PL174323B1

PL174323B1 - Kompozycja farmaceutyczna zawierająca 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinon

Info

Publication number: PL174323B1
Application number: PL93309222A
Authority: PL
Inventors: Winston E. Gutteridge; David B.A. Hutchinson; Victoria S. Latter; Mary Pudney
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1992-11-26
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 1998-07-31
Also published as: US5998449A; CN1087935C; AP9300592A0; ATE191340T1; SK281559B6; CA2150234E; GB9224739D0; HU9501537D0; BG62595B1; SA93140434B1; CZ289692B6; HU225918B1; DK0670719T3; CZ289171B6; TW253835B; EP0670719A1; HUT71346A; NO951995D0; AU685408B2; DE69328307T2

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna zawie- rajaca 2- [4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo] - 3-hydroksy-1,4-naftochinon i chlorowo- dorek 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobi- guanidyny i ewentualnie jeden lub wiecej niz jeden farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienna tym, ze zawiera 2-[4-(4-chloro- fenylo)cykloheksylo] -3 -hydroksy-1,4-naf- tochinon i chlorowodorek l-(4-chlo- rofenylo)-5-izopropylobiguanidyny w sto- sunku 1:1 do 3:1. WZÓR I I PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, zawierająca 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinon (atovaquonu) i chlorowodorek 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny (proguanil) w synergetycznej proporcji, wykazująca aktywność przeciwpasożytniczą. Kompozycje te mają zastosowanie w leczeniu pierwotniakowych infekcji pasożytniczych, takich jak malaria i toksoplazmoza oraz w leczeniu infekcji wywoływanych przez Pneumocystis carinii.

Związek [4-(4-chlorofenylo)cykloheksyło]-3-hydroksy-1,4-naftochinon (atovaquon) był ujawniony, np. w opisie patentowym europejskim nr 123 238, który dotyczył 2-podstawionych

3-h;y<±ro;k^^^1,4-naftochinonów o wzorze 1, w którym albo R¹ oznacza wodór a R² oznaczagrupę C1--alkoksylową, aryloalkoksylową, C1^-alkilo-C1-6-{dkoksylową, fenylową podstawionąjedną lub dwiema grupami, takimi jak halogen i grupa C1-6-alkilowa, halogen i grupa perhalo-C1---alkilowa, albo oba R1 i R² oznaczają grupę C-alkiiową lub fenylową, a n oznacza zero lub 1, oraz ich soli do przyjęcia pod względem fizjologicznym. Określono, że związki te mają aktywność przeclwpierwotniadową. W szczególności, związki o wzorze 1, w którym n oznacza zero, są aktywne przeciwko pasożytowi ludzkiej malarii Plasmodium Falciparum, a także przeciwko gatunkom Eimeria, takim jak E. tenella i E.acervulina, które są organizmami wywołującymi kokcydiozę, oraz związki o wzorze 1, w którym n oznacza 1, są aktywne przeciw pierwotniakom gatunku Theileria, a zwłaszcza T. annulata lub T. parva. Wśród specjalnie wymienionych związków, podanychjako przykład,jest związek o wzorze 1, w którym n oznacza zero, R1 oznacza wodór i R2 oznacza grupę 4-chlorofenylową, tzn. atovaquon.

Proguanił jest dobrze znanym lekiem służącym do zapobiegania malarii, ale nie do jej leczenia. Jest to jeden z najbardziej bezpiecznych leków przeciwmalarycznych i może być podawany małym dzieciom i kobietom ciężarnym. Jednakże pojawiła się już odporność P. falciparum na proguanil, zwłaszcza w Azji Południowo-Wschodniej, co stanowi coraz większy problem.

174 323

Standardowym sposobem zwalczania odporności na leki staje się stosowanie mieszanin więcej niż jednego leku przeciwmalarycznego, albo jednocześnie, albo kolejno. Jednakże wiele takich mieszanin jest mieszaninami antagonistycznymi, co zmniejsza skuteczność leczenia, a sposoby dawkowania są często skomplikowane, co zwiększa prawodopodobieństwo, że chorym nie uda się zakończyć leczenia. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem mieszanina leków przeciwmalarycznych, która nie jest antagonistyczna i która nie wymaga stosowania złożonego sposobu dawkowania.

Obecnie stwierdzono nieoczekiwanie, że w wyniku stosowania mieszaniny, albo jednocześnie, albo kolejno, atovaquonu przedstawionego w tym opisie wzorem 2, z proguanilem, uzyskuje się wzmocnienie aktywności przeciwpasożytniczej, a zwłaszcza przeciwmalarycznej. Ponadto, taka mieszanina o wzmocnionym działaniu związku o wzorze 1 z proguanilem może być z łatwością przygotowywana w postaci pojedynczego preparatu farmaceutycznego.

