BG62595B1

BG62595B1 - Средство за лечение на протозойни инфекции на база атовакуонс прогуанил

Info

Publication number: BG62595B1
Application number: BG99656A
Authority: BG
Inventors: Winston E. Gutteridge; David B. Hutchinson; Victoria S. Latter; Mary Pudney
Original assignee: The Wellcome Foundation Limited
Priority date: 1992-11-26
Filing date: 1995-05-22
Publication date: 2000-03-31
Also published as: HUT71346A; EP0670719A1; JPH08503938A; SI9300614A; KR100294802B1; US5998449A; NO313225B1; RO119280B1; DK0670719T3; PL174323B1; GR3033745T3; CZ289692B6; CN1087935C; CY2193B1; SA93140434B1; BG99656A; AU5532294A; CZ289171B6; ATE191340T1; SG45387A1

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до синергитични комбинации от 2-[-4-(4-хлорофенил)циклохексил]-3-хидрокси-1,4-нафтохинон (атовакуон) и прогуанил, които проявяват антипаразитна активност. По-специално изобретението се отнася до фармацевтични състави, свдьржащи тези комбинации, тяхното използване за лечение на протозойни паразитни инфекции като малария и токсоплазмоза и използването им за лечение на инфекции, причинени от Pneumocystis carinii.

Предшестващо състояние на техниката

Съединението 2- [-4-(4-хлорофенил)циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафтохинон (атовакуон) е описано в ЕР + 123 238, който се отнася до 2заместени-3-хидрокси-1,4-нафгохинони с формула

в която или R¹ означава водород и R²означава Ц 6алкокси, аралкокси, С^алкил-С, 6 алкокси, фенил, заместен с една или две групи, избрани от халоген и С^алкил, халоген и перхалоС16алкил, или R¹ и R² и двата означават С,6 алкил или фенил и п е 0 или 1 и техни физиологичноприемливи соли. За тези съединения е посочено, че имат антипротозойна активност. Поспециално за съединенията с формула I, в която η е 0 е посочено, че са активни срещу маларийния паразит Plasmodium falciparum у човека и срещу Eimeria видове като E.tenella и E.acervulina, които организми причиняват кокцидиози, а за съединенията с формула I, в която η е 1 е посочено, че са активни срещу протозои от вида Theileria и по-специално T.annulata или T.parva. Сред съединенията конкретно назовано и илюстрирано с пример е съединението с формула I, в която η е 0, R* означава водород и R² означава 4-хлорофенил, т.е. атовакуон.

Прогуанилът е добре известно лекарствено средство за профилактика, но не за лечение на малария. Това е едно от най-сигурните лекарствени средства против малария и може да се дава на малки деца и бременни жени.Обаче се наблюдава устойчивост на P.falciparum към прогуанил, по-специално в Югоизточна Азия, и това е един нарастващ проблем.

За да се преодолее устойчивостта към лекарственото средство, са използвани стандартни начини за комбиниране на повече от едно лекарствени средства против малария едновременно или в последователност. Много такива комбинации, обаче, са антагонистични, което се изразява в лечение с по-малка ефективност, а режимите на дозиране са често усложнени.

В Parasistology Todey article vol.8, no.8, p.252-255 и vol.9, no.2, p.66-68 е описана комбинация на лекарствени средства, включваща атовакуон и използвана за лечение и/или профилактика на протозойни инфекции или инфекции, причинени от Р.саппп. Твърди се, че в комбинация с атовакуона могат да се използват и профилактични средства, подобни на прогуанила. Не се съобщават данни за съществуване на потенциращо съотношение между атовакуона и някое от тези профилактични лекарства, при което съотношение двете съставки действат синергично. Това още повече се отнася за прогуанила.

Задачата на изобретението е да се създаде комбинация от лекарствени средства за лечение и/или профилактика на протозойна инфекция или инфекция, причинена от P.carinii у млекопитаещи, които лекарствени средства освен, че не са антагонистични и не изискват усложнен режим на дозиране, но и едновременно с това действат синергично помежду си.

Техническа същност на изобретението

Установено е, че комбинацията от атовакуон, представен в описанието с формула

и прогуанил, използвани едновременно или в последователност, води до потенциране на противопаразитната и по-специално на противомала рийната активност. Освен това, потенциращата комбинация от съединение с формула II и прогуанил може да бъде в отделна фармацевтична форма за приложение.

Изобретението преди всичко се отнася до метод за лечение и/или профилактика на протозойна паразитна инфекция, напр. малария или токсоплазмоза, или инфекция, причинена от Р. carinii у млекопитаещи, включително хора, който се състои в прилагане на ефективно количество атовакуон или негова физиологичноприемлива сол и едновременно или последователно прилагане на ефективно количество прогуанил.

