FI107807B - Tärkkelyksen entsymaattinen hydrolyysi glukoosiksi geenimanipuloidun entsyymin avulla - Google Patents
Tärkkelyksen entsymaattinen hydrolyysi glukoosiksi geenimanipuloidun entsyymin avulla Download PDFInfo
- Publication number
- FI107807B FI107807B FI925901A FI925901A FI107807B FI 107807 B FI107807 B FI 107807B FI 925901 A FI925901 A FI 925901A FI 925901 A FI925901 A FI 925901A FI 107807 B FI107807 B FI 107807B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- glucoamylase
- amino acid
- glucose
- enzyme
- exchange
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 91
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 90
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 title claims abstract description 75
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 title claims abstract description 42
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 title claims abstract description 42
- 239000008107 starch Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 239000008103 glucose Substances 0.000 title description 65
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 title description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 title description 2
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims abstract description 123
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 51
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 30
- 108010028688 Isoamylase Proteins 0.000 claims description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 11
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 11
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 3
- 241001134780 Bacillus acidopullulyticus Species 0.000 claims 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000009923 sugaring Methods 0.000 claims 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 82
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 58
- DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N isomaltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N 0.000 description 33
- AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N Isomaltose Natural products OC[C@H]1O[C@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N 0.000 description 32
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 28
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 24
- 108050008938 Glucoamylases Proteins 0.000 description 18
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 16
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 16
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 102400000471 Isomaltase Human genes 0.000 description 11
- 108010026867 Oligo-1,6-Glucosidase Proteins 0.000 description 11
- BNABBHGYYMZMOA-AHIHXIOASA-N alpha-maltoheptaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O[C@@H]6[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]6O)CO)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O BNABBHGYYMZMOA-AHIHXIOASA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 5
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 5
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960002632 acarbose Drugs 0.000 description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N (2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-methyl-5-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1-cyclohex-2-enyl]amino]-2-oxanyl]oxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)N[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1)O)C)[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 3
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 3
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 3
- XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N acarviostatin I01 Natural products OC1C(O)C(NC2C(C(O)C(O)C(CO)=C2)O)C(C)OC1OC(C(C1O)O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(O)C(O)C1O XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 3
- 102000016679 alpha-Glucosidases Human genes 0.000 description 3
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 3
- DBTMGCOVALSLOR-AXAHEAMVSA-N galactotriose Natural products OC[C@@H]1O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H](O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H](CO)[C@@H]3O)[C@@H]2O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-AXAHEAMVSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- -1 isomaltol oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- FBJQEBRMDXPWNX-FYHZSNTMSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)C(O)O2)O)O1 FBJQEBRMDXPWNX-FYHZSNTMSA-N 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N isomaltol Natural products CC(=O)C=1OC=CC=1O HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 description 1
- 108010043797 4-alpha-glucanotransferase Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000757144 Aspergillus niger Glucoamylase Proteins 0.000 description 1
- 241000228251 Aspergillus phoenicis Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101100084046 Caenorhabditis elegans cyn-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229920002245 Dextrose equivalent Polymers 0.000 description 1
- 101710194570 Glucoamylase I Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/20—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an exo-1,4 alpha-glucosidase, e.g. dextrose
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
5 107807 Tärkkelyksen entsymaattinen hydrolyysi glukoosiksi geeni-manipuloidun entsyymin avulla - Hydrolys av stärkelse tili glukos med hjälp av ett genmanipulerat enzym
Keksinnön kohteena on uusia entsyymejä ja menetelmä entsyymien käyttämiseksi glukoosin valmistamiseksi tärkkelyksestä. Erityisesti keksintö liittyy glukoamylaasi-entsyymivariant-teihin ja sellaisten erilaisten entsyymivarlanttien käyttöön 10 tärkkelysyksiköstä tai osittain hydrolysoidusta tärkkelyksestä valmistetun glukoosisaannon nostamiseksi.
Glukoamylaasi (1,4-a-D-glukaaniglukohydrolaasi, EC 3.2.1.3) on entsyymi, joka katalysoi D-glukoosin vapauttamista tärk-15 kelyksen tai vastaavista oligo- ja polysakkaridi-molekyylien ei-redusoivista päistä. Glukoamylaaseja valmistetaan useilla rihmasienillä ja hiivoilla, joista Aspergillukset ovat kaupallisesti tärkeimmät.
20 Kaupallisesti glukoamylaasientsyymiä käytetään viljatärkke-lyksen, joka on jo osittain hydrolysoitu a-amylaasin toimes-ta, muuttamiseksi glukoosiksi. Glukoosi muutetaan edelleen • · ... glukoosi-isomeraasilla seokseen, joka sisältää noin yhtä pal- » « jon glukoosia ja fruktoosia. Tämä seos tai seos, joka edel- ♦ · * *·* * 25 leen on rikastettu fruktoosin suhteen, on yleisesti käytetty • ♦ : korkeafruktoosiviljasiirappi, joka on kaupallistettu ympäri • · V·· maailmaa. Tämä siirappi on maailman tonniluvultaan suurin : tuote, joka on valmistettu entsymaattisella menetelmällä. Ne kolme entsyymiä, jotka ovat mukana tärkkelyksen muuttamisessa ·♦··; 30 fruktoosiksi, ovat tärkeimpiä teollisia entsyymejä, joita on .···. valmistettu, siitä huolimatta, että kaksi niistä, a-amylaasi ja glukoamylaasi, ovat suhteellisen halpoja painon tai akti- - · · * ’···* viteetin perusteella.
··· • · • « • · · 35 On olemassa kaksi pääasiallista ongelmaa, jotka liittyvät • · · · .···. glukoamylaasin kaupalliseen käyttöön korkeafruktoosivilja- siirapin valmistuksessa. Ensimmäinen ongelma liittyy glukoamylaasin lämpöstabiliteettiin. Glukoamylaasi ei ole yhtä lämpöstabiili kuin α-amylaasi tai glukoosi-isomeraasi ja se 2 107807 on eniten aktiivinen ja stabiili alemmilla pH-arvoilla kuin joko α-amylaasi tai glukoosi-isomeraasi. Niinpä sitä on käytettävä erillisessä astiassa alemmassa lämpötilassa ja pH:ssa. Toiseksi korkeissa kiintoaine-pitoisuuksissa, joita 5 käytetään kaupallisesti korkea-fruktoosiviljasiirapin valmistuksessa, glukoamylaasi syntetisoi di-, tri- ja tetrasak-karideja tuotetusta glukoosista. Niinpä glukoosin saanto ei ylitä 95 %:a teoreettisesta. Määrältään pääasiallinen muodostettu sivutuote on isomaltoosi, disakkaridi, joka sisältää 10 kahta glukosyyliradikaalia kytkettynä a- (1->·6) -sidoksella. Glukoamylaasi, joka pystyy tuottamaan glukoosia ilman sivutuotteita olisi kaupallisesti potentiaalisesti tärkeä, jos sen kustannukset eivät olisi merkittävästi korkeampia kuin nykyisin tuotetun entsyymin, joka pääasiallisesti valmiste-15 taan kahdella toisiaan hyvin lähellä olevalla sienilajilla Aspergillus nicrer ja Aspergillus awamori. Glukoamylaasit näistä kahdesta lähteestä ovat identtisiä.
Glukoamylaasit erilaisista sienilähteistä on sekvensoitu ja 20 niillä on korkea homologia (viite 1, 2). Korkea homologia erilaisten sienilähteiden välillä viittaa siihen, että kaikki entsyymit ovat rakenteellisesti ja toiminnallisesti samanlai- • · ... siä. Lisäksi kineettiset määritykset muutamilla glukoamylaa- • · *·” seilla ovat osoittaneet, että niiden alipaikkakohtaiset sito- » · · *·’ ' 25 misenergiat ovat melkein identtiset (viite 3, 4, 5, 6, 7) .
• · * * · • · · • « · · « · ·.*·: Hakija on suorittanut tutkimuksia koskien A. nigerista ja A^_ »·» ·* awamorista saatujen identtisten glukoamylaasien aminohappojen homologiaa, sekä yhdessä muiden glukoamylaasien kanssa että ·:*·· 30 yhdessä muiden entsyymien kanssa, jotka hydrolysoivat tärk- .··*. kelystä ja sen tapaisia aineita (viite 8) . Tämä tehtiin sel- ^ laisten aminohappojen, jotka olivat yhteisiä entsyymeissä, v · · *· "·'··' jotka eivät pysty lohkaisemaan a- (1—>6) -glukoosisidoksia • · · (pääasiallisesti α-amylaasi) , tunnistamiseksi niistä, jotka 35 pystyvät hydrolysoimaan a-(l-»6)-glukoosisidoksia (glukoamy- • * · · .*··. laasit ja isomaltaasi) .
• · ♦ · ·
Hakija on havainnut, että glukoamylaasi on edustettuna kolmessa kuudesta samansekvenssisestä alueesta useampien tärk- 3 107807 kelyshydrolaasien joukossa (viite 8). On määritetty, että Alue 1 A. nioer -glukoamylaasiradikaaleista 109-122, Alue 4 glukoamylaasiradikaaleista 172-184 ja Alue 6 radikaaleista 382-398 sisältävät nämä samankaltaisuudet sekvenssin suhteen.
5 Alueet edustavat sekvenssisamankaltaisuuksia entsyymeillä, jotka lohkaisevat ainoastaan α- (1—>4)-sidoksia, entsyymeillä, jotka lohkaisevat ainoastaan a- (1—>6)-sidoksia ja glukoamy-laasilla, joka lohkaisee molempia. Aminohapot asemissa 178, 182, 183 ja 184 erosivat ryhmien kesken, mikä viittaa amino-10 happojen vaihtoon näissä asemissa. Hakija on myös todennut homologiaa asemassa 119. Käyttämällä kasettimutagenisointia hakija on tehnyt aminohapposubstituointeja eräissä näissä asemissa homologiatutkimusten mukaisesti (viite 8).
15 Neljännentoista ICS-kokouksen yhteydessä Tukholmassa 1988 hakija esitti posterin, joka kuvasi, että asemasuunnattu mutageenisuus tukee Tyrll6:n ja Trpl20:n osallistumista substraattisitomiseen ja Glul80 katalyysiin. Lisäksi esitettiin, että Trpl70:lla on rooli isomaltoosin sitomisessa, 20 mutta tämä aspekti jää tutkittavaksi asemasuunnatulla muta-geenisuudella. Posteri paljasti myös, että Asnl82:n mutaatio Alarksi edellytti aktiivisen entsyymin, mutta mitään tuloksia • · ... ei esitetty eikä ehdotettu koskien tämän entsyymin suhteel- • · ”1 lista spesifisyyttä.
« » · 25 • · • · · M· Kuten edellä on todettu, epäkohta glukoamylaasin teollisessa • · käytössä on siinä, että D-glukoosisaannot rajoittuvat noin • · · V· 95 %:iin väkevissä tärkkelysliuoksissa. Tämä tapahtuu tärkke lyksen oc-1 (->6)-D-glukooosisidosten hitaan hydrolyysin takia ·;··· 30 ja siitä syystä, että D-glukoosista muodostuu asteittain erilaisia kasaantuvia kondensaatiotuotteita, pääasiallisesti \ a- (1—>6)-kytkettyjä isomalto-oligosakkarideja (viite 9). On '•y‘ käytännössä mutkikasta vähentää nopeutta, jolla glukoamylaasi lohkaisee ja sen takia muodostaa a-(1—>6)-sidoksia suhteessa ··· 35 nopeuteen, jolla se lohkaisee a-(1—>4)-sidoksia. Mutaatiot * · « · .·**. asemissa Trpl20, Aspl76, Glul79 ja Glul80 A. awamori -gluko- amylaasissa olivat kaikki kriittisiä entsyymiaktiviteetille (viitteet 10, 11).
4 107807
Hakija jatkoi muiden aminohappomutaatioiden tutkimista tavoitteen ollessa glukoamylaasin selektiivisyyden lisääminen maltoosin hydrolyysiin verrattuna isomaltoosin hydrolyysiin. Nämä kokeet ovat ongelmallisia, koska glukoamylaasin kolmi-5 ulotteista rakennetta ei ole määritetty. Sen sijaan käytettiin ensisijaisesti alueellisia sekvenssisamankaltaisuuksia muilla glukoamylaaseilla kuin A. awamorilla ja A. niaerilla tuotetuilla sekä muilla entsyymeillä, jotka ovat aktiivisia a-(l—>4)- ja a-(1^-6)-kytketyillä D-glukosyylioligo- ja poly-10 sakkarideilla (Kuvio 1).
Hakija suoritti siten testejä, jotka esimerkiksi koskivat Serll9:n, Leul77:n, Trpl78:n, Asnl82:n, Glyl83:n ja Serl84:n mutaatioita.
15
Alueella 1 (Kuvio 1) glukoamylaasilla on asemissa, jotka vastaavat A. niaer 119: ää, joko Ser, Ala tai Pro, joissa oc-amylaaseilla ja syklodekstriiniglukaanitransferaaseilla (CGTaasi) kaikilla on Tyr. Sen takia A. niaer -glukoamylaasin 20 Serll9 saatettiin läpikäymään mutaatio Tyr:ksi, jotta se voisi muistuttaa cc-amylaaseja ja CGTaaseja.
• • « · · • · ... Alueella 4 Leul77 saatettiin läpikäymään mutaatio His:ksi ‘y;‘ koska entsyymit, joilla on aktiviteettia a- (l->6) -glukoosi- • · · *.* ' 25 sidoksiin tunnusomaisesti sisältävät aminohapporadikaaleja, • · : joilla on tässä homologisessa asemassa pienempiä alifaattisia • · :.*·· sivuketjuja, kun taas entsyymit, joilla on aktiviteettia ::: ainoastaan a- (1—>4)-D-glukoosisidoksiin, sisältävät ensisi jaisesti Phe:n tai Trp:n, joilla on suuria aromaattisia 30 sivuketjuja. Tässä asemassa esiintyvät myös Ile, Vai ja Leu.
