CZ289692B6

CZ289692B6 - Farmaceutická kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)-cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinonu a proguanilu a farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ289692B6
Application number: CZ1999805A
Authority: CZ
Inventors: Winston E. Gutteridge; David B. A. Hutchinson; Victoria S. Latter; Mary Pudney
Original assignee: The Wellcome Foundation Limited
Priority date: 1992-11-26
Filing date: 1999-03-09
Publication date: 2002-03-13
Also published as: US5998449A; CN1087935C; AP9300592A0; ATE191340T1; SK281559B6; CA2150234E; GB9224739D0; HU9501537D0; BG62595B1; SA93140434B1; PL174323B1; HU225918B1; DK0670719T3; CZ289171B6; TW253835B; EP0670719A1; HUT71346A; NO951995D0; AU685408B2; DE69328307T2

Abstract

Podstatu °e en tvo° farmaceutick kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)-cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinonu a proguanilu, v n jsou proguanil a 2-/4-(4-chlorfenyl)-cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinon p° tomny v hmotnostn m pom ru 1:1 a 1:3. V²hodn jsou zejm na farmaceutick prost°edky, obsahuj c 50 mg a 3 g ka d z uveden²ch l tek, zvl t v²hodn 500 mg 2-/4-(4-chlorfenyl)-cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinonu a 200 mg proguanilu.\

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká synergických kombinací 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4naftochinonu (atovakvonu) a proguanilu, které mají antiparazitickou aktivitu. Tento vynález se zvláště týká farmaceutických prostředků, které obsahují takovou kombinaci, jejich použití při ošetřování protozoálních parazitických infekcí, jako je malárie a toxoplazmóza (nemoc Janků), a jejich použití při ošetřování infekcí způsobených Pneumocystis carinii.

Dosavadní stav techniky

Sloučenina 2-/4_(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinon (atovakvon) byla již dříve popsána, například v evropském patentovém spise č. 123 238, který se týká 2-substituovaných 3-hydroxy-l,4-naftochnonů obecného vzorce I

(I), ve kterém

R¹ znamená atom vodíku a

R² je zvolen z alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkoxyskupiny, alkaralové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, fenylu substituovaného jednou nebo dvěma skupinami zvolenými z atomu halogenu a alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, dále atomu halogenu a perhalogenalkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku nebo

R¹ a R² znamenají oba alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo fenylovou skupinu a n znamená nulu nebo číslo 1 a jejich fyziologicky přijatelných solí. Uvádí se, že tyto sloučeniny mají antiprotozoální aktivitu. Zvláště sloučenina obecného vzorce I, ve které n představuje nulu, je uvedena jako sloučenina aktivní proti parazitu způsobujícímu malárií u lidí, Plasmodium falciparum, a také proti druhům Eimeria, jako je Eimeria tenella a Eimeria acervulina, které jsou organismy způsobujícími kokcidiózu. Dále se uvádí, že sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém n představuje číslo 1, mají být aktivní proti protozoním kmene Theileria, zvláště Theileria annulata a theileria parva. Mezi sloučeninami zvláště jmenovanými a doloženými v příkladech je sloučenina obecného vzorce I, ve kterém n představuje nulu, R* znamená atom vodíku a R² představuje 4-chlorfenyl, to znamená atovakvon.

-1CZ 289692 B6

Proguanil je dobře známá léčivá látka pro profylaxi malárie, avšak nikoli pro její léčení. Tato látka je jedním z nej bezpečnějších léčivých látek působících proti malárii a může se podávat malým dětem a těhotným ženám. K uvedené sloučenině je však rezistentní Plasmodium falciparum, zvláště v jihovýchodní Asii, a tato rezistence vytváří vzrůstající problém.

Za účelem boje proti rezistenci léčivé látky se stává obvyklou praxí používat kombinace většího počtu než jedné látky působící proti malárii, buď současně, nebo postupně. Mnoho takových kombinací však působí antagonisticky, co má za výsledek méně účinné ošetření a dávkovači režimy jsou často komplikované, se vzrůstající pravděpodobností selhání u pacientů při kompletním ošetření. Proto je předmětem tohoto vynálezu poskytnout kombinaci léčivých látek působících proti malárii, které nejsou antagonistické a které nevyžadují komplexní dávkovači režim.

Podstata vynálezu

Nyní s překvapením bylo nalezeno, že kombinováním, buď současným, nebo následným, atovakvonu představovaného v tomto popisu vzorce II

a proguanilu, se dosahuje potenciace antiparazitického a zvláště antimalarického účinku. Kromě ‘ toho se potencionovaná kombinace sloučeniny vzorce II a proguanilu může jednoduše předkládat v jediném farmaceutickém prostředku.

Podstatu vynálezu tvoří farmaceutická kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)-cyklohexyl/-3-hydroxy1,4-nafito-chinonu a proguanilu, v níž jsou proguanil a 2-/4-(4-chlorfenyl)-cyklohexyl/-3hydroxy-l,4-naftochinon přítomny v hmotnostním poměru 1:1 až 1:3.

