RO119280B1

RO119280B1 - Asociere farmaceutică, compoziţie farmaceutică şi utilizarea asocierii farmaceutice pentru tratamentul şi/sau profilaxia unei infecţii cauzate de protozoare parazite sau a unei infecţii cauzate de pneumocystis carinii

Info

Publication number: RO119280B1
Application number: RO95-00963A
Authority: RO
Inventors: Winston Gutteridge; David Brian Hutchinson; Victoria Latter; Mary Pudney
Original assignee: The Wellcome Foundation Limited
Priority date: 1992-11-26
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 2004-07-30
Also published as: US5998449A; CN1087935C; AP9300592A0; ATE191340T1; SK281559B6; CA2150234E; GB9224739D0; HU9501537D0; BG62595B1; SA93140434B1; PL174323B1; CZ289692B6; HU225918B1; DK0670719T3; CZ289171B6; TW253835B; EP0670719A1; HUT71346A; NO951995D0; AU685408B2

Abstract

Asocierea farmaceutică, conform invenţiei, conţine 2-[4-(4-clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă şi proguanil, în raport de 1:1 până la 3:1, iar compoziţia farmaceutică, conform invenţiei, conţine 2-[4-(4-clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă şi proguanil, în raport de 1:1 până la 3:1 şi unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic. Asocierea farmaceutică se utilizează pentru tratamentul şi/sau profilaxia unei infecţii cauzate de protozoare sau a unei infecţii cauzate de Pneumocystis carinii. ŕ

Description

Invenția se referă la o asociere farmaceutică, o compoziție farmaceutică, utilizarea asocierii pentru tratamentul și/sau profilaxia infecțiilor cauzate de protozoare parazite sau

Pneumocystis carinii.

Compusul 2-(4-(4-clorfenil)ciclohexil)-3-hidroxi-1,4-naftochinonă atovaquonă, care a fost descris anterior, de exemplu în EP123238, care se referă la 3-hidroxi-1,4-naftochinone-2-substituite, cu formula (I)

R* ^Rî (I) în care R¹ este hidrogen și R² este ales dintre alcoxi, aralcoxi, alchil-C^ alcoxi, fenil, substituit prin una sau două grupări alese dintre halogen și alchil, halogen și perhalo-C^ alchil, fie R¹ și R² sunt ambii alchil sau fenil și n este 0 sau 1 și săruri acceptabile fiziologic ale acestora. Compușii au activitate față de protozoare. în mod specific, compușii de formula (I), în care n este 0, sunt activi față de parazitul malariei umane Plasmodium falciparum și, de asemenea, față de specii Eimeria, precum E.tenella și E. acervulina, care sunt organismele ce produc coccidioză și compușii de formula (I), unde n este 1, fiind activi față de protozoarele genului Theileria, în special T. annulata sau T. parva. Printre compușii numiți și exemplificați, în mod specific, este compusul de formula (I), în care n este 0,R¹,fiind hidrogen și R² este 4-clorfenil, adică atovaquonă.

Proguanilul este un medicament bine cunoscut pentru profilaxia, dar nu și pentru tratamentul malariei. El este unul dintre cele mai sigure medicamente antimalarice și poate fi dat la copii mici și femei gravide. Cu toate acestea, a apărut fenomenul de rezistență al P. falciparum la proguanil, în special în Asia de sud-est și este o problemă în creștere.

în vederea combaterii rezistenței la medicament, a devenit o practică standard utilizarea asocierilor a mai mult decât un medicament antimalaric, fie simultan, fie secvențial. Totuși, multe asemenea asocieri sunt antagoniste, având ca rezultat un tratament de eficiență mai scăzută, iar regimurile de dozare sunt adesea complicate, crescând probabilitatea nereușitelor la tratamentul complet.

Se cunoaște o metodă de tratament a toxoplasmozei, prin administrarea 2-[4-(4-clorofenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonei și o compoziție farmaceutică pentru tratamentul și/sau profilaxia toxoplasmozei care conține compusul 2-(4-(4-clorofenil)ciclohexil]-3-hidroxi1,4-naftochinonă sau o sare acceptabilă farmaceutic.

Problema, pe care o rezolvă invenția, este asocierea și rapoartele de amestecare optimă ale componentelor.

Asocierea farmaceutică, conform invenției, este constituită din 2-[4-(4-clorfenil) ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă și proguanil, într-un raport cuprins în intervalul de la 1:1 la 3:1.

Asocierea farmaceutică cuprinde 2-[4-(4-clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă și proguanilul, care sunt în raport de 5:2. Asocierea farmaceutică cuprinde 2-[4-(4-clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă, sub formă de izomer trans sau de amestec de izomeri cis și trans, în care predomină izomerul trans.

Compoziția farmaceutică cuprinde o asociere de 2-[4-(4-clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi1,4-naftochinonă și proguanil, în raport de 5:2, în asociere cu unul sau mai mulți purtători acceptabili farmaceutic. Asocierea se utilizează pentru tratamentul și/sau profilaxia, cauzate de protozoare parazite sau a unei infecții cauzate de Pneumocystis carinii, la mamifere.

