NO313225B1 - Kombinasjon av atovaquon og proguanil for behandling av protozoinfeksjoner - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår synergistiske kombinasjoner av 2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-l,4-naftoquinon (atovaquon) og proguanil som har anti-parasittisk aktivitet. Mer spesifikt angår oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger og enhetsdoseformuleringer som inneholder nevnte kombinasjoner, deres anvendelse i behandling av protozo-parasittiske infeksjoner slik som malaria og toksoplasmose og deres anvendelse i behandling av infeksjoner forårsaket av Pneumocystis carinii.

Forbindelsen 2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-l,4-naftoquinon (atovaquon) er tidligere beskrevet, for eksempel i europeisk patent nr. 123238 som angår 2-substituerte-3-hydroksy-1,4-naftoquinoner med formel (I)

der enten R<*> er hydrogen og R<2> er valgt fra C^_£, alkoksy, aralkoksy, C^_(, alkyl-C^_^ alkoksy, fenyl substituert med en eller to grupper valgt fra halogen og C^- b alkyl, halogen og perhalo-<C>i_6 alkyl eller R<1> og R2 er begge <C>^_^ alkyl eller fenyl, og n er null eller 1, og fysiologisk aksepterbare salter derav. Forbindelsene hevdes å ha antiprotozoaktivitet. Forbindelsene med formel (I) der n er null sies å være aktive mot human malariaparasitt Plasmodium falciparum og også mot Eimeria arter som E. tenella og E. acervulina som er forår-sakende organismer for coccidiosis og forbindelser med formel (I) der n er 1 sies å være aktive mot protozoer fra slekten Theileria. særlig T. annulata eller T. parva. Blant forbindelsene som spesifikt navngis og eksemplifiseres er forbindelsen

med formel (I) der n er null, R<1> er hydrogen og R<2> er 4-klorfenyl , dvs. atovaquon.

Proguanil er et velkjent medikament for profylakse, men ikke for behandling av malaria. Det er et av de sikreste anti-malar iamedikamenter og kan gies til små barn og gravide kvinner. Resistens av P.falciparum til proguanil har fremkommet, særlig i Sydøst-Asia, og er et økende problem.

For å overvinne medikamentresistens, er det blitt standard å anvende kombinasjoner av mer enn et antimalariamiddel, enten samtidig eller etter hverandre. Mange slike kombinasjoner er imidlertid antagonistiske, resulterer i mindre effektiv behandling og doseringssystemene er ofte kompliserte, økende sannsynlighet for at pasientene ikke fullfører behandlingen. Det er således et mål med foreliggende oppfinnelse å skaffe tilveie en kombinasjon av antimalariamedikamenter som ikke er antagonistiske og som ikke krever et kompleks doseringssys-tem.

Det er nå overraskende funnet at ved å kombinere, enten ledsagende eller i rekkefølge, atovaquon, representert med formel (II)

og proguanil, blir potentiering av antiparasittisk og særlig antimalariaaktivitet oppnådd. Ytteligere en potentieringskom-binasjon av forbindelsen med formel (II) og proguanil kan på enkel måte presenteres i en enkel farmasøytisk formulering.

I et første trekk tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en kombinasjon av 2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-1,4-naftoquinon og proguanil, karakterisert ved at forholdet av proguanil:2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-l,4-naftoquinon er i området fra 1:1 til 1:3.

I et annet trekk skaffer foreliggende oppfinnelse tilveie anvendelse av en kombinasjon som nevnt over til fremstilling av et medikament for behandling og/eller profylakse av en protozoparasittisk infeksjon, for eksempel malaria eller toksoplasmose eller en infeksjon forårsaket av P. carinii, i pattedyr inkludert mennesker.

Forbindelsen med formel (II) og proguanil blir fortrinnsvis administrert samtidig. Fortrinnsvis blir forbindelsen med formel (II) og proguanil administrert i et potentierende forhold.