Ve výhodném provedení tvoří součást vynálezu také kombinace 2-74-(4-chlorfenyljcyklohexyl/3-hydroxy-l,4-naftochinonu a proguanilu, v níž proguanil a 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3hydroxy-l,4-naftochinon jsou přítomny v hmotnostním poměru 2:5.

Součást podstaty vynálezu tvoří rovněž farmaceutický prostředek pro léčení a/nebo profylaxi protozoálních infekcí nebo infekcí vyvolaných u savců P. carinii, účinnou složku tohoto prostředku tvoří kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu a proguanilu podle některého z nároků 1 až 3 spolu s alespoň jedním farmaceutickým nosičem.

Výhodné jsou zejména farmaceutické prostředky, obsahující 50 mg až 3 g každé z uvedených látek, zvláště výhodně 500 mg 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu a 200 mg proguanilu. Součást řešení tvoří rovněž farmaceutický prostředek pro léčení a/nebo profylaxi protozoálních infekcí nebo infekcí, vyvolaných u savců P. carinii, účinnou složku tohoto prostředku tvoří svrchu uvedená kombinace.

Tento vynález také skýtá z jiného hlediska metodu ošetřování a/nebo profylaxe malárie u savců včetně člověka, která spočívá v podávání účinného množství kombinace atovakvonu nebo jeho fyziologicky přijatelné soli a proguanilu.

-2CZ 289692 B6

Hydroxyskupina atovakvonu může tvořit soli s vhodnými bázemi. Fyziologicky přijatelné soli atovakvonu zahrnují soli anorganických bází, jako soli alkalických kovů (například sodíku nebo draslíku) a soli alkalických zemin (například vápníku), soli organických bází, například fenylethylbenzylaminu, dibenzylethylendiaminu, ethanolaminu a diethanolaminu, a soli aminokyselin, například lysinu a argininu.

Je třeba si uvědomit, že sloučenina vzorce II může existovat jako cis nebo jako trans izomer, to znamená, že může být cis nebo trans substituována naftochinonovým jádrem a chlorfenylovou skupinou. Jak cis izomeiy, tak trans izomeiy a jejich směsi v libovolném poměru se mohou používat podle tohoto vynálezu. Z obecného hlediska, pokud sloučenina je ve formě směsi izomerů, trans izomer bude přítomen v množství kolem 50% hmotn. nebo převažujícím izomerem, ale použití směsi, ve které převažuje cis izomer, je také zahrnuto do rozsahu tohoto vynálezu. Zvláštní poměr izomerů se může měnit podle potřeby, obvyklé směsi však tvoří směsi, ve kterých poměr izomerů cis a izomerů trans je přibližně 1:1, 40:60 a 5:95. Pro použití podle tohoto vynálezu je výhodný trans izomer sloučeniny vzorce II nebo směs jejího cis a trans izomerů, obsahující alespoň 95 %, například 99 % hmotn. trans izomerů.

Sloučenina vzorce II může také existovat v tautomemí formě, ve které hydroxyskupina poskytuje svůj proton jedné z oxoskupin a použití takových tautomemích forem je zahrnuto do rozsahu tohoto vynálezu. Předpokládá se však, že stabilní formou je forma, která je znázorněna vzorcem II.

Množství kombinace atovakvonu a proguanilu vyžadované ktomu, aby bylo účinné jako antiparazitický prostředek, se bude samozřejmě měnit a nakonec bude záviset na rozhodnutí praktického nebo veterinárního lékaře. Okolnosti, které je zapotřebí vzít v úvahu, zahrnují cestu podání a povahu prostředku, tělesnou hmotnost savce, věk a obecný stav, povahu a vážnost choroby určené k ošetřování. Z obecného hlediska, vhodná účinná dávka pro podávání člověku, určená k ošetřování malárie, je v rozmezí od 2,0 do 30 mg proguanilu na kilogram tělesné hmotnosti za den a od 0,5 do 30 mg atovakvonu na kilogram tělesné hmotnosti za den, například od 3 do 20 mg proguanilu na kilogram tělesné hmotnosti za den a od 1 do 20 mg atovakvonu na kilogram tělesné hmotnosti za den, zvláště od 5 do 15 mg proguanilu na kilogram tělesné hmotnosti za den a od 3 do 15 mg atovakvonu na kilogram tělesné hmotnosti za den.

Vhodná účinná dávka k podávání člověku, určená k profylaxi malárie, je v rozmezí od 3 do 20 mg na kilogram tělesné hmotnosti za týden jak u proguanilu, tak u atovakvonu.

Mělo by se vzít v úvahu, že dávky uvedené výše jsou vypočteny pro léčivé látky jako takové.

Využitelnost

Pro použití podle tohoto vynálezu se kombinace atovakvonu a proguanilu výhodně předkládá jako farmaceutický prostředek.