RO 119280 Β1

Avantajul invenției este obținerea unei asocieri farmaceutice și a unei compoziții cu biodisponibilitate superioară. 50

S-a găsit, în mod surprinzător, că prin asocierea fie concomitentă, fie secvențială, a atovaquonei, reprezentată în această descriere prin formula (II):

și proguanilului, se obține potențarea activității antiparazitare și, în special, antimalarice. Mai mult decât atât, o asociere de potențare a compusului de formula (II) și a proguanilului se 60 poate prezenta simplu, într-o compoziție farmaceutic unică.

într-un prim aspect, invenția de față furnizează o metodă pentru tratamentul și/sau profilaxia infecțiilor parazitare cu protozoare, de exemplu, malarie sau toxoplasmoză sau o infecție produsă de P.carinii la mamifere, inclusiv la oameni, care cuprinde administrarea unei cantități eficiente de atovaquonă sau o sare acceptabilă fiziologic a acesteia, și, con- 65 comitent sau secvențial, administrarea unei cantități eficiente de proguanil.

într-un al doilea aspect, prezenta invenție furnizează atovaquonă pentru utilizare la fabricarea unui medicament, pentru administrarea fie concomitent, fie secvențial, cu proguanil pentru tratamentul și/sau profilaxia unei infecții parazitare cu protozoare, de exemplu, malarie sau toxoplasmoză sau o infecție produsă de P.carinii la mamifere, inclusiv la oameni. 70

De preferință, compusul de formula (II) și proguanilul se administrează concomitent, în modul cel mai preferat, compusul de formula (II) și proguanilul se administrează într-un raport de potențare.

Astfel, conform unui aspect suplimentar al prezentei invenții, aici se asigură o asociere a atovaquonei sau a unei sări a acesteia, acceptabilă fiziologic și proguanil, în care ato- 75 vaquona sau sarea sa și proguanilul sunt prezente într-un raport de potențare.

Termenul “raport de potențare” se folosește aici pentru a arăta că atovaquona și proguanilul sunt prezente într-un astfel de raport, încât activitatea antiparazitară a asocierii este mai mare decât cea doar a atovaquonei sau proguanilului sau activitatea cumulativă, care poate fi anticipată pentru asociere, bazat pe combinarea activităților componenților indi- 80 viduali. Astfel, componenții individuali acționează sinergie, în asociere, cu condiția ca ei să fie furnizați într-un raport de potențare.

Un raport de potențare, care poate fi folosit cu succes pentru tratarea malariei, inclusiv a tulpinilor de malarie rezistente la hidroxinaftochinonă, este în domeniul 1:0,1...1:100 de proguanikatovaquonă. Raportul de potențare adecvat este în domeniul 1:0,2...1:10. 85

Un raport de potențare preferat, în mod deosebit, este în domeniul 1:1...1:3.

Prezenta invenție asigură, de asemenea, într-un alt aspect, o metodă pentru tratamentul și/sau profilaxia malariei la mamifere, inclusiv la oameni, care cuprinde administrarea unei cantități eficiente a unei asocieri de atovaquonă sau a unei sări acceptabile fiziologic a acesteia și proguanil. 90

Gruparea hidroxi a atovaquonei poate forma săruri ca baze corespunzătoare, sărurile acceptabile fiziologic ale atovaquonei incluzând săruri ale bazelor anorganice, cum ar fi săruri ale metalelor alcaline (de exemplu, sodiu și potasiu) și săruri ale metalelor alcalino-pământoase (de exemplu, calciu), săruri ale bazelor organice, de exemplu, feniletilbenzilamină, dibenziletilendiamină, etanolamină și dietanolamină și săruri aminoacide, de exemplu lizină 95 și arginină. Compusul de formula (II) poate exista ca izomer cis- sau trans-, ceea ce înseamnă că ciclul ciclohexil poate fi substituit c/s- sau trans-, prin nucleul naftochininei și1 gruparea clorfenil. Ambii izomeri, cis- și trans- și amestecuri ale acestora, în orice raport, potI fi folosiți în conformitate cu invenția de față. în general, când compusul este sub forma unuii amestec de izomeri, izomerul trans- va fi prezent într-o cantitate de circa 50% sau va fi izomerul predominant, utilizarea amestecurilor în care predomină izomerul cis- va fi, de asemenea, inclusă în cuprinsul invenției. Raportul specific al izomerilor poate fi variat, după necesitate; amestecurile tipice le includ pe cele în care raportul izomerilor cis- / trans- este de circa 1:1, 40:60 și 5:95. Pentru utilizare, conform invenției prezente, izomerul trans- al compusului de formula (II) sau un amestec al său de izomeri cis- și trans-, conținând cel puțin 95%, de exemplu 99% din izomerul trans-, este de preferat.

Compusul de formula (II) poate exista, de asemenea, într-o formă tautomeră, în care gruparea hidroxil donează protonul său uneia dintre grupările oxo. Totuși, este de presupus că forma stabilă este cea prezentată în formula (II).