Ifølge et ytterligere trekk ved oppfinnelsen tilveiebringes en farmasøytisk sammensetning som omfatter en kombinasjon som nevnt over i forening med en eller flere farmasøytisk aksepterbare bærere derav.

Ifølge enda et trekk ved oppfinnelsen tilveiebringes en enhetsdosef ormulering som omfatter 50 mg til 3 g av hver atovaquon og proguanil.

Begrepet "potentierende forhold" blir her anvendt for å indikere at atovaquon og proguanil er tilstede i et forhold slik at den antiparasittiske aktiviteten av kombinasjonen er større enn om hver av atovaquon eller proguanil alene eller den samlede aktiviteten som forventes for kombinasjonen basert på aktiviteten av de individuelle komponentene. De individuelle komponentene virker således synergistiske i kombinasjon forutsatt at de presenteres i et potentierende forhold.

Et potentierende forhold som med hell kan bli anvendt i å behandle malaria, innbefatter hydroksynaftoquinonresistente stammer av malaria i området 1:0,1-1:100 av proguanil:atovaquon. Det er velegnet at potentieringsforholdet er i området 1:0,2-1:10.

Et særlig foretrukket potentieringsforhold er i området 1:1-1:3.

Eydroksylgruppen i atovaquon kan danne salter med passende baser, og fysiologisk aksepterbare salter av atovaquon innbefatter uorganiske basesalter slik som alkalimetall (for eksempel natrium og kalium) salter og jordalkalimetallsalter (for eksempel kalsiumsalter); organiske basesalter for eksempel fenyletylbenzylamin, dibenzyletylendiamin, etanol-amin og dietanolaminsalter; og aminosyresalter for eksempel lysin og arginin.

Det skal bemerkes at forbindelsen med formel (II) kan eksistere som cis- eller transisomerer, dvs. at cykloheksyl-ringen kan være cis- eller transsubstituert med nafto-quinonkjernen og klorfenylgruppen. Både cis- og transisomerer og blandinger av disse i et hvilket som helst forhold kan bli anvendt i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse. Generelt når forbindelsen er i form av en blanding av isomerer vil transisomeren være tilstede i en mengde på ca. 50$ eller vil være den dominerende isomeren men anvendelse av blandinger hvori cisisomeren dominerer er også innbefattet i foreliggende oppfinnelse. Det spesifikke forhold av isomerer kan varierea dersom det er nødvendig; typiske blandinger innbefatter de der cis/ transisomerforholdet er ca. 1:1,40:60 og 5:95. For anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse er transisomeren av forbindelsen (II) foretrukket, eller en

LI

blanding av dens cis og transisomerer inneholdende minst 95$ for eksempel 99$ av transisomeren.

Forbindelsen med formel (II) kan også eksistere i en tautomer form hvori hydroksylgruppen betegner dens proton til en av oksogruppene og anvendelse av slike tautomere former er innbefattet i foreliggende oppfinnelse. Det antas imidlertid at den stabile formen er den som er vist i formel (II).

Mengden av en kombinasjon av atovaquon og proguanil er nødvendig for å være effektiv som et antiparasittisk middel, vil naturligvis variere og bestemmes ut fra kunnskapen til den behandlende lege eller veterinær. Faktorer som må betraktes innbefatter administreringsvei og egenskapene til formuleringen, pattedyrets kroppsvekt, alder og generell tilstand og egenskaper og alvorlighet av sykdommen som skal behandles. Generelt er en egnet effektiv dose for administrering til mennesker for behandling av malaria i området fra 2,0 mg til 30 mg proguanil pr. kg kroppsvekt pr. dag og 0,5 mg til 30 mg atovaquon pr. kg kroppsvekt pr. dag, for eksempel fra 3 til 20 mg/kg/dag proguanil og 1 til 20 mg/kg/dag atovaquon, særlig 5 til 15 mg/kg/dag proguanil og 3 til 15 mg/kg/dag atovaquon.