Sposób leczenia i/lub zapobiegania pierwotniakowej infekcji pasożytniczej, np. malarii lub toksoplazmozie, lub infekcji wywoływanej przez P. carinii u ssaków, włącznie z ludźmi polega na podawaniu skutecznej ilości atovaquonu lub jego soli do przyjęcia pod względem fizjologicznym i na jednoczesnym lub kolejnym podawaniu skutecznej ilości proguanilu.

Związek o wzorze 2 i proguanil korzystnie są podawane jednocześnie. Związek o wzorze 2 i proguanil najbardziej korzystnie są podawane w stosunku wzmagającym działanie.

Stosunek wzmagający działanie, który może być stosowany z dobrymi wynikami w leczeniu malarii, włącznie z gatunkami malarii odpornymi na hydroksynaftochinon, jest w zakresie stosunku proguanil: atovaquonod 1:0,1 do 1:100. Stosunek wzmagający działanie jest korzystnie w zakresie od 1:0,2 do 1:10.

Szczególnie korzystny jest stosunek wzmagający działanie w zakresie od 1:1 do 1:3.

Sposób leczenia i/lub zapobiegania malarii u ssaków, włącznie z ludźmi, który polega na podawaniu skutecznej ilości mieszaniny atovaquonu, lub jego soli do przyjęcia pod względem fizjologicznym, i proguanilu.

Grupa hydroksylowa atovaquonu może tworzyć sole z odpowiednimi zasadami, a solami atovaquonu do przyjęcia pod względem fizjologicznym są sole zasad nieorganicznych, takie jak sole metali alkalicznych (np. sodu i potasu) i sole metali ziem alkalicznych (np. sole wapnia); sole zasad organicznych, np. fenyloetylobenzyloaminy, dibenzyloetylenodiaminy, etanoloaminy i dietanoloaminy; i sole aminokwasów, np. lizyny i argininy.

Przyjmuje się, że związek o wzorze 2 może występować w postaci izomeru cis lub trans, tzn. pierścień cykloheksylowy może być podstawiony w położeniu cis lub trans przez pierścień naftochinonowy i grupę chlorofenylową. Zarówno izomery cis i trans, jak i ich mieszaniny w dowolnym stosunku mogą być stosowane według niniejszego wynalazku. Na ogól, gdy związek jest w postaci mieszaniny izomerów, to izomer trans występuje w ilości około 50% lub w ilości przeważającej, jednak stosowanie mieszanin, w których przeważa izomer cis wchodzi także w zakres niniejszego wynalazku. Konkretny stosunek izomerów może się zmieniać, w miarę potrzeby; zwykle mieszaniny mają stosunek izomerów cis/trans około 1:1, 40:60 i 5:95. Do zastosowań według niniejszego wynalazku jest korzystne stosowanie izomeru trans związku o wzorze 2 lub mieszaniny izomerów cis i trans, zawierającej co najmniej 95%, np. 99% izomeru trans.

Związek o wzorze 2 może istnieć także w postaci tautomerycznej, w której grupa hydroksylowa oddaje swój proton jednej z grup okso; stosowanie takich postaci tautomerycznych wchodzi także w zakres niniejszego wynalazku. Jednakże uważa się, że postacią trwałą jest postać przedstawiona wzorem 2.

Ilość mieszaniny atovaquonu i proguanilu, jaka jest potrzebna do uzyskania skuteczności jako środka przeciwpasożytniczego, jest oczywiście zmienna i ostatecznie winna być określona przez lekarza lub weterynarza. Czynniki, jakie należy przy tym uwzględnić obejmują - sposób podawania i rodzaj preparatu, masę ciała ssaka, jego wiek i stan ogólny oraz rodzaj i ciężkość leczonej choroby. Na ogół, odpowiednia skuteczna dawka podawana ludziom w leczeniu malarii jest w zakresie od 2,0 do 30 mg proguanilu na kg masy ciała na dzień i od 0,5 do 30 mg atovaquonu na kg masy ciała na dzień, np. od 3 do 20 mg/kg/dzień proguanilu i od 1 do 20 mg/kg/dzień atovaquonu, a zwłaszcza od 5 do 15 mg/kg/dzień proguanilu i od 3 do 15 mg/kg/dzień atovaquonu.

17-4323

Odpowiednia skuteczna dawka u ludzi dla zapobiegania malarii jest w zakresie od 3 do 20 mg na kilogram masy ciała i na tydzień, zarówno proguanilu, jak i atovaquonu, np. od 6 mg/kg/tydzień do 10 mg/mg/tydzień, zarówno proguanilu, jak i atovaquonu.

Należy rozumieć, że powyższe dawki obliczono w odniesieniu do leków per se.

Do stosowania kompozycji według niniejszego wynalazku, mieszanina atovaquonu i proguanilu jest korzystnie przygotowywana w postaci preparatu farmaceutycznego.

