SI9300614A

SI9300614A - Atovaquone and proguanil combinations

Info

Publication number: SI9300614A
Application number: SI9300614A
Authority: SI
Inventors: Winston Edward Gutteridge; David Brian Ashton Hutchinson; Victoria Susan Latter; Mary Pudney
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1992-11-26
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 1994-06-30
Also published as: HUT71346A; EP0670719A1; BG62595B1; JPH08503938A; KR100294802B1; US5998449A; NO313225B1; RO119280B1; DK0670719T3; PL174323B1; GR3033745T3; CZ289692B6; CN1087935C; CY2193B1; SA93140434B1; BG99656A; AU5532294A; CZ289171B6; ATE191340T1; SG45387A1

Description

Kombinacije atovakona in progvanila

Pričujoči izum se nanaša na sinergistične kombinacije 2-[4-(4-klorofenil)-cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinona (atovakona) in progvanila, ki imajo anti-parazitski učinek. Podrobneje se izum nanaša na farmacevtske pripravke, ki vsebujejo te kombinacije, na njihovo uporabo pri zdravljenju protozojskih parazitskih infekcij, kot malarije in toksoplazmoze, in na njihovo uporabo pri zdravljenju infekcij, ki jih povzroča Pneumocystis carinil.

f

Spojina 2-[4-(4-klorofenil)cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinon (atovakon) je bila že razkrita, npr. v evropskem patentu št. 123,238, ki se nanaša na 2-substituirane 3-hidroksi-l,4-naftokinone s formulo (I)

v kateri je bodisi R¹ vodik in je R² izbran izmed C16-alkoksi, aralkoksi, C^-alkilC^-alkoksi, fenila, substituiranega z eno ali dvema skupinama, izbranima izmed halogena in C^-alkila, halogena in perhalo-C^-alkila, bodisi sta R¹ in R² oba Cwalkil ali fenil in je n 0 ali 1, in na njihove fiziološko sprejemljive soli. Trdijo, da imajo spojine anitiprotozojski učinek. Izrecno trdijo, da so spojine s formulo (I), v kateri je n 0, učinkovite proti parazitu humane malarije Plasmodiumu falciparum in tudi proti vrstam Eimeria, kot E.tenella in E.acervulina, ki so organizmi, ki povzročajo kokcidiozo, in za spojine s formulo (I), v kateri je n 1, trdijo, da so učinkovite proti protozojem rodu Theileria, zlasti T. annulata ali T.parva. Med spojinami, ki so izrecno imenovane in navedene za primer, je spojina s formulo (I), v kateri je n 0, R¹vodik in R² 4-klorofenil, t.j. atovakon.

Progvanil je znano zdravilo za profilakso, toda ne za zdravljenje malarije. Je eno najvarnejših protimalarijskih zdravil in ga lahko dajemo majhnim otrokom in nosečnicam. Vendar pa se je pojavila odpornost P.falciparum proti progvanilu, zlasti v Jugovzhodni Aziji, in je vedno večji problem.

Za boj proti odpornosti proti zdravilom postaja uporaba več kot enega sredstva proti malariji, bodisi istočasno ali zapored, standardna praksa. Vendar pa so mnoge take kombinacije antagonistične, kar ima za posledico manj učinkovito zdravljenje, in režimi doziranja so pogosto zapleteni, kar zvišuje verjetnost, da bolnikom ne bo uspelo dovršiti zdravljenja. V skladu s tem je bil en smoter pričujočega izuma dati na razpolago kombinacijo protimalarijskih zdravil, ki ne bi bila antagonistična in ki ne bi zahtevala kompleksnega režima doziranja.

Sedaj pa smo presenetljivo ugotovili, da dosežemo s kombiniranjem, bodisi istočasnim ali zaporednim, atovakona, ki ga v tem opisu predstavlja formula (II)

Cl in progvanila ojačitev antiparazitskega in zlasti antimalarijskega učinka. Poleg tega lahko ponudimo ojačevalno kombinacijo spojine s formulo (II) in progvanila enostavno v enem samem farmacevtskem pripravku.

V prvem vidiku daje pričujoči izum na razpolago postopek za zdravljenje in/ali profilakso protozojske parazitske infekcije, npr. malarije ali toksoplazmoze, ali infekcije, ki jo povzroča P.carinii pri sesalcih, vključno ljudeh, ki obsega dajanje učinkovite množine atovakona ali njegove fiziološko sprejemljive soli in istočasno ali zaporedno dajanje učinkovite množine progvanila.

V drugem vidiku daje pričujoči izum na razpolago atovakon za uporabo pri izdelavi zdravila, za bodisi istočasno ali zaporedno dajanje s progvanilom, za zdravljenje in/ali profilakso protozojske parazitske infekcije, npr. malarije ali tokosoplazmoze, ali infekcije, ki jo povzroča P.carinii pri sesalcih, vključno ljudeh.

