CZ289171B6

CZ289171B6 - Kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinonu a proguanilu pro léčení protozoálních parazitických infekcí

Info

Publication number: CZ289171B6
Application number: CZ19951192A
Authority: CZ
Inventors: Winston E. Gutteridge; David B. A. Hutchinson; Victoria S. Latter; Mary Pudney
Original assignee: The Wellcome Foundation Limited
Priority date: 1992-11-26
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 2001-11-14
Also published as: CN1087935C; AP517A; CN1091632A; ZA938832B; SI9300614A; SK281559B6; SK57095A3; PT670719E; BG99656A; JP3768231B2; DK0670719T3; OA10352A; US6291488B1; HU9501537D0; NZ257901A; SA93140434B1; IL107755A; DE69328307D1; BG62595B1; UA45948C2

Abstract

P°edm tem tohoto °e en je pou it kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinonu a proguanilu s pom rem proguanilu k 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-1,4-naftochinonu v rozmez 1:1 a 1:3 pro v²robu farmaceutick ho prost°edku pro l en a/nebo profylaxi protozo ln ch parazitick²ch infekc nebo infekc , vyvolan²ch u savc Pneumocystis carinii.\

Description

Kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu a proguanilu pro léčení protozoálních parazitických infekcí

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití synergických kombinací 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3hydroxy-l,4-naftochinonu (atovakvonu) a proguanilu, které mají antiparazitickou aktivitu, pro výrobu farmaceutických prostředků, pro léčení protozoálních parazitických infekcí, jako je malárie a toxoplazmóza (nemoc Janků) a pro léčení infekcí způsobených Pneumocystis carinii.

Dosavadní stav techniky

Sloučenina 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinon (atovakvon) byla již dříve popsána, například v evropském patentovém spise EP 123 238, který se týká 2-substituováných 3-hydroxy-l,4-naftochinonů obecného vzorce I

ve kterém

R¹ znamená atom vodíku a

R² je zvolen z alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkoxyskupiny, alkarylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, fenylu substituovaného jednou nebo dvěma skupinami zvolenými z atomu halogenu a alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, dále atomy halogenu a perhalogenalkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, nebo

R¹ a R² znamenají oba alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo fenylovou skupinu a n znamená nulu nebo číslo 1, a jejich fyziologicky přijatelných solí. Uvádí se, že tyto sloučeniny mají antiprotozoální aktivitu. Zvláště sloučenina obecného vzorce I, ve kterém n představuje nulu, je uvedena jako sloučenina aktivní proti parazitu způsobujícímu malárií u lidí, Plasmodium falciparum, a také proti druhům Eimeria, jako je Eimeria tenella a Eimeria acervulina, které jsou organismy způsobujícími kokcidiózu. Dále se uvádí, že sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém n představuje číslo 1, mají být aktivní proti protozím kmene Theileria, zvláště Theileria annulata a Theileria parva. Mezi sloučeninami zvláště jmenovanými a doloženými v příkladech je sloučenina obecného vzorce I, ve kterém n představuje nulu, R¹ znamená atom vodíku a R² přestavuje 4-chlorfenyl, to znamená atovakvon.

-1 CZ 289171 B6

Proguanil je dobře známá léčivá látka pro profylaxi malárie, avšak nikoli pro její léčení. Tato látka je jednou z nejbezpečnějších léčivých látek působících proti malárii a může se podávat malým dětem a těhotným ženám. K uvedené sloučenině je však rezistentní Plasmodium falciparum, zvláště v jihovýchodní Asii, a tato rezistence vytváří vzrůstající problém.

Za účelem boje proti rezistenci léčivé látky se stává obvyklou praxí používat kombinace většího počtu než jedné látky působící proti malárii, buď současně nebo postupně. Mnoho takových kombinací však působí antagonisticky, což má za výsledek méně účinné ošetření a dávkovači režimy jsou často komplikované, se vzrůstající pravděpodobností selhání u pacientů při 10 kompletním ošetření. Proto je předmětem tohoto vynálezu poskytnout kombinaci léčivých látek působících proti malárii, které nejsou antagonistické a které nevyžadují komplexní dávkovači režim.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří použití kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4naftochinonu a proguanilu s poměrem proguanilu k 2-/4~(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy1,4-nafitochinonu v rozmezí 1 : 1 až 1 : 3 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení 20 a/nebo profylaxi protozoálních parazitických infekcí nebo infekcí vyvolaných u savců

Pneumocystis carinii.

Ve výhodném provedení je poměr proguanilu k 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4naftochinonu 2:5.

V dalším výhodném provedení se 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinon užije ve formě trans-izomeru nebo ve formě směsi izomerů cis a trans, v níž převažuje trans-izomer.

