PT670719E

PT670719E - Combinacao de atovaquona com proguanil para o tratamento de infeccoes provocadas por protozoarios

Info

Publication number: PT670719E
Application number: PT94900254T
Authority: PT
Inventors: Victoria Susan Latter; Winston Edward Gutteridge; Mary Pudney; David Brian Ashton Hutchinson
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1992-11-26
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 2000-09-29
Also published as: HUT71346A; EP0670719A1; BG62595B1; JPH08503938A; SI9300614A; KR100294802B1; US5998449A; NO313225B1; RO119280B1; DK0670719T3; PL174323B1; GR3033745T3; CZ289692B6; CN1087935C; CY2193B1; SA93140434B1; BG99656A; AU5532294A; CZ289171B6; ATE191340T1

Description

DESCRIÇÃO “COMBINAÇÃO DE ATOVAQUONA COM PROGUANIL PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES PROVOCADAS POR PROTOZOÁRIOS” A presente invenção descreve combinações sinérgicas de 2-[4-- (4-clorofenil) -ciclo-hexil]-3-hidroxi-l, 4-naftoquinona (atovaquona) e proguanil que possuem actividade antiparasitica. Mais particularmente, a invenção diz respeito a composições farmacêuticas que contêm as referidas combinações, à sua utilização no tratamento de infecções provocadas por parasitas protozoários, tais como a malária e a toxoplasmose, e ainda à sua utilização no tratamento de infecções provocadas por Pneumocystis carinii. 0 composto 2—[4— (4-clorofenil) -ciclo-hexil]-3-hidroxi-l, 4-nafto-quinona (atovaquona) já havia sido descrito anteriormente, por exemplo, na patente de invenção europeia n° 123 238 que versa sobre as 2--substituído-3-hidroxi-l,4-naftoquinonas de fórmula estrutural (I)

1 ral (I), em que o símbolo n representa 0, são activos contra o parasita Plasmodium falciparum da malária dos seres humanos e também contra as espécies de Eimeria tais como E. tenella e E. acervulina, que são os organismos causadores da coccidiose, e ali se afirma também que os compostos de fórmula estrutural (I), em que o símbolo n representa o número 1, são activos contra protozoários do género Theileria, em particular T. annulata ou T. parva. Entre os compostos especificamente designados e exemplificados está o composto de fórmula estrutural (I) em que o símbolo n representa zero, o símbolo R1 representa um átomo de hidrogénio e o símbolo R2 representa um grupo 4-clorofenilo, isto é, o composto atovaquona. 0 composto proguanil é um fármaco bem conhecido para a profilaxia da malária, mas não para o seu tratamento. É um dos fármacos antimaláricos mais seguros que pode ser administrado a crianças muito jovens e a mulheres grávidas. No entanto, surgiu já a resistência do P. falciparum ao proguanil, em particular no sudoeste asiático, o que tem vindo a constituir um problema cada vez maior.

Com a finalidade de se combater a resistência ao fármaco, tem vindo a ser uma prática convencional utilizar combinações de mais de um agente antimalárico, administrados quer simultânea quer sequencialmente. No entanto, muitas dessas combinações são antagonísticas, daí resultando um tratamento menos eficaz e dando origem a regimes de dosagem que são por vezes complicados, aumentando a probabilidade de os pacientes não cumprirem um tratamento completo. Assim sendo, constitui um objecto da presente invenção proporcionar uma combinação de fármacos antimaláricos que não sejam antagonísticos e para a qual não seja necessário um regime complexo de dosagem.

Verificou-se agora surpreendentemente que ao combinar, quer de forma concomitante quer sequencialmente, o composto atovaquona, representado na presente memória descritiva pela fórmula estrutural (II) 2

e o composto proguanil, se consegue obter uma potenciação da actividade antiparasítica e em particular da actividade antimalárica. Além disso, é possível apresentar simplesmente numa única formulação farmacêutica uma combinação potenciadora do composto de fórmula estrutural (II) e de proguanil.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona atovaquona utilizável para a preparação de um medicamento para administração quer de forma concomitante quer sequencialmente com proguanil para o tratamento e/ou profilaxia de uma infecção provocada por parasitas protozoários, v.g. a malária ou a toxo-plasmose, ou para combater uma infecção provocada por P. carinii nos mamíferos, incluindo os seres humanos.

De preferência, o composto de fórmula estrutural (II) e o proguanil são administrados de forma concomitante. 0 composto de fórmula estrutural (II) e o proguanil são administrados numa proporção potenciadora. A proporção potenciadora está compreendida no intervalo entre 1:1-1:3 respectivamente de proguanil:atovaquona. Esta proporção pode ser utilizada com bons resultados para o tratamento da malária, incluindo o combate às espécies de malária resistentes à hidroxi-naftoquinona.

