ES2226664T3 - Metodo para tratar la superficie de productos alimentarios. - Google Patents
Metodo para tratar la superficie de productos alimentarios.Info
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Abstract
Un método para aumentar la duración en almacenamiento de los alimentos elaborados tratando la superficie del producto alimentario con una composición bactericida que tiene un efecto antimicrobiano intensificado y que comprende una combinación de nisina y un agente quelante en una cantidad eficaz para matar, impedir o inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes patógena tras contacto y que permanece suficientemente eficaz después de termotratamiento y procesamiento, en el que dicho producto alimenticio incluye comestibles cocinados y elaborados; dicho método incluye recubrir dicha superficie del producto alimentario con dicha composición en una cantidad suficiente para matar, impedir o inhibir el crecimiento de la bacteria Listeria monocytogenes patógena sobre la superficie del producto alimentario; dicho recubrimiento se lleva a cabo por pulverización de dicha composición sobre dicha superficie del producto alimentario; en el que dicha composición es una disolución ácida que contiene dicha nisina como un soluto o dispersión en concentraciones de 5 a 250 ppm en peso de la composición total y en el que dicho agente quelante incluye EDTA, ácido cítrico o sus sales; dicho quelante está presente en dicha disolución en cantidades desde 0, 2 hasta 3, 0 por ciento en peso.
Description
Método para tratar la superficie de productos
alimentarios.
El invento se refiere a un método para inhibir o
impedir el crecimiento de microbios tales como bacterias, mohos y
levaduras en las superficies de los alimentos. La "conservación de
los alimentos", según se emplea este término en esta memoria,
incluye métodos que protegen frente a la intoxicación alimentaria,
así como métodos que retrasan o impiden el deterioro de los
alimentos debido a los microbios. La conservación de los alimentos
conserva los alimentos seguros para consumo e inhibe o impide el
deterioro de los nutrientes o cambios organolépticos que provoquen
que los alimentos se vuelvan menos apetitosos.
El "deterioro de los alimentos", según se
emplea este término en esta memoria, incluye cualquier alteración en
la condición del alimento que lo convierte en menos apetitoso, lo
que incluye cambios en sabor, olor, textura o apariencia. El
alimento deteriorado puede ser tóxico o no serlo.
La "intoxicación alimentaria", según se
emplea este término en esta memoria, se refiere a la enfermedad
provocada en mamíferos por ingesta de alimentos contaminados por
virus, mohos o bacterias patógenas y/o sus toxinas. El alimento
contaminado por patógenos no muestra necesariamente ningún signo
organoléptico de deterioro. La intoxicación alimentaria bacteriana
puede estar provocada bien por infección del hospedante con el
organismo bacteriano o bien por acción de una toxina producida por
la bacteria en el alimento o en el hospedante.
Prevenir el deterioro del alimento y la
intoxicación alimentaria se ha procurado a lo largo de la historia,
a menudo mediante ensayo y error. Los primeros intentos han dado
como resultado la adopción de métodos de conservación alimentaria
tales como la desecación, la salazón y/o el ahumado de los alimentos
con objeto de conservarlos. Es relativamente reciente en la historia
registrada que la conservación alimentaria se está asentando sobre
una fundación científica. En el siglo diecinueve, el trabajo de
científicos tales como Louis Pasteur y Robert Koch elucidó los
principios bacterianos de la intoxicación y deterioro alimentarios y
proporcionó nuevos métodos de identificación de bacterias patógenas
y de conservación de los alimentos.
Los tecnólogos de alimentos actuales emplean un
conjunto de procedimientos y agentes físicos, químicos y biológicos
para conservar los alimentos e impedir la transmisión de
enfermedades vía los productos alimentarios. Además de
procedimientos tales como la irradiación, la fermentación, la
pasteurización, el control de temperatura, el pH y/o la actividad
del agua, existe una plétora de agentes químicos. Estos agentes
incluyen antioxidantes para impedir la degradación química del
alimento, así como composiciones que matan o inhiben bacterias
deletéreas y/u otros microbios, de modo que conservan los alimentos,
es decir, impiden tanto el deterioro de los alimentos como la
transmisión de enfermedades. Los agentes químicos antimicrobianos
empleados comúnmente incluyen nitritos, nitratos, dióxido de azufre,
sulfitos y ácidos, tales como ácido acético, propiónico, láctico,
benzoico y sórbico y sus sales, humo de leña y humo líquido y
antibióticos tales como natamicina y nisina.
Prevenir la intoxicación alimentaria es de
capital importancia en la industria de la fabricación alimentaria.
La preocupación por la inocuidad de los alimentos ha llevado a la
mayoría de los países a regular fuertemente la industria alimentaria
para asegurar la salud pública. También, los fabricantes de
alimentos elaborados invierten considerables recursos para asegurar
la inocuidad de sus productos. A pesar de estos esfuerzos, la
intoxicación alimentaria sigue ocurriendo. Muchos casos de
intoxicación alimentaria se han atribuido a bacterias tales como
Salmonella, Clostridium y Staphylococcus, entre
otras.
Una preocupación creciente en la industria de la
fabricación alimentaria es el descubrimiento, relativamente
reciente, de la contaminación extendida de Listeria en aves
de corral y en alimentos elaborados como salchichas de Viena, otras
salchichas, quesos, productos lácteos que incluyen helados novedosos
y marisco. De especial preocupación es la evidencia reciente de que
los alimentos elaborados, pasteurizados y totalmente cocidos, se
están contaminando con microbios tales como Listeria
monocytogenes después de la cocción o pasteurización y
previamente al embalado para el punto de venta. Tal contaminación es
típicamente una contaminación de superficie que se cree originada
por contacto de los microbios con las superficies de los alimentos
subsiguiente al termotratamiento (es decir, cocción o
pasteurización). Microbios tales como Listeria pueden
transportarse por el aire (es decir, llevados por el polvo) o estar
presentes en las superficies de contacto de los alimentos, tal como
el equipo de elaboración.
En los años 80 se han notificado numerosos brotes
de intoxicación alimentaria en todo el mundo, en los que el agente
causante se sospechó o se identificó como alimentos contaminados por
Listeria. Se han descrito brotes de listeriosis (infección
por la bacteria Listeria) en humanos en Massachussets,
California y Pensilvania en los EE.UU. y también en Canadá y Suiza.
Estos brotes se han atribuido a la ingesta de alimentos contaminados
por Listeria, tales como la ensalada de col fresca, el queso
fabricado a partir de leche cruda, la superficie para hacer madurar
a los quesos blandos y el salami. Cientos de personas se han visto
afectadas con una proporción de mortalidad de hasta aproximadamente
un tercio de los afectados. Particularmente susceptibles a la
enfermedad (que es contagiosa) son las mujeres embarazadas, los
fetos, los recién nacidos y los lactantes, así como adultos con
sistemas inmunes deteriorados, por ejemplo, adultos en tratamiento
con fármacos inmunosupresores tales como corticosteroides. La
listeriosis es una enfermedad grave que puede provocar meningitis,
abortos espontáneos y septicemia perinatal. Aunque es tratable tras
un diagnóstico temprano, la listeriosis no tratada muestra una
elevada tasa de mortalidad.
La conservación de los alimentos por inhibición
del crecimiento de Listeria monocytogenes es difícil. Según
se informa, Listeria puede reproducirse y crecer tanto
aeróbica como anaeróbicamente, a pHs superiores a 4,85 y en un
amplio intervalo de temperaturas que pueden ser tan bajas como 3ºC y
tan altas como unos 45ºC. Ésto significa que Listeria puede
crecer a temperaturas normales de refrigeración. También se ha
descrito que Listeria puede crecer en una disolución acuosa
con hasta un 10% de sal. Afortunadamente, la cocción o la
pasteurización matan a Listeria. Desafortunadamente, la
contaminación por microorganismos puede ocurrir después de
pasteurización por el fabricante. Mucha gente come alimentos
elaborados después de que haya pasado un período significativo de
tiempo desde una primera cocción o pasteurización por el fabricante
del alimento, de tal modo que se permite crecer a la bacteria
introducida por contaminación posterior a la pasteurización. Dado
que este consumo de alimento puede llevarse a cabo sin recalentar el
alimento elaborado hasta temperaturas suficientes, durante el tiempo
suficiente, para matar cualquier microbio (como Listeria) que
se haya podido introducir con posterioridad a la cocción inicial,
hay riesgo de intoxicación alimentaria. El invento presente trata de
mejorar el riesgo referido.
