HU225918B1

HU225918B1 - Combination of atovaquone with proguanil for the treatment of protozoal infections and p. carinii

Info

Publication number: HU225918B1
Application number: HU9501537A
Authority: HU
Inventors: Victoria Susan Latter; Winston Edward Gutteridge; David Brian Ashton Hutchinson; Mary Pudney
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1992-11-26
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 2007-12-28
Also published as: US5998449A; CN1087935C; AP9300592A0; ATE191340T1; SK281559B6; CA2150234E; GB9224739D0; HU9501537D0; BG62595B1; SA93140434B1; PL174323B1; CZ289692B6; DK0670719T3; CZ289171B6; TW253835B; EP0670719A1; HUT71346A; NO951995D0; AU685408B2; DE69328307T2

Description

A jelen találmány 2-[4-(4-klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4-naftokinon (atovaquon) és 1-(p-klór-fenil)-5-izopropil-biguanid (proguanil) szinergista kombinációra vonatkozik, amelyek parazitaellenes hatásúak. Továbbá a találmány tárgyát képezi a fenti kombinációk alkalmazása protozoa által okozott parazitafertőzések, így malária és toxoplazmózis és Pneumocystis carinii által okozott fertőzések kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmények előállítására.

A 2-[4-(4-klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4-naftokinont már korábban, például a 123,238 számú európai szabadalmi leírásban ismertették. A leírás olyan (I) általános képletű 2-helyettesített-3-hidroxi-1,4-nafto-kinonokra és gyógyászatilag elfogadható sóikra vonatkozik, amelyek képletében

R¹ hidrogénatom és

R² 1-6 szénatomos alkoxicsoport, aralkoxicsoport, (1-6 szénatomos alkil)-(1—6 szénatomos alkoxi)csoport, fenilcsoport, amely egy vagy két halogénatommal vagy 1-6 szénatomos alkilcsoporttal helyettesített, halogénatom vagy perhalogén(1-6 szénatomos alkil)-csoport, vagy

R¹ és R² mindegyike 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy fenilcsoport, és n értéke 0 vagy 1.

A vegyületekről azt mondják, hogy protozoaellenes hatásúak. Speciálisan azok az (I) általános képletű vegyületek, amelyekben n értéke 0, a humán malária parazita Plasmodium falciparum ellen és Eimeria fajok, így az E. tenella és E. acervulina ellen hatásosak, amelyek kokcidiózist okozó organizmusok, és az olyan (I) általános képletű vegyületek, amelyekben n értéke 1, a Theileria nemzetséghez tartozó, különösen a T. annulata vagy T. parva protozoákkal szemben hatásosak. A megnevezett és példában bemutatott vegyületek között van az az (I) általános képletű vegyület, amelyben n értéke 0, R jelentése hidrogénatom és R² jelentése 4-klór-fenil-csoport, azaz az atovaquon.

A proguanil a malária megelőzésére, de nem a kezelésére használható jól ismert szer. Egyike a legbiztonságosabb maláriaellenes gyógyszereknek, és fiatal gyerekeknek és terhes nőknek is adható. Azonban megjelent a proguanilra rezisztens P. falciparum, különösen Délkelet-Ázsiában, és ez egyre nagyobb gondot okoz.

A gyógyszer-rezisztencia legyőzésére állandó gyakorlattá válik egynél több antimaláriás szer kombinációjának használata, amelyeket vagy egyidejűleg vagy egymást követően adagolnak. Azonban sok ilyen kombináció antagonista, ami abban mutatkozik meg, hogy a kezelés kevésbé hatásos; és a dózisok adagolásának rendje gyakran bonyolult, ami annak a valószínűségét növeli, hogy a betegek nem tudják a kezelést elvégezni. Ennek megfelelően a jelen találmány célja olyan antimaláriás szerekből álló kombináció rendelkezésre bocsátása, amely nem antagonista és amely nem igényel bonyolult adagolási rendet.

Meglepő módon azt találtuk, hogy vagy egyidejűleg vagy egymást követően atovaquont, amely a (II) képlettel jellemezhető,

és proguanilt kombinálunk 1:2-1:3 arányban parazitaellenes és különösen maláriaellenes hatás érhető el. Emellett a (II) képletű vegyület és proguanil potencírozó kombinációja egyszerűen, egyetlen gyógyászati készítmény formájában előállítható.

A találmány továbbá atovaquont bocsát rendelkezésre gyógyszer előállítására való alkalmazásra, amely vagy proguanillel egyidejűleg vagy azt követően adagolva protozoa parazita által okozott fertőzés, például malária vagy toxoplazmózis vagy P. carinii által okozott fertőzés kezelésére és/vagy megelőzésére emlősökben, ezen belül emberekben.

