養
因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）
、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）のような骨成長因子、インスリン様成長因子
（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、巨核球由来成長因子（ＭＧＤＦ）、
ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、トロンボポエチン、血小板由来成長因子（
ＰＧＤＦ）、コロニー刺激成長因子（ＣＳＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ
）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲン活性化因
子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよびカリクレインを含みう
るが、これらに限定されない。ここで使用する「タンパク質」という用語は、ペ
プチド、ポリペプチド、コンセンサス分子、それらのアナログ、誘導体あるいは
組合せを含む。

【００４３】使用するタンパク質（あるいはそのアナログ）にかかわりなく、選択システイ
ン変異をタンパク質配列に導入するように前記タンパク質を修飾する。システイ
ン点変異の目的は、Ｎ末端に特異的なＰＥＧ複合のための既存のテクノロジーを
補足する第二の複合部位を提供することである。これらの「システイン」タンパ
ク質アナログは、前記技術で周知の従来の方法を用いて容易に調製することがで
きる。

【００４４】たとえば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）は、構造上レプチンに非常に
類似した四重らせん束タンパク質である。ＧＣＳＦは還元的アルキル化によって
Ｎ末端で容易にモノポリエチレングリコール化されるが、追加的なアミン特異的
ポリエチレングリコール化は４個のリシン残基（Ｌｙｓ^１６、Ｌｙｓ^２３、Ｌｙ
ｓ^３４およびＬｙｓ^４０）のいずれかでランダムに起こる。これは、少なくとも
４つの異なる位置アイソフォームの混合物から成るジポリエチレングリコール化
ＧＣＳＦの不均質な製剤を生じる。困難ではあるが、これらの位置アイソフォー
ムは分離することができ、極めて多様な度合の残留活性を示した。アラニンスキ
ャニングによりＧＣＳＦ活性部位のトポグラフィーマップを作成するという試み
によって、らせんＮｏ．１とＮｏ．４に位置する少なくとも６個の残基（Ｌｙｓ ^１６、Ｇｌｕ^１９、Ｌｙｓ^２３、Ｇｌｕ^４６、Ａｓｐ^１０９およびＡｓｐ^１１２）が同定され、これらは、アラニンへの変異を生じたとき、５倍を越えるＧＣＳ
Ｆ活性の喪失を生じさせた（Ｙｏｕｎｇら、Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，６：１２２８
−１２３６（１９９７）。これは、Ｌｙｓ^１６あるいはＬｙｓ^２３でのポリエチ
レングリコール化がＧＣＳＦ活性の低下をもたらすという所見を裏付けるであろ
う。二重ポリエチレングリコール化のテクノロジーをＧＣＳＦに適用するために
は、システイン残基を、活性部位とＮ末端の両方から遠位の部位に導入しなけれ
ばならない。そのようなシステイン変異は、過度の接触を生じることなく溶媒を
分子間のジスルフィド形成に暴露する、二次構造の要素の表面上に位置付ける。
このアプローチの例として、それぞれらせんＮｏ．２、Ｎｏ．３およびＮｏ．５
上のＳｅｒ^５３→Ｃｙｓ^５３、Ｇｌｙ^８７→Ｃｙｓ^８７およびＳｅｒ^１５５→Ｃ
ｙｓ^１５５の変異が提案される。しかしながら他のいかなる位置も、ＧＣＳＦ活
性を保存しており、分子間タンパク質架橋を抑制しながら有効なＰＥＧ複合を促
進し、さらに高収率で産生することができれば、適当と判断しうることに留意し
なければならない。

【００４５】一部のタンパク質の場合には、ポリエチレングリコール化の１つの部位として
天然配列中に既に存在するシステイン残基を代替的に使用し、それによってＮ末
端のポリエチレングリコール化を避けることもできる。さらに、２つの選択シス
テイン変異を天然タンパク質配列に導入し、それらのシステイン残基の各々を二
重ポリエチレングリコール化複合において使用して、やはりＮ末端のポリエチレ
ングリコール化を回避することができる。

【００４６】本発明において調製するレプチンアナログは、選択システイン変異、Ａｒｇ^７ ^２ →Ｃｙｓ^７２あるいはＳｅｒ^７８→Ｃｙｓ^７８を含む。これらの変異は、レプ
チンの三次元モデルに対するトポグラフィーマップ上の小さな化学修飾に基づき
、それらの修飾をタンパク質のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ活性に対
する作用に関連づける。かかる部位は、レプチンの内因性生物活性を保存し、且
つ２つの部位（すなわちＮ末端と第二のシステイン部位）を識別することができ
る、二者択一的であるが適合性の化学を可能にするように選択され、従って各々
の部位でＰＥＧサイズとコンフォメーションの独立した変形を提供する。変異を
Ｎ末端から遠位に、そして架橋化学を促進するように溶媒に暴露された表面上に
位置付けるという追加的な配慮を払った。