Assim, de acordo com .outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona uma combinação de atovaquona, ou de um seu sal fisiologicamente aceitável, e de proguanil, em que o composto atovaquona, ou o seu sal, e o composto proguanil se encontram presentes numa proporção entre proguanil:atovaquona compreendida no intervalo que vai desde 1:1 até 1:3. A expressão ‘proporção potenciadora’ aqui utilizada serve para indicar que o composto atovaquona e o composto proguanil se encontram presentes numa proporção tal que a actividade antiparasítica da 3 combinação é superior à de qualquer dos dois compostos atovaquona ou proguanil por si sós ou superior à actividade aditiva que seria previsível para a combinação com base na simples soma das actividades de cada um dos componentes. Dito isto, significa então que cada um dos componentes actua de modo sinérgico na combinação, desde que se encontre presente dentro dos limites definidos pela proporção po-tenciadora. 0 grupo hidroxilo da atovaquona pode formar sais com bases adequadas, compreendendo os sais de atovaquona fisiologicamente aceitáveis os sais obtidos com bases inorgânicas, tais como os sais de metais alcalinos (v.g. o sódio e o potássio) e os sais de metais alcalino-terrosos (v.g. o cálcio); os sais de bases orgânicas, v.g. os sais de fenil-etil-benzilamina, dibenzil-etileno-diamina, etanol-amina e dietanolamina; e ainda os sais de aminoácidos, v.g. a lisina e a arginina.

Faz-se observar que o composto de fórmula estrutural (II) pode existir como isómero cis ou trans, ou seja, o anel ciclo-hexilo pode ser cis- ou trans-substituí do pelo núcleo de naftoquinona e pelo grupo clorofenilo. É possível utilizar qualquer dos isómeros cis e trans e as suas misturas em qualquer proporção, em conformidade com a presente invenção. Em geral, se o composto estiver sob a forma de uma mistura de isómeros, então o isómero trans irá estar presente numa quantidade de cerca de 50% ou irá ser o isómero predominante, mas a utilização de misturas em que seja predominante o isómero cis também faz parte do âmbito da presente invenção. A proporção específica entre os isómeros pode variar conforme necessário: as misturas típicas são aquelas em que a proporção entre os isómeros cis/trans é aproximadamente de 1:1, 40:60 e 5:95. De acordo com a presente invenção, é preferível utilizar o isómero trans do composto de fórmula estrutural (II) ou uma mistura de isómeros cis e trans que contenha pelo menos 95%, v.g. 99%, do isómero trans.. O composto de fórmula estrutural (II) também pode existir sob uma forma tautomérica em que o grupo hidroxilo concede o seu protão a um dos grupos oxo, estando a utilização de tais formas tautoméricas 4

abrangida no âmbito da presente invenção. No entanto, admite-se que a forma estável seja a representada na fórmula estrutural (II). A quantidade de uma combinação de composto atovaquona e pro-guanil necessária para ser eficaz como agente antiparasitico irá variar, como é evidente, e em última instância ficará à discrição do médico assistente ou do veterinário. Os factores a ter em conta são a via de administração e a natureza da formulação, o peso corporal do mamífero, a sua idade e estado geral de saúde e ainda a natureza e a gravidade da doença que se pretenda tratar. Em geral, considera--se adequada uma dose eficaz, para administração a um ser humano para o tratamento da malária, quando compreendida entre 2,0 mg e 30 mg de proguanil por quilograma de massa corporal por dia e entre 0,5 mg e 30 mg de atovaquona por quilograma de massa corporal por dia, por exemplo, uma dose de proguanil desde 3 a 20 mg/kg/dia e uma dose de atovaquona desde 1 a 20 mg/kg/dia, em particular uma dose de proguanil desde 5 a 15 mg/kg/dia e uma dose de atovaquona desde 3 a 15 mg/kg/dia.

Uma dose adequada e eficaz para administração a um ser humano, para a profilaxia da malária, está compreendida entre 3 a 20 mg por quilograma de massa corporal por semana para qualquer dos compostos proguanil e atovaquona, por exemplo, entre 6 mg/kg/semana até 10 mg/ /kg/semana para qualquer dos compostos proguanil e atovaquona.

Faz-se observar que as doses referidas supra são calculadas em termos dos fármacos per si.

De acordo com a presente invenção, a utilização da combinação dos compostos atovaquona e proguanil prevê que tal combinação esteja preferèncialmente sob a forma de uma formulação farmacêutica.