A „potencírozó arány kifejezés arra utal, hogy az atovaquon és a proguanil olyan arányban van jelen, amelyben a kombináció parazitaellenes hatása nagyobb, mint akár az atovaquoné akár a proguanilé önmagában, vagy mint az egyes komponensek aktivitását figyelembe véve a kombináció megjósolható additív aktivitása lenne. így az egyes komponensek szinergetikusan hatnak a kombinációban, amennyiben potencírozó arányban vannak jelen.

Az atovaquon hidroxilcsoportja megfelelő bázisokkal sókat képezhet, és az atovaquon fiziológiásán elfogadható sói a szervetlen bázisokkal alkotott sók, így alkálifém-, például nátrium- vagy káliumsók és alkáliföldfém-, például kalciumsók; szerves bázissal alkotott sók, például a fenil-etil-benzil-amin-, dibenzil-etilén-diamin-, etanol-amin- és dietanol-amin-só; és aminosavakkal, például a lizinnel és az argininnel alkotott sók.

A (II) képletű vegyület cisz- vagy transz-izomer formájában létezhet, azaz a ciklohexilcsoporthoz a naftokinon mag és a klór-fenil-csoport cisz- vagy transzhelyzetben kapcsolódhat. Mind a cisz-, mind a transzizomer, mind pedig azok bármilyen arányú keveréke használható a találmány szerint. Általában, amikor a vegyület izomerkeverék formájában van, a transz-izomer kb. 50%-ot képvisel, vagy ez a domináns izomer,

HU 225 918 Β1 de azon elegyek alkalmazása is a találmány körébe tartozik, amelyekben a cisz-izomer dominál. Az izomerek speciális aránya szükség szerint variálható; jellemző keverékek azok, amelyekben a cisz/transz izomerek aránya kb. 1:1, 40:60 és 5:95. A találmány szerinti alkalmazás szempontjából a (II) képletű vegyület transzizomer formája vagy a cisz/transz izomerek olyan keveréke előnyös, amelynek legalább 95%-a, például 99%-a transz-izomer.

A (II) képletű vegyület tautomer formában is előfordulhat, amelyben a hidroxilcsoport a protonját az egyik oxocsoportnak adja, és az ilyen tautomer formák alkalmazása is a találmány körébe tartozik. Azt gondoljuk azonban, hogy a (II) képletnek megfelelő forma a stabil.

Az atovaquon és proguanil kombinációjának parazitaellenes szerként hatásos mennyisége természetesen változó és végső soron a humán- vagy állatorvos megítélésétől függ. A figyelembeveendő tényezők többek között az adagolás módja, a készítmény természete, az emlős testtömege, kora és általános állapota és a kezelendő betegség természete és súlyossága. Általában az embernek malária kezelésére beadandó hatásos dózis 2,0 mg és 30 mg közötti mennyiségű proguanil/kg testtömeg/nap és 0,5 mg és 30 mg közötti mennyiségű atovaquon/kg testtömeg/nap, például 3-20 mg/kg/nap proguanil és 1-20 mg/kg/nap atovaquon, különösen 5-15 mg/kg/nap proguanil és 3-15 mg/kg/nap atovaquon.

A malária megelőzésére alkalmas hatásos dózis ember esetében 3-20 mg/kg/hét proguanil és ugyanennyi atovaquon, például 6 mg/kg/hét és 10 mg/kg/hét közötti mennyiségű proguanil és ugyanennyi atovaquon.

Természetesen a fentebb említett dózisok magukra a hatóanyagokra vonatkoznak.

A találmány szerinti alkalmazásra az atovaquont és a proguanilt előnyösen gyógyászati készítmény formájában állítjuk elő.

A gyógyászati készítmények a hatóanyagot, amely az atovaquon és a proguanil kombinációja, egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval és adott esetben más gyógyhatású és/vagy megelőző komponenssel együtt tartalmazzák. Az egy vagy több hordozónak elfogadhatónak, azaz a készítmény más komponenseivel összeférhetőnek és a recipiens egészségére ártalmatlannak kell lennie.

Ennek megfelelően a találmány tárgyát olyan gyógyászati készítmény is képezi, amely atovaquon és proguanil kombinációját egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt tartalmazza.

A jelen találmány kiterjed gyógyászati készítmények előállítására is, amely abban áll, hogy az atovaquon és proguanil kombinációját egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval társítjuk.

Az atovaquon és proguanil kombinációját kényelmesen egységdózis-formájú gyógyászati készítménnyé alakítjuk. Egy kényelmes egységdózis-készítmény a hatóanyagok mindegyikének 10 mg és 3 g, például 50 mg és 3 g közötti mennyiségeit tartalmazza.

Egy jellemző egységdózis például 500 mg atovaquont és 200 mg proguanilt tartalmaz.