El documento WO 89/12399 A1 describe una
composición bacteriocina que incluye lantionina que contiene
bacteriocinas (como nisina) y un agente quelante. Este documento
muestra los efectos in vitro de dichas composiciones frente a
diferentes bacterias.
El documento
GB-A-940 379 describe composiciones
de conservantes que contienen ésteres del ácido
p-hidroxibenzoico y su empleo en la conservación
alimentaria.
Un objetivo del invento es matar, inhibir e
impedir el crecimiento de microorganismos patógenos en la superficie
de un producto alimentario mediante un método de transferencia de un
agente antimicrobiano a una superficie de un producto alimentario en
una cantidad controlada.
Otro objetivo del invento es aumentar la duración
en almacenamiento de los alimentos elaborados por aplicación de una
mezcla sinérgica, preferiblemente un líquido o una suspensión, de
una bacteriocina derivada de Streptococcus lactis (o su
equivalente sintético) y un agente quelante.
De este modo, el presente invento proporciona un
método para aumentar la duración en almacenamiento de los alimentos
elaborados, según se explica en la reivindicación 1. Realizaciones
adicionales se abarcan en las reivindicaciones dependientes
respectivas.
Los objetivos antedichos y otros que se harán
aparentes a continuación pueden llevarse a cabo al tratar un
comestible, es decir, una superficie de un producto alimentario con
un agente microbiano, un agente quelante tal como EDTA o ácido
cítrico, en combinación con la bacteriocina nisina derivada de
Streptococcus. El tratamiento se realiza por pulverización.
El agente antimicrobiano permanece sobre la superficie del producto
alimentario en una cantidad eficaz para matar, impedir o inhibir el
crecimiento bien de organismos que deterioran los alimentos o de
microorganismos patógenos tales como Listeria que se
encuentra sobre la misma.
La composición bactericida empleada, de acuerdo
con el presente invento, incluye nisina, agente antibacteriano
termorresistente, bacteriocina derivada de Streptococcus (o
el equivalente sintético). Este agente es eficaz preferiblemente
frente al crecimiento de bacterias gram positivas, especialmente
Listeria monocytogenes y es termorresistente.
No es necesario que todos y cada uno de los
objetivos anteriores estén presentes en todas las realizaciones del
invento; es suficiente con que el invento pueda emplearse de forma
ventajosa.
Lo fundamental de la composición del invento es
la combinación sinérgica de un agente secuestrador o quelante, tal
como una sal de EDTA o ácido cítrico, con la bacteriocina nisina
derivada de Streptococcus (o su equivalente sintético). Se
prefiere especialmente una mezcla líquida o suspensión de nisina y
un agente quelante.
Un aspecto fundamental de un método del presente
invento es la protección de la superficie del producto alimentario
durante un período de tiempo sustancial después del tratamiento.
Un aspecto fundamental de una realización de la
película del invento es el empleo del agente antimicrobiano
termorresistente nisina que es eficaz frente a las bacterias después
de pasteurización o termotratamiento.
Se ha descubierto que una composición
antimicrobiana que comprende una combinación sinérgica de la
bacteriocina nisina derivada de Streptococcus (o un
equivalente sintético) y un agente quelante como el ácido cítrico
presenta unas inesperadamente buenas propiedades bactericidas,
especialmente contra bacterias patógenas tales como Listeria
monocytogenes. Adicionalmente, tal composición es capaz,
sorprendentemente, de prolongar la duración en almacenamiento de los
alimentos al impedir el deterioro de los alimentos durante períodos
de tiempo mayores que los que se esperarían teniendo en cuenta la
eficacia de cada componente separadamente.
Nisina es la bacteriocina empleada. Nisina es una
bacteriocina polipeptídica producida por la bacteria del ácido
láctico, Streptococcus lactis del grupo N.
Según se informa, nisina es un nombre colectivo
que representa a varias sustancias estrechamente relacionadas, que
se han designado nisinas A, B, C, D y E, que tienen una composición
de aminoácidos similar. La estructura y propiedades de nisina son
más ampliamente comentadas en el artículo de E. Lipinska, titulado
"Nisin and its Applications" en The 25th Proceedings of the
Easter School in Agriculture Science at the University of
Nottingham, 1976, páginas 103-130 (1977); artículo
que se incorpora en esta memoria como referencia. El comité de
estandarización biológica de la organización mundial de la salud
(The World Health Organization Committee on Biological
Standardization) ha establecido una preparación de nisina de
referencia internacional y la unidad internacional (UI, de aquí en
adelante) se define como 0,001 mg de esta preparación. NISAPLIN es
el nombre de la marca comercial del concentrado de nisina que
contiene 1 millón de UI por gramo, la cual está disponible
comercialmente en Aplin & Barrett Ltd., Trowbridge, Wiltshire,
Reino Unido.
La nisina es un conservante alimentario conocido
del cual también se sabe que es termoestable, estable en ácido y
activo frente a bacterias gram positivas. La nisina se emplea como
conservante alimentario en productos lácteos y vegetales,
normalmente junto con termotratamiento. La nisina también se
encuentra de forma natural en la leche cruda y se ha empleado en la
termoelaboración de pastas cárnicas. La nisina se considera no
tóxica, con datos toxicológicos que indican que no presenta efectos
adversos a niveles de 3,3 millones de UI por kg de peso corporal.
Según se dice, la nisina puede soportar el calentamiento a 121ºC sin
pérdida de actividad. Aunque se espera alguna pérdida de actividad
cuando se emplea con alimentos elaborados, ésta puede mejorarse, por
ejemplo, aumentando la cantidad de nisina aplicada. Los niveles
eficaces de nisina para conservar los productos alimentarios varían,
según se informa, desde 25-500 UI/g o más.
Agentes quelantes apropiados incluyen EDTA, ácido
cítrico o sus sales.
Estos agentes secuestradores son útiles en la
elaboración de los alimentos en su forma de sal, que son normalmente
sales de álcalis metálicos o alcalinotérreas tales como sodio,
potasio o calcio o sales cuaternarias de amonio. Los compuestos
secuestradores con múltiples valencias pueden emplearse de forma
beneficiosa para ajustar el pH o introducir o sustraer de manera
selectiva iones metálicos, por ejemplo, en un sistema de
revestimiento del alimento. Información adicional acerca de agentes
secuestradores o quelantes se describe en T. E. Furia (Ed.), CRC
Handbook of Food Additives, 2ª edición, páginas 271 -294 (1972,
Chemical Rubber Co.) y M.S. Peterson y A.M. Johnson (Eds.),
Encyclopedia of Food Science, páginas 694-699 (1978,
AVI Publishing Company, Inc.); ambos artículos se incorporan en esta
memoria como referencia.
Los términos "agente quelante" y "agente
secuestrador" se emplean en esta memoria como sinónimos y se
definen como compuestos orgánicos o inorgánicos capaces de formar
complejos de coordinación con metales.
Los agentes quelantes empleados no son tóxicos
para los mamíferos e incluyen ácidos aminopolicarboxílicos y sus
sales, tales como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o sus
sales (particularmente sus sales di y trisódicas) y ácidos
hidrocarboxílicos y sus sales, como el ácido cítrico.
