FI105525B - Mikrobeja torjuvat koostumukset, kalvo ja menetelmä elintarvikkeiden pinnan käsittelemiseksi - Google Patents

Description

x 105525

Mikrobeja torjuvat koostumukset, kalvo ja menetelmä elintarvikkeiden pinnan käsittelemiseksi

Antimikrobiska sammansättningar, film och förfarande för yt-behandling av livsmedel

Oheinen keksintö kohdistuu antimikrobisiin eli mikrobeja torjuviin sekä bakterisidisiin eli bakteereja tappaviin koostumuksiin sekä tällaisia koostumuksia sisältäviin pakkaus- ja jalostuskalvoihin elintarvikkeita varten sekä menetelmään, jolla voidaan estää tai torjua mikrobien kuten bakteereiden, homeiden ja hiivojen kasvu elintarvikkeiden pinnalla.

Ohessa käytetty käsite "elintarvikkeiden säilöminen" kattaa sellaiset menetelmät, jotka suojaavat ruokamyrkytykseltä, sekä myös sellaiset menetelmät, jotka hidastavat mikrobien aiheuttamaa elintarvikkeiden pilaantumista tai estävät sen. Elintarvikkeiden säilöminen pitää ruuan turvallisena nautittavaksi ja se estää ravintoaineiden hajoamista tai torjuu organoleptisia muutoksia, joiden seurauksena elintarvikkeiden maittavuus huononee.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "elintarvikkeen pilaantuminen" tarkoitetaan mitä tahansa elintarvikkeen tilassa tapahtuvaa muutosta, mukaan lukien maun, tuoksun, rakenteen tai ulkonäön muuttuminen, joka heikentää elintarvikkeen maittavuutta. Pilaantunut elintarvike voi olla toksista, ei kuitenkaan välttämättä. 1 " Ohessa käytetyllä käsitteellä "ruokamyrkytys" tarkoitetaan • 4 nisäkkäissä esiintyviä sairauksia, jotka johtuvat patogeeni-silla viruksilla, homeilla tai bakteereilla ja/tai niiden toksiineilla kontaminoituneen ruuan nauttimisesta. Patogeeneillä kontaminoituneessa ruuassa ei todeta välttämättä lainkaan organoleptista pilaantumista. Bakteeriperäinen ruokamyrkytys voi johtua joko siitä, että bakteeriorganismi infektoi isännän, tai toksiinista, jota bakteerit tuottavat joko elintarvikkeessa tai isännässä.

2 105525

Elintarvikkeiden pilaantumista ja ruokamyrkytyksiä on pyritty estämään kautta aikojen yritykseen ja erehdykseen perustuvilla menetelmillä. Varhaisimmat yritykset ovat johtaneet esimerkiksi sellaisiin elintarvikkeiden säilömismenetelmiin kuten ruuan kuivaus, suolaus ja/tai savustus sen säilömiseksi. Ruuan säilömiselle saatiin vasta suhteellisen myöhään tieteelliset perusteet. 19. vuosisadalla sellaiset tiedemiehet kuten Louis Pasteur ja Robert Koch selvittivät ruokamyrkytyksen ja elintarvikkeiden pilaantumisen bakteeriperäiset syyt ja he kehittivät uusia menetelmiä patogeenisten bakteereiden tunnistamiseksi ja elintarvikkeiden säilömiseksi.

Nykyään elintarviketeknologeilla on käytettävissä lukuisia fysikaalisia, kemiallisia ja biologisia menetelmiä ja aineita, joilla voidaan säilöä elintarvikkeita ja estää sairauksien leviäminen elintarvikkeiden välityksellä. Esimerkiksi sellaisten menetelmien kuten säteilytyksen, fermentoinnin, pastöroinnin, lämpötilan, pH-arvon ja/tai veden aktiivisuuden säätämisen lisäksi olemassa on ylenpalttisesti kemiallisia aineita. Näistä aineista voidaan mainita hapettumista estävät aineet, joilla estetään elintarvikkeen kemiallinen ·. hajoaminen, sekä koostumukset, jotka tappavat tai torjuvat haitallisia bakteereita ja/tai muita mikrobeja, jolloin elintarvike saadaan säilyväksi, eli jolloin sekä pilaantuminen että sairauksien välittyminen saadaan estetyksi. Tavallisesti käytetyistä, mikrobeja torjuvista kemiallisista aineista voidaan mainita nitriitit, nitraatit, rikkidioksidi, sulfiitit sekä erilaiset hapot kuten etikkahappo, pro-pionihappo, maitohappo, bentsoehappo ja sorbinihappo sekä niiden suolat, puusavu ja nestemäinen savu, sekä antibiootit kuten natamysiini ja nisiini.

Ruokamyrkytysten estäminen on kaikkein tärkeimpiä tehtäviä f elintarvikkeita jalostavassa teollisuudessa. Huoli elintarvikkeiden turvallisuudesta on johtanut siihen, että useim- 3 105525 missä maissa elintarviketeollisuudelle on asetettu tiukkoja säädöksiä kansalaisten terveyden takaamiseksi. Niinpä jalostettujen elintarvikkeiden valmistajat investoivat huomattavasti varoja tuotteidensa turvallisuuden takaamiseen. Ruokamyrkytyksiä esiintyy näistä ponnisteluista huolimatta. Monet esiintyvät ruokamyrkytykset johtuvat bakteereista, mm. Salmonella-. Clostridium- ja Staphylococcus-sukui en bakteereista.

Elintarvikkeita jalostavassa teollisuudessa kasvavaa huolta aiheuttaa se viimeaikoina tehty havainto, että laajalle levinnyttä Listeria-kontaminaatiota esiintyy siipikarjatuot-teissa ja jalostetuissa elintarvikkeissa kuten Wieninmakka-roissa, muissa makkaroissa, juustossa, maitotaloustuotteissa, mukaan lukien juuri valmistettu jäätelö, sekä merestä saaduissa tuotteissa. Erityistä huolestumista aiheuttavat ne viimeaikoina tehdyt havainnot, että pastöroidut ja täysin kypsennetyt jalostetut elintarvikkeet ovat kontaminoituneet esimerkiksi sellaisilla mikrobeilla kuten Listeria monocytogenes kypsentämisen tai pastöroinnin jälkeen ja ennen niiden pakkaamista myyntipisteitä varten. Tällaisen kontaminoitumisen, jota esiintyy tyypillisesti tuotteen pinnalla, uskotaan johtuvan siitä, että mikrobit pääsevät kosketukseen elintarvikkeen pinnan kanssa lämpökäsittelyn (eli kypsentämisen tai pastöroinnin) jälkeen. Mikrobeja, esimerkiksi Listeria-bakteereia. voi olla läsnä ilmassa (eli ne voivat kulkeutua pölyn mukana), tai niitä voi esiintyä elintarvikkeiden kanssa kosketukseen joutuvilla pinnoilla kuten jalostuslaitteistossa.

* ' ·

Maailmassa todettiin 1980-luvulla useita ruokamyrkytysesiin-tymiä, joiden aiheuttajaksi epäiltiin tai tunnistettiin Listeriä-bakteeri11a kontaminoituneet elintarvikkeet. Ihmisissä esiintyneitä listerioosisairauksia (Liiteriä-bakteerin aiheuttamaa infektiota) on todettu Yhdysvalloissa Massachusetts:in, Kalifornian ja Pennsylvanian osavaltiois-?’ . sa sekä myös Kanadassa ja Sveitsissä. Näiden tautiesiinty- mien on todettu johtuvan Listeriä-bakteeri11a kontaminoitu- 4 105525 neiden elintarvikkeiden kuten kaalisalaatin, raakamaidosta tehdyn juuston, pintakypsytettyjen pehmeiden juustojen ja salamin nauttimisesta. Satoja henkilöitä on sairastunut, kuolleisuuden ollessa jopa kolmasosa sairastuneista. Tämän (tarttuvan) sairauden saavat erityisen helposti raskaana olevat naiset, sikiöt, vastasyntyneet ja pikkuvauvat sekä aikuiset henkilöt, joiden immuunijärjestelmä on heikentynyt, esimerkiksi sellaiset aikuiset, joita hoidetaan esimerkiksi sellaisilla immuunijärjestelmää tukahduttavilla lääkkeillä kuten kortikosteroideilla.

Listerioosi on vakava sairaus, joka voi aiheuttaa aivokalvon tulehduksen (meningitis) , spontaanin abortin ja syntymättömälle lapselle verenmyrkytyksen. Kun sairaus diagnos-toidaan varhaisessa vaiheessa, se voidaan hoitaa, kun taas hoitamattoman listerioosin tapauksessa kuolleisuus on suuri.

Elintarvikkeiden säilöminen siten, että Listeria monocytogenes -bakteerin kasvu saadaan estetyksi, on vaikeata. Nykyisten tietojen mukaan Listeria kykenee lisääntymään ja kasvamaan sekä aerobisesti että anaerobisesti, arvon 4,85 ylittävässä pH.-ssa ja laajalla lämpötila-alueella, jonka pienimmät arvot voivat olla jopa vain noin 3 °C ja suurimmat arvot jopa noin 45 °C. Tämä tarkoittaa sitä, että Listeria kykenee kasvamaan normaaleissa jäähdytyslämpötiloissa. Samoin tiedetään, että Listeria kykenee kasvamaan vesiliuoksissa, joiden suolapitoisuus on jopa 10 %. Onneksi keittäminen ja pastöroiminen tappavat Listeriä-bakteerin. Valitettavasti elintarvikkeen jalostaja voi kuitenkin aiheuttaa kontaminoitumisen mikro-organismilla pastöroinnin jälkeen. Monet ihmiset nauttivat jalostettuja elintarvikkeita vasta sitten, kun huomattavan pitkä ajanjakso on kulunut elintarvikkeen ensimmäisen kypsentämisen tai pastöroinnin jälkeen, mikä tekee mahdolliseksi pastöroinnin jälkeen elintarvikkeisiin joutuneiden kontaminoivien bakteereiden kasvun. Koska elintarvikkeen nauttiminen voi tapahtua kuumentamatta jalostettua elintarviketta riittävän korkeaan lämpötilaan riittä- 5 105525 vän pitkäksi ajaksi mahdollisten, elintarvikkeeseen alustavan kypsentämisen jälkeen joutuneiden mikrobien (kuten Lis-terian) tappamiseksi, niin olemassa on ruokamyrkytyksen vaara. Oheisen keksinnön tehtävänä on tämän vaaran pienentäminen.

Keksinnön tavoitteena on saada aikaan uusi bakteereita torjuva koostumus, joka käsittää yhdistelmänä Pediococcus-bakteerista saatua tai vastaavanlaista synteettistä bakte-riosiinia kuten pediosiinia sekä kelatoivaa tai komplekseja muodostavaa ainetta.

Keksinnön toisena tavoitteena on saada aikaan kalvo, jonka sisältämä, lämpöä kestävä ja mikrobeja torjuva aine käsittää Pediococcus-bakteerista saatua tai vastaavanlaista synteettistä bakteriosiinia kuten pediosiinia sekä kelatoivaa tai komplekseja muodostavaa ainetta.

Keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan kalvo, jonka sisältämä, bakteereja torjuva koostumus kykenee tappamaan Lister ia -bakteereita ja/tai estämään sen kasvua.

Keksinnön tavoitteena on saada aikaan polymeerikalvo, joka kykenee siirtämään säädetyn määrän mikrobeja torjuvaa ainetta elintarvikkeen pinnalle.

Keksinnön muuna tavoitteena on menetelmä elintarvikkeen pinnalla esiintyvien patogeenisten mikro-organismien tappamiseksi, torjumiseksi tai niiden kasvun ehkäisemiseksi siirtämällä säädetty määrä mikrobeja torjuvaa ainetta elintarvik-keen pinnalle.

Keksinnön muuna tavoitteena on mikrobeja torjuvan aineen siirtäminen elintarvikkeeseen sellaisena tehokkaana määränä, joka estää mainitun kalvon poistamisen jälkeen elintarvikkeen pinnalla esiintyvien patogeenisten bakteereiden ·' - kasvun elintarvikkeen normaalin säilytys jakson ajan.

s 105525 Ο

Keksinnön muuna tavoitteena on estää tai torjua Listeria monocytogenes -bakteerin kasvu kuorettomien wieninmakkaroiden pinnalla alustavan kypsentämisen ja kuorenpoiston jälkeen pakkaamalla ne kuluttajille myymistä varten siihen saakka, kunnes kuluttaja avaa pakatut wieninmakkarat niiden nauttimiseksi .

Keksinnön muuna tavoitteena on pidentää jalostettujen elintarvikkeiden säilyvyyttä käsittelemällä ne Pediococcus-bakteerista saadun (tai vastaavanlaisen synteettisen) bakte-riosiinin sekä kelatoivan aineen seoksella, joka on edullisesti neste tai suspensio.

Keksinnön edellä esitetyt ja muut tavoitteet, jotka ovat ilmeisiä seuraavan kuvauksen perusteella, voidaan saavuttaa käsittelemällä elintarvike, edullisesti elintarvikkeen pinta, mikrobeja torjuvalla aineella, edullisesti kelatoi-valla aineella kuten sitruunahapolla, jota käytetään yhdessä Pediococcus-bakteerista saadun bakteriosiinin kuten pedi-osiinin kanssa. Tämä käsittely voidaan toteuttaa millä tahansa sopivalla tavalla kuten ruiskuttamalla, kastamalla, sekoittamalla tai saattamalla elintarvike kosketukseen mikrobeja torjuvaa ainetta sisältävän kalvon kanssa. Tämä kalvo voi pitää aineen kosketuksessa elintarvikkeen pinnan kanssa siten, että säädetty määrä tätä ainetta siirtyy kalvosta elintarvikkeen pinnalle, tai kalvosta voi siirtyä mikrobeja torjuvaa ainetta (siirtoainetta kuten tseiiniä käyttäen tai käyttämättä) elintarvikkeeseen siten, että kun kalvo poistetaan, niin siirtynyttä mikrobeja torjuvaa ainetta jää elintarvikkeen pinnalle tehokas määrä, joka tappaa tai torjuu joko elintarviketta pilaavia organismeja tai * patogeenisiä mikro-organismeja kuten Listeriabakteereita tai ehkäisee niiden kasvun.

Keksinnön erään piirteen mukaisesti aikaan saadaan elintarvikkeiden pakkauskalvo, jonka käsittämä polymeerikalvo sisältää bakteereja torjuvaa, lämpöä kestävää, Pediococcus-bakteereista saatua (tai vastaavanlaista synteettistä) bak- 7 105525 teriosiinia. On edullista, että tämä aine torjuu tehokkaasti gram-positiivisten bakteereiden, erityisesti Listeria monocytogenes-bakteerin kasvua, ja se voi olla lämpöä kestävä antibiootti tai bakteriosiini kuten bakteriosiini PA-1.

Välttämätöntä ei ole se, että kaikki edellä mainitut tavoitteet saavutettaisiin keksinnön kaikilla suoritusmuodoilla; riittää, että keksintöä voidaan käyttää edullisesti.

Keksinnön mukaiselle koostumukselle on olennaista komplekseja muodostavan tai kelatoivan aineen kuten EDTA-suolan tai sitruunahapon ja Pediococcus-bakteerista saadun (tai vastaavan synteettisen) bakteriosiinin kuten pediosiini PA-l:n välinen synergistinen yhdistelmä.

Erään keksinnön mukaisen menetelmän olennainen piirre on elintarvikkeen pinnan suojaaminen olennaisen ajanjakson ajan kalvon poistamisen jälkeen.

Keksinnön mukaisen kalvon erään suoritusmuodon olennainen piirre on se, että siinä käytetään lämpöä kestävää, mikrobeja torjuvaa ainetta, joka kykenee torjumaan bakteereita pastöroinnin tai lämpökäsittelyn jälkeen.

« • Uudella mikrobeja torjuvalla koostumuksella, joka käsittää synergistisenä yhdistelmänä Pediococcus-bakteerista saatua bakteriosiinia kuten pediosiinia (tai jotakin synteettistä vastinetta) sekä kelatoivaa ainetta kuten sitruunahappoa, on todettu odottamattoman hyviä bakteereja tappavia ominaisuuksia, jotka kohdistuvat erityisesti patogeenisiä bak- » »f teereita kuten Listeria monocvtoaenes-bakteeria vastaan. Lisäksi keksinnön mukainen koostumus kykenee yllättäen pidentämään elintarvikkeen säilyvyyttä estämällä elintarvikkeen pilaantuminen sellaisen ajanjakson ajan, joka on pitempi kuin mitä olisi odotettavissa koostumuksen kummankin, yksinään käytetyn komponentin tehokkuuden perusteella.

105525 8

Oheisessa keksinnössä voidaan käyttää Pediococcus-bakteerei-den tuottamaa bakteriosiinia. Pediococcus-bakteerit ovat maitohappobakteereita, joita käytetään lähtöviljelminä fermentoituja makkaroita valmistettaessa. Pediococcus-bak-teereiden tiedetään estävän sekä patogeenisten että pilaavien mikro-organismien kasvua. Julkaisussa Hoover et ai., "A Bacteriocin Produced by Pediococcus Species Associated with a 5.5-Megadalton Plasmid", Journal of Food Protection, voi. 51, no. 1, sivut 29-31 (tammikuu, 1988), joka liitetään kokonaisuudessaan tällä viittauksella oheiseen hakemukseen, on kuvattu 5,5 megadaltonin plasmidiin yhdistetyn Pediococcus-lai in tuottama bakteriosiini, jonka todetaan estävän tehokkaasti useiden Listeria monocytogenes-kantoien kasvua. Monista erilaisista Pediococcus-lajeista saatujen bakteriosiinien tiedetään torjuvan tai tappavan tehokkaasti Listeria monocytogenes-bakteereia tai estävän niiden kasvua. Erityisesti tiedetään, että Pediococcus acidilactici-bakteerin tuottama bakteriosiini torjuu tehokkaasti Liste-ria monocvtoaenes-bakteereita. Julkaisussa Pucci et ai., "Inhibition of Listeria Monocytogenes by Using Bacteriocin PA-1 Produced by Pediococcus acidilactici PAC 1,0", Applied and Environmental Microbiology, vol. 54, no. 10, sivut 2349-2353 (lokakuu 1988), joka liitetään kokonaisuudessaan oheiseen hakemukseen tällä viittauksella, Pediococcus acidi- v laetiei-bakteerin esitetään tuottavan Listeria-bakteereita erittäin tehokkaasti torjuvaa ainetta. Mainitussa julkaisussa tarkastellusta Pacidilactici-kannasta käytettiin merkintää PAC 1,0, ja sen tuottama bakteriosiini, josta käytettiin merkintää PA-1, torjui hyvin tehokkaasti Listeria monocytogenes-bakteereita käytettäessä siirrosteita, joiden alkuperäinen bakteeripitoisuus oli 1,2 x 102/ml. PA-l-bakte-riosiinia tuottaa yhtiö Microlife Technics, Sarasota, Florida. Sekä Pediococcus pentosaceus- että Pediococcus acidilactici-kannan tuottamaa bakteriosiinia kutsutaan ohessa pediosiiniksi.