A gyógyászati készítmények orális, topikális, így dermális, bukkális és szublinguális, rektális és parenterális, így szubkután, intradermális, intramuszkuláris és intravénás, valamint orr-gyomor csövön keresztül történő adagolásra alkalmasak lehetnek. A készítmények - ahol megfelelő - diszkrét dózisegységek formájában és bármely, a gyógyszerészet területén jól ismert módszerek bármelyikével készülhetnek. Ezen módszerek mindegyike magában foglalja a hatóanyagok folyékony vagy finom eloszlású szilárd vagy mind a kétféle hordozóval való társítását és azután, amennyiben szükséges, a terméknek a kívánt alakra történő formálását.

Az orálisan adagolható olyan készítmények, amelyekben a hordozó szilárd, legelőnyösebben egységdózis, így bolusz, kapszula vagy tabletta formájában készülnek, ezek mindegyike a hatóanyagok egy előre meghatározott mennyiségét tartalmazza. A tabletta készülhet préseléssel vagy öntéssel, adott esetben egy vagy több segédanyag alkalmazásával. A préselt tablettákat úgy állíthatjuk elő, hogy egy alkalmas gépben a szabadon folyó formában, így por vagy granulátum formájában levő hatóanyagokat adott esetben kötőanyaggal, kenőanyaggal, közömbös hígítóanyaggal, síkosítóanyaggal, felületaktív vagy diszpergálószerrel keverjük. Az öntött tablettákat úgy állíthatjuk elő, hogy egy közömbös folyékony hígítóanyagban öntjük. A tablettákat adott esetben bevonjuk, vagy ha nem vonjuk be, adott esetben törőrovátkával látjuk el. A kapszulákat úgy készítjük, hogy a hatóanyagokat vagy önmagukban vagy egy vagy több segédanyaggal együtt kapszulahéjba töltjük és azután azokat a szokásos módon lezárjuk. A levélkék a kapszulákhoz hasonlítanak; ez esetben a hatóanyagokat és a segédanyagokat rizspapírból készült borítékba zárjuk. A (II) képletű vegyület és a proguanil kombinációját diszpergálható granulátumba is foglalhatjuk, amelyet beadás előtt például vízben szuszpendálhatunk vagy az ételre szórhatunk. A granulátumot például levélkébe is csomagolhatjuk. Az olyan orálisan adagolható készítmények, amelyekben a hordozó folyékony, vizes vagy nemvizes folyadékkal készült oldatok vagy szuszpenziók vagy „olaj a vízben” folyékony emulziók lehetnek.

Az orálisan adagolható készítmények szabályozott hatóanyag-leadású dózisformák, például olyan tabletták alakjában is előállíthatók, amelyekben a hatóanyagokat egy alkalmas leadást szabályozó mátrixban formáljuk, vagy megfelelő hatóanyag-leadást szabályozó filmmel vonjuk be. Az ilyen készítmények különösen kényelmesek a megelőző alkalmazás céljára.

A hatóanyagokból orr-gyomor csövön keresztül adagolható oldatot vagy szuszpenziót is készíthetünk.

Azokat a rektális adagolásra alkalmas készítményeket, amelyekben a hordozó szilárd anyag, legelőnyösebben egységdóziskúpok formájában állítjuk elő. Megfelelő hordozók többek között a kakaóvaj vagy a szakterületen általánosan használt más anyagok. A kúpokat úgy készíthetjük, hogy a hatóanyag-kombinációt

HU 225 918 Β1 a meglágyított vagy olvasztott hordozókkal összekeverjük, majd hűtjük és formába öntjük.

A parenterálisan adagolható gyógyászati készítmények a hatóanyag-kombináció vizes vagy olajos hordozóval készült steril oldatai vagy szuszpenziói lehetnek. Az injektálható készítmények boluszinjekció vagy folyamatos infúzió céljára is készülhetnek. Az ilyen készítményeket egységdózist vagy több dózist tartalmazó tartályokban szereljük ki, a tartályokat a készítmény betáplálása után lezárjuk és felhasználásig zárva tartjuk. Más esetben a hatóanyagok por formájúak is lehetnek. Ezt a port megfelelő vivőanyaggal, például steril, pirogénmentes vízzel a felhasználás előtt oldatba vihetjük.

Az atovaquon és proguanil kombinációjából nyújtott hatású depókészítményt is előállíthatunk, amelyet intramuszkuláris injekció vagy például szubkután vagy intramuszkuláris implantátum formájában adhatunk be. A depókészítmények például alkalmas polimer vagy hidrofób anyagokat vagy ioncserélő gyantákat tartalmazhatnak. Az ilyen nyújtott hatású készítmények különösen kényelmesen használhatók megelőzésre.