Výraz „poměr vedoucí k potenciaci“ se zde používá k označení, že atovakvon a proguanil jsou přítomny v takovém poměru, že antiparazitická aktivita kombinace je větší než buď aktivita samotného atovakvonu nebo aktivita samotného proguanilu nebo přídavná aktivita, která by se dala předpovědět pro kombinaci založenou na aktivitách jednotlivých složek. Tak jednotlivé složky působí synergicky v určené kombinaci, kde jsou přítomny v poměru vedoucímu k potenciaci.

Poměr vedoucí k potenciaci, který se může úspěšně používat pro ošetřování malárie, včetně působení na kmeny malárie rezistentní k hydroxynaftochinonu, je v rozmezí od 1 : 0,1 do 1 : 100 proguanilu k atovaktvonu. Vhodný poměr vedoucí k potenciaci je v rozmezí od 1 : 0,1 do 1 : 10.

Zvláště výhodný poměr vedoucí k potenciaci je v rozmezí od 1 : 1 do 1 : 3.

Hydroxyskupina atovakvonu může tvořit soli s vhodnými bázemi. Fyziologicky přijatelné soli atovakvonu zahrnují soli anorganických bází, jako soli alkalických kovů (například sodíku nebo 45 draslíku) a soli alkalických zemin (například vápníku), soli organických bází, například fenylethylbenzylaminu, dibenzylethylendiaminu, ethanolaminu a diethanolaminu, a soli aminokyselin, například lysinu a argininu.

Je třeba si uvědomit, že atovakvon může existovat jako cis nebo jako trans izomer, to znamená, 50 že může být cis nebo trans substituován naftochinonovým jádrem a chlorenylovou skupinou. Jak cis izomery, tak trans izomery a jejich směsi v libovolném poměru se mohou používat podle tohoto vynálezu. Z obecného hlediska, pokud sloučenina je ve formě směsi izomerů, trans izomer bude přitom v množství 50 % hmot, směsi nebo bude převažujícím izomerem, ale použití směsi, ve které převažuje cis izomer, je také zahrnuto do rozsahu tohoto vynálezu. Zvláštní poměr 55 izomerů se může měnit podle potřeby, obvyklé směsi však tvoří směsi, ve kterých poměr izomeru

-2CZ 289171 B6 cis a izomeru trans je přibližně 1 : 1, 40:60 a 5 :95. Pro použití podle tohoto vynálezu je výhodný trans izomer atovakvonu nebo směs jeho cis a trans izomeru atovakvonu nebo směs jeho cis a trans izomeru, obsahující alespoň 95 %, například 99 % hmotnostních trans izomeru, vztaženo na směs izomerů.

Množství kombinace atovakvonu a proguanilu vyžadované ktomu, aby bylo účinné jako antiparazitický prostředek, se bude samozřejmě měnit a nakonec bude záviset na rozhodnutí praktického nebo veterinárního lékaře. Okolnosti, které je zapotřebí vzít v úvahu, zahrnují cestu podání a povahu prostředku, tělesnou hmotnost savce, věk a obecný stav, povahu a vážnost choroby určené k ošetřování. Z obecného hlediska, vhodná účinná dávka pro podávání člověku, určená k ošetřování malárie, je v rozmezí od 2,0 do 30 mg proguanilu na kilogram tělesné hmotnosti za den a od 0,5 do 30 mg atovakvonu na kilogram tělesné hmotnosti za den, například od 3 do 20 mg proguanilu na kilogram tělesné hmotnosti za den a od 1 do 20 mg atovakvonu na kilogram tělesné hmotnosti za den, zvláště od 5 do 15 mg proguanilu na kilogram tělesné hmotnosti za den a od 3 do 15 mg atovakvonu na kilogram tělesné hmotnosti za den.

Vhodná účinná dávka k podávání člověku, určená k profylaxi malárie, je v rozmezí od 3 do 20 mg na kilogram tělesné hmotnosti za týden jak u proguanilu, tak u atovakvonu.

Farmaceutické prostředky zahrnují aktivní látky (to znamená kombinaci atovakvonu a proguanilu) spolu s jednou nebo větším počtem jeho farmaceuticky přijatelných nosičů a popřípadě jinými terapeutickými a/nebo profylaktickými složkami. Nosná látka nebo nosné látky musí být přijatelné vtom smyslu, že jsou kompatibilní sjinými složkami prostředku a nemají nepříznivý vliv na svého příjemce.