Prednostno damo spojino s formulo (II) in progvanil istočasno. Najbolj prednostno damo spojino s formulo (II) in progvanil v ojačevalnem razmerju.

Izraz ojačevalno razmerje, kot ga uporabljamo tukaj, da bi pokazali, da sta atovakon in progvanil prisotna v takem razmerju, da je antiparazitski učinek kombinacije večji od učinka atovakona ali progvanila samega ali od aditivnega učinka, ki bi ga lahko napovedali za kombinacijo na osnovi učinkov posameznih sestavin. Zato učinkujejo v kombinaciji posamezne komponente sinergistično, pod pogojem, da so prisotne v ojačevalnem razmerju.

Ojačevalno razmerje, ki ga lahko uspešno uporabimo za zdravljenje malarije, vključno sevov malarije, ki so odporni proti hidroksinaftokinonu, je v območju progvanikatovakon 1:0,1-1:100. Primerno je ojačevalno razmerje v območju 1:0,2 do 1:10.

Posebno prednostno ojačevalno razmerje je v območju 1:1-1:3.

Pričujoči izum daje v drugem vidiku tudi na razpolago tudi postopek za zdravljenje in/ali profilakso malarije pri sesalcih, vključno ljudeh, ki obsega dajanje učinkovite množine kombinacije atovakona ali njegove fiziološko sprejemljive soli in progvanila.

Hidroksilna skupina atovakona lahko tvori s primernimi bazami soli in fiziološko sprejemljive soli atovakona vključujejo soli z anorgansko bazo, kot soli alkalijske kovine (npr. natrija in kalija) in soli zemeljskoalkalijske kovine (npr. kalcijeve soli); sob z organsko bazo, npr. soli s feniletilbenzilaminom, dibenziletilendiaminom, etanolaminom in dietanolaminom, in sob z amino kislinami, npr. lizinom in argininom.

Upoštevali bomo, da lahko spojine s formulo (II) obstojajo kot cis- ab trans-izomer, t.j. da je lahko cikloheksilni obroč cis- ab trans-substituiran z naftokinonovim jedrom in klorofenilno skupino. V skladu s pričujočim izumom lahko uporabimo cis- in transizomere kot tudi njihove zmesi v kateremkoli razmerju. Če je spojina v obliki zmesi izomerov, bo na splošno trans-izomer prisoten v množini okoli 50 % ab pa bo prevladujoči izomer, vendar je v obsegu izuma vključena tudi uporaba zmesi, v katerih prevladuje cis-izomer. Specifično razmerje izomerov lahko po potrebi variiramo. Tipične zmesi vključujejo tiste, v katerih je razmerje med cis- in transizomerom okoli 1:1, 40:60 in 5:95. Za uporabo v skladu s pričujočim izumom je prednosten trans-izomer spojine s formulo (II) ab zmes njenih cis- in trans-izomerov, ki vsebuje vsaj 95 %, npr. 99 % trans-izomera.

Spojina s formulo (II) lahko obstoja tudi v tavtomemi obliki, v kateri da hidroksilna skupina svoj proton eni od okso skupin, in uporaba takih tavtomernih oblik je vključena v obsegu tega izuma. Vendar pa smatramo, da je stabilna oblika tista, ki jo kaže formula (II).

Množina kombinacije atovakona in progvanila, ki je potrebna, da bi bila učinkovita kot antiparazitsko sredstvo, bo seveda variirala in o njej bo končno odločal zdravnik ab živinozdravnik. Faktorji, ki jih je treba upoštevati, vključujejo način dajanja in naravo pripravka, telesno maso sesalca, njegovo starost in splošno stanje in naravo in resnost bolezni, ki jo je treba zdraviti. Na splošno je primerna učinkovita doza za dajanje Človeku za zdravljenje malarije v območju od 2,0 mg do 30 mg progvanila na kg telesne mase dnevno in 0,5 mg do 30 mg atovakona na kg telesne mase dnevno, npr. od 3 do 20 mg/kg/dan progvanila in 1 do 20 mg/kg/dan atovakona, zlasti od 5 do 15 mg/kg/dan progvanila in od 3 do 15 mg/kg/dan atovakona.

Primerna učinkovita doza za dajanje človeku za profilakso malarije je v območju od po 3 do 20 mg progvanila in atovakona na kg telesne mase na teden. npr. od po 6 mg/kg/teden do 10 mg/kg/teden progvanila in atovakona.

Razumljivo je, da so doze, o katerih govorimo zgoraj, izračunane kot zdravila sama.

Za uporabo v skladu s pričujočim izumom ponudimo kombinacijo atovakona in progvanila prednostno kot farmacevtski pripravek.