En velegnet effektiv dose for administrering til menneske for profylakse av malaria er i området fra 3 til 20 mg/kg kroppsvekt pr. uke av hver av proguanil og atovaquon for eksempel fra 6 mg/kg/uke til 10 mg/kg/uke av hver av proguanil og atovaquon.

Det er underforstått at doseringene som er referert til over beregnes med basis i medikament per se.

For anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse blir kombinasjonen av atovaquon og proguanil fortrinnsvis presentert som en farmasøytisk formulering.

Farmasøytiske formuleringer omfatter aktive ingredienser (dvs. kombinasjonen av atovaquon og proguanil) sammen med en eller flere farmasøytiske aksepterbare bærere for dette og eventuelt andre terapeutiske'og/eller profylaktiske ingredienser. Bæreren(e) må være aksepterbar i betydning at den er kompatibel med andre ingredienser i formelen og ikke skadelig på mottageren.

Foreliggende oppfinnelse skaffer således tilveie en farmasøy-tisk sammensetning som omfatter en kombinasjon av atovaquon og proguanil i forening med en eller flere farmasøytisk aksepterbare bærere for dette.

Kombinasjonen av atovaquon og proguanil kan hensiktsmessig presenteres som en formulering i enhetsdoseform. En hensiktsmessig enhetsdoseformulering inneholder aktive ingredienser i mengder fra 10 mg til 3 g hver, for eksempel 50 mg til 3 g hver. Typiske enhetsdoser kan inneholde for eksempel 500 mg atovaquon og 200 mg proguanil eller 500 mg atovaquon og 500 mg proguanil.

Farmasøytiske formuleringer innbefatter de som er egnede for oral, topisk (inkludert dermal, kinn og sublingual), rektal og parenteral (inkludert subkutan, intradermal, intramuskulær og intravenøs), administrering så vel som administrering ved nese-magesystemet. Formuleringen kan, der det passer, presenteres i adskilte doseringsenheter og kan bli fremstilt ved en hvilken som helst metode som er velkjent innenfor farmasifagområdet. Alle metoder innbefatter trinnet med å bringe i forening de aktive ingrediensene med flytende bærere eller finfordelte faststoffbærere eller begge deler, og deretter, om nødvendig, forme produktet til den ønskede formulering.

Farmasøytiske formuleringer som er egnede for oral administrering der bæreren er et faststoff blir fortrinnsvis presentert i enhetsdoseformuleringer slik som boluser, kapsler eller tabletter hver Inneholdende en forhåndsbestemt mengde aktiv ingrediens. En tablett kan bli laget ved sammenpressing eller forming, eventuelt med en eller flere hj elpeingredienser. Pressede tabletter kan bli fremstilt ved sammenpressing i en egnet maskin av de aktive forbindelsene i en fritt-strømmende form slik som pulver eller granuler eventuelt blandet med et bindemiddel, smøremiddel, inert fortynningsmiddel, smørende middel, overflateaktivt middel eller dispergeringsmiddel. Formede tabletter kan bli laget ved forming i et inert flytende fortynningsmiddel. Tablettene kan eventuelt bli belagt og dersom de er ubelagte, kan de eventuelt bli trukket. Kapsler kan bli fremstilt ved å fylle aktive ingredienser, enten alene eller i blanding med en eller flere hjelpeingredienser i kapselskjell og deretter forsegle dem på vanlig måte. Kapselputer er analoge med kapsler der de aktive ingrediensene sammen med eventuelle hjelpeingredienser blir forseglet i en rispapirinnpakking. Kombinasjonen av forbindelsen med formel (II) og proguanil kan også bli formulert som dispergerbare granuler, som for eksempel kan suspenderes i vann før administrering, eller drysset på mat. Granulene kan bli pakket for eksempel i en pute. Formuleringer som er egnede for oral administrering der bæreren er en væske kan presenteres som en oppløsning eller en suspensjon i en vandig væske eller i en ikke-vandig væske, eller som en olje-i-vannflytende emulsjon.