Természetesen a fentebb említett hordozó komponensek mellett az előzőekben leírt, különféle módon adagolható gyógyászati készítmények amennyiben alkalmas, egy vagy több további hordozó komponenst, így higítóanyagokat, puffereket, zamatanyagokat, kötőanyagokat, felületaktív szereket, sűrítőanyagokat, kenőanyagokat, konzerválószereket, ezen belül antioxidánsokat és hasonlókat, valamint olyan anyagokat tartalmazhatnak, amelyek a készítményt a recipiens vérével izotóniássá teszik.

Állatgyógyászatban az orális, parenterális és az intrarumenális adagolásra alkalmas készítmények használhatók.

Az atovaquon előállítási eljárásait a 123,238 számú európai szabadalmi leírásban ismertetik, egy speciális módszert az 1. példában mutatunk be.

1. példa

2-[transz-4-(Klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4naftokinon

a) 4-(4-Klór-fenil)-ciklohexán-1-karbonsav g acetil-kloridot és 60 g finoman porított alumínium-kloridot 120 ml szén-diszulfidban összekeverünk, és azután az elegyet szén-dioxid/oxitol fürdőben -50 °C-ra hűtjük. 30 g, előzőleg -50 °C-ra hűtött ciklohexánt csepegtetünk 10 perc alatt a fenti elegyhez, miközben a reakcióelegy hőmérsékletét -20 °C alatt tartjuk. Az elegyet -50 °C-on további 60 percig keverjük, majd az oldószert dekantáljuk, így gumiszerű narancsszínű komplexet kapunk. Ahogy az anyag környezeti hőmérsékletre melegedett, egy kis klór-benzolt adunk hozzá; azután az összesen 300 ml klór-benzol maradékát adjuk az elegyhez, és a kapott oldatot 3 órán át keverés közben 40 °C-on melegítjük. Ezt követően jég és tömény sósav elegyébe öntjük, a szerves réteget elválasztjuk, 2 mólos sósavval, 2 mólos nátrium-hidroxid-oldattal és vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. A terméket vákuumban desztilláljuk, a 133,3 Pa nyomáson 140-156 °C-on forró frakciót összegyűjtjük, azonos térfogatú 40-60 °C-on forró petroléterrel hígítjuk, -6 °C-ra hűtjük és folyamatosan nitrogéngázt buborékoltatunk át rajta, majd a kivált színtelen szilárd anyagot elkülönítjük.

6,2 g nátrium-hidroxid 42 ml vízzel készült 0 °C-ra hűtött oldatához 2,8 ml brómot adunk. A fentebb előállított helyettesített hexahidroacetofenonból 3,1 g-ot 15 ml dioxánban oldunk, és a hideg hipobromit-oldatot hozzáadjuk, miközben a reakcióelegy hőmérsékletét 20 °C alatt tartjuk. A reakcióelegyet környezeti hőmérsékleten 6 órán át keverjük, majd egy éjszakán át állni hagyjuk. A hipobromit feleslegének elbontására nátrium-metabiszulfitot adunk az elegyhez, amelyet azután hűtünk és savanyítunk. Színtelen szilárd anyag válik ki, amelyet kiszűrünk, vízzel mosunk és szárítunk, majd etanolból átkristályosítunk. így 4-(4-klór-fenil)-ciklohexán-1-karbonsavat kapunk, amely 254-256 °C-on olvad.

b) 2-[4-(4-Klór-fenil)-ciklohexil]-3-klór-1,4-naftokinon

3,95 g (0,02 mól) 2-klór-1,4-naftokinon, 4,9 g (0,02 mól) 4-(4-klór-fenil)-ciklohexán-1-karbonsav és 1,05 g (0,0062 mól) porított ezüst-nitrát elegyét élénk keverés közben 40 ml acetonitrilben visszafolyatás közben forraljuk. 12,0 g (0,0525 mól) ammónium-perszulfát 50 ml vízzel készült oldatát csepegtetjük hozzá 1 óra alatt. Ezután az elegyet 3 órán át visszafolyatás közben forraljuk, majd jégben 30 percig hűtjük és azután szűrjük. A maradék ragacsos szilárd anyagot két alkalommal forró kloroformmal extraháljuk a szervetlen anyag eltávolítására. A kloroformot lepárlással eltávolítjuk, ekkor kb. 2,7 g sárgásbarna szilárd anyag marad vissza. Ezt 40 ml forró acetonitrilben oldjuk, a kevés oldhatatlan anyagot szűréssel eltávolítjuk. Hűtésre a cím szerinti vegyület sárga kristályok (550 mg) formájában válik ki, olvadáspont 172-175 °C.

