ES2226686T3 - Pelicula de envasado alimentario y metodo para el tratamiento de la superficie de los alimentos. - Google Patents
Pelicula de envasado alimentario y metodo para el tratamiento de la superficie de los alimentos.Info
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Abstract
Una película de envasado del alimento que incluye una película polimérica que contiene nisina; dicha película se adapta para transferir dicha nisina a la superficie de un producto alimentario en contacto con ésta en una cantidad eficaz para impedir o inhibir el crecimiento microbiano en dicha superficie del alimento después de la eliminación de dicha película y, comprendiendo dicha película dicha nisina en una cantidad eficaz para impedir o inhibir el crecimiento de Listeria tras contacto, en la que dicha película está entremezclada, recubierta y/o impregnada con dicha nisina, de modo que la nisina se puede liberar de dicha película y se transfiere a una superficie del producto alimentario en una cantidad controlada hasta el punto necesario para proporcionar un efecto antimicrobiano sobre dicha superficie del producto alimentario, incluso después de eliminar dicha película del contacto con dicha superficie del producto alimentario.
Description
Película de envasado alimentario y método para el
tratamiento de la superficie de los alimentos.
El invento se refiere a películas de envasado y
elaboración para productos alimentarios que contienen composiciones
antimicrobianas y bactericidas y a un método para inhibir o impedir
el crecimiento de microbios tales como bacterias, mohos y levaduras
en las superficies de los alimentos.
La "conservación de los alimentos", según se
emplea este término en esta memoria, incluye métodos que protegen
frente a la intoxicación alimentaria, así como métodos que retrasan
o impiden el deterioro de los alimentos debido a microbios. La
conservación de los alimentos conserva los alimentos seguros para
consumo e inhibe o impide el deterioro de los nutrientes o cambios
organolépticos que provoquen que los alimentos se vuelvan menos
apetitosos.
El "deterioro de los alimentos", según se
emplea este término en esta memoria, incluye cualquier alteración
en la condición del alimento que lo convierte en menos apetitoso,
lo que incluye cambios en el sabor, olor, textura o apariencia. El
alimento deteriorado puede ser tóxico o no serlo.
La "intoxicación alimentaria", según se
emplea este término en esta memoria, se refiere a la enfermedad
provocada en mamíferos por ingesta de alimentos contaminados por
virus, mohos o bacterias patógenas y/o sus toxinas. El alimento
contaminado por patógenos no muestra necesariamente ningún signo
organoléptico de deterioro. La intoxicación alimentaria bacteriana
puede estar provocada bien por infección del hospedante con el
organismo bacteriano o bien por acción de una toxina producida por
la bacteria en el alimento o en el hospedante.
La prevención del deterioro del alimento y de la
intoxicación alimentaria se ha procurado a lo largo de la historia,
a menudo mediante ensayo y error. Los primeros intentos han dado
como resultado la adopción de métodos de conservación alimentaria
tales como la desecación, la salazón y/o el ahumado de los alimentos
con objeto de conservarlos. Es relativamente reciente en la
historia registrada que la conservación alimentaria se está
asentando sobre una fundación científica. En el siglo diecinueve,
el trabajo de científicos tales como Louis Pasteur y Robert Koch
elucidó los principios bacterianos de la intoxicación y deterioro
alimentarios y proporcionó nuevos métodos de identificación de
bacterias patógenas y de conservación de los alimentos.
Los tecnólogos de alimentos actuales emplean un
conjunto de procedimientos y agentes físicos, químicos y biológicos
para conservar el alimento e impedir la transmisión de enfermedades
vía los productos alimentarios. Además de procedimientos tales como
la irradiación, la fermentación, la pasteurización, el control de
temperatura, el pH y/o la actividad del agua, existe una plétora de
agentes químicos. Estos agentes incluyen antioxidantes para impedir
la degradación química del alimento, así como composiciones que
matan o inhiben bacterias deletéreas y/o otros microbios, de modo
que conservan los alimentos, es decir, impiden tanto el deterioro
como la transmisión de enfermedades. Los agentes químicos
antimicrobianos empleados comúnmente incluyen nitritos, nitratos,
dióxido de azufre, sulfitos y ácidos, tales como el ácido acético,
propiónico, láctico, benzoico y sórbico y sus sales, humo de leña y
humo líquido y antibióticos tales como natamicina y nisina.
La prevención de la intoxicación alimentaria es
de capital importancia en la industria de fabricación alimentaria.
La preocupación por la inocuidad de los alimentos ha llevado a la
mayoría de los países a regular fuertemente la industria
alimentaria para asegurar la salud pública. También, los fabricantes
de alimentos elaborados invierten considerables recursos para
asegurar la inocuidad de sus productos. A pesar de estos esfuerzos,
la intoxicación alimentaria sigue ocurriendo. Muchos casos de
intoxicación alimentaria se han atribuido a bacterias tales como
Salmonella, Clostridium y Staphylococcus,
entre otras.
Una preocupación creciente es el descubrimiento,
relativamente reciente, en la industria de fabricación alimentaria
de la contaminación extendida de Listeria en aves de corral
y en alimentos elaborados como salchichas de Viena, otras
salchichas, quesos, productos lácteos que incluyen helados
novedosos y marisco. De especial preocupación es la evidencia
reciente de que los alimentos elaborados, pasteurizados y
totalmente cocidos, se están contaminando con microbios como
Listeria monocytogenes después de la cocción o pasteurización
y previamente al envasado para el punto de venta. Tal contaminación
es típicamente contaminación de superficie que se cree originada
por contacto de los microbios con las superficies de los alimentos
subsiguiente al termotratamiento (es decir, cocción o
pasteurización). Microbios tales como Listeria pueden ser
transportados por el aire (es decir, llevados por el polvo) o estar
presentes en superficies de contacto de los alimentos, tal como el
equipo de elaboración.
En los años 80 se han notificado numerosos brotes
de intoxicación alimentaria en todo el mundo, en los que el agente
causante se sospechó o se identificó como alimentos contaminados
por Listeria. Se han descrito brotes de listeriosis
(infección por la bacteria Listeria) en humanos en
Massachussetts, California y Pensilvania en los EE.UU. y también en
Canadá y Suiza. Estos brotes se han atribuido a la ingesta de
alimentos contaminados por Listeria, tales como ensalada de
col fresca, queso fabricado a partir de leche cruda, quesos blandos
maduros en su superficie y el salami. Cientos de personas se han
visto afectadas con una tasa de mortalidad de hasta aproximadamente
un tercio de los afectados. Particularmente susceptibles a la
enfermedad (que es contagiosa) son las mujeres embarazadas, los
fetos, los recién nacidos y los lactantes, así como adultos con
sistemas inmunes comprometidos, por ejemplo, adultos en tratamiento
con fármacos inmunosupresores como corticosteroides. La listeriosis
es una enfermedad grave que puede provocar meningitis, abortos
espontáneos y septicemia perinatal. Aunque es tratable con un
diagnóstico temprano, la listeriosis sin tratar muestra una elevada
tasa de mortalidad.
La conservación de los alimentos por inhibición
del crecimiento de Listeria monocytogenes es difícil. Según
se informa, Listeria puede reproducirse y crecer tanto
aeróbica como anaeróbicamente, a pHs superiores a 4,85 y en un
amplio intervalo de temperaturas que pueden ser tan bajas como 3ºC
y tan altas como aproximadamente 45ºC. Ésto significa que
Listeria puede crecer a temperaturas normales de
refrigeración. También se ha descrito que Listeria puede
crecer en una disolución acuosa de hasta un 10% de sal.
Afortunadamente, la cocción o la pasteurización matan a
Listeria. Desafortunadamente, la contaminación por
microorganismos puede ocurrir después de la pasteurización por el
fabricante. Mucha gente come alimentos elaborados después de que
haya transcurrido un período significativo de tiempo desde una
primera cocción o pasteurización por el fabricante del alimento, de
tal modo que se permite crecer a la bacteria introducida por
contaminación posterior a la pasteurización. Dado que este consumo
de alimento puede llevarse a cabo sin recalentar el alimento
elaborado hasta temperaturas suficientes durante el tiempo
suficiente para matar cualquier microbio (como Listeria) que
se haya podido introducir con posterioridad a la cocción inicial,
hay riesgo de intoxicación alimentaria. El invento presente trata de
mejorar el riesgo referido.
El documento
US-A-4 597 972 describe un
procedimiento para controlar el crecimiento de esporas de
Clostridium botulinum y, de ahí, la elaboración de la toxina
botulínica en un producto alimentario, exceptuando un procedimiento
de pasteurización con elevado contenido de humedad de un producto
de queso; dicho procedimiento incluye la adición a dicho producto
de una cantidad de nisina, o de un cultivo productor de nisina,
suficiente para inhibir el crecimiento de la espora botulínica.
Los documentos
US-A-2 979 410,
US-A-3 124 468 y
GB-A-822 758 describen películas de
envasado de alimentos que se recubren con fungicidas, tales como
antibióticos derivados de mohos, como los antibióticos de
tetraciclina.
El documento WO 89/12399 A1, que afecta sólo a la
novedad y es técnica anterior de acuerdo con el Artículo
54(3) EPC, describe composiciones de nisina para uso como
intensificadores de bactericidas de espectro amplio.
Un objetivo del invento es proporcionar una
película que contiene una composición antibacteriana eficaz para
matar y/o inhibir el crecimiento de Listeria.
Es un objetivo del invento proporcionar una
película polimérica capaz de transferir una cantidad controlada de
un agente antimicrobiano a una superficie del producto
alimentario.
Otro objetivo del invento es matar, inhibir o
impedir el crecimiento de microorganismos patógenos sobre la
superficie de un producto alimentario por un método de transferir
un agente antimicrobiano a la superficie de un producto alimentario
en una cantidad controlada.
Otro objetivo del invento es transferir un agente
antimicrobiano a un producto alimentario en una cantidad eficaz
para impedir el crecimiento de bacterias patógenas sobre la
superficie del producto alimentario después de eliminar la película
para la duración en almacenamiento normal del producto
alimentario.
Otro objetivo del invento es impedir o inhibir el
crecimiento de Listeria monocytogenes en salchichas de Viena
sin pellejo después de la cocción inicial y de la eliminación del
envoltorio, a través del envasado para venta al consumidor hasta la
apertura de las salchichas envasadas para consumo por el
consumidor.
Otro objetivo del invento es aumentar la duración
en almacenamiento de los alimentos elaborados por aplicación de una
mezcla sinérgica, preferiblemente un líquido o una suspensión, de
la bacteriocina nisina derivada de Streptococcus lactis (o
su equivalente sintético) y, opcionalmente, un agente quelante.
De este modo, el presente invento proporciona una
película de envasado del alimento, según se define en la
reivindicación 1, así como un método de tratar la superficie de un
producto alimentario, según se define en la reivindicación 15.
Realizaciones adicionales se abarcan en las reivindicaciones
dependientes respectivas.
Los objetivos antedichos y otros, que se harán
aparentes a continuación, pueden llevarse a cabo al tratar un
comestible, es decir, la superficie de un producto alimentario con
un agente antimicrobiano, preferiblemente un agente quelante como
ácido cítrico en combinación con la bacteriocina nisina derivada de
Streptococcus. El tratamiento se lleva a cabo al poner en
contacto el producto alimentario con una película que contiene un
agente antimicrobiano (específicamente nisina). La película puede
mantener el agente en contacto con la superficie del producto
alimentario, de tal modo que transfiere una cantidad controlada del
agente desde la película a la superficie del producto alimentario o
puede transferir el agente antimicrobiano (con o sin empleo de un
agente de difusión como la zeína) al producto alimentario, según lo
cual la película puede retirarse con el restante agente
antimicrobiano transferido sobre la superficie del producto
alimentario en una cantidad eficaz para matar, impedir o inhibir el
crecimiento sobre la misma tanto de organismos que deterioran el
alimento como de microorganismos patógenos tales como
Listeria.
En un aspecto del invento se proporciona una
película de envasado del alimento que incluye una película
polimérica que contiene la bacteriocina termorresistente nisina,
derivada de Streptococcus (o su agente antibacteriano
sintético equivalente). Este agente es eficaz preferiblemente
frente al crecimiento de bacterias gram positivas, especialmente
Listeria monocytogenes, y es termorresistente.
No es necesario que todos y cada uno de los
objetivos anteriores estén presentes en todas las realizaciones del
invento; es suficiente con que el invento pueda emplearse de forma
ventajosa.