Formuleringer for oral administrering innbefatter kontrol-lerte frigjørende doseringsformer for eksempel tabletter der de aktive ingrediensene formuleres i en passende frigjørende - kontrollerende matriks, eller blir belagt med en velegnet frigjørende, kontrollerende film. Slike formuleringer kan være særlige hensiktsmessige for profylaktisk anvendelse.

De aktive ingrediensene kan også formuleres som en oppløsning eller suspensjon som er egnet for administrering via nese-magesystemet .

Farmasøytiske formuleringer som er egnede for rektal administrering der bæreren er et faststoff presenteres fortrinnsvis som enhetsdosesuppositorier. Egnede bærere innbefatter kokossmør og andre materialer som vanligvis blir anvendt innenfor fagområdet. Suppositoriene kan hensiktsmessig bli dannet ved blanding av den aktive kombinasjon med den mykgjorte eller smeltede bærer(ene) etterfulgt av avkjøling og forming i former.

Farmasøytiske formuleringer som er egnede for parenteral administrering innbefatter sterile oppløsninger eller suspensjoner av den aktive kombinasjon i vandige eller oljeholdige bærere. Injiserbare preparater kan bli tilpasset for bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon. Slike preparater presenteres hensiktsmessig i enhetsdose eller mange-dosebeholdere som blir forseglet etter innføring av formulering inntil den er nødvendig for bruk. De aktive ingrediensene kan alternativt være i pulverform som er tilsatt en egnet bærer, slik som steril, pyrogen-fritt vann før bruk.

Kombinasjonen av atovaquon og proguanil kan også bli formulert som et langtvirkende depotpreparat, som kan bli administrert ved intramuskulær injeksjon eller ved implanter-ing for eksempel subkutant eller intramuskulært. Depotprepar-atene kan innbefatte, for eksempel, egnede polymere eller hydrofobe materialer, eller ionebytterharpikser. Slike langtvirkende formuleringer er særlig hensiktsmessige for profylaktisk bruk.

Det skal bemerkes at i tillegg til de forannnevnte bærerin-grediensene kan de farmasøytiske formuleringene for forskjellige administreringsveier som er beskrevet over innbefatte, ettersom det passer en eller flere ytterligere bæreingredien-ser slik som fortynningsmidler, buffere, aromamidler, blndemidler, overflateaktive midler, tykningsmidler, smøremidler, preservativer (innbefattet anti-oksydanter) og lignende, og substanser som innbefattes med det formål å gjøre formuleringen isoton med blodet hos den tilsiktede mottager.

Sammensetninger som er egnede for veterinæranvendelser innbefatter de som er tilpasset for oral, parenteral og intrarumenal administrering.

Fremgangsmåter for å fremstille atovaquon er beskrevet i EP 123238, og en spesifikk metode er illustrert i eksempel 1.

Eksempel 1

2-[" trans- 4-( 4 - kl or fenyl ) cykloheksyl 1 - 3- hydroksy- l . 4- naftoquinon