Cantitatea unei asocieri de atovaquonă și proguanil, necesară a fi eficientă ca agent antiparazitar, va fi, desigur, variată și, în final, este la discreția medicului sau veterinarului practicant. Factorii, care trebuie luați în considerare, includ calea de administrare, natura formulării, greutatea corporală a mamiferului, vârsta și condiția generală, natura și severitatea bolii care trebuie să fie tratată. în general, o doză eficientă corespunzătoare pentru administrare la om, pentru tratamentul malariei este în domeniul de 2,0 mg până la 30 mg proguanil/kg, greutate corporală/zi și 0,5 mg până la 30 mg atovaquonă/kg, greutate corporală/zi, de exemplu, de la 3 până la 20 mg/kg/zi de proguanil și 1 până la 20 mg/kg/zi de atovaquonă, în special, 5 până la 15 mg/kg/zi de proguanil și 3 până la 15 mg/kg/zi de atovaquonă.

O doză eficientă, corespunzătoare pentru administrare la om, pentru profilaxia malariei este în domeniul de la 3 până la 20 mg/kg greutate corporală/săptămână de proguanil și atovaquonă, de exemplu, de la 6 mg/kg/săptămână până la 10 mg/kg/săptămână de proguanil și atovaquonă.

Asocierea de atovaquonă și proguanil este prezentată, de preferință, ca o compoziție farmaceutică.

Compozițiile farmaceutice cuprind ingredienții activi și, anume combinația de atovaquonă și proguanil, împreună cu unul sau mai mulți purtători acceptabili farmaceutic ai acestora și, opțional, alți ingredienți terapeutici și/sau profilactici. Purtătorul(ii) trebuie să fie acceptabili, în sensul de a fi compatibili cu alți ingredienți ai formulării și nedăunători față de receptorul acestora.

Pentru conformitate, invenția de față asigură o compoziție farmaceutică, care cuprinde o asociere de atovaquonă și proguanil, în asociere cu unul sau mai mulți purtători acceptabili farmaceutic ai acestora.

Descrierea conține și modul de preparare a unei compoziții farmaceutice, procedeu care cuprinde aducerea în asociere a unei asocieri de atovaquonă și proguanil, cu unul sau mai mulți purtători acceptabili farmaceutic ai acestora.

Compoziția de atovaquonă și proguanil poate fi prezentată convenabil ca un produs farmaceutic, sub formă de unitate dozată. O compoziție convenabilă de unitate dozată conține ingredienții activi în cantități de la 10 mg până la 3 g fiecare, de exemplu, 50 mg până la 3 g fiecare. în mod obișnuit, unitățile dozate pot conține, de exemplu, 500 mg de atovaquonă și 200 mg de proguanil sau 500 mg de atovaquonă și 500 mg de proguanil.

Compozițiile farmaceutice conform invenției se administrează oral, topic, (inclusiv dermală, bucală și sublinguală), rectal și parenteral (inclusiv subcutanat, intradermal, intramuscular și intravenos), precum și administrare prin sondă nazo-gastrică. Când este necesar, formularea poate fi prezentată convenabil, sub formă de unități dozate diferite și poate

RO 119280 Β1 fi preparată prin oricare din metodele bine cunoscute în domeniul farmaciei. Modul de preparare include etapa de aducere în asociere a ingredienților activi, cu purtători lichizi sau purtători solizi, fiind divizați, sau de ambele tipuri și apoi, dacă este necesar, modelarea produsului în compoziția dorită.

Compozițiile farmaceutice adecvate pentru administrare orală, în care purtătorul este 150 un solid, sunt cel mai adesea prezentate ca formulări de unități dozate, precum boluri, capsule, sau tablete, fiecare conținând o cantitate predeterminată de ingredienți activi. O tabletă poate fi obținută prin compresie sau turnare, opțional cu unul sau mai mulți ingredienți accesorii. Tabletele comprimate se pot obține prin comprimarea, într-o mașină corespunzătoare, a compușilor activi, aflați sub formă de curgere liberă, sub forma unei pudre sau sub 155 formă de granule, amestecate, la alegere cu un liant, lubrifiant, diluent inert, agent de lubrifiere, agent tensioactiv sau agent de dispersie. Tabletele turnate pot fi obținute prin turnarea unui diluent lichid inert. Tabletele pot fi opțional acoperite și, dacă sunt neacoperite, opțional pot fi marcate. Capsulele se pot prepara prin umplerea cu ingredienți activi singuri sau în amestec cu unul sau mai mulți ingredienți suplimentari ai unor învelișuri de capsulare și apoi 160 închiderea acestora, într-un mod uzual. Cașetele sunt analoage capsulelor, unde ingredienții activi împreună cu orice ingredient (ți) suplimentar(i) sunt închiși într-un înveliș din hârtie de orez. Asocierea compusului de formula (II) și proguanil pot fi formulate, de asemenea, sub formă de granule dispersibile care, de exemplu, pot fi suspendate în apă înaintea administrării sau presărate pe alimente. Granulele pot fi împachetate, de exemplu, într-un plic. Corn- 165 poziția pentru administrare orală, în care purtătorul este un lichid, se poate prezenta ca o soluție sau o suspensie într-un lichid apos sau un lichid neapos, sau ca o emulsie lichidă ulei în apă.

