DE69034155T2

DE69034155T2 - Verfahren zur Oberflächenbehandlung von Nahrungsmitteln

Info

Publication number: DE69034155T2
Application number: DE69034155T
Authority: DE
Inventors: Darrel Loel Worth Wilhoit
Original assignee: Viskase Companies Inc
Current assignee: Viskase Companies Inc
Priority date: 1989-02-21
Filing date: 1990-02-16
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2010-02-17
Also published as: EP0384319B1; ATE179307T1; EP1084628A2; EP1084628B1; EP0384319A1; DK1068808T3; JP2794318B2; FI900844A0; DE69033070D1; DE69034156D1; JPH02300106A; EP1084628A3; EP0750853A3; DE69033070T2; DE69034156T2; DE69033779T2; DK1084628T3; ATE273625T1; EP0750853A2; AU4993590A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibierung oder Verhinderung des Wachstums von Mikroben, wie Bakterien, Schimmel (Schimmelpilzen) und Hefen auf Lebensmitteloberflächen.
"Lebensmittelkonservierung", wie diese Bezeichnung hier gebraucht wird, umfaßt Verfahren, die gegen Lebensmittelvergiftungen schützen, ebenso wie Verfahren, die den Verderb von Lebensmitteln durch Mikroben verzögern oder verhindern. Lebensmittelkonservierung führt zu für den Verbrauch sicherer Nahrung und inhibiert oder verhindert die Verschlechterung des Nährwerts von Lebensmitteln oder organoleptische Veränderungen, die bewirken, daß die Nahrung weniger appetitlich wird.
"Lebensmittelverderb", wie diese Bezeichnung hier gebraucht wird, umfaßt jede Veränderung des Zustands von Lebensmitteln (Nahrung), die sie weniger appetitlich macht, einschließlich Veränderungen im Geschmack, Geruch, der Textur oder des Aussehens. Verdorbene Nahrung kann gegebenenfalls giftig sein.
"Lebensmittelvergiftung", wie diese Bezeichnung hier gebraucht wird, bezieht sich auf Säugetiererkrankungen, die durch die Einnahme von Nahrung verursacht werden, die durch pathogene Viren, Schimmel oder Bakterien und/oder deren Toxine verursacht wird. Durch Pathogene infizierte Nahrung zeigt nicht notwendigerweise irgendwelche organoleptische Zeichen von Verderb. Bakterielle Lebensmittelvergiftung kann sowohl durch Infektion des Wirts durch den bakteriellen Organismus wie auch durch die Wirkung eines Toxins verursacht werden, das von den Bakterien entweder in der Nahrung oder in dem Wirt produziert wird.
Die Verhinderung von Lebensmittelverderb und Lebensmittelvergiftung ist in der Geschichte oft nach dem Prinzip von Versuch und Irrtum (trial and error) versucht worden. Die frühen Versuche haben zu Verfahren der Lebensmittelkonservierung geführt, wie Trocknung, Einsalzen und/oder Räuchern von Nahrungsmitteln, um sie zu konservieren. Erst in relativ jüngerer Geschichte ist die Lebensmittelkonservierung auf eine wissenschaftliche Grundlage gestellt wor den. Im neunzehnten Jahrhundert hat die Arbeit von Wissenschaftlern, wie Louis Pasteur und Robert Koch, die bakteriellen Ursachen von Lebensmittelvergiftung und -verderb aufgeklärt und neue Verfahren zur Identifizierung pathogener Bakterien und zur Lebensmittelkonservierung geschaffen.
Die heutigen Lebensmitteltechnologen verwenden eine Reihe von physikalischen, chemischen und biologischen Verfahren und Mittel, um Nahrung zu konservieren und um die Übertragung von Krankheiten durch Lebensmittel zu verhindern. Zusätzlich zu solchen Verfahren, wie Bestrahlung, Fermentation bzw. Vergärung, Pasteurisierung, Temperaturkontrolle, pH- und/oder Wasserstoffionenaktivität existiert eine Reihe chemischer Mittel. Diese Mittel umfassen Antioxidantien, um den chemischen Abbau von Nahrung zu verhindern, ebenso wie Zusammensetzungen, die schädliche Bakterien und/oder andere Mikroben töten oder inhibieren, wobei die Nahrung konserviert wird, d. h. sowohl gegen deren Verderb als auch gegen die Ubertragung von Krankheiten Vorsorge getroffen wird. Allgemein verwendete antimikrobielle Chemikalien umfassen Nitrite, Nitrate, Schwefeldioxid, Sulfite und Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Benzoesäure und Sorbinsäure und deren Salze, Holzrauch und flüssige Räuchermittel, ebenso wie Antibiotika, wie Natamycin und Nisin.
Die Verhinderung von Lebensmittelvergiftung ist von herausragender Bedeutung für die Lebensmittelindustrie. Die Sorge um die Lebensmittelsicherheit hat in den meisten Ländern dazu geführt, die Lebensmittelindustrie strengen Regeln zu unterziehen, um die öffentliche Gesundheit sicherzustellen. Die Hersteller von Fertignahrung investieren auch beträchtliche Mittel, um die Sicherheit ihrer Produkte zu gewährleisten. Trotz dieser Anstrengungen kommt Lebensmittelvergiftung immer noch vor. Viele Fälle von Lebensmittelvergiftung werden Bakterien zugeschrieben, wie Salmonella, Clostridium und Staphylococcus und anderen.
Von steigender Bedeutung ist die für die Lebensmittelindustrie relativ junge Erkenntnis einer weitverbreiteten Infizierung bzw. Kontamination von Geflügel und Fertignahrung, wie Wiener Würstchen ("Wiener"), anderen Wurstwaren, Käse, Molkereiprodukten einschließlich neueren Eisspezialitäten und Fischwaren, durch Listeria. Von besonderer Bedeutung ist die neuere Erkenntnis, daß pasteurisierte und voll durchgekochte Fertignahrung mit Mikroben, wie Listeria monocytogenes, infiziert sein kann, auch nach dem Kochen und Pasteurisieren und vor dem Abpacken für den Verkauf. Diese Infizierung bzw. Kontamination ist eine typische Oberflächeninfizierung bzw. -kontamination, die vermutlich durch den Kontakt von Mikroben mit den Lebensmitteloberflächen nach der Wärmebehandlung (d. h. Kochen oder Pasteurisieren) verursacht wird. Mikroben, wie Listeria, können aus der Luft stammen (d. h. durch Staub übertragen werden) oder auf den Oberflächen der Verarbeitungsausrüstungen vorhanden sein, die mit den Lebensmitteln in Berührung kommen.