a) 4-( 4- klorfenyl) cykloheksan- l- karboksylsyre

Acetylklorid (30 g) og finpulverformet aluminiumklorid (60

g) ble omrørt sammen i karbondisulfid (120 ml) og deretter avkjølt til -50°C i et C02/oktitolbad. Cykloheksn (30 g), tidligere avkjølt til -50°C, ble tilsatt dråpvis i løpet av 10 minutter under opprettholdelse av temperaturen i reaksjonsblandingen under -20" C. Blandingen ble omrørt ved -50° C i ytterligere 60 minutter og oppløsningsmidlet ble deretter dekantert og det ble igjen et gummiaktig orange kompleks. Litt klorbenzen ble tilsatt når materialet ble oppvarmet til omgivelsestemperatur; den gjenværende klorbenzen (totalt 300 ml) ble deretter tilsatt, den således oppnådde oppløsningen oppvarmet ved 40°C i 3 timer under omrøring, tømt i en blanding av is og konsentrert saltsyre og det organiske laget separert, vasket med 2M saltsyre, 2M natriumhydroksid og vann, tørket over vannfri natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Produktet ble destillert i vakuum, fraksjonell koking ved 140-154°C (0,1 mm Hg) samlet, fortynnet med et likt volum petroleter (40-60), avkjølt til -6°C og en kontinuerlig strøm av gass boblet gjennom, og utskilt fargeløst faststoff utvunnet.

Brom (2,8 ml) ble tilsatt en oppløsning natriumhydroksid (6,2 g) i vann (42 ml) ved 0°C. Den ovenfor oppnådde substituerte heksahydroacetofenon (3,1 g) ble oppløst i dioksan (15 ml) og kald hypobromittoppløsning ble deretter tilsatt, holdt reaksjonsblandingen under 20°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 6 timer og fikk deretter anledning til å stå over natten. Natriummetabisulfitt ble tilsatt for å ødelegge overskudd hypobromitt, blandingen ble avkjølt og deretter surgjort og ga et fargeløst faststofff. Det faste stoffet ble filtrert av, vasket med vann, tørkete og krystallisert på nytt fra etanol og ga 4-84-klorfenyl)cykloheksan-l-karboksylsyre, smeltepunkt. 254-256°C. b) 2- f4-( 4- klorfenylIcykloheksyll - 3- klor- l. 4- naftoquinon En blanding av 2-klor-l,4-naftoquinon (3,95 g, 0,02 mol),

4-(4-klorfenyl)cykloheksan-l-karboksylsyre (4,9 g, 0,02 mol) og pulverformet sølvnitrat (1,05 g, 0,0062 mol) ble oppvarmet til tilbakestrømming under kraftig omrøring i 40 ml acetonitril. En oppløsning av ammoniumpersulfat (12,0 g, 0,0525 mol) i 50 ml vann ble tilsatt dråpvis i løpet av 1 time. Blandingen ble tilbakestrømmet i 3 timer og

deretter avkjølt i is i 30 minutter, og etter dette ble den filtrert, og resterende klebrig faste stoff ekstrahert to ganger med kokende kloroform for å fjerne uorganisk materiale. Klorofrmen ble fjernet ved inndamping og det ble igjen et gul-brunt faststff (ca. 2,7 g). Dette ble oppløst i 40 ml kokende acetonitril, litt uoppløselig materiale ble fjernet ved filtrering. Ved avkjøling separerte tittelforbindelsen som gule krystaller (550 mg), smeltepunkt 172-175°C.

NMR, dH(S6-DMS0) 8,05 (2H, mult. 3-naft), 7,85 (2H, mult. a-naft), 7,30 (4H, s., PhH), 3,30 (1H, br.t., CH), 2,67 (1H, br.t., CH), 1,2-2,4(8H, mult., 4xCH2).

c) 2- f4-( 4- klorfenyl/ cykloheksyll- 3- hydroksy- l. 4- naftoquinon Produktet fra trinn (b) ble suspendert i 10 ml kokende

metanol og 0,55 g kaliumhydroksid i 5,5 ml vann ble dråpvis tilsatt i løpet av 15 minutter. Blandingen ble tilbakestrømmet inntil det var dannet en mørk rød oppløsning (etter ca. 6 timer) når 2 ml konsentert saltsyre ble forsiktig tilsatt dråpvis. Blandingen ble avkjølt og filtrert, og den faste resten vasket grundig med vann. Vannvasken ble surgjort på nytt og filtrert. De kombinerte faste restene (500 mg), smeltepunkt 200-209°C, ble krystallisert på nytt fra acetonitril og ga tit-telproduktet som transisomeren (300 mg), smeltepunkt 216-219°C.