Kombinace atovakvonu a proguanilu může být obvykle přítomna jako farmaceutický prostředek ve formě dávkové jednotky: Obvyklá formulace dávkové jednotky obsahuje aktivní látky v množství, které odpovídá od 10 mg do 3 g každé aktivní látky, například od 50 mg do 3 g každé aktivní látky. Obvyklé dávkové jednotky mohou obsahovat například 50 mg atovakvonu a 200 mg proguanilu nebo 500 mg atovakvonu a 500 mg proguanilu.

Farmaceutické prostředky zahrnují prostředky vhodné k orálnímu, lokálnímu (včetně dermálního, bukálního a sublinguálního), rektálnímu a parenterálnímu (včetně subkutánního, intradermálního, intramuskulámího a intravenózního) podání, stejně jako pro podání nasogastrickou trubicí. Pokud je to vhodné, prostředek může být běžně přítomen v oddělených dávkových jednotkách a může se vyrobit libovolným způsobem dobře známým v oblasti farmacie. Všechny způsoby zahrnují stupeň uvedení aktivní látky do styku s kapalnými nosnými látkami nebo jemně rozmělněnými tuhými látkami, popřípadě oběma těmito typy nosných látek a potom, pokud je to zapotřebí, tvarování produktu na požadovaný prostředek.

Farmaceutické prostředky vhodné k orálnímu podávání, ve kterých nosná látka je tuhá, jsou nejvýhodněji přítomny jako formulace v dávkové jednotce, jakou je bolus, kapsle nebo tableta, obsahující vždy předem stanovené množství aktivních látek. Tableta může být zvolena lisováním nebo odléváním, popřípadě s jednou nebo větším počtem pomocných látek. Lisované tablety se mohou vyrábět lisováním na vhodném stroji účinných látek ve volně tekoucí formě, jako prášku nebo granulí, popřípadě smíchaných s pojivém, mazivem, inertním ředidlem, kluznou látkou, povrchově aktivní látkou nebo dispergačním činidlem. Odlévané tablety se mohou zhotovovat odléváním s využitím inertního kapalného ředidla. Tablety se mohou popřípadě povlékat, a pokud jsou nepovlečené, mohou se opatřit zářezem. Kapsle se mohou vyrábět naplněním aktivních látek, buď samotných nebo ve směsi s jednou nebo větším počtem pomocných látek, do obalů kapsle a potom uzavřít obvyklým způsobem. Kašety (tobolky na lék) jsou analogické kapslím, ve kterých jsou aktivní látky dohromady s pomocnou látkou nebo pomocnými látkami uzavřeny v obalu z rýžového papíru. Kombinace atovakvonu s proguanilem se mohou také zpracovávat na dispergovatelné granule, které se mohou také zpracovávat na dispergovatelné granule, které se mohou například suspendovat ve vodě před podáním nebo rozprášit na

-3CZ 289171 B6 potravu. Granule se mohou také balit například do sašetů (váčků na lék). Prostředky vhodné k orálnímu podání, ve kterých nosná látka je kapalná, mohou být přítomny jako roztok nebo jako suspenze ve vodné kapalině nebo vodné kapalině nebo jako emulze oleje ve vodě.

Prostředky pro orální podání zahrnují dávkové formy s řízeným uvolňováním, například tablety, ve kterých aktivní látky jsou zpracovány do vhodného základu umožňujícího řízené uvolňování nebo povlečeny filmem, který vhodně řídí uvolňování. Takové prostředky mohou být zvláště vhodné k profylaktickému použití.

Účinné látky se mohou také upravit na roztok nebo suspenzi, které jsou vhodné pro podání nasogastrickou trubicí.

Farmaceutické prostředky vhodné k rektálnímu podávání, ve kterých nosná látka tuhá, jsou nejčastěji přítomny jako dávkové jednotky ve formě čípků. Mezi vhodné nosné látky se zahrnuje kakaové máslo a jiné látky obvykle vyrábět smícháním kombinace aktivních látek se změklou nebo roztavenou nosnou látkou nebo nosnými látkami, poté rychlým ochlazením a tvarováním ve formách.

Farmaceutické prostředky vhodné pro parenterální podávání zahrnuje sterilní roztoky nebo suspenze kombinace účinných látek, obsažené ve vodných nebo olejových pomocných prostředcích. Injikovatelné preparáty mohou být uzpůsobeny k podávání jako dávková injekce nebo pro kontinuální infuzi. Takové prostředky jsou obvykle přítomny v zásobnících s jedinou dávkou nebo větším počtem dávek, které jsou uzavřeny po zavedení prostředku, až do vyžadovaného použití. Podle jiného provedení aktivní látky mohou být v práškové formě, a prostředek se vytvoří před použitím s vhodnou pomocnou látkou, jako sterilní vodou zbavenou pyrogenních látek.