« 9 105525

Sopivista kelatoivista (komplekseja muodostavista) aineista voidaan mainita karboksyylihapot, polykarboksyylihapot, aminohapot ja fosfaatit. Käyttökelpoisiksi oletetaan erityisesti seuraavat yhdisteet ja niiden suolat: etikkahappo, adeniini, adipiinihappo, ADP, alaniini, β-ala-niini, albumiini, arginiini, askorbiinihappo, asparagiini, aspartiinihappo, ATP, bentsoehappo, n-voihappo, kaseiini, sitrakonihappo, sitruunahappo, kysteiini, vedetön etikka-happo, desferri-ferrikrysiini, desferri-ferrikromi, desfer-ri-ferrioksamiini E, 3,4-dihydroksibentsoehappo, dietylee-nitriamiinipentaetikkahappo (DTPA), dimetyyliglyoksiimi, O,O-dimetyylipurpurogalliini, EDTA, muurahaishappo, fumaari-happo, globuliini, glukonihappo, glutamiinihappo, glutaari-happo, glysiini, glykolihappo, glysyyliglysiini, glysyyli-sarcosiini, guanosiini, histamiini, histidiini, 3-hydroksi-flavoni, inosiini, inosiini-trifosfaatti, raudaton ferri-kromi, isovaleerihappo, itakonihappo, kojihappo, maitohappo, leusiini, lysiini, maleiinihappo, maliinihappo, metio-niini, metyylisalisylaatti, nitrilotrietikkahappo (NTA), ornitiini, ortofosfaatti, oksaalihappo, oksysteariini, β-fenyylialaniini, fosforihappo, fytaatti, pimeelihappo, pivaalihappo, polyfosfaatti, proliini, propionihappo, purii-ni, pyrofosfaatti, palorypälehappo, riboflaviini, salisyyli-aldehydi, salisyylihappo, sarkosiini, seriini, sorbitoli, ’* meripihkahappo, viinihappo, tetrametafosfaatti, tiosulfaat- ti, treoniini, trimetafosfaatti, trifosfaatti, tryptofaani, uridiinidifosfaatti, uridiinitrifosfaatti, n-valeerihappo, väliini ja ksantosiini.

Monia näistä edellä mainituista, komplekseja muodostavista aineista voidaan käyttää elintarvikkeita jalostettaessa suoloinaan, jotka ovat tavallisesti alkalimetalli- tai maa-al-kalimetallisuoloja kuten natrium-, kalium- tai kalsiumsuolo-ja tai kvaternäärisiä ammoniumsuoloja. Komplekseja muodostavia, valenssiltaan moninkertaisia yhdisteitä voidaan käyttää edullisesti pH-arvon säätämiseen tai metalli - ionien se- lektiiviseksi liittämiseksi tai poistamiseksi esimerkiksi elintarvikejärjestelmän pinnoitteesta. Lisätietoutta kom- 10 105525 plekseja muodostavista ja kelatoivista aineista on löydettävissä teoksista T. E. Furia (toim.), CRC Handbook of Food Additives, 2. painos, sivut 271-294 (1972, Chemical Rubber

Co.), sekä M.S. Peterson and A.M. Johnson (toim.), Encyclopedia of Food Science, sivut 694-699 (1978, AVI Publishing

Company, Inc.), jotka kummatkin mainitut artikkelit liitetään oheen tällä viittauksella.

Käsitteitä "kelatoiva aine" ja "komplekseja muodostava aine" käytetään ohessa toistensa synonyymeinä, ja ne määritellään orgaanisiksi tai epäorgaanisiksi yhdisteiksi, jotka kykenevät muodostamaan koordinaatiokomplekseja metallien kanssa.

Samoin oheessa käytetty käsite "kelatoiva aine" kattaa mole-kyyliset kapseloivat yhdisteet kuten syklodekstriinin. Kelatoiva aine voi olla epäorgaanista tai orgaanista, sen ollessa edullisesti orgaanista.

Edulliset kelatoivat aineet eivät ole toksisia nisäkkäille ja niistä voidaan mainita aminopolykarboksyyylihapot ja niiden suolat kuten etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) tai sen suolat (erityisesti sen di- ja trinatriumsuolat) sekä hydrokarboksyyylihapot ja niiden suolat kuten sitruuna-happo. Kuitenkin oletetaan, että keksinnössä voidaan käyttää kelatoivina aineina myös muuta kuin sitruunahappoa tai muuta kuin sitraatti-hydrokarboksyylihappoa kuten etikka-happoa, muurahaishappoa, maitohappoa, viinihappoa ja niiden suoloj a.

* ·

Kuten edellä mainittiin, käsite "kelatoiva aine" on määritelty ja sitä käytetään ohessa komplekseja muodostavan aineen synonyyminä ja sen katsotaan myös kattavan molekyyli-set kapseloivat yhdisteet kuten syklodekstriinin. Syklodeks-triinit ovat syklisiä hiilihydraattimolekyylejä, joiden käsittämät kuusi, seitsemän tai kahdeksan glukoosionomeeria : . ovat järjestäytyneet toroidin muotoiseksi renkaaksi. Niitä kutsutaan vastaavasti alfa-, beeta- ja gamma-syklodekstrii- n 105525 niksi. Syklodekstriinillä viitataan ohessa sekä muokkaamattomiin että muokattuihin syklodekstriinimonomeereihin ja -polymeereihin. Syklodekstriiniä olevia molekulaarisia kapselinmuodostajia on saatavana kaupallisesti yhtiöstä American Maize-Products, Hammond, Indiana. Syklodekstrii-nejä on kuvattu yksityiskohtaisemmin teoksen Inclusion Compounds. voi III (Academic Press, 1984) kappaleessa 11, sivut 331-390 (J. Szejtli, "Industrial Applications of

Cyclodextrin") , joka kappale liitetään oheen tällä viittauksella .

Seoksia, jotka sisältävät Pediococcus-peräistä bakteriosii-nia kuten pediosiinia sekä yhtä tai useampaa kelatoivaa ainetta, voidaan käyttää keksinnön mukaisesti. Nämä seokset voivat olla kiinteinä nestesuspensioissa tai liuoksina. Mikäli toisin ei mainita, ohessa käytetty käsite "liuos" ei tarkoita ainoastaan nesteeseen liuenneita kiintoaineita tai nesteitä vaan myös kiintoaine-nesteessä-suspensioita tai -seoksia. Kelatoivaa ainetta ja bakteriosiinia sisältävän seoksen sopivia liuottimia, laimentimia tai kantajia ovat esimerkiksi vesi, alkoholi, propyleeniglykoli, öljyt kuten mineraali-, eläin- tai kasviöljy, glyseriini tai lesitiini.

Vaikka kaupallisesti saatavat bakteriosiinit voivatkin si-sältää maitotaloustuotteita, niin kuitenkin saattaa olla edullista, ettei keksinnön mukainen bakteereja tappava koostumus tai elintarvikkeita säilövä valmiste sisällä lainkaan lisättyjä maitotaloustuotteita kuten juustoa, heraa, juoksettunutta maitoa tai kalsiumia sisältävää, maitoon perustuvaa kintoainetta. Vaikka ohessa ei haluta- « kaan rajoittua mihinkään oletukseen, niin kuitenkin erityisen edullisia saattavat olla kalsiumia ja/tai magnesiumia kelatoivat aineet. Keksinnön mukainen seos, joka sisältää bakteriosiinia ja kelatoivaa ainetta, voidaan levittää elintarvikkeisiin kuten maitotaloustuotteisiin ja muihin kuin maitotaloustuotteisiin kuten makkaroihin, muihin liha- : - tuotteisiin, vihanneksiin ja hedelmiin millä tahansa perin teisellä pinnoitusmenetelmällä, esimerkiksi ruiskuttamalla 12 105525 tai kastamalla elintarvike liuokseen tai käyttämällä kyllästettyä tai pinnoitettua kalvoa jäljempänä kuvatulla tavalla. Näiden liuosten pH voidaan asettaa hyvin laajalle pH-alueelle, näiden liuosten ollessa kuitenkin edullisesti neutraaleja tai happamia. Oletetaan, että happamat liuokset edistävät tai ylläpitävät näiden uusien liuosten mikrobeja torjuvaa vaikutusta ja näin ollen ne ovat edullisia. Edullisia ovat liuokset, joiden pH on pienempi tai yhtäsuuri kuin noin 6 ja erityisen edullisia ovat liuokset, joiden pH on pienempi tai yhtäsuuri kuin 5. Seoksessa komponentteina läsnäolevien bakteriosiinin ja kelatoivan aineen määrät voivat vaihdella riippuen esimerkiksi sellaisista tekijöistä kuin bateriosiinityypistä, kelatoivan aineen tyypistä, pH-arvosta, muista läsnäolevista aineosista (esimerkiksi liuoksessa käytetyn liuottimen tyypistä), käyttötavasta eli siitä, minkä tyyppiseen elintarvikkeeseen näitä materiaaleja levitetään, miten levittäminen toteutetaan (esim. sekoittamalla elintarvikkeeseen tai pinnoittamalla se) , myöhemmistä jalostusolosuhteista (esim. lämpökäsittely) , siitä toivotusta ajanjaksosta, jonka ajan seos vaikuttaa bakteereja tappavasti tai torjuvasti, sekä siitä bakteerityypistä, jota vastaan elintarvike halutaan suojata, jne. Alan asiantuntija kykenee määrittämään bakteriosiinin ja kelatoivan aineen sopivan määrän ilman suuritöistä kokeilua. Vesi on edullinen liuotin valmistettaessa liuos esimerkiksi kasta-miskäsittelyä varten. Bakteriosiinin sopiva määrä elintarvikkeiden kuten makkaroiden käsittelyyn tarkoitetussa seoksessa on 5-250 ppm bakteriosiinia (seoksen kokonaispainosta) tai enemmän. Alle 5 ppm:n määrät ovat mahdollisia, mutta ne voivat olla käyttösovellutuksesta riippuen tehotto-. mampia kuin suuremmat pitoisuudet. Myös yli 250 ppm:n mää rät ovat mahdollisia, mutta suurien pitoisuuksien haittana on se, että ne lisäävät kustannuksia bakteriosiinin kalleudesta johtuen. Alueella 50-150 ppm olevat pitoisuudet on todettu tehokkaiksi ja kustannuksiltaan edullisiksi, ja 150 ppm:n tai sitä suuremmat pitoisuudet on todettu hyvin tehok-: - käiksi ajatellen esimerkiksi sellaisen patogeenisen baktee rin kuten Listeria monocytogenes-bakteerin tuhoamista tai 105525 torjumista esimerkiksi kypsennettyjen frankfurtinmakkaroi-den pinnalta. Keksinnön mukaisella liuoksella voidaan myös torjua muita bakteereita ja se on erityisen tehokasta gram-positiivisia bakteereita vastaan. Kelatoivan aineen käytetyt määrät voivat vaihdella laajalla alueella, esimerkiksi noin alueella 0,2-0,8 tai 3,0 paino-% tai tätä suurempia määriä voidaan käyttää. Keksinnön mukainen koostumus voi myös sisältää muita mikrobeja tai bakteereita torjuvia aineita tai muita lisäaineita kuten väriaineita ja flavori-aineita, esimerkiksi kaasumaista tai nestemäistä savua.

Oheisessa keksinnössä käyttökelpoisista elintarvikkeiden pakkauskalvoista voidaan mainita esimerkiksi sellaiset poly-meerikalvot kuten puhallettu kalvo, suunnattu kalvo, venyvä ja kutistuva kalvo, lämmössä kutistuvat pussit ja elintarvi-kepäällykset. Ohessa käytetyllä käsitteellä "elintarvikkeiden pakkauskalvot" tarkoitetaan taipuisia arkkimateriaale-ja, joiden paksuus on sopivasti 15 mil (n. 0,38 mm) tai vähemmän, ja edullisesti alle 10 mil (25 mikronia).

Sopivista kalvoista voidaan mainita regeneroidusta selluloosasta valmistetut kalvot ja termoplastiset venyvät tai kutistuvat kalvot, jotka voivat olla yksikerroksisia tai monikerroksisia kalvoja. Kutistuvat kalvot on tehty edulli-·' sesti lämmön vaikutuksesta kutistuviksi, kaksiakselisesti suunnatuiksi pusseiksi.

Sopivista kalvoista voidaan mainita elintarvikepäällykset, jotka ovat yleensä taipuisia kalvoja, ja jotka ovat edullisesti putkimaisia ja jotka on voitu valmistaa polymeerimate-.. riaaleista, mukaan lukien selluloosamateriaalit kuten re generoitu selluloosa tai selluloosakarbamaatti, tai muoveista kuten polyolefiinien homopolymeereista tai kopolymee-reista, esimerkiksi polypropyleenista, polyetyleenistä tai polyamideista, polyetyleenitereftalaatista, polyvinylideeni-kloridin kopolymeereista tai etyleeni-vinyyliasetaatti-ko-: polymeereistä, tai valkuaisainekalvoista kuten kollageenis ta. Mainitut päällykset ovat edullisesti putkimaisia sellu- 14 105525 loosasuolia, jotka on valmistettu millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä. Nämä suolet ovat yleensä taipuisia, ohutseinäisiä, saumattomia putkia, jotka on valmistettu edullisesti regeneroidusta selluloosasta tai muusta vastaavasta, ja joiden halkaisija vaihtelee laajalla alueella. Sopivia ovat myös putkimaiset selluloosaa olevat suolet, joiden seinämään on upotettu vahvistava kuituraina. Vahvistavan rainan käsittäviä päällyksiä kutsutaan yleisesti "elintarvikkeiden kuitusuoliksi", kun taas selluloosa-päällyksiä, joissa ei ole kuituvahvistusta, kutsutaan ohessa "kuiduttomiksi" selluloosasuoliksi. Oheisessa keksinnössä voidaan käyttää sekä luonnollisia että synteettisiä suolia.

Oheisen keksinnön käytännön toteutuksessa voidaan käyttää suolia, joita nimitetään perinteisesti "kuivina varastoitaviksi suoliksi". Näiden suolten vesipitoisuus on yleensä noin 5-14 paino-% vettä, mikäli kysymyksessä on kuiduton suoli, tai noin 3-8 paino-% vettä, mikäli kysymyksessä on kuitusuoli, laskien suolen kokonaispainosta, vesi mukaan lukien.

Perinteisesti "geelimäisinä varastoitavat suolet" tunnetut suolet ovat sellaisia suolia, joiden kosteuspitoisuus on suurempi, koska niitä ei olla kuivattu edeltäkäsin, ja myös tällaisia suolia voidaan käyttää keksintöä toteutettaessa.

Perinteisesti "uudestaan kostutettuina suolina" tunnetut suolet ovat kuivia varastosuolia, joihin on lisätty kosteutta, esimerkiksi rypyttämisen ja/tai täytön helpottamiseksi, •« .. ja myös tällaista suolta voidaan käyttää keksintöä toteutet taessa. Näiden suolten vesipitoisuus on yleensä noin 15-23 paino-%, mikäli kysymyksessä on kuiduton suoli, tai noin 16-35 paino-%, mikäli kysymyksessä on kuitusuoli, laskien suolen kokonaispainosta, vesi mukaan lukien.

15 105525

Oheisessa keksinnössä käyttökelpoisista, mikrobeja torjuvista aineista voidaan mainita kaikki sellaiset aineet, jotka saadaan siirtymään tehokkaasti elintarvikkeen pakkauskalvos-ta elintarvikkeeseen, jolloin saadaan aikaan mikrobeja torjuvaa ainetta sisältävä elintarvikkeen pinta, joka aine estää tai torjuu mikro-organismien kasvua tällä pinnalla edullisesti vielä silloinkin, kun kalvo on poistettu kosketuksesta elintarvikkeen pinnan kanssa.

Sopivat mikrobeja torjuvat aineet voivat olla tehokkaita homeita, hiivoja ja/tai bakteereita vastaan. Oletetaan, että sopivia aineita ovat esimerkiksi sellaiset bakteereja torjuvat aineet, jotka vaikuttavat bakteereja tuhoavasti tai torjuvasti, esimerkiksi antibiootit kuten nisiini, natamysii-ni, subtiilini tai Pediococcus-oeräinen bakteriosiini, lämpöä kestävät entsyymit kuten lysotsyymi sekä muut aineet kuten nestemäinen savu, parabeenit, sorbiinihappo, bentsoe-happo ja niiden seokset.

Tällaiset mikrobeja torjuvat aineet voivat sisältää esimerkiksi sellaisia lisäaineita kuten sideaineita, puskureita, emulgaattoreita, siirtymistä helpottavia aineita tai kela-toivia aineita kuten etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) tai sen suoloja. Nämä aineet voivat edistää aineen mikrobeja torjuvaa vaikutusta tai helpotta siirtymistä pakkauskalvosta elintarvikkeeseen.

Erityisesti sideaineita, esimerkiksi vesiliukoisia aineita kuten shellakkaa ja tseiiniä voidaan käyttää siirtäjinä tai siirtoaineina, jotka saavat samoin sisälletyn, mikrobeja • < torjuvan aineen siirtymään pakkauskalvosta elintarvikkeen pinnalle kostuttavissa olosuhteissa. Edulliset side- tai siirtoaineet suosivat elintarvikkeen pintaa pakkauskalvoon verrattuna.

Keksinnön mukainen elintarvikkeiden pakkauskalvo sisältää ’ - kalvon pinnalla tai kalvossa mikrobeja torjuvaa, edullises ti bakteereja torjuvaa ainetta. Tällainen aine vaikuttaa 16 105525 edullisesti bakteereja kuten esimerkiksi Listeria-, Salmonella- ja Clostridium-sukujen bakteereita, ja edullisesti Listeria monocytogenes-lajin bakteereita tappavasti, torjuvasti tai niiden kasvua estävästi.

Edulliset bakteereita torjuvat aineet vastustavat tuhoutumista tai inaktivoitumista lämmön vaikutuksesta, esimerkiksi kypsentämis- tai pastörointilämpötiloissa ja -ajanjaksojen ajan. Välttämätöntä on se, että nämä edulliset aineet kykenevät kestämään pakkauskalvon sisällä olevan elintarvikkeen lämpökäsittelyn ja että ne ovat vielä tehokkaita lämpökäsittelyn ja kalvon poistamisen jälkeen.

Ohessa käytetyllä käsitteellä "lämpöä kestävä" tarkoitetaan sitä, että mikrobeja torjuva aine, jota voidaan sisällyttää kalvoon säädettynä määränä, vastustaa tuhoutumista, inaktivoitumista tai tehokkuuden häviöitä lämpökäsittelyn, esimerkiksi pastöroinnin tai kypsentämisen aikana siten, että lämpökäsittelyn jälkeen elintarvikkeen, johon ainetta sisällytettiin, pinnalla on jäljellä riittävästi ainetta, joka vaikuttaa mikro-organismeja tappavasti, torjuvasti tai niiden kasvua estävästi. On selvää, että aineen määrässä tai aineen tehokkuudessa voi tapahtua pientä häviämistä, ja että aine voi myös inaktivoitua osittain. Riittää kuitenkin, että jäljelle jäänyt aktiivinen aine kykenee suojaamaan elintarvikkeen pinnan patogeenisiä organismeja kuten Liste-ria-bakteereja vastaan.

Keksinnön tyypillisessä sovellutuksessa elintarvikkeen putkimaista selluloosasuolta, joka voi olla kyllästetty tai pinnoitettu mikrobeja torjuvalla aineella, käytetään kuorettomien wieninmakkaroiden valmistukseen. Tässä hyvin tunnetussa makkaroiden pastörointimenetelmässä suoli täytetään lihaemulsiolla ja siitä kieputetaan erillisiä makkaroita. Sitten tämä päällystetty lihaemulsio, jolle suoli antaa lopullisen muodon, kypsennetään (lämpökäsitellään) sopivas-: -- sa lämpötilassa sopivan pituisen ajanjakson ajan pastöroin nin toteuttamiseksi. Lihatuotteita, makkarat mukaan lukien, I’ 105525 pidetään tyypillisesti (jopa pastöroinnin aikana) alle noin 88 °C:n lämpötiloissa ennen niiden myymistä kotitalouksien tai laitosten käyttöön. Yleensä pastöroinnin aikana elintarvikkeen, esimerkiksi jalostetun lihan sisälämpötila nostetaan alueelle, joka on yli noin 63 °C mutta alle noin 82 °C ennen jalostuksen aikana tuotteen muotoiluun mahdollisesti käytetyn kalvon poistamista. Näiden pastöroitujen elintarvikkeiden pintalämpötila ei tyypillisesti nouse suuremmaksi kuin 88 °C, tämän lämpötilan pysyessä tavallisesti pienempänä kuin 77 °C. Tämän jälkeen näitä päällystettyjä wienin-makkaroita voidaan jalostaa tai käsitellä edelleen, esimerkiksi suihkuttamatta niiden päälle vettä ja/tai jäähdyttämällä. Tämän jälkeen suoli poistetaan lämpökäsitellyistä wieninmakkaroista hyvin tunnetulla kuorimisvälineellä, minkä jälkeen wieninmakkarat pakataan uudestaan vähittäiskauppaa varten.