Las mezclas de bacteriocina nisina derivada de
Streptococcus con uno o más agentes quelantes pueden
emplearse de forma útil de acuerdo con el presente invento. Tales
mezclas pueden ser sólidos en suspensiones líquidas o soluciones. A
menos que se indique de otro modo, el empleo del término
"solución" en esta memoria incluye no sólo sólidos o líquidos
disueltos en un líquido, sino también suspensiones de sólidos en
líquidos o mezclas. Los solventes adecuados, diluyentes o soportes
para la mezcla del agente quelante y de la bacteriocina son agua,
alcoholes, propilenglicol, aceites como el aceite mineral, animal o
vegetal, glicerina o lecitina.
Aunque las bacteriocinas disponibles
comercialmente pueden contener productos lácteos puede ser ventajoso
para la composición bactericida o para preparar la conservación
alimentaria del presente invento que no contengan productos lácteos
añadidos tales como queso, suero, cuajadas o sólidos lácteos con
calcio. Se ha descrito que los iones de calcio y magnesio pueden
inactivar la nisina. Parece ser, sin dejarse llevar por las
creencias, que los agentes que secuestran calcio y/o magnesio pueden
ser particularmente convenientes. Las mezclas del presente invento
que contienen una mezcla de bacteriocina y agente quelante se
aplican a los productos alimentarios, incluyendo productos lácteos y
productos no lácteos, como salchichas, otras carnes, vegetales y
frutas, por pulverización. Tales soluciones pueden formularse a pHs
muy variados. Las soluciones ácidas se emplean para intensificar o
mantener la eficacia antibacteriana de estas soluciones. Las
soluciones que tienen un pH menor o igual de aproximadamente 6 se
prefieren, y las menores o iguales a 5 son especialmente preferidas.
Las cantidades de los componentes bacteriocina y agente quelante
pueden variar dependiendo de factores como: tipo de bacteriocina,
tipo de agente quelante, pH, otros constituyentes presentes (p. ej.,
tipo de solvente de la solución), aplicación, es decir, tipo de
producto alimentario sobre el que se aplicarán los materiales, cómo
aplicar (p. ej., revestimiento de la superficie), condiciones de
elaboración subsiguientes (p. ej., termotratamiento), un período de
tiempo deseado de eficacia para matar o inhibir bacterias y tipos de
bacterias frente a las que se protege el producto alimentario, etc.
Un experto en la técnica ordinario puede determinar las cantidades
apropiadas de bacteriocina y de agente quelante sin experimentación
excesiva. El agua es el solvente preferido para preparar una
solución. Las cantidades adecuadas de bacteriocina en una mezcla
para tratar productos alimentarios como salchicha incluyen desde 5
hasta 250 ppm de bacteriocina (por peso de la mezcla total) o más.
Cantidades menores que 5 ppm son factibles, pero dependiendo del uso
pueden ser menos eficaces que concentraciones mayores. Cantidades
mayores que 250 ppm también son factibles, pero concentraciones
crecientes tienen la desventaja de incrementar los costos debido al
dispendio de bacteriocina. Se ha encontrado que las concentraciones
entre 50 y 150 ppm son eficaces y no son caras, donde
concentraciones de 150 ppm o más son muy eficaces para matar o
inhibir tales bacterias patógenas como Listeria
monocytogenes, p. ej., en las superficies de salchichas alemanas
cocidas. La solución puede emplearse contra otras bacterias y es
especialmente eficaz contra bacterias gram positivas. Las cantidades
de agente quelante empleadas pueden variar ampliamente, p. ej.,
cantidades entre un 0,2 y un 0,8 ó 3,0 por ciento en peso o más
pueden emplearse de manera provechosa. La composición también puede
contener otros agentes antimicrobianos o antibacterianos u otros
aditivos, tales como colorantes y aromatizantes, p. ej., humo
gaseoso o líquido.
La nisina es resistente a la destrucción o
inactivación por termotratamiento como temperaturas y tiempos de
cocción o pasteurización. Ésto es esencial para sobrevivir al
termotratamiento del producto alimentario dentro de una película de
empaquetado y para ser eficaz después del termotratamiento y de la
eliminación de la película.
"Termorresistente", según se emplea este
término en esta memoria, significa que el agente antimicrobiano
aguanta la destrucción, inactivación o pérdidas debidas al
termotratamiento, p. ej., por pasteurización o cocción, de modo que
después del termotratamiento aún permanece suficiente agente que es
eficaz para matar, inhibir o impedir el crecimiento de
microorganismos en los productos alimentarios a los que se aplica.
Debe entenderse que pueden ocurrir pérdidas parciales en la cantidad
de agente o en la eficacia del agente y que también puede tener
lugar inactivación parcial. Sin embargo, es suficiente con que el
agente activo restante sea capaz de proteger la superficie del
producto alimentario frente a organismos patógenos como
Listeria.
De acuerdo con el presente invento, la
composición antibacteriana se aplica al producto alimentario
directamente mediante pulverización sobre la superficie del
comestible.
En consecuencia, el agente transferido o aplicado
debe estar presente en cantidad suficiente y permanecer
suficientemente eficaz después del termotratamiento, elaboración y
eliminación de la envoltura para matar, inhibir o impedir el
crecimiento de microbios, preferiblemente Listeria
monocytogenes, durante un período de tiempo bastante largo.
Convenientemente, el agente se mantendrá eficaz a lo largo de las
fechas normales de "vender hasta" o "caduca el" durante
las cuales el producto alimentario se ofrece a la venta por el
minorista. Preferiblemente, el tiempo eficaz debiera extenderse
pasada la apertura del paquete por el consumidor hasta el final del
período normal de frescura cuando el deterioro del alimento se hace
aparente. Para las salchichas de Viena sin pellejo los tiempos
típicos son: aproximadamente entre diez minutos y una hora desde la
eliminación de la envoltura hasta el embalaje de consumo, alrededor
de treinta días a sesenta días desde el embalaje de consumo hasta la
venta al por menor y aproximadamente siete días o más desde a la
apertura del embalaje de consumo, bajo almacenamiento refrigerado
normal, y uso. En cualquier caso, los períodos de tiempo deseados y
la duración en almacenamiento normal variarán de un producto
alimentario a otro producto alimentario y aquellos especialistas en
la técnica reconocerán que los tiempos de empaquetamiento y los
tiempos de duración en almacenamiento variarán dependiendo del tipo
de producto alimentario (p. ej., salchichas de buey, aves de corral
o queso), del tamaño del producto alimentario, del número de piezas
empaquetadas (tamaño de consumición o tamaño de paquete
institucional), de las temperaturas de almacenamiento, de las
condiciones de elaboración y del equipamiento de empaquetado.
El ejemplo anterior es ilustrativo y no debe
tomarse como limitante del invento para usar con las salchichas de
Viena. El invento es aplicable a cualquier producto alimentario, en
particular, a aquellos que pueden beneficiarse de la aplicación de
una cantidad controlada de un agente antimicrobiano en la superficie
del producto alimentario, particularmente un agente antibacteriano.
Se contempla que el método del invento tiene aplicabilidad tanto
para productos alimentarios derivados de animales como de plantas,
que incluye, pero no está limitado a, salchichas de todos los tipos
(de buey, de cerdo, de pollo, de pavo, de pescado, etc.) cortes de
carne originales o secundarios, carnes de almuerzo, jamones,
cordero, bistec, hamburguesa y aves de corral, que incluyen pollo,
pavo, pato, ganso, así como pescado y productos lácteos como quesos
semicurados y curados, quesos elaborados y productos vegetales que
incluyen lechuga, tofú, ensalada de col fresca, sustitutos de
proteína derivados de la soja para carne, etc.
El método del presente invento emplea nisina, el
agente termorresistente antimicrobiano, es decir, antibacteriano.
Nisina es una bacteriocina polipeptídica según se describió
anteriormente.
El invento se entenderá ahora más claramente por
referencia a los siguientes ejemplos que se exponen como meramente
ilustrativos del invento y que no pretenden, de ninguna manera,
limitar el mismo. A no ser que se indique de otra manera, todas las
partes y porcentajes están en peso. Los recuentos bacterianos de
placas son una media aritmética de tres placas, a no ser que se
indique de otra manera. Los recuentos estimados de placas se
llevaron a cabo mediante procedimientos aceptados de forma
generalizada en el campo de la microbiología.