【００４７】Ａｒｇ^７２→Ｃｙｓ^７２の変異は、溶媒の接触可能性を高めるためにフレキシ
ブルループに位置し、一方Ｓｅｒ^７８→Ｃｙｓ^７８の変異は、再折りたたみの初
期に天然システイン（Ｃｙｓ^９７およびＣｙｓ^１４７）から離れて並置すること
により再折りたたみの回収率を高めうるＣらせんの底部で起こる。新しいＣｙｓ ^７８複合部位は、Ｎ末端と推定上のレセプタ結合界面の両方から遠位である。そ
のように位置付けたＣｙｓ^７８は、コンジュゲートの流体力学容積を最大限にし
ながら、第二ポリマー複合とレセプタ結合の両方による立体干渉を最小限に抑え
るのを助けると仮定した。さらに、Ｃｙｓ^７８部位はＣらせんにおけるその位置
の故に選択したが、そのことから、自然発生的な分子間あるいは分子内ジスルフ
ィド形成に抵抗し、従ってアナログの安定性と工程の回収率を改善すると考えら
れる。この仮説は、同時に産生されたＡｒｇ^７２→Ｃｙｓ^７２アナログによって
支持される。Ａｒｇ^７２→Ｃｙｓ^７２部位は隣接するフレキシブルループ内にあ
り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたとき、高いレベルの凝集物と折
りたたみ誤りにより、ほとんど回収不能であった。

【００４８】２つの複合化学は相互に適合性であり、比較的部位特異的であるので、生じる
コンジュゲートは、典型的には高い度合の均一性を持ち、従来のクロマトグラフ
ィー法によって容易に精製される。

【００４９】その後、上述した「システイン」タンパク質アナログを使用して、二重ポリエ
チレングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートを調製する。本発明におい
て調製する二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートは、簡
単な二段階合成においてＳｅｒ^７８→Ｃｙｓ^７８レプチンアナログを使用して、
所望する二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートを生成す
る。生じるバイオコンジュゲートは、Ｃｙｓ^７８およびＮ末端での部位特異的結
合により四重らせん束の反対側の末端でポリエチレングリコール化されたレプチ
ンアナログを持つ。

【００５０】使用するポリマー分子は水溶性ポリマーの中から選択されうる。（還元的アル
キル化工程のためには、ポリマーは単一反応性アルデヒドを有していなければな
らない。）結合するタンパク質が、生理環境のような水性環境において沈澱しな
いように、選択するポリマーは水溶性でなければならない。還元的アルキル化の
ためには、選択するポリマーは、本発明の方法で規定するように重合の度合を制
御できるように、単一反応性アルデヒドを有していなければならない。好ましく
は、最終産物製剤の治療用途のために、ポリマーは医薬上許容される。当業者は
、ポリマー／タンパク質コンジュゲートを治療に使用するかどうか、そしてその
場合には所望する用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性などの配慮、
およびその他の配慮に基づいて所望するポリマーを選択することができる。水溶
性ポリマーは、たとえばポリエチレングリコール、デキストランあるいはポリ（
ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホ
モポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオ
キシエチル化ポリオルおよびポリビニルアルコールから成る群から選択されうる
。

【００５１】下記に論じるような至適化のための配慮の下に、ポリマーはいかなる分子量の
ものでもよく、また分枝していてもあるいは分枝していなくてもよい。ポリエチ
レングリコールに関しては、好ましい分子量は約１０ｋＤａから約１００ｋＤａ
の間であり（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの製剤中、一部の分
子が明言された分子量を上回り、一部が下回ることを表わす）。所望する治療プ
ロフィール（たとえば所望する持続放出の期間、存在する場合には生物活性への
作用、取り扱いの容易さ、抗原性の度合あるいは抗原性の欠如、および治療タン
パク質あるいはアナログへのポリエチレングリコールの他の既知の作用）に依存
して、様々なサイズが使用できる。

【００５２】ポリエチレングリコール分子をタンパク質に結合するために様々な手段が用い
られてきた。一般には、タンパク質上に認められる反応基を通してポリエチレン
グリコール分子をタンパク質に連結する。リシン残基上あるいはＮ末端にあるも
ののようなアミノ基がそのような結合に好都合である。たとえば、Ｒｏｙｅｒ（
米国特許第４，００２，５３１号、前出）は、ポリエチレングリコール分子を酵
素に結合するために還元的アルキル化を用いることを述べている。Ｗｒｉｇｈｔ
の１９９３年４月２８日公開の特許願ＥＰ０５３９１６７号、「Ｐｅｇイ
ミデートおよびそのタンパク質誘導体」（ＰｅｇＩｍｉｄａｔｅｓａｎｄ
ＰｒｏｔｅｉｎＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓＴｈｅｒｅｏｆ）は、遊離アミノ基
を持つペプチドと有機化合物をＰＥＧの直接誘導体あるいは関連水溶性有機ポリ
マーで修飾することを述べている。Ｓｈａｗの１９９０年２月２７日発行の米国
特許第４，９０４，５８４号は反応性アミン基を通してポリエチレングリコール
分子を結合するためのタンパク質中のリシン残基の数の変更に関するものである
。ＰＣＴＷＯ９６／４０９１２号、前出の８ページ以降は、レプチン（その
中ではＯＢタンパク質と称されている）をＮ末端で誘導体化する方法を説明して
いる。

【００５３】本発明の好ましい実施態様では、システイン残基でのＰＥＧ分子のタンパク質
への結合は、リシンアミンに対してＣｙｓ^７８チオールへのマレイミドの選択性
を最大にするため〜ｐＨ６．５での反応を使用して（このｐＨは同時にチオール
の酸化を最小限に抑える）、ＰＥＧ分子をシステイン残基に結合することを含む
；タンパク質のＮ末端への第二のＰＥＧ分子の結合は、レプチン上の他の位置の
アミン基はプロトン化されるがアミノ末端のアミンはプロトン化されないような
十分に酸性のｐＨで、アミン結合を形成するための還元条件下でＰＥＧ分子をレ
プチン成分に結合することを含む。