Preparaty farmaceutyczne zawierają składniki czynne (tj. mieszaninę atovaquonu i proguanilu) łącznie z jednym lub kilkoma nośnikami do przyjęcia pod względem fizjologicznym i ewentualnie z innymi składnikami terapeutycznymi i/lub profilaktycznymi. Nośnik (nośniki) winien (winny) być do przyjęcia pod względem kompatybilności z innymi składnikami receptury i nie powinny być szkodliwe dla biorcy.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinon i chlorowodorek 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny i ewentualniejeden lub więcej niżjeden farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzująca się tym, że zawiera 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]-3-hy droksy-1,4-naftochinon i chlorowodorek 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny w stosunku 1:1 do 3:1.

Korzystna kompozycja według wynalazku zawiera 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]3-hydroksy-1,4-naftochinon i chlorowodorek 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny w stosunku 5:2.

W innym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zwiera 2-[4-(4-chlorofenylo) cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinon w postaci izomeru trans lub w postaci mieszaniny izomerów cis i trans, w której przeważa izomer trans.

Korzystnie kompozycja w postaci jednostkowej dawki zawiera 50 mg do 3 g każdego z

2-[4-(4-chlorofenylo) cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinonu i chlorowodorku 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny. Sposób wytwarzania preparatu farmaceutycznego, obejmuje łączenie mieszaniny atovaquonu i proguanilu z jednym lub kilkoma jego nośnikami do przyjęcia pod względem farmaceutycznym.

Mieszaninę atovaquonu i proguanilu można dogodnie przygotowywać jako preparat farmaceutyczny w jednostkowej postaci dawkowania. Dogodna jednostkowa postać dawkowania zawiera składniki czynne w ilościach od 10 mg do 3 g każdy, np. od 50 mg do 3 g każdy. Zwykłe jednostkowe dawki mogą zawierać np. 500 mg atovaquonu i 200 mg proguanilu lub 500 mg atovaquonu i 500 mg proguanilu.

Preparaty farmaceutyczne mogą być preparatami odpowiednimi do podawania doustnego, miejscowego (skórnego, policzkowego i podjęzykowego), odbytniczego i pozajelitowego (podskórnego, śródskórnego, domięśniowego i dożylnego), jak również do podawania zagłębnikiem nosowo-żołądkowym. Gdy jest to potrzebne, to preparaty mogą być w postaci osobnych jednostek dawkowania i mogą być przygotowywane dowolnym sposobem znanym w technice farmacji. Wszystkie te sposoby obejmują etap łączenia składników aktywnych z ciekłymi nośnikami lub z silnie rozdrobnionymi stałymi nośnikami, lub z tymi obydwoma rodzajami, a następnie, o ile to jest konieczne, etap formowania produktu w postaci pożądanego preparatu.

Preparaty farmaceutyczne odpowiednie do podawania doustnego, w których nośnik jest ciałem stałym, występują najkorzystniej w postaci takich preparatów jednostkowego dawkowania, jak duże pigułki, kapsułki lub tabletki, z których każda zawiera określoną z góry ilość aktywnych składników. T abletkę można wykonać metodą prasowania lub formowania zjednym lub z kilkoma składnikami pomocniczymi. Prasowane tabletki mogą być w postaci osobnych jednostek dawkowania i mogą być przygotowane metodą prasowania w odpowiedniej maszynie związków aktywnych w postaci sypkiej, takiej jak proszek lub granulki, ewentualnie zmieszane ze spoiwem, środkiem smarnym, środkiem powierzchniowo czynnym lub środkiem dyspergującym. Formowane tabletki mogą być przygotowywane w wyniku formowania w obojętnym ciekłym rozcieńczalniku. Tabletki mogą być ewentualnie powlekane, a gdy nie są powlekane, to mogą być zarysowywane nacięciem. Kapsułki mogąbyć przygotowywane metodą napełniania powłok kapsułek aktywnymi składnikami, albo samymi albo w mieszaninie z jednym lub z kilkoma składnikami pomocniczymi, i następnego ich zamykania zwykłym sposobem. Opłatki są podobne do kapsułek, przy czym czynne składniki razem z dowolnym pomocniczym skład174 323 nikiem (składnikami) zamyka się z otoczce z ryżowego papieru. Mieszaninę związku o wzorze 2 i proguanilu można także przygotować w postaci dyspergowalnych granulek, które przed podawaniem mogą być np. zawieszone w wodzie lub natryskiwane na żywność. Granulki mogą być pakowane, np. do torebki. Preparaty odpowiednie do podawania doustnego, w których nośnik jest cieczą, mogą występować w postaci roztworu lub zawiesiny w cieczy wodnej lub w cieczy niewodnej, lub też w postaci ciekłej emulsji typu olej-w-wodzie.