NMR (d₆-DMSO) δ: 8,05 (2H, m, β-naft.), 7,85 (2H, m, a-naft.); 7,30 (4H, s, PhH); 3,30 (1H, széles t, CH); 2,67 (1H, széles t, CH); 1,2-2,4 (8H, m, 4x2CH₂).

c) 2-[4-(4-Klór-fenll)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4-naftokinon

A b) lépés termékét 10 ml forró metanolban szuszpendáljuk, és 0,55 g kálium-hidroxid 5,5 ml vízzel készült oldatát csepegtetjük hozzá 15 perc alatt. A keveréket visszafolyatás közben addig (kb. 6 órán át) forraljuk, amíg sötétvörös oldat képződik. Ekkor 2 ml tömény sósavat adunk az oldathoz óvatosan, cseppenként. Az elegyet hűtjük és szűrjük, és a szilárd maradékot vízzel alaposan mossuk. A vizes mosóleveket ismét megsavanyítjuk és szüljük. Az egyesített szilárd maradékot (500 mg), amely 200-209 °C-on olvad, acetonitrilböl átkristályosítjuk, így a cím szerinti terméket 300 mg transz-izomer formájában kapjuk, amelynek olvadáspontja 216-219 °C.

2. példa

A következő példák a szokásos gyógyászati készítményeket mutatják be, amelyek a találmány szerint alkalmazhatók.

I

HU 225 918 Β1 ]

A) Filmbevonatú tabletta

Mag:

1. példa szerinti vegyület

Proguanil-hidroklorid

Mikrokristályos cellulóz (Avicel PH101) Hidroxi-propil-cellulóz, L-sub (LHPC.LHII) Nátrium-keményítő-glikolát (Explotab) Povidon K30

Magnézium-sztearát

Kompressziós tömeg

Bevonat:

Polimer diszperzió (hidroxi-propil-metilcellulóz és titán-dioxid és polietilénglikol 400 és színezőanyag) Fényezőszer:,

Polietilénglikol 8000 összes tömeg:

B) Diszpergálható filmbevonatú tabletta Mag:

1. példa szerinti vegyület

Proguanil-hidroklorid

Mikrokristályos cellulóz (Avicel PH101) Hidroxi-propil-cellulóz, Lo-sub (LHPC, LH11)

Nátrium-keményítő-glikolát (Explotab)

Povidon K30

Magnézium-sztearát

Nátrium-alumínium-szilikát (Veegum F)

Nátrium-szacharin

Kompressziós tömeg:

Bevonat:

Polimer diszperzió (hidroxi-propilmetil-cellulóz és titán-dioxid és polietilénglikol 400 és színezőanyag) Fényezőszer:

Polietilénglikol 8000

Összes tömeg:

mg mg 1012 mg

Biológiai vizsgálati eredmények

3. példa

Hatóanyag-kölcsönhatások összehasonlítása az 1. példa szerinti vegyület más maláriaellenes szerekkel alkotott kombinációiban

Az in vitro hatóanyag-érzékenységi vizsgálatokat Desjardins [Desjardin és munkatársai, Antimalarial Agents and Chemotherapy 1979; 16(6) 710-718] félautomata eljárásával végeztük. Ebben a rendszerben a maláriaellenes hatást annak alapján értékeljük, hogy a hatóanyag növekvő koncentrációja mellett mennyire gátolt a radiojelzett hipoxantin beépülése a parazitákba.

A vizsgálandó maláriaellenes szereket vízben, 95%-os etanolban vagy dimetil-szulfoxidban oldottuk; a vízzel készült hatóanyagoldatot 95%-os etanollal 1:1 arányban hígítottuk. A hatóanyagoldatokat azután 10% humán szérumot tartalmazó táptalajjal hígítottuk a becsült IC₅₀ koncentrációk kb. 20-50-szeresének megfelelő kiindulási koncentrációkig. A vizsgált hatóanyagok és oldószereik a következők voltak:

500 mg 200 mg 130 mg mg 30 mg 36 mg 5 mg

1000 mg mg mg 1022 mg

500 mg 200 mg 100 mg mg 40 mg 20 mg mg 50 mg mg 1000 mg

Hatóanyag	Kezdeti oldószer	Táptalaj
1. példa szerinti vegyület	DMSO	1640
Kinin	Etanol-víz	1640
Klorokin	Víz-etanol	1640
Meflokin	Etanol-víz	1640
Primakin	Etanol-víz	1640
Arteszunát	Etanol-víz	1640
PM443	DMSO	1640
Tetraciklin	DMSO	1640
Norfloxacin	DMSO	1640
Ciprofloxacin	DMSO	1640
Proguanil	Etanol-víz	Lo-folát
Cikloguanil	Etanol-víz	Lo-folát
Pirimetamin	DMSO	Lo-folát
Trimetoprim	DMSO	Lo-folát
Szulfametoxazol	DMSO	Lo-folát
Dapszon	DMSO	Lo-folát
Klopidol	DMSO	Lo-folát
Allopurinol	Etanol-víz	Lo-folát
PS-15	DMSO	Lo-folát
WR99210	DMSO	Lo-folát