• « · • · * ·* A. niaer -glukoamylaasin radikaalissa 178 Trp saatettiin :.i.: läpikäymään mutaatio Arg:ksi, koska Trp säilytettiin gluko- • « · amylaaseissa ja isomaltaasissa, jotka lohkaisevat a-(l-»6)-35 sidoksia, mutta Arg:ia löytyy kaikissa a-amylaaseissa, ··«« .···. maltaaseissa, CGTaasissa, amylomaltaasissa ja haarautuneessa • · entsyymissä, jotka eivät lohkaise mainittuja sidoksia.
5 107807
Perustuen samoihin vertailuihin Asnl82 saatettiin läpikäymään mutaatio Ala:ksi, koska Asn säilytettiin kaikissa glukoamy-laaseissa ja isomaltaasissa, mutta oli useimmissa a-amylaa-seissa korvattu radikaaleilla, jotka sisälsivät lyhyitä ali-5 faattisia sivuketjuja kuten Ala, Vai ja Ser, tavallisesti Ala.
A. niaer -glukoamylaasiasemassa 183 kaikilla gluko-amylaa-seilla on Gly, isomaltaasilla on hapan ketju Glu, kun taas 10 entsyymeillä, jotka lohkaisevat ainoastaan a-(l-»4)-glukoo-sisidoksia, on emäksinen sivuketju, ensisijaisesti Lys, joskin Arg myöskin esiintyy. Haarautunut entsyymi on ainoa oc-(1-M)-sidokseen vaikuttava entsyymi, joilla ei ole emäksistä ryhmää tässä asemassa, vaan sen sijaan Ala. Sen takia Glyl83 15 muutettiin Lys:ksi.
Asemassa 184 glukoamylaaseilla on Ser, Vai ja Met, kun taas isomaltaasilla on myös Vai. Entsyymit, jotka lohkaisevat a-(1—>4)-sidoksia, sisältävät kuitenkin enimmäkseen His:a tässä 20 asemassa, vaikka Gly, Leu, Gin ja Ser myös esiintyvät. Sen takia Serl84 muutettiin His:ksi.
• • · · · • · ... Tämän keksinnön mukaan on aikaansaatu menetelmä tärkkelyksen » · *·;·* tai osittain hydrolysoidun tärkkelyksen muuttamiseksi dekst- *·* * 25 roosia sisältäväksi siirapiksi, joka menetelmä käsittää vai- • » : heen, jossa tärkkelyshydrolysaatti muutetaan sokeriksi Asper- • « gilTus-kannasta saatavissa olevan glukoamylaasin sellaisen • · * : mutantin läsnä ollessa, jolla suhteessa Aspergillus niaerin glukoamylaasiin on korotettu selektiivisyys oi-(1—>4)-glukoo-30 sisidoksiin ja joka käsittää jonkin seuraavista mutaatioista: « * · • · ··« A. niqer -glukoamylaasin Ser 119:ää vastaavassa positiossa " · · · olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, « ·· edullisesti Tyr:lla; •j. 35 A. niqer -glukoamylaasin Asn 182: ta vastaavassa positiossa M·· .·*·. olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Asn, edullisesti Ala:11a; 6 107807 A. nicrer -glukoamylaasin Gly 183:a vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Gly, edullisesti Lys:lla; A. niaer -glukoamylaasin Ser 184:ää vastaavassa positiossa 5 olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Hisrlla.
Tämän keksinnön mukaan on näin ollen myös aikaansaatu Asper-aiUus-kannasta saatavissa olevan glukoamylaasin mutantti, 10 jolla on suhteessa Aspergillus niaerin glukoamylaasiin korotettu selektiivisyys a- (1—>4) -glukoosisidoksiin ja käsittää jonkin seuraavista mutaatioista: A. niger -glukoamylaasin Ser 119:ää vastaavassa positiossa 15 olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Tyr:lla; A. niger -glukoamylaasin Asn 182:ta vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Asn, edullisesti Ala:11a; 20 A. niger -glukoamylaasin Gly 183:a vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Gly, edullisesti Lys:lla; • · A. niger -glukoamylaasin Ser 184 :ää vastaavassa positiossa • · *** olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, • t · ]·*/ 25 edullisesti Hisilla; • · · •·ϊ · edellyttäen, että mutaation läpikäyneen entsyymin ollessa • · * * * *. *! johdettu A. niger -glukoamylaasista, Asn:n korvaaminen • « · ♦ Ala: 11a aminohappopositiossa Asn 182 ei ole ainoa mutaatio.
*:··· 30 Tämän keksinnön muut edut ovat helposti ymmärrettävissä, kun .1. se tulee paremmin selvitetyksi viittaamalla seuraavaan seik- • tt *. kaperäiseen kuvaukseen, jolloin sitä tarkastellaan liitetty- ♦ · · *”·’ jen kuvioiden yhteydessä, joissa: • · • · • · · 35 Kuvio 1 esittää A. niger -glukoamylaasin Alueen 1 (a) , Alueen • t«t .·**. 4 (b) ja Alueen 6 (c) vertailua muihin glukoamylaaseihin, oc- • •m amylaaseihin, isomaltaasiin, maltaasiin ja syklodekstriini-glukaanitransferaaseihin (viite 8) (Glukoamylaasien merkinnät: An: A. niger. Ro: Rhizopus oryzae. Sd: Saccharomyces 7 107807 diastaticus ja Sf: Saccharomycopis fibulicrera; α-amylaasien merkinnät: Ao: Aspergillus orvzae, Pp: Porcine pancreati, Bs: Bacillus subtilis ja Ba: Barley Isozymel; Rl: Kanin suolis-tonsisäinen isomaltaasi; maltaasin merkintä: Se: Saccharomv-5 ces cerevisiae; syklodekstriiniglukaanitransferaasien merkinnät: aB: alkalophilic Bacillus sp. strain 1011 ja Kp: Klebsiella pneumoniae. Varjostetut alueet edustavat sekvens-sivertailuja kuudessa, mutaation läpikäyneessä asemassa GA:ssa; alleviivaukset tarkoittavat identifioituja, toimin-10 nallisesti tärkeitä radikaaleja; * tarkoittaa GA katalyyttisiä ryhmiä);
Kuvio 2 esittää kaaviota, josta A. awamori-alukoamylaasin mutaatiot ilmenevät kohdissa Serll9, Leul77, Trpl78, Asnl82, 15 Glyl83 ja Serl84 ja jossa nukleotidimuutokset on merkitty pienillä kirjaimilla villityypin sekvenssin yläpuolella;
Kuvio 3 esittää plasmidi pGAC9:n (viite 20) kaaviota, jossa restriktiopaikat on merkitty; ja 20
Kuvio 4 esittää tietoja Asnl82-»Ala- ja villityyppiglukoamy-laasien kondensaatioreaktion tutkimuksista. Reaktio-olo- • ·
... suhteet olivat: 30 paino-% glukoosin lähtöpitoisuus 0,1 M
• · » ·
Hl natriumasetaattipuskurissa deuteriumoksidissa pH:n ollessa • · · 25 4,5 ja lämpötilan 35 °C. Asnl82-»Ala:n ja villityyppientsyy- • · · ··· : min pitoisuudet olivat 10 ja vastaavasti 5 mg/ml. Tuotteen • · muodostusnopeus edustaa isomaltoosin ja isomaltotrioosin : summaa seurattuna H NMR-spektrometrisesti (viite 22) 500 MHz:ssä 4,94 ppm:ssä Bruker AM-500-spektrometrillä. Merkki o ·:··: 30 edustaa Asnl82—>Ala- ja + villityyppientsyymiä. Lähtösuhde .***. nopeuksille, joilla muodostuminen a-(1-^6)-sidoksista a- ·*· *. (1—>4)-sidoksiin tapahtuu, on Asnl82—»Ala:lie 22 % villityyp- » ♦ * · *·”* piglukoamylaasin arvosta.
• · • · ·»· ·;· 35 Tämä keksintö esittää uusia entsyymi variantteja ja menetelmää ··*· ;***; entsyymin käyttämiseksi glukoosin valmistamiseksi tärkkelyk- »·« sestä. Yleisesti menetelmä käsittää prekursoritärkkelyksen osittaisen hydrolyysivaiheen a-amylaasin läsnä ollessa ja sen jälkeen D-glukoosin vapauttamisen tärkkelyksen tai vastaavien 8 107807 oligo- tai polysakkaridimolekyylien ei-redusoivista päätteistä edelleen hydrolysoimalla glukoamylaasin läsnäollessa a-(1—>4) — ja a- (1—>6) -glukoosisidoksia lohkaisemalla.
5 Erityisesti prekursoritärkkelyksen osittainen hydrolyysi a-amylaasia käyttäen aiheuttaa tärkkelysmolekyylin alkuhajoa-misen sen sisäisiä a-(l-»4)-sidoksia hydrolysoimalla. Kaupallisissa sovellutuksissa alkuhydrolyysi α-amylaasia käyttämällä suoritetaan lämpötilassa, joka on noin 105 °C. Käsi-10 tellään hyvin korkeaa tärkkelyspitoisuutta, joka edustaa tavallisesti 30-40 % kiintoainetta. Alkuhydrolyysi suoritetaan hyvin huolellisesti viiden minuutin ajan tässä korotetussa lämpötilassa. Osittain hydrolysoitu tärkkelys voidaan sitten siirtää toiseen astiaan ja inkuboida se noin tunnin 15 ajan lämpötilassa 85-90 °C, jolloin saadaan dekstroosiekvi-valentti (D.E.), joka on 10-15.
Vaihe, joka käsittää D-glukoosin vapauttamisen tärkkelyksen tai vastaavien oligo- tai polysakkaridimolekyylien ei-redu- 20 soivista päätteistä edelleen hydrolysoimalla glukoamylaasin läsnä ollessa, suoritetaan tavallisesti erillisessä astiassa ...» alennetussa lämpötilassa 30:n ja 60 °C:n välillä. Substraat- • · ... tinesteen lämpötila lasketaan edullisesti alueeseen 55-60 °C.
*** Liuoksen pH lasketaan alueesta 6-6,5 alueeseen 3 - 5,5.
• · · ]·’/ 25 Liuoksen pH on edullisesti 4 - 4,5. Liuokseen lisätään gluko- • · · ··· · amylaasia ja reaktio suoritetaan 48-72 tunnin ajan.
• · • · · • ·· • · • · · ; Kuten edellä on mainittu, muodostuu kondensaatiotuotteita, jotka sisältävät a-(l->6)-sidottuja isomalto-oligosakkarideja.
·:··; 30 Nikolov et ai., 1988 (viite 9) on seikkaperäisesti selvittä- ·1. nnyt reversion kinetiikan. Tämän reversioreaktion merkitys on ··· ·, siinä, että vaikka glukoamylaasi pystyy hydrolysoimaan kaikki • · · *·”’ tärkkelyksestä löydetyt D-glukoosisidokset, D-glukoosisaantoja • · '···* yli 95 % teoreettisesta ei saavuteta väkevissä tärkkelysdekst- 35 riiniliuoksissa johtuen D-glukoosia koskevista kondensaatio- • · ** • · ♦ • · • · ·· · 9 107807 reaktioista, joita tavallisesti kutsutaan reversioreaktioiksi (viitteet 12 - 16).
Kondensaatioreaktio on bimolekyläärinen reaktio, kun taas hydrolyysireaktioon osallistuu vai yksi molekyyli. Sen 5 takia korkeiden kiintoainepitoisuuksien käyttö, mikä on tavallista teollisissa sovellutuksissa, johtaa merkittävien kondensaatiotuotemäärien muodostamiseen. Joskin tärkkelyksen käsittely alhaisemmissa konsentraatioissa vähentäisi kondensaatiotuotteita, tällainen muutos ei ole 10 kaupallisesti toivottavaa. Tämä johtuu siitä, että joko laimean glukoosituotteen liuoksen kuljetus (sillä on korkea paino suhteessa konsentroituun tuotesiirappiin) tai nesteen haihduttaminen glukoosituotteen väkevöimiseksi on erittäin kallista.
15 Tämän keksinnön mukaan on esitetty parannus, jossa inkuboidaan osittain hydrolysoituja tärkkelys- tai vastaavia oligo- ja polysakkaridimolekyylejä glukoamylaasin tai vastaavien entsyymien läsnäollessa, joilla on ainakin yksi mutaatio, jossa on substituoitu aminohappo, joka on 20 valittu vertailemalla muiden entsyymien rakenteellisesti • « ... vastaaviin alueisiin, jotka entsyymit yksinomaan '** hydrolysoivat vain a-(l—>4) -glukoosisidoksia. Tätä • · ♦ /*/ perustosiasiaa on käytetty entsyymien a-(l—>4)-glukooosi- ·'·♦ * sidosten selektiivisyyden lisäämiseksi. Kuten on selvitetty 25 tekniikan taustaa käsittelevässä osassa, nämä mutaatiot • ·« · johdettiin hakijan sekvenssivertailututkimuksista, jotka koskivat identtisiä A. niqer- ja A. awamori-:*·.: glukoamylaaseja. Kuten yllä on todettu, näissä tutkimuksissa tunnustettiin aminohappoja, jotka olivat . 30 yhteisiä vastaavissa entsyymeissä, jotka eivät pysty ’* hydrolysoimaan a-(l—>6 )-glukoosisidoksia niistä, jotka pystyvät hydrolysoimaan a-(l—>6)-glukoosisidoksia.