Preparaty do podawania doustnego są to postaci dawkowania o kontrolowanej szybkości uwalniania, np. tabletki, w których składniki aktywne.są wprowadzone do odpowiedniej matrycy kontrolującej szybkość uwalniania lub są powleczone odpowiednią błoną kontrolującą szybkość uwalniania. Takie preparaty mogą być szczególnie dogodne do zastosowań w profilaktyce.

Aktywne składniki mogą być także przygotowywane jako roztwór lub zawiesina odpowiednia do podawania zgłębnikiem nosowo-żołądkowym.

Preparaty farmaceutyczne odpowiednio do podawania odbytniczego, w których nośnik jest ciałem stałym, mają najkorzystniej postać czopkówjednostkowego dawkowania. Odpowiednim nośnikiem jest masło kakaowe i inne substancje stosowane zwykle w technice. Czopki można dogodnie formować metodą dodawania do aktywnej mieszaniny zmiękczonego lub stopionego nośnika (nośników) z następnym chłodzeniem i ukształtowaniem w formach.

Preparatami farmaceutycznymi odpowiednimi do podawania pozajelitowego są jałowe roztwory lub zawiesiny aktywnej mieszaniny w podłożach wodnych lub oleistych. Preparaty do wstrzykiwania mogą być przygotowane w jednej dużej dawce do wstrzykiwania lub w postaci ciągłej kroplówki. Takie preparaty występują często w pojemnikach zawierających jedną lub wiele dawek, które to pojemniki pozostają zamknięte po wprowadzeniu preparatu aż do użycia. Składniki aktywne mogą być także w postaci proszku przygotowywanego przed użyciem przez dodatek odpowiedniego podłoża, takiego jak jałowa woda nie zawierająca pirogenów.

Mieszanina atovaguonu i proguanilu może być także przygotowywana w postaci porcji preparatu o przedłużonym działaniu w tkance, która może być podawana metodą zastrzyków domięśniowych lub metodą wszczepienia, np. podskórnie lub domięśniowo. Porcje preparatu o przedłużonym działaniu w tkance mogą zawierać np. odpowiednie substancje polimeryczne lub hydrofobowe, lub też żywice jonowymienne. Takie preparaty o przedłużonym działaniu są szczególnie odpowiednie do zastosowań profilaktycznych.

Uważa się, że, poza wymienionymi powyżej składnikami nośnika, preparaty farmaceutyczne do różnych, opisanych powyżej sposobów podawania mogą także zawierać, w, miarę potrzeby, jeden lub kilka dodatkowych składników nośnika, takich jak rozcieńczalniki, bufory, środki zapachowe, spoiwa, środki powierzchniowo czynne, zagęszczacze, środki smarne, konserwanty (włącznie z przeciwutleniaczami) itp., oraz substancje dodawane w celu nadania preparatowi izotoniczności z krwią przewidywanego biorcy.

Kompozycje odpowiednie do zastosowań weterynaryjnych obejmują preparaty dostosowane do podawania doustnego, pozajelitowego i dożwaczowego.

Sposoby wytwarzania atovaquonu podano w opisie EP 123 238, ajeden sposób przedstawiono w przykładzie I.

Przykład I. 2-[trans-4-(4-chlorofenylo)cyldohe]k5ylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinon

a) Kwas 4-(4-chlorofenylo)cykloheksano-1-karboksylowy g chlorku acetylu i 60 g drobno sproszkowanego chlorku glinowego zmieszano razem w 120 ml dwusiarczku węgla, a następnie ochłodzono do temperatury -50°C w kąpieli CO2oksytol. 30 g cykloheksanu, uprzednio ochłodzonego do temperatury -50°C, wkraplano w ciągu 10 minut, utrzymując temperaturę reakcji poniżej -20°C. Całość mieszano nadal w temperaturze -50°C w ciągu 60 minut, a następnie zdekantowano rozpuszczalnik, uzyskując gumowaty pomarańczowy kompleks. Dodano nieznaczną ilość chlorobenzenu, przy czym substancja ogrzała się do temperatury pokojowej; następnie dodano resztę chlorobenzenu (łącznie 300 ml), otrzymany roztwór ogrzewano w temperaturze 40°C w ciągu 3 godzin, z jednoczesnym mieszaniem, wylano go na mieszaninę lodu i stężonego kwasu solnego, oddzielono warstwę organiczną, przemytoją 2 M kwasem solnym, 2 M wodorotlenkiem sodowym i wodą, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym i odparowano do sucha. Produkt destylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, zebrano frakcję wrzącą w temperaturze 140-154°C, 13,3 Pa (0,1 mm Hg),

174 323 rozcieńczono równą objętością eteru naftowego (40-60), ochłodzono do temperatury 6°C, przepuszczano ciągły strumień gazowego azotu i odzyskano bezbarwne ciało stałe.