As formulações farmacêuticas compreendem os ingredientes activos (isto é, a combinação de atovaquona e de proguanil) conjuntamente com um ou vários veículos farmaceuticamente aceitáveis indicados para o efeito e facultativamente outros ingredientes terapêuticos e/ou profilácticos. Qualquer dos veículos deve ser aceitável no sentido em que tem de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não pode ser prejudicial para o mamífero em causa. 5 /

Assim sendo, a presente invenção proporciona uma formulação farmacêutica que compreende uma combinação de atovaquona e de proguanil em associação com um ou vários veículos farmaceuticamente aceitáveis para o efeito, em que a proporção entre os compostos proguanil e atovaquona é aquela que aqui foi indicada. A presente invenção proporciona também um processo para a preparação de uma formulação farmacêutica, consistindo tal processo em associar entre si uma combinação de atovaquona e proguanil, nas proporções aqui referidas, com um ou vários veículos farmaceuticamente aceitáveis para o efeito. A combinação de atovaquona e de proguanil pode ser apresentada convenientemente como formulação farmacêutica numa forma de dosagem unitária. Uma formulação de dosagem unitária conveniente contém os ingredientes activos em quantidades compreendidas entre 10 mg e 3 g de cada composto, v.g. entre 50 mg e 3 g de cada um deles. As doses unitárias típicas podem conter, por exemplo, 500 mg de atovaquona e 200 mg de proguanil ou 500 mg de atovaquona e 500 mg de proguanil.

As formulações farmacêuticas compreendem aquelas que são adequadas para administração oral, tópica (incluindo a administração dermal, bucal e sublingual), rectal e parentérica (incluindo a administração subcutânea, intradermal, intramuscular e intravenosa) e também para administração por meio de um tubo nasogástrico. Sempre que adequado, a formulação pode ser apresentada convenientemente sob a forma de unidades de dosagem discretas e pode ser preparada por qualquer dos métodos bem conhecidos na especialidade farmacêutica. Todos esses métodos compreendem o passo que consiste em associar os ingredientes activos com veículos líquidos ou com veículos sólidos finamente divididos ou com veículos de ambos os tipos e depois, se necessário, dando ao produto obtido a forma desejada.

As formulações farmacêuticas convenientes para administração oral, em que o veículo é um sólido, são apresentadas mais preferencialmente sob a forma de formulações de dosagem unitária, tais como pastilhas, cápsulas ou comprimidos, contendo cada uma destas formas de dosagem uma quantidade predeterminada dos ingredientes activos. É possível produzir um comprimido por compressão ou por mol- 6 dagem, facultativamente com um ou vários ingredientes complementares. Os comprimidos obtidos por compressão podem ser preparados comprimindo numa máquina adequada os compostos activos, previamente obtidos numa forma de partículas soltas, por exemplo, um pó ou grânulos facultativamente misturados com um agente aglutinante, um lubrificante, um diluente inerte, um agente para facilitar o deslizamento, um agente tensioactivo ou um agente dispersante. Os comprimidos moldados podem ser obtidos por moldagem com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser facultativamente revestidos e no caso de não serem revestidos podem ser facultativamente entalhados. É possível produzir cápsulas enchendo cada uma das peças componentes de uma cápsula com os ingredientes activos, quer por si sós quer misturados com um ou vários ingredientes secundários> sendo então as cápsulas fechadas pelo processo habitual. Os trociscos são análogos às cápsulas, sendo neste caso os ingredientes activos conjuntamente com o(s) ingrediente(s) secundário(s) encerrados num invólucro de papel de arroz. A combinação do composto de fórmula estrutural (II) e de proguanil também pode ser formulada sob a forma de grânulos dispersíveis que podem ser, por exemplo, colocados em suspensão em água antes da sua administração, ou espalhados nos alimentos. Os grânulos podem ser acondicionados, v.g. num saquinho. As formulações adequadas para administração oral, em que o veículo é um liquido, podem ser apresentadas sob a forma de uma solução ou de uma suspensão num líquido aquoso ou num líquido não aquoso, ou sob a forma de uma emulsão liquida de tipo óleo-em-água.

As formulações para administração oral compreendem as formas de dosagem de libertação controlada, v.g. os comprimidos em que os ingredientes activos são formulados numa matriz adequada que regula a libertação, ou então são recobertos com uma película adequada que regula a libertação. Tais formulações podem ser particularmente convenientes para utilização profiláctica.

Os ingredientes activos também podem ser formulados como solução ou suspensão adequada para administração por meio de um tubo naso-gástrico. 7

As formulações farmacêuticas adequadas para administração rectal, em que o veiculo é um sólido, são apresentadas mais preferencialmente como supositórios de dose unitária. Como veículos adequados para este fim refere-se a manteiga de cacau e outros materiais vulgarmente utilizados na especialidade. Os supositórios podem ser produzidos convenientemente, misturando a combinação dos ingredientes activos com um ou vários veículos amolecidos ou fundidos, seguindo-se o arrefecimento e a sua configuração em moldes.