Farmaceutické prostředky zahrnují aktivní látky (to znamená kombinaci atovakvonu a proguanilu) dohromady s jednou nebo větším počtem jeho farmaceuticky přijatelných nosných látek a popřípadě jinými terapeutickými a/nebo profylaktickými složkami. Nosná látka nebo nosné látky musí být přijatelné vtom smyslu, že jsou snášenlivé s jinými složkami prostředku a nemají zhoubný vliv na svého příjemce.

Proto tento vynález poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje kombinaci atovakvonu a proguanilu společně s jednou nebo větším počtem jejich farmaceuticky přijatelných nosných látek.

-3CZ 289692 B6

Tento vynález dále skýtá způsob výroby farmaceutického prostředku, který zahrnuje uvedení kombinace atovakvonu a proguanilu do styku s jedním nebo větším počtem jejich farmaceuticky přijatelných nosných látek.

Kombinace atovakvonu a proguanilu může být obvykle přítomna jako farmaceutický prostředek ve formě dávkové jednotky. Obvyklá formulace dávkové jednotky obsahuje aktivní látky v množství, které odpovídá od 10 mg do 3 g každé aktivní látky, například od 50 mg do 3 g každé aktivní látky. Obvyklé dávkové jednotky mohou obsahovat například 500 mg atovakvonu a 200 mg proguanilu nebo 500 mg atovakvonu a 500 mg proguanilu.

Farmaceutické prostředky zahrnují prostředky vhodné k orálnímu, lokálnímu (včetně dermálního, bukálního a sublinguálního), rektálnímu a parenterálnímu (včetně subkutánního, intradermálního, intramuskulámího a intravenózního) podání, stejně jako pro podání nosogastrickou trubicí. Pokud je to vhodné, prostředek může být běžně přítomen v oddělených dávkových jednotkách a může se vyrobit libovolným způsobem dobře známým v oblasti farmacie. Všechny způsoby zahrnují stupeň uvedení aktivní látky do styku s kapalnými nosnými látkami nebo jemně rozmělněnými tuhými látkami, popřípadě oběma těmito typy nosných látek a potom, pokud je to zapotřebí, tvarování produktu na požadovaný prostředek.

Farmaceutické prostředky vhodné k orálnímu podávání, ve kterých nosná látka je tuhá, jsou nejvýhodněji přítomny jako formulace v dávkové jednotce, jakou je bolus, kapsle nebo tableta, obsahující vždy předem stanovené množství aktivních látek. Tableta může být zhotovena lisováním nebo odléváním, popřípadě s jednou nebo větším počtem pomocných látek. Lisované tablety se mohou vyrábět lisováním na vhodném stroji, účinných látek ve volně tekoucí formě, jako prášku nebo granulí, popřípadě smíchaných s pojivém, mazivem, inertním ředidlem, kluznou látkou, povrchově aktivní látkou nebo dispergačním činidlem. Odlévané tablety se mohou zhotovovat odléváním s využitím inertního kapalného ředidla. Tablety se mohou popřípadě povlékat a pokud jsou nepovlečené, mohou se opatřit zářezem. Kapsle se mohou vyrábět naplněním aktivních látek, buď samotných, nebo ve směsi s jednou nebo větším počtem pomocných látek, do obalů kapsle a potom uzavřít obvyklým způsobem. Kašety (tobolky na lék) jsou analogické kapslím, ve kterých jsou aktivní látky dohromady s pomocnou látkou nebo pomocnými látkami uzavřeny v obalu z rýžového papíru. Kombinace sloučeniny vzorce II s proguanilem se mohou také zpracovávat na dispergovateíné granule, které se mohou například suspendovat ve vodě před podáním nebo rozprášit na potravu. Granule se mohou také balit například do sašetů (váčků na lék). Prostředky vhodné k orálnímu podání, ve kterých nosná látka je kapalná, mohou být přítomny jako roztok nebo jako suspenze ve vodné kapalině nebo nevodné kapalině nebo jako emulze oleje ve vodě.

Prostředky pro orální podání zahrnují dávkové formy s řízeným uvolňováním, například tablety, ve kterých aktivní látky jsou zpracovány do vhodného základu umožňujícího řízené uvolňování nebo povlečeny filmem, který vhodně řídí uvolňování. Takové prostředky mohou být zvláště vhodné k profýlatickému použití.

Účinné látky se mohou také upravit na roztok nebo suspenzi, které jsou vhodné pro podání nasogastrickou trubicí.

Farmaceutické prostředky vhodné k rektálnímu podávání, ve kterých nosná látka je tuhá, jsou nejčastěji přítomny jako dávkové jednotky ve formě čípků. Mezi vhodné nosné látky se zahrnuje kakaové máslo a jiné látky obvykle používané v oboru. Čípky se mohou obvykle vyrábět smícháním kombinace aktivních látek se změklou nebo roztavenou nosnou látkou nebo nosnými látkami, poté rychlým ochlazením a tvarováním ve formách.