In den achtziger Jahren ist weltweit über einige Fälle von Lebensmittelvergiftungen berichtet worden, in denen als vermutliche oder tatsächliche Ursache Listeria-infizierte Nahrungsmittel identifiziert worden sind. Fälle von Listeriosis (Infektion durch Listeriabakterien) beim Menschen sind aus Massachusetts, Kalifornien und Pennsylvania in den USA und auch aus Kanada und der Schweiz berichtet worden. Diese Fälle sind der Einnahme Listeria-infizierter Nahrung zugeschrieben worden, wie Krautsalat, Rohmilchkäse, oberflächengereiftem Weichkäse und Salami. Hunderte von Menschen sind infiziert worden mit einer Mortalität von bis zu einem Drittel der Infizierten. Besonders empfindlich gegen die Krankheit (die ansteckend ist) sind Schwangere, Föten, Neugeborene und Kleinkinder, ebenso wie Erwachsene mit geschädigtem Immunsystem, wie Erwachsene, die mit immunsuppressiven Medikamenten, wie Corticosteroiden, behandelt werden. Listeriose ist eine Erkrankung, die Meningitis, Spontanabort und perinatale Blutvergiftung verursachen kann. Obwohl bei Früherkennung behandelbar, weist unbehandelte Listeriose eine hohe Mortalitätsrate auf.
Lebensmittelkonservierung durch Inhibierung des Wachstums von Listeria monocytogenes ist schwierig. Listeria kann sich erwiesenermaßen bei pH-Werten oberhalb von 4,85 und über einen weiten Temperaturbereich, der zwischen 3 und bis zu 45 °Celsius betragen kann, sowohl aerob als auch anaerob, vermehren und wachsen. Das heißt, daß Listeria bei normalen Kühlschranktemperaturen gedeihen kann. Es wurde auch berichtet, daß sich Listeria in wäßrigen Lösungen von bis zu 10 % Kochsalz vermehren kann. Glücklicherweise tötet Kochen oder Pasteurisieren Listeria ab. Unglücklicherweise kann Kontaminierung durch Mikroorganismen erst nach dem Pasteurisieren beim Verarbeiter vorkommen. Viele Leute verzehren Fertignahrung erst, nachdem seit dem ersten Kochen oder Pa steurisierung beim Verarbeiter eine beträchtliche Zeitspanne vergangen ist. Viele Leute verzehren Fertignahrung noch nach beträchtlichen Zeiten nach dem ersten Kochen oder Pasteurisieren beim Nahrungsmittelhersteller, wodurch es auf diese Weise ermöglicht wird, daß sich Bakterien, die sich durch Infektion nach der Pasteurisierung angesiedelt haben, vermehren. Da dieses Verzehren vorkommen kann, ohne daß die Fertignahrung zuvor wieder auf genügende Temperaturen erhitzt wird und dies für eine ausreichende Dauer, um verschiedene Mikroben (wie z. B. Listeria) abzutöten, die sich nach dem ursprünglichen Kochen angesiedelt haben könnten, besteht ein Risiko der Lebensmittelvergiftung. Die vorliegende Erfindung soll diese vorerwähnten Risiken vermindern.
Die WO 89/12399 A1 beschreibt eine bakterizide Zusammensetzung mit bakteriziden Verbindungen, welche Lanthionin (wie Nisin) und einen Chelatbildner umfassen. Diese Schrift zeigt in-vitro-Effekte dieser Verbindungen gegen verschiedene Bakterien.
Die GB-A-940 379 beschreibt Zusammensetzungen zur Konservierung, welche p-Hydroxybenzoesäureester umfassen, sowie ihre Verwendung zur Nahrungsmittelkonservierung.
Ein Gegenstand der Erfindung ist es, durch ein Verfahren der Übertragung einer kontrollierten Menge einer antimikrobiellen Zusammensetzung auf die Oberfläche eines Lebensmittels pathogene Mikroorganismen auf der Oberfläche des Lebensmittels abzutöten, zu inhibieren oder deren Wachstum zu verhindern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, die Haltbarkeit von verarbeiteten Nahrungsmitteln (Fertignahrungsmitteln) durch Anwendung einer synergistischen Mischung, vorzugsweise einer Flüssigkeit oder einer Suspension eines von Streptococcus lactis stammenden (oder äquivalenten synthetischen) Bakteriocins und eines Chelatbildners (Komplexbildners) zu erhöhen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Haltbarkeit verarbeiteter Nahrungsmittel gemäß Patentanspruch 1 bereit. Weitere Ausführungsformen werden in den entsprechenden abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Die vorstehenden Gegenstände und andere, die sich aus dem folgenden ergeben, können durch die Behandlung eines Nahrungsmittels, d. h. einer Lebensmitteloberfläche, mit einer antimikrobiellen Zusammensetzung, einem Komplexbildner, wie EDTA oder Zitronensäure, in Kombination mit dem von Streptococcus lactis stammenden Bakteriocin Nisin erreicht werden. Die Behandlung erfolgt durch Aufsprühen. Die antimikrobielle Zusammensetzung verbleibt auf der Lebensmitteloberfläche in einer wirksamen Menge, um lebensmittelverderbende Organismen oder pathogene Mikroorganismen, wie Listeria, darauf abzutöten oder deren Wachstum zu verhindern oder zu inhibieren.
Die erfindungsgemäß verwendete bakterizide Zusammensetzung umfaßt das wärmeresistente, von Streptococcus lactis abgeleitete Bakteriocin (oder deren synthetisches Äquivalent) bzw. antibakterielle Mittel Nisin. Das Mittel ist insbesondere wirksam gegen das Wachstum von grampositiven Bakterien, insbesondere Listeria monocytogenes, und ist wärmeresistent.
Es ist nicht erforderlich, daß jeder und sämtliche der vorgenannten Gegenstände in allen Ausführungsformen der Erfindung vorhanden sind; es ist ausreichend, daß die Erfindung vorteilhaft angewandt werden kann.
Wesentlich für die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist die synergistische Kombination eines komplexbildenden oder chelatisierenden Mittels, wie eines EDTA-Salzes oder Zitronensäure, mit dem von Streptococcus lactis abgeleiteten Bakteriocin (oder synthetischem Äquivalent) Nisin. Eine flüssige Mischung oder Suspension von Nisin und einem Chelatbildner ist besonders bevorzugt.
Ein wesentlicher Aspekt eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Schutz der Lebensmitteloberfläche für eine wesentliche Zeitdauer nach der Behandlung.