As formulações farmacêuticas adequadas para administração paren-térica compreendem as soluções ou suspensões estéreis da combinação activa em veículos aquosos ou oleaginosos. As preparações injectáveis podem ser adaptadas para injecção por bolus (ampola grande) ou por infusão continua. Tais preparações são apresentadas convenientemente em reservatórios de dose unitária ou de doses múltiplas que são perfeitamente fechados após a introdução, até ao momento em que venham a ser utilizados. Em alternativa, os ingredientes activos podem estar sob a forma de pó com o qual a formulação será reconstituída num veículo adequado, tal como a água estéril isenta de qualquer agente pirogénico, antes da utilização. A combinação de atovaquona e de proguanil também pode ser formulada sob a forma de uma preparação implantável para actuação a longo prazo, a qual pode ser administrada por injecção intramuscular ou por implantação, v.g. subcutânea ou intramuscularmente. As preparações implantáveis podem conter, por exemplo, materiais poliméricos ou hidrófobicos convenientes ou resinas de permuta iónica. Tais formulações de actuação a longo, prazo são particularmente convenientes para utilização profiláctica.

Para além dos ingredientes e dos veículos referidos antes, faz-se observar que as formulações farmacêuticas para as diversas vias de administração descritas antes também podem conter, conforme adequado, um ou vários ingredientes veiculares complementares, tais como diluentes, agentes tampão, agentes aromatizantes, aglutinantes, agentes tensioactivos, espessantes, lubrificantes, conservantes (incluindo os antioxidantes) e outros que tais, e ainda as substâncias 8 que são incorporadas com a finalidade de fazer com que a formulação fique isotónica com o sangue do mamífero em causa.

As composições adequadas para fins veterinários compreendem as que estão adaptadas para administração oral, parentérica e instrumental.

Os métodos para a preparação de atovaquona estão descritos no documento EP 123 238, estando ilustrado no exemplo 1 um método específico.

Exemplo 1 2-[Trans-4- (4-clorofenil) -ciclo-hexil]-3-hidroxi-l, 4-naftoquinona a) Ácido 4-(4-clorofenil)-ciclo-hexano-l-carboxílico

Agitou-se conjuntamente 30 g de cloreto de acetilo e 60 g de cloreto de alumínio finamente pulverizado em 120 mL de dissul-fureto de carbono e depois arrefeceu-se para -50°C num banho de C02/oxitol. Acrescentou-se gota a gota 30 g de ciclo-hexeno, previamente arrefecido para -50°C, durante 10 minutos, enquanto se mantinha a temperatura da mistura de reacção abaixo de -20°C. Agitou-se a mistura a -50°C durante mais 60 minutos e depois decantou-se o solvente para se obter um complexo gomoso cor--de-laranja. Juntou-se um pouco de clorobenzeno, à medida que o material foi aquecendo até à temperatura ambiente/ depois acrescentou-se a parte restante do clorobenzeno (um total de 300 mL), aqueceu-se a solução obtida para 40°C durante 3 horas, sob agitação, verteu-se sobre uma mistura de gelo e de ácido clorídrico concentrado e separou-se a camada orgânica, lavou-se com ácido clorídrico 2M, com uma solução de hidróxido de sódio 2M e com água, secou-se sobre sulfato de sódio anidro e evaporou--se até à secura. Destilou-se o produto ín vacuo, recolheu-se a fracção cujo ponto de ebulição está entre 140°C-154°C (0,1 mm Hg), diluiu-se com igual volume de éter do petróleo (40-60), arrefeceu-se para -6°C e fez-se borbulhar através dessa fracção 9

uma corrente contínua de azoto gasoso, tendo então sido recuperado o sólido que se separou.

Juntou-se 2,8 mL de bromo a uma solução de 6,2 g de hidróxido de sódio em 42 mL de água à temperatura de 0°C. Dissolveu-se 3,1 g da hexa-hidro-acetofenona substituída obtida supra, em 15 mL de dioxano, e depois acrescentou-se a solução fria de hipo-bromito, mantendo-se a mistura de reacção a uma temperatura abaixo de 20°C. Agitou-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 6 horas e depois deixou-se em repouso de um dia para o outro. Juntou-se metabissulfito de sódio para destruir o excesso de hipobromito, arrefeceu-se a mistura e depois acidificou-se para se obter um sólido incolor. Removeu-se ó sólido por filtração, lavou-se com água, secou-se e deixou-se recristalizar a partir de etanol para proporcionar o ácido 4--(4-clorofenil)-ciclo-hexano-l-carboxílico, p.f. 254°C-256°C. b) 2-[4- (4-Clorofenil) -ciclo-hexill-3-cloro-l, 4-naftoquinona