A hatóanyag-kombinációk tanulmányozására a kiindulási koncentrációjú oldatokat különféle (1:5, 1:2, 2:1 és 5:1) arányokban elegyítettük. A hatóanyagoldatokat és a kombinációkat ezután egy 96 mérőhelyes mikrotiterlemezre vittük, az 1. példa szerinti vegyületet, a kombinált hatóanyagot és a két hatóanyag négy kombinációját kétszeres ismétlésben. A hatóanyagokból 1:3 arányú sorozathígítást készítettünk a közeggel, ezzel töltöttük ki a 96 mérőhelyet egy 12 csatornás pipetta segítségével. A dihidrofolsav reduktáz (DHFR) gátlók közé sorolt vegyületek értékelésére módosított táptalajt használtunk, amely a folsavat és a PABA-t csak fiziológiás koncentrációkban tartalmazta.

A fennmaradó biológiai eljárásokat a Desjardins technikának megfelelően végeztük, azzal az eltérés45 sel, hogy három P. falciparum törzset (több hatóanyaggal szemben rezisztens W-2-klónt, hatóanyag-érzékeny, de meflokinnel szemben rezisztens D-6 kiónt és 1. példa szerinti vegyületre érzékeny C2B izolátumot) használtunk, és az inkubálást 72 órára hosszabbítottuk meg.

Az egyedi IC₅₀-értékeket a Micromath Scientific Software-től származó „MINSQ” programm segítségével számítottuk. Minden páros adatsort a Desjardins által alkalmazott hiperbolikus tangens függvénybe he55 lyettesítettünk.

Az IC₅₀-értékeket oly módon normalizáltuk, hogy az 1. példa szerinti vegyület IC₅₀-értékét 1 -nek vettük, és a többi, kombinált hatóanyaghoz arányos normalizált értékeket rendeltünk a tanulmányozott két hatóanyag minden aránya esetében. Izobologramot szerkesztet5

HU 225 918 Β1 tünk az adatoknak az alábbi egyenletbe való helyettesítésével:

Xi

Y=1---!Xi+e'*{1-Xi) aholYj= az 1. példa szerinti vegyület IC₅₀-értéke, amikor másik hatóanyaggal kombináljuk;

X, = a másik hatóanyag IC₅₀-értéke, amikor az 1. példa szerinti vegyülettel kombináljuk;

I = a kölcsönhatási paraméter, amely az átfordulás mértékére utal.

Az I értéket minden kombinációra kiszámítottuk. A pozitív I értékek szinergetikus kombinációra, a negatív értékek antagonitzmusra utaltak és az l=0 esetén a kölcsönhatás additív.

Az eredmények az 1. táblázatban láthatók:

1. táblázat

Az 1. példa szerinti vegyülettel kombinált hatóanyag	I
W-2	D-6	C2B
Kinin	-1,36
Klorokin	-1,84	-1,40
Meflokin	-1,19
Tetraciklin	1,27	1,11	0,02-0,08
Primakin	-0,79
Arteszunsav		-0,18
PM443		-1,28
Norfloxacin	1,02
Ciprofloxacin	-1,22
Pirimetamin	0,36		-0,48
Trimetoprim	1,27		0,58
Proguanil	2,43, 2,88	2,56	2,56
Cikloguanil	2,21	1,66	0,13, -0,73
Allopurinol	1,14	0,43
PS—15	1,77; 0,65; 1,97	-0,74
WR99210	0,02
Szulfametoxazol	2,75
Dapszon	-0,39
Klopidol	2,38; 2,65	0,73

Az eredmények azt mutatják, hogy a 2-[4-(4-klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4-naftokinon és proguanil kombinációi fejtették ki a legegyenletesebb potencírozást a vizsgált más hatóanyag-kombinációkhoz viszonyítva, különösen a hidroxi-naftokinon rezisztens C2B törzzsel szemben.

A proguanillal történő kombinálás optimális arányát mind a három malária parazita törzsre megbecsültük a proguanil IC₅₀-értéke és a (II) képletű vegyület IC₅₀-értéke arányának meghatározásával. Az eredményt a 2. táblázatban adjuk meg.

2. táblázat

	W-2	D-6	C2B
Proguanil: (I) képletű vegyület	920:1 2473:1	4038:1	0,2:1

4. példa

Az 1. példa szerinti vegyület, a proguanil és kombinációik in vivő toxoplazmaellenes hatásának összehasonlítása

A vegyületek és kombinációik hatását T. gondii egér modellben vizsgáltuk, a hatóanyag-aktivitás mértékéül a halál bekövetkezéséig eltelt idő növekedését és az egerek túlélési százalékát választottuk.