Farmaceutické prostředky vhodné pro parentrální podávání zahrnují sterilní roztoky nebo suspenze kombinace účinných látek, obsažené ve vodných nebo olejových pomocných prostředcích. Injikovatelné preparáty mohou být uzpůsobeny k podávání jako dávková injekce nebo pro

-4CZ 289692 B6 kontinuální infuzi. Takové prostředky jsou obvykle přítomny v zásobnících s jedinou dávkou nebo větším počtem dávek, které jsou uzavřeny po zavedení prostředku, až do vyžadovaného použití. Podle jiného provedení aktivní látky mohou být v práškové formě, a prostředek se vytvoří před použitím s vhodnou pomocnou látkou, jako sterilní vodou zbavenou pyrogenních látek.

Kombinace atovakvonu a proguanilu se může také zpracovat na dlouhodobě působící depotní prostředek, který se může podávat intramuskulámí injekcí nebo implantací, například subkutánně nebo intramuskulámě. Depotní prostředky mohou obsahovat například vhodné polymerní nebo hydrofóbní materiály nebo iontoměničové pryskyřice. Takové dlouhodobě působící prostředky jsou zvláště vhodné k profylaktickému použití.

Mělo by se uznat, že kromě svrchu uvedených nosných látek farmaceutické prostředky pro různé cesty podání pospané výše mohou podle potřeby zahrnovat jednu nebo větší počet dalších nosných látek, jako jsou ředidla, pufry, ochucovadla, pojivá, povrchově aktivní látky, zahušťovadla, maziva, konzervační prostředky (včetně antioxidantů) a podobně, a látky zahrnuté za účelem dosažení prostředku isotonického s krví zamýšleného příjemce.

Prostředky vhodné k veterinárnímu použití zahrnují prostředky upravené pro orální nebo parenterální podání a pro podání do bachoru.

V průběhu příkladové části jsou použity následující zkratky:

WR99210 je 4,6-diamino-l ,2-dihydro-2,2-dimethyl-l-/(gamma-2',4 ',5 '-trichlorfenoxy)propyloxy/-s-triazinhydrochlorid,

PS-15 je diamidhydrochlorid N-(l-methylethyl)-N73-(2,4,5-trichlorfenoxy)propoxy/imidodikarbonimidu,

PABA je kyselina p-aminobenzoová,

SDS je dodecylsulfát sodný a

TCA je kyselina trichloroctová.

Příklady provedení vynálezu

Způsoby výroby atovakvonu jsou popsány v evropském patentovém spise EP 123 238 a jeden zvláštní způsob je ilustrován v příkladu 1.

Příklad 1

Způsob výroby 2-/trans-4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l ,4-naftochinonu

a) Způsob výroby kyseliny 4-(4-chlorfenyl)cyklohexan-l-karboxylové g acetylchloridu a 60 g jemně rozmělněného práškového chloridu hlinitého se míchá dohromady se 120 ml sulfidu uhličitého a potom ochladí na teplotu -50 °C v lázni z oxidu uhličitého a oxitolu. K reakční směsi se během 10 minut přikape 30 g cyklohexenu, který byl předem ochlazen na teplotu -50 °C, přičemž teplota reakční směsi se udržuje pod -20 °C. Směs se míchá za reakční teploty -50 °C po dobu dalších 60 minut a rozpouštědlo se potom dekantuje, aby zůstal gumovitý oranžový komplex. K tomuto komplexu se přidá malé množství chlorbenzenu, jakmile se látka zahřeje na teplotu místnosti. Nato se přidá zbytek chlorbenzenu

-5CZ 289692 B6 (celkově 300 ml), takto získaný roztok se zahřívá na teplotu 40 °C po dobu 3 hodin za míchání, vylije na směs ledu a koncentrované kyseliny chlorovodíkové a oranžová vrstva se oddělí, promyje 2-molámí kyselinou chlorovodíkovou, 2-molámím roztokem hydroxidu sodného a vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a odpaří do sucha. Získaná látka se destiluje za sníženého tlaku, frakce vroucí za teploty 140 až 154°C/13,3Pa se zachytí, zředí stejným množstvím petroletheru (o teplotě varu 40 až 60 °C) a ochladí na teplotu -6 °C. Reakční směsí se probublává nepřetržitý proud plynného dusíku a zachytí se oddělená bezbarvá tuhá látka.