Ein wesentlicher Aspekt einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Folie ist die Verwendung des wärmeresistenten antimikrobiellen Mittels Nisin, das gegen Bakterien nach der Pasteurisierung oder Wärmebehandlung wirksam ist.
Es wurde überraschenderweise herausgefunden, daß eine antimikrobielle Zusammensetzung, die eine synergistische Kombination des von Streptococcus stammenden Bakteriocins Nisin (oder eines synthetischen Äquivalents) und eines Chelatbildners, wie Zitronensäure, enthält, unerwarteterweise gute bakterizide Eigenschaften insbesondere gegen pathogene Bakterien, wie Listeria monocytogenes, aufweist. Zusätzlich ist eine solche Zusammensetzung überraschenderweise in der Lage, die Haltbarkeit von Lebensmitteln zu verlängern, indem sie ein Verderben der Lebensmitteln für einen längeren Zeitraum verhindert, als man basierend auf der Wirksamkeit einer der beiden Bestandteile allein erwartet hätte.
Das verwendete Bakteriocin ist Nisin. Nisin ist ein Polypeptidbakteriocin, das durch Milchsäurebakterien, Streptococcus lactis Gruppe N, hergestellt wird.
Nisin ist wie angegeben eine Sammelbezeichnung, die verschiedene, nahe verwandte Substanzen darstellt, die als Nisin A, B, C, D und E bezeichnet werden und eine ähnliche Aminosäurezusammensetzung aufweisen. Die Struktur und die Eigenschaften von Nisin sind weiterhin diskutiert in dem Artikel von E. Lipinska mit dem Titel "Nisin und seine Anwendungen", The 25th Proceedings of the Easter School in Agriculture Science at the University of Nottingham 1976, Seiten 103–130 (1977), wobei dieser Artikel hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Das Komitee über biologische Standardisierung der Weltgesundheitsorganisation (World Health Organization Committee on Biological Standardization) hat eine internationale Referenzdarstellung von Nisin aufgestellt, und die Internationale Einheit (International Unit, im folgenden IU) ist definiert als 0,001 mg dieser Zusammensetzung. NISAPLIN ist der Handelsname für ein Nisinkonzentrat, das 1 Million IU pro g enthält, welches kommerziell enthältlich ist von Aplin & Barrett Ltd., Trowbridge, Wiltshire, England.
Nisin ist ein bekanntes Lebensmittelkonservierungsmittel, welches bekanntermaßen wärme- bzw. hitzestabil und säurestabil und aktiv gegen grampositive Bakterien ist. Nisin wird als Lebensmittelkonservierungsmittel in Milchprodukten und Gemüse üblicherweise in Verbindung mit einer Wärmebehandlung eingesetzt. Nisin kommt gleichermaßen natürlich in Rohmilch vor und ist bei der Hitzeverarbeitung von Fleischpasten eingesetzt worden. Nisin gilt als nichttoxisch mit toxikologischen Daten, die keinen schädlichen Effekt bei Mengen von 3,3 Millionen IU pro kg Körpergewicht zeigen. Nisin kann nachweislich Erwär mungen bis zu 121 °C ohne Verlust seiner Aktivität standhalten. Obwohl ein gewisser Verlust der Aktivität erwartet werden kann, wenn Nisin in behandelten Lebensmitteln eingesetzt wird, kann dies beispielsweise durch eine Erhöhung der eingesetzten Nisinmenge verbessert werden. Wirksame Mengen an Nisin zur Konservierung von Lebensmitteln liegen bekanntlich im Bereich von 25–500 IU/g oder mehr.
Geeignete Chelatbildner oder Komplexbildner umfassen EDTA, Zitronensäure oder ihre Salze.
Diese Komplexbildner sind bei der Nahrungsmittelverarbeitung in ihrer Salzform verwendbar, die im allgemeinen Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze sind, wie Natrium-, Kalium- oder Kalzium- oder quaternäre Ammoniumsalze. Komplexbildende Verbindungen mit Mehrfachvalenzen können vorteilhafterweise verwendet werden, um den pH-Wert einzustellen oder selektiv Metallionen z. B. in ein Lebensmittel-Überzugssystem einzuführen oder daraus zu entfernen. Zusätzliche Information über komplexbildende und chelatbildende Agenzien ist von T. E. Furia (Hrsg.), CRC Handbook of Food Additives, 2. Aufl., S. 271–294 (1972, Chemical Rubber Co.) und M.S. Peterson und A.M. Johnson (Hrsg.), Encyclopedia of Food Science, S. 694–699 (1978, AVI Publishing Company, Inc.) offenbart; beide Artikel werden vollinhaltlich in die Beschreibung aufgenommen.
Die Bezeichnungen "chelatisierendes Mittel (Chelatbildner)" und "Komplexbildner" werden hier als Synonyme verwendet und werden definiert als organische oder anorganische Verbindungen, die in der Lage sind, Koordinationskomplexe mit Metallen einzugehen.
Die verwendeten Chelatbildner sind für Säugetiere nichttoxisch und umfassen Aminopolycarbonsäuren und deren Salze, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder deren Salze (insbesondere deren Di- oder Trinatriumsalze), sowie Hydroxycarbonsäuren und deren Salze, wie Zitronensäure.
Mischungen des von Streptococcus stammenden Bakteriocins Nisin mit einem oder mehreren Chelatbildnern können erfindungsgemäß vorteilhafterweise ver wendet werden. Solche Mischungen können fest-in-flüssig-Suspensionen oder Lösungen sein. Wenn nicht anders bezeichnet, bedeutet die Verwendung des Begriffs "Lösung" nicht nur Feststoffe oder Flüssigkeiten, die in einer Flüssigkeit gelöst sind, sondern auch fest-in-flüssig-Suspensionen oder -Mischungen. Geeignete Lösemittel, Verdünnungsmittel oder Träger für die Mischung des Chelatbildner und des Bakteriocins sind Wasser, Alkohole, Propylenglykol, Öle, wie Mineralöl, tierisches oder pflanzliches Öl, Glycerin oder Lecithin.