Освен това изобретението се отнася и до атовакуон за използване при приготвяне на лекарствено средство за едновременно или последователно прилагане с прогуанил за лечение и/ или профилактика на протозойна паразитна инфекция, напр. малария или токсоплазмоза или инфекция, причинена от P.carinii у млекопитаещи, включително хора.

За предпочитане съединението с формула II и прогуанилът се прилагат едновременно. Наймного се предпочита съединението с формула II и прогуанилът да се прилагат в потенциращо съотношение.

Така изобретението се отнася и до комбинацията атовакуон или негова физиологичноприемлива сол и прогуанил, в която атовакуонът или неговата сол и прогуанилът са в потенциращо съотношение.

Терминът “потенциращо съотношение” тук се използва, за да се означи, че ефективните количества на атовакуон и прогуанил са в такова съотношение, че противопаразитната активност на комбинацията е по-висока от тази само на атовакуона или само на прогуанила или от сумарната активност, която би трябвало да се очаква за комбинацията въз основа на активностите на отделните компоненти. Така отделните компоненти действат синергитично в комбинация, когато са в потенциращо съотношение.

Съотношение, което може успешно да се използва за лечение на малария включва резистентни спрямо хидроксинафтохинон щамове на малария в границите 1:0,1-1:100 прогуанил:атовакуон. Подходящо съотношение е в границите 1:0,2-1:10.

Особено предпочитано потенциращо съотношение на ефективни количества е в границите 1:1-1:3.

Друго предпочитано потенциращо съотношение на ефективни количества е 2:5.

Настоящото изобретение се отнася също и до метод за лечение и/или профилактика на малария у млекопитаещи, включително хора, който се състои в приложение на ефективно количество от комбинация на атовакуон или негова физиологичноприемлива сол и прогуанил.

Хидроксилната група на атовакуона може да образува соли с подходящи основи, а физиологичноприемливите соли на атовакуона могат да бъдат неорганични основни соли като алкалнометални (напр. натриева или калиева) соли и алкалоземнометални соли (напр. калциеви соли), органични основни соли, напр. фенилетилбензиламиносоли, дибензилетилендиаминосоли, етаноламиносоли и диетаноламиносоли и соли с аминокиселини, напр. лизин и аргинин.

Съединението с формула II може да съществува като цис или като транс изомер, което означава, че циклохексиловият пръстен може да бъде цис или транс заместен от нафтохиноновото ядро и хлорофенилната група. Както цис, така и транс изомерите и техните смеси могат да се използват във всякакво съотношение съгласно изобретението. Най-общо, когато съединението е във форма на смес от изомери, транс изомерът присъства в количество от около 50 % или може да бъде преобладаващият изомер, но използването на смеси, в които преобладава цис изомерът, също влизат в обхвата на изобретението. Конкретното съотношение на изомерите може да варира в зависимост от нуждата, като типични смеси са такива, които съдържат цис/транс изомера в съотношение 1:1,40:60 и 5:95. За използване съгласно изобретението се предпочита транс изомерът на съединение с формула II или смес от цис и транс изомерите на съединението, съдържаща най-малко 95 %, напр. 99 % транс изомер.

Съединението с формула II може да съществува също така в тавтомерна форма, в която хидроксилната група отдава своя протон на една от оксогрупите и използването на такива тавтомерни форми също се включва в обхвата на изобретението. Смята се, обаче, че стабилната форма е тази, показана на формула II.

Количеството на комбинацията атовакуон и прогуанил, което е необходимо, за да бъде ефективно като противопаразитно средство, ще варира, разбира се, и се определя от предписанието на лекуващия хуманен или ветеринарен лекар. Факторите, които трябва да се имат предвид, са начинът на прилагане и видът на формата за приложение, телесното тегло на млекопитаещото, възрастта и общото състояние и природата и тежестта на заболяването, което се лекува. Подходяща ефективна доза за прилагане на хора за лечение на малария е в границите от 2,0 до 30 mg прогуанил за килограм телесно тегло и 0,5 mg до 30 mg атовакуон за килограм телесно тегло на ден, например от 3 до 20 mg/kg/ден прогуанил и 1 до 20 mg/kg/ден атовакуон, по-специално 5 до 15 mg/kg/ден прогуанил и 3 до 15 mg/kg/ден атовакуон.

Подходяща ефективна доза за прилагане на хора за профилактика на малария е в границите от по 3 до 20 mg за килограм телесно тегло за седмица от прогуанил и от атовакуон, например от по 6 mg/kg/седмица до 10 mg/kg/седмица от прогуанил и от атовакуон.

Споменатите по-горе дози се изчисляват от гледна точка на лекарствените средства per se.