Compozițiile pentru administrare orală includ forme dozate cu eliberare controlată, în care ingredienții activi sunt formulați într-o matrice corespunzătoare, cu eliberare contra- 170 lată sau sunt acoperiți cu un film corespunzător de eliberare controlată. Astfel de compoziții pot fi convenabile, în mod deosebit, pentru utilizare profilactică.

Ingredienții activi pot fi, de asemenea, formulați ca o soluție sau suspensie corespunzătoare administrării pe calea tubajului nazo-gastric.

Compozițiile farmaceutice pentru administrare rectală, în care purtătorul este un so- 175 lid, sunt prezentate, cel mai adesea, ca unități dozate sub formă de supozitoare. Purtătorii corespunzători cuprind untul de cacao și alte materiale folosite, de obicei, în domeniu. Supozitoarele se pot forma convenabil, prin amestecarea asocierii active, cu purtător (ri) de înmuiere sau topire, urmată de răcire și modelare în forme.

Compozițiile farmaceutice adecvate pentru administrare parenterală includ soluții sau 180 suspensii sterile ale asocierii active, în vehicule apoase sau uleioase. Preparatele injectabile se pot adapta pentru injectare sau infuzie continuă. Asemenea preparate sunt prezentate, în mod convenabil, sub formă de containere doză unitară sau multidoză, care sunt închise după introducerea formulării, până la necesitatea folosirii. Alternativ, ingredienții activi pot fi sub formă de pulbere, care se reconstituie înaintea utilizării, cu un vehicul corespunzător, 185 cum ar fi apă sterilă apirogenă.

Asocierea de atovaquonă și proguanil se poate formula, de asemenea, ca preparat depozit cu acțiune îndelungată, care se poate administra prin injecție intramusculară sau prin implantare, de exemplu subcutanat sau intramuscular. Preparatele depozit pot include, de exemplu, materiale corespunzătoare polimerice sau hidrofobe sau rășini schimbătoare de 190 ioni. Asemenea formulări cu acțiune prelungită sunt convenabile, în special, pentru utilizare profilactică.

Se va înțelege că, în plus, față de ingredienții purtători deja menționați, compozițiile farmaceutice pentru diferitele căi de administrare, descrise mai sus, pot include, când este cazul, unul sau mai mulți ingredienți purtători suplimentari, cum ar fi diluenți, tampoane, agenți de aromare, lianți, agenți tensioactivi, agenți de îngroșare, lubrifianți, agenți de conservare (inclusiv antioxidanți) și altele asemenea și substanțe incluse în vederea conferirii izotoniei, formulării cu sângele receptorului.

Compozițiile corespunzătoare pentru utilizare veterinară includ pe cele adaptate pentru administrare orală, parenterală și intrarumenală.

κυ riyzou di

Se dă, mai jos, un exemplu de realizare a compoziției farmaceutice. A. Tabletă acoperită cu film

Miez:
Compus din exemplul 1	500 mg
Proguanil hidroclorit	200 mg
Celuloză microcristalină (Avicel PH 101)	130 mg
Celuloză hidroxipropil, Lo-sub, (LHPC, LH11)	99 mg
Amidon glicolat de sodiu (Explotab)	30 mg
Povidonă K 30	36 mg
Stearat de magneziu	5 mg
Greutate la comprimare	1000 mg
Acoperire:
Dispersie polimerică
(hidroxipropilmetilceluloză și dioxid de titan și polietilenglicol 400 și colorant)	20 mg
Finisare:
Polietilenglicol 8000	2 mg
Greutate totală:	1022 mg

B. Tabletă dispersabilă acoperită cu strat subțire

Miez:
Compus de la exemplul 1	500 mg
Proguanilhidroclorid	200 mg
Celuloză microcristalină (Avicel PH 101)	100 mg
Celuloză hidroxipropil, Lo-sub, (LHPC, LH11)	83 mg
Amidon glicolat de sodiu (Explotab)	40 mg
Povidonă K 30	20 mg
Stearat de magneziu	5 mg
Docusat de sodiu	1 mg
Silicat de magneziu-aluminiu (Veegum F)	50 mg

Tabel (continuare)

Miez:
Zaharină sodică	1 mg
Greutatea de comprimare	1000 mg
înveliș:
Dispersie polimerică
(hidroxipropilmetilceluloză și dioxid de titan și polietilenglicol 400 și colorant)	10 mg
Finisare:
Polietilenglicol 8000	2 mg
Greutate totală:	1012 mg

235

240

Metode pentru prepararea atovaquonei sunt descrise în EP 123 238 și una dintre metodele specifice este ilustrată în testul 1. 245