Lo fundamental de la composición del invento es
la combinación sinérgica de un agente secuestrante o quelante, tal
como una sal de EDTA o ácido cítrico, con la bacteriocina nisina
derivada de Streptococcus (o su equivalente sintético). Una
mezcla líquida o suspensión de nisina y de agente quelante se
prefieren especialmente.
Un aspecto fundamental de un método del presente
invento es la protección de la superficie del producto alimentario
durante un período de tiempo sustancial después de la eliminación
de la película.
Un aspecto fundamental de una realización de la
película del invento es el empleo del agente antimicrobiano
termorresistente nisina que es eficaz frente a bacterias después de
pasteurización o termotratamiento.
Se ha descubierto que una composición
antimicrobiana que incluye una combinación sinérgica de la
bacteriocina nisina derivada de Streptococcus (o su
equivalente sintético) y un agente quelante tal como el ácido
cítrico presenta unas propiedades bactericidas inesperadamente
buenas, especialmente contra bacterias patógenas, tales como
Listeria monocytogenes. Además, tal composición es capaz,
sorprendentemente, de prolongar la duración en almacenamiento de
los alimentos al impedir el deterioro de los alimentos durante un
período de tiempo mayor que el que se esperaría teniendo en cuenta
la eficacia de cada componente separadamente.
Nisina es la bacteriocina empleada. Nisina es una
bacteriocina polipeptídica producida por la bacteria del ácido
láctico, Streptococcus lactis del grupo N.
Según se informa, nisina es un nombre colectivo
que representa a varias sustancias relacionadas estrechamente, que
se han designado nisinas A, B, C, D y E, que tienen una composición
de aminoácidos similar. La estructura y propiedades de la nisina
son más ampliamente comentadas en el artículo de E. Lipinska,
titulado "Nisin and its Applications" en The 25th Proceedings
of the Easter School in Agriculture Science at the University of
Nottingham, 1976, páginas 103-130 (1977); artículo
que se incorpora en esta memoria por referencia. El comité de
estandarización biológica de la organización mundial de la salud
(The World Health Organization Committee on Biological
Standardization) ha establecido una preparación de nisina de
referencia internacional y la unidad internacional (UI, de aquí en
adelante) se define como 0,001 mg de esta preparación. NISAPLIN es
el nombre de la marca comercial del concentrado de nisina que
contiene 1 millón de UI por gramo, la cual está disponible
comercialmente en Aplin & Barrett Ltd., Trowbridge, Wiltshire,
Inglaterra.
La nisina es un conservante alimentario conocido
del que también se sabe que es termoestable, estable a los ácidos y
activo frente a bacterias gram positivas. La nisina se emplea como
un conservante alimentario en productos lácteos y vegetales,
normalmente junto con tratamiento térmico. La nisina también se
encuentra de forma natural en la leche cruda y se ha empleado en la
termoelaboración de pastas cárnicas. La nisina se considera no
tóxica, con datos toxicológicos que indican que no presenta efectos
adversos a niveles de 3,3 millones de UI por kg de peso corporal.
Según se dice, la nisina puede soportar el calentamiento a 121ºC sin
pérdida de actividad. Aunque se espera alguna pérdida de actividad
cuando se emplea con alimentos elaborados, ésta puede mejorarse,
por ejemplo, aumentando la cantidad de nisina aplicada. Los niveles
eficaces de nisina para conservar los productos alimentarios varían,
según se informa, desde 25-500 UI/g o más.
Agentes quelantes (secuestrantes) apropiados
incluyen ácidos carboxílicos, ácidos policarboxílicos, aminoácidos
y fosfatos. En particular, los siguientes compuestos y sus sales
están entre los que se consideran útiles:
Ácido acético
Adenina
Ácido adípico
ADP
Alanina
\beta-Alanina
Albúmina
Arginina
Ácido ascórbico
Asparragina
Ácido aspártico
ATP
Ácido benzoico
Ácido n-butírico
Caseína
Ácido citracónico
Ácido cítrico
Cisteína
Ácido deshidrácetico
Desferri-ferricrisina
Desferri-ferricromo
Desferri-ferrioxamina E
Ácido 3,4-dihidroxibenzoico
Ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA)
Dimetilglioxima
O,O-dimetilpurpurogallina
EDTA
Ácido fórmico
Ácido fumárico
Globulina
Ácido glucónico
Ácido glutámico
Ácido glutárico
Glicina
Ácido glicólico
Glicilglicina
Glicilsarcosina
Guanosina
Histamina
Histidina
3-hidroxiflavona
Inosina
Inosina trifostato
Ferricromo sin hierro
Ácido isovalérico
Ácido itacónico
Ácido kójico
Ácido láctico
Leucina
Lisina
Ácido maléico
Ácido málico
Metionina
Metilsalicilato
Ácido nitrilotriacético (NTA)
Ornitina
Ortofosfato
Ácido oxálico
Oxistearina
\beta-fenilalanina
Ácido fosfórico
Fitato
Ácido pimélico
Ácido piválico
Polifosfato
Prolina
Ácido propiónico
Purina
Pirofosfato
Ácido pirúvico
Riboflavina
Salicilaldehído
Ácido salicílico
Sarcosina
Serina
Sorbitol
Ácido succínico
Ácido tartárico
Tetrametafosfato
Tiosulfato
Treoniona
Trimetafosfato
Trifosfato
Triptófano
Uridina difosfato
Uridina trifosfato
Ácido n-valérico
Valina
Xantosina
Muchos de los anteriores agentes secuestrantes
son útiles para la elaboración de los alimentos en sus formas
salinas, que son normalmente sales de álcalis metálicos o
alcalinotérreos tales como sodio, potasio o calcio o sales
cuaternarias de amonio. Los compuestos secuestrantes con múltiples
valencias pueden emplearse de forma beneficiosa para ajustar el pH
o introducir o sustraer de manera selectiva iones metálicos, por
ejemplo, en un sistema de revestimiento del alimento. Información
adicional acerca de agentes secuestrantes y quelantes se describe
en T. E. Furia (Ed.), CRC Handbook of Food Additives, 2ª edición,
páginas 271 -294 (1972, Chemical Rubber Co.) y M.S. Peterson y A.M.
Johnson (Eds.), Encyclopedia of Food Science, páginas
694-699 (1978, AVI Publishing Company, Inc.); ambos
artículos se incorporan en esta memoria por referencia.
Los términos "agente quelante" y "agente
secuestrante" se emplean en esta memoria como sinónimos y se
definen como compuestos orgánicos o inorgánicos capaces de formar
complejos de coordinación con metales.
También, según se emplea el término "agente
quelante" en esta memoria, incluye compuestos encapsuladores de
moléculas tales como la ciclodextrina. El agente quelante puede ser
inorgánico u orgánico, pero preferiblemente es orgánico.
Los agentes quelantes preferidos no son tóxicos
para los mamíferos e incluyen ácidos aminopolicarboxílicos y sus
sales, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o sus
sales (particularmente sus sales di y trisódicas) y ácidos
hidrocarboxílicos y sus sales, como el ácido cítrico. Sin embargo,
agentes quelantes de tipo ácido hidrocarboxílico distintos del ácido
cítrico y del citrato también se cree que son útiles en el presente
invento, tales como ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico,
ácido tartárico y sus sales.
Según se indicó anteriormente, el término
"agente quelante" se define y se usa en esta memoria como un
sinónimo de agente secuestrante y se define también como agente que
incluye compuestos encapsuladores de moléculas, como la
ciclodextrina. Las ciclodextrinas son moléculas de carbohidratos
cíclicos que tienen seis, siete u ocho monómeros de glucosa
dispuestos en un anillo en forma de "donut", que se marcan
alfa, beta o gama ciclodextrina, respectivamente. Según se emplea
en esta memoria, la ciclodextrina se refiere tanto a monómeros como
a polímeros de ciclodextrina no modificados y modificados. Los
encapsuladores moleculares de ciclodextrina están disponibles
comercialmente de American Maize-Products de
Hammond, Indiana. Las ciclodextrinas se describen más ampliamente
en el Capítulo 11 titulado "Industrial Applications of
Cyclodextrin" de J. Szejtli, páginas 331-390 de
Inclusion Compounds, Vol. III (Academic Press, 1984), cuyo
capítulo se incorpora en la presente memoria por
referencia.
referencia.
Las mezclas de bacteriocina nisina derivada de
Streptococcus con uno o más agentes quelantes pueden
emplearse de forma útil de acuerdo con el presente invento. Tales
mezclas pueden ser sólidos en suspensiones líquidas o soluciones. A
menos que se indique de otro modo, el empleo del término
"disolución" en esta memoria incluye no sólo sólidos o
líquidos disueltos en un líquido, sino también suspensiones de
sólido en líquido o mezclas. Solventes adecuados, diluyentes o
soportes para la mezcla del agente quelante y de la bacteriocina son
agua, alcoholes, propilenglicol, aceites como aceite mineral,
animal o vegetal, glicerina o lecitina.
Aunque las bacteriocinas disponibles
comercialmente pueden contener productos lácteos puede ser
ventajoso para la composición bactericida o para la preparación de
la conservación alimentaria del presente invento que no contengan
productos lácteos añadidos tales como queso, suero, cuajadas o
sólidos lácteos con calcio. Se ha descrito que los iones de calcio
y magnesio pueden inactivar la nisina. Parece ser, sin dejarse
llevar por las creencias, que los agentes que secuestran calcio y/o
magnesio pueden ser particularmente convenientes. Las mezclas del
presente invento que contienen una mezcla de bacteriocina y agente
quelante se aplican a los productos alimentarios, incluyendo
productos lácteos y productos no lácteos, como salchichas, otras
carnes, vegetales y frutas, mediante empleo de una película
impregnada o recubierta según se describe abajo. Tales soluciones
pueden formularse a pHs muy variados, pero las más convenientes
serán neutras o ácidas. Las soluciones ácidas se cree que
intensifican o mantienen la eficacia antibacteriana de estas
soluciones y, en consecuencia, se prefieren. Las soluciones que
tienen un pH menor o igual que aproximadamente 6 se prefieren y las
menores o iguales a 5 se prefieren especialmente. Las cantidades de
los componentes bacteriocina y agente quelante pueden variar
dependiendo de factores como: tipo de bacteriocina, tipo de agente
quelante, pH, otros constituyentes presentes (p. ej., tipo de
solvente de la solución), aplicación, es decir, tipo de producto
alimentario sobre el que se aplicarán los materiales, modo de
empleo, condiciones de elaboración subsiguientes (p. ej.,
termotratamiento), un período de tiempo deseado de eficacia para
matar o inhibir bacterias y tipos de bacterias frente a las que se
protege el producto alimentario, etc. La persona medianamente
especializada en la técnica puede determinar las cantidades
apropiadas de bacteriocina y de agente quelante sin experimentación
excesiva. El agua es el disolvente preferido para preparar una
solución. Las cantidades adecuadas de bacteriocina en una mezcla
para tratar productos alimentarios como salchicha incluyen desde 5
hasta 250 ppm de bacteriocina (por peso de la mezcla total) o más.
Cantidades menores que 5 ppm son factibles, pero dependiendo del
uso pueden resultar menos eficaces que concentraciones mayores.
Cantidades mayores que 250 ppm también son factibles, pero
concentraciones crecientes tienen la desventaja de incrementar los
costos debido al dispendio de bacteriocina. Se ha encontrado que
las concentraciones entre 50 y 150 ppm son eficaces y no son caras,
donde concentraciones de 150 ppm o más son muy eficaces para matar
o inhibir bacterias patógenas como Listeria monocytogenes,
p. ej., en las superficies de salchichas alemanas cocidas. La
solución puede emplearse contra otras bacterias y es especialmente
eficaz contra bacterias gram positivas. Las cantidades de agente
quelante empleadas pueden variar ampliamente, p. ej., cantidades
entre un 0,2 y un 0,8 ó 3,0 por ciento en peso o más pueden
emplearse de manera provechosa. La composición también puede
contener otros agentes antimicrobianos o antibacterianos u otros
aditivos, tales como colorantes y aromatizantes, p. ej., humo
gaseoso o líquido.
Las películas de envasado de alimentos apropiadas
para el empleo en el presente invento incluyen películas
poliméricas tales como película soplada, película orientada,
película de estirada y contraída, bolsas termocontraibles y
envoltorios de alimentos. "Películas de envasado de alimentos",
según se emplea este término en esta memoria, son materiales en
forma de lámina flexible que son convenientemente de 0,38 mm (15
mil) o menos y preferiblemente de menos de 0,25 mm (10 mil) de
grosor.