【００５４】一般に、投与のために必要な医薬上許容される希釈剤、防腐剤、溶解補助剤、
乳化剤、アジュバントおよび／あるいは担体と共に、有効量の化学修飾されたタ
ンパク質あるいは誘導体産物を含有する医薬組成物は、本発明に包含される。（
参照してここに組み込まれるＰＣＴ９７／０１３３１号参照）。所望する生物
学的に活性な物質のための至適医薬剤型は、投与経路と所望する用量に依存して
当業者により決定されるであろう。例示的な医薬組成物は、「レミントンの医薬
化学」（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎ
ｃｅｓ）（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，１８版、Ｅａｓｔｏｎ，
ＰＡ，ｐ．１４３５−１７１２（１９９０））。本発明の医薬組成物は、経口お
よび非経口製剤（たとえば筋肉内、皮下、経皮、内臓、ＩＶ（静脈内）、ＩＰ（
腹腔内）、関節内、耳内への設置、ＩＣＶ（大脳室内）、ＩＰ（腹腔内）、動脈
内、クモ膜下腔内、関節包内、眼窩内、経肺、経鼻、直腸、および子宮−経粘膜
製剤）によって投与しうる。

【００５５】本発明の組成物の治療用途は使用する生物活性物質に依存する。当業者は、所
望する生物活性物質をその意図する治療用途のために本発明に容易に適合させる
ことができるであろう。そのような物質の治療用途は、図面を含めて参照してこ
こに組み込まれる下記の公表文献中で詳細に述べられている。治療用途は、イン
ターフェロン（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，３７
２，８０８号、同第５，５４１，２９３号参照）、インターロイキン（図面を含
めて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，０７５，２２２号参照）、エ
リトロポイエチン（図面を含めて参照してここに組み込まれる米国特許第４，７
０３，００８号、同第５，４４１，８６８号、同第５，６１８，６９８号、同第
５，５４７，９３３号、および同第５，６２１，０８０号参照）、顆粒球コロニ
ー刺激因子（図面を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第４，９９９
，２９１号、同第５，５８１，４７６号、同第５，５８２，８２３号、同第４，
８１０，６４３号、およびＰＣＴ特許公開第９４／１７１８５号参照）、幹細胞
因子（図面を含めて参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第９１／０５
７９５号、９２／１７５０５号および９５／１７２０６号参照）、およびＯＢタ
ンパク質（図面を含めて参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第９６／
４０９１２号、９６／０５３０９号、９７／００１２８号、９７／０１０１０号
および９７／０６８１６号参照）のようなタンパク質のための使用を含むがこれ
らに限定されない。さらに、本発明の組成物はまた、生物活性物質が治療するこ
とを意図する状態の治療あるいは改善のための１つ又はそれ以上の薬剤の製造の
ためにも使用しうる。

【００５６】当業者は、投与と所望する治療効果の観察によって有効用量を確認することが
できるであろう。好ましくは、コンジュゲートの製剤は、約０．０１μｇレプチ
ン成分／ｋｇ体重／日から１０ｍｇレプチン成分／ｋｇ体重／日の用量が所望す
る治療効果を生じるような製剤である。有効用量は経時的な診断ツールを用いて
決定しうる。たとえば、血液中（あるいは血漿中あるいは血清中）のレプチンの
量を測定するための診断を最初に使用してレプチンタンパク質の内因性レベルを
調べることができる。そのような診断ツールは、抗体サンドイッチアッセイのよ
うな抗体アッセイの形態でありうる。最初に内因性レプチンタンパク質の量を定
量し、基線を決定する。内因性および外因性レプチンタンパク質成分（すなわち
、自己産生されたかあるいは投与された、体内で認められるタンパク質、アナロ
グあるいは誘導体）の定量を治療期間を通じて継続しながら治療用量を決定する
。それ故、用量は治療期間を通じて変化し、たとえば最初に治療の恩恵が認めら
れるまでは比較的高い用量を使用し、治療効果を維持するためにはより低い用量
を使用することができる。

【００５７】二重ポリエチレングリコール化レプチンの治療用途は、体重調節、糖尿病の治
療あるいは予防、血中脂質の低下（および関連する状態の治療）、脂肪なし体重
の増加ならびにインスリン感受性の上昇を含む。

【００５８】体重調節。本発明の組成物および方法は体重減少のために使用しうる。もうひ
とつ別の見地からは、本発明の組成物は所望する体重あるいは肥満レベルの維持
のために使用できる。マウスモデルで明らかにされたように（下記参照）、本発
明の二重ポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートの投与は体重減少を
もたらす。失われるボディマスは主として脂肪組織あるいは脂肪である。そのよ
うな体重損失は下記に述べるもののような随伴状態の治療に結びつけることがで
き、それ故治療適用を構成する。さらに、体重調節が単に外観の改善だけを目的
とする場合の化粧品用途をここで提供する。