Tízes csoportokba osztott 20 gm-os CBA/CA egereket orálisan, szonda segítségével a T. gondii Csg törzs 6 cisztájával megfertőztünk. A hatóanyaggal való kezelést 3 nappal később kezdtük és 10 napig folytattuk. Minden hatóanyagot orálisan, szonda segítségével adtunk be. A következő csoportokat vizsgáltuk: Kontrollok

Atovaquon 10 mg/kg

Atovaquon 25 mg/kg

Proguanil 25 mg/kg

Atovaquon 10 mg/kg+Proguanil 25 mg/kg Atovaquon 25 mg/kg+Proguanil 25 mg/kg

Minden állatot napi két alkalommal, 30 napon át vizsgáltunk, és minden halált feljegyeztünk.

Az eredményeket a 3. és 4. táblázatban foglaljuk össze.

3. táblázat

A halál bekövetkeztéig eltelt idő átlaga (nap)

Atovaquon

	0	10 mg/kg	25 mg/kg
Proguanil	0	14,0	20,1	24,1
(mg/kg)	25	9,0	18,4	29,3

4. táblázat %-os túlélés

Atovaquon

	0	10 mg/kg	25 mg/kg
Proguanil	0	10,0	10,1	10,0
(mg/kg)	25	0,0	0,0	80,0

A halálig eltelt átlagos idő a kontroliegerek esetében 14 nap volt, csak egy állat élte túl a kísérletet (10%). (Lehet, hogy ez az állat nem fertőződött meg az alkalmazott kis inokulum miatt. Az atovaquon önmagában ezt az időt 10 mg/kg dózisban 20,1 napra és 25 mg/kg dózisban 24,1 napra hosszabbította meg, mindkét esetben egyetlen túlélő volt (10%). A proguanil az emberben mutatott kiváló biztonságossága ellenére egérben toxikus. 25 mg/kg dózisban a proguanil a toxicitás jeleit mutatja, 9 napra csökkentve a halálig eltelt átlagos időt, és nincs túlélő. 10 mg/kg atovaquon és

HU 225 918 Β1 mg/kg proguanil kombinációja a halálig eltelt idő átlagát 18,4 napra emeli. 25 mg/kg atovaquon és 25 mg/kg proguanil kombinációja a proguanil toxicitása ellenére is növeli a halálig eltelt időt, és az egerek 80%-a túléli a kísérletet az atovaquon egymagában való adagolásakor tapasztalt minimális 10%-os túléléssel szemben.

5. példa

Az 1. példa szerinti vegyület, a proguanil és kombinációik in vitro toxoplazmaellenes hatásának összehasonlítása

Az in vitro hatóanyag-érzékenységi vizsgálatokat félautomata technikával végeztük, amely a malária esetében használt módszeren alapult [Desjardins és munkatársai, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1979, 16(6) 710-718], azonban a ³[H]-uracil T. gondiiba való szelektív beépülését mértük. Ebben a rendszerben az toxoplazmaellenes hatást a radiojelzett uracil parazitába való beépülésének gátlásaként értékeltük növekedő hatóanyag-koncentrációk mellett.

A hatóanyagokat dimetil-szulfoxidban oldottuk, és 3%-os fötális borjúszérumot tartalmazó táptalajjal hígításokat készítettünk. A hatóanyag-kombinációk tanulmányozásához a kiindulási koncentrációjú hatóanyagoldatokat különféle, 1:1, 1:3 és 3:1 arányban kombináltuk. A hatóanyagoldatokból és kombinációkból 1:2 arányú sorozathígításokat készítettünk, és ezeket párhuzamosan vizsgáltuk egy 96 mérőhelyes lemezen, amelyet előzőleg HeLa sejtekkel és T. gondii RH törzzsel oltottunk be. A hatóanyagok hozzáadása a parazitákkal való beoltás után 2 órával történt, és ezt követően a lemezeket 37 °C-on 24 órán át inkubáltuk. Miután ³[H]uracilt adtunk az elegyhez, az inkubálást 37 °C-on még 8 órán át folytattuk. A meghatározást úgy fejeztük be, hogy a felülúszó folyadékot eltávol ítottuk, a T. gondiH tartalmazó sejteket SDS-ben szétroncsoltuk, és a jelzett fehérjéket TCA-val egy szűrőlapra kicsaptuk. A jelzés beépülését egy Beta-lemez szcintillációs számlálóval mértük. Az uracilbeépülés százalékos gátlását a vegyületekre és a kombinációkra kiszámítottuk, az IC₅₀-értékeket GS1 programmal számoltuk. Az IC₅o-értékeket normalizáltuk oly módon, hogy az 1. képletű vegyület IC₅₀-értékéhez 1-et és a proguanil IC₅₀-értékéhez és a két vizsgált hatóanyag minden arányához normalizált értékeket rendeltünk. Izobologramot szerkesztettünk ezen normalizált IC₅₀-értékeknek egymás függvényében való ábrázolásával. A potencírozást az izobologram vonala alatt levő értékek, az additív hatást a vonalon levő adatok és az antagonizmust a vonal feletti értékek mutatják.