Las películas adecuadas incluyen celulosa
regenerada y películas termoplásticas estiradas y contraídas y
pueden ser películas en monocapa o multicapa. Las películas
contraídas se forman preferiblemente dentro de bolsas
termocontraibles orientadas biaxialmente.
Las películas adecuadas incluyen envoltorios de
alimentos que son generalmente películas flexibles, que son
preferiblemente tubulares y pueden estar formadas por materiales
poliméricos que incluyen materiales celulósicos como celulosa
regenerada o carbamato de celulosa o por plásticos como
homopolímeros o copolímeros de poliolefinas, p. ej., copolímeros de
polipropileno, polietileno o poliamidas, poli(tereftalato de
etileno), poli(cloruro de vinilideno) o copolímeros de
etileno-acetato de vinilo o por películas
proteínicas como colágeno. Preferiblemente, los envoltorios son
envoltorios celulósicos tubulares que se preparan por uno
cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Tales
envoltorios son tubos generalmente flexibles, de pared fina sin
costuras que están formados preferentemente por celulosa
regenerada, y similares, con distintos diámetros. También son
apropiados los envoltorios celulósicos tubulares que tienen una red
reforzadora fibrosa embebida en su pared. Los envoltorios que
tienen una red reforzada son normalmente denominados "envoltorios
fibrosos del alimento", mientras que los envoltorios celulósicos
sin el refuerzo fibroso se refieren en esta memoria como envoltorios
celulósicos "no fibrosos". Ambos envoltorios naturales y
sintéticos están contemplados por el presente invento.
Los envoltorios convencionalmente conocidos como
"envoltorios de materia prima seca" pueden emplearse en la
práctica de este invento. Tales envoltorios tienen generalmente un
contenido de agua en el intervalo de entre aproximadamente un 5 y
aproximadamente un 14 por ciento de agua en peso en envoltorio no
fibroso y dentro del intervalo de entre aproximadamente un 3 y
aproximadamente un 8 por ciento de agua en peso en envoltorio
fibroso, según el peso total del envoltorio, agua incluida.
Los envoltorios convencionalmente conocidos como
"envoltorios de materia prima gel" son envoltorios que tienen
más elevados contenidos de humedad, ya que no se han secado
previamente y tales envoltorios pueden emplearse en la práctica de
este invento.
Los envoltorios convencionalmente conocidos como
"envoltorios rehumedecidos" son envoltorios de materia prima
seca a los que se añade humedad, por ejemplo, para facilitar el
fruncido y/o relleno y tal envoltorio puede emplearse en la
práctica de este invento. Tales envoltorios tienen generalmente un
contenido en agua dentro del intervalo de aproximadamente un 15 a
aproximadamente un 23 por ciento en peso en envoltorio no fibroso o
dentro de aproximadamente un 16 a aproximadamente un 35 por ciento
en peso en envoltorio fibroso, según el peso total del envoltorio,
agua incluida.
El agente antimicrobiano empleado en el invento
es nisina que puede ser eficazmente transferida desde una película
de envasado de alimento hasta un producto alimentario para
proporcionar una superficie de producto alimentario que contiene
dicha nisina, lo que impide o inhibe el crecimiento de
microorganismos encima incluso después de eliminar el contacto de la
película con la superficie del producto alimentario.
El agente antimicrobiano (es decir, nisina) puede
incluir aditivos tales como agentes aglutinantes, tampones,
emulsionantes, adyuvantes de transferencia o agentes quelantes como
ácido etilendiaminotetraácetico (EDTA) o sus sales. Estos agentes
pueden aumentar el efecto antimicrobiano de la nisina o ayudar en
la transferencia desde la película de envasado hasta el producto
alimentario.
En particular, los agentes aglutinantes, p. ej.
agentes insolubles en agua como goma laca y zeína, pueden emplearse
como medios o agentes de transferencia para proporcionar
transferencia de la nisina incorporada en seguida desde una
película de envasado hasta una superficie del producto alimentario
bajo condiciones humidificantes. Los agentes aglutinantes o de
transferencia preferidos tendrán sustantividad preferencial por la
superficie del producto alimentario relativo a la película de
envasado.
La película de envasado del alimento del presente
invento contendrá sobre o dentro de la película el agente
antimicrobiano y antibacteriano nisina. La nisina será eficaz para
matar, inhibir o impedir el crecimiento de bacterias como aquellas
del género Listeria, Salmonella y Clostridium
y, preferiblemente, las especies de Listeria
monocytogenes.
Nisina es resistente a la destrucción o
inactivación por termotratamiento tal como temperaturas y tiempos
de cocción o pasteurización. Ésto es esencial para sobrevivir al
termotratamiento del producto alimentario dentro de una película de
envasado y para ser eficaz después del termotratamiento y de la
eliminación de la película.
"Termorresistente", según se emplea este
término en esta memoria, significa que el agente antimicrobiano (es
decir, nisina), que es capaz de aplicarse a una película en una
cantidad controlada, soporta la destrucción, inactivación o
pérdidas debidas al termotratamiento, p. ej., por pasteurización o
cocción, de modo que después del termotratamiento aún permanece
suficiente nisina que es eficaz para matar, inhibir o impedir el
crecimiento de microorganismos sobre los productos alimentarios a
los que se aplica. Debe entenderse que pueden ocurrir pérdidas
parciales en la cantidad de agente o en la eficacia del agente y que
también puede tener lugar inactivación parcial. Sin embargo, es
suficiente que el agente activo restante sea capaz de proteger la
superficie del producto alimentario frente a organismos patógenos
como Listeria.
En una aplicación típica del invento un
envoltorio de alimentos celulósico tubular que puede impregnarse o
recubrirse con el agente antimicrobiano nisina se emplea en la
producción de salchichas de Viena sin pellejo. En este
procedimiento bien conocido de pasteurización de salchichas, el
envoltorio se rellena con la emulsión cárnica y se forma en
eslabones. La emulsión cárnica embutida, a la que se da su forma
mediante el envoltorio, se cuece entonces (termotratada) a una
temperatura adecuada durante suficiente tiempo para llevar a cabo
la pasteurización. Típicamente, los productos cárnicos, incluidas
las salchichas, se conservan (incluso durante pasteurización) a
temperaturas por debajo de aproximadamente 88ºC (190ºF) antes de la
venta para uso particular o institucional. Generalmente, durante la
pasteurización los productos alimentarios, tales como carne
elaborada, se llevarán hasta una temperatura interna por encima de
los aproximadamente 63ºC (145ºF) y no superior a los
aproximadamente 82ºC (180ºF) antes de eliminar cualquier película
empleada para dar forma al producto durante la elaboración. La
temperatura superficial de estos productos alimentarios
pasteurizados no supera los 88ºC (190ºF) típicamente, ni es
inferior normalmente a los 77ºC (170ºF). Las salchichas embutidas
pueden procesarse adicionalmente, p. ej., mediante rociado con agua
y/o enfriamiento. El envoltorio se elimina entonces, por medios bien
conocidos de pelado, de las salchichas termotradas y las salchichas
se envasan de nuevo para venta al por menor.
En una realización del invento, el envoltorio es
un envoltorio pelable que está particularmente adaptado para pelado
y eliminación por maquinaria a grandes velocidades. El envoltorio se
conoce en la técnica como pelable a mano o por medio de máquinas.
No todo envoltorio que es pelable a mano está adaptado para el
pelado a alta velocidad llevado a cabo por máquinas como la bien
conocida Apollo Peeler fabricada por la compañía Ranger Tool
Company, Inc. de Bartlett, Tennessee. Éste y peladores comerciales
similares son capaces de eliminar el envoltorio de 40.000 a 60.000
salchichas por hora.
Por eso, el agente antimicrobiano (es decir,
nisina) que se aplica al envoltorio antes del rellenado debe
resistir a los efectos de este termotratamiento y pasos de
elaboración y permanecer eficaz para matar, inhibir o impedir el
crecimiento de microorganismos indeseables después del
termotratamiento. También, el agente (es decir, nisina) debe
transferirse al producto alimentario en una cantidad eficaz porque
el envoltorio se elimina. La contaminación microbiana de las
superficies de las salchichas puede ocurrir en el espacio de tiempo
después de la eliminación del envoltorio y antes del envasado.
Alternativamente, el agente antimicrobiano (es
decir, nisina), p. ej., en forma de una composición antibacteriana,
puede aplicarse a un producto alimentario por medio de un
recubrimiento en una película que se aplica después del
termotratamiento.
En consecuencia, el agente transferido o aplicado
(es decir, nisina) debe estar presente en cantidad suficiente y
permanecer suficientemente eficaz después del termotratamiento,
elaboración y eliminación del envoltorio para matar, inhibir o
impedir el crecimiento de microbios, preferiblemente Listeria
monocytogenes, durante un período de tiempo suficiente. Este
período de tiempo de eficacia para la nisina aplicada a la película
debe extenderse, al menos, desde el momento de la eliminación del
envoltorio hasta el envasado para venta, p. ej., a consumidores o
instituciones. Convenientemente, la nisina permanecerá eficaz a lo
largo de las fechas normales de "vender antes de" o
"caduca" durante las cuales el producto alimentario se ofrece a
la venta por el minorista. Preferiblemente, el tiempo eficaz
debiera extenderse pasada la apertura del paquete por el consumidor
hasta el final del período normal de frescura, cuando el deterioro
del alimento se hace aparente. Para las salchichas de Viena sin
pellejo los tiempos típicos son: aproximadamente entre diez minutos
y una hora desde la eliminación del envoltorio hasta el envasado de
consumo, alrededor de treinta días a sesenta días desde el envasado
de consumo hasta la venta normal al por menor y aproximadamente
siete días o más desde la apertura del envasado de consumo, bajo
almacenamiento refrigerado normal, al uso. En cualquier caso, los
períodos de tiempo deseados y la duración en almacenamiento normal
variarán de un producto alimentario a otro producto alimentario y
los especialistas en la técnica reconocerán que los tiempos de
envasado y los tiempos de duración en almacenamiento variarán
dependiendo del tipo de producto alimentario (p. ej., salchichas de
buey, aves de corral o queso), del tamaño del producto alimentario,
del número de piezas envasadas (tamaño de consumición o tamaño de
paquete institucional), de las temperaturas de almacenamiento, de
las condiciones de elaboración y del equipamiento de envasado.
La transferencia del agente antimicrobiano nisina
desde la superficie interna de una película en contacto directo con
una superficie contigua del producto alimentario, de acuerdo con
una realización del invento, es tal que la nisina se transfiere de
forma permanente, al menos en parte, al producto alimentario
durante su elaboración en una cantidad suficiente eficaz para matar
o inhibir el crecimiento de la bacteria Listeria sobre la
superficie del producto alimentario a pesar del subsiguiente pelado
y eliminación del envoltorio.
El ejemplo anterior es ilustrativo y no debe
tomarse como limitante del invento para usar con las salchichas de
Viena. El invento es aplicable a cualquier producto alimentario, en
particular, a aquellos que pueden beneficiarse de la aplicación de
una cantidad controlada del agente antimicrobiano nisina en la
superficie del producto alimentario. Se contempla que las películas
y métodos del invento tienen aplicación tanto en productos
alimentarios de origen animal o vegetal, que incluyen, pero no está
limitado a, salchichas de todos los tipos (de buey, de cerdo, de
pollo, de pavo, de pescado, etc.) cortes de carne originales o
secundarios, carnes de almuerzo, jamones, cordero, bistec,
hamburguesa y aves de corral, que incluyen pollo, pavo, pato,
ganso, así como pescado y productos lácteos como quesos semicurados
y curados, quesos elaborados y productos vegetales que incluyen
lechuga, tofú, ensalada de col fresca, proteína derivada de la soja
sustituta de la carne, etc.
La película y/o método del presente invento
emplea el agente termorresistente antimicrobiano, es decir,
antibacteriano, nisina. Nisina es una bacteriocina polipeptídica
según se describió anteriormente.
La nisina utilizada, de acuerdo con el método y
la película del presente invento, puede aplicarse antes o después
de la formación de la película para intercalar, recubrir y/o
impregnar la película con una cantidad controlada de nisina por
unidad de área de película. Los agentes quelantes, agentes
aglutinantes, emulsionantes y otros aditivos pueden aplicarse de
forma similar al envoltorio simultáneamente (bien en una mezcla o
de forma separada) o pueden aplicarse en serie.