Ejemplos
1-28
La eficacia de varias soluciones de ensayo y de
concentraciones de los agentes antimicrobianos nisina (del invento)
y pediocina (comparativa) se examinaron mediante un método de ensayo
líquido frente al crecimiento de bacterias patógenas, tal como la
bacteria gram positiva Listeria monocytogenes. El crecimiento
de bacterias aeróbicas totales se midió también y se examinaron las
eficacias de forma similar. El uso de los agentes quelantes ácido
etilendiaminotetraacético (sal disódica), ácido cítrico y
ciclodextrina también se examinó, aisladamente y con varias
concentraciones de nisina o pediocina.
Estos ejemplos se llevaron a cabo mediante el
empleo de técnicas asépticas bien conocidas por los especialistas en
la técnica de microbiología. Se inoculó caldo de triptosa
esterilizado de doble potencia de la marca DIFCO con, al menos,
aproximadamente 10.000 unidades formadoras de colonias (ufc) por ml
de una mezcla de dos cepas patógenas de Listeria
monocytogenes serotipo 4b aisladas del alimento. Este caldo
inoculado se añadió entonces a los tubos de ensayo con soluciones de
ensayo antimicrobianas de doble potencia empleando partes iguales de
caldo inoculado y de solución de ensayo. Entonces, los tubos de
ensayo se taparon y los contenidos se mezclaron completamente. Las
Tablas 1a y 1b dan una relación de los componentes de la solución de
ensayo y de las cantidades. Después del ensayo, el pH se midió de
forma similar para las soluciones mezcladas del caldo no inoculado y
para las soluciones de ensayo; los valores de pH también se muestran
en las Tablas 1a y 1b. Las cantidades de los componentes de la
solución de ensayo se calcularon en base a una solución de "doble
potencia" que fue luego diluida con un volumen igual de caldo
inoculado según se describe anteriormente. Las cantidades
relacionadas en las Tablas 1a y 1b se calcularon asumiendo pesos
iguales para volúmenes iguales de caldo inoculado y de soluciones de
ensayo. Las soluciones de ensayo inoculadas mezcladas se llevaron a
cabo por triplicado y se incubaron sin agitación a aproximadamente
30ºC. Por cada muestra de ensayo se apartó asépticamente una
alícuota de 0,3 ml con pipeta inmediatamente después de agitar (cero
(0) horas), así como a las 4, 8, 24 y 48 horas. Inmediatamente
después de la recogida, estas alícuotas se sembraron sobre placas de
agar LPM y de agar de soja tríptica, de acuerdo con procedimientos
de recuento convencionales de placas conocidos por los especialistas
en la técnica de microbiología, para determinar los recuentos de
Listeria y de bacterias aeróbicas totales. El recuento
selectivo de Listeria se llevó a cabo mediante el método de
la División de Microbiología del Departamento de Agricultura de
EE.UU. (USDA) del Servicio de Seguridad e Inspección Alimentarias
(FSIS) titulado "Método FSIS para el aislamiento e identificación
de Listeria monocytogenes a partir de carne elaborada y de
productos de aves de corral" (para uso en el programa provisional
de reconocimiento de laboratorio), según se describe en el artículo
titulado anteriormente, fechado el 4 de Noviembre de 1988 por A.B.
Moran y fechado el 8 de Noviembre de 1988 por R.W. Johnston de FSIS
y disponible del FSIS, que se incorpora en esta memoria como
referencia. Los resultados del recuento bacteriano para los
componentes de las soluciones de ensayo y para las concentraciones
particulares se indican en las Tablas 1a y 1b como recuento
bacteriano promedio aritmético de las unidades formadoras de
colonias (ufc) por ml de tres placas en réplica.
Los ejemplos 1 y 2 son ejemplos control (no del
invento). En los ejemplos 1 y 2 las soluciones de ensayo fueron agua
desionizada, que se mezclaron con caldo según se describe
anteriormente (a excepción de en el Ejemplo 1 que no fue inoculado)
y se presentaron como controles. El Ejemplo 2 fue inoculado y se
tomó como control. Los resultados del ensayo indican que para el
control no inoculado (Ejemplo 1) no hubo niveles significativos de
Listeria presentes durante las 48 horas del período del
ensayo y que el crecimiento de bacterias aeróbicas totales no fue
aparente hasta el período de ensayo de 8 horas, cuando tal
crecimiento procedió a un ritmo rápido desde el período de 8 horas
hasta los períodos de ensayo de 24 horas y de 48 horas. El control
de agua dsionizada inoculada (Ejemplo 2) exhibió una fase de estado
latente desde el recuento inicial de aproximadamente 31.000 ufc por
ml para la muestra de ensayo de 4 horas (37.000 ufc por ml) seguido
de un crecimiento explosivo a las 8 horas (10,000.000 ufc por ml) y
a las 24 horas (300,000.000 ufc por ml), seguido por una fase de
muerte a las 48 horas (7,700.000 ufc por ml). Esta fase de muerte
después de un crecimiento explosivo se cree debida a factores
relacionados con el crecimiento elevado que precedió inmediatamente,
tales como el agotamiento de los nutrientes o la producción por la
bacteria de ensayo (Listeria) de productos inhibidores de
desecho. De forma similar, los recuentos de bacterias aeróbicas
totales exhibieron un período de crecimiento lento seguido por un
crecimiento explosivo y luego un "ir muriendo". Al realizar el
recuento de las bacterias aeróbicas totales de los Ejemplos
1-28, hubo evidencia de bacilos formadores de
esporas en muchos ejemplos. Típicamente, estos organismos
representan la diferencia entre los recuentos de bacterias aeróbicas
totales y los de Listeria.
Dos agentes quelantes diferentes, específicamente
(1) la sal disódica de EDTA (Na_{2}EDTA) y (2) el ácido cítrico se
sometieron a ensayo para su actividad antibacteriana colocando un
0,8 por ciento en peso de cada uno en agua desionizada e inoculando
según se describe anteriormente. Se encontró que el Ejemplo 3
(Na_{2}EDTA) inhibía el crecimiento de los organismos de
Listeria con un número máximo de organismos determinados a
las 24 horas, seguido de fase de muerte a las 48 horas. El Ejemplo 4
(ácido cítrico) también resultó eficaz para matar e inhibir
Listeria, aunque el nivel de organismos fluctuó a lo largo
del período de ensayo de 48 horas con un recuento promedio elevado
de 35.000 ufc por ml descrito a las 8 horas. Con respecto a los
recuentos de bacterias aeróbicas totales, el Na_{2}EDTA resultó
inhibitorio con un recuento promedio de placas descrito elevado de
88.000 ufc por ml a las 8 horas, comparado con los 560 millones de
ufc por ml para el control inoculado (Ejemplo 2). El ácido cítrico
resultó muy eficaz; produjo una reducción estable en el número de
bacterias aeróbicas totales a lo largo del período de ensayo a
partir de un recuento promedio inicial de 6.500 ufc por ml hasta uno
bajo de 640 ufc por ml a las 48 horas. La eficacia del ácido cítrico
puede haberse debido al menos en parte a un efecto del pH, donde un
bajo pH puede restringir el crecimiento de bacterias, como se sabe
en la técnica.
En los Ejemplos 5-16 las
soluciones de ensayo emplearon varias concentraciones de nisina sola
y con ácido cítrico y Na_{2}EDTA. Los recuentos promedio de
Listeria de las placas para todos estos ejemplos fueron de
menos de 10 ufc por ml durante todos los períodos de ensayo,
incluyendo el ensayo cero horas que se llevó a cabo inmediatamente
después de la inoculación. Se determinó que todos, el Ejemplo 2 (el
control inoculado), así como los Ejemplos 3 y 4 (que sólo contienen
los agentes quelantes), tenían recuentos promedio de Listeria
de al menos 10.000 ufc por ml inmediatamente después de la
inoculación (0 h). Por tanto, podría parecer que todas las muestras
con nisina inoculadas de forma similar, bajo estas condiciones de
ensayo, actuasen matando sustancialmente toda Listeria tras
la mezcla. El que no se observe crecimiento de Listeria
después del período inicial de ensayo puede indicar bien una
erradicación inicial o una reducción significativa de
Listeria después de una inhibición muy eficaz.