K roztoku 6,2 g hydroxidu sodného ve 42 ml vody se za teploty 0 °C přidá 2,8 ml bromu. 3,1 g substituovaného hexahydroacetofenonu získaného výše se rozpustí v 15 ml dioxanu a poté se přidá studený roztok bromnanu, přičemž reakční směs se udržuje za teploty pod 20 °C. Reakční směs se míchá za teploty místnosti po dobu 6 hodin a potom nechá stát přes noc. Aby se dosáhlo rozkladu přebytečného bromnanu, přidá se dvojsiřičitan sodný, směs se ochladí a potom okyselí. Tak se dostane bezbarvá tuhá látka. Tato tuhá látka se odfiltruje, promyje vodou, vysuší a rekrystaluje z ethanolu. Získá se kyselina 4-(4-chlorfenyl)cyklohexan-l-karboxylová, která má teplotu tání 254 až 256 °C.

b) Způsob výroby 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-chlor-l ,4-naftochinonu

Směs 3,95 g (0,02 mol) 2-chlor-l ,4-naftochinonu, 4,9 g (0,02 mol) kyseliny 4-(4-chlorfenyl)cyklohexan-l-karboxylové a 1,05 g (0,0062 mol) práškového dusičnanu stříbrného se vaří pod zpětným chladičem za intenzivního míchání ve 40 ml acetonitrilu. K reakční směsi se přikape během 1 hodiny roztok 12,0 g (0,0525 mol) persíranu amonného v 50 ml vody. Směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 3 hodin, poté se chladí ledem po dobu 30 minut a po této době se filtruje a výsledná lepkavá tuhá hmota se dvakrát extrahuje vroucím chloroformem, k odstranění anorganické látky. Chlorform se odpaří a dostane se přibližně 2,7 g žluto-hnědé tuhé látky. Tato látka se rozpustí ve 40 ml vroucího acetonitrilu a malé množství nerozpustné látky se odstraní filtrací. Po ochlazení se sloučenina pojmenovaná v nadpise oddělí jako žluté krystaly o hmotnosti 550 mg, které mají teplotu tání 172 až 175 °C.

NMR spektrální analýza: dH (5₆-DMSO): 8,05 (2H, multiplet, β-naftyl), 7,85 (2H, multiplet, a-naftyl), 7,30 (4H, s, PhH), 3,30 (1H, široký triplet, CH) 2,67 (1H, široký triplet, CH), 1,2 - 2,4 (8H, multiplet, 4 x CH₂) ppm.

c) Způsob výroby 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l ,4-naftochinonu

Produkt ze stupně b) se suspenduje v 10 ml vroucího methanolu a během 15 minut se k získané suspenzi přikape roztok 0,55 hydroxidu draselného v 5,5 ml vody. Směs se vaří pod zpětným chladičem, až se vytvoří tmavě červený roztok (po přibližně 6 hodinách), kdy se opatrně přikapou 2 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Směs se ochladí a filtruje a tuhý zbytek se důkladně promyje vodou. Vodné promývací louhy se znovu okyselí a filtrují. Spojené tuhé zbytky (o hmotnosti 500 mg), které mají teplotu tání 200 až 209 °C, se rekiystalují z acetonitrilu a dostane se sloučenina pojmenovaná v nadpise, jako trans izomer o hmotnosti 300 mg, který má teplotu tání 216 až 219 °C.

-6CZ 289692 B6

Příklad 2

Dále uvedené příklady ilustrují obvyklé farmaceutické prostředky, které se mohou používat podle tohoto vynálezu.

A: Tableta povlečená filmem

Jádro:

sloučenina z příkladu 1	500 mg
hydrochlorid proguanilu	200 mg
mikrokiystalická celulóza (Avicel PH101)	130 mg
hydroxypropylcelulóza Lo-sub (LHPC, LH11)	99 mg
natriumglykolát škrobu (Eplotab)	30 mg
povidon K30	36 mg
stearát hořečnatý	5 mg
hmotnost po slisování	1000 mg

Povlak:

disperze polymeru (hydroxypropylmethylcelulóza a oxid titaničitý 20 mg s polyethylenglykolem 400 a barvivém)

Leštidlo:

polyethylenglykol 8000 celková hmotnost

B: Tableta povlečená disperzním filmem Jádro:

mg

1022 mg

sloučenina z příkladu 1	500 mg
hydrochlorid proguanilu	200 mg
mikrokrystalická celulóza (Avicel PH101)	100 mg
hydroxypropylcelulóza Lo-sub (LHPC, LH11)	83 mg
natriumglykolát škrobu (Eplotab)	40 mg
povidon K30	20 mg
stearát hořečnatý	5 mg
dokusát sodný	1 mg
křemičitan hořečnato-hlinitý (Veegum F)	50 mg
sodná sůl sacharinu	1 mg
hmotnost po slisování	1000 mg

Povlak:

disperze polymeru (hydroxypropylmethylcelulóza a oxid titaničitý 10 mg s polyethylenglykolem 400 a barvivém)

Leštidlo:

polyethylenglykol 8000 celková hmotnost mg

1012 mg

-7CZ 289692 B6

Výsledky biologických testů

Příklad 3

Porovnání interakce léčivých látek v kombinacích sloučeniny z příkladu 1 s jinými látkami působícími proti malárii

Studie senzitivity léčivé látky in vitro se provádějí za použití poloautomatizovaného technického postupu, který popsal Desjardins (Desjardins a kol., Antimalarial Agents and Chemotherapy 16(6), 710-718/1979/). Antimalarijní aktivita v tomto systému se stanovuje inhibicí radiologicky značeného hypoxanithinu vpraveného do parazitů při stupňujících se koncentracích léčivé látky.