En el presente invento el agente antimicrobiano
(es decir, nisina) y los aditivos pueden aplicarse sobre la
superficie externa de una película, tal como un envoltorio tubular,
pasando el envoltorio a través de un baño de una solución que
contiene el agente y/o aditivos. Puede permitirse a la nisina
infiltrarse en el envoltorio, durante un tiempo suficiente para que
el envoltorio incorpore la cantidad deseada de nisina y aditivos,
antes de retirar cualquier exceso de líquido al pasar el envoltorio
a través de rodillos exprimidores o escurridores, y similares. El
procedimiento de pasar el envoltorio a través de un baño de
tratamiento (que puede también denominarse "baño de inmersión"
o "depósito de inmersión") puede denominarse también paso de
"inmersión". Alternativamente, la nisina y los aditivos pueden
aplicarse externamente al envoltorio mediante métodos distintos de
la inmersión, como pulverización, pincelación, chapado por
laminación, impresión y similares.
Alternativamente, la nisina o aditivos pueden
aplicarse a la superficie interna de una película tubo, tal como un
envoltorio, por cualquiera de los diversos procedimientos bien
conocidos descritos en la patente de EE.UU. nº 4.171.381 de Chiu,
cuya descripción se incorpora por referencia. Éstos incluyen
compresión o recubrimiento por burbujeo, pulverización y
recubrimiento por fruncido.
El método de compresión para recubrir el interior
de un envoltorio conlleva el relleno de una parte del envoltorio
con el material de recubrimiento, de modo que el disco de material
de recubrimiento generalmente se encuentra en la parte inferior de
una forma en "U" que se origina cuando el envoltorio se pliega
sobre dos rodillos paralelos y entones se mueve la longitud
continua indefinida del envoltorio de modo que el disco de material
de recubrimiento permanezca confinado dentro del envoltorio,
mientras que el envoltorio se mueve pasado el disco y se recubre
en
su pared interna del material de recubrimiento contenido dentro del disco.
su pared interna del material de recubrimiento contenido dentro del disco.
También, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº
3.451.827 se describe un método de pulverización por aplicación de
una variedad de materiales de recubrimiento sobre la superficie
interna de envoltorios de pequeño diámetro. En la patente de EE.UU.
nº 3.378.379 de Shiner et al. se emplea un método de
"compresión" para aplicar materiales de recubrimiento a la
superficie interna de envoltorios de gran diámetro.
El agente antimicrobiano (es decir, nisina) puede
aplicarse a cualquier cara de la película siempre y cuando la
superficie de la película adaptada para el contacto con el producto
alimentario sea capaz de permitir la transferencia de la nisina al
producto alimentario. Por ejemplo, un envoltorio de alimento
celulósico tubular puede recubrirse en su interior by compresión con
una solución que contiene nisina como soluto o dispersión, o por
pulverización de una cantidad controlada bien en seco o en forma
líquida. Entonces, el interior del envoltorio puede rellenarse con
un producto alimentario, tal como jamones, emulsión cárnica o
queso, para poner en contacto el producto alimentario con la nisina.
Alternativamente, la superficie externa del envoltorio puede
recubrirse con la nisina y el envoltorio puede rellenarse por
inversión por medios bien conocidos en la técnica (véase, p.
ej., la patente de EE.UU. nº 4.162.693), para poner en contacto la
superficie del producto alimentario con la nisina.
Debe señalarse que la nisina que recubre la
superficie de la película, bien recubriendo externamente o
recubriendo internamente, puede o no puede existir como una
superficie de recubrimiento únicamente. Por ejemplo, la nisina puede
penetrar la estructura celulósica de un envoltorio dado que la
celulosa absorbe un solvente líquido de la solución que contiene la
nisina. Alternativamente, puede emplearse una película no
absorbente de termoplástico o una película celulósica que tiene un
recubrimiento de barrera que impide la impregnación o una película
multicapas que permite impregnación parcial hasta una capa barrera.
En consecuencia, según se emplea en esta memoria, el término
"recubrimiento" debe entenderse como que la pared de la
película no está necesariamente impregnada, sino que puede tener
solamente el agente antimicrobiano (es decir, nisina) sobre su
superficie; pero el término puede también aplicarse cuando la pared
de la película está entremezclada o impregnada con la nisina. En
cualquier caso, en la práctica la nisina debe liberarse de la
película y transferirse a una superficie de un producto alimentario
hasta el punto necesario para proporcionar un efecto antimicrobiano
sobre la superficie del producto alimentario.
Las soluciones que contienen nisina pueden, de
acuerdo con el presente invento, contener también otros
ingredientes que pueden usarse convenientemente para tratar una
película. Por ejemplo, un envoltorio de alimento tubular puede
estar recubierto con, p. ej., glicerina y/o propilenglicol que
pueden funcionar como agentes humectantes o emolientes y similares,
bien en una solución con nisina o separadamente.
Otros ingredientes que se emplean normalmente en
la fabricación de, o en el tratamiento adicional de, la película de
envasado del alimento también pueden estar presentes en, o sobre,
la película si se desea y pueden emplearse de la misma manera y
cantidades que si la nisina no se hubiera empleado. Por ejemplo,
los éteres de celulosa y los aceites minerales se emplean
frecuentemente con envoltorios celulósicos y los agentes
antibloqueo y antiestáticos se emplean frecuentemente con las
películas termoplásticas.
La película puede tener forma de hoja o tubular.
Puede venir en rollos o con longitud exacta. La película tubular
puede formarse dentro de bolsas por técnicas convencionales, p.
ej., sellado térmico y corte a lo largo de un tubo o pueden
fruncirse. La película puede fruncirse por métodos
convencionales.
Algunos tipos de películas como los envoltorios
de celulosa regenerada previamente al fruncido pueden secarse y/o
humidificarse hasta un contenido de agua adecuado para el fruncido
y/o procesamiento adicional. La necesidad de secado y/o
humidificación convencional depende del contenido acuoso del
envoltorio después del tratamiento, del tipo de envoltorio y del uso
final. Los envoltorios de materia prima gel, de materia prima seca
y rehumedecidos pueden emplearse, todos, de forma apropiada en el
presente invento.
El invento se entenderá ahora más claramente por
referencia a los siguientes ejemplos que se exponen como meramente
ilustrativos del invento y que no pretenden, de ninguna manera,
limitar el mismo. A no ser que se indique de otra manera, todas las
partes y porcentajes están en peso y todos los porcentajes
relativos a las películas o envoltorios se basan en el peso total de
la película o envoltorio. Los recuentos bacterianos por placa son
una media aritmética de tres placas, a no ser que se indique de
otra manera. Los recuentos estimados por placa se llevaron a cabo
mediante procedimientos aceptados de forma generalizada en la
técnica de la microbiología.
Ejemplos
1-28
Las eficacias de varias soluciones de ensayo y de
las concentraciones de los agentes antimicrobianos nisina (del
invento) y pediocina (comparativa) se examinaron mediante un método
de ensayo líquido frente al crecimiento de bacterias patógenas, tal
como la bacteria gram positiva Listeria monocytogenes. El
crecimiento de bacterias aeróbicas totales también se evaluó y se
examinaron las eficacias de forma similar. El uso de los agentes
quelantes ácido etilendiaminatetraacético (sal disódica), ácido
cítrico y ciclodextrina también se examinó, aisladamente y con
varias concentraciones de nisina o pediocina.
Estos ejemplos se llevaron a cabo mediante el
empleo de técnicas asépticas bien conocidas por los especialistas
en la técnica de microbiología. Se inoculó caldo de triptosa de
doble potencia de la marca DIFCO esterilizado con, al menos,
aproximadamente 10.000 unidades formadoras de colonias (ufc) por ml
de una mezcla de dos cepas patógenas de Listeria
monocytogenes serotipo 4b aisladas del alimento. Este caldo
inoculado se añadió entonces a los tubos de ensayo con soluciones
de ensayo antimicrobianas de doble potencia empleando partes
iguales de caldo inoculado y de solución de ensayo. Entonces, los
tubos de ensayo se taparon y los contenidos se mezclaron
completamente. Las Tablas 1a y 1b dan una relación de los
componentes de la solución de ensayo y de las cantidades. Después
del ensayo, el pH se midió de forma similar para las soluciones
mezcladas de caldo no inoculado y para las soluciones de ensayo; los
valores de pH también se muestran en las Tablas 1a y 1b. Las
cantidades de los componentes de la solución de ensayo se calcularon
en base a una solución de "doble potencia" que fue luego
diluida con un volumen igual de caldo inoculado, según se describe
anteriormente. Las cantidades relacionadas en las Tablas 1a y 1b se
calcularon asumiendo pesos iguales para volúmenes iguales de caldo
inoculado y de soluciones de ensayo. Las soluciones de ensayo
inoculadas mezcladas se hicieron por triplicado y se incubaron sin
agitación a aproximadamente 30ºC. Por cada muestra de ensayo se
apartó asépticamente una alícuota de 0,3 ml con pipeta
inmediatamente después de agitar (cero (0) horas), así como a las 4,
8, 24 y 48 horas. Inmediatamente después de la remoción, estas
alícuotas se sembraron sobre placas de agar LPM y de agar de soja
tríptica de acuerdo con procedimientos de recuento de placas
convencionales conocidos por los especialistas en la técnica de
microbiología para determinar los recuentos de Listeria y de
bacterias aeróbicas totales. El recuento selectivo de
Listeria se llevó a cabo mediante el método de la División de
Microbiología del Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA) del
Servicio de Seguridad e Inspección Alimentarias (FSIS) titulado
"Método FSIS para el aislamiento e identificación de Listeria
monocytogenes a partir de carne elaborada y de productos de aves
de corral" (para el uso en el programa provisional de
reconocimiento de laboratorio), según se describe en el artículo
titulado anteriormente, fechado el 4 de Noviembre de 1988 por A.B.
Moran y fechado el 8 de Noviembre de 1988 por R.W. Johnston de FSIS
y disponible del FSIS, que se incorpora en esta memoria por
referencia. Los resultados del recuento bacteriano para los
componentes de las soluciones de ensayo y para las concentraciones
particulares se describen en las Tablas 1a y 1b como un recuento
bacteriano promedio aritmético de las unidades formadoras de
colonias (ufc) por ml de tres placas repetidas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los ejemplos 1 y 2 son ejemplos control (no del
invento). En los ejemplos 1 y 2 las soluciones de ensayo fueron
agua desionizada, que se mezclaron con caldo según se describe
anteriormente (a excepción de en el Ejemplo 1 que no fue inoculado)
y se presentaron como controles. El Ejemplo 2 fue inoculado y se
tomó como control. Los resultados del ensayo indican que para el
control no inoculado (Ejemplo 1) no hubo niveles significativos de
Listeria presentes durante las 48 horas del período del
ensayo y que el crecimiento de bacterias aeróbicas no fue aparente
hasta el período de ensayo de 8 horas, cuando tal crecimiento
procedió a un ritmo rápido desde el período de 8 horas hasta los
períodos de ensayo de 24 horas y de 48 horas. El control de agua
desionizada inoculada (Ejemplo 2) exhibió una fase de estado latente
desde el recuento inicial de aproximadamente 31.000 ufc por ml para
la muestra de ensayo de 4 horas (37.000 ufc por ml) seguido de un
crecimiento explosivo a las 8 horas (10.000.000 ufc por ml) y a las
24 horas (300.000.000 ufc por ml), seguido por una fase de muerte a
las 48 horas (7.700.000 ufc por ml). Esta fase de muerte después de
un crecimiento explosivo se cree debida a factores relacionados con
el crecimiento elevado que precedió inmediatamente, tales como el
agotamiento de los nutrientes o la producción por la bacteria a
ensayo (Listeria) de productos inhibidores de desecho. De
forma similar, los recuentos de bacterias aeróbicas totales
exhibieron un período de crecimiento lento seguido por un
crecimiento explosivo y luego un "ir muriendo". Al realizar el
recuento de las bacterias aeróbicas totales de los Ejemplos
1-28, hubo evidencia de bacilos formadores de
esporas en muchos ejemplos. Típicamente, estos organismos
representan la diferencia entre los recuentos de bacterias
aeróbicas totales y los de Listeria.