• · • · « • » » • ·
Erityisesti tehtiin aminohappojen mutaatiot asemissa, jotka • · 35 vastaavat A. niqer Alueen 1 radikaaleja 109-122, Alue 4:n radikaaleja 172-184 ja Alue 6:n radikaaleja 382-398, jotka 10 107807 oli saatettu läpikäymään mutaatio aminohappoihin, joilla oli homologiset asemat entsyymeissä, jotka selektiivisesti hydrolysoivat ainoastaan a-(l—>4)-glukoosisidoksia. Spesifiset mutaatiot, jotka osoittavat lisääntyvän 5 maltoosihydrolyysi-selektiivisyyden tehdään asemissa 119, 182, 183 ja 184. Hakija osoittaa edelleen merkittävän glukoosisaannon lisäyksen laskettuna yksikköä tärkkelystä kohti, jota on hydrolysoitu mutaatiota Alal82;lla läpikäyneellä glukoamylaasilla verrattuna suhteelliseen 10 saantoon, joka on saatu villityyppi-glukoamylaasilla, jolla on Asnl82.
On todettu, että mutaation läpikäyneellä glukoamylaasilla, jolla on Alal82, on merkittävästi korkeampi maltoosi/isomaltoosi-selektiivisyys (selektiivisyys 15 a-(l—>4)-glukoosisidosten hydrolyysiin verrattuna a-(l—>6)-glukoosisidosten hydrolyysiin), kun taas sillä on vain pieni lasku aktiviteetissa. Lisäksi isomaltoosin muodostuminen 30 % glukoosista oli mutaation läpikäyneellä
Asnl82—>Ala-glukoamylaasilla ainoastaan 20 % villityyppi- 20 amylaasin aiheuttamasta ja mitattuna NMRsllä ilmeni, että
Asnl82—>Ala vähensi alkunopeuden 80 %:lla verrattuna ... villityyppientsyymiin. 33-1/3 tunnin inkuboinnin jälkeen • · saadun isomaltoosisisällön mutaation läpikäyneen entsyymin • * * *·* ‘ läsnäollessa arvioitiin olevan noin kolmasosa siitä, mikä • « ' • · · ·’·· ‘ 25 oli saatu ekvivalenttisen määrän villityyppientsyymin V*: läsnäollessa. Edelleen saadaan tilastollisesti merkittävä »·· V : glukoosisaannon lisäys mutaation läpikäyneen Asnl82—>Ala- glukoamylaasin avulla verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin. Hakija on todennut noin 1 %:n • · 30 glukoosisaannon lisäyksen (1 % jäljellä olevasta 5 %:n .* . saantopotentiaalista, eli 95 %:sta 96 %:in). Hakija on • · · ** * luonut entsyymin, joka lisää glukoosisaannon vähintään 20 %:lla jäljellä olevasta mahdollisesta saannosta. Tämä on :*:*.· aikaansaatu glukoamylaasimutaatiolla, jolla on korotettu :*·.! 35 spesifisyys a-(l—>4)-glukoosisidoksiin erityisesti verrattuna a-(l—>6)-glukoosisidoksiin samalla kun se säilyttää vähintään 75 % entsyymiaktiviteetista perustuen 11 107807 disakkaridimaltoosihydrolyysiin.
Mutaation läpikäynyttä glukoamylaasia voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä yhdistettynä entsyymiin, joka hydrolysoi ainoastaan a-(l—>6)-glukoosisidoksia 5 molekyyleissä, joilla on vähintään neljä glukosyyli-radikaalia. Erityisesti mutaation läpikäynyttä glukoamylaasia voidaan käyttää yhdistettynä pullulanaasiin tai isoamylaasiin. Isoamylaasin ja pullulanaasin käyttö haarojen poistoon, entsyymien molekyyliominaisuudet ja 10 entsyymien potentiaalinen käyttö glukoamylaasin kanssa on kuvattu kirjassa G.M.A. van Beynum et ai., Starch Conversion Technology Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142.
Kuvio 1 esittää Alueiden 1, 4 ja 6 vertailua A. niqer-15 glukoamylaasilla, jolla on rakenteellisia samankaltaisuuksia muiden glukoamylaasien, a-amylaasien, isomaltaasin, maltaasin ja CGTaasin kanssa. Kuten yllä on todettu, tämä kartta hahmottaa perustelut substituointi-strategialle, jota on harjoitettu tämän keksinnön mukaisten 20 uusien entsyymien aikaansaamiseksi.
• « • · · • · « · YY. Kuvio 2 esittää kuvaa A. awamori-qlukoamvlaasin • · · / , mutaatioista kohdissa Serll9, Leul77, Trpl78, Asnl82, 4 » » j Glyl83 ja Serl84. Nukleotidimuutokset on merkitty pienillä *. *: kirjaimilla villityyppisekvenssin yläpuolella. Mutaatiot • «· : 25 asemissa 119, 182, 183 ja 184 ovat tämän keksinnön kohteena.
• 4 • · · • « · • 4
Mutanttigeenien valmistus, villityyppigeenien lähde ja • .* . eristys ja kloonausmenetelmät on kuvattu seikkaperäisesti • · « *· *; julkaisussa Sierks et ai., 1989 (viite 10).
30 Entsyymireagenssit, mutaatioiden rakentaminen käyttämällä :V: kasettimutagenisointia suoritettiin kuten on kuvattu julkaisussa Sierks et ai., 1989 (viite 10). Asnl82—>Ala- « · mutaatio rakennettiin Hpal-Apal-kasettiin käyttämällä nukleotidejä 12 107807 5 ' -ATGGGCCCGGTGTTGCACATTCGTAAG-3 ' ja 5'-GCTGGCTCGTCTTTCTTTACGATTGCTGT-3' ka s ettina j a mutageenisina pöhjustusaineina vastaavasti, sisältäen 15 emäsparin päällekkäisyyttä. Seuraavia oligonukleotidejä 5 käytettiin 119, 183 ja 184-mutanttien rakentamiseksi.
Ser—>Tyrll9 CGG CCG CCC CCA GTA ACC AGT GTA G
Gly—>Lysl83 CGT AAA GAA AGA GCT CTT GTT AAC TTC TTC
Ser—>Hisl84 CGT AAA GAA AGA GTG GCC ATT AAC TTC TTC CCA
Mutantit rakennettiin kuten kuvattiin yllä.
10 Mutaation läpikäyneen entsyymin tuotanto, puhdistus ja kineettinen karakterisointi tehtiin julkaisun Sierks et ai., 1989 (viitteet 10, 11) mukaan.
Plasmidin identifiointi ja menetelmä, jolla ympätään geeni plasmidiin on kuvattu seikkaperäisesti julkaisussa Sierks 15 et ai., 1989 (viite 10). Referenssi kuvaa plasmidin puhdistusta, subkloonausta, sekvensointia ja kasettimutagenisointia. Kuviossa 3 on esitetty kuva plasmidista restriktiopaikkoineen. Referenssi kuvaa • · edelleen geeniekspression ja glukoamylaasientsyymin • · III 20 valmistusta ja puhdistusta.
• » » • « · • 1 ♦ · » *♦· | Kuvio 3 osoittaa erityisesti plasmidin pGAC9 .
« « « ’· '1 Glukoamylaasigeeniä sisältävä plasmidi ympättynä V : hiivakantaan S. cerevisiae C468 talletettiin American Type
Culture Collection:ilia ja identifioitiin numerolla ATCC
25 20690 Cetus Corporationin toimesta 17. marraskuuta 1983.
Tämän plasmidin kasvuun ja ekspressioon hiivassa viitataan / . seuraavassa julkaisussa: Innis, M.A. et ai., (1985) • «· * I Expression, glycosylation and secretion of an Aspergillus glucoamylase by Saccharomyces cerevisiae. Science 228: 21 -30 26.
• · · • · · • · · • ·
Menetelmä, jolla poistetaan plasmidit hiivoista E.coli-replikaatioon, jonka totesimme toimivan pGAC9:lle, on 13 107807 esitetty seuraavassa julkaisussa: Hoffman, C.S. ja F. Winston (1987). Kymmenen minuutin ajan kestävä DNA-preparointi hiivasta vapauttaa tehokkaasti itsenäisiä plasmideja Escherichia coli-transformaatioon. Gene 57: 267-5 272. Sekvenssi pBR322 sallii plasmidin itsenäisen replikaation E. coli:ssa ja sisältää ampisilliinigeenin. Enol promoottori ja terminaattori ovat kaksi enolaasigeenin aluetta, jotka sallivat glukoamylaasigeenin ekspression hiivassa. Leu2 sekvenssi sallii hiivatransformanttien 10 valinnan leusiinivajanaisista ympäristöstä. Hiiva 2μ sekvenssi sallii plasmidin itsenäisen replikaation hiivassa. Pstl, EcoRI, Hindlll, BamHI ja Sali ovat restriktio-endonukleaasin paikkoja.
Menetelmä, jolla tuotetaan glukoamylaasia A. niqer:ista ja 15 A. awamori:sta on kuvattu julkaisussa Pazur et ai. (viite 18). Pazur-julkaisu kuvaa seikkaperäisesti glukoamylaasi-entsyymin tuotannon ja eristämisen, joka on edelleen kehitetty Clarke ja Svenssonin toimesta (viite 19) käyttämällä affiniteettikromatografiaa akarboosi-20 Sepharose:11a.
• · · » • ·
Glukoamylaasi on kaupallisesti saatavissa Novo Nordisk • · A/S:ltä, Bagsvaerd, Tanska; Cultor 0Y:ltä, Helsinki, Suomi; « · * .* . ja Gist-Brocades:ilta, Delft, Alankomaat. Pullulanaasi on • · · *;* ‘ saatavissa Novo Nordisk A/S:ltä. Isoamylaasi on saatavissa • · » 25 Sigma Chemical Corp.:lta, St. Louis, MO, U.S.A.
• · · • · ·
Seuraava kokeellinen aineisto antaa esimerkkejä mutaatioita « · :.'*i läpikäyneen glukoamylaasin selektiivisyydestä ja : aktiviteetista tämän keksinnön menetelmän mukaisesti, jolla / . tuotetaan glukoosia entsymaattisesti tärkkelyksestä.
« · · • · » • · 30 Esimerkki 1 • · • · · • · • · • · !'·· Mutaation läpikäyneiden glukoamylaasien kineettisten parametrien vertailu käyttäen maltoosia, isomaltoosia ja maltoheptaoosia substraatteina.
>07807 14
Tehtiin vertaileva tutkimus Saccharomvces cerevisiae:ssa ekspressoiduilla kuudella mutanttiglukoamylaasilla. Vertailut kuuden mutaatioita läpikäyneen glukoamylaasin kineettisten parametrien kesken tehtiin käyttämällä 5 maltoosia, isomaltoosia ja maltoheptaoosia substraatteina, ja niitä verrattiin villityyppi-glukoamylaasin vastaaviin arvoihin. Villityyppiglukoamylaasi tarkoittaa mutaatiota läpikäymätöntä glukoamylaasia ekspressoituna Saccharomvces cerevisiae:ssa. Koe suoritettiin sen takia, että entsyymien 10 selektiivisyys a-(l—>4)-sidosten (maltoosin) hydrolyysiin tulisi vertailtua a-(l—>6)-sidosten (isomaltoosin) hydrolyysiin.
Aineet ja menetelmät
Entsyymit, reagenssit ja mutaatioiden rakentaminen 15 kasettimutagenisointia käyttäen tehtiin kuten yllä on kuvattu (viite 10). Leul77—>His- ja Trp—>178 Arg-mutaatiot rakennettiin SnaBI-Hpal-kasetissa kuten aikaisemmin on kuvattu (viite 11) nukleotideilla 5'-ATAGTTAACTTCTTCCC AGTGATCATATCCTGTCTG-3' ja vastaavasti ...: 20 5 ' -ATAGTTAACTTCTTCGCGG-AGATCATATCCTGTCTG-3 ' . Asnl82—>Ala- • 4 .···, mutaatio rakennettiin Hpal-Apal-kasetissa käyttämällä 4 1 nukleotidejä !2.' 5 ' -ATGGGCCCGGTGTTGCACAGCAAT-CGTAAAG-3 ' ja vastaavasti : 5' -GCTGGCTCGTCTTTCTTTACGATTGCTCT-3' kasettina ja
• t I
25 mutageenisinä pöhjustusaineina, sisältäen 15 emäsparin *»1 ' päällekkäisyyttä (viite 21). Seuraavia oligonukleotidejä käytettiin 119-, 183- ja 184-mutanttien rakentamiseksi.
« 1 • ·» * ♦
Ser—>Tyrll9 CGG CCG CCC CCA GTA ACC AGT GTA G
.·! : Gly—>Lysl83 CGT AAA GAA AGA GCT CTT GTT AAC TTC TTC
• ' 1/. 30 Ser—>Hisl84 CGT AAA GAA AGA GTG GCC ATT AAC TTC TTC CCA
• · ·
Mutantit rakennettiin kuten kuvattiin yllä.
2 • · • · · • · · m ·
Mutaation läpikäyneiden entsyymien tuotanto, puhdistus ja kineettinen karakterisointi suoritettiin kuten oli kuvattu 15 107807 julkaisussa Sierks et ai., 1989 (viite 10). Tulokset Taulukossa V oli saatu 119-, 183- ja 184-mutanteillä, joissa glukoamylaasiaktiviteetti määritettiin yllä kuvatulla tavalla paitsi 45°C:ssa.
5 Tulokset ja niiden arviointi
Kuusi mutaatiota, Serll9—>Tyr, Leul77—>His, Trpl78—>Arg ja Asnl82—>Ala, Glyl83—>Lys ja Serl84—>His rakennettiin kloonattuun A. awamori-alukoamvlaasiqeeniin kasetti-mutagenisoinnilla ja ekspressoitiin S. cerevisiae:ssa.