Farmacevtski pripravki obsegajo učinkovine (t.j. kombinacijo atovakona in progvanila) skupaj z enim ali več farmacevtsko sprejemljivimi nosilci zanje in v danem primeru drugimi terapevtskimi in/ali profilaktičnimi sestavinami. Nosilec (nosilci) mora (morajo) biti sprejemljiv (sprejemljivi) v smislu, da so združljivi z drugimi sestavinami pripravka in da niso škodljivi za njegovega prejemnika.

V skladu s tem daje pričujoči izum na razpolago farmacevtski pripravek, ki obsega kombinacijo atovakona in progvanila v povezavi z enim ali več farmacevtsko sprejemljivimi nosilci zanju.

Nadalje daje pričujoči izum na razpolago postopek za pripravo farmacevtskega pripravka, ki obsega združevanje kombinacije atovakona in progvanila z enim ali več farmacevtsko sprejemljivimi nosilci zanju.

Kombinacijo atovakona in progvanila lahko primerno nudimo kot farmacevtski pripravek v obliki dozirne enote. Primeren pripravek dozirne enote vsebuje učinkovini v množinah od po 10 mg do 3 g, npr. po 50 mg do 3 g. Tipična dozirna enota lahko vsebuje npr. 500 mg atovakona in 200 mg progvanila ali 500 mg atovakona in 500 mg progvanila.

Farmacevtski pripravki vključujejo pripravke, primerne za oralno, lokalno (vključno dermalno, bukalno ali sublingvalno), rektalno in paranteralno (vključno subkutano, intradermalno, intramuskularno in intravensko) dajanje kot tudi za dajanje po nazogastrični cevi. Kjer je primerno, lahko pripravek prikladno ponudimo v ločenih dozirnih enotah in pripravimo ga lahko po katerikoli od metod, ki so znane v farmacevtski stroki. Vse metode vključujejo stopnjo združevanja učinkovin s tekočimi nosilci ali fino porazdeljenimi trdnimi nosilci ali obemi in nato, če je potrebno, oblikovanje produkta v želeni pripravek.

Farmacevtske pripravke, primerne za oralno dajanje, v katerih je nosilec trdna snov.

ponudimo najbolj prednostno kot pripravke v dozirnih enotah, kot pilule, kapsule ali tablete, od katerih vsebuje vsaka vnaprej določeno množino učinkovin. Tableto lahko izdelamo s stiskanjem ali oblikovanjem, v danem primeru z eno ali več pomožnimi sestavinami. Stisnjene tablete lahko pripravimo s stiskanjem učinkovin v sipki obliki, kot prahu ali granul, ki so v danem primeru pomešane z vezivom, lubrikantom, inertnim razredčilom, mazivnim sredstvom, površinsko aktivnim sredstvom ali dispergirnim sredstvom, v primernem stroju. Oblikovane tablete lahko izdelamo z oblikovanjem v inertnem tekočem razredčilu. Tablete so lahko v danem primeru preslojene, in če so nepreslojene, so lahko v danem primeru opremljene z delilno zarezo. Kapsule lahko pripravimo tako, da napolnimo učinkovine, bodisi same ah v zmesi z eno ah več dodatnimi sestavinami, v lupine za kapsule in jih nato zapremo na običajen način. Oblati so analogni kapsulam, kjer so učinkovine skupaj s katerokoli dodatno sestavino (dodatnimi sestavinami) zaprte v ovojnico iz riževega papirja. Kombinacije spojine s formulo (II) in progvanila lahko formuliramo tudi kot disperzibilne granule, ki jih lahko npr. pred dajanjem suspendiramo v vodi ali posujemo na hrano. Granule lahko zapakiramo, npr. v vrečko. Pripravke, primerne za oralno dajanje, kjer je nosilec tekočina, lahko ponudimo kot raztopino aii suspenzijo v vodni tekočini ali v nevodni tekočini ali kot tekočo emulzijo olje-v-vodi.

Pripravki za oralno dajanje vključujejo dozirne enote s kontroliranim sproščanjem, npr. tablete, v katerih so učinkovine formulirane v primerni matrici, ki kontrolira sproščanje, ali so preslojene s primernim filmom, ki kontrolira sproščanje. Taki pripravki so lahko posebno primerni za profilaktično uporabo.

Učinkovine lahko formuliramo tudi kot raztopino ali suspenzijo, primerno za dajanje po nazo-gastrični cevi.

Farmacevtske pripravke, primerne za rektalno dajanje, v katerih je nosilec trdna snov, ponudimo najbolj prednostno kot supozitorije z dozirno enoto. Primerni nosilci vključujejo kakavovo maslo in druge materiale, ki se običajno uporabljajo v stroki. Supozitorije lahko primerno oblikujemo tako, da primešamo aktivno kombinacijo zmehčanemu ali staljenemu nosilcu (zmehčanim ali staljenim nosilcem), čemur sledi ohlajenje in oblikovanje v kalupih.