За използване съгласно изобретението комбинацията атовакуон и прогуанил за предпочитане се приготвя като фармацевтична форма за приложение.

Фармацевтичните форми за приложение съдържат активните компоненти (това е комбинацията атовакуон и прогуанил) заедно с един или повече фармацевтично приемливи носители и в даден случай други терапевтични и/или профилактични компоненти. Носителят (те) трябва да бъде приемлив в смисъл на съвместимост с другите компоненти на формата и да не вреди на получателя.

Съответно настоящото изобретение се отнася до фармацевтични форми за приложение, съдържащи комбинация от атовакуон и прогуанил, заедно с един или повече фармацевтичноприемливи носители.

Комбинацията от атовакуон и прогуанил може удобно да се приготви като фармацевтична форма за прилагане в единична доза. Подходяща форма на единична доза е такава, съдържаща активните компоненти в количества от по 10 mg до 3 g всеки, т.е. 50 mg до 3 g всеки. Типични единични дози са съдържащите например 500 mg атовакуон и 200 mg прогуанил или 500 mg атовакуон и 500 mg прогуанил.

Фармацевтични форми за приложение са тези, подходящи за орално, локално (включително дермално, в устата и под езика), ректално и парентерално (вкл. подкожно, интрадермално, мускулно и венозно) приложение както и приложение през назогастралния път. Формите за приложение, където е подходящо, могат да съществуват удобно в дискретни единични дози и могат да се получат по методи, добре познати в областта на фармацията. Всички методи включват етап на свързване на активните компоненти с течни носители или фино раздробени твърди носители или и двата и след това, ако е необходимо, оформяне на продукта в желаната форма за приложение.

Най-предпочитаните фармацевтични форми за приложение, подходящи за орално прилагане, където носителят е твърд, са единични дозирани форми като глобули, капсули или таблети, всяка съдържаща предварително определено количество от активните компоненти. Таблетите могат да се приготвят чрез пресоване или формоване, в даден случай с един или повече свързващи компоненти. Пресовани таблети могат да се приготвят чрез пресоване в подходяща машина на активните съединения в свободно течлива форма като прахове или гранули, в даден случай заедно със свързващи вещества, инертни разредители, смазващи средства, повърхно-стноактивни средства или диспергираши средства. Формованите таблети могат да се приготвят чрез формоване в инертен течен разредител. Таблетите в даден случай могат да се покрият, а ако не са покрити, могат в даден случай да се разделят с черта. Капсулите могат да се получат чрез пълнене на активните компоненти или самостоятелно, или в смес с един или повече свързващи компонента, в капсулни черупки и след това да се затворят по подходящ начин. Аналогични на капсулите са сашетите, в които активните компоненти заедно с някакъв свързващ компонент (и) са затворени в обвивка от оризова хартия. Комбинацията от съединение с формула II и прогуанил може също да се приготви във форма на диспергируеми гранули, които могат, например, да се суспенират във вода преди прилагане или да се впръскат върху храната. Гранулите могат да се пакетират напр. в сашети. Подходящи за орално приложение форми, в които носителят е течност, могат да бъдат разтвори или суспензии във водна течност или неводна течност или като течна емулсия масло във вода.

Приготвянето на формите за орално приложение включва контролирано освобождаване на дозираните форми, напр. таблети, където активните компоненти са приготвени във форма на подходящо освобождавана контролираща матрица, или са покрити с подходящо освобождаван контролиращ филм. Такива форми са особено подходящи за профилактично използване.

Активните компоненти могат също така да се приготвят във форма на разтвор или суспензия, подходящи за прилагане през назогастралния път.

Фармацевтичните форми за приложение, подходящи за ректално прилагане, където носителят е твърд, най-често са приготвени като супозитории в единична доза. Подходящи носители са какаово масло и други материали, обичайно използвани в тази област. Супозиториите могат удобно да се приготвят чрез смесване на активната комбинация с омекотен или стопен носител (и), след което се замразява и оформя в калъпи.

Фармацевтичните форми за парентерално прилагане могат да бъдат стерилни разтвори или суспензии на активната комбинация във воден или маслен пълнител. Инжекционните препарати могат да бъдат пригодени като инжекции за вкарване на ударна доза или за непрекъсната инфузия. Такива препарати е удобно да се държат в контейнери за единична доза или за многократни дози, които се затварят след вкарване на формата, докато е необходимо използване. В даден случай активните компоненти могат да бъдат във форма на прах, който се композира преди употреба с подходящ пълнител като свободна от пороген вода.

Комбинацията от атовакуон и прогуанил може също така да се приготви във форма на дългодействащ депопрепарат, който може да се прилага посредством мускулни инжекции или посредством имплантиране, например подкожно или мускулно. Депопрепаратите могат да включват, например, подходящи полимерни или хидрофобни материали или йонообмени смоли. Такива форми с продължително действие са особено удобни за профилактично използване.