Los resultados de los recuentos de las placas de
bacterias aeróbicas totales para los Ejemplos 5-16
demuestran el efecto de la concentración de nisina en ausencia y
presencia de un agente quelante sobre el crecimiento total de las
bacterias.
Los Ejemplos 5-8 fueron
soluciones de ensayo de diversas concentraciones de nisina (en forma
de una preparación de nisina de la marca comercial Nisaplin
disponible en Aplin & Barrett Ltd.) en agua desionizada. Todos
los Ejemplos 5-8 muestran una muerte inicial de las
bacterias inoculadas hasta un nivel inferior a 10 ufc para cada
concentración de nisina. Los recuentos de bacterias aeróbicas
totales obtenidos al sembrar las soluciones de ensayo inoculadas
sobre agar no selectivo de soja tríptica debieran ser una mezcla de
Listeria añadida intencionadamente y de contaminación
fortuita de otros microorganismos. Por comparación, todos los
Ejemplos 2-4 muestran unos recuentos iniciales de
entre 5.900-9.100 ufc por ml, mientras que el
control no inoculado (Ejemplo 1) tuvo un recuento inicial de menos
de 10 ufc por ml.
La comparación del Ejemplo 5, que contiene 1 ppm
de nisina, con el control inoculado (Ejemplo 2) muestra que la
nisina es eficaz, en particular inicialmente al matar bacterias
aeróbicas y controlar, al menos inicialmente, el crecimiento de las
bacterias aeróbicas. Sin embargo, para el período de ensayo de 24
horas el recuento promedio de 130 ufc por ml a las 8 horas del
Ejemplo 5 había crecido de forma explosiva hasta 9,100.000 ufc por
ml. Este crecimiento es menor que el del control inoculado (Ejemplo
2) y aproximadamente igual al del control sin inocular (Ejemplo 1) a
las 24 horas. El rápido crecimiento de las bacterias aeróbicas
totales continuó en el Ejemplo 5, lo que resultó en un recuento de
placas promedio de 45,000.000 ufc por ml a las 48 horas. La
comparación del Ejemplo 5 con los Ejemplos 6-8
demuestra que el aumento de la concentración de nisina actuará
retrasando el comienzo de la fase de crecimiento explosivo para las
bacterias aeróbicas totales y reducirá el recuento promedio de
bacterias aeróbicas totales para cada período de tiempo relativo a
otras soluciones de ensayo que contienen menos nisina.
Los Ejemplos 9-12 igualan a los
Ejemplos 5-8 en concentración de nisina, pero
contienen también un 0,8 por ciento en peso de un agente quelante,
la sal disódica de EDTA (de aquí en adelante Na_{2}EDTA). Los
resultados para los recuentos promedio de placas de bacterias
aeróbicas totales son, excepto para las 110 ufc por ml a las 48
horas del Ejemplo 9, todos menores que 10 ufc por ml. De este modo,
una comparación de, por ejemplo, los recuentos promedio de bacterias
a las 24 horas para el Ejemplo 3 (0,8% en peso de Na_{2}EDTA),
Ejemplo 5 (1 ppm de nisina) y Ejemplo 9 (la combinación de 1 ppm de
nisina y 0,8 de Na_{2}EDTA) muestra recuentos promedio de
bacterias aeróbicas totales de 88.000 ufc por ml, 9,100.000 ufc por
ml y < 10 ufc por ml, respectivamente. La reducción sorprendente
de bacterias hasta menos de 10 ufc por ml para la combinación de
nisina y agente quelante es inesperada. La nisina y agentes
quelantes tales como Na_{2}EDTA parecen actuar sinérgicamente para
reducir el número promedio de bacterias aeróbicas totales, según se
muestra por comparación de los datos a las 24 horas y 48 horas de
los Ejemplos 3 y 5-12. En los Ejemplos
13-16, un segundo agente quelante se probó combinado
con la nisina. Estos ejemplos fueron similares a los Ejemplos
5-8, pero cada uno de ellos contenía también un 0,8
por ciento en peso de ácido cítrico. A excepción de un recuento
promedio inicial de 30 ufc por ml para el Ejemplo 16, todas estas
soluciones de ensayo que contenían la combinación de ácido cítrico y
nisina dieron recuentos promedio de placa de aeróbicos totales de
menos de 10 ufc por ml. Los resultados del ensayo anterior
demuestran la actividad antibacteriana de los agentes quelantes
individuales y de nisina, así como la sorprendente e inesperada
buena actividad de la combinación de nisina y agente quelante frente
a los niveles de bacterias aeróbicas totales. Ésto sugiere que la
combinación de nisina con un agente quelante tal como Na_{2}EDTA o
ácido cítrico funciona con una eficacia inesperada para matar e
inhibir bacterias y puede, por tanto, aplicarse a un producto
alimentario para mejorar drásticamente la duración en
almacenamiento.
En los Ejemplos 17-28 (ejemplos
comparativos) las soluciones de ensayo contienen varias
concentraciones de pediocina con y sin los agentes quelantes
Na_{2}EDTA y ácido cítrico. La pediocina se añadió como una
preparación que se produjo en la leche desnatada de acuerdo con
procedimientos generalmente conocidos en la técnica de preparar
pediocina por cultivo de Pediococcus acidilacti en leche
desnatada.
En relación con los recuentos de placa promedio
de Listeria en la Tabla 1a, es aparente que la pediocina sola
mata e inhibe el crecimiento de Listeria, pero no tan
eficazmente como la nisina en base a igual peso. Los resultados
indican que el aumento de la concentración de pediocina por encima
de 1 ppm reduce generalmente el número de Listeria en los
recuentos iniciales. Las cantidades de pediocina hasta un nivel de
10 ppm o menos inhibieron el crecimiento de Listeria relativo
al control inoculado (Ejemplo 2), pero Listeria continuó
creciendo, mientras que Pediocina a un nivel de 50 ppm o superior no
sólo parece reducir los recuentos de bacteria descritos
inicialmente, sino también impidió que el recuento de
Listeria incrementase exponencialmente, es decir, el recuento
promedio mayor de Listeria durante el período de ensayo de
las 48 horas fue 740 ufc por ml. En los Ejemplos
21-24 las soluciones analizadas fueron similares a
las de los Ejemplos 17-20 salvo que el 0,8 por
ciento en peso del agente quelante Na_{2}EDTA estaba presente con
las concentraciones diversas de pediocina. Como se demostró por
comparación de los Ejemplos 21-24 con el Ejemplo 3 y
los Ejemplos 17-20, la combinación de pediocina y
Na_{2}EDTA resultó inesperadamente eficaz para matar e inhibir el
crecimiento de Listeria a lo largo del período de ensayo de
48 horas, particularmente para niveles bajos de pediocina (10 ppm o
menos). En los Ejemplos 25-28, estas soluciones de
ensayo sustituyeron otro agente quelante, el ácido cítrico, por el
Na_{2}EDTA de los Ejemplos 21-24. Los recuentos
promedio de Listeria por placa para las soluciones que
contienen pediocina y ácido cítrico son sorprendentemente bajos e
indican una eficacia sinérgica para matar e inhibir a la bacteria
Listeria. Por ejemplo, a continuación una comparación de los
recuentos promedio por placa a las 24 horas: para 0,8% en peso de
ácido cítrico solo, 70.000 ufc por ml (Ejemplo 4); para 1 ppm de
pediocina, 170,000.000 ufc por ml (Ejemplo 17) y para la combinación
de 0,8% en peso de ácido cítrico y 1 ppm de pediocina, 10 ufc por ml
(Ejemplo 25). El resultado de 10 ufc por ml del Ejemplo 25 es
extraordinariamente bajo. Las reducciones logarítmicas que pueden
conseguirse por combinación de pediocina y agente quelate relativas
a los componentes individuales solos es significativa e
inesperada.