Obwohl die kommerziell erhältlichen Bakteriocine Molkereiprodukte enthalten können, kann es für die bakteriziden Kompositionen oder Zubereitungen für die Lebensmittelkonservierung vorteilhaft sein, keine zusätzlichen Molkereiprodukte wie Käse, Molke, Quark oder calciumhaltige feste Milchprodukte zu enthalten. Es ist berichtet worden, daß Calcium- und Magnesiumionen Nisin inaktivieren können. Es könnte sein, ohne daß dies bindend sein soll, daß Mittel, die Calcium und/oder Magnesium als Chelat binden, besonders vorteilhaft sein können. Mischungen, die eine Mischung von Bakteriocin und einem Chelatbildner enthalten, werden auf Lebensmittel einschließlich Molkereiprodukte und Nichtmolkereiprodukte wie Wurstwaren, andere Fleischwaren, Gemüse und Früchte durch Aufsprühen aufgebracht. Solche Lösungen können in einem weiten pH-Bereich formuliert werden. Saure Lösungen werden zur Verbesserung oder Aufrechterhaltung der bakteriellen Wirkung eingesetzt. Lösungen, die einen pH-Wert von etwa 6 oder weniger haben, sind bevorzugt, und solche mit einem pH-Wert von etwa 5 oder weniger sind besonders bevorzugt. Die Mengen des Bakteriocins und der chelatbildenden Komponente können unterschiedlich sein, abhängig von Faktoren, wie Art des Bakteriocins, Art des Komplexbildners, pH-Wert; anderen Bestandteilen (z. B. Art des Lösungsmittels), Anwendung, d. h. Art des Lebensmittels, auf das die Materialien angewendet werden sollen, wie sie angewendet werden (z. B. Oberflächenbehandlung, spätere Verarbeitungsbedingungen (z. B. Wärmebehandlung), gewünschte Zeitdauer der Wirksamkeit, Bakterien abzutöten oder zu hemmen und Art der Bakterien, gegen die das Lebensmittel geschützt werden soll. Jemand mit üblicher Erfahrung auf dem Fachgebiet kann geeignete Mengen des Bakteriocins und des Komplexbildners ohne unangemessenes Herumprobieren bestimmen. Wasser ist das bevorzugte Lösungsmittel, um eine Lösung herzustellen. Geeignete Mengen von Bakteriocin in einer Mischung zur Behandlung von Lebensmitteln, wie Wurstwaren, umfassen 5 bis 250 ppm Bakteriocin (Gewicht, bezogen auf die gesamte Mischung) oder mehr. Mengen von weniger als 5 ppm sind ausführbar, können jedoch je nach Anwendung weniger wirksam sein als eine höhere Konzentration. Mengen von mehr als 250 ppm sind ebenfalls ausführbar, aber steigende Konzentrationen haben den Nachteil steigender Kosten, wegen der Ausgaben für das Bakteriocin. Konzentrationen zwischen 50 und 150 ppm wurden als wirksam und kostengünstig ermittelt, mit Konzentrationen von 150 ppm oder mehr, die besonders wirksam sind, um pathogene Bakterien, wie Listeria monocytogenes, abzutöten oder zu inhibieren, z. B. auf der Oberfläche gekochter "Frankfurter Würstchen". Die Lösung kann gegen andere Bakterien eingesetzt werden und ist speziell wirksam gegen grampositive Bakterien. Die Mengen an angewendetem Komplexbildner können in weitem Bereich schwanken, z. B. können Mengen zwischen 0,2 und 0,8 oder 3 oder mehr vorteilhaft angewandt werden. Die Zusammensetzung kann andere antimikrobielle oder antibakterielle Mittel oder andere Zusätze, wie Farbstoffe und Aromastoffe, z. B. gasförmigen oder Flüssigrauch, enthalten.
Nisin ist gegen Abbau oder Inaktivierung durch Wärmebehandlung, wie Kochen oder Pasteurisiertemperaturen und -zeiten, widerstandsfähig. Dies ist notwendig, um die Wärmebehandlung des Lebensmittels innerhalb einer Verpackungsfolie zu überstehen und nach der Wärmebehandlung und der Entfernung der Folie wirksam zu sein.
"Wärmeresistent", wie dieser Begriff hier verwendet wird, bedeutet, daß das antimikrobielle Mittel dem Abbau, der Inaktivierung oder Verlusten durch eine Wärmebehandlung, d. h. durch Pasteurisieren oder Kochen widersteht, so daß nach der Wärmebehandlung genügend von dem Mittel übrigbleibt, das wirksam ist, um Mikroorganismen auf Lebensmitteln, auf die es aufgebracht worden ist, zu töten oder deren Wachstum zu hemmen oder zu verhindern. Es soll so verstanden sein, daß teilweise Verluste bei der Menge des Mittels vorkommen können und daß auch eine teilweise Inaktivierung vorkommen kann. Es ist jedoch ausreichend, daß das verbleibende aktive Mittel in der Lage ist, die Lebensmitteloberfläche gegen pathogene Organismen, wie Listeria, zu schützen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die antimikrobielle Zusammensetzung direkt auf ein Lebensmittel durch Aufsprühen aufgebracht.
Daher sollte das übertragene oder angewandte Mittel in einer ausreichenden Menge vorhanden sein, und nach der Wärmebehandlung, der Verarbeitung und der Entfernung der Wursthülle genügend wirksam bleiben, um Mikroorganismen, insbesondere Listeria monocytogenes für eine genügend lange Zeitdauer abzutöten oder deren Wachstum zu hemmen oder zu verhindern. Vorteilhafterweise soll das Mittel bis zum herkömmlichen "Verkauf bis..."-Datum oder "Verfallsdatum", bis zu dem das Produkt vom Einzelhandel zum Verkauf angeboten wird, wirksam bleiben. Vorzugsweise soll sich die Wirksamkeitsdauer auf die Zeit nach dem Öffnen der Packung erstrecken, bis zum Ende der normalen Frischeperiode, wenn der Verderb des Lebensmittels offensichtlich wird. Für hautlose "Wiener" sind typische Zeiten: Etwa zehn Minuten bis zu einer Stunde zwischen dem Abziehen der Haut und dem Abpacken für den Verbraucher, etwa dreißig bis sechzig Tage seit dem Abpacken bis zum Verkauf im Einzelhandel; und ungefähr sieben Tage oder mehr nach dem Öffnen der Packung durch den Verbraucher, bei normaler Kühlschranklagerung und Verbrauch. Auf jeden Fall können die erwünschten Zeiten und die normale Aufbrauchdauer von Lebensmittel zu Lebensmittel schwanken und der Fachmann wird erkennen, daß die Zeiten in der Abpackung und die Aufbrauchdauern von der Art des Lebensmittels (z. B. Rindfleisch-Wiener, Geflügel oder Käse) und der Größe des Lebensmittels bzw. des Lebensmittelstücks, der Anzahl der Stücke je Packung (Einzel- oder Großverbraucher), Lagertemperaturen, Verarbeitungsbedingungen und Abpackeinrichtungen abhängen.