Ясно е, че освен посочените носители, фармацевтичните форми за приложение за различните начини на прилагане, описани по-горе, могат да включват, ако е необходимо, един или повече носещи компоненти като разредители, буфери, ароматизиращи средства, свързващи средства, повърхностноактивни средства, сгъстители, смазващи средства, консерванти (вкл. антиоксидантни) и подобни и субстанции, включени с цел изотонично превръщане на формите в кръвта на получателя.

Съставите, подходящи за ветеринарно използване, включват форми за орално, парентерално и интраруменално прилагане.

Примери за изпълнение на изобретението

Методи за получаване на атовакуон са описани в ЕР 123 238, а един конкретен метод е посочен в пример 1.

Пример 1.

2- [транс-4-(4-хлорофенил)циклохексил] -3хидрокси-1,4-нафтохинон

а) 4-(4-хлорофенил)циклохексан-1-карбоксилна киселина

Ацетилхлорид (30 g) и фино разпрашен алуминиев хлорид (60 g) се разбъркват заедно във въглероден дисулфид (120 ml) и след това се охлажда до -50°С в баня от СО₂/окситол. Предварително охладен до -50°С циклохексен (30 g), се прибавя на капки в продължение на 10 min, като температурата на реакционната смес се поддържа под -20°С. Сместа се разбърква при -50°С в продължение на още 60 min и разтворителят след това се декантира, като остава лепкав оранжев комплекс. Прибавя се малко хлорбензен, като продуктът се затопля до стайна температура, след това се прибавя останалото количество хлорбензен (общо 300 ml), така полученият разтвор се нагрява при 40°С в продължение на 3 h при разбъркване, излива се в смес от лед и концентрирана солна киселина и органичният слой се отделя, промива се с 2М солна киселина, 2М натриев хидроксид и вода, суши се над безводен натриев сулфат и се изпарява до сухо. Продуктът се дестилира под вакуум, фракцията, кипяща при 140 - 154°С (0,1 mm Hg) се събира, разрежда се с равен обем петролеев етер (40 - 60°С), охлажда се до -6°С и се пропуска непрекъсната струя газ азот, а отделеният безцветен твърд продукт се извлича.

Към разтвор на натриев хидроксид (6,2 g) във вода (42 ml) при 0^рС се прибавя бром (2,8 ml). Полученият заместен хексахидроапетофенон (3,1 g) се разтваря в диоксан (15 ml) и след това се прибавя студен разтвор на хипобромит, като температурата на реакционната смес се поддържа под 20°С. Реакционната смес се разбърква при стайна температура в продължение на 6 h и след това се оставя да стои една нощ. Прибавя се натриев метабисулфит, за да се разруши излишният хипобромит, сместа се охлажда и след това се подкислява, като се получава безцветно твърдо вещество. Твърдото вещество се филтрира, промива се с вода, суши се и се прекрис тализира из етанол, като се получава 4-(4-хлорофенил)циклохексан-1-карбоксилна киселина, т. на топене 254 - 256°С.

б) 2-[4-(4-хлорофенил)циклохексил]-3хлоро-1,4-нафтохинон 5

Смес от 2-хлоро-1,4-нафтохинон (3,95 g, 0,02 mol), 4-(4-хлорофенил)циклохексан-1-карбоксилна киселина (4,9 g, 0,02 mol) и прахообразен сребърен нитрат (1,05 g, 0,0062 mol) се нагрява под обратен хладник при енергично 10 разбъркване в 40 ml ацетонитрил. На капки за период от 1 h се прибавя разтвор на амониев персулфат (12,0 g, 0,0525 mol) в 50 ml вода. Сместа се нагрява под обратен хладник в продължение на 3 h, след това се охлажда в лед в 15 продължение на 30 min, след което се филтрира, а полученият лепкав твърд продукт се екстрахира двукратно с кипящ хлороформ, за да се отстранят неорганичните продукти. Хлороформът се отстранява чрез изпаряване, като се получава 20 жълто-кафяв твърд продукт (около 2,7 g). Той се разтваря в 40 ml кипящ ацетонитрил, малкото количество неразтворим продукт се отстранява чрез филтриране. При охлаждане като жълти кристали се отделя продуктът съгласно загла- 25 вието, (550 mg), т. на топене 172 - 175°С.

ЯМР, dH( 5₆-DMSO) 8,05 (2Н, m, β-нафт.),

7,85 (2Н, m, α-нафт.), 7,30 (4Н, s, PhH), 3,30 (1H, широк t, CH), 2,67 (1H, широк t, CH), 1,2 - 2,4 (8H, m, 4xCH₂). 30

в) 2-[4-(4-хлорофенил)циклохексил]-3хидрокси-1,4-нафгохинон.