Keksinnön eräässä suoritusmuodossa suoli on kuorittava suoli, joka soveltuu erityisen hyvin erittäin nopeaan koneelliseen kuorimiseen ja suolen poistoon. Alalla tunnetut suolet voidaan kuoria joko käsin tai koneellisesti. Kaikki suolet, jotka voidaan kuoria käsin, eivät sovellu erittäin nopeaan koneelliseen kuorimiseen, jossa käytetään esimerkiksi hyvin tunnettua Apollo Peeler-kuorijaa, jonka valmistaja on Ranger Tool Company, Inc., Bartlett, Tennesee. Tämä ja samankaltaiset kaupalliset kuorimiskoneet kykenevät poistamaan suolet 40 000 - 60 000 makkarasta tunnissa.

Näin ollen mikrobeja torjuvan aineen, jota sisällytetään päällykseen ennen sen täyttämistä, on kestettävä tämän läm-.. pökäsittelyn ja jalostusvaiheiden vaikutuksia, ja sen on säilytettävä epätoivottuja mikro-organismeja tappava, torjuva tai niiden kasvua estävä vaikutuksensa lämpökäsittelyn jälkeen. Lisäksi tämän aineen on siirryttävä elintarvikkeeseen tehokkaana määränä, koska päällys poistetaan. Wienin-makkaroiden pinta voi kontaminoitua mikrobeilla päällyksen : - poistamisen jälkeen ja ennen makkaroiden pakkaamista.

is 105525

Vaihtoehtoisesti mikrobeja torjuvaa ainetta kuten keksinnön mukaista bakteereja torjuvaa koostumusta voidan sisällyttää elintarvikkeeseen kalvon päällä olevan pinnoitteen avulla, jolla kalvolla elintarvike pinnoitetaan lämpökäsittelyn jälkeen, tai tällaista koostumusta voidaan sisällyttää suoraan sekoittamalla sitä elintarvikkeeseen, ruiskuttamalla sitä elintarvikkeen pinnalle tai kastamalla elintarvike tällaiseen bakteereja torjuvaan koostumukseen.

Näin ollen siirtynyttä tai sisällytettyä ainetta tulisi olla läsnä riittävän suurena määränä ja sen tulisi pysyä riittävän tehokkaana lämpökäsittelyn, jalostuksen ja päällyksen poistamisen jälkeen mikrobien, edullisesti Listeria monocytogenes-bakteerien tuhoamiseksi, torjumiseksi tai niiden kasvun estämiseksi riittävän pitkän ajanjakson ajan. Kalvolle levitettyjen aineiden tehoamisajan tulisi ulottua vähintään päällyksen poistamisesta pakkaamiseen saakka, joka pakkaaminen toteutetaan tuotteen myymiseksi esimerkiksi kuluttajille tai laitoksille. Tämä aine pysyy edullisesti tehokkaana normaaliin "viimeiseen myyntipäivään" saakka, jota ennen vähittäiskauppias tarjoaa tuotetta myytäväksi. On edullista, että tämä tehoamisaika jatkuu myös sen jälkeen, kun kuluttaja on avannut pakkauksen, ja että se ulottuu normaalin säilyvyysajan loppuun saakka, jolloin elintar- > · * vikkeen pilaantuminen tulee ilmeiseksi. Kuorettomien wienin-makkaroiden tapauksessa tyypilliset ajat ovat noin 10 minuutista yhteen tuntiin päällyksen poistamisesta kuluttajia varten pakkaamiseen; noin 30-60 vuorokautta kuluttajia varten pakkaamisesta normaalin vähittäismyynnin päättymiseen,· ja noin 7 vuorokautta tai enemmän kuluttajapakkauksen • t .. avaamisesta nauttimiseen saakka tavallisessa jääkaapissa säilyttäen. Joka tapauksessa toivotut ajanjaksot ja normaali säilyvyys vaihtelevat elintarvikkeesta toiseen, ja alan asiantuntijalle on selvää, että pakkausajat ja säilymisajat vaihtelevat elintarvikkeen tyypistä (esim. naudanliha, wieninmakkarat, siipikarja tai juusto), elintarvikkeen * koosta, pakattujen kappaleiden lukumäärästä (kuluttajapak-kaus tai laitospakkaus), säilytyslämpötiloista, jalostus- 105525 19 olosuhteista ja pakkauslaitteistosta riippuen.

Keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti mikrobeja torjuvan aineen siirtyminen elintarvikkeen pinnan kanssa suorassa kosketuksessa olevan ja siihen rajoittuvan kalvon sisäpinnalta tapahtuu siten, että ainetta siirtyy elintarvikkeeseen sen jalostamisen aikana vähintään osittain pysyvästi ja sellaisena määränä, joka riittää vaikuttamaan Listeria-bakteereita tappavasti tai niiden kasvua estävästi elintarvikkeen pinnalla huolimatta siitä, että päällys kuoritaan irti ja poistetaan myöhemmin elintarvikkeesta.

Edellä kuvattu esimerkki ainoastaan havainnollistaa keksintöä, ja sen tarkoituksena ei ole rajoittaa keksinnön soveltamista vain wieninmakkaroihin. Keksintöä voidaan soveltaa mihin tahansa elintarvikkeeseen, erityisesti sellaisiin elintarvikkeisiin, joissa mikrobeja, erityisesti bakteereja torjuvan aineen säädetyn määrän käyttäminen elintarvikkeen pinnalla on hyödyllistä. Keksinnön mukaisia koostumuksia, kalvoja ja menetelmiä voidaan soveltaa sekä eläinkunnasta että kasvikunnasta saatuihin elintarvikkeisiin, joista voidaan mainita kaikentyyppiset makkarat (kuten naudanlihasta, sianlihasta, kananlihasta, kalkkunasta, kalasta ja muista vastaavista tehdyt makkarat), leikatut lihatuotteet, - .· luonaslihatuotteet, kinkut, lampaanliha, paistit, hampuri laiset ja siipikarja kuten kananpojat, kalkkunat, ankka, hanhi, sekä kala- ja maitotaloustuotteet kuten puolipehmeät ja kovat juustot, jalostettu juusto sekä vihannestuotteet kuten salaatti, tofu, kaalisalaatti, soijaan perustuvat proteiinipitoiset lihakorvikkeeet ja muut vastaavat, näihin • · .. kuitenkaan rajoittumatta.

Oheisen keksinnön mukaisessa kalvossa ja/tai menetelmässä voidaan edullisesti käyttää mikrobeja, edullisesti bakteereja torjuvaa lämpöä kestävää ainetta kuten lysotsyymiä, nisiiniä tai bakteriosiini PA-l:ta, jota tuottaa ? - Pediococcus acidilactici PAC 1,0. Nisiini on edellä kuvattu polypeptidinen bakteriosiini.

20 1 0 5 5 2 5 .

Lysotsyymi on entsyymi, joka voi hajottaa bakteereita. Ly-sotsyymi tunnetaan myös N-asetyyliheksosaminodaasina tai 1,4-beeta-N-asetyylimuramidaasina ja sitä voidaan eristää munan albumiinista ja sitä esiintyy runsaasti luonnossa. Koska lysotsyymi on entsyymi, joka hajottaa tai liuottaa bakteerisoluja, niin se tehoaa gram-positiivisia bakteereita kuten Listeria monocytogenes-bakteereita vastaan. Esitettyjen tietojen mukaan lysotsyymi kestää 100 °C:n lämpötilaa aktiivisuuden pienentyessä tällöin vain vähän. Katso esimerkiksi Proctor et ai., "The Chemistry of Lysozyme and Its Use as a Food Preservative and a Pharmaceutical", CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, vol. 26, osa 4, sivut 359-395 (1988), joka liitetään oheen tällä viittauk sella. Lysotsyymiä on saatavana vesiliukoisena valkoisena jauheena yhtiöstä Miles, Inc., Elkhart, Indiana.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä ja kalvossa käytettyjä mikrobeja torjuvia aineita voidaan sisällyttää ennen kalvon muodostamista tai sen jälkeen aineen sirottamiseksi kalvoon tai kalvon pinnoittamiseksi ja/tai kyllästämiseksi, jotta saadaan säädetty määrä mainittua ainetta kalvon pinta-alayksikköä kohden. Tähän tarkoitukseen voidaan myös käyttää ai-neseoksia tai monia eri aineita voidaan sisällyttää peräkkäin. Päällykseen voidaan samalla tavalla sisällyttää kela-toivia aineita, sideaineita, emulgaattoreita ja muita lisäaineita joko samanaikaisesti (joko seoksena tai toisistaan erillään) tai nämä aineet voidaan sisällyttää peräkkäin.

Oheisessa keksinnössä mikrobeja torjuva aine ja lisäaineet • · .. voidaan levittää kalvon, esimerkiksi letkumaisen suolen ulkopinnalle johtamalla päällys mainittua ainetta ja/tai lisäaineita sisältävän liuoshauteen läpi. Aineen voidaan antaa imeytyä päällykseen ennen liuosylimäärän poistamista johtamalla päällys puristustelojen tai pyyhkimien tai muiden vastaavien läpi, tämän imeytymisajan ollessa niin pit- - kä, että päällykseen ehtii sisältyä toivottu määrä mainit tua ainetta ja lisäaineita. Menetelmä, jossa päällys johde- 105525 21 taan käsittelyhauteen (jota voidaan myös kutsua "upotushau-teeksi" tai "upotussäiliöksi") läpi, voidaan myös nimittää upotusvaiheeksi. Aine ja lisäaineet voidaan vaihtoehtoisesti levittää päällyksen ulkopinnalle muillakin kuin upotus-menetelmillä, esimerkiksi ruiskuttamalla, pensselöimällä, telapinnoittamalla, painamalla ja muilla vastaavilla tavoilla .

Vaihtoehtoisesti aine tai lisäaineet voidaan levittää putkimaisen kalvon, esimerkiksi päällyksen sisäpinnalle millä tahansa usealla hyvin tunnetulla menetelmällä, joita on kuvattu nimellä Chiu myönnetyssä US-patenttijulkaisussa 4 171 381, joka liitetään oheen tällä viittauksella. Näistä menetelmistä voidaan mainita tulppa- tai kuplapinnoittaminen, ruiskuttaminen ja pinnoittaminen rypytettäessä.

Tulppamenetelmässä päällyksen sisäpinnan pinnoittamiseksi osa päällyksestä täytetään pinnoittavalla materiaalilla siten, että yleensä pinnoittavaa materiaalia oleva tulppa sijaitsee "U"-kirjaimen muotoisen, kahden sylinteritelan päälle sijoitetun päällyksen pohjalla, minkä jälkeen päällyksen jatkuvaa määrittämätöntä pituutta liikutetaan siten, että pinnoittavaa materiaalia oleva tulppa pysyy päällyksen sisällä päällyksen kulkiessa tämän tulpan ohi, jolloin sen . .· sisäseinä pinnoittuu tulpan muodostavalla pinnoittavalla materiaalilla.

Samoin esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 3 451 827 on kuvattu ruiskutusmenetelmä erilaisten pinnoittavien materiaalien levittämiseksi päällysten, joiden sisähalkaisija on • « .. pieni, sisäpinnalle. Nimellä Shiner et ai. myönnetyssä US- patenttijulkaisussa 3 378 379 käytetään "tulppaan" perustuvaa menetelmää pinnoittavien materiaalien levittämiseksi päällysten, joiden halkaisija on suuri, sisäpinnalle.

Mikrobeja torjuvaa ainetta voidaan levittää kalvon kummalle - tahansa puolelle, kunhan vain elintarvikkeen kanssa koske tukseen joutuva kalvopinta sallii aineen siirtymisen elin- 22 105525 tarvikkeeseen. Esimerkiksi elintarviketta varten tarkoitetun putkimaisen selluloosapäällyksen sisäpinta voidaan pinnoittaa muodostamalla tulppa liuoksesta, joka sisältää ainetta liuenneena tai dispersiona, tai ruiskuttamalla säädetty määrä joko kuivaa tai nestemäistä ainetta. Sitten päällyksen sisäpuoli voidaan täyttää elintarviketuotteella kuten kinkuilla, lihaemulsioilla tai juustolla elintarvikkeen saamiseksi kosketukseen aineen kanssa. Vaihtoehtoisesti päällyksen ulkopinta voidaan pinnoittaa aineella ja päällys voidaan täyttää kääntäen se alalla hyvin tunnetulla tavalla (katso esim. US-patenttijulkaisu 4 162 693) elintarvikkeen saamiseksi kosketukseen aineen kanssa.

Huomattakoon, että kalvon pinnalle pinnoitettu aine, olipa se pinnoitettu uiko- tai sisäpinnalle, voi olla yksinomaan pinnan pinnoitteena, mikä ei ole kuitenkaan välttämätöntä. Aine voi esimerkiksi tunkeutua päällyksen selluloosarakente-eseen, kun selluloosa absorboi ainetta sisältävän liuoksen nestemäistä liuotinta. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää ab-sorboimatonta termoplastista kalvoa tai estopinnoitteen käsittävää selluloosakalvoa, joka estopinnoite estää kyllästymisen, tai monikerroksista kalvoa, joka sallii kyllästymisen estokerrokseen saakka. Näin ollen ohessa käytetty käsite "pinnoite" tarkoittaa sitä, ettei kalvon seinämä ole vält-Y tämättä kyllästynyt mikrobeja torjuvalla aineella, vaan se voi käsittää tätä ainetta pelkästään pinnallaan, mutta tämä käsite pätee myös silloin kun ainetta on sironnut kalvon seinämän sisään tai kun kalvo on kyllästynyt tällä aineella. Joka tapauksessa käytön aikana aineen tulisi vapautua kalvosta ja siirtyä elintarvikkeen pinnalle määränä, joka ;; tarvitaan saamaan aikaan mikrobeja torjuva vaikutus elintar vikkeen pinnalla.

Keksinnön mukaisesti mikrobeja torjuvaa ainetta sisältävät liuokset voivat myös sisältää muita aineosia, jotka soveltuvat kalvon käsittelyyn. Esimerkiksi elintarvikkeen putki-- mainen päällys voidaan pinnoittaa esimerkiksi glyseriinillä ja/tai propyleeniglykolilla, jotka voivat toimia kostuttavi- na aineina tai pehmentävinä aineina, tai muilla vastaavil la, joko liuoksena mikrobeja torjuvan aineen kanssa tai erikseen.

23 105525

Toivottaessa kalvossa tai sen pinnalla voi olla läsnä myös muita aineosia, joita käytetään normaalisti elintarvikkeiden pakkauskalvon valmistuksessa ja jatkokäsittelyssä, ja näitä muita aineosia voidaan käyttää samalla tavalla ja samanlaisina määrinä kuin silloin, kun mikrobeja torjuvaa ainetta ei käytetä. Esimerkiksi selluloosapäällysten yhteydessä käytetään usein selluloosaeettereitä ja mineraaliöljyä ja termoplastisten kalvojen yhteydessä käytetään usein tarttumista estäviä ja antistaattisia aineita.

Kalvo voi olla arkkimainen tai putkimainen. Se voi olla rullana tai katkaistuina pituuksina. Putkimaisesta kalvosta voidaan muodostaa pusseja tavanomaisilla tekniikoilla, esimerkiksi lämpösaumaamalla ja leikkaamalla putken poikki tai se voidaan rypyttää. Kalvo voidaan rypyttää tavanomaisilla menetelmillä.

Tietyn tyyppiset kalvot kuten regeneroitua selluloosaa oleva suoli ennen rypyttämistä voidaan kuivata ja/tai kostuttaa sellaiseen vesipitoisuuteen, joka sopii rypyttämis- : een ja/tai jatkokäsittelyyn. Tavanomaisen kuivaamisen ja/- tai kostuttamisen tarve riippuu suolen vesipitoisuudesta käsittelyn jälkeen, suolityypistä ja sen loppukäytöstä. Oheisessa keksinnössä voidaan käyttää sopivasti sekä gee-limäistä varastopäällystä, kuivaa varastopäällystä että uudestaan kostutettua päällystä.

• I

Keksintöä kuvataan edelleen seuraavilla esimerkeillä, joiden tarkoituksena on ainoastaan havainnollistaa keksintöä sitä millään tavalla rajoittamatta. Mikäli toisin ei mainita, kaikki osuudet ja prosentuaaliset osuudet perustuvat painoon ja kaikki kalvosta tai päällyksestä lasketut osuudet perustuvat kalvon tai päällyksen kokonaispainoon. Maljoilta lasketut bakteerien lukumäärät on laskettu kolmelta 24 105525 maljalta saatujen lukumäärien aritmeettisena keskiarvona, mikäli toisin ei mainita. Bakteerimäärät arvioitiin mikrobiologiassa yleisesti hyväksytyillä menetelmillä.

Esimerkit 1-28

Eri koeliuosten ja erilaisten mikrobeja torjuvien aineiden (nisiini, keksinnön mukainen pediosiini) pitoisuuksien tehokkuus patogeenisten bakteereiden, esimerkiksi gram-posi-tiivisten Listeria monocytogenes- bakteereiden kasvua vastaan määritettiin nesteessä suoritettavalla määritysmenetelmällä. Myös kaikkien aerobisten bakteereiden kasvu mitattiin ja tehokkuus määritettiin samalla tavalla. Samoin tutkittiin kelatoivina aineina käytettyjä etyleenidiamiinitet-raetikkahappoa (dinatriumsuola), sitruunahappoa ja syklo-dekstriiniä sekä yksinään että yhdessä nisiinin tai keksinnön mukaisen pediosiinin kanssa.