Eksempel 2

De følgende eksempler illustrerer konvensjonelle farmasøy-tiske formuleringer som kan bli benyttet i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse:

A. Filmbelagt tablett

B. Dispergerbar fFilmbelagt tablett

Biologiske testresultater

Eksempel 3

Sammenligning av medikamentinteraks. ioner i kombinasjoner av forbindelse fra eksempel 1 med andre antimalariamidler

In vitro medikamentsensitivitetsstudier ble gjennomført ved å anvende den halvautomatiserte teknikken til Desjardins (Desjardins et. al. Antimalarial Agents and Chemotherapy 1979; 16(6):710-718). Antimalaria-aktivitet i dette systemet bestemmes ved hemming av radiomerket hypoksantin inkorportert i parasitter ved graderte konsentrasjoner av medikamenter.

Antimalaria-medikamenter for testing ble oppløst i vann, 95$ etanol, eller DMSO; medikamenter oppløst i vann ble fortynnet 1:1 med 95$ etanol og medikamenter oppløst i etanol ble fortynnet 1:1 med vann. Medikamentoppløsninger ble deretter fortynnet med dyrkingsmedium inneholdende 10$ humant serum til utgangskonsentrasjoner 20-50 ganger estimert IC50. Testede medikamenter og deres oppløsningsmidler er opplistet under:

For å studere medikamentkombinasjoner, ble medikamentopp-løsninger ved startkonsentrasjoner kombinert i forskjellige forhold (1:5, 1:2,2:1 og 5:1). Medikamentoppløsninger og kombinasjoner ble deretter innført i en 96-brønners mikro-tlterplate og ga doble rader av forbindelse fra eksempel 1, medikamentet som ble kombinert og fire kombinasjoner av de to medikamentene. Serie 1:3 fortynner av medikamenter med media ble gjort for å fylle 96-brønns mikrotiterplaten ved å anvende en 12-kanals pipetterer. For å evaluere medikamenter som var klassifisert som dihydrofolsyrereduktasehemmere (DHFR), ble det modifisert dyrkningsmediet anvendt og inneholdt bare fysiologiske konsentrasjoner av folinsyre og

PABA.

De gjenværende biologiske fremgangsmåtene ble gjennomført i henhold til Desjardins-teknikk med unntagelse av tre stammer P.falciparum ble anvendt (multi-medikament resistent W-2 klon, medikament-sensitivt men mefloquin resistent D-6 klon og C2B isolat resistent til forbindelsen fra eksempel 1) og inkubasjonen ble forlenget i 72 timer.

Individuelle IC5Q-verdier ble beregnet ved å anvende "MINSQ"-programmet fra Micromath Scientific Software. Hvert sett av parrede data ble tilpasset den hyperbolske tangentfunksjon som anvendes av Desjardins.

-L KJ

IC5Q-verdier ble normalisert ved å tilegne verdier 1 til IC50 for forbindelsen fra eksempel 1 og til andre medikamenter som ble kombinert med proporsjonalt normaliserte verdier for hvert forhold av de to medikamentene som ble studert. Et isobologram ble konstruert ved å tilpasse data i ligningen:

der Yi = IC50 for forbindelse fra eksempel 1 når det er kombinert med et annet medikament

Yi = IC5Q for et annet medikament når det er

kombinert med forbindelsen fra eksempel 1

I = interaksjonsparameter som angir grad av reversering

Verdier for I ble beregnet for hver kombinasjon. Positive verdier av I indikerte en synergistisk kombinasjon, negative verdier indikerte antagonisme og 1=0 indikerer additiv interaksjon.

Resultatene er vist i tabell 1.

Resultatene viser at kombinasjonene av 2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-l,4-naftoquinon og proguanil viste den mest konsekvente potentiering sammenlignet med de andre undersøkte medikamentkombinasjoner, særlig mot hydroksynafto-quinonresistent" C2B stammen.