【００５９】糖尿病の治療。本発明の組成物および方法は、ＩＩ型糖尿病の予防あるいは治
療において使用しうる。ＩＩ型糖尿病は肥満と相関しうるので、体重を低減する
（あるいは所望する体重を維持する、あるいは肥満レベルを低減又は維持する）
ために本発明を使用することは、同時に糖尿病を軽減する、あるいは糖尿病の発
現を予防することができる。さらに、体重減少をもたらすのに十分な用量が存在
しない場合でも、本発明の組成物は糖尿病を予防あるいは軽減するために使用す
ることができる。

【００６０】血中脂質調節。本発明の組成物および方法は血中脂質レベルの調節において使
用しうる。高脂血症（脂肪血症、血中脂質異常とも称される）は、循環血液中に
異常に多量の脂質が存在する状態である。理想的には、単に血中脂質レベルの低
下だけを所望する、あるいは血中脂質レベルの維持を所望する状況においては、
体重減少をもたらすには不十分な用量を用いる。従って、肥満患者の治療初期に
は、体重減少と随伴する血中脂質レベルの低下が達成される用量を投与すること
ができる。ひとたび十分な体重減少が達成されれば、体重の回復を防ぐのに十分
であるが、所望する血中脂質レベル、あるいはたとえばここで述べるような他の
状態を維持するのに十分な用量を投与することができる。レプチンタンパク質の
作用は可逆性であるので、これらの用量は経験的に決定することができる。たと
えば、Ｃａｍｐｆｉｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：５４６−５４９（１９
９５）の５４７。それ故、体重減少を所望しないときに、ある用量が体重減少を
もたらすことが認められれば、所望する血中脂質レベルを達成し、且つ所望する
体重を維持するためにより低い用量を投与する。たとえば、参照してここに組み
込まれるＰＣＴ特許公開ＷＯ９７／９６８１６号参照。

【００６１】脂肪なし体重あるいはインスリン感受性の上昇。理想的には、脂肪なし体重の
増加だけを所望する状況においては、体重減少をもたらすには不十分な用量とす
る。従って、肥満者の治療の初期には、体重減少と随伴する脂肪組織の減少／脂
肪なし体重の増加が達成される用量を投与することができる。ひとたび十分な体
重減少が達成されれば、体重の回復を防ぐのに十分であるが、所望する脂肪なし
体重の増加（あるいは脂肪なし体重の軽減の予防）を維持するのに十分な用量を
投与することができる。インスリンに対する個人の感受性を高めるためには、同
様の用量上の配慮を考慮することができる。個人が糖尿病の治療のために投与さ
れるインスリン（あるいは潜在的に、アミリン、アミリン拮抗物質あるいは作用
物質、あるいはチアゾリジンジオン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）
、あるいは他の潜在的糖尿病治療薬）の量を低減するのに十分な、体重減少を伴
わない脂肪なし体重の増加を達成することができる。全体的な強さを高めるため
に、同様の用量上の配慮を行うことができる。随伴する全体的強度の上昇を伴っ
た脂肪なし体重の増加は、体重減少をもたらすには不十分な用量で達成されうる
。赤血球数（および血液中の酸素）の増加および骨吸収又は骨粗しょう症の低下
のような他の恩恵も、体重減少を伴わずに達成されうる。たとえば、参照してこ
こに組み込まれるＰＣＴ特許公開第ＷＯ９７／１８８３３号参照。

【００６２】併用治療。本発明の組成物および方法は、食事療法や運動のような他の治療と
組み合わせて使用することができる。他の薬剤は、糖尿病の治療に有用なもの（
たとえばインスリンおよび場合によってはアミリン、それらの拮抗物質あるいは
作用物質、チアゾリジンジオン（たとえば、参照してここに組み込まれるＰＣＴ
特許公開第ＷＯ９８／０８５１２号参照）、あるいは他の潜在的糖尿病治療薬
）、コレステロールおよび血圧低下薬剤（血中脂質レベルを低下させるものある
いは他の心臓血管薬剤）、活性上昇薬剤（たとえばアンフェタミン）、利尿薬（
液体排泄のため）、ならびに食欲抑制薬（神経ペプチドＹレセプタあるいはセロ
トニン再取込み阻害因子に作用する物質など）を含む。そのような投与は同時あ
るいは順次に行うことができる。さらに、本発明の方法は、身体の全体的外観を
変えるためにデザインされた美容整形（たとえば脂肪吸引法あるいはボディマス
を低減するためにデザインされたレーザー手術あるいはボディマスの外観を増加
させるためにデザインされたインプラント手術）のような手術処置と組み合わせ
て使用することができる。動脈斑のような脂肪沈着による血管の遮断によって引
き起こされる有害な状態を軽減するためにデザインされたバイパス手術あるいは
他の手術のような心臓手術の健康上の恩恵を、本発明の組成物および方法の併用
によって高めることができる。超音波あるいはレーザー法のような胆石を除去す
るための方法も、本発明の治療法の前、その期間中あるいはその後のいずれかに
使用することができる。さらに、本発明の方法は、骨折、筋肉損傷のための手術
又は治療、あるいは脂肪なし組織重量の増加によって改善される他の治療の補助
として使用しうる。