Nämä esimerkit toteutettiin aseptisilla tekniikoilla, jotka ovat tuttuja mikrobiologiaa tunteville henkilöille. Steriloituun DIFCO-merkkiseen tryptoosialustaan, jonka väkevyys oli kaksinkertainen, siirrostettiin vähintään noin 10 000 pesäkettä muodostavaa yksikköä (cfu) yhtä millilitraa kohden elintarvikkeesta eristetyn Listeria monocytogenes-serotwpin 4b kahta patogeenistä kantaa. Sitten tällä tavalla siirrostettua elatusalustaa lisättiin koeputkiin, jotka sisälsivät mikrobeja torjuvia koeliuoksia, joiden väkevyys oli kaksinkertainen. Lisätyn elatusalustan ja koeliuosten tilavuudet olivat yhtäsuuret. Koeputket varustettiin korkeilla ja niiden sisältöä sekoitettiin huolella. Koeliuosten komponentit ja määrät on lueteltu taulukoissa la ja Ib. Kokeen jälkeen pH mitattiin samalla tavalla sekoitetuista liuoksista, jotka sisälsivät siirrostamatonta elatusalustaa ja koeliuoksia, ja myös nämä pH-arvot on esitetty taulukoissa la ja Ib. Koeliuoksissa läsnäolevien komponenttien määrät laskettiin "väkevyydel-; tään kaksinkertaisesta" liuoksesta, joka laimennettiin sitten yhtä suurella tilavuudella siirrostettua elatusalus- 2= 105525 taa, kuten edellä on esitetty. Taulukoissa la ja Ib luetellut määrät laskettiin olettaen, että yhtä suuret tilavuudet siirrostettua alustaa ja koeliuosta painoivat yhtä paljon. Sekoitetuista ja siirrostetuista koeliuoksista tehtiin kolme rinnakkaisnäytettä, joita inkuboitiin sekoittamatta noin 30 °C:ssa. Kustakin koenäytteestä otettiin aseptisesti pipetillä 0,3 ml:n näyte välittömästi sekoittamisen jälkeen (ajanhetkellä 0 tuntia), sekä 4, 8, 24 ja 48 tunnin kuluttua. Välittömästi ottamisen jälkeen nämä näytteet maljättiin LPM-agaria ja tryptistä agaria sisältäville maljoille noudattamalla tavanomaisia, mikrobiologiaa tunteville henkilöille tuttuja maljalaskentamenetelmiä Listeria-bakteerei-den lukumäärän ja aerobisten bakteereiden kokonaislukumäärän määrittämiseksi. Selektiivinen Listeria-laskenta toteutettiin menetelmän "FSIS Method for the Isolation and Identification of Listeria Monocytogenes from Processed Meat and Poultry Products" mukaisesti [U.S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service (FSIS), Microbiology Division] (jota menetelmää käytetään tilapäisessä laboratorioiden tunnistusohjelmassa), kuten on kuvattu edellä mainitussa julkaisussa (päivätty 4. marraskuuta 1988 nimellä A.B. Moran, ja päivätty 8. marraskuuta 1988 nimellä R.W. Johnston, FSIS), jota on saatavana FSIS:stä, ja joka liitetään oheen tällä viittauksella. Bakteereiden « ! · lukumääriä esittävät tulokset koeliuosten tiettyjen kompo nenttien ja pitoisuuksien tapauksessa on esitetty taulukoissa la ja Ib kolmelta rinnakkaismaljalta saatujen bakteeri-määrien aritmeettisena keskiarvona yksikössä pesäkkeitä muodostavia yksiköitä (cfu)/ml.

26 105525

oclOOOOOOOOOOOOOOOO©* OOOOOOOOOO CD

«T·—If—(<·Η<—li—1,—Irrti—It—ΙΟ σ'ΐΛίΛΟΟ'^'ι-ίι-ΙΛίΛ CD

νΟΟΓ' vvvvvvvvvvvvO v v H Ο

• * — — O

O Ή © fi □ o ft o m o Γ» *T if\ Γ- 00 Ή

✓~S O

<roooooooooooooooooooooooooooo = voo^ivvvvvvvvvvvvoocMf^moinra m <s o \ M · ft « « ,-> 3 O O O Si O 3

u_ © Is· © U"> f—I 4J

n O O

u - ! c

^ O o' CD

o r~- c

:CD <"1 ι-t C

h a)

ocOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO W •™ If—lOOr^OOvOin^CSO'NO CD

ε VOOOVVVVVVWVWVVVO< O ^r-l H

—5 © O' ΙΓ> Ο Η Ό f Ο Ό <n O' Ή _| £ °- 1

(DO

<-* C

cn ^ π "OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO c vOO^VVVVVVVVVVVV^^ff^i-l^r-frHr-ii-i V g

si" ^ I

•r- x: -* <D ^ COOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO m ,.i fr m

**I ^ νΟ©©ννννννννννν <f O' N <M Ό if) ·<* ιΛ _J

Ή Ή rH Ο Ή rH (- J < ft N H g . ΝΠΌΝΝηΝΗίΛΝΝΝ^ΝΌηΝΗνΟίη^ΗίηΝ^ΜΗΟ oj r-r'O-Or-r-l-'I'ftO Ό Ό OO,<'i’'«r^O<,'^'Oin^^^OOO (2 ϋ -.CD -—· , ί*'5 co oo οοαοοοοοαοοοοοοο ooaoooooooaocoao 2

c :ca I II · · i i I i........i III........S

·· :C0 C I IOOI I I IOOOOOOOOI I I IOOOOOOOO S

EE'- O "

Q. OCOO O O O O

CL CL CL CL Q- CL CL CL CD. r- , CD CL CL CD. G- CL CL CL CL .3 -*-> J3 CDCDCDCD , , ffl D B CO Γ 'H - CD .....c.c:.c.c ·ϊ . - -M < C. <^<^C0CDCDCD fctHHcDCDCOCD.m • e H 3 HHHHCCCC OOOOcccCe

r 03 00003333 MMWM3333S

i MMMW3333 3333 v C N N N N μ l c_ u τί o .1 I <0 r- I I I I I I I I »«»«ij+ijjD 2 Q. CD I I 3- (/3 I I 1 I Ä ϊ ϊ X ·Η -H H Ή I I I 1 Ä fc Ä Ä t* -r H Ή w g cd cn co cn CD CD CO CD “* O --(ΟΟιη-ΗΟΟΙΛΙ^ΟΟιηι-ΙΟΟ>-ΗΉΟΟ·-Ιτ-<ΟΟ^Η c 2i :CD -—- ΟΗΙΛΝΟΗΙΛΝΟΊίΛΝΟΊΐηΗΟΗΛΗΟΗιηΗ '-f

rt, &o OOOr-tOOOftHOOO<-iOOO<-IOOO<HOOO<-· H

- — -rn °Γ O O OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO +J

ID :® C Η H I I OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO <0 co ^ ε — ό v . o ”“* iH ·Η Ή Ή ·Η H ·r-f ·Η ·Η Ή Ή Μ _>

" C0 0 CCCCCCCCCCCC

ι ID ·Η «ι^ ·Η ·Η ·Η Ή Η Ή ·ι-ΐ ·Η Ή ·Η flj * 1 ·Η •ι-!Ή,Η,ί-<·Η·Η·ι^,ΗΉ·ΗΉΉΉ'ΓΤ:τ-ί·ΗΉ·Η·Η·ι··ί·ΗΉ·ΗΉ ,—f _ _ι ccccccccccccci:ö)««(Oö)mcb(Ocdwö) η Ο ·Η Ή Ή Ή Ή Ή Ή Ή Ή Ή Ή. •flOOOOOGOOOOOO (0 ^ ^ ·-< ·Η Ή ·Η ·Μ ·ι-ί ·Η. ·Η Ή ·Η ·Η Ή Ή Ή ·Η Ή ·Η ·Η ·Η ·Η -η ·-! -Η. Ή ·γι o <c aj en cdcdcdcdcdcdcdcdcdcocdcdtdtjxjotdotjotjxitdo ^

—^ ^ (D<DI 1 ·ΐ“, Ή ·γ! ·Η Ή Ή Ή Ή Ή Ή ·Η ·Η ϋ) Φ (D Φ (D 1) (D 0 ί) (D Ο ID CD

^ >5i I ccccccccccccaaaac.adaac.aa e

5 έ CM

μ- (DC »-tcNrD'Cm'er'COCT'Or—if-jm-cu-ivor-oo^O—(ΐΝΓΌ'Τΐ/ΐ'Λί'-ίο H HHrIH HH H H H N N N N N N N N N ♦ 27 1 0 5 5 2 5 caiooooooo +00000000000000000 + o o

__I '311 © Ο © <Γ © © © p-trHi—4iH»-4r-4,-Hi—4©©©OU“>0©0iri+C7O

= ΟΟΟΌΟΟΟ (vvvvvvvOOMmoOOf^O+COCI

v * * * * * .· «k * * « «k «. A

+ o O N O O O O O *—I I—( Ο Ό H <M

(T OOlHOOO OO O rt q ooooo © © cn

O < Lfl I-(Ο ΟΌ <M

oo cn <r <r n eo E < 1-4

D

-COOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO 4-0 0 "1 <M©0©0©00<Ni-4i-li-4i-Hi-li-lr-4i-t©00©©0©0©+©© π

©OOfnOOmiMvvvvvvvvOOOOCIOOOCt vO© J=J

* * · Ä Ä · ««««««««A at ·« m ©oooiHooo» oonoHonuiH η n ΰ

J2 o o 00 O O O O N « sf <f CO S

o °. °. -1^1 ®<* rH . g O O O CO OrH Ν 9 rl Ό CM .

ΙΠ p««* ^ , C dg, -Ϊ ¢00000000000000000000000000000 ,„oo

^000<Ή»Η^^Ι^Η»Η»ΗγΗιΗι—~j n r*i '2 v s/ vOOOOf-finr^OrHr^OO ^ c O

<D or^in 1-4 --4 4+ U-l OO M ΙΛ S Q

-t-> c 1-1 -* π m 5 <+0000000000000000000000000000 g „ pHOO©*—(CM-Hr-1 H H H rI H H rΪρΗ©©©©,—(ΟΟΟρΗρΗΟΟ C —.

v © o* cm v vvv vvvvvvMi-irv.omeoeoomcMmo a) ^ „ t «»« - - - .

ω n ό < ιλ h ιλ o oo oo^ tZ

χ 2 W CM «M Λ4 π 0 u

H '—' CO CD

-g „ cioooooooooooooooooooooooooooo ""’SS

O X pH © © © pH p-I H rt H H f4pHpHpHpHCP>aO©©©CM©0©CM04©© 1—! rH 5v f-4 -X Vi—loovvvvvvvvvvv r-cnooocnp^ooovoo X '

0 ·Ή «»· »«««·« »«E

<< σ»1ΛΟ -H r~4 <N H oo <f β O 1Γ1Γ

CM pH 4-1 C u_ (Z

0 14- 14— c o a cMcnocM(MCP)cM>Hor^r*>ro<4‘<MOc,n<MpHocp)ml-icneMcncMf-io c _ — 3— ···················»«*##*«·# CO ^ oj Γ'Ι*'0·^Γ>'^·Ι*·Ρ^0000'^^·^·^Γ^0<·'<ί0ιΛ·^·<·'^·^,<··^· Ε^ΛΟ I—I CO <J· X '—' 4—1 4—1 f- e? ,, ®° ®° , , , eoooooooeooooooo ccoocoooooecooeo roco C :X I II · · I I I I........I I I I........χ => => ·· :x o. 1 1001 1 1 loooooooo 1 1 1 100000000 x'^”1 0 5-4 m pH -4

o 0000 O O O O O O

a a a a. a c. c. o. a c. a a a a c. c. o. o. c +j -u» .· .X XXXX X X X X =i 0 0 4-i ^ r. x: .e .c x: ^«!<<xxxx_vxx r-ι < x ·<!·<·<·η!χχχχ μμίΗμηοιοη 4- 1 H C HHHHCCCC oooacccc „ a o C O 0 00000000 WWWWS^^^a^H—l x W 0 WMWW0000 0 0 0 0 Ξ 0 0 c CM 4, CM CM CM CM ί- t- U U NMrgN4hPh y4J44 o CD 1 I « 44 I I I 1 <«4«4J4J4J4J I I | | «J «3 «J aj _>4-14-14-) α I 1 SE -rt I I I I Ä S SE SS ·Η ·1Η ί-4 ·ρ4 I I I I a SB SE 2 Η ·Η ·ι-4 ·Η C c c ε x xtnxcn m x x x x x

Ο _ ·ρ4 c C

·~ΙΟΟΙΛΙρΗΟΟιΛρΗΟΟιΛ<-ΙΟΟρΗρΗΟΟρΗι-ΙΟΟι-Η 4->CC

;X ΟΗιΠΝΟΚΚΙΝΟΗΙΛΝΟΗΚΙΗΟΗιΛΗΟΗΙΛΗ 4-1X0 r- h S? OOO-HOOO·—IOOO·—tOOO>—ί000>-4000ι—I 0 j* 0 c:x I 22 , , 000000000000000000000000 .*cncn m -·:χο.σσι .......... xxx ^ <E—4^^1 IOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO X —4 —4

O <—i CD CO

,, η Ή -Η Η Ή ·Η ·Η Ή Ή ·Η ·Η ·Η ·Η .. ·Η CCCCCCCCCCCCCD-H'-*

,—Η Ή Ή ·Η 'Η ·Η Ή Ή Ή ·γ-{ Ή Ή 4-> CD CD

Ώ 0 ΉΉΉΉΉΉ. Ή ·Η ·Η ·Η Ή Ή Ή Ή Ή Ή ·γ| τ' Ή Ή Ή Ή ·Η ·Η ι-Η £ £ ^ ο cccccccccccccDwcococncncncnxcncocn cd

·Η ·r—! ·Η Ή '1—1 ·Η Ή ·Η ·Η ·Η ·Η ·*—· O O O O O O C O O O O O ,r~~i C C

^ Ή Ή ·^ ·Η ·'ΐ—r Ή ·Η Ή Ή ·Η ·Η ·ΐ“η Ή Ή :**ί ·π-ί ·Η Ή ·^ ·Η r-·, ·ρ^ ·Η ·Η di Oi ^ coco co co cn co <o ω co co cn cn cn (/ioooooooOuOOD cd £ ε

* 0) ω I I ·η Ή ·Η Ή ·Η ·Η Ή ·Η -rM ·Η ·η β) fl) ID fl) 0 0) Ο G) flJ fl) fl) ö) £ ^-1 M

^ >>I ICCCCCCCCCCCCQ.Q.Q.Q-CLQ.C.Q.Q.Q.CLCL OO

03 CS1 3aC

—j · I + + + 3 ε + + •X Z J iHiNn^'inOr'Ooii'Oi-'Nin'itin'CrvcoO'OHnPi + inOr'e

t— ^ 2 I HHHHHHHHHHNNNNNNNNN

« 105525

Esimerkit 1 ja 2 olivat vertailuesimerkkejä (eli ne eivät: olleet keksinnön mukaisia). Esimerkeissä 1 ja 2 koeliuok-sena oli deionoitua vettä, joka sekoitettiin siirrostettuun alustaan edellä kuvatulla tavalla (esimerkissä 1 elatusalustaan ei oltu lisätty siirrostetta) ja niitä käsiteltiin vertailuina. Esimerkki 2 käsitti siirrostetta ja sitä käsiteltiin vertailuna. Koetulokset osoittavat, että siirrosta-mattoman vertailun (esimerkki 1) tapauksessa 48 tunnin pituitiin sen koejakson aikana läsnä ei ollut olennaisia määriä Listeriä-bakteereita ja aerobisten bakteereiden kasvua ei ollut todettavissa koejakson ensimmäisen 8 tunnin aikana, minkä jälkeen tämä kasvu lisääntyi nopeasti koejakson 8-24 h ja 24-48 h aikana. Vertailunäytteenä käytetyssä siirrostetussa ioninvaihdetussa vedessä (esimerkki 2) todettiin hidastunut vaihe alkaen lähtöarvosta, joka oli noin 31 000 cfu/ml, 4 tunnin koenäytteeseen saakka (37 000 cfu/ml), mitä seurasi räjähdysmäinen kasvu (8 tunnin näyte: 10 000 000 cfu/ml ja 24 tunnin näyte 300 000 000 cfu/ml), mitä seurasi kuolemisvaihe (48 tunnin näyte: 7 700 000 cfu/ml). Tämän räjähdyksenomaista kasvua seuraa -van kuolemisvaiheen oletetaan johtuvan sitä välittömästi edeltävään nopeaan kasvuun liittyvistä tekijöistä kuten ravinteiden loppumisesta tai testattavien bakteereiden (Listeria) tuottamista inhiboivista jätetuotteista. Samoin « - aerobisten bakteereiden kokonaislukumäärässä todetaan hi taan kasvun vaihe, mitä seuraa ensin räjähdyksenomainen kasvu ja sitten "kuoleminen". Esimerkeissä 1-28 aerobisten bakteereiden kokonaislukumääriä määritettäessä monissa esimerkeissä havaittiin itiöitä muodostavia basilleja. Nämä .. organismit edustavat tyypillisesti aerobisten bakteereiden *; kokonaislukumäärän ja Lister ia-bakteereiden kokonaislukumää rän välistä eroa.

Kahden erilaisen kelatoivan aineen, nimittäin (1) EDTA:n di-natriumsuolan (Na2EDTA) ja (2) sitruunahapon, bakteereja torjuva aktiivisuus määritettiin laittamalla niitä kumpaa-' kin 0,8 paino-% deionoituun veteen ja siirrostamalla ne edellä kuvatulla tavalla. Esimerkin 3 (Na2EDTA) todettiin 29 1 0 5 5 2 5 inhiboivan Listeria-organismien kasvua siten, että organismien suurin lukumäärä todettiin 24 tunnin kuluttua, mitä seurasi kuolemisvaihe 48 tuntiin saakka. Esimerkki 4 (sitruunahappo) vaikutti myös Listeria-bakteereita tappavasti ja torjuvasti, vaikka organismien lukumäärä vaihtelikin 48 tuntia kestäneen koejakson aikana keskimääräisen lasketun lukumäärän ollessa suurimmillaan eli 35 000 cfu/ml 8 tunnin jälkeen. Mitä tulee aerobisten bakteereiden kokonaislukumäärään, Na2EDTA:lla oli inhiboivaa vaikutusta, mikä nähdään 8 tunnin jälkeen todetusta suurimmasta keskimääräisestä malja-laskennan tuloksesta, joka oli 88 000 cfu/ml, verrattuna siirrostetulla vertailulla (esimerkki 2) todettuun tulokseen 560 000 000 cfu/ml. Sitruunahappo oli hyvin tehokasta; se sai aikaan aerobisten bakteereiden kokonaislukumäärän jatkuvan pienenemisen koko koejakson aikana, lasketun lähtö-lukumäärän ollessa 6500 cfu/ml, ja maljalaskennan tuloksen ollessa niinkin pieni kuin 640 cfu/ml 48 tunnin kuluttua. Sitruunahapon tehokkuus voi johtua osittain pH:n vaikutuksesta, koska alhainen pH-arvo voi rajoittaa bakteerikasvua, kuten alalla tiedetään.

Esimerkeissä 5-16 koeliuoksissa käytettiin erilaisia pitoisuuksia bakteriosiinia yksinään tai yhdessä sitruunahapon ja yhdisteen Na2EDTA kanssa. Näissä kaikissa esimerkeissä : Listeria-bakteerin keskimääräiset lukumäärät olivat alle 10 cfu/ml kaikissa koejaksoissa, mukaan lukien nollahetken koetulos, joka saatiin välittömästi siirrostamisen jälkeen. Esimerkissä 2 (siirrostettu vertailu) sekä esimerkeissä 3 ja 4 (jotka sisälsivät ainoastaan kelatoivaa ainetta) Listeria -bakteereiden keskimääräiseksi lukumääräksi saatiin ;; vähintään 10 000 cfu/ml välittömästi siirrostamisen jälkeen (hetkellä 0 tuntia). Näin ollen tuntuu ilmeiseltä, että kaikki samalla tavalla siirrostetut, nisiiniä sisältävät näytteet tappoivat näissä koeolosuhteissa olennaisesti kaikki Listeriä-bakteerit sekoittamisen aikana. Se tosiseikka, ettei Listeria-kasvua todettu kokeen alkuvaiheen jäi-keen osoittaa joko Listeriä-bakteereiden tuhoutumisen kokeen alussa tai merkittävän vähenemisen, mitä seurasi hyvin 30 105525 tehokas inhibitio.

Esimerkeissä 5-16 tuloksina saadut, aerobisten bakteereiden kokonaislukumäärät osoittavat bakteriosiinipitoisuuden vaikutuksen bakteereiden kokonaiskasvuun kelatoivan aineen puuttuessa tai sen läsnäollessa.

Esimerkeissä 5-8 käytettiin koeliuoksia, jotka sisälsivät ioninvaihdetussa vedessä erilaisia pitoisuuksia bakteriosii-nia (Nisaplin-merkkisenä nisiinivalmisteena, jota on saatavana yhtiöstä Aplin & Barrett Ltd.). Kaikissa esimerkeissä 5-8 todetaan, että siirrostetut bakteerit kuolivat kokeen alussa alle lukumäärän 10 cfu/ml nisiinin kullakin pitoisuudella. Aerobisten bakteereiden kokonaislukumäärien, jotka saatiin maljäämällä siirrostetut koeliuokset epäselektiivi-selle tryptiselle soija-agarille, tulisi edustaa tarkoituksellisesti lisättyjen Listeriä-bakteereiden ja muiden, näytettä sattumanvaraisesti kontaminoivien bakteereiden seosta. Vertaamalla todetaan, että kaikissa esimerkeissä 2-4 kokeen alussa lasketut lukumäärät olivat 5900 - 9100 cfu/ml, kun taas siirrostamattomassa vertailussa (esimerkki 1) laskettu lähtöarvo oli alle 10 cfu/ml.