Продуктът от етап б) се суспендира в 10 ml кипящ метанол и на капки за период от 15 min се прибавя 0,55 g калиев хидроксид в 5,5 ml 35 вода. Сместа се нагрява под обратен хладник, докато се образува тъмночервен разтвор, (след около 6 h), когато на капки непрекъснато се прибавя 2 ml концентрирана солна киселина. Сместа се охлажда и филтрира и твърдият остатък 40 се промива изчерпателно с вода. Водните промивки се подкисляват повторно и се филтрират. Обединените твърди остатъци (500 mg), т. на топене 200 - 209°С се прекристализират из ацетонитрил, като се получава продуктът съгласно 45 заглавието като транс изомер (300 mg), т. на топене 216 - 219°С.

Пример 2.

Следващите примери илюстрират обичайни фармацевтични форми на приложение, които могат 50 да се употребят съгласно изобретението:

А. Филм-таблета
Ядро: Съединение от пример 1	500 mg
Прогуанилхидрохлорид	200 mg
Микрокристална целулоза (Avicel РН101)	130 mg
Хидроксипропилцелулоза, Lo-sub, (LHPC,LH11)	99 mg
Натриевонишестен гликолат (Explotab)	30 mg
Povidone КЗО	36 mg
Магнезиев стеарат	5 mg
Тегло след пресоване	1000 mg
Покритие: Полимерна дисперсия (хидроксипропилметилцелулоза и титанов диоксид и полиетилен-
гликол 400 и оцветители)	20 mg
Полиране: Полиетиленгликал 8000	2 mg
Общо тегло	1022 mg

Б. Диспергируема филм-таблета

Ядро:

Съединение от пример 1 500 mg

Прогуанилхидрохлорид 200 mg

Микрокристална целулоза (Dvicel HP 101) 100 mg

Хидроксипропилцелулоза (Lo-sub,LHPPC,LHl 1)83 mg

Натриевонишестен гликолат (Explotab)40 mg

Povidone K3020 mg

Магнезиев стеарат5 mg

Натриев докузат1 mg

Магнезиевоалуминиев силикат (Veegum F)50 mg

Натриев захарин1 mg

Тегло след пресоване 1000 mg

Покритие:

Полимерна дисперсия (хидроксипропилметилцелулоза и титанов диоксид и полиетиленгликол 400 и оцветител) 10 mg

Полиране:

Полиетиленгликал 8000 2 mg

Общо тегло 1012 mg

Резултати от биологични опити Пример 3.

Сравнение на лекарствени взаимодействия при комбинации на съединение от пример 1 с други средства против малария.

Изследвания на чувствителността към лекарствените средства се провеждат in vitro, като се използва полуавтоматичната техника на Desjardins (Desjardins et al., Antimalarial Agents and Chemotherapy, 1979, 16(6), 710-718). Антималарийната активност по тази система се изпитва чрез инхибиране на радиобелязан хипоксантин, вкаран в паразити посредством степени концентрации на лекарственото средство.

Лекарствените средства против малария, които се изпитват, се разтварят във вода, 95 %ен етанол или диметилсулфоксид (ДМСО), като лекарствените средства, разтворени във вода, се разреждат 1:1 с 95 %-ен етанол, лекарствените средства, разтворени в етанол, се разреждат 1:1 с вода. Разтворите на лекарствените средства след това се разреждат с културална среда, съдържаща 10 % човешки серум, до начални концентрации 20 - 50 пъти определената IC_J0. Изследваните лекарствени средства и техните разтворители са изредени по-долу:

Лекарствено средство	Начален разтворител	Среда
Съед. от пример 1	ДМСО	1640
Quinine	Етанол-вода	1640
Chloroquine	Вода-етанол	1640
Mefloquine	Етанол-вода	1640
Primaquine	Етанол-вода	1640
Artesunate	Етанол-вода	1640
PM443	ДМСО	1640
Tetracycline	ДМСО	1640
Norfloxacin	ДМСО	1640
Ciproflaxacin	ДМСО	1640
Proguanil	Етанол-вода	Lo-folate
Cycloguanil	Етанол-вода	Lo-folate
Pyrimethamine	ДМСО	Lo-folate
Trimethoprim	ДМСО	Lo-folate
Sulfamethxazole	ДМСО	Lo-folate
Dapsohe	ДМСО	Lo-folate
Clopidol	ДМСО	Lo-folate
Allopurinol	Етанол-вода	Lo-folate
PS-15	ДМСО	Lo-folate
WR99210	ДМСО	Lo-folate

С оглед да се изследват комбинации от лекарствени средства, разтвори на лекарственото средство в изходните концентрации се комбинират в различни съотношения (1:5, 1:2, 2:1 и 5:1). Разтворите от лекарствените средства и комбинациите след това се поставят в микротитърни плаки с 96 ямки, като се получават двойни редици от съединението от пример 1, лекарственото средство, което се комбинира и четири комбинации от двете лекарствени средства. Приготвят се серийни разреждания 1:3 на лекарствените средства със среди, за да се допълнят 96-те ямки на микротитърната плака, като се използва 12 канална пипета. За да се оценят лекарствените средства, класифицирани като инхибитори на редуктазата на дихидрофолиевата киселина (DHFR), се използва модифицирана културална среда, която съдържа само физиологични концентрации на фолиева киселина на РАВА.