【００６３】さらに、本発明の組成物は、上記の状態を治療あるいは改善するための１つ又
はそれ以上の薬剤の製造のために使用することができる。

【００６４】下記の実施例は本発明をより詳細に例示するために提供するものであり、その
範囲を制限するものと解釈すべきではない。

【００６５】実施例１この実施例は、Ａｒｇ^７２→Ｃｙｓ^７２レプチンアナログおよびＳｅｒ^７８→
Ｃｙｓ^７８レプチンアナログの調製を述べる。

【００６６】本実験には組換えメチオニルヒトレプチン（ｒｍｅｔＨｕ−レプチン）を使用
した。ここで使用するレプチン成分は原核あるいは真核細胞において作製しうる
が、下記の実施例で用いるレプチン成分については、工業的製造を容易にするた
め細菌が好ましい。さらに、所望のタンパク質をコードする内因性遺伝子の調節
に影響を及ぼす天然あるいは導入調節要素を制御することによって作製されるも
ののような、ヒト細胞において産生されるレプチンを使用してもよい。

【００６７】不対システイン残基を含むヒトレプチンの２つのアナログを大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）から発現させ、精製して、ポリエチレングリコール化反応における基質と
して使用した。これらはＡｒｇ^７２→Ｃｙｓ^７２レプチンアナログおよびＳｅｒ ^７８ →Ｃｙｓ^７８レプチンアナログ（配列番号１のアミノ酸位置に関する変異）
であった。アナログは、標準ＰＣＲ手法を用いて配列番号１の部位特異的変異誘
発によって構築した。使用した変異誘発性オリゴヌチドを下記の表２に示す：

【００６８】

【表２】

【００６９】各対からのアンチセンスプライマー（Ａｒｇ^７２→Ｃｙｓ^７２については１７
３５−４７；Ｓｅｒ^７８→Ｃｙｓ^７８については１７３５−４９）をベクターｐ
ＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）万能センスプライマー１２１６−５２に
よるＰＣＲ反応において使用し、所望する変異を含むレプチン遺伝子の５’末端
を作製した。各対からのセンスプライマー（Ａｒｇ^７２→Ｃｙｓ^７２については
１７３５−４６；Ｓｅｒ^７８→Ｃｙｓ^７８については１７３５−４８）をベクタ
ーｐＡＭＧ２１万能アンチセンスプライマー１２００−５４によるＰＣＲ反応に
おいて使用し、所望する変異を含むレプチン遺伝子の３’末端を作製した。半分
の分子２個を万能プライマーだけを用いる第三のＰＣＲ反応において結合させ、
各々の変異を含む完全長の産物を作製した。各ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレア
ーゼＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化し、やはりＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化したベ
クターｐＡＭＧ２１にライゲーションした。

【００７０】結合したＤＮＡを大腸菌株２５９６のコンピテント宿主細胞に形質転換した。
大腸菌宿主株２５９６はＡｍｇｅｎ菌株３９３（ＡＴＣＣ番号２０２１７３はこ
の菌株のｈｓｄＲバージョンである）から誘導される大腸菌Ｋ−１２系統である
。早期ｅｂｇ領域における温度感受性λリプレッサーと後期ｅｂｇ領域（６８分
）におけるｌａｃＩＱリプレッサーの両方を含むように改変した。

【００７１】組換えタンパク質産物を産生し、正しいヌクレオチド配列を持つ遺伝子を担う
能力に関してクローンをスクリーニングした。Ａｒｇ^７２→Ｃｙｓ^７２変異を含
む１個のそのようなクローンを選択してＡｍｇｅｎ菌株３５５９と称し、Ｓｅｒ ^７８ →Ｃｙｓ^７８変異を含むもうひとつのクローンをＡｍｇｅｎ菌株３５６１と
称した。レプチンアナログの組換え発現は、たとえば、参照してここに組み込ま
れるＷＯ９６／４０９１２号に述べられているように実施した。

【００７２】実施例２この実施例は、二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲート
の調製を述べる。実施例１で述べたように調製したＳｅｒ^７８→Ｃｙｓ^７８レプ
チンアナログから出発し、次の二段階の工程を使用する：段階１。ＮａＨＰＯ_４緩衝液２０−５０ｍＭ、ＥＤＴＡ５ｍＭ、ｐＨ６．５
中にアナログを２−３ｍｇ／ｍｌにとる。次にメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（
ＰＥＧＡ）（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ）を１−３倍モル過剰に
加え、４℃で２−２４時間反応させてＣｙｓ^７８部位に複合する。

【００７３】段階２。ステップ１からの反応混合物のｐＨをｐＨ４−６に低下させ、５−７
倍過剰のメトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧＢ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を十分量のシアノホウ水素化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）と共
に加えてＮａＢＨ_３ＣＮ１５ｍＭを生成する。撹拌しながらこの反応を４℃で
ひと晩進行させる。完了後、反応物をＮａＯＡｃ２０ｍＭ、ｐＨ４に透析し、
＜１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈して、ｐＨをｐＨ３．５に調整する。次
にこの物質を、ＮａＯＡｃ２０ｍＭ、ｐＨ４中、高速セファロースＳＰ樹脂（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより０−２０
０ｍＭＮａＣｌ勾配で精製する。

【００７４】弁別複合化学により、各々の部位に結合するポリマーを独立して変化させるこ
とが可能である。これまでに、２０ｋＤａと３０ｋＤａの線状ＰＥＧおよび４０
ｋＤａの分枝ＰＥＧが評価されており、特にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬ
Ｃ、光散乱法、ペプチドマッピング、ｉｎｖｉｔｒｏレセプタ結合アッセイお
よびｉｎｖｉｖｏバイオアッセイによって特性付けられている。