Léčivé látky s účinkem proti malárii se zkoušejí rozpuštěné ve vodě, v ethanolu s koncentrací 95 % obj. nebo v dimethylsulfoxidu. Sloučeniny se rozpouštějí ve směsi ethanolu s koncentrací 95 % obj. a vody v objemovém poměru 1:1. Pak se roztoky účinných látek ředí kultivačním prostředím, které obsahuje 10% hmotn. lidského séra, vztaženo na hmotnost kultivačního prostředí, na počáteční dvaceti- až padesátinásobné koncentrace odhadovaných hodnot IC₅₀· Dále je uvedeno složení roztoků účinných látek, použitých k provedení zkoušek na účinnost:

Léčivá látka	Počáteční rozpouštědlo	Prostředí
sloučenina DMSO 1640 z příkladu 1 chinin	ethanol-voda	1640
chlorochin	voda-ethanol	1640
meflochin	ethanol-voda	1640
primachin	ethanol-voda	1640
artesunát	ethanol-voda	1640
PM443	DMSO	1640
tetracyklin	DMSO	1640
norfloxacin	DMSO	1640
ciprofloxacin	DMSO	1640
proguanil	ethanol-voda	Lo-folát
cykloguanil	ethanol-voda	Lo-folát
pyrimethamin	DMSO	Lo-folát
trimethoprim	DMSO	Lo-folát
sulfamethoxazol	DMSO	Lo-folát
dapson	DMSO	Lo-folát
clopidol	DMSO	Lo-folát
allopurinol	ethanol-voda	Lo-folát
PS-15	DMSO	Lo-folát
WR99210	DMSO	Lo-folát

Za účelem studia kombinace léčivých látek se roztoky léčivé látky při počátečních koncentracích kombinují v různých poměrech (1:5, 1:2, 2:1 a 5:1). Roztoky léčivé látky a kombinace se potom vnesou na mikrotitrační plotnu s 96 jamkami, aby se dosáhly dvě řady sloučeniny z příkladu 1. Tím je kombinována léčivá látka a jsou čtyři kombinace dvou léčivých látek. Série ředění léčivé látky v poměru 1:3 s prostředím se naplní do mikrotitrační plotny s 96 jamkami za použití pipety s 12 kanálky. K ohodnocení se léčivé látky klasifikují jako inhibitoiy reduktázy kyseliny dihydrolistové (DHFR), přičemž se použije modifikovaného kulturního prostředí, které obsahuje pouze fyziologické koncentrace kyseliny listové a PABA.

Zbývající biologické procedury se provádějí podle technického postupu popsaného Desjardinem s tím rozdílem, že se použijí tři kmeny Plasmodium falciparum (multidrogově rezistentní klon

-8CZ 289692 B6

W-2, drogově senzitivní, ale kmeflochinu rezisitentní klon D-6 a C2B izolát rezistentní ke sloučenině z příkladu 1) a inkubace se prodlouží na dobu 72 hodin.

Jednotlivé hodnoty IC50 se vypočítají za použití programu „MINSQ“ od Micrometh Scientific Software. Každá souprava párových hodnot se prodlouží hyperbolickou tangenciální funkcí za použití postupu podle Desjardinse.

Hodnoty IC₅₀ byly normalizovány stanovením hodnot 1 k IC50 pro sloučeninu z příkladu 1 a pro jinou léčivou látku, která byla kombinována s proporcionálně normalizovanými hodnotami pro každý poměr dvou léčivých látek, které se studují. Isobologram se sestrojí zařazením hodnot do rovnice:

Yi= 1 - [Χ;/(Χ; + e^!*(l -X0/] ve kterém

Yi znamená hodnotu IC₅₀ pro sloučeninu z příkladu 1, pokud je kombinována s jinou léčivou látkou,

Xi znamená hodnotu IC50 pro jinou léčivou látku, pokud je kombinována se sloučeninou z příkladu 1 a

I znamená parametr interakce ukazující stupeň reverze.