Con respecto a los recuentos promedio de
bacterias aeróbicas totales, la pediocina parece retrasar y reducir
el crecimiento, siendo las concentraciones mayores de pediocina más
eficaces, particularmente en los períodos de ensayo de 24 y 48
horas. El empleo de pediocina y de los agentes quelantes
Na_{2}EDTA y ácido cítrico también resultó eficaz para inhibir el
crecimiento de las bacterias aeróbicas totales.
Los Ejemplos 1-28 anteriores
demuestran la eficacia de varios agentes antimicrobianos frente a
bacterias patógenas y aeróbicas. De forma inesperada, la combinación
de nisina y un agente quelante, tal como Na_{2}EDTA o ácido
cítrico, se mostró sorprendentemente eficaz frente a las bacterias
aeróbicas totales relativo al empleo de cualquiera de los
componentes por separado. También, inesperada es la sorprendente
eficacia de la combinación de pediocina y un agente quelante tal
como Na_{2}EDTA o ácido cítrico relativo a los componentes
individuales frente a la bacteria patógena Listeria.
Ejemplos
29-43
Varios agentes antimicrobianos aplicados a
productos alimentarios, como salchichas de Viena, se sometieron a
ensayo para determinar su eficacia frente al deterioro subsiguiente.
Las salchichas alemanas pasteurizadas preparadas frescas sin piel
(eliminación del envoltorio) tendrán típicamente bacterias de
superficie en menos de 1.000 ufc por salchicha directamente después
de hacer vacío al embalaje durante los procedimientos de fabricación
comercial típicos. Cuando los recuentos de bacterias alcanzan los
órdenes de magnitud de 10^{7} a 10^{8} o mayores ufc por
salchicha alemana, entonces el deterioro se hace típicamente
visualmente evidente. Bacterias comunes en el deterioro de carnes
procesadas, refrigeradas y empaquetadas al vacío incluye
Lactobacillus. En particular, se ha sometido a ensayo la
eficacia de varias soluciones para proteger los productos
alimentarios sumergidos en ellas frente al crecimiento de bacterias
patógenas como Listeria monocytogenes.
Se emplearon salchichas alemanas formadas a
partir de emulsiones cárnicas y procesamiento típico. Las salchichas
alemanas se prepararon mediante relleno de emulsión cárnica de buey
y cerdo dentro de los envoltorios celulósicos de la marca comercial
E-Z Peel NOJAX® (disponibles comercialmente en la
Viskase Corporation de Chicago, Illinois) y por cocción
(aproximadamente 1 hora) en un ahumadero de gas controlado por
humedad a una humedad relativa de aproximadamente un 20% hasta que
las salchichas alemanas alcanzaron una temperatura interna de, al
menos, 71ºC (160ºF), bajo condiciones sin humo añadido. Entonces se
desprendió el envoltorio mediante un pelador comercial y se desechó.
La emulsión cárnica se fabricó a partir de los ingredientes
referidos en la Tabla A mediante picado y mezclado durante unos
cinco minutos en una picadora comercial y entonces desmenuzado a
través de un moledor comercial de emulsiones para obtener una
emulsión cárnica uniforme. Un análisis químico de las salchichas
pasteurizadas reveló un 56,9% de humedad, un 27,7% de grasa, un
12,2% de proteína, un 2,5% de ceniza, un 1,90% de sal, 65 ppm de
nitrito sódico y un pH de 6,40 en la superficie de la salchicha.
Las salchichas refrigeradas almacenadas a 4ºC
(40ºF) se recubrieron en su superficie con soluciones de ensayo al
sumergir individualmente las salchichas en un líquido de ensayo
durante aproximadamente 30 segundos con la menor manipulación
posible, seguido de un período de aproximadamente 30 segundos
durante el cual cada salchicha se mantuvo verticalmente para
escurrirse. Las salchichas recubiertas se inocularon entonces (salvo
un control no inoculado) con una mezcla de tres cepas de Listeria
monocytogenes patógena (que se cultivaron a partir de cepas
aisladas bien de carne animal o carne vegetal) hasta un nivel de
aproximadamente 10.000 - 30.000 unidades formadoras de colonias
(ufc) por salchicha alemana. Inmediatamente después de la
inoculación, las salchichas alemanas de cada ejemplo se sometieron a
ensayo por lavado con un tampón estéril que fue entonces sembrado
empleando métodos descritos anteriormente, tanto en agar de levadura
triptona glucosa (TGY), no selectivo de Listeria, como en
agar LPM selectivo de Listeria y se incubaron para determinar
la presencia de bacterias aeróbicas totales y Listeria.
A continuación de la inoculación, las salchichas
se empaquetaron de forma individual en bolsas disponibles
comercialmente en PERFLEX® 51B Barrier Bags (manufacturadas por
Viskase Corporation de Chicago, Illinois). Estas bolsas se
sometieron a vacío y se sellaron por calor bajo un vacío elevado con
un instrumento comercial para hacer vacío/sellar para proporcionar
una barrera al oxígeno y a la humedad del medio ambiente. Las
muestras de ensayo se almacenaron a temperaturas ambiente (alrededor
a 25ºC) durante dos días y entonces se sometieron a ensayo para los
recuentos de bacterias totales y de Listeria, según se
describió con anterioridad para las muestras después de la
inoculación. Las soluciones de ensayo y los recuentos de bacterias
se describen en la Tabla 2.
En los Ejemplos 29-43, los
agentes antimicrobianos se disolvieron o suspendieron en agua
desionizada. Todas las soluciones de ensayo descritas en la Tabla 2
fueron acuosas.
El Ejemplo 29 difirió de los otros ejemplos en
que sus salchichas alemanas se sumergieron en una muestra de sólo
agua desionizada y no fueron posteriormente inoculadas con
organismos de Listeria. El Ejemplo 29 se tomó como un control
no inoculado (no del invento) para examinar el crecimiento de
cualquier organismo ya presente en el entorno, por ejemplo, de las
salchichas o introducido por contaminación accidental. Los
resultados del Ejemplo 29 indican que no hubo niveles significativos
de Listeria detectados durante el período de ensayo de dos
días, mientras que el recuento promedio de las placas para las
bacterias aeróbicas totales aumentó desde 2,600 hasta unas 590.000
ufc estimadas por salchicha.
El Ejemplo 30 se llevó a cabo como un control
inoculado (no del invento) con agua desionizada como la solución de
ensayo. Este Ejemplo resultó idéntico al Ejemplo 24, salvo que las
salchichas alemanas sumergidas se inocularon con organismos de
Listeria.
A lo largo del periodo de ensayo de dos días, el
crecimiento de Listeria resultó explosivo y alcanzó un
recuento promedio estimado por placa de 38,000.000 ufc por salchicha
alemana. El recuento de bacterias aeróbicas totales mostró un
crecimiento explosivo similar.
En el Ejemplo 31, una solución del 3 por ciento
en peso de la sal trisódica de EDTA no afectó apreciablemente ni al
crecimiento de Listeria ni al crecimiento de aeróbicos
totales en las salchichas a lo largo del período de ensayo de los
dos días.
En los Ejemplos 32-35 se
analizaron varias concentraciones de nisina sola y en combinación
con el agente quelante Na_{3}EDTA en las salchichas. En estos
ejemplos, la nisina se añadió como una preparación producida por
fermentación de la leche. Esta preparación de nisina está disponible
comercialmente bajo el nombre comercial "Nisaplin" en Aplin
& Barrett de Trowbridge, Inglaterra. En las soluciones de ensayo
para obtener, por ejemplo, un 0,01 por ciento en peso de nisina fue
necesario añadir un 0,4 por ciento de la preparación de nisina
(Nisaplin).