10 Taulukossa I ja V on esitetty tuloksia kineettisistä tutkimuksista kuudella mutaatiolla käyttäen maltoosia, maltoheptaoosia ja isomaltoosia substraatteina. Tulokset yllä tuottivat selektiivisyyttä mutanteille asemissa 119, 183 ja 184, jotka on kuvattu Taulukossa VI.
15 Leul77—>His-mutaation kcat-arvot laskivat myös kaikille kolmelle substraatille verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin, isomaltoosin osalta enemmän kuin ...j kymmenkertaisesti ja maltoosin ja maltoheptaoosin osalta .···. viisinkertaisesti. KM-arvot kasvoivat vähemmän kuin 50 % -20 maltoheptaoosin ja isomaltoosin osalta mutta kolmin-.* . kertaisesti maltoosin osalta. Isomaltoosihydrolyysin 4 I · *** * selektiivisyys maltoosihydrolyysiin verrattuna oli taas • · · ’· suhteellisen muuttumaton verrattuna siihen, mitä se oli « ·* ’ villityyppientsyymin kohdalla, kun taas maltoheptaoosi- 25 hydrolyysi verrattuna maltoosihydrolyysiin oli • » s/·· kaksinkertainen. Vaikka alifaattisen ja hydrofobisen
Leul77jn korvaaminen aromaattisella ja hydrofiilisella .·! ; His:llä tuskin vaikutti maltoosin selektiivisyyteen • · * verrattuna isomaltaasin selektiivisyyteen, sekvenssi- • « 30 samanlaisuudet viittavat siihen, että hydrofobisen • · V,: aromaattisen renkaan, joka on löydetty tässä asemassa J^·.; kaikkien α-amylaasien kohdalla paitsi Taka-amylaasi A:ssa, pitäisi lisätä sitä.
16 107807
Trpl78—>Arg-xnutaation Kcat-arvot laskivat 5 - 8 -kertaisesti näille kolmelle substraatille verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin. KM-arvot laskivat lievästi maltoosille ja nousivat lievästi maltoheptaoosille 5 verrattuna villityyppi-entsyymiin. Isomaltaasin KM-arvo nousi kuitenkin enemmän kuin kaksinkertaiseksi, mikä johti maltoosin selektivisyyden kaksinkertaistamiseen isomaltaasi-hydrolyysiin verrattuna. Selektiivisyys maltoheptaoosiin verrattuna maltoosipilkkomiseen oli 10 muuttumaton.
Asnl82—>Ala-mutaation kcat-arvot laskivat lievästi jokaiselle näille kolmelle substraatille verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin, mutta ei läheskään siinä määrin kuin muiden mutaatioiden kohdalla. Maltoosin KM-arvo 15 laski lievästi, maltoheptaoosin arvo nousi lievästi ja isomaltoosin arvo kaksinkertaistui. Nämä sidosmuutokset heijastuivat maltoosiselektiivisyyden enemmän kuin kaksinkertaiseen nousuun isomaltoosipilkkomiseen nähden verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin sekä 20 maltoheptaoosiselektiivisyyden merkittävään laskuun :**: verrattuna maltoosihydrolyysiin.
/* * « · *·» .*·’· Trpl78—>Arg- ja Asnl82—>Ala-mutaatiot johtivat toivottuun 0 ί maltoosiselektiivisyyden nousuun verrattuna ; isomaltoosihydrolyysiin, joskin edelliseen liittyi paljon ·;** 25 suurempi kcat-arvojen pudotus näille kolmelle substraateille i » * kuin jälkimmäisen osalta. Nämä kaksi mutaatiota . . pohjautuivat substituutioihin, joiden tarkoitus oli tehdä • · · *'e/ glukoamylaasin aktiivinen paikka enemmän samankaltaiseksi • · · * kuin aktiivinen paikka sellaisilla amylaaseilla, joilla ei 30 ole kykyä hydrolysoida a-(l—>6) -D-glukoosisidoksia. Koska • « ...·· nämä kaksi mutaatiota vaikuttivat eri tavoin maltoosin ja /. isomaltoosin sidokseen, kun taas k__fc-arvot pienenivät • * * '-'öu *·**’ määrällisesti samassa suhteessa kaikille kolmelle 4 · * ^ substraatille Trpl78 ja Asnl82 vaikuttavat alipaikkaan 2 35 sellaisella tavalla, että ne vaikuttavat toisiinsa vahvemmin maltoosin kuin isomaltoosin kohdalla.
17 107807
Seri19—>Tyr-mutantin kineettiset parametrit osoittivat ' hieman korkeamman kcat-arvon ja alemman KH-arvon maltoosille ja hieman korkeamman kcat-arvon ja kaksinkertaisen Κ,,,-arvon isomaltoosille. Tämä johti maltoosin osalta enemmän kuin 5 kaksinkertaisesti korotettuun spesifisyyteen verrattuna isomaltoosiin. Glyl83—>Lys-mutantti osoitti lievästi korotetun kcat-arvon ja pienennetyn KM-arvon maltoosilla ja korotetut kcat- ja KM-arvot isomaltoosille, mikä johti selektiivisyyden lievään nousuun. Lopuksi Serl84—>His-10 mutantti myös nosti kcat- ja vähensi KH-arvon maltoosille, mutta vaikutti vain vähän isomaltoosin kineettisiin parametreihin. Tämä aiheutti tälle mutantille suhteellisen spesifisyyden nousun, joka oli juuri alle kaksinkertainen.
Yllä kuvatut tulokset osoittavat, että kaikki sekvenssi-15 homologiaan perustuvat mutaatiot (asemat 119, 178, 182, 183 ja 184) a-(l—>4)-entsyymeillä johtivat korotettuun maltoosihydrolyysiselektiivisyyteen, ja kaikilla mutaatioilla asema 178:n mutaatiota lukuunottamatta oli ainoastaan lievästi alennettu joskaan ei parempaa 20 aktiviteettiä. On hyvät perustelut sille, että mutaatiot * » ... näissä kahdessa alueessa yhtä hyvin kuin kolmannessa « · *** samankaltaisuus-alueessa (Alue 6) aikaansaavat myös . I · ***/ selektiivisyyden lisääntymistä. Tämä todistaa myös, että • · » ·«· · hakijan valitsemat aminohapot eivät välttämättä ole ainoat « » *· *t 25 eivätkä parhaat valinnat tietyssä paikassa, koska «·· V · lukuisissa tapauksissa useampi kuin yksi aminohappo olisi voinut tulla poimituksi. Tämä antaa tärkeät perustelut 2*\j päätellä, että mikä tahansa mutaatio näissä kolmessa »’Vt alueessa ja mikä tahansa aminohappo yhdessä näistä .* . 30 paikoista kuuluu tämän keksinnön suojapiiriin.
• » · « * *
Mutaatiot osoittavat, että on mahdollista ennustaa « * : toiminnallisia muutoksia entsyymiaktiviteetissa kokonaan ·’·.· homologian perusteella entsyymeillä, joilla ei ole • * tunnettua kolmiulotteista rakennetta, mutta joilla on 35 toiminnallisia eroja, joita voidaan korreloida tunnettuihin 18 107807 toiminnallisiin radikaaleihin.
Esimerkki 2
Kondensaatiotutkimuksia Asnl82—>Ala- ja villityyppi-glukoamylaaseille 5 Korkeilla glukoosipitoisuuksilla glukoamylaasit katalysoivat kondensaatioreaktioita ja isomaltoosi on merkittävin akkumuloitu tuote. Seuraava koe vertailee Asnl82—>Ala- ja villityyppi-glukoamylaasin kondensaatioreaktioiden katalysointia.
10 Inkuboitiin 30 paino-% lähtöglukoosipitoisuus 0.1 M
natriumasetaattipuskurissa deuteriumoksidissa pH:ssa 4.5 lämpötilassa 35°C. Asnl82—>Ala- ja villityyppientsyymin pitoisuudet olivat 10 ja vastaavasti 5 mg/ml. Tuotemuodostuksen nopeus edustaa isomaltoosin ja 15 isomaltotrioosin summaa määritettynä *H NMR- spektrometrisesti 500 MHz:11a mitattuna 4.94 ppm:lla Bruker AM 500 spektrometrillä.
« • · · · • · .·**. Kuviossa 4 o edustaa Asnl82—>Ala- ja + villityyppi-« « · entsyymiä. Korjattuna entsyymipitoisuuksien eroja 20 huomioiden, lähtösuhde nopeuksille, millä muodostuminen a- i- · · (1—>6):sidoksista a-(l—>4):sidoksiin tapahtuu, on Asnl82- • « · *..* ->Ala-mutantille 22 % villityyppiglukoamylaasin arvosta « » · *·* käyräsovituksella määritettynä (viite 22).
• * *.'·: Tiedot osoittavat, että isomaltoosimuodostumisen alkunopeus • « « V · 25 Asnl82—>Ala-mutantilla katalysoituna laski * : viisinkertaisesti verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin, • · kuten näkyy kuviosta 4. Tämä johtuu isomaltoosin • · • välimuotokompleksin spesifisestä destabiloitumisesta. Tämä • · · koe esittää vaikutusmekanismia, millä mutanttientsyymi • » ·.*·· 30 saattaa nostaa konsentroidusta tärkkelysliuoksesta saadun glukoosisaannon yli 95 %, joka tavallisesti saavutetaan.
19 107807
Kuudenkymmenen tunnin inkubaatioajän jälkeen villityyppi-glukoamylaasin tuottama isomaltoosin ja isomaltotrioosin kokonaispituus lähestyi tasapäinoarvoansa (noin 0.14 M), kun taas kaksinkertaisen Asnl82—>Ala-mutanttimäärän 5 tuottama kokonaispitoisuus oli vähemmän kuin 0.1 M.
Esimerkki 3
Asnl82—>Ala mutaation läpikäyneen entsyymin ja mutaation läpikäymättömän entsyymin vertaileva tutkimus glukoosisaantoa silmälläpitäen 10 Seuraavat kokeet vertailevat glukoosisaannon (glukoosipitoisuus, g/L) seuraavilla entsyymeillä: luonnollinen glukoamylaasi Aspergillus niqer:ista sekä haaroja lohkaisevilla entsyymeillä että ilman sellaisia; villityyppiglukoamylaasi Saccharomvces cerevisiaersta sekä 15 haaroja lohkaisevilla entsyymeillä että ilman sellaisia; ja Asnl82—>Ala-glukoamylaasi Saccharomvces cerevisiae:sta sekä haaroja lohkaisevilla entsyymeillä että ilman sellaisia. Kuten on todettu yllä, niitä kahta haaroja ;··· lohkaisevaa entsyymiä, joita käytettiin, pullulanaasia ja .*··. 20 isoamylaasia, on jo rajoitetussa määrin käytetty tähän tarkoitukseen. -Mikään haaroja lohkaiseva entsyymi ei pysty • · · .* . hydrolysoimaan a-(l—>6)-sidoksia substraateilla, joilla on I vähemmän kuin noin neljä glukosyyliradikaalia. Entsyymit • · » eivät siten pysty hydrolysoimaan isomaltoosia, jolla on • · · *·* ’ 25 ainoastaan kaksi glukoosiradikaalia.
• · ·*.’·: Glukoosin ja isomaltaasin välinen tasapaino säilyy • · · · muuttumattomana. Tämä tapahtuu käytetystä entsyymistä .·. : riippumatta. Koska tasapaino määräytyy yksinomaan reaktion • »· termodynamiikan perusteella, muutos suhteellisessa 30 nopeudessa, millä kaksi glukoosimolekyylia muodostuu • · isomaltoosin hydrolyysista tulee täsmäämään samaan • · suhteelliseen muutokseen nopeudessa, millä isomaltoosi muodostuu kahden glukoosimolekyylin kondensaation seurauksena. Tämä on riippuvainen systeemin mikros- 20 107807 kooppisesta palautuvuudesta.
Materiaalit ja menetelmät
Saccharomvces cerevisisae-hiivakantaa, jolla oli glukoamylaasia Aspergillus awamori:sta, jolloin 5 glukoamylaasi oli joko läpikäynyt mutaation (Aspl82—>Ala) tai ei ollut läpikäynyt mitään mutaatiota (kutsuttu villityypiksi), viljeltiin 30°CiSsa 72 tunnin ajan kymmenen litran erissä 19 litran Lab-Line Bioengineering fermentorissa Iowa State University Facility:ssä.
10 Elatusaine sisälsi alussa 2 % glukoosia, 1.7 g/L
hiivatyppiemästä, 5 g/L ammoniumsulfaattia, 100 mg/L L- histidiiniä mutta ei yhtään leusiiniä. Koska plasmidi, joka kantoi glukoamylaasigeenin, koodasi L-leusiinin tuotantoa kun taas emohiivakanta ei tehnyt sitä, jätettiin L-leusiini 15 pois elatusaineesta. Elatusaine pidettiin pH:ssa 4.5 lisäämällä ammoniumhydroksidia. Lisättiin ilmaa elatusaineeseen niin, että happi pysyi 80 %:n kyllästysasteessa. Glukoosia lisättiin ajankohtina 27, 52, ja 60 h jotta sen pitoisuus palautuisi 2 %:in tai sitä ;··· 20 lisättiin vain kerran ajankohtana 48 h, tässäkin .···. tapauksessa 2 %:in, jotta glukoosipitoisuuden vaikutusta • · · glukoamylaasisaantoon voitaisiin tutkia.