Останалите биологични процедури се извършват съгласно техниката на Desjardins, с изключение на това, че се използват три щама от P.falciparum (резистентният на много лекарствени средства W-2 клон, чувствителният към лекарственото средство, но резистентен към Mefloquine D-6 клон и С2В изолат, резистентен към съединението от пример 1, и след това се инкубира в продължение на 72 h.

Отделните IC_J0 се изчисляват, като се използва програмата “MINSQ” от Micromath Scientific Software. Всяка установена двойка данни съответства на хиперболичната тангентна функция, използвана от Desjardins.

IC_i0 стойностите се нормализират чрез даване стойности от 1 до IC_J0 за съединението от пример 1 и за другото лекарствено средство, с което се комбинира с пропорционално нормализираните стойности за всяко съотношение от двете изследвани лекарствени средства. Построява се изоболограма, като се попълват данните от уравнението:

Y.- 1-[Х./(Х.+е'’(1-Х^))] където Y. = 1С_М за съединението от пример 1, когато се комбинира с друго лекарствено средство.

Xi = 1С₃₀ за друго лекарствено средство, когато се комбинира със съединение от пример 1.

I = параметър на взаимодействие, показващ степента на реверсиране.

Стойностите на I се изчисляват за всяка комбинация. Положителните стойности на I показват синергична комбинация, отрицателните стойности сочат антагонизъм, a I = 0 показва адитивно взаимодействие.

Резултатите са дадени в таблица 1.

Таблица 1.

Лекарствено средство, комбинирано със съединение от пример 1	W-2	D-6	C2B
Quinine	-1,36
Chloroquine	-1,84	-1,40
Mefloquine	-1,19
Tetracycline	1,27	1,11	0,02-0,08
Primaquine	-0,79
Артесунова
киселина	-0,18
PM443	-1,28
Norfloxacin	1,02
Ciprofloxacin	-1,22
Pyrimethamine	0,36	-0,48
Trimethoprim	1,27	0,58
Quinine	-1,36
Chloroquine	-1,84	-1,40
Mefloquine	-1Д9
Tetracycline	1,27	1,11	0,02-0,08
Primaquine	-0,79
Артесунова
киселина	-0,18
PM443	-1,28
Norfloxacin	1,02
Ciprofloxacin	-1,22
Pyrimethamine	0,36	-0,48
Trimethoprim	1,27	0,58
Proguanil	2,43, 2,88	2,56	2,56
Cycloquanil	2,21	1,66	0,13-0,73
Allopurinol	1,14	0,43
PS-15	1,77,0,65, 1,97	-0,74
WR99210	0,02
Sulfamethhoxazol	2,75
Dapsone	-0,39
Clopidol	2,38, 2,65	0,73

Резултатите показват, че комбинацията от

2- [4- (4-хлорофенил) циклохексил] -3-хидрокси-1,4нафтохинон и прогуанил проявява най-устойчиво потенциране в сравнение с другите изпитвани комбинации от лекарствени средства, особено срещу резистентния на хидроксинафтохинон С2В щам.

Оптималното съотношение на комбинацията с прогуанил се оценява за всеки от трите щама малариен паразит чрез определяне на съотношението от 1С₃₀ на прогуанил към IC_J0 на съединението с формула II.

Резултатите са показани в таблица 2 подолу:

Таблица 2.

W-2 D-6 С2В

Прогуанил:

Съед. с формула II 920:1 4038:1 0,2:1

2473:1

Пример 4.

Сравнение на антитоксоплазмената активност на съединение от пример 1, прогуанил и тяхна комбинация

Активността на съединенията и комбинациите се изпитват на миши модел T.gondii, като се използва увеличението на времето до смъртта и процента на оживелите мишки като мярка за активността на лекарственото средство.