Farmacevtski pripravki, primerni za parenteralno dajanje, vključujejo sterilne raztopine ali suspenzije aktivne kombinacije v vodnih ali oljnatih vehiklih. injekcijske pripravke lahko prilagodimo za bolusno injekcijo ali kontinuirno infuzijo. Take pripravke ponudimo primerno v posodah z dozirno enoto ali z več dozami, ki so po uvedbi pripravka zaprte, dokler jih ne rabimo za uporabo. Alternativno so lahko učinkovine v prahasti obliki in jih pred uporabo združimo s primernim vehiklom, kot sterilno, nepirogeno vodo.

Kombinacijo atovakona in progvanila lahko pripravimo tudi kot depojski pripravek z dolgotrajnim delovanjem, ki ga lahko damo z intramuskulamo injekcijo ali z implantacijo, npr. subkutano ali intramuskulamo. Depojski pripravki lahko vključujejo npr. primerne polimerne ali hidrofobne materiale ali ionske izmenjalne smole. Taki pripravki z dolgotrajnim delovanjem so zlasti primerni za profilaktično uporabo.

Razumljivo je, da lahko vključujejo farmacevtski pripravki za različne načine dajanja, opisane zgoraj, poleg prej omenjenih nosilnih sestavin, kot je primerno, eno ali več nosilnih sestavin, kot razredčil, pufeijev, sredstev za aromo, veziv, površinsko aktivnih sredstev, zagostil, lubrikantov, konservansov (vključno antioksidantov) ipd., in snovi, ki so vključene zato, da bi napravili pripravek izotoničen s krvjo predvidenega prejemnika.

Pripravki, primerni za veterinarsko uporabo, vključujejo tiste, ki so prilagojeni za oralno, parenteralno in intraruminalno dajanje.

Postopki za pripravo atovakona so opisani v EP 123,238 in en specifičen postopek je pojasnjen v primeru 1.

Primer I

2-[trans-4-(4-klorofenil)cikloheksill-3-hidroksi-l,4-naftokinon

a) 4-(4-klorofenil)cikloheksan-l-karboksilna kislina

Acetil klorid (30 g) in fino uprašeni aluminijev klorid (60 g) smo mešali skupaj v ogljikovem disulfidu (120 ml) in nato ohladili v kopeli s CO^oksitolom na -50°C. V teku 10 minut smo po kapljicah dodali cikloheksen (30 g), ki smo ga predhodno ohladili na -50°C, pri čemer smo vzdrževali temperaturo reakcijske zmesi pod -20°C. Zmes smo mešali pri -50°C še 60 minut in topilo nato oddekantirali, da je preostal smolnat oranžen kompleks. Dodali smo malo klorobenzena, ko se je material segreval na sobno temperaturo. Nato smo dodali preostanek klorobenzena (skupno 300 ml), tako dobljeno raztopino segrevali med mešanjem 3 ure na 40°C, jo zlili na zmes ledu in koncentrirane klorovodikove kisline in vodni sloj ločili, sprali z 2 M klorovodikovo kislino, 2 M natrijevim hidroksidom in vodo, posušili nad brezvodnim natrijevim sulfatom in uparili do suhega. Produkt smo destilirali v vakuumu, zbrali frakcijo z vreliščem 140 do 154°C (13,33 Pa), jo razredčili z enakim volumnom petrol etra (40-60), ohladili na -6°C, skoznjo prepihavali kontinuiran tok mehurčkov dušika in pridobili brezbarvno trdno snov, ki seje izločila.

Raztopini natrijevega hidroksida (6,2 g) v vodi (42 ml) z 0°C smo dodali brom (2,8 ml). Zgoraj dobljeni substituirani heksahidroacetofenon (3,1 g) smo raztopili v dioksanu (15 ml) in nato dodali mrzlo raztopino hipobromita, pri čemer smo vzdrževali reakcijsko zmes pri temperaturi pod 20°C. Reakcijsko zmes smo mešali pri sobni temperaturi 6 ur in jo nato pustili stati preko noči. Dodali smo natrijev metabisulfit, da smo razkrojili prebitek hipobromita, zmes ohladili in nato nakisali, da smo dobili brezbarvno trdno snov. Trdno snov smo odfiltrirali, sprali z vodo, posušili in prekristalizirali iz etanola, da smo dobili 4-(4-klorofenil)-cikloheksan-l-karboksilno kislino, tal. 254-256°C.

b) 2-i4-(4-klorofenil)cikloheksil1-3-kloro-l,4-naftokinon

Zmes 2-kloro-l,4-naftokinona (3,95 g, 0,02 mola), 4-(4-klorofenil)cikloheksan-lkarboksilne kisline (4,9 g, 0,02 mola) in uprašenega srebrovega nitrata (1,05 g, 0,0062 mola) smo segrevali v 40 ml acetonitrila med močnim mešanjem do refluksa. V teku 1 ure smo dodali po kapljicah raztopino amonijevega persulfata (12,0 g. 0,0525 mola) v 50 ml vode. Zmes smo refluktirali 3 ure in jo nato hladili v ledu 30 min, nakar smo jo filtrirali in preostalo lepljivo trdno snov ekstrahirali dvakrat z vrelim kloroformom, da smo odstranili anorganski material. Kloroform smo odstranili z uparevanjem, da je preostala rumeno rjava trdna snov (okoli 2,7 g). To smo raztopili v 40 ml vrelega acetonitrila. Malo netopnega materiala smo odstranili s filtracijo. Pri ohlajenju se je naslovna spojina izločila kot rumeni kristali (550 mg), tal. 172-175°C.