Dos agentes quelantes diferentes, específicamente
(1) la sal disódica de EDTA (Na_{2}EDTA) y (2) el ácido cítrico
se sometieron a ensayo en cuanto a su actividad antibacteriana
colocando un 0,8 por ciento en peso de cada uno en agua desionizada
e inoculando según se describió anteriormente. Se encontró que el
Ejemplo 3 (Na_{2}EDTA) inhibía el crecimiento de los organismos de
Listeria con un número máximo de organismos determinados a
las 24 horas, seguido de fase de muerte a las 48 horas. El Ejemplo
4 (ácido cítrico) también resultó eficaz para matar e inhibir
Listeria, aunque el nivel de organismos fluctuó a lo largo
del período de 48 horas de ensayo con un recuento promedio elevado
de 35.000 ufc por ml descrito a las 8 horas. Con respecto a los
recuentos de bacterias aeróbicas totales, el Na_{2}EDTA resultó
inhibitorio con un recuento promedio de placas descrito elevado de
88.000 ufc por ml a las 8 horas, comparado con las 560 millones de
ufc por ml para el control inoculado (Ejemplo 2). El ácido cítrico
resultó muy eficaz: Produjo una reducción estable en el número de
bacterias aeróbicas totales a lo largo del período de ensayo a
partir de un recuento promedio inicial de 6.500 ufc por ml hasta uno
bajo de 640 ufc por ml a las 48 horas. La eficacia del ácido
cítrico puede haberse debido al menos en parte a un efecto del pH,
donde un bajo pH puede restringir el crecimiento de bacterias, como
se conoce en la técnica.
En los Ejemplos 5-16 las
soluciones de ensayo emplearon varias concentraciones de nisina
sola y con ácido cítrico y Na_{2}EDTA. Los recuentos promedio de
Listeria de las placas para todos estos ejemplos fueron de
menos de 10 ufc por ml durante todos los períodos de ensayo,
incluyendo el ensayo cero horas, llevado a cabo inmediatamente
después de la inoculación. Se determinó que todos, el Ejemplo 2 (el
control inoculado), así como los Ejemplos 3 y 4 (que sólo contienen
los agentes quelantes), tenían recuentos promedio de Listeria
de al menos 10.000 ufc por ml inmediatamente después de la
inoculación (0 h). Por tanto, podría parecer que todas las muestras
inoculadas de forma similar que contienen nisina bajo estas
condiciones de ensayo actuasen matando sustancialmente toda
Listeria tras la mezcla. El que no se observe crecimiento de
Listeria después del período inicial de ensayo puede indicar
bien una erradicación inicial o una reducción significativa de
Listeria después de una inhibición muy eficaz.
Los resultados de los recuentos de las placas de
bacterias aeróbicas totales para los Ejemplos 5-16
demuestran el efecto de la concentración de nisina en ausencia y
presencia de un agente quelante sobre el crecimiento total de las
bacterias.
Los Ejemplos 5-8 fueron
soluciones de ensayo de diversas concentraciones de nisina (en
forma de una preparación de nisina de la marca comercial Nisaplin
disponible en Aplin & Barrett Ltd.) en agua desionizada. Todos
los Ejemplos 5-8 muestran una muerte inicial de las
bacterias inoculadas hasta un nivel inferior a 10 ufc para cada
concentración de nisina. Los recuentos de bacterias aeróbicas
totales obtenidos al sembrar las soluciones de ensayo inoculadas
sobre agar no selectivo de soja tríptica debieran ser una mezcla de
Listeria añadida intencionadamente y de contaminación
fortuita de otros microorganismos. Por comparación, todos los
Ejemplos 2-4 muestran unos recuentos iniciales de
entre 5.900-9.100 ufc por ml, mientras que el
control no inoculado (Ejemplo 1) tuvo un recuento inicial de menos
de 10 ufc por ml.
La comparación del Ejemplo 5, que contiene 1 ppm
de nisina, con el control inoculado (Ejemplo 2) muestra que la
nisina es eficaz, en particular inicialmente al matar bacterias
aeróbicas y controlar, al menos inicialmente, el crecimiento de las
bacterias aeróbicas. Sin embargo, para el período de ensayo de 24
horas el recuento promedio de 130 ufc por ml a las 8 horas del
Ejemplo 5 había crecido de forma explosiva hasta 9.100.000 ufc por
ml. Este crecimiento es menor que el del control inoculado (Ejemplo
2) y aproximadamente igual al del control sin inocular (Ejemplo 1) a
las 24 horas. El rápido crecimiento de las bacterias aeróbicas
totales continuó en el Ejemplo 5, lo que resultó en un recuento de
placas promedio de 45.000.000 ufc por ml a las 48 horas. La
comparación del Ejemplo 5 con los Ejemplos 6-8
demuestra que el aumento de la concentración de nisina actuará
retrasando el comienzo de la fase de crecimiento explosivo para las
bacterias aeróbicas totales y reducirá el recuento promedio de
bacterias aeróbicas totales para cada período de tiempo relativo a
otras soluciones de ensayo que contienen menos nisina.
Los Ejemplos 9-12 igualan a los
Ejemplos 5-8 en concentración de nisina, pero
contienen también un 0,8 por ciento en peso de un agente quelante,
la sal disódica de EDTA (de aquí en adelante Na_{2}EDTA). Los
resultados para los recuentos promedio de placas de bacterias
aeróbicas totales son, excepto para las 110 ufc por ml a las 48
horas del Ejemplo 9, todos menores de 10 ufc por ml. De este modo,
una comparación de, por ejemplo, los recuentos promedio de
bacterias a las 24 horas para el Ejemplo 3 (0,8% en peso de
Na_{2}EDTA), Ejemplo 5 (1 ppm de nisina) y Ejemplo 9 (la
combinación de 1 ppm de nisina y 0,8 de Na_{2}EDTA) muestra
recuentos promedio de bacterias aeróbicas totales de 88.000 ufc por
ml, 9,100.000 ufc por ml y < 10 ufc por ml, respectivamente. La
reducción sorprendente de bacterias hasta menos de 10 ufc por ml
para la combinación de nisina y agente quelante es inesperada. La
nisina y agentes quelantes, tales como Na_{2}EDTA, parecen actuar
sinérgicamente para reducir el número promedio de bacterias
aeróbicas totales, según se muestra por comparación de los datos de
las 24 horas y 48 horas de los Ejemplos 3 y 5-12.
En los Ejemplos 13-16, se probó un segundo agente
quelante combinado con nisina. Estos ejemplos fueron similares a
los Ejemplos 5-8, pero cada uno de ellos contenía
también un 0,8 por ciento en peso de ácido cítrico. A excepción de
un recuento promedio inicial de 30 ufc por ml para el Ejemplo 16,
todas estas soluciones de ensayo que contenían la combinación de
ácido cítrico y nisina dieron recuentos promedio de placa de
aeróbicos totales de menos de 10 ufc por ml. Los resultados del
ensayo anterior demuestran la actividad antibacteriana de los
agentes quelantes individuales y de nisina, así como la
sorprendente e inesperada buena actividad de la combinación de
nisina y agente quelante frente a los niveles de bacterias
aeróbicas totales. Ésto sugiere que la combinación de nisina con un
agente quelante tal como Na_{2}EDTA o ácido cítrico funciona con
una eficacia inesperada para matar e inhibir bacterias y puede, por
tanto, aplicarse a un producto alimentario para mejorar
drásticamente la duración en almacenamiento.
En los Ejemplos 17-28 (ejemplos
comparativos) las soluciones de ensayo contienen varias
concentraciones de pediocina con y sin los agentes quelantes
Na_{2}EDTA y ácido cítrico. La pediocina se añadió como una
preparación que se produjo en la leche desnatada de acuerdo con
procedimientos generalmente conocidos en la técnica de preparar
pediocina por cultivo de Pediococcus acidilacti en leche
desnatada.
En relación con los recuentos de placa promedio
de Listeria en la Tabla 1a, es aparente que la pediocina
sola mata e inhibe el crecimiento de Listeria, pero no tan
eficazmente como la nisina en base a igual peso. Los resultados
indican que el aumento de la concentración de pediocina por encima
de 1 ppm reduce generalmente el número de Listeria en los
recuentos iniciales. Las cantidades de pediocina hasta un nivel de
10 ppm o menos inhibieron el crecimiento de Listeria relativo
al control inoculado (Ejemplo 2), pero Listeria continuó
creciendo, mientras que Pediocina a un nivel de 50 ppm o superior
no sólo parece reducir los recuentos de bacteria descritos
inicialmente, sino también impidió que el recuento de
Listeria incrementase exponencialmente, es decir, el recuento
promedio mayor de Listeria durante el período de ensayo de
las 48 horas fue 740 ufc por ml. En los Ejemplos
21-24 las soluciones analizadas fueron similares a
las de los Ejemplos 17-20 salvo que el 0,8 por
ciento en peso del agente quelante Na_{2}EDTA estaba presente con
las concentraciones diversas de pediocina. Como se demostró por
comparación de los Ejemplos 21-24 con el Ejemplo 3 y
los Ejemplos 17-20, la combinación de pediocina y
Na_{2}EDTA resultó inesperadamente eficaz para matar e inhibir el
crecimiento de Listeria a lo largo del período de ensayo de
48 horas, particularmente para niveles bajos de pediocina (10 ppm o
menos). En los Ejemplos 25-28, estas soluciones de
ensayo sustituyeron otro agente quelante, el ácido cítrico, por el
Na_{2}EDTA de los Ejemplos 21-24. Los recuentos
promedio de Listeria por placa para las soluciones que
contienen pediocina y ácido cítrico son sorprendentemente bajos e
indican una eficacia sinérgica para matar e inhibir la bacteria
Listeria. Por ejemplo, a continuación una comparación de los
recuentos promedio de placa a las 24 horas: para 0,8% en peso de
ácido cítrico solo, 70.000 ufc por ml (Ejemplo 4); para 1 ppm de
pediocina, 170,000.000 ufc por ml (Ejemplo 17) y para la combinación
de 0,8% en peso de ácido cítrico y 1 ppm de pediocina, 10 ufc por
ml (Ejemplo 25). El resultado de 10 ufc por ml del Ejemplo 25 es
extraordinariamente bajo. Las reducciones logarítmicas que pueden
conseguirse por combinación de pediocina y agente quelante
relativas a los componentes individuales solos es significativa e
inesperada.
Con respecto a los recuentos promedio de
bacterias aeróbicas totales, la pediocina parece retrasar y reducir
el crecimiento, siendo las concentraciones mayores de pediocina más
eficaces, particularmente en los períodos de ensayo de 24 y 48
horas. El empleo de pediocina y de los agentes quelantes
Na_{2}EDTA y ácido cítrico también resultó eficaz para inhibir el
crecimiento de las bacterias aeróbicas totales.
Los Ejemplos 1-28 anteriores
demuestran la eficacia de varios agentes antimicrobianos frente a
bacterias patógenas y aeróbicas. De forma inesperada, la
combinación de nisina y un agente quelante, tal como Na_{2}EDTA o
ácido cítrico, se mostró sorprendentemente eficaz frente a las
bacterias aeróbicas totales relativo al empleo de cualquiera de los
componentes por separado. También, inesperada es la sorprendente
eficacia de la combinación de pediocina y un agente quelante, tal
como Na_{2}EDTA o ácido cítrico, relativo a los componentes
individuales frente a la bacteria patógena Listeria.
Ejemplos
29-43
Varios agentes antimicrobianos aplicados a
productos alimentarios, como salchichas de Viena, se sometieron a
ensayo para determinar su eficacia frente al deterioro
subsiguiente. Las salchichas alemanas pasteurizadas preparadas
frescas sin pellejo (eliminación de la envoltura) tendrán
típicamente bacterias de superficie en menos de 1.000 ufc por
salchicha directamente después de hacer vacío al envasado durante
los procedimientos de fabricación comercial típicos. Cuando los
recuentos de bacterias alcanzan los 10^{7} a 10^{8} o mayores
órdenes de magnitud de ufc por salchicha alemana, entonces el
deterioro se hace típicamente evidente visualmente. Bacterias
comunes en el deterioro de carnes procesadas, refrigeradas y
envasadas al vacío incluyen Lactobacillus. En particular, se
ha sometido a ensayo la eficacia de varias soluciones para proteger
los productos alimentarios sumergidos en ellas frente al
crecimiento de bacterias patógenas como Listeria
monocytogenes.