Das vorstehende Beispiel ist beispielhaft und sollte nicht derart verstanden werden, die Erfindung als auf "Wiener" beschränkt anzusehen. Die Erfindung ist auf jede Art von Lebensmittel anwendbar, insbesondere solche, die von der Aufbringung einer bestimmten Menge eines antimikrobiellen, insbesondere antibakteriellen Mittels auf die Lebensmitteloberfläche Vorteile haben. Es wird in Betracht gezogen, daß das erfindungsgemäße Verfahren anwendbar ist auf sowohl pflanzliche wie tierische Nahrungsmittel einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Wurstwaren aller Art (wie von Rind, Schwein, Huhn, Pute, Fisch), Erst- oder Folgeteilstücke von Fleisch, Frühstücksfleisch, Schinken, Lamm, Steak, Hamburger und Geflügel einschließlich Hähnchen, Puten, Enten, Gänse ebenso wie Fisch und Molkereiprodukte, wie Halbweich- oder Hartkäse, Käsewaren und Gemüsewaren, wie Salat, Tofu, Krautsalat, Proteinersatzstoffe für Fleisch auf Sojabasis etc.
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet das antimikrobielle, d. h. antibakterielle, hitzebeständige Mittel Nisin. Nisin ist ein wie zuvor beschriebenes Polypeptidbakteriocin.
Die Erfindung wird nun noch besser verstanden werden, wenn auf die folgenden Beispiele Bezug genommen wird, die jedoch hauptsächlich der Erläuterung der Erfindung dienen und nicht dazu bestimmt sind, diese in irgendeiner Weise zu begrenzen. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich alle Teile und Prozentangaben auf das Gewicht. Auszählungen auf den bakteriellen Kulturplatten sind, wenn nicht anders angegeben, ein arithmetisches Mittel aus jeweils drei Platten. Abgeschätzte Auszählungen wurden mit allgemein anerkannten Verfahren der Mikrobiologie vorgenommen.
Beispiele 1 bis 28:
Die Wirksamkeit verschiedener Testlösungen und Konzentrationen des antimikrobiellen Mittels Nisin (erfindungsgemäß) und Pediocin (Vergleichsbeispiele) wurde mittels einer Flüssigtestmethode gegenüber dem Wachstum pathogener Bakterien, wie den grampositiven Bakterien Listeria monocytogenes, untersucht. Die Vermehrung rein aerober Bakterien wurde ebenfalls gemessen und die Wirksamkeit ähnlich untersucht. Die Verwendung der Chelatbildner Ethylendiamintetraessigsäure (Dinatriumsalz), Zitronensäure und Cyclodextrin wurde ebenfalls allein und mit verschiedenen Konzentrationen von Pediocin untersucht.
Diese Beispiele wurden mit den in der Mikrobiologie fachbekannten Steriltechniken durchgeführt. Doppelt konzentrierte sterilisierte Nährbouillon der Marke DIFCO wurde mit wenigstens 10.000 koloniebildenden Einheiten (cfu, colony forming units) je ml einer Mischung zweier pathogener Stämme aus Lebensmitteln isolierter Listeria monocytogenes vom Serotyp 4b angeimpft. Der angeimpfte Bouillon wurde dann Teströhrchen zugesetzt, die doppelt konzentrierte antimikrobielle Testlösungen enthielten, wobei jeweils gleiche Mengen angeimpfter Bouillon und Testlösung verwendet wurden. Die Röhrchen wurden dann mit Stopfen verschlossen und der Inhalt durchgemischt. Tabellen 1a und 1b führen die Bestandteile der Testlösungen und deren Mengen auf. Während des Tests wurde der pH-Wert an ähnlich gemischten Lösungen angeimpfter Bouillon und Testlösungen gemessen und die pH-Werte ebenfalls in den Tabellen 1a und 1b wiedergegeben. Die Menge der Bestandteile der Testlösungen wurde auf der Basis einer "doppelt konzentrierten" Lösung berechnet, die dann mit dem gleichen Volumen angeimpftem Bouillon, wie vorstehend beschrieben, verdünnt wurde. Die in den Tabellen 1a und 1b aufgeführten Mengen wurden unter der Annahme gleicher Volumina von angeimpftem Bouillon und Testlösung berechnet. Die gemischten angeimpften Testlösungen wurden jeweils als Dreifachproben ohne Bewegung bei etwa 30 °C inkubiert. Für jede Probe wurde ein Aliquot von 0,3 ml mittels einer Pipette steril entnommen und zwar unmittelbar nach der Mischung (null (0) Stunden) und dann nach 4, 8, 24 und 48 Stunden. Unmittelbar nach der Entnahme wurden diese Aliquots auf LPM- und Soyabouillon-Agarplatten jeweils nach den in der Mikrobiologie fachüblichen Standardmethoden der Plattenauszählung ausgezählt, um die Zählraten ("counts") von Listeria und der rein aeroben Bakterien zu bestimmen. Die selektive Auszählung von Listeria wurde unter Verwendung des für das vorläufige Laborerkennungsprogramm (For Use in Interim Laboratory Recognition Program) bestimmten, als "FSIS Method for the Isolation and Identification of Listeria Monocytogenes From Processed Meat and Poultry Products" bezeichneten Verfahren des U.S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service (FSIS), Microbiology Division, vorgenommen, wie sie in der vorstehenden Veröffentlichung von A.B. Moran vom 4. November 1988 und von R. W. Johnston (FSIS) vom 8. November 1988 beschrieben ist, die von FSIS erhältlich ist und die vollinhaltlich unter Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird. Die Ergebnisse der Bakterienauszählung für jede nach Zusammensetzung und Konzentration besondere Testlösung sind in den Tabellen 1a und 1b als arithmetische Mittel der Bakterien-Zählraten ("counts") koloniebildender Einheiten (cfu) pro ml für jeweils drei Abdruckplatten wiedergegeben.