Kombinace atovakvonu a proguanilu se může také zpracovat na dlouhodobě působící depotní prostředek, který se může podávat intramuskulámí injekcí nebo implantací, například subkutánně nebo intramuskulámě. Depotní prostředky mohou obsahovat například vhodné polymemí nebo hydrofobní materiály nebo iontoměničové pryskyřice. Takové dlouhodobě působící prostředky jsou zvláště vhodné k profylaktickému použití.

Je zřejmé, že kromě svrchu uvedených nosných látek mohou farmaceutické prostředky pro různé způsoby podání popsané výše podle potřeby obsahovat jednu nebo větší počet dalších nosných látek, jako jsou ředidla, pufry, ochucovadla, pojivá, povrchově aktivní látky, zahušťovadla, maziva, konzervační prostředky (včetně antioxidantů) a podobně, a látky zahrnuté za účelem dosažení prostředku izotonického s krví zamýšleného příjemce.

Prostředky vhodné k veterinárnímu použití zahrnují prostředky upravené pro orální nebo parenterální podání a pro podání do bachoru.

Příklady provedení vynálezu

Způsob výroby atovakvonu jsou popsány v evropském patentovém spise EP 123 238 a jeden zvláštní způsob je ilustrován v příkladu 1.

-4CZ 289171 B6

Příklad 1

Způsob výroby 2-/trans-4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l ,4-naftochinonu

a) Způsob výroby kyseliny 4-(4-chlorfenyl)cyklohexan-l~karboxylové g acetylchloridu a 60 g jemně rozmělněného práškového chloridu hlinitého se míchá dohromady se 120 ml sulfidu uhličitého a potom se ochladí na teplotu -50 °C v lázni z oxidu uhličitého a oxitolu. K reakční směsi se během 10 minut přikape 30 g cyklohexenu, který byl předem ochlazen na teplotu -50 °C, přičemž teplota reakční směsi se udržuje pod -20 °C. Směs se míchá za reakční teploty -50 °C po dobu dalších 60 minut a rozpouštědlo se potom dekantuje, aby zůstal gumovitý oranžový komplex. K tomuto komplexu se přidá malé množství chlorbenzenu, jakmile se látka zahřeje na teplotu místnosti. Nato se přidá zbytek chlorbenzenu (celkově 300 ml), takto získaný roztok se zahřívá na teplotu 40 °C po dobu 3 hodin za míchání, vylije se směs ledu a koncentrované kyseliny chlorovodíkové a oranžová vrstva se oddělí, promyje se 2-molámí kyselinou chlorovodíkovou, 2-molámím roztokem hydroxidu sodného a vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a odpaří dosucha. Získaná látka se destiluje za sníženého tlaku, frakce vroucí za teploty 140 až 154°C/13,3Pa se zachytí, zředí stejným množstvím petroletheru (o teplotě varu 40 až 60 °C) a ochladí na teplotu -6 °C. Reakční směsí se probublává nepřetržitý proud plynného dusíku a zachytí se oddělená bezbarvá tuhá látka.

K roztoku 6,2 g hydroxidu sodného ve 42 ml vody se za teploty 0 °C přidá 2,8 ml bromu. 3,1 g substituovaného hexahydroacetofenonu získaného výše se rozpustí v 15 ml dioxanu a poté se přidá studený roztok bromnanu, přičemž reakční směs se udržuje za teploty pod 20 °C. Reakční směs se míchá za teploty místnosti po dobu 6 hodin a potom se nechá stát přes noc. Aby se dosáhlo rozkladu přebytečného bromnanu, přidá se dvojsiřičitan sodný, směs se ochladí a potom okyselí. Tak se dostane bezbarvá tuhá látka. Tato tuhá látka se odfiltruje, promyje vodou, vysuší a rekrystaluje zethanolu. Získá se kyselina 4-(4-chlorfenyl)cyklohexan-l-karboxylová, která má teplotu tání 254 až 256 °C.

b) Způsob výroby 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-chlor-1,4-naftochinonu

Směs 3,95 g (0,02 mol) 2-chlor-l,4-naftochinonu, 4,9 g (0,02 mol) kyseliny 4-(4-chlorfenyl)cyklohexan-l-karboxylové a 1,05 g (0,0062 mol) práškového dusičnanu stříbrného se vaří pod zpětným chladičem za intenzivního míchání ve 40 ml acetonitrilu. K reakční směsi se přikape během 1 hodiny roztok 12,0 g (0,0525 mol) persíranu amonného v 50 ml vody. Směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 3 hodin, poté se chladí ledem po dobu 30 minut a po této době se filtruje a výsledná lepkavá tuhá hmota se dvakrát extrahuje vroucím chloroformem k odstranění anorganické látky. Chloroform se odpaří a dostane se přibližně 2,7 g žlutohnědé tuhé látky. Tato látka se rozpustí ve 40 ml vroucího acetonitrilu a malé množství nerozpustné látky se odstraní filtrací. Po ochlazení se sloučenina pojmenovaná v nadpise oddělí jako žluté krystaly o hmotnosti 550 mg, které mají teplotu tání 172 až 175 °C.