Se emplearon salchichas alemanas formadas a
partir de emulsiones cárnicas y procesamiento típico. Las
salchichas alemanas se prepararon mediante relleno de emulsión
cárnica de buey y cerdo dentro de los envoltorios celulósicos de la
marca comercial E-Z Peel NOJAX® (disponibles
comercialmente en la Viskase Corporation de Chicago, Illinois) y por
cocción (aproximadamente 1 hora) en un ahumadero de gas controlado
por humedad a una humedad relativa de aproximadamente un 20% hasta
que las salchichas alemanas alcanzaron una temperatura interna de,
al menos, 71ºC (160ºF), bajo condiciones sin humo añadido. Entonces
se desprendió el envoltorio mediante un pelador comercial y se
desechó. Las salchichas alemanas peladas se almacenaron brevemente
en una bolsa de polietileno a aproximadamente 4ºC hasta que comenzó
el ensayo microbiológico. La emulsión cárnica se fabricó a partir
de los ingredientes referidos en la Tabla A mediante picado y
mezclado durante unos cinco minutos en una picadora comercial y
después desmenuzado a través de un moledor de emulsiones comercial
para obtener una emulsión cárnica uniforme. Un análisis químico de
las salchichas pasteurizadas reveló un 56,9% de humedad, un 27,2%
de grasa, un 12,2% de proteína, un 2,5% de ceniza, un 1,90% de sal,
65 ppm de nitrito sódico y un pH de 6,40 en la superficie de la
salchicha.
Las salchichas refrigeradas almacenadas a 4ºC
(40ºF) se recubrieron en su superficie con soluciones de ensayo al
sumergir individualmente las salchichas en un líquido de ensayo
durante aproximadamente 30 segundos con la menor manipulación
posible, seguido de un período de aproximadamente 30 segundos
durante el cual cada salchicha se mantuvo verticalmente para
escurrirse. Las salchichas recubiertas se inocularon entonces (salvo
un control no inoculado) con una mezcla de tres cepas de
Listeria monocytogenes patógena (que se cultivaron a partir
de cepas aisladas bien de carne animal o carne vegetal) hasta un
nivel de aproximadamente 10.000 - 30.000 unidades formadoras de
colonias (ufc) por salchicha alemana. Inmediatamente después de la
inoculación, las salchichas alemanas de cada ejemplo se sometieron
a ensayo por lavado con un tampón estéril que fue entonces sembrado
empleando métodos descritos anteriormente tanto en agar de levadura
triptona glucosa (TGY) no selectivo de Listeria como en agar
LPM selectivo de ésta y se incubaron para determinar la presencia
de bacterias aeróbicas totales y Listeria.
A continuación de la inoculación, las salchichas
se envasaron de forma individual en bolsas disponibles
comercialmente de PERFLEX® 51B Barrier Bags (manufacturadas por
Viskase Corporation de Chicago, Illinois). Estas bolsas se
sometieron a vacío y se sellaron por calor bajo un vacío elevado con
un aparato para hacer vacío y sellador comercial para proporcionar
una barrera al oxígeno y a la humedad del medio ambiente. Las
muestras de ensayo se almacenaron a temperatura ambiente (alrededor
a 25ºC) durante dos días y entonces se analizaron los recuentos de
bacterias totales y de Listeria según se describió con
anterioridad para las muestras después de la inoculación. Las
soluciones de ensayo y los recuentos de bacterias se describen en la
Tabla 2.
\newpage
En los Ejemplos 29-43, los
agentes antimicrobianos se disolvieron o suspendieron en agua
desionizada. Todas las soluciones de ensayo descritas en la Tabla 2
fueron acuosas.
El Ejemplo 29 difirió de los otros ejemplos en
que sus salchichas alemanas se sumergieron en una muestra de sólo
agua desionizada y no fueron posteriormente inoculadas con
organismos de Listeria. El Ejemplo 29 se tomó como un
control no inoculado (no del invento) para examinar el crecimiento
de cualquier organismo ya presente en el entorno, por ejemplo, de
las salchichas o introducido por contaminación accidental. Los
resultados del Ejemplo 29 indican que no hubo niveles
significativos de Listeria detectados durante el período de
ensayo de dos días, mientras que el recuento promedio de las placas
para las bacterias aeróbicas totales aumentó desde 2.600 hasta unas
590.000 ufc estimadas por salchicha.
El Ejemplo 30 se llevó a cabo como un control
inoculado (no del invento) con agua desionizada como solución de
ensayo. Este Ejemplo resultó idéntico al Ejemplo 24, salvo que las
salchichas alemanas sumergidas se inocularon con organismos de
Listeria. A lo largo del periodo de ensayo de dos días, el
crecimiento de Listeria resultó explosivo y alcanzó un
recuento promedio estimado por placa de 38.000.000 ufc por
salchicha alemana. El recuento de bacterias aeróbicas totales
mostró un crecimiento explosivo similar.
En el Ejemplo 31, una solución del 3 por ciento
en peso de la sal trisódica de EDTA no afectó apreciablemente ni al
crecimiento de Listeria ni al crecimiento de aeróbicos
totales en las salchichas a lo largo del período de ensayo de los
dos días.
En los Ejemplos 32-35 se
analizaron varias concentraciones de nisina sola y en combinación
con el agente quelante Na_{3}EDTA en las salchichas. En estos
ejemplos, la nisina se añadió como una preparación producida por
fermentación de la leche. Esta preparación de nisina está
disponible comercialmente bajo el nombre comercial "Nisaplin"
en Aplin & Barrett de Trowbridge, Inglaterra. En las soluciones
de ensayo para obtener, por ejemplo, un 0,01 por ciento en peso de
nisina fue necesario añadir un 0,4 por ciento de la preparación de
nisina (Nisaplin).
Aunque se cree que todas las salchichas
recubiertas de la solución de ensayo de los Ejemplos
30-43 se inocularon inicialmente con, al menos,
aproximadamente 10.000 ufc de Listeria por salchicha, los
recuentos iniciales promedio por placa para Listeria para
los Ejemplos 32-35 fueron todos menores que 10 ufc.
Estos recuentos iniciales bajos se cree que indican que cantidades
sustanciales de Listeria murieron al entrar en contacto con
el recubrimiento que contenía nisina. Todas las soluciones de
recubrimiento que contenían nisina resultaron eficaces en la
reducción del crecimiento de Listeria a lo largo del período
de dos días, siendo las soluciones con mayores cantidades de nisina
las más eficaces en inhibir Listeria. El Ejemplo 32, en el
que el recubrimiento de la salchicha alemana contenía sólo nisina a
nivel de 100 ppm en la solución de ensayo se mostró más eficaz a lo
largo del período de dos días. Sin embargo, ésto puede deberse bien
a una erradicación inicial o a una reducción significativa después
de una inhibición muy eficaz. Los resultados de los ensayos para las
bacterias aeróbicas totales sugieren que 100 ppm de nisina y un 3,0
por ciento en peso de Na_{3}EDTA actúan sinérgicamente para
detener el crecimiento de las bacterias aeróbicas totales sobre las
superficies cárnicas recubiertas, cocinadas o pasteurizadas, según
se observa de la comparación del Ejemplo 35 con los Ejemplos 31 y
32.
En los Ejemplos 36-39, se empleó
una preparación no comercial de nisina. Esta preparación de nisina
se obtuvo cultivando Streptococcus lactis en leche desnatada
empleando procedimientos conocidos habitualmente. El Ejemplo 36
analizó las salchichas recubiertas con una solución de nisina a 52
ppm sin el agente quelante Na_{3}EDTA. La comparación de los
resultados del Ejemplo 36 con los Ejemplos 31 y 39 indican que el
empleo de la combinación de nisina y del agente quelante
Na_{3}EDTA proporcionaron una reducción sorprendente e inesperada
en ambos recuentos promedio de Listeria por placa y de
bacterias aeróbicas totales durante el período de ensayo de dos
días.
Se examinaron otros agentes quelantes con una
acción inhibitoria y de muerte inesperadamente buena frente a las
bacterias aeróbicas totales para la combinación de nisina y ácido
cítrico o ciclodextrina. La combinación de nisina y ciclodextrina y
de nisina y ácido cítrico también mostró una eficacia muy buena
frente al crecimiento de Listeria sobre las superficies de
los alimentos. La ciclodextrina empleada en estos ejemplos fue
beta-ciclodextrina, que está disponible
comercialmente de la compañía American
Maize-Products de Hammond, Indiana.
Los Ejemplos 29-43 demuestran que
una composición bactericida que contiene nisina y un agente
quelante, tal como Na_{3}EDTA, ácido cítrico o ciclodextrina,
puede emplearse para matar e inhibir bacterias patógenas y
prolongar la duración en almacenamiento de los alimentos. La
composición novedosa que contiene una combinación de nisina y
agente quelante parece útil como conservante alimentario. En esta
memoria la solución se aplicó sobre las superficies de salchichas
por inmersión, pero se cree que pueden emplearse otros métodos de
aplicación, según se comentó anteriormente, como pulverización,
mezclado o contacto con una película de recubrimiento desprendible
y que la combinación del invento puede emplearse, no sólo con carne
elaborada, sino con otros alimentos que incluyen frutas, verduras,
productos de cereales, productos lácteos, huevos, así como carnes,
aves de corral y pescados. Se cree que la composición tiene
utilidad para productos alimentarios frescos, crudos, cocinados,
pasteurizados y esterilizados. La eficacia sinérgica, para matar e
inhibir patógenos y organismos que deterioran los alimentos, se
demuestra por los resultados de los ensayos anteriores.
\newpage
Ejemplos
44-55
Varios agentes antimicrobianos se aplicaron a las
salchichas alemanas sumergiendo cada una de ellas dentro de las
soluciones de ensayo basadas en agua que contienen los agentes. Las
salchichas sumergidas se inocularon con bacterias y se analizó el
crecimiento de bacterias en su superficie a lo largo del tiempo.
Los procedimientos para este ensayo fueron sustancialmente idénticos
a los seguidos en los Ejemplos 29-43 anteriores,
salvo en lo que se indica a continuación. La emulsión cárnica
empleada aquí fue sustancialmente la misma receta empleada en los
Ejemplos 29-43, salvo que no se empleó dextrosa en
la emulsión cárnica de los Ejemplos 44-55. Las
condiciones de cocción y elaboración de las salchichas fueron las
mismas con la salvedad de que la humedad relativa fue del 25% y que
las salchichas alemanas se cocieron hasta alcanzar una temperatura
interna de 72ºC (162ºF). Un análisis químico de las salchichas una
vez pasteurizadas reveló un pH de la superficie de 6,36 y una
humedad del 56,3%, un 28,7% de grasa, un 12,4% de proteína, un 2,6%
de ceniza, un 1,94% de sal y 56 ppm de nitrito sódico. Aunque no se
añadió humo, se realizó un análisis de humo que indicó 24,6 mg de
ácido, 0,3 mg de fenol y 7,1 mg de compuestos de tipo carbonilo por
cada 100 g de salchicha alemana cocida. Estas cantidades se cree que
se deben a una acumulación residual de constituyentes del humo del
ahumadero.
Las salchichas alemanas se recubrieron en las
soluciones de ensayo mediante inmersión durante treinta segundos,
seguido de escurrido durante treinta segundos. Entonces, las
salchichas recubiertas se inocularon con una mezcla de tres cepas
de Listeria monocytogenes patógena al pipetear 0,05 ml
(alrededor de 100 células) de inóculo sobre cada salchicha. El
inóculo se esparció con un bastoncillo de algodón estéril. Las
salchichas se envasaron entonces en dos capas de cuatro en bolsas
PER-FLEX® 51B Barrier Bags disponibles
comercialmente (fabricadas por Viskase Corporation de Chicago,
Illinois). En estas bolsas de película de termoplástico se hizo
vacío y se sellaron por calor bajo vacío elevado con un aparato
para hacer vacío/sellador comercial para proporcionar una barrera al
oxígeno y a la humedad del medio ambiente. Grupos separados de
paquetes se prepararon para las salchichas recubiertas con cada
solución de ensayo. Cada paquete sellado de ocho salchichas se
almacenó a aproximadamente 4,4ºC (40ºF). Se analizaron triplicas de
los paquetes inicialmente (Día 0) y a los 14, 28 y 42 días de
almacenado. Para el ensayo, una salchicha se retiró asépticamente
de cada paquete siendo analizada y colocada en una bolsa con 10 ml
de tampón fosfato, entonces se agitó para aclarar las células
bacterianas adheridas a la superficie de la salchicha. Se sembraron
diluciones decimales seriadas en agar LMP y agar TGY como en los
ejemplos anteriores 29-43. Los resultados del
recuento promedio aritmético por placa de los tres paquetes
replicados sometidos a ensayo se describen en la Tabla 3.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las salchichas alemanas de los Ejemplos 44 y 45
fueron recubiertas al sumergir cada salchicha dentro de una
solución diluyente de fostato tamponado de Butterfield que contenía
aproximadamente 42,5 ppm de ortofosfato potásico en agua
desionizada ajustada a pH de 7,2. Los Ejemplos 44 y 45 difirieron en
que sólo las salchichas del Ejemplo 45 se inocularon con
Listeria. Por tanto, el Ejemplo 44 sirvió como control no
inoculado (no del invento) y el Ejemplo 45 sirvió como control
inoculado (no del invento) similar a los Ejemplos anteriores 29 y
30. El diluyente de fostato tamponado de Butterfield se empleó para
minimizar cualquier interrupción debida a las fuerzas osmóticas de
cualquier bacteria ya presente o añadida. Los resultados indican
niveles no significativos de Listeria a lo largo del período
de ensayo de 42 días para el control no inoculado, mientras que el
recuento promedio de las placas para las bacterias aeróbicas
totales ascendió hasta 3.200.000 ufc por salchicha para el día 42
de ensayo. Las salchichas del control inoculado (Ejemplo 45)
mostraron un crecimiento rápido de Listeria a partir de un
recuento promedio inicial de placas de 340 ufc por salchicha hasta
un promedio de 1.400.000.000 ufc por salchicha a los 28 días. El
recuento de bacterias por placa para la muestra del día 42 no se
determinó debido a los números de bacterias excesivamente elevados
según se determinó por examen visual de los paquetes que revelaron
turbiedad del fluido contenido dentro del paquete evacuado. Los
expertos en la técnica de microbiología de los alimentos saben que
esta turbiedad indica niveles extremadamente elevados de bacterias.