Do roztworu 6,2 g wodorotlenku sodowego w 42 ml wody dodawano 2,8 ml bromu w temperaturze 0°C. 3,1 g otrzymanego powyżej heksahydroacetofenonu rozpuszczono w 15 ml dioksanu, a następnie dodawano zimny roztwór podbrominu, utrzymując temperaturę poniżej 20°C. Całość mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 6 godzin, a następnie pozostawiono na noc. Dodano pirosiarczynu sodowego w celu rozłożenia nadmiaru podbrominu, mieszaninę ochłodzono i następnie zakwaszono, uzyskując bezbarwne ciało stałe. Ciało stałe odsączono, przemyto wodą, wysuszono i przekrystalizowano w etanolu, uzyskując kwas 4-(4-chlorofenylo)cvkloheksano-1-karboksylowy, temperatura topnienia 254-256°C.

b) 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksyloj-3-chloro-1,4-naftochinon

Mieszaninę 3,95 g (0,02 mola) 2-chloro-1,4-naftochinonu, 4,9 g (0,02 mola) kwasu

4-(4-chlorofenylo)cykloheksano-1-karboksylowego i 1,05 g (0,0062 mola) azotanu srebrowego ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w 40 ml acetonitrylu, z jednoczesnym silnym mieszaniem. Wkraplano w ciągu 1 godziny roztwór 12,0 g (0,0525 mola) nadsiarczanu amonowego w 50 ml wody. Mieszaninę ogrzewano do wrzeniapod chłodnicą zwrotną w ciągu 3 godzin, następnie chłodzono w lodzie w ciągu 30 minut, po czym przesączono, a pozostałe lepkie ciało stałe ekstrahowano dwukrotnie wrzącym chloroformem w celu usunięcia substancji nieorganicznej. Chloroform odparowano i otrzymano około 2,7 g żółtobrązowego ciała stałego. Rozpuszczono je w 40 ml wrzącego acetonitrylu, a nieznaczną ilość substancji nierozpuszczalnej odsączono. Po ochłodzeniu oddzielono 550 g związku podanego w tytule w postaci żółtych kryształów, temperatura topnienia 172-175°C.

NMR, dH(&,-DMSO) 8,05 (2H, mull., β-naft), 7,85 (2H, mult., α-naft), 7,30 (4H, s., PhH), 3,30 (1H, br. t„ CH), 2,67 (1H, br. t., CH), 1,2-2,4 (8H, mult., 4xCH₂).

c) 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksyloj-3-hydroksy-1,4-naftochinon

Produkt z etapu (b) zawieszono w 10 ml wrzącego metanolu i wkraplano 0,55 g wodorotlenku potasowego w 5,5 ml wody w ciągu 15 minut. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną, aż do powstania ciemnoczerwonego roztworu (po upływie około 6 godzin), po czym ostrożnie wkraplano 2 ml stężonego kwasu solnego. Mieszaninę ochłodzono i przesączono, a stałą pozostałość przemyto dokładnie wodą. Wodę z płukania ponownie zakwaszono i przesączono. 500 mg połączonych stałych pozostałości (temperatura topnienia 200-209°C) przekrystalizowano z acetonitrylu, uzyskując 300 mg związku podanego w tytule w postaci izomeru trans, temperatura topnienia 216-219°C.

Przykład II. Poniższe przykłady przedstawiają zwykłe preparaty farmaceutyczne, które mogą być stosowane według niniejszego wynalazku.

A. Tabletka powlekana błoną

Rdzeń:
Związek z przykładu I	500 mg
Chlorowodorek proguanilu	200 mg
Mikrokrystaliczna celuloza (Avicel PH101)	130 mg
Hydroksypropyloceluloza, Lo-sub, (LHPC, LH11)	99 mg
Glikolan sodowy skrobi (Explotab)	30 mg
Povidone K30 (poliwinylopirolidon)	36 mg
Stearynian magnezowy	5 mg
Łączna masa do prasowania	1000 mg
Powłoka:
Zawiesina polimerowa
(Hydroksypropylometyloceluloza, dwutlenek tytanowy,
glikol polietylenowy 400 i barwniki)	20 mg
Polerowanie:
Glikol polietylenowy 8000	2. mg
Łączna masa	1022mg

B. Dyspergowalna tabletka powlekana błoną Rdzeń:

Związek z przykładu I 500 mg

Chlorowodorek proguenilu 2(0) mg

Mikrokrystaliczna celuloza 1Avicel PH101) 110) mg

Hrdroksyproprloceluloaa, Lo-sub, (LHPC, LH 11) 83 mg

Glikolan sodowy skrobi ^plo^b) 40 mg

Povidone K30 20 -cg

Stearynian magnezowy 5 mg

Dokusan sodowy 1 mg

Krzemian magnezowo-glinowy 1Vnngam F) 50 -cg

Łączna masa do prasowania 1100) mg

Powłoka:

Zawiesina polimerowa

1Hrdrfksypropylometylocnlulfae, dwutlenek tytanowy, glikol polietylenowy 400 i barwnik) 10 mg

Polerowanie:

Glikol polietylenowy 3000 2mg

Łączna masa 1012 mg

Wyniki testów biologicznych

Przykład UL Porównanie oddziaływań leków w mieszaninach związku z przykładu I z innymi lekami arznciwmelerycznymi

Badania in vitro wrażliwości na leki wykonywano półautomatyczną metodą Derjardinsa (Desjardins i in., Antimalarial Agents and Chemoterapy 1979; 16(6):710-713). Aktywność praeziwmalerrzzną w tym układzie oceniano na podstawie hamowania przez stopniowane stężenia leków wcielenia w pasożyty znakowanej promieniotwórczo hyafksentyny.

Testowane leki przeciwmeleIycznn roaaasacaenf w wodzie, 95% etanolu lub DMSO; leki rozpuszczono w wodzie rozcieńczano w stosunku LI 95% etanolem, a leki rozpuszczone w etanolu rozcieńczano w stosunku 1:1 wodą. Następnie rozcieńczano roztwory leków bakteryjną pożywką hodowlaną zawierającą 10% ludzkiej surowicy, do wyjściowych stężeń od 20 do 50 razy większych od ocenianej wartości IC50· Badane leki i ich rozpuszczalniki zestawiono poniżej:

Lek Początkowy rozpuszczalnik	Pożywka
Związek z przykładu I	DMSO	1640
Chinina	etanol-woda	1640
Chlorochin	woda-etanol	1640
MeClochin	etanol-woda	1640
Primachin	etanol-woda	1640
Artesunat	etanol-woda	1640
PM443	DMSO	1640
Tetracyklina	DMSO	1640
NfrCloksecyna	DMSO	1640
Crprofloksacrne	DMSO	1640
Proguanil	etanol-woda	Lo-Colate
Crkloguanil	etanol-woda	Lo-Colate
Pirrmntamina	DMSO	Lo-Colate
Trimetoprim	DMSO	Lo-Colate
SuCemetfkseaol	DMSO	Lo-Colate
Dapson	DMSO	Lo-Colate
Klopidol	DMSO	Lo-Colate
Allopurinol	etanol-woda	Lo-Colate
PS-15	DMSO	Lo-Colate
WR99210	DMSO	Lo-Colate

174 323

W celu zbadania mieszanin leków, mieszano w różnych stosunkach (1:5, 1:2, 2:1 i 5:1) roztwory leków o stężeniach wyjściowych. Roztwory leków i mieszaniny wprowadzano następnie na płytki do mikromiareczkowania z 96 dołkami, aby uzyskać podwójne rzędy związku z przykładu I, leku podawanego mieszaniu oraz czterech mieszanin dwu leków. Kolejne rozcieńczenia leków pożywkami w stosunku 1:3 wykonywano w celu napełnienia płytki do mikromiareczkowania z 96 dołkami przy użyciu 12-kanałowego urządzenia pipetującego. W celu oceny leków sklasyfikowanych jako inhibitory reduktazy kwasu dihydrofoliowego (DHFR) zastosowano modyfikowaną hodowlaną pożywkę bakteryjną, która zawierała jedynie fizjologiczne stężenia kwasu foliowego i PABA.

Inne procedury biologiczne wykonywano zgodnie z techniką Desjardinsa, z tą różnicą, że użyto trzech szczepów P. Falciparum (odporny na wiele leków klon W-2, wrażliwy na leki lecz odporny na meflochin klon D-6 i izolat C2B odporny na związek z przykładu I) oraz przedłużono inkubację do 72 godzin.

Poszczególne wartości IC50 obliczano stosując program MINSQ z Micromath Scientific Software. Każdy zbiór par danych wyrównywano do funkcji tangensa hiperbolicznego stosowanej przez Desjardinsa.

Wartości IC50 znormalizowano, przypisując wartości IC50 równe 1 związkowi z przykładu I i innemu lekowi mieszanemu ze znormalizowanymi proporcjonalnie wartościami dla każdego stosunku dwu badanych leków. Skonstruowano izobologram wyrównując dane do równania:

Yt = 1- [Xi/(X1 + e¹* (1-Xx))], w którym: Y1 = IC50 związku z przykładu I zmieszanego z innym lekiem, Xj = IC50 innego leku zmieszanego ze związkiem z przykładu I, I=parametr oddziaływania wskazujący na stopień odwrócenia.

Dla każdej mieszaniny obliczono wartości I. Dodatnie wartości I wskazywały na mieszaninę synergetyczną, wartości ujemne wskazywały na antagonizm, a I = 0 wskazywało na oddziaływanie addytywne.

Wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Lek zmieszany ze związkiem z przykładu I	I
W-2	D-6	C2B
Chinina	-1,36
Chlorochin	-1,84	-1,40
Meflochin	-1,19
Tetracyklina	1,27	1,11	0,02, -0,08
Primachin	-0,79
Kwas artesunowy		-0,18
PM443		-1,28
Norfloksacyna	1,02
Cyprofloksacyna	-1,22
Pirymetamina	0,36		-0,48
Trimetoprim	1,27		0,58
Proguanil	2,43,2,88	2,56	2,56
Cykloguanil	2,21	1,66	0,13, -0,73
Allopurynol	1,14	0,43
PS-15	177, 0,65,1,97	-0,74
WR99210	0,02
Sulfometoksazol	2,75
Dapson	-0,39
Klopidol	2,38, 2,65	0,73

Wyniki te pokazują, że mieszaniny 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4naftochinonu z proguanilem wykazywały najbardziej zgodne wzmaganie działania leku przez drugi lek w porównaniu z innymi mieszaninami leków, w szczególności przeciwko szczepowi C2B odpornemu na hydroksynaftochinon.

Optymalny stosunek mieszaniny z proguanilem oceniano dla każdego z trzech szczepów pasożytu malarii przez oznaczanie stosunku IC50 proguanilu do IC50 związku o wzorze II. Wyniki podano w poniższej tabeli 2.

Tabela 2

	W-2	D-6	C2B
Proguanil: związek o wzorze I	920:1 2473:1	4038:1	0,2:1

Przykład IV. Porównanie aktywności antytoksoplazmowych in vivo związku z przykładu I, proguanilu i ich mieszanin

Aktywności związków i mieszanin zbadano na modelu myszy T. gondii, stosując jako miarę aktywności leku przedłużenie czasu do śmierci i procentowe przeżycie myszy.

Grupy myszy 10,20 g CVBA/CA zarażono doustnie metodą odżywiania przez zgłębnik sześciomatorbielami szczepu T. gondii, a leczenie lekiem zaczynano 3 dni później i prowadzono w ciągu 10 dni. Wszystkie leki podawano doustnie metodą odżywiania przez zgłębnik. Zbadano następujące grupy:

grupy kontrolne atovaquon @10 mg/kg atovaquon @ 25 mg/kg proguanil @ 25 mg/kg atovaquon @10 mg/kg + proguanil @ 25 mg/kg atovaquon @ 25 mg/kg + proguanil @ 25 mg/kg

Wszystkie zwierzęta oceniano dwa razy dziennie w ciągu 30 dni i rejestrowano wszystkie śmierci.

Wyniki podano w tabelach 3 i 4.

Tabela 3

Średni czas do śmierci, dni

Średni czas do śmierci myszy kontrolnych wynosił 14 dni i tylko jedno zwierzę przeżyło [10%]. (To zwierzę mogło nie być zarażone małą użytą ilością materiału inokulacyjnego). Sam atovaquon przedłużył ten czas do 20,1 dni dla 10 mg/kg i do 24,1 dni dla 25 mg/kg, w obu przypadkach przeżyło tylko 1 zwierzę [10%]. Proguanil, mimo doskonałych wyników bezpieczeństwa u ludzi, jest trujący dla myszy. Dla 25 mg/kg proguanil wykazuje oznaki toksyczności, skracając średni czas do śmierci do 9 dni, przy czym żadne zwierzę nie przeżyło. Mieszanina 10 mg/kg atovaquonu z 25 mg/kg proguanilu spowodowała średni czas do śmierci równy 18,4 dni. Mieszanina 25 mg/kg atovaquonu i 25 mg/kg proguanilu spowodowała przedłużenie czasu do śmierci, mimo toksyczności proguanilu, a 80% myszy przeżyło, w porównaniu

174 323 z bardzo małą wartością przeżycia, wynoszącą 10% myszy, w przypadku myszy, którym podawano sam atovaquon.

Przykład V. Porównanie aktywności antytoksoplazmowych in vitro związku z przykładu I, proguanilu i ich mieszanin

Badania in vitro wrażliwości na leki wykonywano półautomatyczną metodą opartą na metodzie zastosowanej w odniesieniu do malarii (Desjardins i in., Antimalarial Agents and Chemotherapy 1979; 16(6):710-718). Aktywność przeciwtoksoplazmową w tym układzie oceniano na podstawie hamowania przez stopniowane stężenia leków wcielania w pasożyty znakowanego promieniotwórczo uracylu.