A lemezeket háromszoros ismétlésben készítettük és minden értéket ábrázoltunk.

Az eredmények az 5. táblázatban láthatók.

5. táblázat

Normalizált IC₅₀-ek
Atovaquon	Proguanil	Potencfrozás
0,559278	0,583893	nincs
0,196689	0,614094	van
0,729381	0,253691	van
0,345238	0,527273	van
0,130952	0,6	van
0,233333	0,118182	van
0,404959	0,451538	van
0,229201	0,768462	van
0,244904	0,091538	van

6. példa

Az 1. példa szerinti vegyület, a proguanil és kombinációik in vivő Pneumocystis elleni hatásának összehasonlítása

A vegyületek és kombinációik hatását Pneumocystis pneumonia SCID (severe combined immunodeficiency, súlyos kombinált immunhiány) egér modellben vizsgáltuk.

Az egerek fertőzöttségének szintjét minden csoportban standard tüdőimpressziós kenetek és immunfluoreszcenciavizsgálatokkal mértük. Minden egérhez egy értéket rendeltünk, ahol 0 azt jelenti, nincs fertőzés, és a +4 azt, hogy nagyon erős a fertőzés. Az eredményeket a 6. táblázatban foglaltuk össze.

6. táblázat

Kezelés (p.o.)	Értékelés	Fertőzött egerek száma/vizsgált egerek száma	Átlagérték±SE	A kontroll %-a
0	+1	+2	+3	+4
Kezeletlen kontroll	0	0	0	3	7	10/10	3,70±0,14	100
Atovaquon 50 mg/kg naponta	0	0	5	5	0	10/10	2,50±0,16	68
Atovaquon 25 mg/kg naponta	0	0	1	7	2	10/10	3,10±0,17	84
Proguanil 25 mg/kg naponta	0	0	0	2	8	10/10	3,80±0,13	85

HU 225 918 Β1

6. táblázat (folytatás)

Kezelés (p.o.)	Értékelés	Fertőzött egerek száma/vizsgált egerek száma	Átlagérték±SE	A kontroll %-a
0	+1	+2	+3	+4
Atovaquon+proguanil 50+25 mg/kg naponta	5	4	1	0	0	5/10	0,50±0,21	14
Atovaquon+proguanil 25+25 mg/kg naponta	1	0	4	4	0	8/9	2,22±0,31	60

Amikor az atovaquont egyedül adagoltuk, csökkentette a fertőzés mértékét. A proguanil önmagában 25 mg/kg/nap dózisban hatástalan volt a PCP megelőzésében a SCID egérben.

A proguanil atovaquonnal kombinációban szinergizmust mutatott.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. 2-[4-(4-Klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4-naftokinon és proguanil kombinációja, amelyben a proguanil és 2-[4-(4-klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4-naftokinon tömegaránya 1:2 és 1:3 közötti.
2. Az 1. igénypont szerinti kombináció, amelyben a proguanil és 2-[4-(4-klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4naftokinon tömegaránya 2:5.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti kombináció, amelyben a 2-[4-(4-klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4naftokinon transz-izomer vagy a cisz- és transz-izomerek keveréke formájában van jelen, ez utóbbiban a transz-izomer a domináns.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kombináció protozoa-parazitafertőzés és P. carinii által oko15 zott fertőzés emlősben történő kezelésére vagy megelőzésére való alkalmazásra.
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kombináció alkalmazása protozoa-parazitafertőzés vagy a P. carinii által okozott fertőzés emlősben való kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a protozoa által okozott parazitafertőzés malária.
7. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a protozoa-parazitafertőzés toxoplazmózis.
8. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás P. carinii által okozott fertőzés kezelése és/vagy megelőzése.
9. 2-[4-(4-Klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4-naftokinon alkalmazása toxoplazmózis vagy P. carinii által emlősökben okozott fertőzés kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására, proguanillal való egyidejű vagy egymást követően történő adagoláshoz, ahol a proguanil:2-[4-(4-klór-fenil)ciklohexil]-3-hidroxi-1,4-naftokinon tömegaránya 1:2-1:3.
10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a proguanil:2-[4-(4-klór-fenil)-ciklohexil]-3-hidroxi-1,4-naftokinon tömegaránya 2:5.