• · « • 1 • 1 · • · · | Viljelyliemi suodatettiin ultrasuodatusmembraanilla ja • ·« *,.1 otettiin talteen kirkas supernatantti, joka sisälsi • · · *·1 ‘ 25 viilityyppiglukoamylaasin tai mutaation läpikäyneen glukoamylaasin. Talteenotetut supernatantit konsentroitiin # · ultrasuodatuksella 100 mL:aan, lyofilisoitiin, liuotettiin • · » : uudestaan, dialysoitiin ja syötettiin DEAE-Fractogel- .·. : pylvääseen, joka eluoitiin joko portaattomasti laskevalla 30 pH:11a tai portaattomasti nousevalla natriumkloridilla.
• ·
Fraktiot, jotka sisälsivät glukoamylaasiaktiviteettia, • · laskettiin pylvääseen sisältäen Sepharose-kytkettyä akarboosia, pseudo-tetrasakkaridi, joka spesifisesti inhiboi glukoamylaasia. Glukoamylaasi-akarboosi-kompleksi 35 hajotettiin 1.7 M Tris-eluentilla (viite 19).
21 107807
Puhdistetut glukoamylaasinäytteet, jotka olivat lähtöisin kolmesta tyypistä, viljeltiin DE15-dekstriinissä pH:ssa 4.5 ja 35°C:ssa 120 tunnin ajan. Kolme tyyppiä olivat 1) A. awamori-glukoamvlaasi, joka oli saatu Miles 5 Laboratories:lta, Elkhart, IN, USA, jolla oli glukoamylaasi I-muoto (sama kuin se, joka oli tuotu S. cereviviae:en ympätyllä glukoamylaasigeenillä), eristettynä pylväskromatografisesti ja käytännöllisesti katsoen puhdistettu homogeenisuuteen, 2) villityyppi-glukoamylaasi, 10 joka oli tuotettu hiivafermentaatiolla ja 3) mutaation läpikäynyt glukoamylaasi (Aspl82—>Ala), joka oli tuotettu samalla tavoin. Jokainen näistä kolmesta glukoamylaasi-tyypistä inkuboitiin kolmella eri tavalla: joko yksin pitoisuudessa 4.5 IU/mL, pitoisuudessa 4.5 IU/mL 4.5 15 IU/mL:11a pullulanaasia ja pitoisuudessa 4.5 IU/mL 4.5 IU/mL:11a isoamylaasia. Kaikki entsyymiaktiviteetit mitattiin kansanvälisissä yksiköissä (IU) isoamylaasia lukuunottamatta, jonka kohdalla yksikkö oli määriteltynä valoabsorbanssin lisäämisellä 0.1:llä 60 nM:ssä 10 mm:n 20 kyvetissä tunnin kestävän riisitärkkelyksen hydrolyysin :**: jälkeen ja käyttämällä redusoivan sokerin määritystä.
.·*·. Kaikissa yhdeksässä kokeessa mitattiin glukoosipitoisuus spektrofotometrisesti glukoosioksidaasi-hapetuksen jälkeen.
• · · • · « · · • · · *Γ* ! Tulokset • » » • · · • · • · · • · · *·* 25 Parhaat tulokset saatiin kun glukoosipitoisuuden annettiin laskea nollaan ajankohdan 20 h läheisyydessä ja kun se pysyi siinä ajankohtaan 48 h asti. Ajankohdassa 48 h • * · : glukoosia lisättiin, jotta pitoisuus palautuisi takaisin 2 : %:in. Glukoosipuutteen aikana hiiva luultavasti kasvoi • · · 30 hiivatyppiemäksessä olevilla orgaanisilla aineilla, koska • · ei havaittu mitään kasvunopeuden laskua. Glukoamylaasi- • * tuotanto käynnistyi kun glukoosipitoisuus saavutti nollan.
♦ · • · · • · · • «
Tavallisesti puhdistetaan glukoamylaasi laskemalla se DEAE-Fractogel-pylvään läpi laskevalla lineaarisella pH- 22 107807 gradientilla 6 - 3. Mutaation läpikäynyt entsyymi ei kuitenkaan adsorboitunut hyvin näissä olosuhteissa, koska suuri osa poistui huokostilavuuteen. Sen takia se puhdistettiin pH:ssa 6 käyttämällä lineaarista 5 suolagradienttia 0.0:sta 0.4:än M natriumkloridia. Saatiin ainoastaan yksi glukoamylaasipiikki tällä pylväällä ja pylväällä, joka oli pakattu Sepharoseien kytketyllä akarboosilla, jossa akarboosi on potentiaalinen glukoamylaasi-inhibiittori.
10 Taulukkojen II-IV mukaan glukoosisaannot olivat korkeimmillaan kun dekstriini hydrolysoitiin 35°C:ssa ja pH:ssa 4.5 ja kun glukoosimylaasi oli sekoitettuna joko pullulanaasiin tai isoamylaasiin, joka nopeasti lohkaisi substraattimolekyylien a-(l—>6)-sidokset, jolloin se antoi 15 glukoamylaasille mahdollisuuden hydrolysoida jäljellä olevat a-(l—>4)-sidokset nopeammin. Tämä käyttäytyminen on havaittu muiden toimesta ja seoksia käytetään tosiaan usein kaupallisesti. Mutaation läpikäynyt glukoamylaasi antoi hieman korkeamman saannon kuin luonnollinen A. awamori- 20 glukoamylaasi tai hiiva-villityyppiglukoamylaasi, ja erot olivat tilastollisesti merkittäviä. Glukoosi-pitoisuuksien .··*. huiput saavutettiin lähellä ajankohtaa 60 h samalla tavoin .*··. kuin glukoosin teollisessa valmistuksessa glukoamylaasilla> • * · joka kuitenkin tapahtuu 60°C:ssa mieluummin kuin 35°C:ssa.
• · · • · · · • · • * · 25 Taulukoiden II, III, ja IV vertailussa on merkityksellistä, että glukoamylaasi Asnl82—>Ala-mutantti yksin (ilman haaroja lohkaisevaa entsyymiä) aiheutti glukoosituotannossa • · :.*·· merkittävän nousun verrattuna luonnolliseen tai V · villityyppi-glukoamylaasiin, joka nousu oli 1 % yhdessä » .·. : 30 setissä reaktio-oloja. Käyttämällä tämän keksinnön mukaista | menetelmää saadaan siis merkittävä glukoosisaannon nousu . yksikköä hydrolysoitua tärkkelystä kohti suhteessa saantoon, joka saadaan inkuboimalla tärkkelystä ja/tai vastaavia oligo- ja polysakkaridimolekyylejä mutaatiota 35 läpikäymättömän glukoamylaasin kanssa, jolla on Asn aminohappoasemassa 182.
23 107807
Yllä annetut tiedot osoittavat, että glukoamylaasi-entsyymi, jolla on Asnl82—>Ala-mutaatio, johtaa entsyymiselektiivisyyden nousuun a-(l—>4)-sidosten suhteen verrattuna a-(l—>6)-sidoksiin samoin kuin 5 glukoosituotannon 1 %:n nousuun. Jopa marginaaliset parannukset, jotka glukoosisaannossa ylittävät 95 %:n ovat, kaupallisesti merkittäviä.
Hakija on osoittanut, että pullulanaasin tai isoamylaasin lisäys glukoamylaasiin aina johtaa nopeammin maksimaalisen 10 glukoosisaannon saavuttamiseen. Pullulanaasin lisäys antaa hieman korkeamman maksimisaannon kuin glukoamylaasi yksin, todennäköisesti siitä syystä, että haaroja lohkaisevat entsyymit nopeasti lohkaisevat a-(l—>6)-sidokset, jotka estävät glukoamylaasia hydrolysoimasta a-(l—>4)-sidoksia. 15 Isoamylaasin lisäys oli vähemmän tehokas glukoosin maksimisaannon nostamisessa, ja molemmat tulokset tukevat muiden tekemiä havaintoja tällä alalla.
Asnl82—>Ala-mutanttiglukoamylaasi antoi hieman korkeampia :··· maksimisaantoja kuin luonnollinen tai villityyppientsyymit, .·*·. 20 jolloin luonnollinen entsyymi ja villi tyyppi-entsyymi • · · luultavasti olivat identtisiä keskenään villityyppi- • * · entsyymissä olevaa, S. cerevisiaern (viite 20) lisäämää • · · *!’! lisä-glykosylaatiota lukuunottamatta. Mutanttientsyymi pullulanaasin tai isoamylaasin kanssa antoi korkeamman *·* * 25 saannon kuin luonnon entsyymi tai villityyppi-entsyymi yhdistettynä pullulanaasiin tai isoamylaasiin.
• · · « · • · · : Yhteenvetona voidaan todeta, että tämän keksinnön .·, : menetelmän mukaisesti käytettyinä yllä mainitut • « · * mutanttiglukoamylaasientsyymit antavat korkeamman 30 glukoosisaannon hydrolysoitua tärkkelysyksikköä kohti *.·.* verrattuna saantoon, joka on saatavissa inkuboimalla • » tärkkelystä ja/tai vastaavia oligo- tai polysakkaridimolekyylejä mutaation läpikäymättömän glukoamylaasin läsnäollessa, joten tämä edustaa 24 107807 kaupallisesti arvokasta keksinnöllistä menetelmää.
Lisäksi koeaineisto osoittaa, että entsyymien perusrakenteen vertailu ja informaation käyttö toiminnallisiin radikaaleihin voi johtaa siihen, että 5 pystytään ennustamaan muutettu muoto, joka on seurauksena aminohappokorvauksesta.
• · · 1 • · • · ··· • « · • · « • · · * · • « · • ♦ ♦ ··# · « · · • ♦· • · • · · • · · • · » • · • · » • «i « « • · · • · « • · » • · • ♦ · • ·· • · • · • ♦ • · · • · · m « • ♦ « · · • · · « · 25 107807
Referenssilista 1. Tanaka, Y. et al, (1986) Comparison of amino acid sequences of a glucoamylase from Aspergillus saitoi with 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4)-ethyl carbodiimide. J.
5 Biochem., 91, 125 - 133.
2. Itoh, T., et al., (1987) Nucleotide sequence of the glucoamylase gene GLU1 in yeast Saccaromvcopsis fibuligera.
J. Bacteriol., 169, 4171 - 4176.
3. Hiromi, K., (1970) Interpretation of dependency of rate 10 parameters on the degree of polymerisation of substrate in enzyme-catalyzed reactions. Evaluation of subsite affinities of exo-enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun., 40, 1-6.
4. Savel'ev, A.N. et al., (1982) Carboxyl groups in active 15 site of glucoamylase from Aspergillus awamori. Biochemistry (USSR), 47, 1365 - 1367.
·”·* 5. Tanaka, A. et al., (1983) Fraktionation of isoenzymes :***: and determination of the subsite structure of glucoamylase • · · ·*·’: from Rhizopus niveus. Agr. Biol. Chem., 47, 573 - 580.
• · · • « « ,·. : 20 6. Koyama, T. , et al., (1984) Subsite affinity of the • · · #···* glucoamylase from Aspergillus saitoi. Chem. Pharm. Bull.
32, 757 -761.
• « *· *: 7. Meagher, M.M. , (1989) Subsite mapping of Aspergillus • · · ’.* * niqer glucoamylases I and II with malto- and 25 isomaltooligosaccarides. Biotechnol. Bioeng., 34, 681 - .1..: 688.
• · • · • · · *·*·* 8. Svensson, B. , (1988) Regional Distant Sequence Homology • ·
Between Amylases, α-glucosidases and transglucanosilases. FEBS Lett., vol. 230, p. 72 - 76.
26 107807 9. Nikolov, Z.L., et al., (1989) Kinetics, equilibria and modeling of the formation of oligosaccarides from D-glucose with Aspergillus nicer glucoamylases I and II. Biotechnol. Bioeng., 34, 694 - 704.
5 10. Sierks, M.R. et al., (1989) Site-directed mutagenesis at the active site Trpl20 of Aspergillus awamori glucoamylase. Protein Eng., 2, 621 - 625.
11. Sierks, M.R et al., (1990) Determination of Aspergillus awamori.glucoamylase catalytic mechanism by site-directed 10 mutagenesis at active site Aspl76, Glul79 and Glul80. Protein Eng., lähetetty julkaistavaksi.
12. Pazur, J.H. et al., (1967) Carbohydr. Res., 4, 371.
13. Watanabe, T. et al., (1969) Starke, 21, 18.
14. Watanabe, T. et al., (1969) Starke, 21, 44.
15 15. Hehre, E.J. et al., (1969) Arch. Biochem. Biophys., ;··; 135, 75.
• « · • · - 16. Pazur, J.H. et al., (1977) Carbohydr. Res.,58, 193.
« « I
• · « · · • · · *Γ] I 17. Svensson, B. et al. , (1983) The complete amino acid
* M
20 sequence of the glycoprotein, glucoamylase Gl, from « · ♦ *·* ‘ Aspergillus niaer. Carlsberg Res. Commun. , 48, 529 - 544.
« · 18. Pazur, J.H. et al., (1959) J. Biol. Chem., 234, 1966.
« « · • · · <a · · : 19. Innis, M.A. et al., (1985) Expression, Glycosylation « * · ....: and Secretion of an Aspergillus glucoamylase by * · 1
Saccaromyces cerevisiae. Sciences, 228, 21 - 26.
» · * · · « « « • · • · V·· 20. Sierks, M.R. et al., (1990) Catalytic Mechanism of
Fungal Glucoamylase as Defined by Mutagenesis of Aspl76, Glul79 and Glul80 in the Enzyme from Aspergillus awamori.
27 107807
Protein Eng., voi. 3, 193 - 198.
21. Sierks, M.R., (1988) Mutagenesis of the Active Site of Glucoamylase from Aspergillus awamori. Ph. D. väitöskirja, Iowa State University.