Los números de bacterias excesivos a los 42 días resultaron
aparentes en todos los ejemplos, salvo para el control no inoculado
(Ejemplo 44) y los Ejemplos 54 y 55 comentados a continuación. Los
resultados del recuento de placas de mesófilos aeróbicos totales
muestran que el crecimiento de bacterias aeróbicas totales que
incluyen tanto Listeria (un anaerobio facultativo) como
cualquier aumento accidental de bacterias desde un promedio de 120
ufc por salchicha hasta un promedio de 1.900.000.000 ufc por
salchicha en el día 28 de ensayo.
En los Ejemplos 46-53, se
analizaron las soluciones basadas en agua de la sal disódica de
EDTA. Se analizó sobre las salchichas Na_{2}EDTA en solución solo
o en combinación con propilenglicol, benzoato sódico, sorbato
potásico, lisozima y como un sistema de tres componentes con
propilenglicol y parabenos. El propilenglicol también se sometió a
ensayo solo y con un humo líquido disponible comercialmente vendido
bajo el nombre comercial de Charsol®, C-10 por Red
Arrow Products Co. de Manitowoc, Wisconsin. Todas las salchichas
recubiertas con estas soluciones de ensayo mostraron un crecimiento
de bacterias inaceptablemente elevado al final del período de
ensayo de 42 días. Sin embargo, los Ejemplos 46,
49-52 resultaron de algún provecho en la inhibición
del crecimiento de las bacterias según se mostró por los reducidos
recuentos promedio de bacterias aeróbicas totales hasta el día 28 de
ensayo relativo al control inoculado, pero sólo las soluciones que
contenían lisozima, benzoato sódico y sorbato potásico de los
Ejemplos 52, 50 y 51, respectivamente, mostraron algún efecto en
producir reducciones logarítmicas en los recuentos promedio de
Listeria por placa a los 28 días.
Los Ejemplos 54 y 55 analizaron soluciones
basadas en agua que contenían 100 ppm y 250 ppm de nisina (la
nisina se añadió en forma de Nisaplin) en combinación con un 0,8
por ciento en peso de Na_{2}EDTA como un recubrimiento
antibacteriano para las salchichas alemanas pasteurizadas. Estos
recubrimientos resultaron eficaces frente a la inoculación de las
salchichas con Listeria patógena, reduciendo el recuento
inicial promedio de placa a menos de 10 ufc por salchicha y
manteniendo un recuento promedio de placa de 20 ufc o menos por
salchicha durante el período completo de 42 días de ensayo. El
empleo de agar LMP selectivo de Listeria puede reducir, a
través de la naturaleza selectiva del agar, el número de organismos
de Listeria presentes originalmente. Por tanto, el recuento
de bacterias aeróbicas totales se llevó a cabo empleando un agar de
métodos convencionales no selectivo como el agar TGY. Los recuentos
realizados para bacterias aeróbicas totales incluyen no sólo
colonias de Listeria, sino también cualquier colonia casual
de otras bacterias que puedan crecer en competición con, o además
de, Listeria, tales como Staphlococcus. Los recuentos
promedio por placa para el total de bacterias aeróbicas de los
Ejemplos 54 y 55 indican una reducción logarítmica sorprendente en
organismos relativo al control inoculado del Ejemplo 45. Los
recuentos promedio por placa fueron no sólo de 10 ufc o menos por
salchicha inicialmente y en el día 14, sino que los recuentos a los
28 días fueron < 10, < 10 y 3.900 ufc por salchicha para el
Ejemplo 54 y < 10, 230 y 70.000 ufc por salchicha para el
Ejemplo 55 comparado con los 80 millones, 440 millones y 5,2 miles
de millones de ufc por salchicha para las tres placas control
inoculadas (promedio: 1,9 miles de millones de ufc). A los 42 días
las salchichas recubiertas de la solución de 100 ppm de nisina y
Na_{2}EDTA tuvieron un recuento promedio de placa menor a 10 ufc
por salchicha, mientras que las tres placas sometidas a ensayo para
las salchichas recubiertas de la solución de 250 ppm de nisina y
Na_{2}EDTA del Ejemplo 55 se contaron en <10; 270.000 y
1.300.000 ufc por salchicha. De ese modo, los recuentos de
bacterias aeróbicas totales en el día 42 para las salchichas
alemanas inoculadas del Ejemplo 54 y 55 pueden compararse
favorablemente con los recuentos de las tres placas de 130.000,
180.000 y 9.200.000 ufc por salchicha (promedio: 3,2 millones de
ufc) sometidos a ensayo a los 42 días para el control no
inoculado del Ejemplo 44. Estos resultados espectaculares
indican además que las composiciones que contienen nisina y un
agente quelante pueden usarse para proteger frente al crecimiento
de bacterias patógenas y que deterioran los alimentos durante
largos períodos de tiempo a temperaturas reducidas. De este modo, la
conservación de los alimentos puede mejorarse con tiempos mayores de
conservación. Las composiciones pueden emplearse para recubrir
películas de envasado con el subsiguiente contacto con la
superficie del alimento.
Ejemplos
56-65
Los ejemplos 56-65 valoraron el
potencial antimicrobiano del uso de envoltorios de salchichas
recubiertos para el control de Listeria monocytogenes y de
otros microorganismos que tienen lugar de forma natural en las
salchichas alemanas a las que se han retirado los envoltorios antes
del envasado al vacío.
Las salchichas se fabricaron empleando la receta
de emulsión de buey y cerdo y el procedimiento descrito
anteriormente para los Ejemplos 29-43, salvo que el
nivel de dextrosa en la receta de los Ejemplos 56-65
fue la mitad de la descrita en la Tabla A. La elaboración fue
similar, pero a una humedad relativa de 25% y las salchichas se
cocieron hasta alcanzar una temperatura interna de aproximadamente
71ºC (160ºF). Una excepción adicional al procedimiento anterior
para fabricar salchichas fue que el envoltorio empleado se recubrió
internamente con los componentes del ensayo por adición de nisina
y/o sal di o trisódica de EDTA a la solución de fruncido antes del
frunce del envoltorio. Los componentes a ensayo se añadieron en
cantidades suficientes para dar los porcentajes en peso referidos
en la Tabla 4, los cuales están basados en el peso total del
envoltorio rehumedecido terminado de fruncir. Los Ejemplos 56 y 57
se sometieron a ensayo, respectivamente, como controles no inoculado
e inoculado (no del invento) y emplearon el envoltorio disponible
comercialmente que contenía sustancialmente los mismos componentes
de la solución de fruncido que los Ejemplos 58-65,
salvo que sin nisina ni tampoco una sal sódica de EDTA. Las
soluciones típicas de fruncido se describen, p. ej., en la patente
de EE.UU. nº 3.898.348 que se incorpora en esta memoria por
referencia. Después de la eliminación de los envoltorios, las
salchichas se refrigeraron a aproximadamente 4ºC hasta el inicio
del ensayo microbiológico. Las salchichas refrigeradas recién
hechas se inocularon con una mezcla de Listeria monocytogenes
y se analizaron inicialmente (día 0) y a los 7, 14, 28 y 42 días,
siguiendo los procedimientos descritos con anterioridad para los
Ejemplos 44-55, salvo por lo ya señalado en esta
memoria. La inoculación de las salchichas con Listeria se
llevó a cabo a un nivel de, al menos, aproximadamente 1.000
organismos por salchicha. Las salchichas inoculadas se almacenaron
ocho en un paquete, con grupos separados de paquetes para las
salchichas de cada envoltorio a ensayo, de forma similar a los
procedimientos de los Ejemplos 44-55 y se
almacenaron a aproximadamente 4,4ºC (40ºF) hasta su análisis. El
promedio aritmético de los resultados del ensayo se describen en
las Tablas 4a y 4b.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
En relación a las Tablas 4a y 4b, las salchichas
no inoculadas, no tratadas, del Ejemplo 56 no mostraron evidencia
de Listeria a lo largo de los 42 días de ensayo y el
recuento promedio por placa de aeróbicos totales creció desde 900
ufc por salchicha, inicialmente, hasta 4,300.000 ufc por salchicha
en el día 28 y 22.000 ufc por salchicha en el día 42.
El control no inoculado exhibió un nivel inicial
promedio de Listeria de 8.500 ufc por salchicha, las cuales
crecieron hasta 200.000.000 ufc por salchicha para el día 42 y
tuvieron un recuento inicial de bacterias aeróbicas totales por
placa de 6.700 ufc por salchicha, que crecieron hasta 680 millones
de ufc por salchicha para el día 42. Ambos controles se realizaron
empleando envoltorios celulósicos no fibrosos disponibles
comercialmente E-Z Peel Nojax®, sin modificar,
fabricados por Viskase Corporation de Chicago, Illinois. El examen
de los datos de los Ejemplos 58-65 indica que los
agentes antimicrobianos aplicados al envoltorio antes del relleno
con emulsión cárnica y cocción se transfirieron a las superficies
de las salchichas cocidas en cantidades suficientes para inhibir el
crecimiento tanto de Listeria como de las bacterias
aeróbicas totales relativas al control no inoculado (Ejemplo 57),
después de eliminación del envoltorio de la salchicha.
Envoltorios celulósicos corrientes pueden
emplearse también en el presente invento. Tales envoltorios pueden
no contener adyuvantes químicos de pelado. De forma conveniente,
tales envoltorios pueden tratarse con ácidos o los productos
alimentarios embutidos, particularmente productos alimentarios que
contienen proteína y grasa como salchichas rellenas frescas, pueden
rociarse con una solución ácida previamente al termotratamiento
(cocción o pasteurización). Tal tratamiento ácido puede tener un
efecto beneficioso, el cual mejora o mantiene la capacidad de los
agentes antimicrobianos tales como nisina o pediocina, bien solos o
en conjunción con un agente quelante, para proteger el producto
alimentario embutido antes y después del termotratamiento y/o de la
eliminación del envoltorio.
Ejemplos
I-IV
Los ejemplos I a III son ejemplos comparativos,
no del invento. El Ejemplo IV es del presente invento.
En todos los ejemplos siguientes la película de
envasado del alimento a la que se hace referencia incluye un
envoltorio no fibroso de celulosa regenerada de pequeño diámetro
del tipo de los bien conocidos en la técnica por los fabricantes de
salchichas alemanas sin pellejo, de salchichas de Viena y
similares. Tal envoltorio puede recubrirse o impregnarse con varios
aditivos para mejorar la duración en almacenamiento, el pelado,
etc.
El envoltorio de materia prima seca, no fibroso,
es convencionalmente fruncido en ristras de envoltorio para su uso
en una máquina de rellenado convencional. Durante la operación de
fruncido, justo antes de la reunión del envoltorio en pliegues, se
aplica una solución pulverizada uniformemente a una velocidad
constante sobre la superficie interna del envoltorio. Este es un
método convencional (véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº
3.462.794, la cual se incorpora en esta memoria por referencia)
para aplicar un recubrimiento interno a un envoltorio.