NMR, dH (5₆-DMSO) 8,05 (2H, mult., /3-naft), 7,85 (2H, mult., a-naft), 7,30 (4H, s., PhH), 3,30 (IH, br.t., CH), 2,67 (IH, br. t., CH), 1,2-2,4 (8H, mult., 4xCH₂).

c) 2-[4-(4-klorofenil)cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinon

Produkt iz stopnje (b) smo suspendirali v 10 ml vrelega metanola in v teku 15 min dodali po kapljicah 0,55 g kalijevega hidroksida v 5,5 ml vode. Zmes smo refluktirali, doker ni nastala temno rdeča raztopina (po okoli 6 h), ki smo ji previdno dodali po kapljicah 2 ml koncentrirane klorovodikove kisline. Zmes smo ohladili in filtrirali in trdni preostanek temeljito sprali z vodo. Vodne izpiralne tekočine smo ponovno nakisali in filtrirali. Združene trdne preostanke (500 mg), tal. 200-209°C, smo prekristalizirali iz acetonitrila, da smo dobili naslovni produkt kot trans-izomer (300 mg), tal. 216-219°C.

Primer 2

Naslednji primeri pojasnjujejo običajne farmacevtske pripravke, ki jih lahko uporabimo v skladu s pričujočim izumom.

A. S filmom prevlečena tableta

Jedro:

spojina iz primera 1 500 mg progvanil hidroklorid 200 mg mikrokristalinična celuloza (Avicel PH101) 130 mg hidroksipropil celuloza, Lo-sub, (LHPC, LH11) 99 mg natrijev škrobov glikolat (Explotab) 30 mg povidon K30 36 mg magnezijev stearat 5 mg

Stisna masa 1000 mg

Prevleka:

polimerna disperzija (hidroksipropilmetilceluloza in titanov dioksid in polietilen glikol 400 in barvilo) 20 mg

Politura:

polietilen glikol 8000 2 mg skupna masa 1022 mg

B. Disperzibilna, s filmom prevlečena tableta

Jedro:

spojina iz primera 1 500 mg progvanil hidroklorid 200 mg mikrokristalinična celuloza (Avicel PH101) 100 mg hidroksipropil celuloza, Lo-sub, (LHPC, LH11) 83 mg natrijev škrobov glikolat (Explotab) 40 mg povidon K30 20 mg magnezijev stearat 5 mg natrijev dokuzat 1 mg magnezijev aluminijev silikat (Veegum F) 50 mg natrijev saharin 1 mg

Stisna masa 1000 mg

Prevleka:

polimerna disperzija (hidroksipropilmetilceluloza in titanov dioksid in polietilen glikol 400 in barvilo) 10 mg

Politura:

polietilen glikol 8000 2 mg skupna masa 1012 mg

REZULTATI BIOLOŠKIH TESTOV

Primer 3

Primerjava medsebojnega delovanja zdravil v kombinacijah spojine iz primera 1 z drugimi antimalarijskimi sredstvi

Raziskave občutljivosti za zdravilo in vitro smo izvedli ob uporabi semiavtomatizirane tehnike po Desjardinsu (Desjardins et. al. Antimalarial Agents and Chemotherapy 1979; 16(6): 710-718). Antimalarijski učinek v tem sistemu smo določili z inhibicijo vključitve radioaktivno markiranega hipoksantina v parazite z naraščajočimi koncentracijami zdravil.

Antimalarijska zdravila za testiranje smo raztopili v vodi, 95 %-nem etanolu ali DMSO. Zdravila, raztopljena v vodi, smo razredčili 1:1 s 95 %-nim etanolom in zdravila, raztopljena v etanolu, smo razredčili 1:1 z vodo. Raztopine zdravil smo nato razredčih s kulturnim medijem, ki je vseboval 10 % humanega seruma, do začetnih koncentracij, ki so 20- do 50-kratnik ocenjenega IC₅₀. Testirana zdravila in njihova topila so zbrana niže.