5 22. Svensson, B. ja Sierks, M.R., julkaisemattomat tiedot.
• · * · • « « • · • · <»» *»« • * * ft · ♦ « ft • « · * · » • * « · • · f · * * »« f ♦ · ft * ♦ ·« · « · • « · ft ft · ft · ft • * ft « ft · • • · ft ft * • · · « · « · · ft · • * • ft · ft ft · • « · • · ft · « · ft ft »· # · 107807 28
Cj a ^ S " o a “1 ~ o o r» O Sj· O O rv O O <r ID ”v ' j-1 , 44 44 -H *4 44 44 Ι/Ί <Ö r-*. m •j—^ i—i n «N CO ~+
H η »«Γ O O
^ ^ ^ ·-* CD O O O vo O r* o • as oh n < «s *** ^ S3 +J Λ O -r —.
φ JJ fn -» O O —< CQ <ti < O O ·α © o Ό*
•H iH
44 *H ♦* -M Ή -M CD
»W «ή r«* o m (D ® co o*» ©
<D03c ^ ^ ^ ^ O
Gflj «* ^^03 W-1 © o o -T © o O
•H tÖ < *· >own no m * rH w 2 >1 ~ C S *·
.Lj 5 — 0D <~v O
n «J — rs -JO OVO
n o »e - · .
v. O O O O O *5 44 44 44 44 44 44 t-- H H ? cr.
0 dn _ “S
tL ® <» O
H r. no rv rv no .r^O
Ό ·Η — ao vt rv vo rv O — O
S- U “· ... · ·
fydj1- *-·*" — o © ri O 1*1 O rv O
ÄwH» — Ό r- νΛ r"i 6 ~ e <a _ — •HS Ξ to (0 o Q_W —.«-1 to O O r» 0· = OO OO θ' un -P , r-| * +Ι·Μ· +· Ή *l Ή —
g 3 o S
6 ft <1 m O
0 ft d ^ O -v O
tn S, 2 ^ n ^ n ®^°.
•H >1 -J ex o v» O m Οσ>0 O O
• 4J — vi -f — vn ·**· (0 ·Η — «n
-I—tl—I
r-i ^ Λ *,t,'C‘H — — — • ♦ · *H ^ * ''"ft 1 w 1 ^ • ••tO tdr— W « » O <0 I w l pv t
• •Of-1 X . X tj X
···— a *> — a — — a •••Cu --- tn_. -W _ _ W ^ --- 4-4 1-4 ’** · -P 1 CJ l Oi ,i r. rv rv u ,v. : λ·η o *» — x ow'-x^'rt'-xutj o — *.·· ffl+J - v ϊ 5i o - 5 Ϊ ^ ^ ~ .·:*. oc g m ^ ~ - S * ~ *χ • · · ij JS 2 UXU 2 U X U —i <J X <J N -N X ^ • ιϊΐ O p J< — Jt ii Jt <fl _Si Si Ji 44 4> “ “ r-t+J +J 0 C «Λ*< cd d ^ ϋ δ _*υ ^ ^ se s o ® • « <y ^ * · ♦ ^ , s **
* * * **· 4-J
• * C -H
.·;·. -h h
·,· · to +J
. O O) . . O g i ··: +j «u • · I-1 5-1 ••••: s s • •aa • # * v-i # « ·
* \ O
: ·.: λ ♦ . ^ 3
•H
3 cd E-< 29 107807
Taulukko II Glukoosituotanto DE15 dekstriinistä luonnollisen
Aspergillus niger-glukoamylaasin avulla ilman haaroja lohkaisevia entsyymejä ja niiden kanssa.
x
Glukoosipitoisuus, g/L
Kulunut Glukoamyiaasi Glukoamylaasi Glukoamylaasi aika, h + Pullulanaasi + Isoamylaasi ~Έ 172, 182, 190 205,213,227 202,211,225 25 215,231,233 237,251,259 239,243,247 30 236,241,252 252,270,273 246,248,271 36 245,260,278 266,279,280 260,267,274 46 263,277,282 279,285 282,287 51.5 281,288 285,295 284,291 57.5 287,291 279,289,291,301 286,290,297 61.5 277,285,290 289,294 286,294 70.5 279,285,285,291 283,287· 280,294 78 274,282,284 280,285 279,291 * Ι·Μ 83 J 280,284 282,290 285,291 « · * 1 /S1. 96 279,279,285 277,289 279,287 104.5 279,282 279,283,284,287 274,280,283,292 I 1 *·'1: 120 274,280 275,280,281,285 276,282 * 1 m ----- --— . .
* 1 1 2 " " 1 - ’ 1 11 - - - - -
Maks. glukoosi, g/L 287.7 ±4.1- 291.3 ±4.11 -90.7 ±45' SS: h 63.1 59.6 63.9 «. 1 · « I » » .Kulmakerroin 7 0 h:n -0.123 ± 0.0602 -0.086 ± 0.0582 -0.164 ± 0.099“1 J^.Jjälkean, g/L h ··«·1 — .. . . . _ _ .. - . _ - - - — - — • · ·1·. 1 95 % varmuusraja • 1 t * 1 » 2 Keskivirhe * 1 · • ·» 2 • 4 30 107807
Taulukko III Glukoosituotanto DE15 dekstriinistä Saccharomvces cerevisiae-villitvvppiqlukoamvlaasin avulla ilman haaroja lohkaisevia entsyymejä ja niiden kanssa.
Glukoosipitoisuus, g/L
Kulunut Giukoamyiaasi Glukoamylaasi Glukoamylaasi aiica, n + pullulanaasi + Isoamylaasi ~~12 171, 180 190,196 182, 192 25 218,220 231,245 214,236 30 230,243 241,249 231,235 36 249,269 243,257 257,263 46 266,280 264,286 256,284 51.5 270,286 289,301 270,289 57 J 267,303 288,292 280,289,292 61.5 284,292 288,290 281,287 70.5 278,285,292 276,288,300 279,290 . 78 284,288 274,274,280 281,285 «««« .···. 83.5 272,278 280,289 280,284,291 • · • · · :T: 96 280,286 280,284 276,279,285 104.5 277,282 283,284 275,279,280,281 • 1 • · · 120 278,279,283 278,281,284 278,282,286 • · · • · · _____ __ ------—- __ — — _________— . Saks. glukoosi, g/L 288.3±6.11 288.6±52“ 286.8±6.0- • · · ·# aika, h 66.4 62.5 67.3 •'· · maks .
Tsilmakerroin 70 h = n -0.088 ±0.075- -0.««±0.098~ JD.08S ±0.066" * jälkeen, g/L h - * 95 % varmuusraja • · · 31 107807
Taulukko IV Glukoosituotanto DE15 dekstriinistä Saccharomvces cerevisiae-Asnl82—>Ala-glukoamylaasin avulla ilman haaroja lohkaisevia entsyymejä ja niiden kanssa.
Glukoosipitoisuus, g/L
Kulunut Glukoamylaasi Glukoamylaasi Glukoamylaasi aika, h + Pullulanaasi + Isoamylaasi 12 189, 194 229“. 235* 201,241- 25 229,247 237,2L7 233,233 30 247,252 252.262 257.269 36 258,276 2S0,286 259.280 46 261-, 266“ 271“, 310“ 286,293 51.5 288,292 289,299 286.293 57.5 289,294 291,299 287.292 61.5 280,289 279,285,289,295 280.286 70.5 280,288 281,287 275,289 78 281,287 277,289 283.290 « · * · « · .··♦. 83.5 283.287 276,288 279.286 • ·» 96 279,284 279,284 276.284,285.287 II: 104.5 282,284 273,285,291 284,286 • · no 276,280,284 279,285,291 279,283 • · « • · · ^ I - » ~ —^» • l_l ,¥kS. glukoosi, */1,290.7 ±4.3” 293.0±5.7** 29t.2±5.4-* » · · *;#aika, h 616 58-5 ' 60.6 : jnpks.
/Kulmakerroin 70 h:n -0.088 ± 0.05 1 0.029 ± 0.093“““ -0.033 ± 0.0S 1 “““ •.‘^jälkeen, g/L h • ______________ ____ • m · · · _ - - 1 — . i . i . i- .
• « Il II Il — ,·,·.* Ei käytetty epälineaarisessa regressiossa ·.·.·** 95 % varmuusraja • .*** Keskivirhe » i « • · * • · 32 107807
CN C"| CN CN
2 ώ ώ ώ ώ . ' οι ιο ό c; •H g - ^ n tn — γ-~ »— —
O
o —----- S *> % 2 n ^ ^
m S
O X g r-, Ό n cn :<0 · O ____________
Co·· tn
T* £ H cc m O
>i:(0 .O 3 r~, ·τ >/~i (N
+J H -* _·_·_· _· 4-1 »H Ή ' ’ ' ’ O) :cö ra _______ —_
+> E M
U S ^ ^ Π 'S.
K £ Ξ ^ e*® J ^ ^ ^ ^ **3 --- CD m o g 6 · -M § _ ·Η·3*Μ λ ^Ο'ΐΓ'Τ 0 CU 5 2 - CN ^ - +J<C« £ o o o o km S4 (Ura· 2 ________ ^ ·· <o -g
K -H S
Λ-l Cj S"4 ,_i /-.i -> ^ (— CD C ^ . ~. · 11 ^ r~ γ~- r~ . -P 3 *··· 4-1 CJ Q* I I . I —--—
* * 0) O .H
... cd in -u s : : e ^ 4J * Tr o o .*:*. Retied.
: : : m +j 2 -* • c n (1) p : .*. <u <a m --
:.: : ·Η 1-1 2 ^ ,H
. . Ρ·Η E« en :·.: -p -p si 0 . : c;o-h <e o ~ 5 ... e & )4 ^ 4J — — — — — : : : +j s +j h e :« (tr? <0 ___ S Ή C CD £ • * * ^ ♦ · J*L ' • · · • · « • · · ______________ . ! : > .H a, ^ O 3: * : o i, * - “ ~ ..... ftp C r? .>% l= Λ m m “ - 3 “ ή r t r * * Ή r* ^ -S' ^
··· H c »4 y ... CJ
·.·.* 3 a > V5 N/ C/3 <0 .\J l·* ti· =- - : =- — -- - - =jj 33 107807
Taulukko VI Mutanttientsyymien maltoosiselektiivisyys (G2) verrattuna isomaltoosiin (iG2) ja maltoheptaoo-siselektiivisyys (G7) verrattuna maltoosiin WT S-Y119 G-K183 S-H184 G2/iG2 564 1320 709 995 G7/G2 74 41 53 52 • · · · • · • · · « · • « · • ·« . _ - .
• · · • · « • » • · · • · * • ·· · • I • · » • « • · * • · · • « · • · • · · • · * • · M* « · » • « · • ·
i I * I
• «· • · • · ♦ · • · · • · · • · « · • « · • * · • ·
Claims (9)
1. Menetelmä tärkkelyksen tai osittain hydrolysoidun tärkkelyksen muuttamiseksi dekstroosia sisältäväksi siirapiksi, 5 tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen, jossa tärkkelys-hydrolysaatti muutetaan sokeriksi Aspergillus-kannasta saatavissa olevan glukoamylaasin sellaisen mutantin läsnä ollessa, jolla suhteessa Aspergillus nigerin glukoamylaasiin on korotettu selektiivisyys α-(1—>4)-glukoosisidoksiin ja 10 joka käsittää jonkin seuraavista mutaatioista: A. niger -glukoamylaasin Serll9:ää vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Tyr:lla;
15 A. niger -glukoamylaasin Asnl82:ta vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Asn, edullisesti Ala:11a; A. niger -glukoamylaasin Glyl83:a vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Gly, 20 edullisesti Lysrlla; . A. niger -glukoamylaasin Serl84:ää vastaavassa positiossa • · olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, • · ···* edullisesti Hisilla. ··· • · · • · · • · ·.: · 25
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • · tä, että mutaation läpikäynyt glukoamylaasi on johdettu :T: glukoamylaasista, joka on saatavissa A. nicrerista tai A. awamorista. • · ,···, 30
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet- ’·* tu siitä, että mutaation läpikäynyt glukoamylaasi sisältää * • · · kaksi tai useampia aminohapon korvauksia. • · · • * • ♦ • · ·
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, .···. 35 tunnettu siitä, että glukoamylaasiannos on alueella 0,05 -. • · 0,5 AG-yksikköä grammaa kuivaa kiintoainetta kohti. ! 07807
5. Jonkin edellä mainitun patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää tärkkelyshydro-lysaatin muuttamisen sokeriksi konsentraatiossa, joka on vähintään 30 paino-% kuivaa kiintoainetta. 5
6. Jonkin edellä mainitun patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muuttaminen sokeriksi suoritetaan haaroja lohkaisevan entsyymin läsnäollessa, jolloin entsyymi on valittu ryhmästä, johon sisältyy pullulanaasit 10 ja isoamylaasit, edullisesti Bacillus acidopullulvticusista johdettu pullulanaasi tai Pseudomonas amyloderamosasta johdettu isoamylaasi.
7. Jonkin edellä mainitun patenttivaatimuksen mukainen me-15 netelmä, tunnettu siitä, että muuttaminen sokeriksi suoritetaan pH-alueella 3-5,5 ja lämpötilassa 30-60 °C 48-72 tunnin ajan, edullisesti pH:ssa 4-4,5 ja lämpötilassa 55-60 °C.