Kun esimerkkiä 5, joka sisälsi 1 ppm nisiiniä, verrataan siirrostettuun vertailuun (esimerkki 2) , niin todetaan, että bakteriosiini vaikuttaa erityisesti kokeen alussa aerobisia bakteereita tappavasti ja se säätelee ainakin alussa aerobisten bakteereiden kasvua. Kuitenkin esimerkissä 5 8 tunnin kuluttua saatu keskimääräinen laskentatulos, 130 cfu/ml, oli kasvanut räjähdyksenomaisesti arvoon 9 100 .. 000 cfu/ml kokeen kestettyä 24 tuntia. Tämä kasvu on vähäi sempää kuin siirrostetun vertailun (esimerkki 2) tapauksessa ja suunnilleen samanlaista kuin siirrostamattoman vertailun (esimerkki 1) tapauksessa 24 tunnin jälkeen. Aerobisten bakteereiden nopea kokonaiskasvu jatkui esimerkissä 5, jolloin keskimääräiseksi maljalaskentatulokseksi saatiin 45 ·' 000 000 cfu/ml 48 tunnin kuluttua. Esimerkin 5 vertaaminen esimerkkeihin 6-8 osoittaa, että nisiinin pitoisuuden suu- 31 105525 rentaminen viivästyttää kaikkien aerobisten bakteereiden räjähdyksenomaisen kasvuvaiheen alkamista ja pienentää kunkin ajanjakson aikana saatua aerobisten bakteereiden keskimääräistä kokonaislukumäärää verrattuna muihin koe-liuoksiin, jotka sisältävät vähemmän nisiiniä.

Esimerkit 9-12 olivat esimerkkien 5-8 kaltaisia nisiinipi-toisuuksien suhteen, mutta ne sisälsivät myös 0,8 paino-% kelatoivaa ainetta, eli EDTA:n dinatriumsuolaa (josta käytetään seuraavassa lyhennettä Na2EDTA). Aerobisten bakteereiden kaikki keskimääräiset kokonaismaljalaskentatulokset olivat alle 10 cfu/ml, lukuunottamatta arvoa 110 cfu/ml 48 tunnin kuluttua esimerkissä 9. Täten esimerkiksi esimerkissä 3 (0,8 paino-% Na2EDTA), esimerkissä 5 (1 ppm nisiiniä) ja esimerkissä 9 (1 ppm nisiiniä yhdistettynä 0,8 paino- %:iin Na2EDTA) 24 tunnin kuluttua saadut bakteereiden keskimääräiset lukumäärät olivat 88 000 cfu/ml, 9 100 000 cfu/ml ja <10 cfu/ml, vastaavasti. Bakteereiden lukumäärän yllättävä pieneneminen alle arvon 10 cfu/ml nisiinin ja kelatoivan aineen yhdistelmää käytettäessä on odottamatonta. Nisiini ja kelatoiva aine kuten Na2EDTA vaikuttavat toimivan syner-gistisesti aerobisten bakteereiden keskimääräistä kokonaislukumäärää pienentäen, mikä nähdään esimerkissä 3 sekä esimerkeissä 5-12 saaduista 24 tunnin ja 48 tunnin tuloksis- > < ' ta. Esimerkeissä 13-16 toista kelatoivaa ainetta käytettiin nisiiniin yhdistettynä. Nämä esimerkit olivat esimerkkien 3-8 kaltaisia, mutta kukin niistä sisälsi myös 0,8 paino-% sitruunahappoa. Kaikissa näissä koeliuoksissa, jotka sisälsivät sitruunahapon ja nisiinin yhdistelmää, aerobisten .. bakteereiden keskimääräiseksi kokonaismaljalaskentatulok- seksi saatiin alle 10 cfu/ml, lukuunottamatta esimerkin 16 keskimääräistä lähtötulosta, joka oli 30 cfu/ml. Edellä olevat koetulokset osoittavat yksittäisten kelatoivien aineiden ja nisiinin bakteereja torjuvan aktiivisuuden sekä nisiinin ja kelatoivan aineen yhdistelmän yllättävän ja odottamattoman hyvän aktiivisuuden aerobisten bakteereiden kokonaismääriä vastaan. Tämän perusteella voidaan vetää se johtopäätös, että nisiinin ja kelatoivan aineen kuten Na2ED- 32 1 0 5 5 2 5 TA:n tai sitruunahapon yhdistelmällä on odottamattoman tehokasta bakteereja tappavaa ja torjuvaa vaikutusta, ja että sitä voidaan näin ollen käyttää elintarvikkeissa elintarvikkeen säilyvyyden dramaattiseksi parantamiseksi.

Esimerkeissä 17-28 koeliuokset sisältävät erilaisia pitoisuuksia keksinnön mukaista pediosiinia joko yhdessä kelatoi-vien aineiden kuten Na2EDTA:n ja sitruunahapon kanssa tai ilman niitä. Pediosiini lisättiin valmisteena, jota oli tuotettu rasvattomassa maidossa alalla yleisesti tunnetuilla menetelmillä pediosiinin tuottamiseksi viljelemällä Pediococcus acidilacti-bakteeria rasvattomassa maidossa.

Taulukossa la esitettyjen Listeriä-bakteerin keskimääräisten maljalaskentatulosten perusteella on ilmeistä, että pelkkä keksinnön mukainen pediosiini tappaa Listeria-bakteereita ja estää niiden kasvua, ei kuitenkaan niin tehokkaasti kuin yhtäsuurina painomäärinä käytetty nisiini. Tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisen pediosiinin pitoisuuden nostaminen suuremmaksi kuin 1 ppm pienentää yleensä Listerl-a-bakteereiden lähtölukumäärää. 10 ppm:n tai sitä pienemmät pediosiinimäärät estivät Listeria:n kasvua siirrostettuun vertailuun (esimerkki 2) verrattuna, mutta Listeria:n kasvu jatkui kuitenkin, kun taas 50 ppm:n tai sitä suuremmat pedi-V osiinimäärät eivät ainoastaan pienentäneet bakteerien lähtö- lukumääriä, vaan ne estivät myös Listeriä-määrien logaritmisen suurenemisen, eli 48 tuntia kestäneen koejakson aikana suurin keskimääräinen Listeriä-määrä oli 740 cfu.

Esimerkeissä 21-24 koeliuokset olivat samankaltaisia kuin ·' esimerkeissä 17-20, paitsi että niissä oli läsnä 0,8 paino- % kelatoivaa ainetta eli yhdistettä Na2EDTA ja erilaisia pitoisuuksia keksinnön mukaista pediosiinia. Kuten voidaan todeta vertaamalla esimerkkejä 21-24 esimerkkiin 3 ja esimerkkeihin 17-20, keksinnön mukaisen pediosiinin ja yhdisteen Na2EDTA yhdistelmä vaikutti odottamattoman hyvin * Listeriä-bakteereita tuhoten ja niiden kasvua estäen 48 tunnin pituisen koejakson aikana, erityisesti keksinnön 33 105525 mukaisen pediosiinin pienillä pitoisuuksilla (10 ppm ja sen alle).

Esimerkeissä 21-24 käytetty Na2EDTA korvattiin esimerkkien 25-28 koeliuoksissa toisella kelatoivalla aineella eli sitruunahapolla. Keksinnön mukaista pediosiinia ja sitruunahappoa sisältävien liuosten tapauksessa keskimääräiset Listeria -bakteereiden maljalaskentatulokset ovat yllättävän pieniä ja ne osoittavat synergististä vaikutusta Listeria-bakteereiden tuhoamista ja torjumista ajatellen. Esimerkiksi 24 tunnin jälkeen saatiin seuraavat keskimääräiset malja-laskentatulokset: 0,8 paino-% pelkkää sitruunahappoa - 70 000 cfu/ml (esimerkki 4) ; 1 ppm pediosiinia - 170 000 000 cfu/ml (esimerkki 17); ja yhdistelmä, joka sisältää 0,8 paino-% sitruunahappoa ja 1 ppm pediosiinia - 10 cfu/ml (esimerkki 25) . Esimerkissä 25 saatu tulos 10 cfu/ml on huomattavan alhainen. Keksinnön mukaisen pediosiinin ja kelatoivan aineen yhdistelmällä saavutettava tulosten logaritminen pieneneminen on merkittävää ja odottamatonta erillisiin komponentteihin verrattuna.

Aerobisten bakteereiden keskimääräisiä kokonaismääriä tarkasteltaessa keksinnön mukainen pediosiini vaikuttaa viivästyttävän ja vähentävän kasvua, pediosiinin suurempien pitoi-; : suuksien ollessa tehokkaampia, erityisesti 24 ja 48 tuntia kestäneiden koejaksojen aikana. Keksinnön mukaisen pediosiinin sekä kelatoivana aineena toimivan yhdisteen Na2EDTA ja sitruunahapon yhdistelmät vaikuttivat myös aerobisten bakteereiden kokonaiskasvua estäen.

» · ! Edellä esitetyt esimerkit 1-28 osoittavat erilaisten mikro beja torjuvien aineiden tehokkuuden patogeenisiä ja aerobisia bakteereita vastaan. Nisiinin ja jonkin kelatoivan aineen kuten Na2EDTA:n tai sitruunahapon yhdistelmä todettiin yllättävän tehokkaaksi kaikkia aerobisia baktereita vastaan verrattuna niihin tapauksiin, joissa mainittuja komponentteja käytettiin yksinään. Odottamatonta on keksinnön mukaisen pediosiinin ja jonkin kelatoivan aineen kuten

Na2EDTA:n tai sitruunahapon yhdistelmän yllättävä tehokkuus patogeenisiä Listeria-bakteereita vastaan erillisiin kompo nentteihin verrattuna.

34 1 0 5 5 2 5

Esimerkit 29-43

Elintarvikkeisiin, kuten wieninmakkaroihin sisällytettyjen erilaisten mikrobeja torjuvien aineiden kyky estää elintarvikkeen pilaantuminen testattiin. Juuri valmistettujen kuorettomien (suoli poistettu), pastöroitujen fraankfurtinmak-karoiden pinnalla on bakteereita tyypillisesti alle 1000 cfu/makkara välittömästi vakuumipakkaamisen jälkeen tyypillisissä kaupallisissa valmistusprosesseissa. Kun bakteerei-den lukumäärät nousevat suuruusluokkiin 107-108 cfu/makkara tai vieläkin suuremmiksi, niin pilaantuminen on tyypillisesti nähtävissä. Vakuumipakkattujen, jäähdytettyjen, jalostettujen lihatuotteiden tavallisista pilaajabakteereista voidaan mainita Lactobacillus-kannat. Näissä esimerkeissä selvitettiin erityisesti erilaisten liuosten kyky suojata tähän liuokseen upotetut elintarvikkeet patogeenisten bak-teereiden kuten Listeria monocytogenes-bakteerin kasvulta.

Esimerkeissä käytettiin tyypillisestä lihaemulsiosta muodostettuja ja jalostettuja frankfurtinmakkaroita. Makkarat val-mistettiin täyttämällä nauta/sianlihaemulsiota E-Z Peel No-jax^-merkksiin selluloosasuoliin (saatavana kaupallisesti yhtiöstä Viskase Corporation, Chicago, Illinois), ja niitä kypsennettiin (noin 1 tunnin ajan) kaasulla kuumennetussa savustamossa, johon ei lisätty savua, ja jonka suhteellinen kosteuspitoisuus oli säädetty noin arvoon 20 %, kunnes makkaroiden sisälämpötila oli noussut vähintään arvoon 71 °C. Sitten suoli kuorittiin irti kaupallisella kuorimislaitteel-la ja se heitettiin pois. Kuorittuja makkaroita säilytettiin polyetyleenipussissa noin 4 °C:n lämpötilassa lyhyen aikaa mikrobiologisten kokeiden aloittamiseen saakka. Liha-emulsio valmistettiin taulukossa A luetelluista aineista, joita jauhettiin ja sekoitettiin noin viisi minuuttia kaupallisessa jauhinkulhossa, minkä jälkeen seos hienonnettiin 35 105525 johtamalla se kaupallisen emulgointimyllyn läpi tasaisen lihaemulsion saamiseksi. Näiden pastöroitujen frankfurtin-makkaroiden kemiallisesta analyysistä saatiin tuloksiksi 56,9 % kosteutta, 27,2 % rasvaa, 12,2 % proteiinia, 2,5 % tuhkaa, 1,90 % suolaa, 65 ppm natriumnitraattia ja makkaroiden pinnan pH-arvo 6,40.

Taulukko A

Aineosat_Paino, ka

Naudanliha 13,5

Sianlihan leikkuujätteet 9

Vesi/jää 5,6

Suola 0,506

Dekstroosi 0,45

Frankfurt-mausteet 0,225

Natriumnitriitti 0,05625 Jäähdytetyt makkarat, joita säilytettiin 4 °C:n lämpötilassa, pinnoitettiin koeliuoksilla upottamalla yksittäiset makkarat koeliuokseen noin 30 sekunniksi niitä mahdollisimman vähän koskettaen, minkä jälkeen kutakin makkaraa pidettiin 30 sekunnin ajan pystysuorassa asennossa liuoksen valuttamiseksi pois. Sitten tällä tavalla pinnoitettuihin makkaroihin siirrostettiin (siirrostamatonta vertailua lukuunottamatta) kolmen patogeenisen Listeria monocytogenes-kannan seosta {jotka kannat oli saatu viljelemällä joko lihatuotteesta tai lihanjalostustehtaasta eristetyistä kannoista) noin 10 000-30 000 pesäkettä muodostavaa yksik-, köä (cfu) makkaraa kohden. Välittömästi siirrostamisen I jälkeen kuhunkin esimerkkiin kuuluvat makkarat testattiin huuhtomalla ne steriilillä puskurilla, jota maljattiin sitten edellä kuvattujen menetelmien mukaisesti sekä epä-selektiiviselle tryptoni-glukoosi-hiiva-agarille (TGY) että Listeria:n suhteen selektiiviselle LPM-agarille, joita agareita inkuboitiin aerobisten bakteereiden kokonaismäärän ' ja Listeria-bakteereiden määrän selvittämiseksi.

36 105525

Siirrostamisen jälkeen kukin makkara pakattiin kaupallisesti saatavaan PERFLEXR 51B Barrier Bag-pusseihin (valmistaja: Viskase Corporation, Chicago, Illinois). Näihin pusseihin vedettiin vakuumi ja ne lämpösaumattiin suuressa vakuumissa käyttäen kaupallista vakuumi/saumauslaitetta siten, että makkaroiden ja ympäristön väliin saatiin aikaan hapen ja kosteuden estokerros. Koenäytteitä säilytettiin ympäristön lämpötilassa (noin 25 °C) 2 vuorokautta, minkä jälkeen niistä määritettiin kaikkien bakteereiden ja Listeria -bakteere iden lukumäärät edellä kuvatulla, siirrostamisen jälkeen saatujen näytteiden maljalaskentamenetelmällä. Koeliuokset ja bakteereiden lasketut lukumäärät on esitetty taulukossa 2.

Esimerkeissä 36-39 sekä Esimerkissä 65 käytettiin ei-kaupal-lista bakteriosiinivalmistetta. Valmisteiden bakteriosiini-arvot on tässä selityksessä ilmoitettu valmisteen toimittajan antamien tietojen mukaan. Valmisteiden bakteriosiini-arvot on nyttemmin laskettu uudelleen ja niiden on todettu eroavan valmisteen toimittajan alunperin ilmoittamista tiedoista. Siten varsinaisten bakteriosiinipitoisuuksien oletetaan Esimerkkien 36-39 ja 65 osalta eroavan aikaisemmin tekstissä ja taulukoissa esitetyistä arvoista. Uudelleen lasketut, oikeiksi oletetut arvot on lisätty taulu- ' koihin 2, 4a ja 4b aikaisempien arvojen jälkeen suluissa.

105525 c g w 3 £ « ω gggggggdgggg ro ^ % ® OOOOOOOOOOOOOOO -2, ’^'o'iCD -§:C0

® -* OOOOOOOOOOOOOOO ^ „ p :CD ·ρ -H

4J P OOOOOOOOOOOOOOO ~ ¢0 IP -P tCH

__t * ***«»*«>·»*«»»** —. . . c ·ΓΠ

® § "f ΟΟΟΟΟΟ1ΛΟΟΟΟΟ0ΟΟΟ t „ -m E

•03®·. ΟΟΟΟΟΟΓ'ΟΟΟΓ'Ο OO m φ J) M CO G

_^ ΙΛΟΟΟΟΟ 000 vo on £ 1 σ" So ® r? -¾ in n h n n n o» n r- 00 "f do^ so S .2 -g vo^m^vo ^ r- <r <r ά ° μ: |h

Hdll 3 C J2 C Ο -P

OOOOOOOOOOOOOOO n r CH ij"5 P9P ^ ξ ooo<rooooooi^oOOo 5 F fc TL cno £-go££ ^o.o.^.r.^/.r^. ®«* 8 «£« I» —I ® N N Η HOHN^H vO t". O ° „ .¾ £ ^

m m > CO · 3: tl G

«U«0«U+ OJU G G ·§_ °2= 3 E

OOOOOOOOOOOOOOO 2 £ p .y ^oorwoooooooo^oo di 2 ., tj ^ L .