【００７５】実施例３二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートによって達成さ
れる用量低下を、０．１−１０ｍｇ／ｋｇタンパク質を皮下投与によりマウスに
７日間毎日投与して評価した。所定用量の各コンジュゲートについて、７日間の
試験期間中に達成された３つの最大体重減少の数値を平均した。次いでこの平均
体重減少値を、試験した各用量についての用量関数としてプロットした（図１）
。図１のデータは、二重ポリエチレングリコール化レプチンが１３−２０倍の用
量低下をもたらすことを明らかにしている。図１はいくつかの試験からのデータ
を含むため、合成用量反応曲線と定義される。各コンジュゲートに関するデータ
を対数曲線に適合させると、それを解くことによって一定のパーセンテージの体
重減少を実現するために必要な用量を予測することができる線形方程式が得られ
る。この場合には、４％がデータによく表わされている中間範囲の体重減少値で
ある。４％体重減少について方程式を解くと、下記の表３に示す予測用量と天然
レプチンに比べての用量低下を生じる。

【００７６】

【表３】

【００７７】実施例４二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートのｉｎｖｉｖ
ｏ効果を、野生型マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇを単回皮下投与し、緩衝液対照
と比較して体重減少をモニターすることによって試験した。対照として非修飾ｒ
ｈｕ−レプチンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与した。２０ｋＤａモノＰＥＧ
−レプチン群についての体重減少は３日後に１２％のピークに達し、５日目まで
に回復した（図２）。２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンは６日
目までに１３％の体重減少を誘発し、１０日目までに回復した。さらに良好であ
った３０ｋＤａの二重ポリエチレングリコール化レプチンは７日目までに１６％
の体重減少を誘発し、１４日目まで回復しなかった。図２のデータは、レプチン
の二重ポリエチレングリコール化が実質的に高い効果を促進し、その効果は単回
投与から１４日間持続されることを明らかに示している。これは二重ポリエチレ
ングリコール化レプチンの意外且つ極めて有用な特性であり、天然レプチンより
〜１０倍低い総用量の物質を週１回の注入投与するだけでよいという可能性を提
供する。

【００７８】実施例５２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンの薬物動態プロフィールを
、正常マウスにおいて単回３ｍｇ／ｋｇ用量の皮下あるいは静脈内投与後に検討
した。規則正しい間隔をおいて採取した血清サンプル中の２０ｋＤａ二重ポリエ
チレングリコール化レプチンの濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。静脈内投与
に関しては、２０ｋＤａ二重ＰＥＧ−レプチンコンジュゲートは速やかに〜１０ ^４ｎｇ／ｍｌの最大濃度に達し、７日間にわたって持続して、７日目でもなお〜
２００ｎｇ／ｍｌで検出可能である。皮下投与に関しては、２０ｋＤａ二重ポリ
エチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートは〜１５時間後に〜４×１
０^３ｎｇ／ｍｌの最大濃度に達し、少なくとも６日間持続する（図４）。それと
共に、これらのデータは、天然ｒｈｕ−レプチンと比較して二重ポリエチレング
リコール化レプチンによって達成されるｉｎｖｉｖｏでの薬物動態半減期の極
めて大きな上昇を示している。さらに、このバイオコンジュゲートは、皮下投与
したとき良好な生物学的利用能を持つと思われる。

【００７９】実施例６２０ｋＤａモノポリエチレングリコール化レプチンの投与により、近位微小管
上皮内の腎空胞の蓄積が認められ、これは用量依存的である。空胞形成を誘発す
るのに必要な用量は治療用量を大きく上回っており、重度の空胞形成でも腎機能
障害を引き起こすことはないと思われるが、この明らかな毒性は有害であるとみ
なされる。二重ポリエチレングリコール化レプチンのデザインに適用されるひと
つの仮説は、レプチンの反対側の末端にある２個の独立したポリマーの力学特性
が、コンジュゲートの総流体力学容量を増加させ、ポリマーの崩壊、従って腎微
小管の浸透に抵抗するというものであった。

【００８０】この試験では、体重１８−２１ｇの成体（８−１２週齢）雌性Ｃ５７ＢＬ／６
マウスに緩衝液（ＰＢＳ）、２０ｋＤａモノＰＥＧ−レプチン、２０ｋＤａ二重
ポリエチレングリコール化レプチンあるいは３０ｋＤａ二重ポリエチレングリコ
ール化レプチンのいずれかを投与した。各々の製剤を２．５ｍｇ／ｋｇ／日ある
いは１０ｍｇ／ｋｇ／日の皮下注射によって７日間投与するか、あるいは１０ｍ
ｇ／ｋｇを単回投与してその後７日間の回復期間をおいた。７日目に各投与群か
ら３匹の動物を剖検し、コンジュゲートが誘発する空胞形成の度合を評価するた
め腎臓を組織学的検査に供した。図５は、二重ポリエチレングリコール化レプチ
ンが、有効用量より３０−４５倍高いレベルでも、２０ｋＤａモノポリエチレン
グリコール化レプチン対照と比較して腎空胞を誘発する傾向が劇的に低いことを
示している。この所見は、二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジ
ュゲートが実際にはモノポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートの２
−３倍のＰＥＧ総量／投与を供給送達することを考慮すると特に著明である。さ
らに、図３および４に示されている、二重ポリエチレングリコール化レプチンバ
イオコンジュゲートに関して認められた薬物動態の延長は、これらのコンジュゲ
ートがモノポリエチレングリコール化レプチンコンジュゲートに比べて毎日の投
与スケジュールにおいてかなりの蓄積を生じることを示唆する。