Preparou-se uma mistura de 3,95 g (0,02 mol) de 2-cloro-l,4--naftoquinona e de 4,9 g (0,02 mol) de ácido 4-(4-clorofenil)--ciclo-hexano-l-carboxílico e de 1,05 g (0,0062 mol) de nitrato de prata em pó e aqueceu-se ao refluxo, sob agitação vigorosa, em 40 mL de acetonitrilo. Durante 1 hora acrescentou-se gota a gota uma solução de 12,0 g (0,0525 mol) de persulfato de amónio em 50 mL de água. Manteve-se a mistura ao refluxo durante 3 horas e depois arrefeceu-se com gelo durante 30 minutos, após o que se efectuou a filtração, tendo o sólido viscoso residual sido extraído duas vezes com clorofórmio em ebulição para se remover o material inorgânico. Removeu-se o clorofórmio por evaporação para se obter cerca de 2,7 g de um sólido amarelo acastanhado. Dissolveu-se este sólido em 40 mL de acetonitrilo em ebulição; removeu-se por filtração uma pequena quantidade de um material insolúvel. Ao arrefecer, o composto em epígrafe 10

separou-se sob a forma de cristais amarelos (550 mg), p.f. 172°C-175°C. RMN, dH (ô6-DMSO) 3,05 (2H, mult., β-naft.), 7,85 (2H, mult., a-naft.), 7,30 (4H, s, PhH), 3,30 (1H, t lr, CH) , 2,67 (1H, t lr, CH) , 1,2-2,4 (8H, mult., 4xCH2) . c) 2-[4- (4-Clorofenil) -ciclo-hexill-3-hidroxi-l, 4-naftoquinona

Com o produto obtido no passo (b) preparou-se uma suspensão em 10 mL de metanol em ebulição e acrescentou-se gota a gota, durante 15 minutos, 0,55 g de hidróxido de potássio em 5,5 mL de água. Manteve-se a mistura ao refluxo até se formar uma solução vermelho-escuro (ao fim de cerca de 6 horas), altura em que se acrescentou gota a gota e muito cuidadosamente 2 mL de ácido clorídrico concentrado. Arrefeceu-se a mistura e filtrou-se e lavou-se o resíduo sólido muito bem com água. Os produtos das lavagens com água foram reacidificados e novamente filtrados. Os resíduos sólidos combinados (500 mg), p.f. 200°C--209°C, recristalizaram a partir de acetonitrilo para se obter o composto em epígrafe enquanto isómero trans (300 mg), p.f. 216°C-219°C.

Exemplo 2

Os exemplos seguintes ilustram composições farmacêuticas convencionais que podem ser utilizadas em conformidade com a presente invenção. A. Comprimido recoberto com uma película Núcleo

Composto do exemplo 1 500 mg

Cloridrato de proguanil 200 mg

Celulose microcristalina (Avicel PH101) 130 mg

Hidroxipropil-ceiulose, Lo-sub (LHPC, LH11) 99 mg

Glicolato de amido sódico (Explotab) 30 mg

Povidona K30 36 mg 11 5 mg

Estearato de magnésio

Massa comprimida 1000 mg

Revestimento Dispersão polimérica (hidroxipropil-metil-celulose e dióxido de titânio e polietileno-glicol 400 e corante) 20 mg

Acabamento

Polietileno-glicol 8000 2 mg

Massa total 1022 mg Comprimido recoberto com uma película dispersível · Núcleo Composto do exemplo 1 500 mg Cloridrato de proguanil 200 mg Celulose microcristalina (Avicel PH101) 100 mg Hidroxipropil-celulose, Lo-sub (LHPC, LH11) 83 mg Glicolato do amido sódico (Explotab) 40 mg Povidona K30 20 mg Estearato de magnésio 5 mg Docusato de sódio 1 mg Silicato de alumínio e magnésio (Veegum F) 50 mg Sacarina sódica 1 mg Massa comprimida 1000 mg Revestimento Dispersão polimérica (hidroxipropil-metil-celulose e dióxido de titânio e. polietileno-glicol 400 e corante) 10 mg Acabamento Polietileno-glicol 8000 2 mg Massa total 1012 mg

Exemplo 3

Comparação das interacções dos fármacos em combinações do composto do exemplo 1 com outros agentes antimaláricos

Procedeu-se à realização de estudos de sensibilidade ao fármaco in vitro, utilizando para tal a técnica semiautomática de Desjardins (Desjardins et al, “Antimalarial Agents and Chemotherapy” 1979; 16(6):710-718). A actividade antimalárica neste sistema é avaliada pela inibição da incorporação de hipoxantina, marcada radioacti-vamente, nos parasitas mediante concentrações graduais dos fármacos.

Os fármacos antimaláricos que se pretendia testar foram dissolvidos em água, em etanol a 95% ou em DMSO. Os fármacos dissolvidos em água foram diluídos a 1:1 em etanol a 95% e os fármacos dissolvidos em etanol foram diluídos a 1:1 com água. As soluções dos fármacos foram então diluídas com o meio de cultura que continha 10% de soro humano, até concentrações iniciais 20-50 vezes o valor estimado da CI5c· Os fármacos testados e os seus solventes estão enumerados a seguir. Fármaco Solvente inicial Meio Composto do exemplo 1 DMSO 1640 Qunina Etanol - Agua 1640 Cloroquina Água - Etanol 1640 Mefloquina Etanol - Agua 1640 Primaquina Etanol - Agua 1640 Artesunato Etanol - Agua 1640 PM443 DMSO 1640 Tetracíclina DMSO 1640 Norfloxacina DMSO 1640 Ciprofloxacina DMSO 1640 Proguanil Etanol - Agua Lo-folato Cicloguanil Etanol - Agua Lo-folato Pirimetamina DMSO Lo-folato Trimetoprim DMSO Lo-folato 13