NMR spektrální analýza: dH (5₆-DMSO): 8,05 (2H, multiplet, β-naftyl), 7,85 (2H, multiplet, a-naftyl), 7,30 (4H, s, PhH), 3,30 (1H, široký triplet, CH), 2,67 (1H, široký triplet, CH), 1,2 - 2,4 (8H, multiplet, 4 x CH₂) ppm.

c) Způsob výroby 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu

Produkt ze stupně b) se suspenduje v 10 ml vroucího methanolu a během 15 minut se k získané suspenzi přikape roztok 0,55 g hydroxidu draselného v 5,5 ml vody. Směs se vaří pod zpětným chladičem, až se vytvoří tmavě červený roztok (po přibližně 6 hodinách), kdy se opatrně přikapou 2 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Směs se ochladí a filtruje a tuhý zbytek se důkladně promyje vodou. Vodné promývací louhy se znovu okyselí a filtrují. Spojené tuhé

-5CZ 289171 B6 zbytky (o hmotnosti 500 mg), které mají teplotu tání 200 až 209 °C, se rekrystalují z acetonitrilu a dostane se sloučenina pojmenovaná v nadpise, jako trans izomer o hmotnosti 300 mg, který má teplotu tání 216 až 219 °C.

Příklad 2

Dále uvedené příklady ilustrují obvyklé farmaceutické prostředky, které se mohou používat podle tohoto vynálezu.

A: Tableta povlečená filmem

Jádro:

15	sloučenina z příkladu 1 hydrochlorid proguanilu	500 mg 200 mg
	mikrokrystalická celulóza	130 mg
	(Avicel PH101)
	hydroxypropylcelulóza	99 mg
20	Lo-sub(LHPC, LH111)
	natriumglykolát škrobu	30 mg
	(Eplotab)
	povidon K30	36 mg
	stearát hořečnatý	5 mg
25	hmotnost po slisování	1000 mg
	Povlak:
	disperze polymeru	20 mg

(hydroxypropylmethylcelulóza a oxid titaničitý s polyethylenglykolem 400 a barvivém)

Leštidlo:

35	polyethylenglykol 8000	2 mg
	celková hmotnost	1022 mg
	B: Tableta povlečená disperzním filmem
40	Jádro:
	sloučenina z příkladu 1	500 mg
	hydrochlorid proguanilu	200 mg
45	mikrokrystalická celulóza	100 mg
	(Avicel pHIOl) hydroxypropylcelulóza	83 mg
	Lo-sub(LHPC, LH11) natriumglykolát škrobu	40 mg
50	(Eplotab) povidon K30	20 mg
	stearát hořečnatý	5 mg
	dokusát sodný	1 mg
	křemičitan hořečnato-hlinitý	50 mg
55	(Veegum F)

-6CZ 289171 B6 sodná sůl sacharinu hmotnost po slisování mg

1000 mg

Povlak:

disperze polymeru 10 mg (hydroxypropylmethylcelulóza a oxid titaničitý s polyethylenglykolem 400 a barvivém)

Leštidlo:

polyethylenglykol 8000 celková hmotnost mg

1012 mg

Výsledky biologických testů

Příklad 3

Porovnání interakce léčivých látek v kombinacích sloučeniny z příkladu 1 s jinými látkami působícími proti malárii

Studie senzitivity léčivé látky in vitro se provádějí za použití poloautomatizovaného technického postupu, který popsal Desjardins (Desjardins a kol., Antimalarial Agents and Chemotherapy 16(6). 710 - 718 /1979/). Antimalarijní aktivita v tomto systému se stanovuje inhibici radiologicky značeného hypoxanithinu vpraveného do parazitů při stupňujících se koncentracích léčivé látky.

Léčivé látky působící proti malárii se testují rozpuštěné ve vodě, v 95% ethanolu nebo v dimethylsulfoxidu. Léčivé látky jsou přitom rozpouštěny ve vodě zředěné 95% ethanolem v poměru 1 : 1 stím, že léčivé látky rozpouštěné v ethanolu se ředí vodou v poměru 1:1. Roztoky léčivé látky se potom ředí kultivačním prostředím, které obsahuje 10 % lidského séra, na počáteční dvacetinásobné až desetinásobné koncentrace odhadnutých hodnot IC50. Léčivé látky se testují a jejich roztoky jsou uvedeny dále.