【００８１】実施例７この実施例は、二重ポリエチレングリコール化レプチンとモノポリエチレング
リコール化レプチンを週に１回の投与レジメンで比較した試験について述べる。
０、７、１４および２１日目に２５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ
／ｋｇの２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチン、あるいは２５ｍｇ
／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇの２０ｋＤａモノポリエチレングリコール化レプチ
ンをマウスに皮下投与した。緩衝液対照と比較した体重減少を４４日間にわたっ
てモニターした。

【００８２】図６のデータは、週に１回の投与レジメンで適用したとき、モノポリエチレン
グリコール化レプチンと比べて二重ポリエチレングリコール化レプチンに関する
約１０倍の用量低下を示している。これらのデータは図３および４に示す薬物動
態データと一致し、また二重ポリエチレングリコール化レプチンが実質的な体重
減少（〜２０％）を誘発し、維持できることを明らかにしている。

【００８３】実施例８この実施例は、モノポリエチレングリコール化レプチン製剤と比較して二重ポ
リエチレングリコール化レプチン製剤に関連した腎病変をさらに評価するために
デザインされた試験を述べる。

【００８４】体重１８−２１ｇの成体（１２週齢）雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、対照群を
除いて、週に１回３週間にわたってレプチン製剤の皮下注射を実施し、対照群に
はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を与えた。

【００８５】最後の注射の日に剖検を行い、その際肝と腎を肉眼的異常について検査して、
その後中性緩衝１０％ホルマリンに液浸した。固定後、腎臓、肝臓、リンパ節お
よび脾臓を段階的アルコール中で脱水し、キシレンで浄化して、パラフィンに包
埋した。各々の器官について、各群から３匹のマウスについて１個の組織ブロッ
クを一緒に処理して、各動物につき１つの切片を作製した。

【００８６】６μｍの厚さの切片をヘマトキシリンとエオシン（ＨＥ）で染色し、多数の領
域を４０×、１０×および４００×の倍率で検査した。肝、リンパおよび脾マク
ロファージならびに腎微小管上皮における細胞質空胞変性の重症度を、５段階ス
ケールを用いて半定量的に等級づけた：±＝疑わしい（非常にまれ、ごくわずか
な細胞に小さな空胞）；１＋＝極微（まれ、一部の細胞に小さな空胞）；２＋＝
軽度（直径〜３μｍの控え目な数の空胞）；３＋＝中等度（直径〜３μｍから〜
５μｍの多数の空胞）；あるいは４＋＝著明（直径＞５μｍの大きな無数の融合
した空胞）。まれなケースとして、空胞が存在するが極めてまれである場合には
、疑わしい（±）等級を適用した。このスケールは、組織切片全体での病変の度
合と、個々の機能単位（たとえば１つの尿細管）についての病変の重症度の評価
を結合するものである。

【００８７】試験の結果を図７に示す。２０ｋＤａモノポリエチレングリコール化レプチン
（陽性対照）の初回投与は、多数の近位尿細管の大部分の上皮細胞において中等
度（３＋）の病変（無数の小さな透明の細胞質空胞から成る）を生じさせた。こ
の変性の重症度は、その後の注射と共に著明（４＋）へと上昇した。１又は３週
間の回復期間後、腎上皮は、数はわずかに少ないがはるかに大きな空胞を含んで
いた。

【００８８】すべての用量の２０ｋＤａ二重ポリエチレングリコール化レプチンが、実験期
間中のいくつかの時点で近位尿細管において非常な極微（±）から軽度（２＋）
の空胞形成を生じさせた。３週間の治療期間中、空胞は一般に小さく、細胞内に
単独で又は対として、通常は先端の位置に発生した。大部分が核上細胞質に位置
しており、正常な生理的構造として多くの腎細管細胞中に存在するごく小さな空
胞（おそらくエンドサイトーシスによって）の先端線からは分離されていた。空
胞形成の度合はどの時点においても用量依存的であった。１０ｍｇ／ｋｇ用量に
関してはすべての時点で極微（１＋）数の空胞が認められたが、２．５ｍｇ／ｋ
ｇ用量については３回目の注射後にのみ極めて小さな病変（±）が発生した。軽
度（２＋）の分類は２５ｍｇ／ｋｇ用量に関して２回目の注射後に認められ、試
験の残りの期間を通じて持続した。２．５ｍｇ／ｋｇ用量では、病変は１週間以
内に完全に後退した。１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ用量では、回復期間
中に空胞の数がわずかに減少して個々の空胞が大きくなり、空胞とそれらの内容
物がより大きな空胞あるいは沈着物へと癒合したことを示唆している。

【００８９】図７のデータは、二重ポリエチレングリコール化レプチンがモノポリエチレン
グリコール化レプチンに比べて有意に少ない腎空胞蓄積を示すことを明らかにし
ている。