% v ® ® v ® * " ® © ® ® ® v ® 0 01 ε £ ω ® 0 ra' 00 ο ·η o o o VO o o r·* £ 5£ΐη 8-3ω ^ OOO O Ο <ί N o O (VJ ti litis e ® N θ_ 0_ » N «n en «n 00 ti M (3 E C -8 5 ^ ^ ^ a o “ ra ί c n

(tv 3 ·« > O -P E

• H® C -Ρ ·Π ·Ρ t, E I OOOOOOOOOOOOOOO ® ζ ζ

O \ LO rHOO^Hl-t<HF-(^HOvO«nO—1 O rH 1-Ή Η 4J ·Η B

+1 Ό O v*00 v v v v v <η m v n v 1—f <—ie-ι·η Ol_u3

ςβ r~ ta »« «h « « CD O G. 1/1 ‘ ^ CD

rl ϋ :ro h ΟΌ (S < pH ε _ :® £=

_Jv-^_JtDrH<n (VJ CC C ~ pH O

1 c .y :ra ro ρ1 p

m p. O O -P O? C -P -P

C 'l—3 CO I (DE® r :® I O OOO OOOOOOO C JOO <U -—r 3»

·· :co cl I !··! ······· CO ~ -P C -P G G

cc = ' I ιηιηηηιηηηηηηη E ro ρ ·ρ g p> ro

= ·Η Ή p! C -C CO Ή O P

ο c cc o g >- a EC

CL CL Ή ·ρ C O) i—1 G C0 Q. Cl ·ι-ί H G -P ra O ra E •'f ra ro c- p ·- en g c ·> > ti

r r -u +j o ·ρ -p g ph raG

·. <<<·<<<<απιηυ3 ;>EEGv_,cptG

. H H H H H H H C C .y _y p g pf p ·ρ p| p> j, o ooo o o o g g g g ro .y ra ra = ·ρ p .y • H W H H H WWW33OO ·Ρ0:5Ε0··Ρ30 jj <*"> n n n en <n p o o _y ro g · p -p' .p -p .o "c cd ! en -h e ^ —i :ra :ro g i

Su iiÄiÄZÄiasÄZ.H·^^:^ g h 3 e.·- en e g e b en >> > .y e 'p ro ra e ·ρ e -h o * . * gg :d 4J ·η m τ' Ό jj

n vO ^ Γ». © <f Γν e Ρ -Ρ ·Ρ Ή -P O

= :ra^ ra :ro .-ra ra ^ g -p ra n Li 'e »—*OOi—tOOOO I-I »-e -i-j:ra en e s -i-i e ·η -h

^ e .,¾ °| 2 2 , ° ° ° ° ° ° ° ° , ° , ° H E -4 (j C'H4J

r e- p ^51-1 ^ I OOOOOOOO ΙΟ ΙΟ (Π ECO CDCo?GGG

qj G ·Ρ ·Ρ -P ·Η J P G 3 en ***** ^cpcrapioc'pu

_· ^ ********H<i4! GG PCD^C GO

η ·Ρ·Ρ ·ρ P -P 'P P P ·Ρ ·Ρ 3 "Ό -P ·ρ G P ·Ρ :re —I O

. cm 3 cccccccc e e -p_cenen Groj=>vCJ

p + + -P P -P 'P P -P ‘P 'P ·Ρ -P Ή CD -p P C E D.:ra o O ph ·ρ p .p.p ·ρ ·ρ p ·ρ ·ρ ·ρ ·ρ ·ρ ο Ρί _j e o ra -ρ ra ρ> G GG GGGGGGGG G CD O C PiApHQ.

v o =f G G 1 ·Ρ·Ρ Ρ -ρ Ρ ·Ρ -Ρ Ρ I Ρ I P 'P O C ·Ρ :C0 CO CD CM G —I G

—3 m; 5>5ICCCCCCCCICIC. >-p.pjJE-P>0:3rap

PG®G:raCra->v-H-P

3 . C Ci 3s G I— 3+J C Σ ® ΙΛ . <c E 4. * >— -P · (JvOpl(Nm<rvrivOr^OO<7vOp4<M^ , t * * go Nnnnnnnnnnntftftfcf ^ ^ ^

LP Z

Esimerkeissä 29-43 mikrobeja torjuvat aineet liuotettiin tai suspendoitiin deionoituun veteen. Kaikki taulukossa 2 mainitut koeliuokset olivat vesipohjaisia.

3β 105525

Esimerkki 29 erosi muista esimerkeistä siinä suhteessa, että makkarat kastettiin pelkkään deionoituun veteen eikä niihin tämän jälkeen siirrostettu Lisj^eria-bakteereita. Esimerkki 29 toimi siirrostamattomana vertailuna (eli se ei ollut keksinnön mukainen) esimerkiksi jo makkaroiden pinnalla mahdollisesti läsnäolleiden taustaorganismien tai tahattoman kontaminoitumisen seurauksena makkaroihin siirtyneiden organismien kasvun selvittämiseksi. Esimerkistä 29 saadut tulokset osoittavat, ettei makkaroista todettu merkittäviä määriä Listeria-bakteereita kahden vuorokauden pituisen koejakson aikana, kun taas aerobisten bakteereiden keskimääräinen kokonaislukumäärä nousi arvosta 2600 cfu noin arvoon 590 000 cfu makkaraa kohden.

Esimerkki 30 toimi siirrostettuna vertailuna (eli se ei ollut keksinnön mukainen), jossa koeliuos oli deionoitua vettä. Tämä esimerkki oli samanlainen kuin esimerkki 24, paitsi että liuokseen kastettuihin makkaroihin siirrostet-tiin Listeria-organismia. Kahden vuorokauden pituisen koejakson aikana Listeria:n kasvu oli räjähdyksenomaista, ja •: keskimääräisiksi maljalaskentatuloksiksi saatiin arviolta 38 000 000 cfu/makkara. Aerobisten bakteereiden kokonaismäärä osoitti samankaltaista räjähdyksenomaista kasvua.

Esimerkissä 31 EDTA:n trinatriumsuolan 3 paino-% liuos ei vaikuttanut olennaisesti Listeria .-n kasvuun eikä aerobisten ; bakteereiden kokonaiskasvuun makkaroiden pinnalla kaksi vuo rokautta kestäneen koejakson aikana.

Esimerkeissä 32-35 testattiin frankfurtinmakkaroiden pinnalla pelkkää bakteriosiinia erilaisina pitoisuuksina sekä yhdistettynä kelatoivaan aineeseen Na3EDTA. Näissä esimer-*- - keissä bakteriosiini lisättiin maitoa fermentoimalla saatu na tuotteena. Tätä bakteriosiinivalmistetta on saatavana 105525 .

39 kaupallisesti tuotenimellä "Nisaplin" yhtiöstä Aplin & Barrett, Trowbridge, Englanti. Jotta koeliuoksen bakterio-siinipitoisuudeksi saatiin esimerkiksi 0,01 paino-%, niin liuokseen oli lisättävä bakteriosiinivalmistetta (Nisaplin) 0,4 paino-%.

Vaikka oletettiinkin, että kaikkiin esimerkkien 30-43 mukaisiin, koeliuoksella pinnoitettuihin frankfurtinmakkaroihin oli siirrostettu kokeen alussa Listeria-bakteereita vähintään noin 10 000 cfu/makkara, niin kuitenkin kaikissa esimerkeissä 32-35 Listeria:n alustavat keskimääräiset malja-laskentatulokset olivat alle 10 cfu. Näiden pienien lähtö-määrien uskotaan osoittavan, että olennainen määrä Listeria-bakteereita kuolee joutuessaan kosketukseen bakteriosiinia sisältävän pinnoitteen kanssa. Kaikki bakteriosiinia sisältävät liuokset kykenivät vähentämään Listeria:n kasvua kaksi vuorokautta kestäneen kokeen aikana, suuria bakterio-siinimääriä sisältäneiden liuosten inhiboidessa tehokkaammin Listeria-bakteeria. Esimerkki 32, jossa makkaran pinnoite sisälsi pelkkää bakteriosiinia, koeliuoksen pitoisuuden oltua 100 ppm, vaikutti kaikkein tehokkaimmalta kahden vuorokauden pituisen koejakson aikana. Tämä tulos saattaa kuitenkin johtua joko tuhoutumisesta kokeen alussa tai merkittävästä vähenemisestä, jota seurasi hyvin tehokas inhibi- m tio. Aerobisten bakteereiden kokonaismäärää vastanneiden koetulosten perusteella voidaan päätellä, että 100 ppm bakteriosiinia ja 3,0 paino-% yhdistettä Na3EDTA vaikuttavat synergistisesti pitäen aerobisten bakteereiden kokonaiskasvun pienenä pinnoitetun, kypsennetyn tai pastöroidun lihan pinnalla, mikä nähdään vertaamalla esimerkkiä 35 * · I esimerkkeihin 31 ja 32.

Esimerkeissä 36-39 käytettiin ei-kaupallista bakteriosiinivalmistetta. Tämä bakteriosiinivalmiste tehtiin viljelemällä Streptococcus laetis-bakteeria rasvattomassa maidossa käyttäen yleisesti tunnettuja menetelmiä. Esimerkissä 36 testattiin frankfurtinmakkaroita, joiden pinnoittamiseen käytetty liuos sisälsi 52 ppm bakteriosiinia ilman kelatoi- 40 1 0 5 5 2 5 vaa ainetta (Na3EDTA). Esimerkissä 36 saatujen tulosten vertaaminen esimerkkien 31 ja 39 tuloksiin osoittaa, että bakteriosiinin käyttäminen yhdessä kelatoivan aineen, NajEDTA, kanssa sai aikaan sekä Listeria:n että kaikkien aerobisten bakteereiden keskimääräisten maljalaskentatu-losten yllättävän ja odottamattoman vähenemisen kaksi vuorokautta kestäneen koejakson aikana.

Myös muita kelatoivia aineita tutkittiin, ja bakteriosiinin ja joko sitruunahapon tai syklodekstriinin yhdistelmällä todettiin odottamattoman hyvää inhiboivaa ja tappavaa vaikutusta kaikkiaaerobisia bakteereita vastaan. Bakteriosiini/-syklodekstriini- ja bakteriosiini/sitruunahappo-yhdistelmän kyky torjua Listeria:n kasvua elintarvikkeiden pinnalla todettiin myös oikein hyväksi. Näissä esimerkeissä käytetty syklodekstriini oli beeta-syklodekstriiniä, jota on saatavana kaupallisesti yhtiöstä American Maize-Products Company, Hammond, Indiana.

Esimerkit 29-43 osoittavat, että bakteriosiinia ja kelatoi-vaa ainetta kuten yhdistettä Na3EDTA, sitruunahappoa tai syklodekstriiniä käsittävää, bakteereja torjuvaa koostumusta voidaan käyttää patogeenisten bakteereiden tappamiseen ja inhiboimiseen sekä elintarvikkeiden säilyvyyden paranta- • : miseen. Tämä uusi koostumus, joka käsittää yhdistelmänä bakteriosiinia ja kelatoivaa ainetta, vaikuttaa olevan käyttökelpoinen elintarvikkeiden säilöntäaine. Näissä esimerkeissä liuos levitettiin frankfurtinmakkaroiden pinnalle kastamalla makkarat tähän liuokseen, mutta oletetaan, että myös muita käsittelymenetelmiä voidaan käyttää, kuten edei- ;; lä on esitetty, joista menetelmistä mainittakoon ruiskutta minen, sekoittaminen tai saattaminen kosketukseen irtoavalla pinnoitteella päällystetyn kalvon kanssa. Keksinnön mukaista yhdistelmää ei voida käyttää ainoastaan jalostetuissa lihatuotteissa vaan myös muissa elintarvikkeissa kuten hedelmissä, vihanneksissa, viljatuotteissa, maito- ’* - taloustuotteissa, munissa sekä erilaisissa lihoissa, siipi karja- ja kalatuotteissa. Oletetaan, että tätä koostumusta 105525 .

41 voidaan käyttää tuoreissa, raaoissa, kypsennetyissä, pastöroiduissa ja steriloiduissa elintarviketuotteissa. Edellä saadut koetulokset osoittavat patogeenisiä ja elintarvikkeita pilaavia organismeja tappavan ja inhiboivan synergisti-sen vaikutuksen.

Esimerkit 44-55

Frankfurtinmakkarat käsiteltiin erilaisilla mikrobeja torjuvilla aineilla siten, että kukin makkara kastettiin tätä ainetta sisältäviin vesipohjaisiin koeliuoksiin. Tällä tavalla käsiteltyihin makkaroihin siirrostettiin bakteereita ja bakteerikasvu makkaroiden pinnalla määritettiin ajan funktiona. Tässä kokeessa meneteltiin olennaisesti samalla tavalla kuin esimerkeissä 29-43 lukuunottamatta seuraavassa esitettyjä muutoksia. Näissä esimerkeissä käytetyllä liha-emulsiolla oli olennaisesti esimerkkien 29-43 mukainen valmistusohje, paitsi ettei esimerkkien 44-55 lihaemulsios-sa käytetty dekstroosia. Makkaroiden kypsentämis- ja jalos-tusolosuhteet olivat samat, paitsi että suhteellinen kosteus oli 25 %, ja että makkaroita kypsennettiin niin kauan, kunnes niiden sisälämpötila oli saavuttanut arvon 72 °C.

Näiden nyt pastöroitujen makkaroiden kemiallisesta analyysistä saatiin tuloksiksi: pinnan pH 6,36, 56,3 % kosteutta, « : 2 8,7 % rasvaa, 12,4 % proteiinia, 2,6 % tuhkaa, 1,94 % suolaa ja 56 ppm natriumnitraattia. Vaikkei savua lisättykään, niin kuitenkin savuanalyysi toteutettiin seuraavin tuloksin: 24,6 mg happoa, 0,3 mg fenolia ja 7,1 mg karbonyy-liyhdisteitä 100 g:ssa kypsennettyä makkaraa. Näiden arvojen oletettiin johtuvan savun jäännöskomponenttien muodostu-misesta savustamossa.

Makkarat pinnoitettiin koeliuoksissa upottamalla ne liuoksiin 30 sekunniksi, minkä jälkeen liuosta valutettiin makkaroista 30 sekunnin ajan. Sitten näihin pinnoitettuihin makkaroihin siirrostettiin seoksena kolmea patogeenistä " Listeria monocvtogenes-kantaa pipetoimalla 0,05 ml siirros- tetta (noin 100 solua) kunkin makkaran päälle. Siirroste 42 105525 levitettiin steriilillä puuvillapuikolla. Sitten makkarat pakattiin kahdeksi neljästä makkarasta muodostetuksi kerrokseksi kaupallisesti saataviin PERFLEXR 51B Barrier Bag-pus-seihin (joita valmistaa Viskase Corporation, Chicago, Illinois). Näihin termoplastisesta kalvosta valmistettuihin pusseihin vedettiin vakuumi ja ne lämpösaumattiin suuressa vakuumissa kaupallisella vakuumi/saumaus-laitteella siten, että makkaroiden ja ympäristön väliin saataisiin hapen ja kosteuden estokerros. Kullakin koeliuoksella pinnoitetuista makkaroista valmistettiin erilliset pakkaukset. Kutakin 8 makkaraa sisältävää pakkausta säilytettiin noin 4,4 °C:n lämpötilassa. Kolme rinnakkaispakkausta analysoitiin kokeen alussa (ajanhetkellä 0 vuorokautta) sekä 14, 28 ja 42 vuorokautta kestäneen säilytyksen jälkeen. Määritystä varten yksi makkara poistettiin aseptisesti kustakin testattavasta pakkauksesta ja laitettiin 10 ml fosfaattipuskuria sisältävään pussiin, jota ravisteltiin makkaran pintaan tarttuneiden bakteerisolujen irroittamiseksi. Tämän liuoksen 1/10-laimennossarjasta otetut näytteet maljättiin LPM-agarille ja TGY-agarille edellä esimerkeissä 29-43 kuvatulla tavalla. Taulukossa 3 on esitetty kolmesta tutkitusta rinnakkais-pakkauksesta saatujen maljalaskentatulosten aritmeettiset keskiarvot.

m 9 9 9 43 - 105525

MO P P P P P P P QQOO

< O z zz z z z z zz^o O V o o o

O

en * /- _ « ä £ 00+ oooooooooou ®

«s OOOOOOOOO—I

OOOOOOOOOV + 00000000*0 e £ ooooooooo

<u ooooooooo Q

Ό ««««***«« (1)

^ OOOOOOrHCMO C

45 O r-ι o o r- hT rlH C

f-1 σ» m rH \o <r —c i*. ® ω ε

45 —t rH —I —H

*-> + o -¾ · + io <T o o oo o o o o oooo

.OCCDrn-^OOOOOOOOOrHrH

h u ooooooooovv π

C O CO ' ' « » » « n h KW —I

o —i Di Di o —t o o ο Ό o <m m >—i +j ω Di + <-v m n <· rH p-icj 05 (O Ή !J > ιβ ^ sf ^ 05 •HOE·— Di -C C \ o

0 0 3® C

n Di +- dcc o o oo o o o o oooo c 05 O O r rH CM O 00 o O O 00 O n rl H o

< Di ^ < V rH H rt CO Γ» rH N H V E

mm -f-l

•H »H CD

l—i <no o o ο o o a a oooo 3

ΗΤ-ΗΖΖ*ΖΖΖΖΖΖ-Η-Η (4- CO

V VV O H

H 3 * 0 3*»-·· 0COOOOOOOOOOOO o —I 03 3 . CM rH O OO O O O O O O rH —I Offl (4-(4-.

CO vOOOÖOÖOOOvv -n CD O U 3 (J -“··-·«-» O —I O U- (0 2 22 2 2 2 2 00 CDOC0C3OO0

Di O OO O O O O OO HOE OO

Di O OO O O O 00 OO ri CDOCDO

® “*“*“*“** OHN HC rl ε 2 22 2 2 * ^ °2 Di oc oi o o · o v \ O OO O O CM CM O >, ^ 03Γ— O < Ό CM O CM H n —1 (0 (O O C5 (— Ή

+- “ _T “ “ “ “ O-D =» Ο ϋ O H

o f-t CM r-ι CO CO rl H (OOOO O

. C —-H O O

T 0)3+>vO(AC3 — (A

:2 <0 O OO O O O O OOOO ^ u Di "'(Mii^iE-S

m rH rH o OO O O O O CONH >, ·£ .+ O ^ ;S ~ v ° 00 Om Oe Oe Oe 00 - OO <o ^ ·Η·Ηα 3

lu o n o < o <o o or» £SH °o'c^iS

•H> S^io^co^S^*'1 Q. CM (CO 05 N c ^ 1 1 N4J O (A Ώ 0} ω ή — o o ·~ 4JCÖ I ··» 0) □ ^ ·—t ZJ «

w JC ce O OO β O O e Ö ö O <S ^ O D ^ ^ CD

5 S 5 S? 5 S § S 2522 45Ξ^£ ° ^ -J< v ” ^ N 04 · N -.r^v-vc 2 '3 u ® cccoc

Q) ao (D CD CD CD ^ CO

:CD ·»—" Ή ^ Q. ’Γ-) »1-3.1-5 V

S- £·? U- CD v !—li—t 1—H · · rH

£ is ά. , i ·, i ···· fe-iiis iiiag OE^, , O. o o o O OOOO ccc.Sc o 3CrH-H(DOa>rHO>

rH CC riC—ICCCOC

I —r SH C C C C

< < rH < ^ «r ·υ H -I CD CO CO -4-> (O

(H O H Ϊη ί i f- H c C M -h E E E 45 E

O O CO O O OOOO -rl Q5 05 O <—I —I ’—I 05 <—I

U M μ u M uuuu C C H O O O H o

CM CM q CM CM CM CM (M CM COOit 'DDDOD

H m I I ®l OI JS ei ei cecocdce 450.·—C -4—Ϊ D>- -H

rl I I zi z U Z Ä ZZZZ EE3MD-1.---3.- *J -rtOs-iUJ-iOOO-i-io C :(0--- m in ®DifflE4l>>D(() > 45 U o? XX m CM (—I (M r14_}—J4_ltr(r(roJt, cc :πιο o o o 00 m cm ολοο •ri(occ-Hco®coc® . . O ·· (CO Q. O O I · . · · .... j-i c 45 ^ 05 !-. H - 05 -rl a<E'-rrH rH 1 CM CM rH O O OOOO HJ 05 Di V H H H H ^ E (0-1-105(005050505(15 * O C COCCD—IC454545C005

Di O (4- CO—IH ODCD^rIDi

r-l 3 * (!) E CO

C (0 J-J I. I I Ή * ^OrHC·—5 05CCCCC

- 05 E -4—1 -rt -H rt -4-1 -4*J +5(4-0(0—40(0(0(0(0(0 05 CO* 05* C C C + Ή E rl +l Di 'ro CO—I 'TT—)··—> —5

Di -D 3 r-Ι 3 (D <D <15 ICO +>>.C 053 r-go—i—l—|—l-H

O 05 —I 05 —4 ® Ή 1) ·Η S) ·Η H Β I *5 >v o + -H +1+1CC0 +5(0(0(0(0(0

H\ o o 'rt o Ή 5-H—Ir-H—I——IOOEra05 05CC -ri rOECOCOEEEEE

H (-CD + C0 >.0>-0>NC'rl053COj-IX5--4.rl +C((0 —4+5

O —I fr +5 + +i O-Di Cl Di Q-Di <H +> Ή .C O ® -Ή IH ((0C-+1C—'CCCCC C

ϋ 05 -i(rr+ 0>-0>.0 >--4-1 C H (. It L J1 (I) (CO 3—10505 05 05 05 05 45 05

Di O ·— a5 — 45I(h—Ifc4—4+—Ι(0(15(00>-(0·- -ι E^fflEu^OOOEO

35 ϋ < 05>05>IQ-O'Q.35aCJ5CjQDi05—iQ.CC B(l)-irei3r£ri£ —ί ·η3·Η0Π®Π®®0® 35 UO-Olliyr-ViDiviDi y