Zdravilo	Začetno topilo	Medij
spojina iz primera 1	DMSO	1640
kinin	etanol-voda	1640
klorokin	voda-etanol	1640
meflokin	etanol-voda	1640
primakin	etanol-voda	1640
artesunat	etanol-voda	1640
PM443	DMSO	1640
tetraciklin	DMSO	1640
norfloksacin	DMSO	1640
ciprofloksacin	DMSO	1640
progvanil	etanol-voda	Lo-folat
ciklogvanil	etanol-voda	Lo-folat
_v pirimetamin	DMSO	Lo-folat
trimetoprim	DMSO	Lo-folat

sulfametoksazol	DMSO	Lo-folat
dapson	DMSO	Lo-folat
klopidol	DMSO	Lo-folat
alopurinol	etanol-voda	Lo-folat
PS-15	DMSO	Lo-folat
WR99210	DMSO	Lo-folat

Da bi raziskali kombinacije zdravil, smo raztopine zdravil z izhodnimi koncentracijami kombinirali v različnih razmerjih (1:5,1:2, 2:1 in 5:1). Raztopine zdravil in kombinacije smo nato nanesli na mikrotitracijsko ploščo s 96 vdolbinicami, da smo dobili dvojne vrste spojine iz primera 1, zdravila, ki smo ga kombinirali, in 4 kombinacij obeh zdravil. Izdelali smo serijske razredčine zdravil z mediji 1:3, da smo napolnili mikrotitracijsko ploščo s 96 vdolbinicami ob uporabi 12-kanalne priprave za pipetiranje. Da bi ocenili zdravila, ki smo jih klasificirali kot inhibitorje reduktaze dihidrofolne kisline (DHFR), smo uporabili modificirani kulturni medij, ki je vseboval samo fiziološke koncentracije folne kisline in PABA.

Preostale biološke postopke smo izvedli v skladu z Desjardinsovo tehniko, le da smo uporabili tri seve parazita P. falciparum (klon W-2, odporen proti več zdravilom, klon D-6, občutljiv za zdravilo, vendar odporen proti meflokinu, in izolat C2B, odporen proti spojini iz primera 1) in inkubacijo podaljšali za 72 ur.

Posamezne vrednosti IC₅₀ smo izračunali ob uporabi programa MINSQ firme Micromath Scientific Software. Vsako serijo parov podatkov smo prilagodili tangenti hiperbolske funkcije, ki jo je uporabil Desjardins.

Vrednosti IC_5Q smo normalizirali tako, da smo dodelili vrednosti 1 vrednosti IC₅₍₎ za spojino iz primera 1 in drugim zdravilom, ki jih kombiniramo, s proporcionalnimi normaliziranimi vrednostmi za vsako razmerje dveh zdravil, ki ju preučujemo. Konstruirali smo izobologram tako, da smo podatke prilagodili enačbi

Υ = 1-[Χ/(Χ+6'·(1-Χ,))], kjer je Y = IC₅₀ za spojino iz primera 1, če je kombinirana z drugim zdravilom,

X. — IC_5Q za drugo zdravilo, če je kombinirano s spojino iz primera 1,

I — interakcijski parameter, ki kaže stopnjo reverzije.

Vrednosti parametra I smo izračunali za vsako kombinacijo. Pozitivne vrednosti parametra I so kazale na sinergistično kombinacijo, negativne vrednosti na antagonizem in I = 0 na aditivno interakcijo.

Rezultati so prikazani v tabeli 1.

TABELA 1

Zdravilo, kombinirano I

s spojino iz primera 1	W-2	D-6	C2B
kinin	-1,36
klorokin	-1,84	-1,40
meflokin	-1,19
tetraciklin	1,27	1,11	0,02, -0,08
primakin	-0,79
artesunska kislina		-0,18
PM443		-1,28
norfloksacin	1,02
ciprofloksacin	-1,22
pirimetamin	0,36		-0,48
trimetoprim	1,27		0,58
progvanil	2,43,2,88	2,56	2,56
ciklogvanil	2,21	1,66	0,13,-0,73
alopurinol	1,14	0,43
PS-15	1,77,0,65,1,97	-0,74
WR99210	0,02
sulfametoksazol	2,75
dapson	-0,39
klopidol	2,38,2,65	0,73

Rezultati kažejo, da so kombinacije 2-[4-(4-klorofenil)cikloheksil]-3-hidroksi-l,4naftokinona in progvanila kazale najbolj konsistentno okrepitev zdravila v primerjavi z drugimi testiranimi kombinaciji zdravil, zlasti proti sevu C2B, odpornemu proti hidroksinaftokinonu.

Optimalno razmerje kombinacije s progvanilom so ocenili za vsakega od treh sevov malarijskega parazita tako, da smo določili razmerje vrednosti IC₅₀ progvanila in vrednosti IC₅₀ spojine s formulo (II). Rezultati so navedeni v tabeli 2 niže.

TABELA 2

W-2 D-6 C2B

Progvanil: spojina s formulo (I) 920:1 4038:1 0,2:1

2473:1

Primer 4

Primerjava anti-toksoplazemskih učinkov in vivo za spojino iz primera 1, progvanil in njune kombinacije

Učinke spojin in kombinacij smo preiskali v mišjem modelu s T.gondii, pri čemer smo uporabili kot merili za učinek zdravila podaljšanje časa do smrti in zvečanje odstotka preživetja miši.