Cuatro soluciones diferentes, según se describe
en la Tabla I, pueden aplicarse mediante el procedimiento anterior
para proporcionar cuatro muestras diferentes de envoltorio, donde
cada muestra tiene una cantidad controlada equivalente de solución
uniformemente aplicada sobre ella.
La composición de la solución del Ejemplo I
comparativo es una solución típica pulverizada en el interior de un
envoltorio justo antes del fruncido. El agua humedece el envoltorio
y actúa también como un transportador para los otros componentes,
que pueden incluir un plastificador y/o humectante como el
propilenglicol, un lubricante como el aceite mineral o un
emulsionante como una mezcla de monodiglicéridos etoxilados
vendidos bajo el nombre comercial Mazol 80 por Mazer Chemicals,
Inc. de Gurnee, Illinois y un adyuvante de pelado como la
carboximetilcelulosa.
La solución del Ejemplo II comparativo es de la
misma composición que la del Ejemplo I, salvo que se añade un
agente quelante, es decir, viz la sal disódica de
etilendiaminotetraacético (Na_{2}EDTA.2H_{2}O).
La solución del Ejemplo III comparativo es
similar a la del Ejemplo II comparativo, salvo que un 0,025 por
ciento en peso de la solución incluye un agente antimicrobiano en
la forma de lisozima.
La solución del Ejemplo IV del invento es similar
a la del Ejemplo II comparativo, salvo que se añade un 1,0 por
ciento en peso de Nisaplin. Nisaplin es una preparación comercial
de marca registrada de nisina fabricada a partir de la fermentación
de un cultivo puro de las cepas de Streptococcus lactis no
patógenas pertenecientes a Lancefield grupo N con un digerido de
leche desnatada esterilizada, termotratada, sin penicilina. El
producto de fermentación se concentra por un procedimiento
espumante y se extrae por precipitación de sal bajo condiciones
ácidas y secas mediante un procedimiento de pulverización para
producir una mezcla que tiene una actividad que es 1/40 de la de la
nisina pura. La preparación de la nisina se describe más ampliamente
en el Registro Federal, vol. 53, nº 66, páginas
11.247-11.251 (6 de Abril, 1988), que se incorpora
en esta memoria por referencia. Se emplea desde un 1,0 por ciento
en peso de Nisaplin; la solución del Ejemplo IV contiene un 0,025
por ciento en peso de nisina. La actividad de la nisina pura es de
aproximadamente 40 x 10^{6} UI por gramo.
Cada una de las cuatro soluciones anteriores se
aplica uniformemente sobre muestras similares, aunque distintas, de
envoltorios. Cada solución se pulveriza a una velocidad constante,
que se ajusta para cada solución, para proporcionar un envoltorio
pulverizado que tiene un contenido de humedad acuosa de
aproximadamente un 19,3 por ciento en peso respecto al peso total de
humedad del envoltorio recubierto. Las cuatro muestras de
envoltorio fruncido, cada una recubierta internamente con una
solución diferente, pueden rellenarse de forma convencional con una
emulsión cárnica típica de salchicha de vaca en una máquina
disponible comercialmente, tal como una máquina rellenadora de
salchichas de la marca comercial
Frank-A-Matic fabricada por Townsend
Engineering Co. de Des Moines, Iowa, hasta un diámetro de relleno de
aproximadamente 21-22 milímetros. Las salchichas de
Viena embutidas pueden reunirse entonces en rejillas y colocarse en
un ahumadero para el termotratamiento convencional.
Un procedimiento de termotratamiento típico
incluye dar entrada a aire caliente humedecido desde un calentador
de gas hasta que la temperatura del ahumadero se incrementa
(habitualmente lleva 15-30 minutos) hasta una
temperatura de bola seca de aproximadamente 60ºC (140ºF) y una
humedad relativa (HR) de aproximadamente un 25%. Los tiros del
ahumadero se cierran entonces; se da entrada al humo y la
temperatura y humedad se mantienen constantes a 60ºC/25%HR durante
quince minutos. Entonces se deja de dar entrada al humo, los tiros
del ahumadero se abren según se necesite y la temperatura del
ahumadero aumenta (durante un período de tiempo de normalmente
15-20 minutos) hasta una temperatura de bola seca
de aproximadamente 71ºC (160ºF) a una humedad relativa constante de
aproximadamente 25% y se mantiene ahí durante quince minutos.
Entonces la temperatura de bola seca se aumenta de nuevo
(normalmente precisa 15-20 minutos) hasta
aproximadamente 82ºC (180ºF) a una humedad relativa constante de
25% y se deja ahí durante 45 minutos hasta que la temperatura
interna de las salchichas embutidas alcanza 68-71ºC
(155-169ºF).
Después de alcanzar una temperatura interna de
68-71ºC (155-160ºF), la fuente de
calor se apaga y se rocía agua del grifo fría sobre las salchichas
durante aproximadamente diez minutos, después de lo cual las
salchichas se trasladan a un túnel de ducha de salmuera donde las
salchichas embutidas se rocían en una solución salmuera (8% de sal)
acuosa a aproximadamente -4ºC (25ºF) durante aproximadamente diez
minutos hasta que la temperatura interna de la salchicha se enfríe
hasta aproximadamente 2ºC (35ºF).
El envoltorio puede eliminarse entonces de las
salchichas embutidas enfriadas mediante equipamiento convencional,
tal como un pelador de Range Apollo para producir salchichas "sin
pellejo".
Las salchichas sin pellejo de cada ejemplo pueden
inocularse ahora con una solución tamponada que contiene tres cepas
de Listeria monocytogenes patógena. Listeria puede
aplicarse a cada superficie de salchicha mediante un bastoncillo de
algodón estéril, el cual se sumerge en la solución que contiene
Listeria y se limpia una vez a lo largo de la longitud de la
salchicha, de modo que, al menos, aproximadamente 100 y,
preferiblemente, al menos 1.000 células de Listeria
monocytogenes se depositen sobre la superficie de cada
salchicha.
Las salchichas inoculadas pueden envasarse
entonces en dos capas; cada capa con cuatro salchichas, de modo que
las ocho salchichas están en una bolsa de contención termoplástica
multicapa, la cual tiene una capa central barrera para el oxígeno y
la humedad, que incluye una mezcla de copolímero cloruro de
vinilideno-acrilato de metilo y copolímero de
cloruro de vinilideno-cloruro de vinilo y las capas
externas de copolímero de etileno acetato de vinilo a cada lado de
la capa central. Para cada ejemplo, se hace el vacío a 29 pulgadas
de mercurio de una pluralidad de bolsas cada una con ocho
salchichas y se termosellan.
Las salchichas envasadas inoculadas pueden
entonces refrigerarse a aproximadamente 4ºC (40ºF); muestras de los
paquetes de cada ejemplo se someten a ensayo inicialmente y a partir
de ahí cada dos semanas durante seis semanas.
En los intervalos anteriores, las salchichas de
muestra pueden analizarse retirando una salchicha y eliminando por
lavado cualquier microorganismo con un tampón estéril. El tampón de
lavado se analiza entonces por (1) un recuento de placas estándar
con agar de triptona glucosa levadura por métodos convencionales y
(2) un recuento selectivo para Listeria monocytogenes
empleando agar LPM y el método FSIS descrito anteriormente para los
Ejemplos 1-28.
El muestreo inicial de salchicha se espera
confirme la presencia de Listeria en todas las muestras y de
lisozima y nisina en las salchichas de los Ejemplos III y IV,
respectivamente.
Tanto después de las cuatro como de las seis
semanas se espera que ambos Ejemplos I y II comparativos anteriores
muestren crecimiento de colonias vivas de Listeria
monocytogenes con respecto a la inoculación inicial. Las
salchichas del Ejemplo III tratadas con lisozima se espera muestren
menos organismos viables de Listeria comparados con las
muestras inoculadas control. Las salchichas del Ejemplo IV tratadas
con nisina se espera muestren una disminución en los organismos
viables de Listeria con respecto a las salchichas control
inoculadas a las cuatro y seis semanas.
Los anteriores Ejemplos I a III comparativos y el
Ejemplo IV del presente invento prueban el método y la película del
presente invento.
Claims (21)
1. Una película de envasado del alimento que
incluye una película polimérica que contiene nisina; dicha película
se adapta para transferir dicha nisina a la superficie de un
producto alimentario en contacto con ésta en una cantidad eficaz
para impedir o inhibir el crecimiento microbiano en dicha superficie
del alimento después de la eliminación de dicha película y,
comprendiendo dicha película dicha nisina en una cantidad eficaz
para impedir o inhibir el crecimiento de Listeria tras
contacto, en la que dicha película está entremezclada, recubierta
y/o impregnada con dicha nisina, de modo que la nisina se puede
liberar de dicha película y se transfiere a una superficie del
producto alimentario en una cantidad controlada hasta el punto
necesario para proporcionar un efecto antimicrobiano sobre dicha
superficie del producto alimentario, incluso después de eliminar
dicha película del contacto con dicha superficie del producto
alimentario.
2. Una película, de acuerdo con la reivindicación
1, en la que dicha bacteriocina o agente recubre al menos una
superficie de dicha película.
3. Una película, de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en la que dicha superficie recubierta tiene un pH \leq
6.
4. Una película, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha película contiene además
aditivos tales como agentes aglutinantes, tampones, emulsionantes,
adyuvantes de transferencia y/o agentes quelantes
(secuestrantes).
5. Una película, de acuerdo con la reivindicación
4, en la que dicho agente quelante (secuestrante) se selecciona de
entre el grupo constituido por ácidos aminopolicarboxílicos y sus
sales, como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o sus sales y
por ácidos hidrocarboxílicos y sus sales, como el ácido
cítrico.
6. Una película, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha película incluye materiales
celulósicos como celulosa regenerada.
7. Una película, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha película incluye plásticos
como los homopolímeros o copolímeros de poliolefinas o poliaminas,
poli(tereftalato de etileno), copolímeros de
poli(cloruro de vinilideno) o copolímeros de
etileno-acetato de vinilo.
8. Una película, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha película incluye un
envoltorio de alimentos tubular.
9. Una película, de acuerdo con la reivindicación
8, en la que dicha película incluye un envoltorio de alimentos no
fibroso, celulósico, tubular.
10. Una película, de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha película incluye una
bolsa termocontraible.
11. Una película, de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, que incluye además un producto
alimentario encerrado por dicha película.
12. Una película, de acuerdo con la
reivindicación 11, en la que dicho producto alimentario incluye un
producto alimentario de origen animal o de origen vegetal.
13. Una película, de acuerdo con la
reivindicación 11 ó 12, en la que dicho producto alimentario incluye
productos cárnicos.
14. Una película, de acuerdo con cualquiera de la
reivindicaciones 11 a 13, en la que dicho producto alimentario
incluye salchichas de todos los tipos.
15. Un método para tratar una superficie de un
producto alimentario con nisina; dicho método incluye las siguientes
etapas:
- (a)
- poner en contacto un producto alimentario con una película de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14;
- (b)
- transferir una cantidad controlada de dicha nisina y
- (c)
- eliminar dicha película por medio de la cual una cantidad de dicha nisina transferida permanece sobre la superficie del producto alimentario para impedir o inhibir el crecimiento de microorganismos sobre la misma.
16. Un método, de acuerdo con la reivindicación
15, en el que dichos microorganismos incluyen Listeria
monocytogenes.
17. Un método, de acuerdo con la reivindicaciones
15 ó 16, en el que dicho producto alimentario incluye un producto
alimentario de origen animal o de origen vegetal.
18. Un método, de acuerdo con la reivindicación
17, en el que dicho producto alimentario incluye productos
cárnicos.
19. Un método, de acuerdo con la reivindicación
18, en el que dicho producto alimentario incluye salchichas de todos
los tipos.
20. Un método, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, en el que dicho producto alimentario,
desde la etapa de contacto hasta después de la etapa de eliminación
de dicha película, se mantiene a una temperatura inferior a
aproximadamente 88ºC (190ºF).
21. Un método, de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, en el que dicho producto alimentario se
pasteuriza llevando dicho producto alimentario hasta una
temperatura interna por encima de aproximadamente 63ºC (145ºF) y no
superior a aproximadamente 82ºC (180ºF) antes de la eliminación de
dicha película, en el que dicha temperatura superficial de dicho
producto alimentario no excede 88ºC (190ºF).
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