Testul 1

2-(trans-4-(4-clorfenil)ciclohexil)-3-hidroxi-1,4-naftochinonă

a) Acid 4-(4-clorfenil)ciclohexan-1-carboxilic

S-au amestecat împreună, în disulfură de carbon (120 ml), clorură de acetil (30 g) și clorură de aluminiu, sub formă de pudră fină (60 g) și apoi s-au răcit până la - 50°C, într-o 250 baie COj/oxitol. S-a adăugat ciclohexenă (30 g), răcită anterior până la - 50°C, sub formă de picături, timp de 10 min, menținând, în același timp, temperatura amestecului de reacție sub - 20°C. Amestecul s-a agitat la - 50°C încă 60 de min și apoi s-a decantat solventul, pentru a rămâne un complex vâscos portocaliu. S-a adăugat puțin clorbenzen ca material încălzit la temperatura camerei, apoi s-a adăugat restul de clorbenzen (total 300 ml), soluția obți- 255 nută s-a încălzit la 40°C, timp de 3 h, cu agitare, s-a turnat pe un amestec de gheață și acid clorhidric concentrat și stratul organic separat s-a spălat cu acid clorhidric 2M, hidroxid de sodiu 2M și apă, s-a uscat pe sulfat de sodiu anhidru și s-a evaporat la sec. Produsul s-a distilat în vid, fracția încălzită la 140 - 154°C (0,1 mmHg) s-a colectat, s-a diluat cu un volum egal de eter de petrol (40 - 60), s-a răcit până la - 6°C, s-a barbotat printr-un curent continuu 260 de azot și solidul lipsit de culoare separat s-a recuperat.

S-a adăugat brom (2,8 ml) la o soluție de hidroxid de sodiu (6,2 g), în apă (42 ml), la 0°C. Hexahidroacetofenona substituită, obținută mai sus (3,1 g), s-a dizolvat în dioxan (15 ml) și apoi s-a adăugat soluția rece de hipobromit, păstrând amestecul de reacție sub 20°C. Amestecul de reacție s-a agitat la temperatura camerei, timp de 6 h și apoi s-a lăsat 265 să stea peste noapte. S-a adăugat metabisulfit de sodiu, pentru distrugerea hipobromitului în exces, amestecul s-a răcit și apoi s-a acidulat pentru a da un solid lipsit de culoare. Solidul s-a filtrat, s-a spălat cu apă, s-a uscat și recristalizat din etanol, pentru a obține acid 4-(4clorfenil)ciclohexan-1-carboxilic, punct de topire 254-256°C.

b) 2-(4-(4-clorfenil)ciclohexil)-3-clor-1,4-naftochinonă 270

S-a încălzit, până la reflux, cu agitare viguroasă în 40 ml de acetonitril, un amestec de 2-clor-1,4-naftochinonă (3,95 g, 0,02 moli) acid 4-(4-clorfenil)ciclohexan-1-carboxilic (4,9 g, 0,02 mol) și azotat de argint pulbere (1,05 g, 0,0062 moli). După 1 h, s-a adăugat, în picături, o soluție de persulfat de amoniu (12,0 g, 0,0525 moli), în 50 ml apă. Amestecul s-a refluxat timp de 3 h, apoi s-a răcit în gheață 30 min, după care acesta s-a filtrat, și solidul 275 rezidual lipicios s-a extras de 2 ori, cu cloroform fierbinte, pentru a îndepărta materialul

RO TiyZBU ΒΊ anorganic. Cloroformul s-a îndepărtat prin evaporare, pentru a rămâne un solid galben-brun (circa 2,7 g). Acesta s-a dizolvat în 40 ml de acetonitril fierbinte; prin filtrare s-a îndepărtat puțin material insolubil. La răcire, compusul din titlu s-a separat sub formă de cristale galbene (550 mg), punct de topire 172-175°C.

NMR, dH (δ - DMSO) 8,05 (2H, mult., β-naft), 7,82 (2H, rnult.a-naft), 7,30 (4H, s., PhH), 3,30 (1H, br.t., CH), 2,67 (1H, br.t., CH). 1,2-2,4 (8H, mult, 4xCH₂).

c) 2-(4-(4-clorfenil)ciclohexil)-3-hidroxi-1,4-naftochinonă

Produsul de la etapa (b) s-a suspendat în 10 ml de metanol fierbinte și s-au adăugat, sub formă de picături, 0,55 g de hidroxid de potasiu în 5,5 ml apă, după 15 min. Amestecul s-a refluxat, până când s-a format o soluție roșu-închis (după circa 6 h), când s-a adăugat, în picături, cu precauție, acid clorhidric concentrat (2 ml). Amestecul s-a răcit și s-a filtrat și reziduul solid s-a spălat complet cu apă. Apele de spălare s-au reacidulat și filtrat. Reziduurile solide combinate (500 mg), punct de topire 200-209°C s-au recristalizat din acetonitril pentru a obține produsul din titlu ca izomer trans (300 mg), punct de topire 216-219°C.

Rezultatele testului biologic

Testul 2

Comparație a interacțiunilor medicamentului în asocieri ale compusului din testul 1 cu alte antimalarice

Studiile de sensibilitate la medicament in vitro s-au realizat folosind tehnica semiautomată a lui Desjardins (Desjardins et.al. Antimalarial Agents and Chemotherapy 1979; 16(6):710-718). Activitatea antimalarică în acest sistem este cercetată prin inhibarea hipoxantinei radiomarcate, încorporată în pariți, prin concentrații graduale ale medicamentelor.