8. Aspergillus-kannasta saatavissa olevan glukoamylaasin ><t. mutantti, tunnettu siitä, että sillä on suhteessa Asperail- • · ... lus niaerin glukoamylaasiin korotettu selektiivisyys a- • · ”1 (1—>4)-glukoosisidoksiin ja käsittää jonkin seuraavista mu- • · · taatioista: • ♦ • · · • · · 9 C «·· · ^j • ·.*·· A. niaer -glukoamylaasin Serll9:ää vastaavassa positiossa • · · ί.ί : olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Tyrrlla; ·:··· A. niqer -glukoamylaasin Asnl82:ta vastaavassa positiossa 30 olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Asn, ··· • edullisesti Ala:11a; • · · '*·|·* A. niqer -glukoamylaasin Glyl83:a vastaavassa positiossa • « olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Gly, ··· edullisesti Lys:lla; ···· .***. 35 A. niqer -glukoamylaasin Serl84:ää vastaavassa positiossa • * · olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Hisrlla; 107807 edellyttäen, että mutaation läpikäyneen entsyymin ollessa johdettu A. nicrer -glukoamylaasista, Asn:n korvaaminen Ala:11a aminohappopositiossa Asnl82 ei ole ainoa mutaatio.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen glukoamylaasin mutantti, tunnettu siitä, että se käsittää kaksi tai useampia aminohapon korvauksia. 10
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/546,511 US5162210A (en) | 1990-06-29 | 1990-06-29 | Process for enzymatic hydrolysis of starch to glucose |
| US54651190 | 1990-06-29 | ||
| DK9100182 | 1991-06-28 | ||
| PCT/DK1991/000182 WO1992000381A1 (en) | 1990-06-29 | 1991-06-28 | Enzymatic hydrolysis of starch to glucose, using a genetically engineered enzyme |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI925901A FI925901A (fi) | 1992-12-28 |
| FI925901A0 FI925901A0 (fi) | 1992-12-28 |
| FI107807B true FI107807B (fi) | 2001-10-15 |
Family
ID=24180763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI925901A FI107807B (fi) | 1990-06-29 | 1992-12-28 | Tärkkelyksen entsymaattinen hydrolyysi glukoosiksi geenimanipuloidun entsyymin avulla |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5162210A (fi) |
| EP (1) | EP0536270B1 (fi) |
| JP (1) | JP3249514B2 (fi) |
| AT (1) | ATE195972T1 (fi) |
| DE (1) | DE69132391T2 (fi) |
| DK (1) | DK0536270T3 (fi) |
| ES (1) | ES2150905T3 (fi) |
| FI (1) | FI107807B (fi) |
| GR (1) | GR3034781T3 (fi) |
| WO (1) | WO1992000381A1 (fi) |
Families Citing this family (149)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965442A (en) * | 1993-11-12 | 1999-10-12 | Nec Corporation | Method of altering enzymes and a novel neopullulanase |
| KR19990007930A (ko) * | 1995-04-21 | 1999-01-25 | 슈타르피아 | 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제 변이체 |
| US5888781A (en) * | 1997-03-12 | 1999-03-30 | University Of Maryland Baltimore County | Method for increasing the hydrolytic activity of starch hyrdolases |
| US6352851B1 (en) | 1998-07-15 | 2002-03-05 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants |
| EP1914306A3 (en) * | 1998-07-15 | 2008-09-10 | Novozymes A/S | Glucoamylase Variants |
| EP1097196B2 (en) * | 1998-07-15 | 2011-04-20 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants |
| EP2009098A1 (en) | 1999-07-09 | 2008-12-31 | Novozymes A/S | Glucoamylase variant |
| EP1434861A2 (en) | 2001-10-01 | 2004-07-07 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants |
| US20040063184A1 (en) | 2002-09-26 | 2004-04-01 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| WO2004106533A1 (en) | 2003-05-30 | 2004-12-09 | Novozymes A/S | Alcohol product processes |
| US20040253696A1 (en) | 2003-06-10 | 2004-12-16 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| DK1675941T3 (da) | 2003-06-25 | 2013-08-26 | Novozymes As | Polypeptider med alfa-amylaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem |
| JP2007509630A (ja) | 2003-10-28 | 2007-04-19 | ノボザイムス ノース アメリカ，インコーポレイティド | ハイブリッド酵素 |
| CN102174490B (zh) | 2003-11-21 | 2016-09-28 | 丹尼斯科美国公司 | 颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法 |
| AU2005249422B2 (en) | 2004-05-27 | 2011-03-17 | Genencor International, Inc. | Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions |
| WO2005118800A1 (en) | 2004-05-27 | 2005-12-15 | Genencor International, Inc. | Heterologous expression of an aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis |
| US7332319B2 (en) | 2004-05-27 | 2008-02-19 | Genencor International, Inc. | Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus |
| ES2543131T3 (es) | 2004-12-22 | 2015-08-14 | Novozymes North America, Inc. | Enzimas para tratamiento de almidón |
| US7429476B2 (en) | 2004-12-30 | 2008-09-30 | Genencor International, Inc. | Acid fungal proteases |
| EP1941049A4 (en) | 2005-09-20 | 2011-12-21 | Novozymes North America Inc | PROCESS FOR PRODUCING A FERMENTATION PRODUCT |
| US20080318284A1 (en) | 2005-12-22 | 2008-12-25 | Novozymes North America, Inc. | Processes for Producing a Fermentation Product |
| US8076112B2 (en) | 2006-03-22 | 2011-12-13 | Novozymes A/S | Fermentation processes |
| US7968318B2 (en) | 2006-06-06 | 2011-06-28 | Genencor International, Inc. | Process for conversion of granular starch to ethanol |
| MX2009009378A (es) | 2007-03-09 | 2009-09-22 | Danisco Us Inc Genencor Div | Variantes de alfa-amilasa de especies de bacillus alcalifilico, composiciones que comprenden las variantes de alfa-amilasa, y metodos de uso. |
| EP2137317A1 (en) | 2007-03-14 | 2009-12-30 | Danisco US, INC., Genencor Division | Production of ethanol from barley and ddgs containing reduced beta-glucan and phytic acid |
| JP5167286B2 (ja) | 2007-03-14 | 2013-03-21 | ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン | トリコデルマ・レセイ（ＴＲＩＣＨＯＤＥＲＭＡＲＥＥＳＥＩ）α−アミラーゼはマルトース産生酵素である。 |
| ES2390630T3 (es) | 2007-04-24 | 2012-11-14 | Novozymes North America, Inc. | Detoxificación de materiales que contienen lignocelulosa pretratados |
| DK2191061T3 (da) | 2007-09-03 | 2013-08-19 | Novozymes As | Afgiftning og recirkulering af vaskeopløsning anvendt ved forbehandling af lignocelluloseholdige materialer |
| PL2201108T3 (pl) | 2007-10-18 | 2015-03-31 | Danisco Us Inc | Mieszanki enzymów do fermentacji |
| US8236545B2 (en) | 2008-02-04 | 2012-08-07 | Danisco Us Inc., Genencor Division | TS23 alpha-amylase variants with altered properties |
| WO2009114451A1 (en) | 2008-03-11 | 2009-09-17 | Danisco Us Inc., Genencor Division | Glucoamylase and buttiauxiella phytase during saccharification |
| CN101970672A (zh) | 2008-03-11 | 2011-02-09 | 丹尼斯科美国公司 | 根霉属淀粉酶在颗粒淀粉水解中的应用 |
| MX2010011721A (es) | 2008-04-30 | 2010-11-30 | Danisco Inc | Nuevas variantes de alfa-amilasa quimericas. |
| CN102112621A (zh) | 2008-06-06 | 2011-06-29 | 丹尼斯科美国公司 | 用来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶从淀粉产生葡萄糖 |
| JP5599113B2 (ja) | 2008-06-06 | 2014-10-01 | ダニスコ・ユーエス・インク | 糖化酵素組成物及びその糖化方法 |
| CN102112605B (zh) | 2008-06-06 | 2014-02-26 | 丹尼斯科美国公司 | 来自枯草芽孢杆菌的变体α-淀粉酶及其使用方法 |
| EP2364363A2 (en) | 2008-06-23 | 2011-09-14 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
| BRPI0919525A2 (pt) | 2008-09-30 | 2015-08-18 | Novozymes North America Inc | Métodos para produzir um produto de fermentação a partir de um material contendo lignocelulose, para intensificar hidrólise enzimática e para reduzir o efeito prejudicial de lignina na hidrólise de um material contendo lignocelulose, e, produto de fermentação |
| RU2524118C2 (ru) | 2008-10-15 | 2014-07-27 | Новозимс А/С | Способ пивоварения |
| EP2857515B1 (en) | 2008-11-20 | 2018-02-21 | Novozymes Inc. | Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| CN102272315A (zh) | 2008-12-30 | 2011-12-07 | 诺维信北美公司 | 用溶解空气浮选淤渣改进经预处理的含木素纤维素材料的酶水解 |
| WO2010078392A2 (en) | 2008-12-31 | 2010-07-08 | Novozymes North America, Inc. | Processes of producing fermentation products |
| JP2012522875A (ja) | 2009-04-01 | 2012-09-27 | ダニスコ・ユーエス・インク | アルファ‐アミラーゼ及びプロテアーゼを含む洗浄組成物及び方法 |
| WO2010124206A1 (en) * | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Novozymes North America, Inc. | Antistaling process for flat bread |
| DK2432875T3 (en) | 2009-05-19 | 2016-12-19 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Amylasepolypeptide |
| CA2766720A1 (en) | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Novozymes A/S | Process for treating a substrate with an enzyme |
| CN102498401B (zh) | 2009-07-17 | 2015-12-02 | 诺维信公司 | 在纤维素材料水解中分析纤维素衰变的方法 |
| WO2011017093A1 (en) | 2009-08-07 | 2011-02-10 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase blend for starch processing and method of use thereof |
| CN107299123A (zh) * | 2009-08-19 | 2017-10-27 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 葡糖淀粉酶的变体 |
| CN102665425A (zh) | 2009-09-30 | 2012-09-12 | 诺维信公司 | 馒头制备方法和馒头改进组合物 |
| MX356389B (es) | 2009-10-23 | 2018-05-28 | Danisco Us Inc | Metodos para reducir sacaridos azules. |
| CN102791854A (zh) | 2009-12-22 | 2012-11-21 | 诺维信公司 | 普鲁兰酶变体及其用途 |
| CN102884197A (zh) | 2010-01-29 | 2013-01-16 | 诺维信公司 | 具有酶预处理的沼气生产方法 |
| WO2011100161A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Novozymes North America, Inc. | Addition of alpha - glucosidase and cobalt for producing fermentation products from starch |
| EP2553111B1 (en) | 2010-03-30 | 2016-05-11 | Novozymes A/S | Methods for enhancing by-products from fermentation processes |
| WO2011127802A1 (en) | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
| WO2011154529A1 (en) | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Novozymes A/S | Enzymatic flour correction |
| CN103140586A (zh) | 2010-08-02 | 2013-06-05 | 诺维信北美公司 | 产生发酵产物的方法 |
| EP2608682B1 (en) | 2010-08-24 | 2017-12-13 | Danisco US Inc. | Method of making a snack bar comprising a low temperature rice protein concentrate |
| US9057087B2 (en) | 2010-11-19 | 2015-06-16 | Novozymes North America, Inc. | Processes of producing a fermentation product |
| CN103608460B (zh) | 2010-12-22 | 2017-08-29 | 诺维信北美公司 | 用于产生发酵产物的工艺 |
| BR112013013136A2 (pt) | 2011-01-04 | 2016-07-12 | Novozymes As | processo de produção de biogás |
| US9677094B2 (en) | 2011-02-07 | 2017-06-13 | Novozymes A/S | Process of producing a fermentation product |
| EP2702161A1 (en) | 2011-04-29 | 2014-03-05 | Danisco US Inc. | Use of cellulase and glucoamylase to improve ethanol yields from fermentation |
| BR112013032543A2 (pt) | 2011-06-28 | 2017-01-17 | Novozymes As | processo de produção de biogás |
| BR112014000143B1 (pt) | 2011-07-06 | 2021-04-06 | Novozymes A/S | Variante de alfa-amilase, polinucleotídeo isolado, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de produzir uma variante de alfa-amilase, para produzir um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, e, para a produção um derivado de amido enzimaticamente modificado |
| EP2548944A1 (en) | 2011-07-21 | 2013-01-23 | AB Enzymes GmbH | Process of lysing yeast cell walls |
| BR112013032861A2 (pt) | 2011-07-22 | 2017-01-24 | Novozymes North America Inc | métodos para aumentar a atividade da enzima celulolítica durante a hidrólise do material celulósico, para hidrolisar um material celulósico pré-tratado, para a produção de um produto da fermentação, e para a fermentação de um material celulósico pré-tratado |
| MX2014003641A (es) | 2011-09-29 | 2014-05-21 | Danisco Us Inc | Licuefaccion y sacarificacion de almidon granular a alta concentracion. |
| US9677095B2 (en) | 2011-10-11 | 2017-06-13 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
| EP3845641A1 (en) | 2011-10-28 | 2021-07-07 | Danisco US Inc. | Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants |
| CA2857963C (en) | 2011-12-02 | 2022-08-30 | Novozymes North America, Inc. | Processes for producing fermentation products |
| WO2013083801A2 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Novozymes A/S | Biogas from substrates comprising animal manure and enzymes |
| WO2013096652A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Novozymes, Inc. | Methods for determining the degradation of a biomass material |
| EP2831256A1 (en) | 2012-03-28 | 2015-02-04 | Danisco US Inc. | Low temperature method for making high glucose syrup |
| WO2013148207A2 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Danisco Us Inc. | Direct starch to fermentable sugar |
| CA2869047C (en) | 2012-03-30 | 2022-11-01 | Novozymes North America, Inc. | Processes of producing fermentation products |
| ES2935920T3 (es) | 2012-03-30 | 2023-03-13 | Novozymes North America Inc | Procesos de elaboración de productos de fermentación |
| US9315831B2 (en) | 2012-03-30 | 2016-04-19 | Danisco Us Inc. | Direct starch to fermentable sugar as feedstock for the production of isoprene, isoprenoid precursor molecules, and/or isoprenoids |
| WO2013169645A1 (en) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Danisco Us Inc. | Use of alpha-amylase from aspergillus clavatus for saccharification |