Leki rozpuszczano w DMSO i następnie rozcieńczano je bakteryjną pożywką hodowlaną zawierającą 3% surowicy płodu cieląt. W celu zbadania mieszanin leków, mieszano w różnych stosunkach (1:1,1:3 i 3:1) roztwory leków o stężeniach wyjściowych. Przygotowywano kolejne rozcieńczenia 1:2 roztworów leków, przygotowywano mieszaniny i stosowano je następnie w podwójnych dołkach na płytce z 96 dołkami, z uprzednio posianymi komórkami HeLa i z komórkami RH szczepu T. gondii. Leki dodawano po 2 godzinach od dodania pasożytu i płytki inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 24 godzin, po czym dodawano 3[H]-uracyl i inkubowano jeszcze w ciągu 8 godzin. Test kończono przez usunięcie górnej części płynu, rozerwanie w SDS komórek zawierających T. gondii i wytrącenie na matach filtracyjnych za pomocą TCA znakowanych białek. Wcielanie znacznika za pomocą licznika scyntylacyjnego z płytką Beta. Procentowe hamowanie wcielania uracylu obliczano dla związków, i mieszanin oraz obliczano wartości IC50 za pomocą programu GS 1. Wartości IC50 znormalizowano, przypisując wartości IC50 równe 1 związkowi z przykładu I i proguanilowi, i badano znormalizowane wartości dla każdego stosunku dwu badanych leków. Skonstruowano izobologram przez wykreślenie tych znormalizowanych wartości IC50 względem siebie. Na wzmaganie działania wskazywały wartości występujące poniżej linii izobologramu, na działanie addytywne - wartości na linii, a na antagonizm - wartości powyżej linii.

Płytki sporządzono potrójnie i wykonano wykres zawierający wszystkie wartości.

Wyniki przedstawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Znormalizowane wartości IC50	Wzmaganie działania
atovaquon	proguanil
0,559278	0,583893	nie
0,196689	0,614094	tak
0,729381	0,253691	tak
0,345238	0,527273	tak
0,130952	0,6	tak
0,233333	0,118182	tak
0,404959	0,451538	tak
0,229201	0,768462	tak
0,244904	0,091538	tak

Wyniki pokazują, że mieszaniny atovaquonu i proguanilu mają działanie wzmagające in vitro przeciwko T.gondii.

Przykład VI. Porównanie aktywności antypneumocystowych in vivo związku z przykładu I, proguanilu i ich mieszanin

Aktywności związków i mieszanin zbadano w odniesieniu do modelu myszy na Pheumocystis pneumonia.

Poziom infekcji myszy w każdej grupie mierzono przy użyciu standardowych wymazów wycisku z płuc i testów immunofluorescencyjnych. Każdej myszy przypisywano pewną punktację, przy czym 0 oznacza brak infekcji, a +4 - bardzo silną infekcję. Wyniki przedstawiono w tabeli 6.

Tabela 6

Sposób leczenia	Punktacja	Liczba zakażonych liczba zbadanych	Średnia punktacja ± SE	% w stosunku próby kontrolnej
	0	+1	+2	+3	+4
Próba kontrolna, nie leczona	0	0	0	3	7	10/10	3,70 ±0,14	100
atovaquon 50mg/kg, p.o., dziennie	0	0	5	5	0	10/10	2,50 ±0,16	68
atovaquon 25 mg/kg, p.o., dziennie	0	0	1	7	2	10/10	3,10 ±0,17	84
proguanil 25 mg/kg, p.o., dziennie	0	0	0	2	8	10/10	3,80 ±0,13	85
atovaquon & proguanil 50 + 25 mg/kg, p.o, dziennie	5	4	1	0	0	5/10	0,50 ±0,21	14
atovaquon & proguanil, 25 + 25 mg/kg, p.o., dziennie	1	0	4	4	0	8/9	2,22 ±0,31	60

Podczas dawkowania samego atovaquonu uzyskano zmniejszenia punktacji infekcji. Sam proguanil w dawce 25 mg/mg był nieskuteczny w zapobieganiu PCP u myszy. Stosowanie proguanilu w mieszaninie z atovaquonem działanie synergetyczne.

174 323

WZÓR I

(ch₂)

WZÓR II

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinon i chlorowodorek 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny i ewentualnie jeden łub więcej niż jeden farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że zawiera 2-[4-(4-chlorofenylo)cyklohek.sylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinon i chlorowodorek

1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny w stosunku 1:1 do 3:1.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera 2-[4-(4-chlorofenylo)cykioheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinon i chlorowodorek 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny w stosunku 5:2.
3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftoch.inon w postaci izomeru trans lub w postaci mieszaniny izomerów cis i trans, w której przeważa izomer trans.
4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że w postaci jednostkowej dawki zawiera 50 mg do 3 g każdego z 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinonu i chlorowodorku 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny.
5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że w postaci jednostkowej dawki zawiera 50 mg do 3 g każdego z 2-[4-(4-chlorofenylo)cykloheksylo]-3-hydroksy-1,4-naftochinonu i chlorowodorku 1-(4-chlorofenylo)-5-izopropylobiguanidyny.