Medicamentele antimalarice de testat s-au dizolvat în apă, etanol 95% sau DMSO; medicamentele dizolvate în apă s-au diluat 1:1 cu etanol 95% și medicamentele dizolvate în etanol s-au diluat 1:1 cu apă. Soluțiile medicamentoase s-au diluat apoi cu mediu de cultură, care conține 10% ser uman, la concentrații de start de 20 - 50 ori IC₅₀ estimat. Medicamentele testate și solvenții lor sunt prezentați mai jos:

Medicament	Solvent inițial	Mediu
Compusul exemplului 1	DMSO	1640
Chinină	Etanol-apă	1640
Clorochină	Apă-etanol	1640
Meflochină	Etanol apă	1640
Primachină	Etanol-apă	1640
Artesunat	Etanol-apă	1640
PM443	DMSO	1640
Tetraciclină	DMSO	1640
Norfloxacină	DMSO	1640
Ciprofloxacină	DMSO	1640
Proguanil	Etanol-apă	Lo-folat
Cicloguanil	Etanol-apă	Lo-folat
Pirimetamină	DMSO	Lo-folat
Trimetoprim	DMSO	Lo-folat
Sulfametoxazol	DMSO	Lo-folat

320

RO 119280 Β1

Tabel (continuare)

325

Medicament	Solvent inițial t	Mediu
Dapson	DMSO	Lo-folat
Clopidol	DMSO	Lo-folat
Allopurinol	Etanol-apă	Lo-folat
PS-15	DMSO	Lo-folat
WR99210	DMSO	Lo-folat

în vederea studierii asocierilor de medicamente, s-au combinat soluții de medicament, la concentrații de start, în diferite rapoarte (1:5, 1:2, 2:1 și 5:1). Soluțiile de medicament și asocierile au fost introduse apoi într-o placă microtritratoare de 96-godeuri, pentru a obține șiruri duplicat ale compusului de la testul 1, medicamentul fiind asociat și 4 asocieri a câte 2 medicamente. S-au făcut diluții seriale 1:3, ale medicamentelor cu mediu, pentru a umple cele 96 godeuri ale plăcii de microtitrare, folosind o pipetă cu 12 canale. Pentru a evalua medicamentele clasificate ca inhibitori ai acidului dihidrofolic al reductazei (DHFR), s-a folosit mediul de cultură modificat, care conține doar concentrații fiziologice de acid folie și PABA.

Procedurile biologice care rămân s-au realizat conform tehnicii Desjardins, cu excepția că s-au folosit 3 tulpini de P. facciparum (clona XN-2 multirezistentă la medicamente, clona D 6 sensibilă la medicament, dar rezistentă la meflochină și izolatul C2B rezistent la compusul din testul 1) și incubarea s-a prelungit timp de 72 de h.

ICso individuale s-au calculat folosind programul “MINSQ” de la Micromath Scientific Software. Fiecare set de date perechi s-a corelat la funcția tangentei hiperbolice, folosită de Desjardins.

ICso-urile s-au normalizat prin trasarea valorilor de 1 la IC^ pentru compusul din testul 1 și pentru alt medicament, fiind combinate cu valorile normalizate, proporționale pentru fiecare raport, a câte 2 medicamente de studiat. S-a construit o izobologramă, prin potrivirea datelor la ecuația:

Y_f = 1 - (Χ/(Χ, + e^fl-xO)) unde Yj = IC₅₀ pentru compusul testului 1, când s-a asociat cu alt medicament;

Xi=IC5o pentru alt medicament, când s-a asociat cu compusul de la testul 1;

I = parametru de interacțiune care indică gradul de inversare.

Valorile lui I s-au calculat pentru fiecare asociație. Valorile pozitive ale lui I au indicat o asociație sinergică, valorile negative au arătat antagonism și l=O a indicat o interacțiune cumulativă.

Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1.

330

335

340

345

350

355

Tabelul 1

Medicament combinat cu compusul de la testul 1	I
W-2	D-6	C2B
Chinină	-136
Clorochină	-184	-140
Meflochină	-119
Tetraciclină	127	111	0,02 - 0,08
Primachină	-79

360

365

Tabelul 1 (continuare)

Medicament combinat cu compusul de la testul 1	I
W-2	D-6	C2B
Acid artesunic		-18
PM443		-128
Norfloxacină	102
Ciprofloxacină	-122
Primetanină	36		-48
Trimetoprim	127		58
Proguanil	2,43, 2,88	256	256
Cicloguanil	221	166	0,13-0,73
Allopurinol	114	43
PS-15	1,77, 0,65,1,97	-74
WR 99210	2
Sulfametoxazol	275
Dapson	-39
Clopidol	2,38, 2,65	73

Asocierea de 2-(4-(4-clorfenil)ciclohexil)-3-hidroxi-1,4-naftochinonă și proguanil, așa cum arată rezultatele din tabelul 1, prezintă potențarea cea mai pronunțată, comparativ cu alte asocieri de medicamente testate, în special împotriva tulpinii C2B, rezistentă la hidroxinaftochinonă.