Групи от 10, 20 gm СВА/СА мишки се инфектират орално чрез вкарване със сонда на 6 цисти с щам C_J6 от T.gondii и 3 дни по-късно 5 започва третирането с лекарственото средство, което продължава 10 дни. Всички лекарствени средства се прилагат орално чрез сонда. Изпитвани са следните групи:

Контроли

Atovaquone @ 10 mg/kg

Atovaquone @ 25 mg/kg

Proguanil @ 25 mg/kg

Atovaquone @ 10 mg/kg + Proguanil @ 25 mg/kg

Atovaquone @ 25 mg/kg + Proguanil @ 25 mg/kg Всички животни се изпитват два пъти на ден в продължение на 30 дни и всички умрели се регистрират.

Резултатите са показани на таблици 3 и 4:

Таблица 3.

	0
Прогуанил	0	140
(mg/kg)	25	9,0
		0
Прогуанил	0	10,(
(mg/kg)	25	0,0

Средно време до смъртта (дни)
Атовакуон 10 mg/kg 20,1 18,4	25 mg/kg 24,1 29,3
	Таблица 4.
’/₀ оживели
Атовакуон
10 mg/kg	25 mg/kg
10,1	10,0
0,0	80,0

Средното време до смъртта на контролните мишки и 14 дни, като само едно животно оживява (10 %). (Това животно може да не е било инфектирано с използваната ниска концентрация). Атовакуонът сам го увеличава до 20,1 дни при 10 mg/kg и 24,1 дни при 25 mg/kg, като в двата случая има по едно оживяло животно (10 %). Прогуанилът, въпреки неговата отлична безвредност, регистрирана при хора, е токсичен за мишките. При 25 mg/kg прогуанилът показва признаци на токсичност, като намалява средното време до смъртта на 9 дни, без оживели. Комбинацията от 10 mg/kg атовакуон с 25 mg/kg прогуанил показва средно време до смъртта от 18,4 дни. Комбинацията от 25 mg/kg атовакуон и 25 mg/kg прогуанил показва увеличено време до смъртта въпреки токсичността на прогуанила и оживяват 80 % от мишките в сравнение с минималното оживяване от 10 % при мишки, получено само от атовакуон.

Пример 5.

Сравнение на антитоксоплазмената активност in vitro на съединение от пример 1, прогуанил и техни комбинации

In vitro изследването на чувствителността към лекарственото средство се провежда, като се използва полуавтоматизирана техника на осно вата на тази използвана за малария (Desjardins et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1979, 16 (6) 710-718), но като се използва селективно поглъщане на³ [Н] -урацил от T.gondii. Антитоксоплазмената активност в тази система се определя по инхибирането на поглъщането на радиобелязан урацил от паразити посредством степени концентрации на лекарственото средство.

Лекарствените средства се разтварят в ДМСО и се приготвят разреждания, като се използва културална среда, съдържаща 3 % серум от телешки зародиш. За да се изследват комбинации на лекарствените средства, разтвори на лекарствените средства в начални концентрации се комбинират в различни съотношения 1:1, 1:3, 3:1. Приготвят се серийни разреждания 1:2 на разтворите от лекарствени средства и комбинациите и се използват в двойни ямки на 96-ямкови плаки, с предварителна посявка от HeLa клетки и RH щам от T.gondii. Лекарствените средства се прибавят 2 h след като паразитът и плаките се инкубират при 37°С в продължение на 24 h, след което се прибавя ³ [Н]-урацилът и инкубирането продължава още 8 h. Определянето се извършва, като се отстрани течността над утайката, разкъсват се в SDS клетките, съдър жащи T.gondii, и белязаните протеини се утаяват с ТСА върху филтърна мати. Поглъщането на маркера се измерва на сцинтилационен брояч Beta plate scintilatin counter. Процентът на инхибиране на поглъщането на урацил се изчислява за съединенията и за комбинациите и се пресмятат 1С₅₀, като се използва GS1 програма. 1С₃₀ се нормализират, като се дават стойности от 1 до 1С₃₀за съединението от пример 1 и прогуанил с нормализирани стойности за всяко съотношение от двете изследвани лекарствени средства. Построява се изоболограма чрез начертаване на тези нормализирани 1С₃₀ една спрямо друга. Стойностите, намиращи се под линията на изоболограмата, сочат потенциране, стойностите върху линията сочат адитивен ефект и стойностите над линията сочат антагонизъм.

Плаките се изпълняват трикратно и всички стойности се начертават.

Резултатите са показани на таблица 5.

Таблица 5.

Нормализирани 1С₃₀	Потенциране
Атовакуон	Прогуанил
0,559278	0,583893	не
0,196689	0,614094	да
0,729381	0,253691	да
0,345238	0,527273	да
0,130952	0,6	да
0,233333	0,118182	да
0,404959	0,451538	да
0,229201	0,768462	да
0,244904	0,091538	да

Резултатите показват, че комбинацията от атовакуон и прогуанил проявява потенциране in vitro срещу T.gondii.

Пример 6.