Léčivá látka	Počáteční rozpouštědlo	Prostředí
sloučenina DMSO 1640 z příkladu 1 chinin	ethanol - voda	1640
chlorochin	voda - ethanol	1640
meflochin	ethanol - voda	1640
primachin	ethanol - voda	1640
artesunát	ethanol - voda	1640
PM443	DMSO	1640
tetracyklid	DMSO	1640
norfloxaxin	DMSO	1640
ciprofloxacin	DMSO	1640
proguanil	ethanol - voda	Lo-folát
cykloguanil	ethanol - voda	Lo-folát
pyrimethamin	DMSO	Lo-folát
trimethoprim	DMSO	Lo-folát
sulfamethoxazol	DMSO	Lo-folát
dapson	DMSO	Lo-folát
clopidol	DMSO	Lo-folát

Léčivá látka____________________________Počáteční rozpouštědlo__________Prostředí_______ allopurinol ethanol - voda Lo-folát

PS-15 DMSO Lo-folát

WR99210 DMSO Lo-folát

Za účelem studia kombinace léčivých látek se roztoky léčivé látky při počátečních koncentracích kombinují v různých poměrech (1 : 5, 1 : 2, 2 : 1 a 5 : 1). Roztoky léčivé látky a kombinace se 5 potom vnesou na mikrotitrační plotnu s 96 jamkami, aby se dosáhly dvě řady sloučeniny z příkladu 1. Tím je kombinována léčivá látka a jsou čtyři kombinace dvou léčivých látek. Série ředění léčivé látky v poměru 1 : 3 s prostředím se naplní do mikrotitrační plotny s 96 jamkami za použití pipety s 12 kanálky. K ohodnocení se léčivé látky klasifikují jako inhibitory reduktázy kyseliny dihydrolistové (DHFR), přičemž se použije modifikovaného kulturního prostředí, které ío obsahuje pouze fyziologické koncentrace kyseliny listové a PABA.

Zbývající biologické procedury se provádějí podle technického postupu popsaného Desjardinem s tím rozdílem, že se použijí tři kmeny Plasmodium falciparum (multidrogově rezistentní klon W-2, drogově senzitivní, ale kmeflochinu rezistentní klon D-6 a C2B izolát rezistentní ke 15 sloučenině z příkladu 1) a inkubace se prodlouží na dobu 72 hodin.

Jednotlivé hodnoty IC50 se vypočítají za použití programu „MINSQ“ od Micromath Scientific Software. Každá souprava párových hodnot se proloží hyperbolickou tangenciální funkcí za použití postupu podle Desjardinse.

Hodnoty IC50 byly normalizovány stanovením hodnot 1 k IC50 pro sloučeninu z příkladu 1 a pro jinou léčivou látku, která byla kombinována s proporcionálně normalizovanými hodnotami pro každý poměr dvou léčivých látek, které se studují. Izobologram se sestrojí zařízením hodnot do rovnice:

Yi = 1 - [X/(Xj + e^l-Xi)/] ve kterém

Yj znamená hodnotu IC50 pro sloučeninu z příkladu 1, pokud je kombinována s jinou léčivou látkou,

X znamená hodnotu IC₅₀ pro jinou léčivou látku, pokud je kombinována se sloučeninou z příkladu 1 a

I znamená parametr interakce ukazující stupeň reverze.

Hodnoty I se vypočítají pro každou kombinaci. Kladné hodnoty I ukazují na synergickou kombinaci, negativní hodnoty jsou ukazatelem antagonismu a I rovnající se nule ukazuje na 40 aditivní interakci.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

-8CZ 289171 B6

Tabulka 1

Léčivá látka kombinovaná se sloučeninou z příkladu 1	W-2	I D-6	C2B
chinin	-1,36
chlorochin	-1,84	-1,40
meflochin	-1,19
tetracyklin	1,27	1,11	0,02-0,08
primachin	-0,79
kyselina artesunová		-0,18
PM443		-1,28
norfloxacin	1,02
ciprofloxacin	-1,222
pyrimethamin	0,36		-0,48
trimethoprim	1,27		0,58
proguanil	2,42,2,88	2,56	2,56
cykloquanil	2,21	1,66	0,13,-0,73
allopurinol	1,14	0,43
PS-15	1,77, 0,65,1,97	-0,74
WR99210	0,02
sulfamethoxazol	2,75
dapson	-0,39
klopidol	2,38, 2,65	0,73

Výsledky ukazují, že kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu aproguanilu projevuje mnohem důkladnější potenciaci v porovnání s jinými kombinacemi testovaných léčivých látek, zvláště proti kmeni C2B rezistentnímu k hydroxynaftochinonu.