Sulfametoxazol Dapsona Clopidol Alopurinol

DMSO

Lo-folato

Lo-folato PS-15 WR99210

DMSO Etanol - Agua DMSO

Lo-folato

DMSO

Lo-folato

Para o estudo de combinações de fármacos foram utilizadas soluções de fármacos com as concentrações inicias que foram combinadas em diversas proporções (1:5, 1:2, 2:1 e 5:1). As soluções de fármacos e as combinações foram então introduzidas numa placa de micro-titulação de 96 cavidades para se obter fileiras duplicadas de composto do exemplo 1, tendo o fármaco sido combinado para a preparação de quatro combinações das duas substâncias. Foram produzidas diluições dos fármacos sequenciais, à razão de 1:3, utilizando meios de diluição, que serviram para encher as 96 cavidades da placa de microtitulação, utilizando para tal uma pipetadora de 12 bicos. Para a avaliação de fármacos classificados como inibidores da redutase do ácido diidrofólico (DHFR), utilizou-se um meio de cultura modificado que continha apenas concentrações fisiológicas de ácido fólico e de PABA.

Os outros procedimentos biológicos foram realizados em conformidade com a técnica de Desjardins, com a excepção de terem sido utilizadas três estirpes de P. falciparum (o clone W-2 multirresistente aos fármacos, o clone D-6 sensível aos fármacos mas resistente à me-floquina e o isolado C2B resistente ao composto do exemplo 1), tendo a incubação durado 72 horas.

Procedeu-se ao cálculo de cada um dos valores CI50, utilizando o programa “MINSQ” da “Micromath Scientific Software”. Cada conjunto de dados emparelhados foi ajustado à função tangente hiperbólica utilizada por Desjardins.

Os valores CI5;. foram normalizados pelo artificio de se atribuir o valor 1 à grandeza CI50 do composto do exemplo 1 e ao outro fármaco que foi combinado com valores normalizados proporcionais para cada 14

proporção entre os dois fármacos estudados. Construiu-se um iso-bolograma ajustando os dados à equação:

Yi = 1-[Xí/(Xi + e1* (1-Xi) )] em que é Y± = CI5o para o composto do exemplo 1 quando combinado com outro fármaco

Xi = CI50 para um outro fármaco quando combinado com o composto do exemplo 1 I = parâmetro de interacção que indica o grau de inversão. Efectuou-se o cálculo dos valores de I para cada combinação. Aos valores positivos de I corresponde uma combinação sinérgica, os valores negativos indicam um antagonismo e I = 0 significa uma interacção aditiva.

Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 1. QUADRO 1

Fármaco combinado I com o composto do

Exemplo 1 W-2 D-6 C2B

Qunina -1,36 Cloroquina -1,84 -1,40 Mefloquina -1,19 Tetraciclina 1,27 1, 11 0,02-0,08 Primaquina -0,79 Ácido artesúnico -0,18 PM443 -1,28 Norfloxacina 1, 02 Ciprofloxacina -1,22 Pirimetamina 0, 36 -0, 48 Trimetoprim 1,27 0, 58 Proguanil 2,43, 2,88 2,56 2, 56 Cicloguanil 2, 21 1, 66 0,13-0,73 Alopurinol 1, 14 0, 43 PS-15 1,77, 0, 65, 1, 97 -0, 74 15

WR99210 0,02

Sulfametoxazol 2,75

Dapsona -0,39 0,73

Clopidol 2,38, 2,65

Os resultados demonstram que as combinações de 2—[4— (4-cloro-fenil) -ciclo-hexil]-3-hidroxi-l, 4-naftoquinona e de proguanil manifestaram uma potenciação mais consistente comparativamente com as outras combinações de fármacos que foram testadas, em particular contra a estirpe C2B resistente à hidroxinaftoquinona.

Avaliou-se, para cada uma das três estirpes de parasitas da malária., a proporção óptima da combinação com proguanil, tendo sido determinada para isso a proporção entre o valor CI50 do proguanil e o valor CI50 do composto de fórmula estrutural (II). Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 2 seguinte. QUADRO 2

W-2 D-6 C2B

Proguanil:Composto de fórmula (I) 920:1 4038:1 0,2:1 2473:1

Exemplo 4

Comparação das actividades antitoxoplásmicas in vivo entre o composto do exemplo 1, o proguanil e as suas combinações

Efectuou-se um estudo das actividades dos compostos e combinações num modelo de murganho infectado com T. gondii, utilizando como parâmetros de medida da actividade do fãrmaco o aumento do tempo decorrido até à morte dos murganhos e a percentagem de murganhos sobreviventes.