Aunque se cree que todas las salchichas
recubiertas de la solución de ensayo de los Ejemplos
30-43 se inocularon inicialmente con, al menos,
aproximadamente 10.000 ufc de Listeria por salchicha, los
recuentos iniciales promedio por placa de Listeria para los
Ejemplos 32-35 fueron todos menores a 10 ufc. Estos
recuentos iniciales bajos se cree que indican que cantidades
sustanciales de Listeria murieron al entrar en contacto con
el recubrimiento que contenía nisina. Todas las soluciones de
recubrimiento que contenían nisina resultaron eficaces en la
reducción del crecimiento de Listeria a lo largo del período
de dos días, siendo las soluciones con mayores cantidades de nisina
las más eficaces en inhibir Listeria. El Ejemplo 32, en el
que el recubrimiento de la salchicha alemana contenía sólo nisina a
nivel de 100 ppm en la solución de ensayo, se mostró más eficaz a lo
largo del período de dos días. Sin embargo, ésto puede deberse bien
a una erradicación inicial o a una reducción significativa después
de una inhibición muy eficaz. Los resultados de los ensayos para las
bacterias aeróbicas totales sugieren que 100 ppm de nisina y un 3,0
por ciento en peso de Na_{3}EDTA actúan sinérgicamente para
detener el crecimiento de las bacterias aeróbicas totales sobre las
superficies cárnicas recubiertas, cocinadas o pasteurizadas, según
se observa de la comparación del Ejemplo 35 con los Ejemplos 31 y
32.
En los Ejemplos 36-39, se empleó
una preparación no comercial de nisina. Esta preparación de nisina
se obtuvo cultivando Streptococcus lactis en leche desnatada,
empleando procedimientos conocidos habitualmente. El Ejemplo 36
analizó las salchichas recubiertas con una solución de nisina a 52
ppm sin el agente quelante Na_{3}EDTA. La comparación de los
resultados del Ejemplo 36 con los Ejemplos 31 y 39 indican que el
empleo de la combinación de nisina y del agente quelante
Na_{3}EDTA proporcionaron una reducción sorprendente e inesperada
en ambos recuentos promedio de Listeria por placa y de
bacterias aeróbicas totales durante el período de ensayo de dos
días.
Se examinaron otros agentes quelantes con una
acción inhibitoria y de muerte inesperadamente buena frente a las
bacterias aeróbicas totales para la combinación de nisina y ácido
cítrico o ciclodextrina. La combinación de nisina y ciclodextrina y
de nisina y ácido cítrico también mostró una eficacia muy buena
frente al crecimiento de Listeria sobre las superficies de
los alimentos. La ciclodextrina empleada en estos ejemplos fue
beta-ciclodextrina, que está disponible
comercialmente en la compañía American
Maize-Products de Hammond, Indiana.
Los Ejemplos 29-43 demuestran que
una composición bactericida que contiene nisina y un agente
quelante, tal como Na_{3}EDTA, ácido cítrico o ciclodextrina,
puede emplearse para matar e inhibir bacterias patógenas y prolongar
la duración en almacenamiento de los alimentos. La composición
novedosa que contiene una combinación de nisina y agente quelante
parece útil como conservante alimentario. En esta memoria la
solución se aplicó sobre las superficies de salchichas por
inmersión, pero se cree que pueden emplearse otros métodos de
aplicación, según se comentó anteriormente, como pulverización,
mezclado o contacto con una película de recubrimiento liberable y
que la combinación del invento puede emplearse, no sólo con carne
elaborada, sino con otros alimentos que incluyen frutas, verduras,
productos de cereales, productos lácteos, huevos, así como carnes,
aves de corral y pescados. Se cree que la composición tiene utilidad
para productos alimentarios frescos, crudos, cocinados,
pasteurizados y esterilizados. La eficacia sinérgica para matar e
inhibir patógenos y organismos que deterioran los alimentos se
demuestra por los resultados de los ensayos anteriores.
Ejemplos
44-55
Varios agentes antimicrobianos se aplicaron a las
salchichas alemanas sumergiendo cada una de ellas dentro de las
soluciones de ensayo acuosas que contenían los agentes. Las
salchichas sumergidas se inocularon con bacterias y se analizó el
crecimiento de bacterias en su superficie a lo largo del tiempo. Los
procedimientos para este ensayo fueron sustancialmente idénticos que
los seguidos en los Ejemplos 29-43 anteriores, salvo
en lo que se indica a continuación. La emulsión cárnica empleada
aquí fue sustancialmente la misma receta empleada en los Ejemplos
29-43, salvo que no se empleó dextrosa en la
emulsión cárnica de los Ejemplos 44-55. Las
condiciones de cocción y elaboración de las salchichas fueron las
mismas con la salvedad de que la humedad relativa fue del 25% y que
las salchichas alemanas se cocieron hasta alcanzar una temperatura
interna de 72ºC (162ºF). Un análisis químico de las salchichas una
vez pasteurizadas reveló un pH de la superficie de 6,36 y una
humedad del 56,3%, un 28,7% de grasa, un 12,4% de proteína, un 2,6%
de ceniza, un 1,94% de sal y 56 ppm de nitrito sódico. Aunque no se
añadió humo, se realizó un análisis de humo que indicó 24,6 mg de
ácido, 0,3 mg de fenol y 7,1 mg de compuestos de tipo carbonilo por
cada 100 g de salchicha alemana cocida. Estas cantidades se cree que
se deben a una acumulación residual de los constituyentes de humo
del ahumadero.
Las salchichas alemanas se recubrieron en las
soluciones de ensayo mediante inmersión durante treinta segundos,
seguido de escurrido durante treinta segundos. Entonces, las
salchichas recubiertas se inocularon con una mezcla de tres cepas de
Listeria monocytogenes patógena al pipetar 0,05 ml (alrededor
de 100 células) de inóculo sobre cada salchicha. El inóculo se
esparció con un bastoncillo de algodón estéril. Las salchichas se
empaquetaron entonces en dos capas de cuatro en bolsas
PER-FLEX® 51B Barrier Bags disponibles
comercialmente (fabricadas por la compañía Viskase de Chicago,
Illinois). En estas bolsas de película de termoplástico se hizo
vacío y se sellaron por calor bajo un vacío elevado con un
instrumento comercial para hacer vacío/sellar para proporcionar una
barrera al oxígeno y a la humedad del medio ambiente. Grupos
separados de paquetes se prepararon para las salchichas recubiertas
con cada solución de ensayo. Cada paquete sellado de ocho salchichas
se almacenó a aproximadamente 4,4ºC (40ºF). Se analizaron tres
réplicas de los paquetes, inicialmente (Día 0) y a los 14, 28 y 42
días de almacenado. Para el ensayo, se retiró asépticamente una
salchicha de cada paquete siendo analizada y colocada en una bolsa
con 10 ml de tampón fosfato, entonces se agitó para aclarar de
células bacterianas adheridas a la superficie de la salchicha. Se
sembraron diluciones decimales secuenciales en agar LMP y agar TGY
como en los ejemplos anteriores 29-43. Los
resultados del recuento promedio aritmético por placa de los tres
paquetes replicados sometidos a ensayo se describen en la Tabla
3.