Optimální poměr kombinace s proguanilem se stanoví pro každý ze tři kmenů parazitu malárie, určením poměru hodnoty IC50 proguanilu k hodnotě IC50 sloučeniny vzorce II. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 dále.

Tabulka 2 proguanil: sloučenina obecného vzorce I

W-2_______D-6_______C2B

920:1 4038:1 0,2:1

2473:1

Příklad 4

Srovnání antitoxoplazmové aktivity in vivo sloučeniny z příkladu 1, proguanilu a jejich kombinací

Aktivity sloučenin a kombinací se zkoušejí na myším modelu T. gondii za použití zvyšující se doby k uhynutí a procenta přežití u myší, jako měřítka aktivity léčivé látky.

Skupiny 10 myší kmene CBA/CA o hmotnosti 20 g se infikují 6 cystami kmene C56 T. gondii orálně zavedenou žáludeční sondou. Ošetřování léčivou látkou se začne o 3 dny později a pokračuje po dobu 10 dnů. Všechny léčivé látky se podávají orálně zavedenou žaludeční sondou. Zkoušejí se dále uvedené skupiny látek:

-9ČZ 289171 B6 kontrolní stanovení atovakvon @ 10 mg/kg atovakvon @ 25 mg/kg proguanil @ 25 mg/kg atovakvon @10 mg/kg a proguanil @ 25 mg/kg atovakvon @ 25 mg/kg a proguanil @ 25 mg/kg

Všechna zvířata se zkoušejí dvakrát denně po dobu 30 dnů a každé uhynutí se zaznamená.

Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 3 a 4.

Tabulka 3

Střední doba do uhynutí (dny)	0	atovakvon 10 mg/kg	25 mg/kg
proguanil	0	14,0	20,1	24,1
(mg/kg)	25	9,0	18,4	29,3
Tabulka 4
% přežití
			atovakvon
		0	10 mg/kg	25 mg/kg
proguanil	0	10,0	10,1	10,0
(mgfcg)	25	0,0	0,0	80,0

Střední doba po uhynutí kontrolních myší činí 14 dnů, s pouze jediným přežívajícím zvířetem (10%). (Toto zvíře nemuselo dostat infekci v důsledku nízké hodnoty použitého inokula.) Atovakvon samotný zvyšuje toto přežití na 20,1 dne při dávce 10 mg/kg a na 24,1 dne při dávce 25 mg/kg, v obou případech s jediným přežitím (10%). Proguanil, navzdory své zaznamenané vysoké bezpečnosti u člověka, je toxický pro myši. Při dávce 25 mg/kg proguanil projevuje známky toxicity a snižuje střední dobu k uhynutí na 9 dnů, s žádným přežitím. Kombinace 10 mg/kg atovakvonu s 25 mg/mg proguanilu poskytuje střední dobu přežití 18,4 dne. Kombinace 25 mg/kg atovakvonu s 25 mg/kg proguanilu poskytuje zvýšenou dobu přežití, navzdory toxicitě proguanilu, a 80 % myší přežívá v porovnání s minimálním přežíváním 10 % myší, které obdržely samotný atovakvon.

Příklad 5

Srovnání antitoxiplazmových aktivit in vitro sloučeniny z příkladu 1, proguanilu a jejich kombinaci

Studie senzitivity léčivé látky in vitro se provádějí za použití poloautomatizovaného technického postupu, založeného na postupu používaném pro malárii (Desjardins a kol., Antimalarial Agents and Chemotherapy 16(6), 710-718 /1979/), s tím rozdílem, že se použije selektivního vpravení ³[H]-uracilu T. gondii. Antitoxoplazmová aktivita v tomto systému se stanovuje inhibicí pohlcování radiologicky značeného uracilu v parazitech při stupňujících se koncentracích léčivých látek.