Foram utilizados grupos de 10 murganhos CBA/CA de 20 g que foram infectados por administração oral forçada de 6 quistos da estirpe C56 de T. gondii, tendo então o tratamento com o fãrmaco sido iniciado 3 dias mais tarde e prosseguido durante 10 dias. Todos os fármacos 16 -7

X foram administrados por via oral forçada. Foram examinados os grupos a seguir indicados:

Grupos de contraprova Atovaquona@ 10 mg/kg Atovaquona@ 25 mg/kg Proguanil@ 25 mg/kg

Atovaquona@ 10 mg/kg + Proguanil@ 25 mg/kg Atovaquona@ 25 mg/kg + Proguanil@ 25 mg/kg.

Os animais foram observados duas vezes por dia durante 30 dias e todas as mortes foram anotadas.

Os resultados obtidos estão agrupados nos quadros 3 e 4. QUADRO 3

Tempo médio decorrido até à morte (dias) 25 mg/kg 24,1 29,3

Atovaquona 0 10 mg/kg

Proguanil 0 140 20,1 (mg/kg) 25 9,0 18,4 QUADRO 4

Percentagem de sobrevivos

Atovaquona 0 10 mg/kg 25 mg/kg 0 10, 0 10,1 10, 0 25 .i 0, 0 0, 0 80, 0

Proguanil (mg/kg) 0 tempo médio decorrido até à morte dos murganhos de contraprova foi de 14 dias, tendo apenas sobrevivido um animal [10%]. (É possível que este animal não tenha ficado infectado com a quantidade exígua de inoculo utilizado). O composto atovaquona por si só aumentou este período para 20,1 dias com a dose de 10 mg/kg e para 24,1 dias com a dose de 25 mg/kg, havendo em ambos os casos apenas um sobrevivente [10%]. O composto proguanil, apesar de ser extraordinariamente seguro para os seres humanos, é tóxico para os murganhos. Para a 17 fj dose de 25 mg/kg, o composto proguanil induz sinais de toxicidade, reduzindo para 9 dias o período médio decorrido até à morte, sem nenhuns sobreviventes. A combinação de atovaquona na dose de 10 mg/kg com proguanil na dose de 25 mg/mg, permitiu obter um tempo médio de 18,4 dias até à morte. A combinação de atovaquona na dose de 25 mg/kg com proguanil na dose de 25 mg/kg proporcionou um aumento do período decorrido até à morte, apesar da toxicidade do proguanil, tendo sobrevivido 80% dos murganhos comparativamente com o índice de sobrevivência mínima de 10% de murganhos quando lhes foi administrado apenas o composto atovaquona.

Exemplo 5

Comparação das actividades antitoxoplásmicas in vitro entre o composto do exemplo 1, o proguanil e as suas combinações

Procedeu-se à realização de estudos in vitro de sensibilidade aos fármacos, utilizando para tal uma técnica semiautomática com base na que é utilizada para o estudo da malária (Desjardins et al, “Antimicrobial Agents and Chemotherapy” 1979; 1^6(6):710-718), mas utilizando a incorporação selectiva de 3[H]-uracilo no organismo T. gondii. Avaliou-se a actividade àntitoxoplásmica neste sistema por inibição da incorporação do uracilo, marcado radioactivamente, nos parasitas, utilizando concentrações graduais dos fármacos.

Os fármacos foram dissolvidos em DMSO e as diluições foram preparadas utilizando o meio de cultura que continha 3% de soro fetal de vitelo. Para o estudo das combinações de fármacos foram utilizadas as soluções de fármacos com as concentrações inicias que foram com- j binadas em diversas proporções, designadamente 1:1, 1:3 e 3:1. As soluções dos fármacos foram diluídas sequencialmente à razão de 1:2 e procedeu-se à preparação das combinações que foram utilizadas em cavidades, em duplicado, de 'uma placa de 96 cavidades previamente inoculadas com células de HeLa e com a estirpe RH de T. gondii. Os fármacos foram acrescentados 2 horas após a inoculação com o parasita e as placas foram incubadas a 37°C durante 24 horas, altura em que se acrescentou 3[H]-uracilo, tendo a incubação prosseguido durante mais 8 horas. Completou-se o ensaio removendo o fluído sobrenadante, 18

desmembrando em DSS (o mesmo que SDS) as células que continham T. gondii e fazendo precipitar com TCA, sobre retículos filtrantes, as proteínas marcadas. Mediu-se a incorporação do identificador numa platina de um contador de cintilação β. Calculou-se a percentagem de inibição da incorporação do uracilo por acção dos compostos utilizados e das respectivas combinações e procedeu-se ao cálculo dos valores CIsof utilizando o programa ‘GSl’. Os valores CI5o foram normalizados atribuindo o valor 1 ao parâmetro CI50 para o composto do exemplo 1 e ao composto ptoguanil, tendo sido estudados os valores normalizados para cada proporção entre os dois fármacos. Construiu--se um isobolograma marcando num gráfico os valores normalizados CI5o em função uns dos outros. A existência de um efeito potenciador é indicada pelos valores que ficam abaixo da linha do isobolograma, a existência de um efeito aditivo é indicada pelos valores sobre essa linha e o antagonismo é indicado pelos valores acima de tal linha. A preparação das placas foi realizada em triplicado e todos os valores foram transcritos para o gráfico.

Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 5. QUADRO 5

Potenciação

Valores CI50 normalizados

Atovaquona

Proguanil 0,559278 0,196689 0,729381 0,345238 0,130952 0,233333 0,404959 0,229201 0,244904 0,583893 0,614094 0,253691 0,527273 0, 6 0,118182 0,451538 0,768462 0,091538 Não

Sim

Sim 19

Os resultados demonstram que as combinações de atovaquona e de proguanil induzem um efeito potenciador in vitro contra T. gondii.

Exemplo 6

Comparação das actividades antipneumocísticas in vivo entre o composto do exemplo 1, o proguanil e as suas combinações

Efectuou-se um estudo sobre as actividades dos compostos e suas combinações num modelo de murganho com dicg (o mesmo que scid) infectado com Pneumocystis pneumonia (PCP).

Mediu-se o nivel de infecção dos murganhos de cada grupo, utilizando para tal esfregaços convencionais de impressão pulmonar e testes de imunofluorescência. Âtribuiu-se a cada murganho um valor de uma escala em que 0 significa ausência de infecção e +4 significa infecção muito forte. Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 6. QUADRO 6

Tratamento Escala de classificação Não infectados/ Classificação % de animais 0 +1 +3 +4 +4 não examinados média ± D.P. de contraprova Animais de contraprova não tratados 0 0 0 3 7 10/10 3,70 + 0,14 100 Atovaquona a 50 mg/ /kg p.o. diariamente 0 0 5 5 0 10/10 2,50 ± 0,16 68 Atovaquona a 25 mg/ /kg p.o. diariamente 0 0 1 7 2 10/10 3,10 ± 0,17 84 Proguanil a 25 mg/kg p.o. diariamente 0 0 0 . 2 8 10/10 3,80 ±0,13 85 Atovaquona e proguanil a 50 + 25 rrg/kg p.o. diariamente 5 4 1 0 0 5/10 0,50 ± 0,21 14 Atovaquona e proguanil a 25 + 25 mg/kg p.o. diariamente 1 0 4 4 0 8/9 2,22 ± 0,31 60

Quando aplicado por si só, o composto atovaquona permitiu obter reduções na escala de infecção. 0 composto proguanil por si só, 20 segundo uma dose de 25 mg/kg/dia, foi ineficaz na profilaxia de pcp no murganho com dicg. 0 composto proguanil em combinação com o composto atovaquona teve um efeito sinérgico.

Lisboa, 19 de Junho de 2000 0 AOENTÊ ÕFÍÔÍÀL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Combinação de 2-[4- (4-clorofenil) -ciclo-hexil]-3-hidroxi-l, 4-nafto-quinona e de proguanil, em que a proporção entre proguanil:2-[4-- (4-clorofenil) -ciclo-hexil]-3-hidroxi-l, 4-naftoquinona está compreendida no intervalo entre 1:1 e 1:3.
2. Combinação de acordo com a reivindicação 1, em que a proporção entre proguanil: 2-[4- (4-clorofenil) -ciclo-hexil]-3-hidroxi-l, 4--naftoquinona é de 2:5.
3. Combinação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que o composto 2—[4— (4-clorofenil) -ciclo-hexil]-3-hidroxi-l, 4--naftoquinona está na forma do seu isómero trans ou na forma de uma mistura de isómeros cis e trans em que predomina o isómero trans.
4. Combinação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, utilizável para o tratamento e/ou profilaxia da malária num mamífero.
5. Utilização de uma combinação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de uma infecção com parasitas protozoários ou de uma infecção provocada por P. Carinii em mamíferos.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a infecção com parasitas protozoários é a malária.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a infecção. com parasitas protozoários é a toxoplasmose.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 5, para o tratamento e/ou profilaxia de uma infecção provocada por P. carinii. 1
9. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 8, em que os compostos atovaquona e proguanil são administrados con-comitantemente.
10. Composição farmacêutica que incorpora uma combinação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 em associação com ou vários veículos farmaceuticamente aceitáveis para o efeito.
11. Formulação de dose unitária que contém entre 50 mg e 3 g de cada um dos compostos 2—[4— (4-clorofenil) -ciclo-hexil]-3-hidroxi-l, 4--naftoquinona e proguanil.
12. Formulação de dose unitária de acordo com a reivindicação 11, a qual contém 500 mg de 2-[4-(4-clorofenil)-ciclo-hexil]-3-hidroxi--1,4-naftoquinona e 200 mg de proguanil. Lisboa, 19 de Junho de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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