CC

* r- E

·+. «mvorMcooHOrHcNcn-crinQ* + co o coo ** + M < m io mmmm Z**++ cocoxsoo uj z 105525

Esimerkeissä 44 ja 45 frankfurtinmakkarat pinnoitettiin kastamalla kukin makkara Butterfieldin puskuroituun fosfaatti-laimenninliuokseen, joka sisälsi noin 42,5 ppm kaliumorto-fosfaattia deionoidussa vedessä, jonka pH oli asetettu arvoon 7,2. Esimerkit 44 ja 45 erosivat toisistaan vain siinä suhteessa, että esimerkissä 45 makkaroihin oli siir-rostettu Listeriä-bakteereita. Täten esimerkki 44 oli siir-rostamaton vertailu (siis ei keksinnön mukainen) ja esimerkki 45 on siirrostettu vertailu (siis ei keksinnön mukainen) samalla tavalla kuin edellä esimerkit 29 ja 30. Butter-fieldin puskuroitua fosfaattilaimenninta käyttämällä voitiin minimoida mahdollisesti jo läsnäolevien tai lisättyjen bakteereiden hajoaminen osmoottisten voimien seurauksena. Tulokset eivät osoita merkittäviä Listeriä-määriä siirrosta-mattomassa vertailussa 42 vuorokautta kestäneen koejakson aikana, kun taas aerobisten bakteereiden keskimääräinen mal-jalaskennan kokonaistulos oli 3 200 000 cfu/makkara 42 vuorokautta kestäneessä kokeessa. Siirrostettuun vertailuun kuuluvissa makkaroissa (esimerkki 45) todettiin nopeata Listeria-kasvua, eli maljalaskennan lähtöarvo, 340 cfu/makkara, nousi keskimääräiseen arvoon 1 400 000 000 cfu/makkara 28 vuorokauden aikana. Bakteereiden maljalaskentatulok-sia ei määritetty 42 vuorokauden näytteestä erittäin suuresta bakteerimäärästä johtuen, joka suuri bakteerimäärä voi- » « tiin todeta pakkauksista näköhavainnon perusteella vakuumi-pakkauksen sisältämän nesteen sameutena. Elintarvikemikro-biologiaa tunteville henkilöille on selvää, että tämä sameus johtuu erittäin suurista bakteeripitoisuuksista. Nämä 42 vuorokauden jälkeen todetut suuret bakteerimäärät olivat ilmeisiä kaikissa esimerkeissä lukuunottamatta siirrostama-tonta vertailua (esimerkki 44) sekä jäljempänä tarkasteltuja esimerkkejä 54 ja 55. Aerobisten mesofiilien maljalasken-nan kokonaistulokset osoittavat, että aerobisten bakteereiden, joita ovat sekä Listeriä-bakteerit (fakultatiivinen anaerobi) että muut satunnaiset bakteerit, kokonaiskasvu suureni keskimääräisestä arvosta 120 cfu/makkara keskimää- * ' räiseen arvoon 1 900 000 000 cfu/makkara 28 vuorokautta kestäneen kokeen aikana.

45 105525

Esimerkeissä 46-53 testattiin EDTA:n dinatriumsuolan vesipohjaisia liuoksia. Liuoksena ollut Na2EDTA-suolaa testattiin frankfurtinmakkaroiden pinnalla yksinään ja yhdistettynä propyleeniglykoliin, natriumbentsoaattiin, kaliumsorbaat-tiin, lysotsyymiin sekä kolme komponenttia käsittävänä järjestelmänä yhdessä propyleeniglykolin ja parabeenien kanssa. Propyleeniglykolia testattiin yksinään sekä yhdistettynä kaupallisesti saatavaan nestesavuun, jota yhtiö Red Arrow Products Co., Manitowoc, Wisconsin, myy kauppanimellä CharsolR C-10. Kaikissa näillä koeliuoksilla pinnoitetuissa makkaroissa todettiin asiattoman voimakasta bakteerikasvua 42 vuorokautta kestäneen koejakson päätyttyä. Kuitenkin esimerkit 46, 49-52 kykenivät jonkin verran estämään bakteerikasvua, mikä todetaan aerobisten bakteereiden pienentyneistä keskimääräisistä maljalaskentatuloksista 28 vuorokautta kestäneen kokeen aikana siirrostettuun vertailuun verrattuna, mutta vain esimerkkien 52, 50 ja 51 mukaiset, vastaavasti lysotsyymiä, natriumbentsoaattia ja kaliumsor-baattia sisältäneet liuokset kykenivät edes jollain tavalla saamaan aikaan Listeria-bakteerin keskimääräisten maljalas-kentatulosten logaritmista vähenemistä 28 vuorokauden aikana.

• · : Esimerkeissä 54 ja 55 testattiin vesipohjaisipa liuoksia, jotka sisälsivät 100 ppm ja 250 ppm bakteriosiinia (bakte-riosiini oli lisätty Nisaplin-tuotteena) yhdistettynä 0,8 paino-%:iin Na2EDTA-suolaa, ja joita käytettiin bakteereja torjuvana pinnoitteena pastöroiduissa frankfurtinmakkarois-sa. Nämä pinnoitteet kykenivät vastustamaan patogeenisten Li s teriä-bakteereiden siirrostumista makkaroihin siten, että keskimääräisen maljalaskentatuloksen lähtöarvo laski pienemmäksi kuin 10 cfu/makkara, tämän keskimääräisen malja-laskentatuloksen pysyessä arvossa 20 cfu/makkara tai sen alle koko 42 tuntia kestäneen koejakson ajan. Listeria-bak-teerille selektiivisen LPM-agarin käyttö saattaa vähentää, ‘ ' agarin selektiivisestä luonteesta johtuen, alussa läsnäol- leiden Listeriä-organismien lukumäärää. Tästä syystä aero- « 105525 4 6 bisten bakteereiden kokonaislaskenta toteutettiin käyttämällä epäselektiivistä standardimenetelmäagaria, esimerkiksi TGY-agaria. Aerobisten bakteereiden kokonaislaskentatulok-set eivät sisältäneet ainoastaan Listeriä-pesäkkeitä vaan myös muiden bakteereiden kuten Staphylococcus-bakteereiden muodostamat muut satunnaiset pesäkkeet, jotka muut bakteerit voivat kasvaa Listeria:n kanssa kilpaillen tai niiden rinnalla. Esimerkeissä 54 ja 55 aerobisten bakteereiden keskimääräinen kokonaismaljalaskenta osoittaa organismien lukumäärän yllättävän logaritmisen pienentymisen esimerkin 45 mukaiseen siirrostettuun vertailuun verrattuna. Keskimääräiset maljalaskentatulokset eivät olleet ainoastaan 10 cfu/makkara tai sen alle kokeen alussa ja 14 vuorokauden kuluttua, vaan laskentatulokset olivat myös 28 vuorokauden jälkeen <10, <10 ja 3900 cfu/makkara esimerkissä 54, sekä <10, 230 ja 70 000 cfu/makkara esimerkissä 55, verrattuna kolmelta siirrostetulta vertailumaljalta saatuihin tuloksiin, jotka olivat 80 miljoonaa, 440 miljoonaa ja 5,2 miljardia cfu/makkara (keskiarvo 1,9 miljardia cfu/makkara). 42 vuorokauden kuluttua 100 ppm bakteriosiinia ja Na2EDTA-suolaa sisältäneellä liuoksella pinnoitetuilla makkaroilla saatiin keskimääräiseksi maljalaskentatulokseksi alle 10 cfu/makkara, kun taas esimerkin 55 mukaisten, 250 ppm bakteriosiinia ja Na2EDTA-suolaa sisältäneellä liuoksella pinnoitettujen makkaroiden kolmelta maljalta voitiin laskea <10, 270 000 ja 1 300 000 cfu/makkara. Näin ollen 42 vuorokauden jälkeen esimerkkien 54 ja 55 mukaisilla siirrostetuilia makkaroilla saatuja aerobisten bakteereiden kokonaismalja-laskennan tuloksia voidaan edullisesti verrata esimerkin 44 mukaisen siirrostamattoman vertailun kolmelta maljalta 42 vuorokauden jälkeen laskettuihin tuloksiin, jotka olivat 130 000, 180 000 ja 9 200 000 cfu/makkara (keskiarvo 3,2 miljoonaa cfu). Nämä merkittävät tulokset osoittavat lisäksi, että bakteriosiinia ja kelatoivaa ainetta sisältäviä koostumuksia voidaan käyttää elintarvikkeen suojaamiseksi patogeenisten bakteereiden ja elintarviketta pilaavien bakteeereiden kasvulta pitkien ajanjaksojen ajaksi alenne tuissa lämpötiloissa. Täten elintarvikkeen säilyvyys voi 47 105525 parantua säilytysajan pidentyessä. Näitä uusia koostumuksia voidaan käyttää upotusliuoksena tai niitä voidaan ruiskuttaa tai sekoittaa elintarvikkeeseen tai niillä voidaan pinnoittaa pakkauskalvoja, jotka saatetaan sitten kosketukseen elintarvikkeen kanssa.

Esimerkit 56-65

Esimerkeissä 56-65 selvitettiin frankfurtinmakkaroiden pinnoitettujen päällysten kyky torjua mikrobeja Listeria monocytogenes -bakteer e iden ja muiden luonnostaan makkaroiden pinnalla esiintyvien mikro-organismien kasvun hillitsemiseksi sen jälkeen, kun suoli on poistettu makkarasta ennen va-kuumipakkaamista.

Makkarat valmistettiin edellä esimerkeissä 29-43 kuvatun, naudanliha/sianlihaemulsiota käsittävän valmistusohjeen ja valmistusmenetelmän mukaisesti, paitsi että esimerkeissä 56-65 dekstroosia käytettiin puolet taulukossa A esitetyistä määristä. Jalostaminen toteutettiin samankaltaisesti, suhteellisen kosteuden ollessa kuitenkin 25 %, ja makkaroita kypsennettiin niin kauan, kunnes niiden sisälämpötila saavutti noin arvon 71°C. Toinen ero edellä kuvattuun makkaroiden valmistusmenetelmään nähden oli se, että käytetyn suolen sisäpinta oli pinnoitettu testattavilla komponenteilla siten, että bakteriosiinia ja/tai EDTA:n di- tai trinat-riumsuolaa oli lisätty rypytysliuokseen ennen suolen rypyttämistä. Testattavia komponentteja lisättiin määrinä, joilla päästiin taulukossa 4 lueteltuihin painoprosenttisiin osuuksiin, jotka on laskettu lopullisen rypytetyn, uudestaan kostutetun suolen kokonaispainosta. Esimerkit 56 ja 57 olivat vastaavasti siirrostamaton ja siirrostettu vertailu (ne eivät olleet keksinnön mukaisia) ja niissä käytettiin kaupallisesti saatavaa suolta, joka sisälsi olennaisesti samat rypytysliuoksen komponentit kuin esimerkeissä 58-65, kuitenkin ilman bakteriosiinia ja EDTA:n natriumsuolaa. Tyypillisiä rypytys liuoksia on kuvattu esim. US-patentti-julkaisussa 3 898 348, joka liitetään oheen tällä viittauk- 48 105525 sella. Suolen poistamisen jälkeen makkaroita säilytettiin noin 4 °C:n lämpötilaan jäähdytettyinä mikrobiologisten kokeiden aloittamiseen saakka. Juuri tehtyihin, jäähdytettyihin makkaroihin siirrostettiin Listeria monocytogenes -seosta ja maljalaskentatulokset määritettiin kokeen alussa (0. vuorokautena) sekä 7, 14, 28 ja 42 vuorokauden jälkeen edellä esimerkeissä 44-55 kuvatuilla toimenpiteillä, seuraa-via eroja lukuunottamatta. Makkaroihin siirrostettiin Liste-ria-bakteereita vähintään 1000 organismia/makkara. Siir-rostetut makkarat pakattiin kahdeksan makkaran pakkauksiin siten, että kutakin testattavaa suolta kohden muodostettiin erillisiä pakkauksia esimerkeissä 44-55 kuvatulla tavalla, ja näitä pakkauksia säilytettiin noin 4,4 °C:n lämpötilassa määrityksiin saakka. Taulukoissa 4a ja 4b on esitetty määri-tystulosten aritmeettiset keskiarvot.

Taulukoista 4a ja 4b nähdään, ettei vertailuesimerkin 56 mukaisissa siirrostamattomissa, käsittelemättömissä makkaroissa todettu Listeria-esiintymiä 42 vuorokautta kestäneen kokeen aikana, ja aerobisten bakteereiden keskimääräinen ko-konaismaljalaskennan tulos kasvoi lähtöarvosta 900 cfu/mak-kara 28 vuorokauden kuluttua saatuun arvoon 4 300 000 cfu/-makkara, joka oli saavuttanut 42 vuorokauden jälkeen arvon 22 000 cfu.

49 1 0 5 5 2 5

CD

en I + £ ro esi © O OOOQOOOO % <T H o oooooooo _ °

v- O OOOOOOOO

o ooooooor-t ; _·· O OtTOOOOOiN *-> o m n o O gun o j-cn * * at « « « at O CD U CJ · O «H O O < 00 o *->*-* „ _ ,3 O o M o CC <0 <*-

(Μ <n m :CDCD · ·!-ι C O

^ ·Η 3 Ό O 3 f_ L h OO*- 3 J-\ G OCD·1—joo c<-

vO CD — C G

* + 4-> O ‘—I ·μ O

« + :co .¾ σ ή ε ο σ ¢3 coo ο οοοοοβίοο cnco c ε ο ο · o n h o 000004 oo ο .a -h <r 3 □ v O OOOOO OO HI <r <f --i O Cg - - - - - - - - _*cn r^<j->sMaGa

O N Ο Ο Ό N on μ ·Η OC

Ο <*"1 © Ο Ό N O <N 0) Η ·Η Ή Ή Ή □ ΙΛ cd en oo o EoocnGoar~ μ - - > - -r-CDJ^^CJ^^J^^r^ m VO m CM r-H 0) n H) U) ¢1 J) ΙΛ

v <n en tn 0 g G o G C C

-J g ^c jc ^c JC CD Ή -H

·- G O O O O —η·μ H

CD G G »"H <“H i—l -G -G

E -GO 3333 — CO CO

\ _ _ _ —, _ _ _ Ä eno GHGGO ® ® -1 ** o 2 22222222 ή g n cc cd cd o m bi

G Γ- I—I O (ΝΟΟΟΟΟΟΟ FC 4J 44 4J 4J O

G- v O OOOOOr-O© ,5 .p CCCC 'H-H

g * * * * * “ * “ ro a ο o g ο a ο o v_» 2 00 <»> r~- <t o o > g ™ ™ <^»h 1 μ g g g o o g o .m ” “•'^H-GcococDCDcncn cm :CD I" O O OOOOOOOO !μ :n, CCCCg-H^ :co * o 2SS2S222 en ^ .5.5.5.5v 3 3 v en oo o «n »H <n »h o m .μ ^ ·μ ·μ ·η ή — 4-> jj

m C :CD 4J 4J 44 4-> C3 CO CO

»" ΛϊΝ<ηβη2 E CD CD CO CD □ -G -G

H μ «n <N CG CC CO CO CO O C C

U > G»—f (0 [f] CG Cl GG

es § §§§§§§§§ s«2sBfs 2 -S v -1 *Ί^''l^°i3333^™3

-J < « £* ‘5,·® ·®·®β C C

£ □ H H H H > (0 (D

I 4~> (D CD Π K ^ 'Π'Π icO c 4-1 ε ε ε ε h »-h i-h C :¾ '°° , · , *,«*“"«« 3 ® CO CD CO CC ° E 1 ce-2· 1 1 01000000 g- .2

on E G G G g en G G

Ή '—I CCCC-^CC

zroccccocc

• P CD CO CO CO '—i CD CO

·· <^!^!<«<-<<;·η E E E E 3 E E

h S o a S a o S 0000 00 -H H WWWWWW ° -* j* g: _* 4- g: g: g <n n n is n n m '3 _ p G I 1 4 14 4 4 4 4 4 CG . - · ~ >~_μ cen * * £ z z S 5= o o o o g o o

D. G ό μ μ μ μ g μ G

E m m ο Ο ό m m ή ggggggg O :G -—^ en en Ό ve <>J o O C ~ Ή ή ·μ ·η r—t ·μ ·μ g: g s? -irHooooo ro j* j* ^ μ;

C :ro I OOOOOOO <J-G GGGCOCDGG

e · :ro a 1 · \o-g gggg-ggg g e E' e 10000000 |<u

GO Ci H CD

^ 4-13 LAGCCCC-'-JCC

o !g-g ή cd cd cd ro <—i ro ro 3 E -g CE 'TTTncD'Tn CD ·Η X G G ^ H r—i r—I £ f—) i—l <f >H -G 3 -G 3 * •Hco-eorororocDco G G 1—t G 1—I .μ .μ .μ .μ .μ .μ .μ ^ > CD E E E E CO E Ε

Ο 0< Ο ·μ Ο ·Η CCCCCCC^ HG -G

iiC μ CC μ CD ·Η μ Ή Η ·Η μ ·μ l-tCcncCCC^CC

ϋ; μ 4-ΐ μ -G ·μ ·μ ·μ ·μ μ ·μ ·μ G -H O G G G G G G G

Z3 μ μ.μ μ G G M G G G G Ε-ι3ΌΌ3Ό ΕΌΌ _J ·- G ·μ G I ·μ ·μ ·Η Ή ·μ ·μ ·μ -Η ΟΗΓΓΓΟμΓΓ 3) G>G>ICCCCCCC G-HCCCDCDCDroCroro

=π · UJ C

ε • μ · « Ν «ΟΟΌιΊΝη^ιη * + COX)

GO !“> “D ΙΟίΛνΟνΟΌΟΟΟ * *+ + CDCC.O.O

LG Z II

105525 + Ο Ο οοοοοοοο <? ο ο οοοοοοοο o o οοοοοοοο «s o οοοοοοοο 5

^ <M O Oi-HOOOOOO

π o or->ooo©oo π o o o-troooo 03 r-l θ' H O Π H o O CM r-l O H N N "Τ' _ p CD . . >- tD U- · ^ M ·«£ 0 3 3 ω co u ·

Ci_ 1Λ 01 rl 3 n -i· vO 4-4 X C Ci— — + i c.o o Ji

«00 O ©«00000© M J ® o „ -C

ε <S O O OOtOOOOOO ffl ^ ·“>,_ g ίο o o ο o o o o o ή CO I i—i σ o ·η

v . . . ...... -H CO -—OOP

o o o o o oo <m o o r-- j^ i-i e o o *-H Ο O O O r4 r-l O O ¢-4-1 O -r- CO fr, VO O 00 O <N <D O 3 CD —1 C3 C-

H .... . . ε 03 U— —-| Λ <f O

cd < m <r cm oeo ·h r—c cj -u c r4 —t CO cccco o N (D CO α -H rC ·Η fr

3 C3 -H -H -H O

o ·- O O 4^ 4-> 4-> -G

n o co co en co «I -t->0 O X CC CD —1

r < Ο O ΟΟΟΟΟΟΟΟ CD ϋ OCOCOCO

m <Ηνθ O ΟΟΟΟΟΟΟΟ --e O C

-n in O P>OIONlflinOO e -t-1 Ή ·Η Ή 'Γ • H *- * ........ nSlCOCO'r! m O HNrtH00<TNO CD CD Λ 4-1

r_ Ή CM <f CM X CD ID -C

CD CM Η DKIJICOJJ

ai CIO

^ 1 C C O

V r- © Ο ΟΟΟΟΟΟΟΟ .nice O H ri H :®

m Ο Ο ΟΟΟΟΟΟΟΟ tl) h G 3 3 3 CD

0 O r-l Hfl«C0H«OO ·Η —I O -rl -U W CC

. « ..«..««· c:co cd cd CD

r- , CM vC CN CD H H PO CO ^ CM £ £3 _} 4_) 4J 0) 0)_x C <D C3 C C C >.