-10CZ 289171 B6

Léčivé látky se rozpustí v dimethylsulfoxidu a zředěné roztoky se připraví za použití kulturního prostředí obsahujícího 3 % fetálního telecího séra. Za účelem studia kombinace léčivých látek se roztoky léčivé látky při počátečních koncentracích kombinují v různých poměrech 1:1, 1:3 a 3:1. Připraví se série ředění léčivé látky v poměru 1:2 a kombinací a použijí se ve dvojích jamkách mikrotitrační plotny s 96 jamkami, kam se předem naočkovaly buňky HeLa a RH kmene T. gonii. Léčivé látky se přidají dvě hodiny po parazitovi a desky se inkubují za teploty 37 °C po dobu 24 hodin, kdy se přidá ³[H]-uracil a v inkubaci se pokračuje dalších 8 hodin. Zkouška se dokončí odstraněním kapaliny - supamatantu, T. gonii obsahující buňky se naruší v SDS a značené proteiny se vysráží s TCA na filtrační podložce. Začlenění značeného podílu se měří na β-deskovém scintilačním počítači. Procento inhibice začlenění uracilu se vypočítá pro sloučeniny a kombinace. Hodnoty IC₅₀ se vypočítají za použití programu gSl. Hodnoty IC₅₀ jsou normalizovány stanovením hodnot 1 k IC50 pro sloučeniny pro každý poměr dvou léčivých látek, které se studují. Izobologram se sestrojí vynesením těchto normalizovaných hodnot IC₅₀ proti sobě. Potenciace se ukazuje u hodnot vyskytujících se pod křivkou izobologramu, přídavný účinek hodnotami na křivce a antagonismus hodnotami nad křivkou.

Desky se používají trojmo a všechny hodnoty se vynesou.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5

Normalizované hodnoty IC50 Potenciace atovakvon proguanil

0,559278	0,583893	ne
0,196689	0,614094	ano
0,729381	0,253691	ano
0,345238	0,527273	ano
0,130952	0,6	ano
0,233333	0,118182	ano
0,404959	0,451538	ano
0,229201	0,768462	ano
0,244904	0,091538	ano

Výsledky ukazují, že kombinace atovakvonu a proguanilu projevuje potenciaci in vitro proti T. gondii.

Příklad 6

Srovnání antipneumocystózové aktivity in vivo u sloučeniny z příkladu 1, proguanilu a jejich kombinací

Aktivity sloučenin a kombinací se zkoušení na SCID myším modelu Pneumocystis pneumonia.

Úroveň infekce myší v každé skupině se měří za použití standardních otiskových preparátů plic a imunofluorescenčních testů. Vyhodnocení se provádí pro každou myš, přitom 0 znamená bez infekce a +4 představuje velmi těžkou infekci.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

-11CZ 289171 B6

Tabulka 6

Ošetření	Vyhodnocení	Počet infikovaných/počet zkoušených	Střední hodnota ± směrodatná odchylka	% z kontrolního stanovení
0	+1	+3	+4	+4
neošetřená kontrola	0	0	0	3	7	10/10	3,70±0,14	100
atovakvon 50 mg/kg p.o. denně	0	0	5	5	0	10/10	2,50±0,16	68
atovakvon 25 mg/kg p.o. dennč	0	0	1	7	2	10/10	3,10±0,17	84
proguanil 25 mg/kg p.o. dennč	0	0	0	2	8	10/10	3,80±0,13	85
atovakvon a proguanil 50 + 25 mg/kg p.o. denně	5	4	1	0	0	5/10	0,50±0,21	14
atovakvon a proguanil 25 + 25 mg/kg	1	0	4	4	0	W	2,22±0,31	60

p.o. denně

Pokud se dávkuje samotný atovakvon, vede ke snížení rozsahu infekce. Proguanil samotný v dávce 25 mg/kg za den je neúčinný při profylaxi PCP u SCID myší. Proguanil v kombinaci s atovakvonem projevuje synergii.

V příkladové části vynálezu byly použity následující zkratky:

WR99210

PS-15

PABA TCA SDS DMSO

4,6-diamino-l,2-dihydro-2,2-dimethyl-l-/gamma-2',4',5'-trichlorfenoxypropyloxy/-s-triazin hydrochlorid diaminu N-( 1 -methy lethyl)-N73-(2,4,5-trichlorfenoxy)propoxy/imidodikarbonimidu kyselina p-aminobenzoová kyselina trichloroctová dodecylsíran sodný dimethylsulfoxid

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

25 1. Použití kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu aproguanilu s hmotnostním poměrem proguanilu k 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4naftochinonu v rozmezí 1:1 až 1:3 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo profylaxi protozoálních parazitických infekce nebo infekcí vyvolaných u savců Pneumocystis carinii.
2. Použití kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu a proguanilu s hmotnostním poměrem proguanilu k 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4naftochinonu 2:5 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo profylaxi protozoálních parazitických infekcí nebo infekcí vyvolaných u savců Pneumocystis carinii.
3. Použití kombinace 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinonu a proguanilu, v němž se 2-/4-(4-chlorfenyl)cyklohexyl/-3-hydroxy-l,4-naftochinon užije ve formě trans-izomeru nebo ve formě směsi izomerů cis a trans, v níž převažuje trans-izomer, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo profylaxi protozoálních parazitických infekcí nebo

40 infekcí vyvolaných u savců Pneumocystis carinii.