Optimalt forhold av kombinasjonen med proguanil ble estimert for hver av de tre stammene av malariaparasitt ved bestemm-else av forhold av IC50 av proguanil til IC50 av forbindelsen med formel (II). Resultatene er gitt i tabell 2 under.

Eksempel 4

Sammenligning av anti- toksoplasmaaktiviteter in vivo av forbindelse fra eksempel 1. proguanil og kombinasjoner av disse

Aktiviteter til forbindelsene og kombinasjonene ble undersøkt i en musemodell av T.gondii, ved å anvende økning i tid til døg og prosent overlevelse av mus som målt for medikament-aktivitet.

Grupper på 10, 20 g CBA/CA mus ble infisert oralt ved at de ble gitt 6 cyster av C55 stammen av T.gondii, og medikament-behandling ble startet 3 dager senere og fortsatt i 10 dager. Alle medikamentene ble administrert oralt. Følgende grupper ble undersøkt:

Kontroller:

Atovaquon a 10 mg/kg

Atovaquon a 25 mg/kg

Proguanil a 25 mg/kg

Atovaquon a 10 mg/kg + Proguanil a 25 mg/kg

Atovaquon a 25 mg/kg + Proguanil a 25 mg/kg

Alle dyrene ble undersøkt to ganger daglig i 30 dager og alle dødsfall ble registrert.

Resultatene er vist i tabell 3 og 4:

Gjennomsnittlig tid til død av kontrollmus var 14 dager, og bare et dyr overlevet [10$]. (Dette dyret kan ikke ha blitt infisert med den lave inokkuleringen som ble anvendt.) Atovaquon alene økte denne til 20,1 dager ved 10 mg/kg og 24,1 dager ved 25 mg/kg, i begge tilfeller med en enkelt overlevende [10$]. Proguanil, til tross for dens ypperlige sikkerhetsregister i menneske, er toksisk i mus. Ved 25 mg/kg viste proguanil tegn på toksisitet, og reduserte gjennomsnittlig tid før død til 9 dager, uten noen overlevende. Kombinasjonen av 10 mg/kg atovaquon med 25 mg/mg proguanil ga en gjennomsnittlig tid før død på 18,4 dager. Kombinasjonen av 25 mg/kg atovaquon og 25 mg/kg proguanil ga en øket tid før død til tross for toksisitet av proguanil og 80$ av musene overlevde sammenlignet med den minimale overlevelsen på 10$ mus som ble gitt atovaquon alene.

Eksempel 5

Sammenligning av anti- toksoplasmaaktiviter in vitro av forbindelse fra eksempel 1. proguanil og kombinasjoner derav

In vitro medikamentsensitive studier ble gjennomført ved å anvende en halv-automatisert teknikk basert på den som er anvendt for malaria (Desjardins et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1979 16(6) 710-718), med under utnyttelse av selektiv inkorporeing av <3>[H]-uracil ved T. gondii. Antitokso-plasmaaktivitet i dette systemet bestemmes ved hemming av opptak av radiomerket uracil i parasitter ved gradvis konsentrasjoner av medikamenter.