Hodnoty I se vypočítají pro každou kombinaci. Kladné hodnoty I ukazují na synergickou kombinaci, negativní hodnoty jsou ukazatelem antagonismu a I rovnající se nule ukazuje na aditivní interakci.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Léčivá látka kombinovaná se sloučeninou z příkladu 1	W-2	I D-6	C2B
chinin	-1,36
chlorochin	-1,84	-1,40
meflochin	-1,19
tetracyklin	1,27	1,11	0,02,-0,08
primachin	-0,79
kyselina artesunová		-0,18
PM443		-1,28
norfloxacin	1,02
ciprofloxacin	-1,22
pyrimethamin	0,36		-0,48
trimethoprim	1,27		0,58
proguanil	2,43,2,88	2,56	2,56
cykloguanil	2,21	1,66	0,13, -0,73
allopurinol	1,14	0,43
PS-15	1,77,0,65,1,97	-0,74
WR99210	0,02
sulfamethoxazol	2,75
dapson	-0,39
klopidol	2,38, 2,65	0,73

-9CZ 289692 B6

Výsledky ukazují, že kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu aproguanilu projevuje mnohem důkladnější potenciál s porovnání sjinými kombinacemi testovaných léčivých látek, zvláště proti kmeni C2B rezistentnímu k hydroxynaftochinonu.

Optimální poměr kombinace s proguanilem se stanoví pro každý ze tří kmenů parazitu malárie, určením poměru hodnoty IC₅₀ proguanilu k hodnotě IC₅o sloučeniny vzorce II. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 dále.

Tabulka 2 proguanil: sloučenina obecného vzorce I

W-2_______D-6______C2B

920:1 4038:1 0,2:1

2473:1

Příklad 4

Srovnání antitoxoplazmové aktivity in vivo sloučeniny z příkladu 1, proguanilu a jejich kombinací

Aktivity sloučenin a kombinací se zkoušejí na myším modelu T. gondii za použití zvyšující se doby k uhynutí a procenta přežití u myší, jako měřítka aktivity léčivé látky.

Skupiny 10 myší kmene CBA/CA o hmotnosti 20 g se infikují 6 cystami kmene C56 T. gondii orálně zavedenou žaludeční sodnou. Ošetřování léěivou látkou se začne o 3 dny později a pokračuje po dobu 10 dnů. Všechny léčivé látky se podávají orálně zavedenou žaludeční sondou. Zkoušejí se dále uvedené skupiny látek:

kontrolní stanovení atovakvon @ 10 mg/kg atovakvon @ 25 mg/kg proguanil @ 25 mg/kg atovakvon @ 10 mg/kg a proguanil @ 25 mg/kg atovakvon @ 25 mg/kg a proguanil @ 25 mg/kg

Všechna zvířata se zkoušejí dvakrát denně po dobu 30 dnů a každé uhynutí se zaznamená.

Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 3 a 4.

Tabulka 3

Střední doba do uhynutí (dny) atovakvon ______________________________________0____________10 mg/kg_______25 mg/kg proguanil 0 140 20,1 24,1 (mg/kg)25 9,0 18,4 29,3

-10CZ 289692 B6

Tabulka 4 % přežití atovakvon _______0____________10 mg/kg_______25 mg/kg proguanil 0 10,0 10,1 10,0 (mg/kg)25 0,0 0,0 80,0

Střední doba do uhynutí kontrolních myší činí 14 dnů, s pouze jediným přežívajícím zvířetem (10%). (Toto zvíře nemuselo dostat infekci v důsledku nízké hodnoty použitého inokula.) Atovakvon samotný zvyšuje toto přežití na 20,1 dne při dávce 10 mg/kg a na 24,1 dne při dávce 25 mg/kg, v obou případech s jediným přežitím (10%). Proguanil, navzdory své zaznamenané vysoké bezpečnosti u člověka, je toxický pro myši. Při dávce 25 mg/kg proguanil projevuje známky toxicity a snižuje střední dobu k uhynutí na 9 dnů, s žádným přežitím. Kombinace 10 mg/kg atovakvonu s 25 mg/kg proguanilu poskytuje střední dobu přežití 18,4 dne. Kombinace 25 mg/kg atovakvonu s 25 mg/kg proguanilu poskytuje zvýšenou dobu přežití, navzdory toxicitě proguanilu, a 80% myší přežívá v porovnání s minimálním přežíváním 10% myší, které obdržely samotný atovakvon.

Příklad 5

Srovnání antitoxoplazmových aktivit in vitro sloučeniny z příkladu 1, proguanilu a jejich kombinací

Studie senzitivity léčivé látky in vitro se provádějí za použití poloautomatizovaného technického postupu, založeného na postupu používaném pro malárii (Desjardins a kol., Antimalarial Agents and Chemotherapy 16(6), 710-718/1979/), stím rozdílem, že se použije selektivního vpravení ³[H]-uracilu T. gondii. Antitoxoplazmová aktivita v tomto systému se stanovuje inhibici pohlcování radiologicky značného uracilu v parazitech při stupňujících se koncentracích léčivých látek.