【００９０】いずれのレプチン化合物も（陽性対照物質を含めて）、２．５、１０あるいは
２５ｍｇ／ｋｇ用量での３週間にわたる週１回投与後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの
肝臓、リンパ節あるいは脾臓のマクロファージにおいて空胞を誘発しなかった。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスに０．１−１０ｍｇ／ｋｇタンパク質を皮下投与により７日間毎日投与
したモデルでの様々なレプチン用量反応曲線を示すグラフである。

【図２】マウスに各々の製剤１０ｍｇ／ｋｇを単回皮下注射によって投与したモデルで
の、種々のレプチン製剤が単回投与で誘発する体重減少パーセンテージを示すグ
ラフである。

【図３】３ｍｇ／ｋｇの単回用量を静脈内注射した後のマウスにおける２０ｋＤａ二重
ポリエチレングリコール化レプチンについての薬物動態プロフィールを示すグラ
フである。

【図４】３ｍｇ／ｋｇの単回用量を皮下注射した後のマウスにおける２０ｋＤａ二重ポ
リエチレングリコール化レプチンについての薬物動態プロフィールを示すグラフ
である。

【図５】種々のレプチン製剤に関する腎空胞スコアの比較を示す棒グラフである。

【図６】０、７、１４および２１（ｘ）日目に種々の用量の様々なレプチンコンジュゲ
ート製剤を用いて皮下投与したあとに得られた体重減少％を示すグラフである。

【図７】様々なレプチン製剤に関する腎空胞スコアの比較を示す棒グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者キンストラー，オーラフアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、ニユーベリー・パーク、ビア・リンダ・ 641 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA04 GA25 HA01 4C084 AA02 AA07 BA37 BA42 BA44 CA23 DC50 NA02 NA11 ZA702 ZC332 ZC352 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA30 EA20 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】部位特異的に２つの位置でレプチン部分に結合した２個のポ
リエチレングリコール部部分を含む二重ポリエチレングリコール化レプチンバイ
オコンジュゲート。
【請求項２】前記レプチン成分が（配列番号１のアミノ酸配列に従って）（ａ）任意に２８位のグルタミニル残基を欠き、さらに任意にＮ末端にメチオ
ニル残基を持つ、配列番号１のアミノ酸配列；（ｂ）４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６
７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１
０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２およ
び１４５の位置の１つ又はそれ以上において置換された異なるアミノ酸を持つ（
ａ）項のアミノ酸配列；（ｃ）１００および１３８位のアミノ酸がＧｌｎで置換されている（ｂ）項の
アミノ酸配列；（ｄ）（ｉ）アミノ酸９８−１４６（ｉｉ）アミノ酸１−９９および１１２−１４６（ｉｉｉ）アミノ酸９９から１１２の間に連続的に位置するアミノ酸１００
−１１１の１つ又はそれ以上を持つ、アミノ酸１−９９および１１２−１４６；（ｉｖ）もうひとつ別のアミノ酸で置換されたアミノ酸１００、１０２、１
０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１
４２および１４５の１つ又はそれ以上を持つ、（ｉ）項のトランケートされたレ
プチンアナログ；（ｖ）もうひとつ別のアミノ酸で置換されたアミノ酸４、８、３２、３３、
３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、
７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１
つ又はそれ以上を持つ、（ｉｉｉ）項のトランケートされたレプチンアナログ；（ｖｉ）もうひとつ別のアミノ酸で置換されたアミノ酸４、８、３２、３３
、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７
、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１
１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１つ又はそれ以上
を持つ、（ｉｖ）項のトランケートされたレプチンアナログ；（ｖｉｉ）Ｎ末端にメチオニル残基を持つ（ｉ）−（ｖｉ）項のいずれかの
トランケートされたレプチンアナログ；の中から選択される、トランケートされたレプチンタンパク質アナログ：（ｅ）１つ又はそれ以上の保存されたアミノ酸置換を持つ（ａ）−（ｄ）項の
いずれかのレプチンタンパク質から成る群から選択される、請求項１に記載の二重ポリエチレングリコール化レ
プチンバイオコンジュゲート。
【請求項３】前記ポリエチレングリコール部分が約２０ｋＤａから約４０
ｋＤａの分子量を持つ、請求項１に記載の二重ポリエチレングリコール化レプチ
ンバイオコンジュゲート。
【請求項４】（ａ）前記タンパク質のアミノ酸内の特定アミノ酸位置にシ
ステイン残基を導入して、前記タンパク質のアナログを提供すること；（ｂ）前記システイン残基の位置でポリエチレングリコールを前記アナログに
複合し、モノポリエチレングリコール化タンパク質コンジュゲートを提供するこ
と；（ｃ）前記コンジュゲートのＮ末端に第二のポリエチレングリコールを複合し
、二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートを提供するこ
と；及び（ｄ）前記二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオコンジュゲートを
採集することを含む方法によって生成される二重ポリエチレングリコール化タンパク質バイオ
コンジュゲート。
【請求項５】医薬上許容される担体中に請求項１−３のいずれかに記載の
二重ポリエチレングリコール化レプチンバイオコンジュゲートを含む医薬組成物
。
【請求項６】請求項１−３のいずれかに記載の二重ポリエチレングリコー
ル化レプチンバイオコンジュゲートの有効量を投与することを含む、肥満、糖尿
病および高脂血症の中から選択される状態のための個体の治療方法。