Medikamenter ble oppløst i DMSO og fortynninger fremstilt ved å anvende dyrkningsmedium inneholdende 3$ føtalt kalveserum. For å studere medikamentkombinasjoner, ble medikamentopp-løsninger ved utgangskonsentrasjoner kombinert i forskjellige forhold 1:1, 1:3, 3:1. Serie 1:2 fortynninger av medikamentoppløsninger og kombinasjoner ble fremstilt og anvendt i doble brønner i en 96-brønners plate tidligere sådd med HeLa-celler og RH-stamme T.gondii. Medikamenter ble tilsatt etter 2 timer etter at parasitten og platene var inkubert ved 37° C i 24 timer når 3[H]-uracil ble tilsatt og inkubasjon fortsatt ytterligere 8 timer. Analysen ble fullført ved å fjerne supernatantfluid, bryte opp T. gondii-inneholdende celler i SDS, og utfelling av merkede proteiner med TCA på f iltermatter. Inkorporering av markør ble målt på en Beta-plate scintillasjonsteller. Prosenthemming av uracilinkorporering ble beregnet for forbindelser og kombinasjoner og IC5g-verdier ved å anvende GSl-programmet. IC50 ble normalisert ved å tilegne verdien 1 til IC50 for forbindelsen fra eksempel 1 og proguanil med normaliserte verdier for hvert forhold av de to medikamentene som ble studert. Et isobologram ble konstruert ved å plotte disse normaliserte IC5Q-verdier mot hverandre. Potentiering indikeres ved verdiene som forekom under linjen av isobolo-grammet, en additiv effekt ved verdier på linjen og antagonisme ved verdier over linjen.

Plater ble satt opp i tredoble paralleller og alle verdier plottet.

Resultatene er vist i tabell 5.

Resultatene viser at kombinasjoner av atovaquon og proguanil viser potentiering in vitro mot T. gondii.

Eksempel 6

Sammenligning av anti- Pneumocystis- aktiviteter in vivo av forbindelse fra eksempel 1. proguanil og kombinasjoner av disse

Aktiviteter av forbindelsene og kombinasjonene ble undersøkt i en musemodell med Pneumocystis pneumonia.

Infeksjonsnivået hos mus i hver gruppe ble målt ved å anvende standard lungepåtrykkingssmøring og immunofluorescenstester. En bedømmelse ble tilegnet hver mus der 0 = ingen infeksjon og +4 = meget høy infeksjon. Resultatene er vist i tabell 6.

2

Når den ble dosert alene, ga atovaquon reduksjoner i infeksjonsvurdering. Proguanil alene ved 25 mg/kg/dag var ineffektiv i profylakse av PCP i scid-musen. Proguanil i kombinasjon med atovaquon viste synergi.

Claims (13)

1. En kombinasjon av 2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-1,4-naftoquinon og proguanil, karakterisert ved at forholdet av proguanil:2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-l,4-naftoquinon er i området fra 1:1 til 1:3.

2. En kombinasjon ifølge krav 1, karakterisert ved at forholdet av proguanil:2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-l,4-naftoquinon er 2:5.

3. En kombinasjon ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at 2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-l,4-naftoquinonet er i form av transisomeren eller en blanding av cis- og transisomerene hvori transisomeren dominerer.

4. En kombinasjon ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den anvendes i behandling og/eller profylakse av malaria i pattedyr.

5 . Anvendelse av en kombinasjon ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 for fremstilling av et medikament for behandling og/eller profylakse av protozo-parasittisk infeksjon elle~r en infeksjon forårsaket av P.carinii i pattedyr.

6. Anvendelse ifølge krav 5, der den protozo-parasittiske infeksjonen er malaria.

7. Anvendelse ifølge krav 5, der den protozo-parasittiske infeksjonen er toksoplasmose.

8. Anvendelse ifølge krav 5, for behandling og/eller profylakse av en infeksjon forårsaket a P.carinii.

9. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 8, der atovakonet og proguanil administreres sammen.

10. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 8, der atovaquonet og proguanil administreres sekvensielt.

11. En farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en kombinasjon ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 i forening med en eller flere farmasøytisk aksepterbare bærere derav.

12. En enhetsdoseformulering, karakterisert ved at den omfatter 50 mg til 3 g av hver av 2-[4-(4-klorfenyl)-cykloheksyl]-3-hydroksy-l,4-naftoquinon og proguanil.

13. En enhetsdoseformulering ifølge krav 12, karakterisert ved at den omfatter 500 mg av 2-[4-(4-klorfenyl)cykloheksyl]-3-hydroksy-l,4-naftoquinon og 200 mg av proguanil.