Léčivé látky se rozpustí v dimethylsulfoxidu a zředěné roztoky se připraví za použití kulturního prostředí obsahujícího 3 % fetálního telecího séra. Za účelem studia kombinace léčivých látek se roztoky léčivé látky při počátečních koncentracích kombinují v různých poměrech 1:1, 1:3 a 3:1. Připraví se série ředění léčivé látky v poměru 1:2 a kombinací a použijí se ve dvojích jamkách mikrotitrační plotny s 96 jamkami, kam se předem naočkovaly buňky HeLa a RH kmene T. gonii. Léčivé látky se přidají dvě hodiny po parazitovi a desky se inkubují za teploty 37 °C po dobu 24 hodin, kdy se přidá ³[H]-uracil a v inkubaci se pokračuje dalších 8 hodin. Zkouška se dokončí odstraněním kapaliny - supematantu, T. gonii obsahující buňky se naruší v SDS a značené proteiny se vysráží s TCA na filtrační podložce. Začlenění značného podílu se měří na β deskovém scintilačním počítači. Procento inhibice začlenění uracilu se vypočítá pro sloučeniny a kombinace. Hodnoty IC50 se vypočítají za použití programu GS1. Hodnoty IC₅o jsou normalizovány stanovením hodnot 1 k IC₅₀ pro sloučeninu z příkladu 1 a pro progaunil s normalizovanými hodnotami pro každý poměr dvou léčivých látek, které se studují. Isobologram se sestrojí vynesením těchto normalizovaných hodnot IC₅₀ proti sobě. Potenciace se ukazuje u hodnot vyskytujících se pod křivkou isobologramu, přídavný účinek hodnotami na křivce a antagonismus hodnotami nad křivkou.

Desky se používají trojmo a všechny hodnoty se vynesou.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.

-11 CZ 289692 B6

Tabulka 5

Normalizované hodnoty IC50 Potenciace atovakvon proguanil

0,559278	0,583893	ne
0,196689	0,614094	ano
0,729381	0,253691	ano
0,345238	0,527273	ano
0,130952	0,6	ano
0,233333	0,118182	ano
0,404959	0,451538	ano
0,229201	0,768462	ano
0,244904	0,091538	ano

Výsledky ukazují, že kombinace atovakvonu a progualinu projevuje potenciaci in vitro proti T. gondii.

Příklad 6

Srovnání antipneumocystozové aktivity in vivo u sloučeniny z příkladu 1, proguanilu a jejich kombinací

Aktivity sloučenin a kombinací se zkoušejí na SCID myším modelu Pneumocystis pneumonia.

Úroveň infekce myší v každé skupině se měří za použití standardních otiskových preparátů plic a imunofluorescenčních testů. Vyhodnocení se provádí pro každou myš, přitom 0 znamená bez infekce a +4 představuje velmi těžkou infekci.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6

Ošetření Vyhodnocení Počet infikovaných Střední hodnota % /počet zkoušených ± směrodatná z kontrolního

	0 +1 +3 +4 +4		odchylka	stanovení
neošetřená kontrola	0	0	0	3	7	10/10	3,70 + 0,14	100
atovakvon	0	0	5	5	0	10/10	2,50 ± 0,16	68
50 mg/kg p.o. denně
atovakvon	0	0	1	7	2	10/10	3,10 ±0,17	84
25 mg/kg p.o. denně
proguanil	0	0	0	2	8	10/10	3,80 ± 0,13	85
25 mg/kg p.o. denně
atovaktvon a proguanil	5	4	1	0	0	5/10	0,50 ±0,21	14
50 + 25 mg/kg p.o.
denně
atovakvon a proguanil	1	0	4	4	0	8/9	2,22 ±0,31	60

+ 25 mg/kg p.o. denně

Pokud se dávkuje samotný atovakvon, vede ke snížení rozsahu infekce. Proguanil samotný v dávce 25 mg/kg za den je neúčinný při profylaxi PCP u SCID myší. Proguanil v kombinaci s atovakvonem projevuje synergii.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu aproguanilu, vyznačující se tím, že proguanil a 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3hydroxy-l,4-naftochinon jsou přítomny v hmotnostním poměru 1:1 až 1:3.
2. Farmaceutická kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu aproguanilu podle nároku 1, vyznačující se tím, že proguanil a 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinon jsou přítomny v hmotnostním poměru 2:5.
3. Farmaceutická kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu aproguanilu podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinon je ve formě směsi cis- a trans-izomeru, v níž transizomer převažuje.
4. Farmaceutická kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu a proguanilu podle některého z nároků 1 až 3 pro použití k léčení a/nebo profylaxi protozoálních infekcí nebo infekcí, vyvolaných u savců Pneumocystis carinii.
5. Farmaceutický prostředek pro léčení a/nebo profylaxi protozoálních infekcí, vyvolaných usavců Pneumocystis carinii, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje kombinaci 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu a proguanilu podle některého z nároků 1 až 3 spolu s alespoň jedním farmaceutickým nosičem.
6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že v jednotkové dávce obsahuje 50 mg až 3 g každé z látek tvořících kombinaci, to znamená 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu a proguanilu.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že v jednotkové dávce obsahuje 500 mg 2-/4-(4-chlorfenyl)-cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu a 200 mg proguanilu.