Las salchichas de los Ejemplos 44 y 45 fueron
recubiertas al sumergir cada salchicha dentro de una solución
diluyente de fostato tamponado de Butterfield que contenía
aproximadamente 42,5 ppm de ortofosfato potásico en agua desionizada
ajustada a un pH de 7,2. Los Ejemplos 44 y 45 difirieron en que sólo
las salchichas del Ejemplo 45 se inocularon con Listeria. Por
tanto, el Ejemplo 44 sirvió como un control no inoculado (no del
invento) y el Ejemplo 45 sirvió como un control inoculado (no del
invento) similar a los Ejemplos anteriores 29 y 30. El diluyente de
fostato tamponado de Butterfield se empleó para minimizar cualquier
interrupción debida a las fuerzas osmóticas de cualquier bacteria ya
presente o añadida. Los resultados indican niveles no significativos
de Listeria a lo largo del período de ensayo de 42 días para
el control no inoculado, mientras que el recuento promedio de las
placas para las bacterias aeróbicas totales ascendió hasta 3,200.000
ufc por salchicha para el día 42 de ensayo. Las salchichas del
control inoculado (Ejemplo 45) mostraron un crecimiento rápido de
Listeria a partir de un recuento promedio inicial de placas
de 340 ufc por salchicha hasta un promedio de 1.400,000.000 ufc por
salchicha a los 28 días. El recuento de bacterias por placa para la
muestra del día 42 no se determinó debido a los números
excesivamente elevados de bacterias, según se determinó por examen
visual de los paquetes que revelaron turbiedad del fluido contenido
dentro del paquete hecho vacío. Es conocido por los especialistas en
la técnica de microbiología de los alimentos que esta turbiedad
indica niveles extremadamente elevados de bacterias. Los números
excesivos de bacterias a los 42 días resultaron aparentes en todos
los ejemplos, salvo para el control no inoculado (Ejemplo 44) y para
los Ejemplos 54 y 55 comentados a continuación. Los resultados del
recuento por placa de mesófilos aeróbicos totales muestran que el
crecimiento de bacterias aeróbicas totales, que incluyen tanto
Listeria (un anaerobio facultativo) como cualquier bacteria
casual, aumenta desde un promedio de 120 ufc por salchicha hasta un
promedio de 1.900,000.000 ufc por salchicha en el día 28 de
ensayo.
En los Ejemplos 46-53, se
analizaron las soluciones acuosas de la sal disódica de EDTA. El
Na_{2}EDTA en solución se sometió a ensayo sobre las salchichas
solo o en combinación con propilenglicol, benzoato sódico, sorbato
potásico, lisozima y como un sistema de tres componentes con
propilenglicol y parabenos. El propilenglicol también se sometió a
ensayo solo y con un humo líquido disponible comercialmente vendido
bajo el nombre comercial de Charsol®, C-10 por la
compañía Red Arrow Products Co. de Manitowoc, Wisconsin. Todas las
salchichas recubiertas con estas soluciones de ensayo mostraron un
crecimiento de bacterias inaceptablemente elevado al final del
período de ensayo de 42 días. Sin embargo, los Ejemplos 46,
49-52 resultaron de algún provecho en la inhibición
del crecimiento de las bacterias según se mostró por los reducidos
recuentos promedio de bacterias aeróbicas totales hasta el día 28 de
ensayo relativo al control inoculado, pero sólo las soluciones que
contenían lisozima, benzoato sódico y sorbato potásico de los
Ejemplos 52, 50 y 51, respectivamente, mostraron algún efecto al
provocar reducciones logarítmicas en los recuentos promedio de
Listeria por placa a los 28 días.
Los Ejemplos 54 y 55 analizaron soluciones
acuosas que contenían 100 ppm y 250 ppm de nisina (la nisina se
añadió en forma de Nisaplin) en combinación con un 0,8 por ciento en
peso de Na_{2}EDTA como un recubrimiento antibacteriano para las
salchichas alemanas pasteurizadas. Estos recubrimientos resultaron
eficaces frente a la inoculación de las salchichas con
Listeria patógena, reduciendo el recuento inicial promedio
por placa a menos de 10 ufc por salchicha y manteniendo un recuento
promedio de placa de 20 ufc o menos por salchicha durante el período
completo de 42 días de ensayo. El empleo de agar LMP selectivo de
Listeria puede reducir, a través de la naturaleza selectiva
del agar, el número de organismos de Listeria presentes
originalmente. Por tanto, el recuento de bacterias aeróbicas totales
se llevó a cabo empleando un agar de métodos convencionales no
selectivo como el agar TGY. Los recuentos realizados para bacterias
aeróbicas totales incluyen no sólo colonias de Listeria, sino
también cualquier colonia casual de otras bacterias que puedan
crecer en competición con, o además de, Listeria, tales como
Staphlococcus. Los recuentos promedio por placa para el total
de bacterias aeróbicas de los Ejemplos 54 y 55 indican una reducción
logarítmica sorprendente en organismos relativo al control inoculado
del Ejemplo 45. Los recuentos promedio por placa fueron no sólo de
10 ufc o menos por salchicha inicialmente y en el día 14, sino que
los recuentos a los 28 días fueron < 10, < 10 y 3.900 ufc por
salchicha para el Ejemplo 54 y < 10, 230 y 70.000 ufc por
salchicha para el Ejemplo 55 comparado con los 80 millones, 440
millones y 5,2 miles de millones de ufc por salchicha para las tres
placas control inoculadas (promedio: 1,9 miles de millones de ufc).
A los 42 días las salchichas recubiertas de la solución de 100 ppm
de nisina y Na_{2}EDTA tuvieron un recuento promedio por placa
menor a 10 ufc por salchicha, mientras que las tres placas sometidas
a ensayo para las salchichas recubiertas de la solución de 250 ppm
de nisina y Na_{2}EDTA del Ejemplo 55 se contaron en <10;
270.000 y 1,300.000 ufc por salchicha. De ese modo, los recuentos de
bacterias aeróbicas totales en el día 42 para las salchichas
alemanas inoculadas del Ejemplo 54 y 55 pueden compararse
favorablemente con los recuentos de las tres placas de 130.000,
180.000 y 9,200.000 ufc por salchicha (promedio: 3,2 millones de
ufc) sometidos a ensayo a los 42 días para el control no
inoculado del Ejemplo 44. Estos resultados espectaculares
indican además que las composiciones que contienen nisina y un
agente quelante pueden emplearse para proteger frente al crecimiento
de bacterias patógenas y que deterioran los alimentos durante largos
períodos de tiempo a temperaturas reducidas. De este modo, la
conservación de los alimentos puede mejorarse con tiempos mayores de
conservación. Las composiciones pueden emplearse para pulverizarse
sobre la superficie de los productos alimentarios.
Claims (3)
1. Un método para aumentar la duración en
almacenamiento de los alimentos elaborados tratando la superficie
del producto alimentario con una composición bactericida que tiene
un efecto antimicrobiano intensificado y que comprende una
combinación de nisina y un agente quelante en una cantidad eficaz
para matar, impedir o inhibir el crecimiento de Listeria
monocytogenes patógena tras contacto y que permanece
suficientemente eficaz después de termotratamiento y procesamiento,
en el que dicho producto alimenticio incluye comestibles cocinados y
elaborados;
dicho método incluye recubrir dicha superficie
del producto alimentario con dicha composición en una cantidad
suficiente para matar, impedir o inhibir el crecimiento de la
bacteria Listeria monocytogenes patógena sobre la superficie
del producto alimentario;
dicho recubrimiento se lleva a cabo por
pulverización de dicha composición sobre dicha superficie del
producto alimentario;
en el que dicha composición es una disolución
ácida que contiene dicha nisina como un soluto o dispersión en
concentraciones de 5 a 250 ppm en peso de la composición total y
en el que dicho agente quelante incluye EDTA,
ácido cítrico o sus sales; dicho quelante está presente en dicha
disolución en cantidades desde 0,2 hasta 3,0 por ciento en peso.
2. Un método, de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha composición incluye además aditivos tales como
agentes aglutinantes, tampones, emulsionadores y/o coadyuvantes de
transferencia.
3. Un método, de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el que dicho producto alimentario incluye salchichas de
todos los tipos.
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| Lado | Characteristics of Listeria monocytogenes important for pulsed electric field process optimization | |
| Bottini | Evaluation of antimicrobials against multi-strain cocktails of Salmonella, Escherichia coli O157: H7 and Listeria monocytogenes using a kinetic growth inhibition assay | |
| Baltić et al. | The influence of vacuum-packaging and marination on the behaviour of total Enterobacteriaceae on chicken breast fillets. |