Beispiele 1 und 2 sind Kontrollsbeispiele (nicht erfindungsgemäß). In den Beispielen 1 und 2 waren die Testlösungen entionisiertes Wasser, das mit dem Bouillon, wie oben beschrieben, gemischt wurde (außer, daß Beispiel 1 nicht angeimpft war) und als Blindprobe liefen. Beispiel 2 war angeimpft und lief als Blindprobe. Die Testergebnisse zeigen, daß bei der nicht angeimpften Blindprobe während einer Testdauer von 48 Stunden keine signifikanten Werte für Listeria auftraten und daß keine Vermehrung der rein aeroben Bakterien auftrat bis zum 8-Stunden-Test, von dem ab die Vermehrung bis zur 24- und 48-Stunden-Probe rasch fortschritt. Die angeimpfte Blindprobe mit entionisiertem Wasser (Beispiel 2) zeigte eine Verzögerungsphase ab der anfänglichen Zählrate von etwa 31.000 cfu pro ml bis zur 4-Stunden-Probe (37.000 cfu pro ml), gefolgt von einer explosionsartigen Vermehrung bis 8 Stunden (10.000.000 cfu pro ml) und 24 Stunden (300.000.000 cfu pro ml), gefolgt von einer Absterbephase bis 48 Stunden (7.700.000 cfu pro ml). Diese Absterbephase nach der explosionsartigen Vermehrung wird Faktoren zugeschrieben, die mit der unmittelbar vorhergehenden starken Vermehrung zusammenhängen, wie Erschöpfung der Nährstoffe oder Produktion hemmender Stoffwechselprodukte durch die Testbakterien (Listeria). Vergleichbar zeigen auch die Auszählungen der rein aeroben Bakterien eine Periode langsamer Vermehrung, gefolgt von explosiver Vermehrung und dann ein "Absterben". Bei der Auszählung der rein aeroben Bakterien für die Beispiele 1 – 28 gab es Hinweise auf sporenbildende Bazillen in vielen Beispielen. Typischerweise bilden diese Organismen die Differenz zwischen den rein aeroben Bakterien und den Zählraten von Listeria-Bakterien.
Zwei verschiedene Chelatbildner, nämlich (1) das Dinatriumsalz von EDTA (Na₂EDTA), and (2) Zitronensäure wurden auf ihre antibakterielle Aktivität getestet, indem jeweils 0,8 Gew.-% in entionisiertem Wasser aufgelöst und damit wie vorstehend beschrieben angeimpft wurde. Beispiel 3 (Na₂EDTA) erwies sich als hemmend für die Vermehrung von Listeria-Organismen mit einer Maximalzahl von Organismen nach 24 Stunden, gefolgt von einer Absterbephase bis 48 Stunden. Beispiel 4 (Zitronensäure) war ebenfalls wirksam für die Abtötung und Hemmung von Listeria, obwohl die Menge an Mikroorganismen über den 48-Stunden-Zeitraum schwankte, mit einer mittleren Zählrate von 35.000 cfu pro ml, die nach 8 Stunden gemessen wurde. Für die rein aeroben Bakterien war Na₂EDTA hemmend mit einer wiedergegebenen mittleren Höchstrate von 88.000 cfu pro ml nach 8 Stunden verglichen mit 560 Millionen cfu pro ml für die angeimpfte Kontrollprobe (Beispiel 2). Zitronensäure war sehr wirksam; sie bewirkte eine dauerhafte Verringerung der rein aeroben Bakterien über die gesamte Versuchsdauer hinweg beginnend mit einer anfänglichen Zählrate von 6.500 cfu pro ml zu einer niedrigen Rate von 640 cfu pro ml nach 48 Stunden. Die Wirksamkeit von Zitronensäure kann wenigstens teilweise einem pH-Effekt zugeschrieben werden, wonach niedrige pH-Werte das Bakterienwachstum begrenzen, wie bereits bekannt.
In den Beispielen 5 – 16 enthalten die Testlösungen verschiedene Konzentrationen an Nisin allein und zusammen mit Zitronensäure und Na₂EDTA. Die mittlere Listeria-Plattenzählrate für all diese Beispiele war weniger als 10 cfu pro ml für alle Testperioden einschließlich des unmittelbar durchgeführten 0-Stunden-Tests gefolgt von der Animpfung. Beispiel 2 (die angeimpfte Kontrollprobe) sowie die Beispiele 3 und 4 (die lediglich Chelatbildner enthalten) waren alle bestimmt, mittlere Listeria-Zählraten von mindestens 10.000 cfu pro ml bei unmittelbar folgender Animpfung (0 Stunden) zu haben. Daher scheint es so, daß alle entsprechend angeimpften Proben, die Nisin enthalten, sich unter diesen Testbedingungen so verhielten, daß sie im wesentlichen die gesamte Listeria nach dem Vermischen abtöten. Daß kein Listeriawachstum nach dem anfänglichen Testzeitraum zu erkennen war, könnte entweder auf eine Ausrottung von Anfang an oder eine bedeutende Reduzierung an Listeria gefolgt von einer sehr wirkungsvollen Hemmung hindeuten.
Die Ergebnisse für die Plattenzählrate rein aerober Bakterien der Beispiele 5 – 16 zeigen die Wirkung der Nisinkonzentration in der Abwesenheit und Gegenwart eines Chelatbildners auf das Gesamtwachstum der Bakterien.
Die Beispiele 5 – 8 waren Testlösungen mit unterschiedlichen Nisinkonzentrationen (in Form von Nisaplin-Marken-Nisin-Zubereitung, erhältlich von Aplin & Barrett Ltd.) in entionisiertem Wasser. Die Beispiele 5 – 8 zeigen alle eine Abtötung der angeimpften Bakterien von Beginn an bis zu einer Höhe von weniger als 10 cfu für jede Nisinkonzentration. Die Zählraten rein aerober Bakterien, erhalten durch Aufbringen der angeimpften Testlösungen auf nicht-selektives trytisches Soja-Agar, sollten ein Gemisch aus der absichtlich hinzugefügten Listeria und unbeabsichtigter Verunreinigung durch andere Mikroorganismen sein. Im Vergleich zeigen die Beispiele 2 – 4 alle anfängliche Zählraten von 5.900–9.100 cfu pro ml, wohingegen die nichtangeimpfte Kontrollprobe (Beispiel 1) eine anfängliche Zählrate von weniger als 10 cfu pro ml hatte.
Der Vergleich von Beispiel 5, das 1 ppm Nisin enthält, mit der nichtangeimpften Kontrollprobe (Beispiel 2) zeigt, daß Nisin wirksam ist, besonders anfänglich, um aerobe Bakterien abzutöten und zumindest anfänglich das Wachstum aerober Bakterien zu steuern. Jedoch wuchs bei dem 24-Stunden-Testzeitraum die mittlere 8-Stunden-Zählrate von 130 cfu pro ml in Beispiel 5 explosionsartig auf 9.100.000 cfu pro ml. Dieses Wachstum ist geringer als das der angeimpften Kontrollprobe (Beispiel 2) und ungefähr dasselbe wie das der nichtangeimpften Kontrollprobe (Beispiel 1) nach 24 Stunden. Das schnelle Wachstum der rein aeroben Bakterien setzte sich in Beispiel 5 fort und resultierte in einer mittleren Plattenzählrate von 45.000.000 cfu pro ml nach 48 Stunden. Der Vergleich von Beispiel 5 mit den Beispielen 6 – 8 zeigt, daß das Erhöhen der Nisinkonzentration zu einer Verzögerung des Beginns der explosionsartigen Wachstumsphase für die rein aeroben Bakterien und zu einer Verringerung der mittleren Zahl rein aerober Bakterien für jeden Zeitraum relativ zu den anderen Testlösungen mit weniger Nisin führt.