| CA2874061A1 (en) | 2012-06-08 | 2014-01-09 | Danisco Us Inc. | Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers |
| CN104640994A (zh) * | 2012-08-16 | 2015-05-20 | 丹尼斯科美国公司 | 将异淀粉酶和来自棒曲霉的α-淀粉酶用于糖化的方法 |
| US20150218606A1 (en) | 2012-08-16 | 2015-08-06 | Danisco Us Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus clavatus and pullulanase for saccharification |
| US9828595B2 (en) | 2012-08-17 | 2017-11-28 | Novozymes A/S | Thermostable asparaginase variants and polynucleotides encoding same |
| US20180112203A1 (en) | 2012-11-20 | 2018-04-26 | Danisco Us Inc. | Amylase with maltogenic properties |
| US9765374B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-09-19 | Danisco Us Inc | Method of using α-amylase from Aspergillus fumigatus and isoamylase for saccharification |
| WO2014099415A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Method of using alpha-amylase from aspergillus terreus and pullulanase for saccharification |
| EP2935575B1 (en) | 2012-12-21 | 2018-04-18 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase variants |
| WO2014099525A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof |
| HUE039341T2 (hu) | 2013-03-11 | 2018-12-28 | Danisco Us Inc | Alfa-amiláz kombinatorikus variációi |
| WO2014200658A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis |
| WO2014200656A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces umbrinus |
| WO2014200657A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis |
| WO2014204596A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from bacillaceae family member |
| WO2015007639A1 (en) | 2013-07-17 | 2015-01-22 | Novozymes A/S | Pullulanase chimeras and polynucleotides encoding same |
| CN105934518A (zh) | 2013-09-11 | 2016-09-07 | 诺维信公司 | 用于生产发酵产品的方法 |
| DK3060659T3 (da) | 2013-10-03 | 2019-09-09 | Danisco Us Inc | Alfa-amylaser fra exiguobacterium og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| WO2015050724A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof |
| WO2015057517A1 (en) | 2013-10-17 | 2015-04-23 | Danisco Us Inc. | Use of hemicellulases to improve ethanol production |
| WO2015065978A1 (en) | 2013-10-28 | 2015-05-07 | Danisco Us Inc. | Trehalase in fermentations |
| WO2015066667A1 (en) | 2013-11-04 | 2015-05-07 | Danisco Us Inc. | Proteases in wheat processing |
| WO2015066669A1 (en) | 2013-11-04 | 2015-05-07 | Danisco Us Inc. | Proteases in corn processing |
| EP3071691B1 (en) | 2013-11-20 | 2019-10-23 | Danisco US Inc. | Variant alpha-amylases having reduced susceptibility to protease cleavage, and methods of use, thereof |
| WO2015094809A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Danisco Us Inc. | Chimeric fungal alpha-amylases comprising carbohydrate binding module and the use thereof |
| WO2015094714A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Danisco Us Inc. | Proteases in grain processing |
| CN105960457B (zh) | 2014-01-22 | 2021-09-03 | 诺维信公司 | 普鲁兰酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
| MX2016010031A (es) | 2014-02-07 | 2016-11-15 | Novozymes As | Composiciones para producir jarabes de glucosa. |
| WO2015143144A1 (en) | 2014-03-19 | 2015-09-24 | Novozymes A/S | Method for enhancing activity of an x143 polypeptide |
| CN106170545A (zh) | 2014-04-10 | 2016-11-30 | 诺维信公司 | α‑淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
| AR102419A1 (es) | 2014-10-23 | 2017-03-01 | Novozymes As | Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que las codifican |
| US20170321237A1 (en) | 2014-12-01 | 2017-11-09 | Novozymes A/S | Improved Production of Glucose Syrups |
| CA2981342A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Polypeptides having trehalase activity and the use thereof in process of producing fermentation products |
| US11920170B2 (en) | 2015-12-09 | 2024-03-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
| US20190010470A1 (en) | 2015-12-22 | 2019-01-10 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
| WO2017173190A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
| WO2017173324A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
| WO2017205337A1 (en) | 2016-05-23 | 2017-11-30 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Baking process and a method thereof |
| RU2763378C2 (ru) | 2016-09-23 | 2021-12-28 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ ПРИ НИЗКОМ ЗНАЧЕНИИ pH АЛЬФА-1,4/1,6-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ КРАХМАЛА |
| CN110088287A (zh) | 2016-10-17 | 2019-08-02 | 诺维信公司 | 在乙醇发酵过程中减少泡沫的方法 |
| US10889836B2 (en) | 2016-11-23 | 2021-01-12 | Novozymes A/S | Yeast for ethanol production |
| CA3057713A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Danisco Us Inc | Alpha-amylase combinatorial variants |
| AU2018275794A1 (en) | 2017-06-02 | 2019-12-05 | Novozymes A/S | Improved yeast for ethanol production |
| WO2018226569A1 (en) | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Danisco Us Inc | Use of betaine to stabilize and/or increase the activity of enzymes in stressful environments |
| DK3645555T3 (da) | 2017-06-28 | 2022-03-07 | Novozymes As | Polypeptider med trehalaseaktivitet og polynukleotider, der koder for disse |
| CA3070281A1 (en) | 2017-08-08 | 2019-02-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having trehalase activity and the use thereof in process of producing fermentation products |
| WO2019055455A1 (en) | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Novozymes A/S | MIXTURES OF ENZYMES AND METHODS FOR IMPROVING THE NUTRITIONAL QUALITY OF ANIMAL FEED |
| BR112020007814A2 (pt) | 2017-10-23 | 2020-10-20 | Novozymes A/S | processos para reduzir e/ou prevenir um aumento nos níveis de ácido lático em um sistema de fermentação de biocombustível e para produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, e, uso de um polipeptídeo, ou uma composição enzimática |
| EP3710580A1 (en) | 2017-11-14 | 2020-09-23 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase, composition and method |
| WO2019148192A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Novozymes A/S | Microorganisms with improved nitrogen utilization for ethanol production |
| BR112020016677A2 (pt) | 2018-02-15 | 2020-12-15 | Novozymes A/S | Levedura melhorada para a produção de etanol |
| BR112020024347A2 (pt) | 2018-05-31 | 2021-02-23 | Novozymes A/S | processos para aumentar o crescimento e a produtividade de levedura |
| BR112021000369A2 (pt) | 2018-07-11 | 2021-04-13 | Novozymes A/S | Processos para produção de produtos de fermentação |
| CN112601818A (zh) | 2018-07-25 | 2021-04-02 | 诺维信公司 | 用于生产乙醇的表达酶的酵母 |
| CA3114783A1 (en) | 2018-10-08 | 2020-04-16 | Novozymes A/S | Enzyme-expressing yeast for ethanol production |
| WO2020160126A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Novozymes A/S | Polypeptides having xylanase activity and use thereof for improving the nutritional quality of animal feed |
| CN113853438A (zh) | 2019-04-02 | 2021-12-28 | 诺维信公司 | 用于生产发酵产物的方法 |
| EP3996519A1 (en) | 2019-07-09 | 2022-05-18 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Fat coated particulate enzyme compositions |
| US20220251609A1 (en) | 2019-07-26 | 2022-08-11 | Novozymes A/S | Microorganisms with improved nitrogen transport for ethanol production |
| WO2021026201A1 (en) | 2019-08-05 | 2021-02-11 | Novozymes A/S | Enzyme blends and processes for producing a high protein feed ingredient from a whole stillage byproduct |
| CA3143527A1 (en) | 2019-08-06 | 2021-02-11 | Novozymes A/S | Fusion proteins for improved enzyme expression |
| WO2021046073A1 (en) | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed composition |
| EP4031661A1 (en) | 2019-09-16 | 2022-07-27 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucanase activity and polynucleotides encoding same |
| MX2022006963A (es) | 2019-12-10 | 2022-07-12 | Novozymes As | Microorganismo para fermentacion de pentosa mejorada. |
| AR120775A1 (es) | 2019-12-16 | 2022-03-16 | Novozymes As | Procesos para obtener productos de fermentación |
| WO2021163030A2 (en) | 2020-02-10 | 2021-08-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same |
| CN116438309A (zh) | 2020-11-02 | 2023-07-14 | 诺维信公司 | 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 |
| BR112023025624A2 (pt) | 2021-06-07 | 2024-02-27 | Novozymes As | Célula de levedura recombinante, célula hospedeira recombinante, composição, cocultura, métodos de produção de um derivado de uma célula hospedeira recombinante e de produção de um produto de fermentação, e, uso de uma célula hospedeira recombinante |
| KR20240060703A (ko) | 2021-09-27 | 2024-05-08 | 인터내셔널 엔＆에이치 덴마크 에이피에스 | 사료 첨가제 조성물 및 이의 사용 방법 |
| WO2023225510A1 (en) | 2022-05-17 | 2023-11-23 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed additive comprising enzyme combinations |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4560651A (en) * | 1981-04-20 | 1985-12-24 | Novo Industri A/S | Debranching enzyme product, preparation and use thereof |
| CA1211314A (en) * | 1983-05-20 | 1986-09-16 | William F. Line | Production of dextrose and maltose syrups using an enzyme derived from rice |
| DK167029B2 (da) * | 1983-09-11 | 2000-11-27 | Genencor Int | Enzymprodukt og dets anvendelse ved saccharificering af stivelse |
-
1990
- 1990-06-29 US US07/546,511 patent/US5162210A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-06-28 JP JP51161491A patent/JP3249514B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-28 ES ES91912567T patent/ES2150905T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-28 DE DE69132391T patent/DE69132391T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-28 DK DK91912567T patent/DK0536270T3/da active
- 1991-06-28 AT AT91912567T patent/ATE195972T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-06-28 EP EP91912567A patent/EP0536270B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-28 WO PCT/DK1991/000182 patent/WO1992000381A1/en active IP Right Grant
-
1992
- 1992-12-28 FI FI925901A patent/FI107807B/fi active
-
2000
- 2000-11-08 GR GR20000402470T patent/GR3034781T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI925901A (fi) | 1992-12-28 |
| DE69132391T2 (de) | 2001-02-15 |
| DK0536270T3 (da) | 2000-10-30 |
| FI925901A0 (fi) | 1992-12-28 |
| JPH05507852A (ja) | 1993-11-11 |
| GR3034781T3 (en) | 2001-02-28 |
| WO1992000381A1 (en) | 1992-01-09 |
| EP0536270B1 (en) | 2000-08-30 |
| US5162210A (en) | 1992-11-10 |
| DE69132391D1 (de) | 2000-10-05 |
| ES2150905T3 (es) | 2000-12-16 |
| EP0536270A1 (en) | 1993-04-14 |
| ATE195972T1 (de) | 2000-09-15 |
| JP3249514B2 (ja) | 2002-01-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI107807B (fi) | Tärkkelyksen entsymaattinen hydrolyysi glukoosiksi geenimanipuloidun entsyymin avulla | |
| Wind et al. | Cyclodextrin formation by the thermostable alpha-amylase of Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1 and reclassification of the enzyme as a cyclodextrin glycosyltransferase | |
| EP0140410B2 (en) | Novel enzyme product and its use in the saccharification of starch | |
| FI98378C (fi) | Uusi, erittäin termostabiili -amylaasi | |
| CN103930543B (zh) | 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 | |
| EP0171218B1 (en) | Enzymatic hydrolysis of granular starch directly to glucose | |
| EP0822982B1 (en) | Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants | |
| KR20010032497A (ko) | 막 분리 단계를 포함하는 효소성 전분 당화 | |
| Mukai et al. | Production of trehalose from starch by thermostable enzymes from Sulfolobus acidocaldarius | |
| Saha et al. | Characterization of an endo-acting amylopullulanase from Thermoanaerobacter strain B6A | |
| CN110373403B (zh) | 耐高温中性普鲁兰酶及其应用 | |
| Soccol et al. | Glucoamylase | |
| EP1002062B1 (en) | Starch conversion process using thermostable isoamylases from sulfolobus | |
| Kobayashi et al. | Production of trehalose from starch by novel trehalose-producing enzymes from Sulfolobus solfataricus KM1 | |
| Akimaru et al. | Purification and properties of Bacillus coagulans cyclomaltodextrin glucanotransferase | |
| JPH0118717B2 (fi) | ||
| Yanai et al. | Purification and characterization of a novel α-L-arabinofuranosidase from Pichia capsulata X91 | |
| JP3557272B2 (ja) | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 | |
| WO2000043504A1 (en) | PROTEIN ENGINEERING OF GLUCOAMYLASE TO INCREASE pH OPTIMUM, SUBSTRATE SPECIFICITY AND THERMOSTABILITY | |
| KR100674133B1 (ko) | 폴리펩티드 | |
| KR101014802B1 (ko) | 복합 탈분지 효소를 이용하여 전분으로부터 포도당을 제조하는 방법 | |
| Sierks et al. | Process for enzymatic hydrolysis of starch to glucose | |
| CN111793663B (zh) | 一种具有广泛pH值适应性的淀粉普鲁兰酶及应用 | |
| 森哲也 et al. | Enzymes involved in the biosynthesis and degradation of cyclic maltosyl-maltose in Arthrobacter globiformis M6 | |
| WO2021116400A1 (en) | Process for the preparation of a fermentable sugar composition and the fermentation thereof |