S-a estimat, pentru fiecare dintre cele 3 tulpini parazite, raportul optim al asocierii cu proguanil, prin determinarea raportului IC₅₀ al proguaninei față de IC₅₀, al compusului de formula (II). Rezultatele sunt date mai jos în tabelul 2.

Tabelul 2

Proguanil: Compus cu formula (I)	W-2	D-6	C2B
920:1 2473:1	4038:1	0,2:1

Test 3

Comparație a activităților anti-toxoplasmă in vivo, ale compusului de la testul 1, proquanil și asocierile acestora

S-au examinat activitățile compușilor și asocierilor într-un model șoarece al T.gondii, folosind creșterea în timp, până la moarte și procentul de supraviețuire al șoarecilor, ca măsuri ale activității medicamentului.

S-au infectat oral, prin gavaj cu 6 chisturi ale tulpinii C56, ale T.gondii, grupuri de șoareci CBA/CA de 10, 20 mg și tratamentul cu medicament a început 3 zile mai târziu, durând timp de 10 zile. Toate medicamentele s-au administrat oral, prin gavaj. S-au examinat următoarele grupuri:

Controale

Atovaquonă @10 mg/kg Atovaquonă @ 25 mg/kg Proguanil @10 mg/kg

RO 119280 Β1

Atovaquonă @ 10 mg/kg + Proguanil @ 25 mg/kg

Atovaquonă @ 25 mg/kg + Proguanil @ 25 mg/kg

Toate animalele s-au examinat de două ori pe zi, timp de 30 de zile și s-au înregistrat decesele.

Rezultatele sunt prezentate în tabelele 3 și 4.

Tabelul 3

410

415

Timp mediu până la moarte (zile) Atovaguonă

Proguanil 0 (mg/kg) 25	0	10 mg/kg	25 mg/kg
140 9,0	201184	241293
Tabelul 4 Supraviețuire % Atovaquonă
Proguanil 0 (mg/kg) 25	0	10 mg/kg	25 mg/kg
10,0 0,0	10,1 0,1	100800

420

425

Timpul mediu până la moarte al șoarecilor control a fost de 14 zile, cu doar 1 animal care a supraviețuit (10%). (Acest animal poate nu a fost infectat cu inoculul scăzut folosit). Atovaquonă, singură a crescut, aceasta până la 20,1 zile la 10 mg/kg și 24,1 zile la 25 mg/kg, în ambele cazuri cu 1 singur supraviețuitor (10%). Proguanilul, în ciuda excelentei sale siguranțe, înregistrată la om, este toxic pentru șoareci. La 25 mg/kg, proguanilul prezintă semne de toxicitate, reducând timpul mediu până la moarte la 9 zile, fără nici un supraviețuitor. Asocierea de 10 mg/kg atovaquonă cu 25 mg/kg proguanil a dat un timp mediu până la moarte de 18,4 zile. Asocierea de 25 mg/kg atovaquonă și 25 mg/kg proguanil a dat o creștere a timpului până la moarte, în ciuda toxicității proguanilului și 80% din șoareci au supraviețuit, comparativ cu minimul de șoareci supraviețuitori de 10%, dat de atovaquona singură.

Test 4

Comparația activităților anti-toxoplasmă in vitro ale compusului de la exemplul 1, proguanilului și asocieri ale acestora.

Studiile de sensibilitate la medicament in vitro s-au realizat folosind o tehnică semiautomată, bazată pe cea folosită pentru malarie (Desjardins et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1979,16 (6) 710-718), dar folosind încorporarea selectivă a uraciului - ³[H] de către T. gondii. Activitatea anti-toxoplasmă în acest sistem este cercetată prin absorbția uracilului radiomarcat în paraziți, prin concentrații graduale de medicament.

Medicamentele s-au dizolvat în DMSO și diluțiile s-au preparat folosind mediul de cultură care conține 3% ser fetal de vițel. Pentru studiul asocierilor de medicament, soluțiile de medicament, la concentrații de start, s-au combinat în diferite rapoarte 1:1, 1:3, 3:1. S-au preparat diluții seriale 1:2 ale soluțiilor de medicament și ale asocierilor și s-au folosit în godeuri duplicat ale unei plăci cu 96 godeuri, însămânțată anterior cu celule HeLa și tulpina RH a T. gondii. S-au adăugat medicamentele, la 2 h după parazit și plăcile s-au incubat la 37°C, timp de 24 h, când s-a adăugat uracil - ³[H] și s-a continuat incubarea, pentru încă 3 h.