Die Beispiele 9 – 12 entsprechen in der Nisinkonzentration den Beispielen 5 – 8, aber enthalten auch 0,8 Gew.-% eines Chelatbildners, dem Dinatriumsalz von EDTA (im folgenden Na₂EDTA). Die Ergebnisse für die mittleren Plattenzählraten rein aerober Bakterien sind, ausgenommen die 110 cfu pro ml nach 48 Stunden in Beispiel 9, alle kleiner als 10 cfu pro ml. Folglich zeigt ein Vergleich beispielsweise der mittleren 24-Stunden-Bakterienzählrate von Beispiel 3 (0,8 Gew.-% Na₂EDTA), Beispiel 5 (1 ppm Nisin) und Beispiel 9 (die Kombination von 1 ppm Nisin und 0,8 Gew.-% Na₂EDTA) mittlere Zählraten rein aerober Bakterien von 88.000 cfu pro ml, 9.100.000 cfu pro ml bzw. <10 cfu pro ml. Die überraschende Verringerung der Bakterien auf weniger als 10 cfu pro ml für die Kombination von Nisin und Chelatbildner ist unerwartet. Nisin und Chelatbildner wie Na₂EDTA scheinen synergistisch zu wirken, um die mittlere Anzahl der rein aeroben Bakterien zu verringern, wie durch den Vergleich der 24-Stunden- und 48-Stunden-Daten der Beispiele 3 und 5 – 12 gezeigt wird. In den Beispielen 13–16 wurde ein zweiter Chelatbildner in Kombination mit Nisin ausprobiert. Diese Beispiele waren ähnlich zu den Beispielen 5 – 8, aber jedes enthielt auch 0,8 Gewichtsprozent Zitronensäure. Außer einer anfänglichen mittleren Zählrate von 30 cfu pro ml in Beispiel 16 hatten alle dieser Testlösungen, welche die Kombination von Zitronensäure und Nisin enthielten, mittlere aerobe Plattenzählraten von weniger als 10 cfu pro ml. Die vorangehenden Testergebnisse zeigen die antibakterielle Aktivität der einzelnen Chelatbildner und Nisin sowie die überraschende und unerwartete gute Aktivität der Kombination von Nisin und Chelatbildner gegen die rein aerobe Bakterienzahl. Dies deutet darauf hin, daß die Kombination von Nisin mit einem Chelatbildner wie Na₂EDTA oder Zitronensäure einen unerwarteten Erfolg beim Abtöten und Hemmen der Bakterien zur Folge hat und aus diesem Grund in Lebensmitteln vorgesehen werden kann, um die Haltbarkeit deutlich zu verbessern.
In den Beispielen 17 – 28 (Vergleichsbeispiele) enthalten die Testlösungen verschiedene Konzentrationen von Pediocin und gegebenenfalls die Chelatbildner Na₂EDTA und Zitronensäure. Pediocin wurde als Zubereitung bzw. Präparation hinzugegeben, welche in entrahmter Milch gemäß Verfahren hergestellt wurde, die im Bereich der Herstellung von Pediocin durch Kultivierung von Pediococcus acidilacti in entrahmter Milch allgemein bekannt sind.
In bezug auf die mittleren Plattenauszählungen von Listeria in Tabelle 1a wird deutlich, daß Pediocin als solches bzw. allein Listeria abtötet und deren Wachstum inhibiert, dieses jedoch nicht so effizient wie Nisin bei einer gleichen Gewichtsbasis. Die Ergebnisse zeigen, daß eine Erhöhung der Konzentration von Pediocin über 1 ppm im allgemeinen die Listerienanzahl in anfänglichen Auszählungen reduziert. Pediocingehalte in einer Höhe von 10 ppm oder weniger inhibierten das Wachstum von Listeria im Vergleich zu der angeimpften Kontrolle (Beispiel 2), aber Listeria setzte das Wachstum fort, wogegen Pediocin in einer Höhe von 50 ppm oder höher nicht nur die anfänglich ermittelten Bakterienauszählungen reduzierte, sondern auch die Zunahme der Listerienanzahl in jeder Aufzeichnungsphase verhinderte, d. h. die höchste mittlere Listeria-Zählung während der Testperiode von 48 Stunden betrug 740 cfu pro ml. In den Beispielen 21 bis 24 waren die Testlösungen vergleichbar zu denen von Beispielen 17 – 20, außer daß 0,8 Gew.-%. des Chelatbildners Na₂EDTA in den verschiedenen Pediocinkonzentrationen zugegen war. Wie ein Vergleich der Beispiele 21 – 24 zu Beispiel 3 und Beispielen 17 – 20 verdeutlicht, zeigt die Kombination von Pediocin und Na₂EDTA eine unerwartete Wirksamkeit in bezug auf das Abtöten von Listeria und die Inhibierung des Wachstums von Listeria innerhalb der Testperiode von 48 Stunden, insbesondere für geringe Mengen an Pediocin (10 ppm und weniger). In den Beispielen 25 – 28 wurden diese Testlösungen mit einem anderen Chelatbildner, Zitronensäure, anstelle von Na₂EDTA in den Beispielen 21 – 24 versetzt. Die mittlere Listeria-Plattenauszählung für die Pediocin und Zitronensäure enthaltenden Lösungen sind überraschenderweise gering und weisen auf eine synergistische Wirksamkeit in bezug auf das Abtöten und die Inhibierung von Bakterien der Gattung Listeria. Ein Vergleich der mittleren Plattenauszählungen bei 24 Stunden erfolgt beispielhaft: Für 0,8 Gew.-%. Zitronensäure allein – 70.000 cfu pro ml (Beispiel 4); für 1 ppm Pediocin – 170.000.000 cfu pro ml (Beispiel 17); und für die Kombination von 0,8 Gew.-%. Zitronensäure und 1 ppm Pediocin – 10 cfu pro ml (Beispiel 25). Das Ergebnis von 10 cfu pro ml in Beispiel 25 ist bemerkenswert gering. Die logarithmische Reduzierung, welche durch die Kombination von Pediocin und dem Chelatbildner im Vergleich zu den jeweiligen Komponenten allein erreicht werden kann, ist signifikant und unerwartet. In bezug auf die mittlere Auszählung der gesamten aeroben Bakterien scheint Pediocin das Wachstum zu verzögern und zu reduzieren, wobei höhere Konzentrationen von Pediocin wirksamer sind, insbesondere bei den Testperioden von 24 und 48 Stunden. Die Verwendung von Pediocin und den Chelatbildnern Na₂EDTA und Zitronensäure waren auch wirksam in bezug auf die Inhibierung des Wachstums der gesamten aeroben Bakterien.