Сравнение на анти-Pneumocystis активностите in vivo на съединение от пример 1, прогуанил и техни комбинации.

Активностите на съединенията и комбинациите се изпитват върху Pneumocystis pneumonia у мишки.

Степента на инфекция във всяка група мишки се измерва, като се използват стандартни белодробни намазки и имунофлуоресцентни тестове. Резултатът при всяка мишка се означава с 0 = липса на инфекция + 4 = много тежка инфекция. Резултатите са показани на таблица 6.

Третиране	0	Резутат
+ 1	+3	+4	+ 4
Нетретирана контрола	0	0	0	3	7
Атовакуон 50 mg/kg р.о. дневно	0	0	5	5	0
Атовакуон 25 mg/kg р.о. дневно	0	0	1	7	2
Прогуанил 25 mg/kg р.о. дневно	0	0	0	2	8
Атовакуон и прогуанил 50 + 25 mg/kg р.о. дневно	5	4	1	0	0
Атовакуон и	1	0	4	4	0

ТАБЛИЦА 6
Брой инфектирани/	Среден	% от
Брой не-	резултат	контро-
инфектирани	+SE	лата
10/10	3,70±0,14	100
10/10	2,50±0,16	68
10/10	3,1 0±0,1 7	84
10/10	3,80±0,13	85
5/10	0,50±0,21	14
8/9	2,22±0,31	60

прогуанил + 25 mg/kg

р.о. дневно

Когато се дозира самостоятелно, атовакуонът показва намаляване на инфектирането. Прогуанилът при 25 mg/kg на ден е неефективен за профилактика на РСР у изследваните мишки. Прогуанилът в комбинация с атовакуон показва синергизъм.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за лечение и/или профилактика на протозойна паразитна инфекция или инфекция, причинена от P.carinii у млекопитаещи, характеризиращ се с това, че се прилага ефективно количество от 2- [4-(4-хлорофенил)циклохексил] -

3-хидрокси-1,4-нафтохинон и прогуанил в съотношение в границите от 1:1 до 3:1.
2. Метод за лечение и/или профилактика на протозойна паразитна инфекция или инфек ция, причинена от P.carinii у млекопитаещи, характеризиращ се с това, че се прилага ефективно количество от 2-[4-(4-хлорофенил)циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафтохинон и прогуанил в съотношение 5:2.
3. Метод съгласно претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че 2-[4-(4-хлорофенил)циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафтохиноньт е под форма на транс изомер или на смес от цис и транс изомери, в която смес транс изомерът преобладава.
4. Метод съгласно претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че протозойната паразитна инфекция е малария.
5. Метод съгласно претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че протозойната паразитна инфекция е токсоплазмоза.
6. Метод съгласно претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че е за лечение и/или профилактика на инфекции, причинени от P.carinii.
7. Метод съгласно коя да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че атовакуонът и прогуанилът се прилагат едновременно. 5
8. Комбинация на 2-[4-(4-хлорофенил)циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафтохинон и прогуанил, характеризираща се с това, че 2-(4-(4хлорофенил) циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафтохинонът и прогуанилът са в съотношение в грани- 10 ците от 1:1 до 3:1.
9. Комбинация на 2-[4-(4-хлорофенил)циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафтохинон и прогуанил, характеризираща се с това, че 2-(4-(4хлорофенил) циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафто- 15 хинонът и прогуанилът са в съотношение 5:2.
10. Комбинация съгласно претенция 8 или 9, характеризираща се с това, че 2-[4-(4-хлорофенил) циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафгохинонът е във форма на транс изомер или смес от цис и 20 транс изомери, в която смес транс изомерьт преобладава.
11. Използване на комбинация съгласно претенции от 8 до 10 за изготвяне на лекарствено средство за лечение и/или профилактика на протозойна паразитна инфекция или инфекция, причинена от P.carinii у млекопитаещи.
12. Фармацевтична форма за приложение, характеризираща се с това, че съдържа комбинация съгласно някоя от претенции от 8 до 10 заедно с един или повече фармацевтично приемливи носители.
13. Единична дозирана фармацевтична форма, характеризираща се с това, че съдържа по 50 mg до 3 g от 2- [4- (4-хлорофенил) циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафтохинон и от прогуанила.
14. Единична дозирана фармацевтична форма съгласно претенция 13, характеризираща се с това, че съдържа 500 mg 2- [4- (4-хлорофенил) циклохексил] -3-хидрокси-1,4-нафтохинон и 200 mg прогуанил.

Експерт: Г.Тодоров Издание на Патентното ведомство на Република България 1113 София, бул. Д-р Г. М. Димитров 52-Б Редактор: Р.Георгиева Пор. № 40020 Тираж: 40 MB