430

435

440

445

450

455

RO 119280 Bl

Cercetarea s-a definitivat prin îndepărtarea fluidului supernatant, ruperea celulelor care conțin T. gondiiîn SOS și precipitarea proteinelor marcate TCA, pe împletituri filtrante. încorporarea marcajului s-a măsurat pe o placă Beta, numărătoare de scintilație. Procentul inhibării uracilului încorporat s-a calculat pentru compuși și asocieri și s-au calculat IC_M folosind programul GS1. S-au normalizat IC₅₀ prin considerarea valorilor a 1 până la IC_S0 pentru compusul de la testul 1 și proguanil cu valorile normalizate, pentru fiecare raport a câte 2 medicamente luate în studiu. S-a construit o izobologramă prin marcarea acestor IC₅₀ normalizate, fiecare față de celălalt. Potențarea s-a indicat prin valorile întâlnite mai jos de linia izobologramei, un efect cumulat prin valorile pe linie și antagonismul prin valori peste linie.

Plăcile s-au montat în triplicate și s-au marcat toate valorile. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 5.

Tabelul 5

IC₅₀ normalizate Atovaquonă	Proguanil	Potențare
559278	583893	Nu
196689	614094	Da
729381	253691	Da
345238	527273	Da
130952	6	Da
233333	118182	Da
404959	451538	Da
229201	768462	Da
244904	91538	Da

Așa cum rezultă din tabelul 5, asocierea de atovaquonă și proguanil prezintă in vitro potențare contra T. gondii.

Test 5

Comparația activităților anti-Pneumocystis in vivo ale compusului de la testul 1, proguanilului și asocierea acestora.

Activitățile compușilor și asocierilor s-au examinat într-un model de șoarece acid al Pneumocystis pneumonia.

Nivelul infecției șoarecilor din fiecare grup s-a măsurat folosind frotiuri de impresie pulmonară standard și teste de imunofluorescență. S-a marcat un scor pentru fiecare șoarece, unde 0 = nici o infecție și + 4 = infecție foarte puternică. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 6.

Tabelul 6

Tratament	SCOR	Nr.infect./ Nr. examin.	Scor mediu ± SE	% din control
0	+1	+3	+4	+4
control netratat	0	0	0	3	7	10/10	3,70±0,14	100
Atovaquonă 50 mg/kg p.o.zi	0	0	5	5	0	10/10	2,50±0,16	68

RO 119280 Β1

Tabelul 6 (continuare) 500

Tratament	SCOR	Nr.infect./ Nr. examin.	Scor mediu ±SE	% din control
0	+1	+3	+4	+4
Proguanil 25 mg/kg p.o.zi	0	0	0	2	8	10/10	3,80±0,13	85
Atovaquona și Proguanil 60+25 mg/kg p.o.zi	5	4	1	0	0	5/10	0,50±0,21	14
Atovaquona și Proguanil 25+25 mg/kg p.o.zi	1	0	4	4	0	8/9	2,22±0,31	60

Când s-a dozat singură, atovaquona a dat reduceri în scorul infecției. Proguanilul singur la 25 mg/kg/zi a fost ineficient în profilaxia PCP, la șoarecele scid. Proguanilul în aso- 515 ciere cu atovaquona a prezentat sinergism.

Claims

Revendicări

1. Asociere farmaceutică caracterizată prin aceea că este constituită din 2-(4-(4- 520 clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naflochinonă și proguanil, într-un raport cuprins în intervalul de la 1:1 la 3:1.
2. Asociere farmaceuticăconform revendicării 1, caracterizată prin aceea că 2-(4-(4clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă și proguanilul sunt în raport de 5:2.
3. Asociere conform revendicărilor 1 sau 2, caracterizată prin aceea că 2-[4-(4-clor- 525 fenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă este sub formă de izomer trans sau de amestec de izomeri cis și trans, în care predomină izomerul trans.
4. Compoziție farmaceutică caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde o aso- ciere definită în oricare din revendicările 1...3, împreună cu unul sau mai mulți purtători acceptabili farmaceutic. 530
5 Compoziție farmaceutică conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde o asociere de 2-[4-(4-clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă și proguanil, în raport de 5:2 , în asociere cu unul sau mai mulți purtători acceptabili farmaceutic.
6. Compoziție farmaceutică conform revendicării 4 sau 5, caracterizată prin aceea că 2-[4-(4-clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinona este sub formă de izomer trans sau 535 un amestec de izomeri cis și trans, în care predomină izomerul trans.
7. Compoziție farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 5 și 6, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde de la 50 mg la 3 g din fiecare 2-[4-(4-clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă și proguanil.
8. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 4 și 6, caracterizată prin aceea 540 că are în compoziție 500 mg 2-[4-(4-clorfenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftochinonă și 200 mg proguanil.
9. Utilizare a asocierii definite în revendicarea 1, pentru tratamentul și/sau profilaxia cauzate de protozoare parazite sau a unei infecții cauzate de Pneumocystis carinii, la mamifere. 545

RO 119280 Β1

550 :4
10. Utilizare conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că infecția cauzată de protozoare parazite este malaria.
11. Utilizare conform oricăreia dintre din revendicările 1 ...9, caracterizată prin aceea că infecția cauzată de protozoare parazite este toxoplasmoza.
12. Utilizare conform cu oricare din revendicările 9...11, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde administrarea concomitentă de atovaquonă și proguanil.