Skupine po 10 miši CBA/CA s po 20 g smo okužili oralno tako, da smo jim prisilno dali 6 cist seva C₅₆ T.gondii, in zdravljenje z zdravilom začeli 3 dni kasneje in z njim nadaljevali 10 dni. Vsa zdravila smo dali oralno s prisilnim dajanjem. Raziskali smo tele skupine:

Kontrole atovakon z 10 mg/kg atovakon s 25 mg/kg progvanil s 25 mg/kg atovakon z 10 mg/kg + progvanil s 25 mg/kg atovakon s 25 mg/kg -h progvanil s 25 mg/kg

Vse živali smo pregledovali 30 dni 2-krat dnevno in zabeležili vse smrti.

Rezultati so prikazani v tabeli 3 in 4.

TABELA 3

Povprečni čas do smrti (dnevi)

		0	Atovakon 10 mg/kg	25 mg/kg
Progvanil (mg/kg)	0 25	140 9,0	20,1 18,4	24,1 29,3
			TABELA4 % preživetja
		0	Atovakon 10 mg/kg	25 mg/kg
Progvanil (mg/kg	0 25	10,0 0,0	10,1 0,0	10,0 80,0

Povprečni čas do smrti kontrolnih miši je bil 14 dni, pri čemer je preživela samo ena žival [10 %]. (Ta žival se ni okužila z nizkim inokulumom, ki smo ga uporabili). Atovakon sam je to zvečal na 20,1 dneva pri 10 mg/kg in na 24,1 dneva pri 25 mg/kg, v obeh primerih z enim samim preživelim [10 %]. Progvanil je navzlic svojemu slovesu izvrstne varnosti pri ljudeh toksičen za miši. Pri 25 mg/kg kaže progvanil znake toksičnosti, pri čemer se povprečni čas do smrti skrajša na 9 dni in ni preživelih. Kombinacija 10 mg/kg atovakona in 25 mg/kg progvanila je dala povprečni čas do smrti 18,4 dneva. Kombinacija 25 mg/kg atovakona in 25 mg/kg progvanila je dala podaljšan čas do smrti navzlic toksičnosti progvanila in preživelo je 80 % miši v primerjavi z minimalnim preživetjem 10 % miši, ki smo jim dali samo atovakon.

Primer 5

Primerjava anti-toksoplazemskih učinkov in vitro za spojino iz primera 1, progvanil in njune kombinacije

Raziskave občutljivosti za zdravilo in vitro smo izvedli ob uporabi semiavtomatizirane tehnike, temelječe na tehniki, ki se uporablja za malarijo (Desjardins et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1979 16 (6) 710-718), le da smo uporabili selektivno vključitev ³[H]-uracila v T.gondii. Antitoksoplazemski učinek v tem sistemu določimo z inhibicijo privzema radioaktivno markiranega uracila v parazite z naraščajočimi koncentracijami zdravil.

Zdravila smo raztopili v DMSO in pripravili razredčine ob uporabi kulturnega medija, ki je vseboval 3 % fetalnega telečjega seruma. Da bi preučili kombinacije zdravil, smo kombinirali raztopine zdravil z začetnimi koncentracijami v različnih razmerjih 1:1, 1:3, 3:1. Pripravili smo serijske razredčine 1:2 raztopin zdravil in kombinacij in jih uporabili v dvojnih vdolbinicah plošče s 96 vdolbinicami, ki smo jih predhodno zasejali s celicami HeLa in sevom RH T.gondii. Dve uri po parazitu smo dodali zdravila in plošče inkubirali pri 37°C 24 ur, ko smo dodali ³[H]-uracil in z inkubacijo nadaljevali še 8 ur. Preizkus smo dokončali s tem, da smo odstranili supernatantno tekočino, zdrobili celice, ki so vsebovale T.gondii, v SDS, in oborili markirane proteine s TCA na filtrski polsti. Vključitev markerja smo izmerili na ploŠčnem scintilacijskem števcu za /3-žarke. Odstotno inhibicijo vključitve uracila smo izračunali za spojine in kombinacije in ob uporabi programa GS1 izračunali vrednosti IC₅₀. Vrednosti IC₅₀ smo normalizirali tako, da smo dodelili vrednost 1 vrednostim IC₅₀ za spojine iz primera 1 in progvanil z normaliziranimi vrednostmi za vsako razmerje obeh zdravil, ki smo ju preučevali. Konstruirali smo izobologram tako, da smo nanesli te normalizirane vrednosti IC₅₀ drugo proti drugi. Na okrepitev zdravila so kazale vrednosti, ki so ležale pod krivuljo izobolograma, na aditiven učinek vrednosti na krivulji in na antagonizem vrednosti nad krivuljo.