, i X —-I r—i X X X >.

01 > C <D —I

-r-ι V_4 _ -r-i CM CO CO CO CD

X) _ _ _ ______ _·“ j* r-ι ro ro n e

o m CO O ΟΟΟΟΟΟΟΟ v -h .r h H ^ CD

£ 5 o o οοοοοοοο a 2."i ^ P* Q e e e e e c<: * ******** sd co co co cu ,_N 'C {4J C'* •'“J ,r"5 ,r"5

C X —H r-i —H --I

i' ·-* D x ro ro ro ro o r-jjroeeee

:® -5 . , 00 00 CO OO 00 CC ÖC g-,S -H e C C C

e ero ro * _’ ’ ‘ _ ‘ _ en a —1 x x x x h n o. 1 · 01000000 p o e e e e CD E -—> zrocccc

> 4J CO CO CO CD

•h ω ε ε e ε H ihiini °o ,rJ oaooaoo o a .*.*.* _ WWPeWWWM cm3.. .... ..

m nmcvimnn .Hv.jnnna <L· I 1 β I 0 IQ 0) CB 4) <0 , TT “tl -C. ϋ C CD I 1 β I ä ^ β ör - '“ί O Π5 iC ? ^ ? 5

O 1 ' ÄIÄÄÄäää CO‘nö)*JfHl-htH

0 ·η ro e ro ro ro ro 1 :co - SS S S £ o o <r-Sxrororororo , g H^OSOOO ^1,2.5855 § £ !3 cl S 3 °°°. ^“6-.**:*.*

en C £ CO 4-> i OOOOOOO lACOCOCCCCC

_v S 4-> iwwwwwww ·η ro ro ro ro ro ro n CO QJ e £ 05 '·η a_> 3 4-J 3 % (D H CD H --; «—(<—Ι'-ί

Π .CO r—f CO r—f ·Η ·Η Ή ·Η ·Η Ή ·Η Ή CO E CO CO CO CO CO

S h ο·^ο·η e e e e e e e ^ροεεεεε m e- CO fH CO «H r—. ·Η γ-!·Η·Η ^ ή 4-5

m n t. tj 4-J ·Η ·*Η τ>ί·Η·Η'ί-{·Η C-tC4-iCCCCC

g Hiu-r^p ro ro ro ro ro ro ro a>-—»coöjcucucdq; V r-! d) ·Η I H Ή ‘ί—ί 'Π Ή ·Η ·Η £ ·Η ^ £ Ό ^ "Ο "Ο

S C0>C0>ICCCCCCC 'HöJOJHlIII

, CO-HCOCCOCOCOCÖ <0 ε ·Η· VO Γ- ΟΟΟ'ΟΗΝΠ'^ΐη * + CQ0 u*> tn ιηίΛνΟΌΌ^νΟΌ * 3+C+4-COJ3 UJ 'Ζ 51 105525

Siirrostetussa vertailussa Listeria:n keskimääräiseksi lähtöarvoksi saatiin 8500 cfu/makkara, joka kasvoi 42 vuorokauden aikana arvoon 200 000 000 cfu/makkara. Tässä vertailussa kaikkien aerobisten bakteereiden alustava keskimääräinen maljalaskentatulos oli 6700 cfu/makkara, joka kasvoi 42 vuorokauden aikana arvoon 680 miljoonaa cfu/makkara. Kummassakin vertailussa käytettiin muokkaamatonta, kuiduilla vahvistamatonta, kaupallisesti saatavaa E-Z Peel NojaxR-selluloosasuolta, jonka valmistaja oli Viskase Corporation, Chicago, Illinois. Esimerkeistä 58-65 saatujen tulosten tarkastelu osoittaa, että mikrobeja torjuvia aineita, joita oli levitetty suoleen ennen sen täyttämistä lihaemulsiolla ja ennen kypsentämistä, oli siirtynyt kypsennettyjen frank-furtinmakkaroiden pinnalle määrinä, jotka riittivät inhiboimaan sekä Listeria:n että kaikkien aerobisten bakteereiden kasvua siirrostettuun vertailuun verrattuna (esimerkki 57) sen jälkeen, kun suoli oli poistettu makkaroista.

Oheisessa keksinnössä voidaan myös käyttää tavanomaisia ("regular") selluloosasuolia. Nämä suolet voivat olla ilman kuorimista helpottavia kemikaaleja. Tällaiset suolet on edullisesti voitu käsitellä hapoilla, tai päällystetyt elintarvikkeet, erityisesti proteiinia ja rasvaa sisältävät elintarvikkeet kuten juuri täytetyt makkarat voidaan suih-kuttaa happamalla liuoksella ennen lämpökäsittelyä (kypsentämistä tai pastörointia). Tällainen happokäsittely voi parantaa tai ylläpitää mikrobeja torjuvien aineiden, kuten nisiinin tai keksinnön mukaisen pediosiinin joko yksinään tai kelatoivaan aineeseen yhdistettynä, kykyä suojata päällystettyä elintarviketta ennen lämpökäsittelyä ja/tai kuorimista tai sen jälkeen.

Esimerkit I-IV

Esimerkit I ja II ovat vertailuesimerkkejä, jotka eivät ole keksinnön mukaisia. Esimerkit III ja IV ovat oheisen keksin-.. nön mukaisia.

52 105525

Kaikissa seuraavissa esimerkeissä mainittu elintarvikkeiden pakkauskalvo on kuiduilla vahvistamaton, regeneroitua selluloosaa oleva, alalla hyvin tunnettua tyyppiä oleva pienikokoinen suoli, jota voidaan käyttää kuorettomien frankfurtin-makkaroiden, wieninmakkaroiden ja muiden vastaavien valmistamiseen. Tällainen suoli voidaan pinnoittaa tai kyllästää erilaisilla lisäaineilla säilyvyyden, kuoriutuvuuden, jne. parantamiseksi.

Kuiduilla vahvistamaton kuivavarastosuoli on perinteisesti rypytetty suolipätkiksi tavanomaisissa täyttökoneissa käyttöä varten. Rypytystoimenpiteen aikana, juuri ennen suolen kokoamista laskokseksi, suolen sisäpinnalle levitetään tasaisesti ruiskuttamalla liuosta vakionopeudella. Tämä on tavanomainen menetelmä (katso esim. US-patenttijulkaisu 3 462 794, joka liitetään oheen tällä viittauksella) suolen sisäpinnan pinnoittamiseksi.

Edellä kuvatulla menetelmällä voidaan levittää neljä erilaista, taulukossa I kuvattua liuosta, jolloin saadaan neljä erilaista suolinäytettä, joista kukin sisältää yhtä-suuren säädetyn määrän liuosta suolen pinnalle tasaisesti levitettynä.

•ί Vertailuesimerkissä I käytetty liuoskoostumus on tyypilli nen, juuri ennen rypyttämistä suolen sisäpinnalle ruiskutettava liuos. Vesi kosteuttaa suolen ja se toimii myös muiden komponenttien kantajana, joista komponenteista voidaan mainita pehmintimet ja/tai kostutusaineet kuten propyleeni-glykoli, liukastusaineet kuten mineraaliöljy, emulgaattorit kuten etoksiloitujen monodiglyseridien seokset, joita yhtiö Mazer Chemicals, Inc., Gurnee, Illinois, myy tuotenimella Mazol 80, sekä kuorimista helpottavat aineet kuten karboksi-metyyliselluloosa.

53 105525

Vertailuesimerkissä II käytettävän liuoksen koostumus on sama kuin esimerkissä I käytetyssä liuoksessa, lukuunottamatta sitä, että siihen on lisätty kelatoivana aineena ety-leenidiamiinitetraetikkahapon dinatriumsuolaa (Na2EDTA·-2H20).

Keksinnön mukaisessa esimerkissä III liuos on samankaltaista kuin vertailuesimerkissä II, paitsi että liuos sisältää 0,025 paino-% lysotsyyminä olevaa mikrobeja torjuvaa ainetta .

Keksinnön mukaisessa esimerkissä IV liuos on samankaltaista kuin vertailuesimerkissä II, paitsi että siihen on lisätty 1,0 paino-% tuotetta Nisaplin. Nisaplin on tavaramerkillä suojattu kaupallinen nisiinivalmiste, joka on tehty fermen-toimalla Lancefield-ryhmään N kuuluvien Streptococcus lac-tis-bakteerin ei-patogeenisten kantojen puhdasviljelmiä penisilliiniä sisältämättömässä, lämpökäsittelemällä steriloidussa, rasvattomassa maitohajotteessa. Fermentointituote väkevöidään vaahdotusprosessilla ja se erotetaan suolalla säestämällä happamissa olosuhteissa ja kuivataan sumutuspro-sessilla, jolloin saadaan seosta, jonka aktiivisuus on 1/40 puhtaan nisiinin aktiivisuudesta. Nisiinivalmistetta kuvataan yksityiskohtaisemmin julkaisussa Federal Register Voi. 53, no. 66, sivut 11247-11251 {6. huhtikuuta 1988), joka liitetään oheen tällä viittauksella. Koska liuoksessa käytetään 1,0 paino-% Nisaplin-tuotetta, niin esimerkin IV mukainen liuos sisältää 0,025 paino-% nisiiniä. Puhtaan nisiinin aktiivisuus on noin 40 x 10^ IU/g.

Kutakin näistä neljästä liuoksesta levitetään tasaisesti samankaltaisten, mutta erillisten suolinäytteiden pinnalle. Kutakin liuosta ruiskutetaan vakionopeudella, joka määritetään kunkin liuoksen tapauksessa siten, että saadun, ruiskuttamalla käsitellyn suolen vesikosteuspitoisuus on noin 19,3 paino-% kostean pinnoitetun suolen kokonaispainosta *- - laskien.

54 105525 Nämä neljä rypytettyä suolinäytettä, joiden kunkin sisäpinta on pinnoitettu erilaisella liuoksella, voidaan täyttää tavanomaisesti frankfurtinmakkaroille tyypillisellä, pelkkää naudanlihaa sisältävällä lihaemulsiolla käyttäen kaupallisesti saatavaa konetta kuten Frank-A-Matic-merkkistä makkaroiden täyttökonetta, jonka valmistaja on Townsend Engineering Co., Des Moines, Iowa, siten, että halkaisija täytettynä on noin 21-22 mm. Päällystetyt makkarat voidaan sitten koota telineille ja viedä savustamoon niiden lämpö-käsittelemiseksi tavalliseen tapaan.

Tyypillisessä lämpökäsittelyprosessissa savustamoon johdetaan kostutettua kuumaa ilmaa kaasulämmitteisestä kuumenta-jasta siten, että savustamon lämpötila saadaan kohoamaan (mihin kuluu tavallisesti 15-30 minuuttia) 60 °C:n suuruiseen, kuivalla tuntoelimellä saatuun lämpötilaan, ja suhteellinen kosteus (RH) noin arvoon 25 %. Sitten savustamon kostutuslaitteet suljetaan; savua päästetään sisään ja lämpötilaa ja kosteutta pidetään vakioarvoissa 60 °C/25 % RH viisitoista minuuttia. Tämän jälkeen savun johtaminen lopetetaan, savustamon kostutuslaitteiden annetaan aueta tarpeen mukaan ja savustamon lämpötila nostetaan (tavallisesti 15-20 minuutin pituisen ajanjakson aikana) noin arvoon 71 °C (saatu kuivalla tuntoelimellä) pitäen suhteelli-nen kosteus vakiona eli noin arvossa 25 %, ja näitä olosuhteita ylläpidetään 15 minuuttia. Sitten lämpötila (mitattu kuivalla mittaelimellä) nostetaan jälleen (tavallisesti 15-20 minuutin aiakna) noin 82 °C:hen pitäen suhteellinen kosteus vakiona eli noin arvossa 25 %, ja näitä olosuhteita ylläpidetään noin 45 minuuttia, kunnes päällystettyjen makkaroiden sisälämpötila on noussut arvoon 68-71 °C.

Sen jälkeen, kun sisälämpötila on noussut alueelle 68-71 °C, lämmitys lopetetaan ja makkaroiden päälle ruiskutetaan kylmää vesijohtovettä noin 10 minuutin ajan, minkä jälkeen makkarat siirretään suihkutunneliin, jossa päällystettyjen *- - makkaroiden päälle suihkutetaan suolan vesiliuosta (8 % suolaa) noin -4 °C:n lämpötilassa noin 10 minuutin ajan, kunnes makkaroiden sisälämpötila on saatu laskemaan noin arvoon 2 °C.

55 1 0 5 5 2 5

Sitten suoli voidaan poistaa jäähdytetyistä, päällystetyistä makkaroista käyttäen tavanomaista laitetta kuten Ranger Apollokuorimislaitetta "kuorettomien" makkaroiden saamiseksi .

Nyt kunkin esimerkin mukaisiin kuorettomiin makkaroihin voidaan siirrostaa puskuroitua liuosta, joka sisältää kolmea patogeenistä Listeria monocytogenes-kantaa. Listeria-baktee-rit voidaan siirtää kunkin makkaran pinnalle steriilillä puikolla, joka on kastettu Listeriä-pitoiseen liuokseen, ja joka vedetään sitten kerran makkaran koko pituutta pitkin siten, että kunkin makkaran pinnalle saadaan siirtymään vähintään noin 100 ja edullisesti vähintään 1000 Listeria monocytogenes-solua.

Sitten nämä siirrostetut makkarat voidaan pakata kahdeksi kerrokseksi, kunkin kerroksen käsittäessä neljä makkaraa, siten, että yhteensä kahdeksan makkaraa saadaan pakatuksi monikerroksiseen termoplastiseen estokerrospussiin, jonka ytimen muodostaa vinylideenikloridi-metyyliakrylaatti-kopo-lymeerin ja vinylideenikloridi-vinyylikloridi-kopolymeerin seoksesta valmistettu hapen ja kosteuden estokerros ja tämän ydinkerroksen kummallakin puolella on etyleeni-vinyy-liasetaatti-kopolymeeria oleva ulkokerros. Kussakin esimerkissä lukuisiin pusseihin, joissa kussakin on 8 makkaraa, vedetään 29 in Hg (noin 736,6 mm Hg) alipaine ja ne sulje-taan lämpösaumaamalla.

Sitten nämä pakatut, siirrostetut makkarat voidaan jäähdyttää noin 4 °C:n lämpötilaan, ja kussakin esimerkissä pakkauksista otetut makkarat analysoidaan kokeen alussa ja kulloinkin kahden viikon jälkeen yhteensä kuuden viikon ajan.

56 105525

Edellä mainituin väliajoin makkaranäytteet voidaan analysoida poistamalla makkara pussista ja huuhtomalla sen pinnalla mahdollisesti olevat mikro-organismit steriiliin puskuriin. Sitten huuhteluliuoksella toteutetaan (1) standardimaljalas-kenta tavanomaisen menetelmän mukaisesti käyttäen tryptoni-glukoosi-hiiva-agaria sekä (2) selektiivinen Listeria mono-cytogenes-maljalaskenta LPM-agarilla ja FSIF-menetelmällä, joka on kuvattu edellä esimerkeissä 1-28.

Kokeen alussa toteutetulla makkara-analyysillä varmistetaan Listeria-bakteereiden läsnäolo kaikissa näytteissä sekä ly-sotsyymin ja nisiinin läsnäolo esimerkkeihin III ja IV, vastaavasti, kuuluvien makkaroiden pinnalla.

Sekä neljän että kuuden viikon kuluttua esimerkkeihin I ja II kuuluvissa makkaroissa odotetaan esiintyvän elävien Listeria monocytogenes-pesäkkeiden kasvua alkuperäiseen siirrostukseen verrattuna. Esimerkkiin III kuuluvissa, lysotsyymillä käsitellyissä makkaroissa odotetaan esiintyvän vähemmän eläviä Listeria-oraanismeia kuin siirrostetuis-sa vertailunäytteissä. Samoin esimerkkiin IV kuuluvissa, nisiinillä käsitellyissä makkaroissa odotetaan esiintyvän neljän ja kuuden viikon jälkeen vähemmän eläviä LisL^ria-organismeja kuin siirrostetuissa vertailumakkaroissa.

*

Vertailuesimerkit I ja II sekä oheisen keksinnön mukaiset esimerkit III ja IV havainnollistavat keksinnön mukaista menetelmää ja kalvoa.

Edellä kuvatun keksinnön muut muunnokset ovat ilmeisiä alan asiantuntijalle, ja seuraavissa patenttivaatimuksissa määritellyn keksinnön katsotaan kattavan kaikki tällaiset muunnokset .

• ·

Claims (15)

105525

1. Bakteereja torjuva koostumus, joka on tarkoitettu elintarviketuotteeseen lisättäväksi elintarvikkeen säilömistä varten, tunnettu siitä, että se käsittää Pediococcus-peräistä bakteriosiinia tai vastaavaa synteettistä bakteereja torjuvaa ainetta yhdessä kelatoivan aineen kanssa määränä, joka on tehokas patogeenisten Listeria monocytogenes-bakteeri-en tappamiseksi, torjumiseksi tai kasvun ehkäisemiseksi joutuessaan kosketukseen niiden kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että bakteriosiini tai bakteereja torjuva aine on lämpöä kestävä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että bakteereja torjuva aine käsittää Pedio-coccus acidilaetiti-organismista peräisin olevaa bakteriosiinia tai vastaavaa synteettistä ainetta.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että bakteereja torjuva aine on pediosiini.

.. 5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1...4 mukainen koostu mus, tunnettu siitä, että koostumus on nesteenä tai kiintoaine-nesteessä -suspensiona.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1. . .5 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että kelatoiva aine on orgaanista . ,· ainetta, joka on valittu EDTA:n tai jokin sen suolan, sitruuna- « hapon tai jokin sen suolan ja syklodekstriinin muodostamasta ryhmästä.

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1...6 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että koostumuksen pH . se 105525

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1...6 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että koostumuksen pH s5. 9

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1...8 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että bakteriosiinia on läsnä koostumuksessa pitoisuutena, joka on vähintään 5 ppm koostumuk sen painosta.

10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1...8 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että bakteriosiinia on läsnä koostumuksessa pitoisuutena, joka on vähintään 100 ppm koostumuksen painosta.

11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1...10 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että kelatoivaa ainetta on läsnä koostumuksessa määränä, joka on vähintään noin 0,2 % koostumuksen painosta.

12. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1...10 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että kelatoivaa ainetta on läsnä koostumuksessa määränä, joka on vähintään noin 0,8 % koostumuksen painosta.

·. 13. Menetelmä elintarvikkeen pinnan käsittelemiseksi bakteere ja torjuvalla aineella, tunnettu siitä, että elintarvike saatetaan kosketukseen kalvon kanssa, joka kalvo on pinnoitettu sellaisella määrällä jonkin patenttivaatimusten 1...12 mukaista bakteereja torjuvaa koostumusta, joka määrä riittää patogeenisen Listeria monocytogenes-bakteerien tappa-miseksi, torjumiseksi tai kasvun ehkäisemiseksi. f

14. Menetelmä elintarvikkeen pinnan käsittelemiseksi bakteereja torjuvalla aineella, tunnettu siitä, että elintarvike pinnoitetaan sellaisella määrällä jonkin patenttivaatimusten 1...12 mukaista bakteereja torjuvaa koostumusta, joka määrä riittää patogeenisen Listeria monocytogenes-bakteerien tappamiseksi, torjumiseksi tai kasvun ehkäisemiseksi elintar vikkeen pinnalla. 59 105525

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että pinnoittaminen toteutetaan ruiskuttamalla mainittua koostumusta elintarvikkeen päälle tai kastamalla elintarvike tähän seokseen. 105525