Plošče smo nastavili v trojniku in nanesli vse vrednosti.

Rezultati so prikazani v tabeli 5.

TABELA 5

Normalizirane vrednosti IC₅₀ Okrepitev atovakon progvanil

0,559278	0,583893	ne
0,196689	0,614094	da
0,729381	0,253691	da
0,345238	0,527273	da
0,130952	0,6	da
0,233333	0,118182	da
0,404959	0,451538	da
0,229201	0,768462	da
0,244904	0,091538	da

Rezultati kažejo, da kažejo kombinacije atovakona in progvanila okrepitev zdravila in vitro proti T.gondii.

Primer 6

Primerjava anti-pnevmocističnih učinkov in vivo za spojino iz primera L progvanil in njune kombinacije

Učinke spojin in kombinacij smo raziskali v modelu miši z resno kombinirano imunsko pomanjkljivostjo za Pneumocystis pneumonia.

Nivo okužbe miši pri vsaki miši smo izmerili ob uporabi standardnih pljučnih odtiskov razmazov in imunofluorescenčnih testov. Vsaki miši smo dodelili točke, kjer pomeni 0 = ni okužbe in +4 = zelo huda okužba. Rezultati so prikazani v tabeli 6.

TABELA 6

Zdravljenje	Točke	Število	Povprečno	%
		okuženih/	točk	kon-
0	+ 1 +3	+4 +4 število preiskanih	± s.n.*	trole

kontrola, 0 nezdravljena atovakon 0 mg/kg p.o. dnevno atovakon 0 25 mg/kg p.o. dnevno progvanil 0 25 mg/kg p.o. dnevno

0 3

5 5

1 7

0 2

10/10

3,70 ± 0,14 100

2,50 ± 0,16 68

3,10 ± 0,17 84

3,80 ±0,13 85 atovakon in 5 4 progvanil 50 + 25 mg/kg p.o. dnevno

0 5/10

0,50 ± 0,21 14 atovakon in 1 0 4 progvanil 25 + 25 mg/kg p.o. dnevno

0 8/9

2,22 ± 0,31 60 * s.n. — standardna napaka

Če smo ga dali samega, je atovakon povzročil znižanje točk za okužbo. Progvanil sam je bil pri 25 mg/kg/dan neučinkovit pri profilaksi PCP pri miši z resno kombinirano imunsko pomanjkljivostjo. Progvanil v kombinaciji z atovakonom je pokazal sinergijo·

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Uporaba 2-[4-(4-klorofenil)cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinona za izdelavo zdravila za skupno ali zaporedno dajanje s progvanilom za zdravljenje in/ali profilakso protozojske parazitske okužbe ali okužbe, ki jo povzroča P.carinii pri sesalcih.
2. Uporaba po zahtevku 1, označena s tem, da je protozojska parazitska okužba malarija.
3. Uporaba po zahtevku 1, označena s tem, da je protozojska parazitska okužba toksoplazmoza.
4. Uporaba po zahtevku 1 za zdravljenje in/ali profilakso okužbe, ki jo povzroča P.carinii.
5. Kombinacija 2-[4-(4-klorofenil)cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinona in progvanila.
6. Kombinacija po zahtevku 5, označena s tem, da sta 2-[4-(4-klorofenil)cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinon in progvanil prisotna v ojačevalnem razmerju.
7. Kombinacija po zahtevku 6, označena s tem, da je razmerje progvanil:2-[4(4-klorofenil)cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinon v območju od 1:1 do 1:3.
8. Kombinacija po kateremkoli od zahtevkov 5 do 7, označena s tem, da je 2-[4(4-klorofenil)cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinon v obliki trans-izomera ali zmesi cis- in trans-izomerov, v kateri prevladuje trans-izomer.
9. Kombinacija po kateremkoli od zahtevkov 5 do 8 za uporabo pri zdravljenju in/ali profilaksi protozojske parazitske okužbe ali okužbe, ki jo povzroča P.carinii pri sesalcu.
10. Uporaba kombinacije po kateremkoli od zahtevkov 5 do 8 za izdelavo zdravila za zdravljenje in/ali profilakso protozojske parazitske okužbe ali okužbe, ki jo povzroča P.carinii pri sesalcu.
11. Farmacevtski pripravek, označen s tem, da obsega kombinacijo po kateremkoli od zahtevkov 5 do 8 skupaj z enim ali več farmacevtsko sprejemljivimi nosilci zanjo.
12. Pripravek dozirne enote, označen s tem, da obsega po 50 mg do 3 g 2-[4-(4klorofenil)-cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinona in progvanila.
13. Pripravek dozirne enote po zahtevku 10, označen s tem, da obsega 500 mg 2-[4-(4-klorofenil)cikloheksil]-3-hidroksi-l,4-naftokinona in 200 mg progvanila.