Die vorangehenden Beispiele 1 – 28 zeigen die Wirksamkeit von unterschiedlichen antimikrobiellen Mitteln gegen pathogene und aerobe Bakterien. Unerwarteterweise zeigte sich die Kombination Nisin und Chelatbildner wie Na₂EDTA oder Zitronensäure als überraschend wirksam gegen die rein aeroben Bakterien im Vergleich zur Verwendung jedes Bestandteils für sich. Darüber hinaus zeigte sich auch unerwarteterweise eine überraschende Wirksamkeit der Kombination von Pediocin und einem Chelatbildner, wie Na₂EDTA oder Zitronensäure, im Vergleich zu den einzelnen Bestandteilen gegenüber pathogenen Bakterien der Gattung Listeria.
Beispiele 29 bis 43:
Verschiedene antimikrobielle Mittel, die in Lebensmitteln, wie Wiener Würstchen, enthalten sind, wurden auf ihre Wirksamkeit gegen späteres Verderben getestet. Frisch behandelte, hautlose (Hülle entfernt), pasteurisierte Frankfurter haben typischerweise Oberflächenbakterien von weniger als 1.000 cfu pro Frankfurter, wenn sie unmittelbar danach mit Hilfe gängiger technischer Verarbeitungsverfahren vakuumverpackt werden. Wenn die Bakterien-Zählraten 10⁷ bis 10⁸ oder eine höhere Größenordnung erreichen, dann ist der Verderb typischerweise deutlich sichtbar. Übliche Fäulnis-. oder Verderbnisbakterien in vakuumverpacktem, gekühltem, behandeltem Fleisch enthalten einen Lactobazillus. Besonders die Wirksamkeit von verschiedenen Lösungen beim Schützen von darin eingetauchten Lebensmitteln gegen das Wachstum von pathogenen Bakterien wie Listeria monocytogenes wurde getestet.
Frankfurter, die durch eine typische Fleischemulsion und Herstellung gebildet waren, wurden verwendet. Die Frankfurter wurden hergestellt durch Stopfen einer Rind-/Schweinefleischemulsion in E-Z Peel NOJAX^® Markenzellulosehüllen (im Handel erhältlich von Viskase Corporation, Chicago, Illinois) und Kochen (etwa 1 Stunde) in einer gasgefeuerten, feuchtigkeitskontrollierten Räucherkammer bei einer relativen Feuchtigkeit von etwa 20 %, bis die Frankfurter eine Innentemperatur von mindestens 160 °F (71 °C) unter Bedingungen ohne zugegebenen Rauch erreicht hatten. Die Hülle wurde dann von einer üblichen Abziehmaschine abgezogen und entsorgt. Die enthäuteten Frankfurter wurden in einem Polyethylenbeutel bei etwa 4 °C kurz gelagert, bis das mikrobiologische Testen begann. Die Fleischemulsion wurde mit den in Tabelle A aufgeführten Bestandteilen durch Zerhacken und Vermischen für 5 Minuten in einem üblichen Schüsselzerhacker ("bowl chopper") und dann durch Zerkleinern in einer üblichen Emulsionsmühle zum Erreichen einer einheitlichen Fleischemulsion hergestellt. Eine chemische Analyse der pasteurisierten Frankfurter ergab 56,9 % Feuchtigkeit, 27,2 % Fett, 12,2 % Protein, 2,5 % Asche, 1,90 % Salz, 65 ppm Natriumnitrit und einen pH-Wert an der Oberfläche der Frankfurter von 6,40.
Tabelle A: Rind/Schwein-Emulsion
Die gekühlten Frankfurter, die bei 40 °F (4 °C) gelagert wurden, wurden mit Testlösungen oberflächenbeschichtet durch Eintauchen einzelner Frankfurter in eine Testflüssigkeit für etwa 30 Sekunden mit so wenig Materialbewegung wie möglich, gefolgt von einem Zeitraum von etwa 30 Sekunden, während dem jedes Frankfurter zum Abtropfen senkrecht gehalten wurde. Die beschichteten Frankfurter wurden anschließend angeimpft (mit Ausnahme einer nichtangeimpften Kontrollprobe) mit einem Gemisch aus drei Arten von pathogenen Listeria monocytogenes (die aus Arten gezüchtet wurden, die entweder von einem Fleischprodukt oder aus einer Fleischfabrik isoliert wurden) in einer Höhe von annähernd 10.000 bis 30.000 koloniebildenden Einheiten (cfu) pro Frankfurter. Unmittelbar nach der Animpfung wurden die Frankfurter eines jeden Beispiels getestet durch Waschen mit einem sterilen Puffer, der anschließend mit dem zuvor beschriebenen Verfahren mit nichtselektivem Tryptonglukosehefen(TGY)-Agar und Listeria-selektivem LPM-Agar beschichtet und in den Brutschrank gelegt wurde, um die Gegenwart rein aerober Bakterien und Listeria zu bestimmen.
Nach der Animpfung wurden die Frankfurter einzeln in im Handel erhältliche PERFLEX^® 51B-Isolierbeutel (hergestellt von Viskase Corporation, Chicago, Illinois) verpackt. Diese Beutel wurden unter Hochvakuum evakuiert und heiß versiegelt mit einer üblichen Vakuumpumpe/Versiegelungsgerät, um gegenüber der Umgebung eine Sauerstoff- und Feuchtigkeitssperre zu schaffen. Die Testproben wurden bei Umgebungstemperatur (etwa 25 °C) für 2 Tage gelagert und anschließend auf reine Bakterien- und Listeria-Zählraten getestet, wie dies für die Proben nach dem Animpfung zuvor beschrieben wurde. Die Testlösungen und Bakterien-Zählraten sind in Tabelle 2 aufgeführt.
In den Beispielen 29 – 43 wurden die antimikrobiellen Mittel in entionisiertem Wasser gelöst oder suspendiert. Die Testlösungen, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, sind alle auf Wasserbasis.
Beispiel 29 unterscheidet sich von den anderen Beispielen darin, daß seine Frankfurter nur in eine entionisierte Wasserprobe getaucht wurden und später nicht mit Listeria-Organismen angeimpft wurden. Beispiel 29 wurde als eine nichtangeimpfte Kontrollprobe (nicht erfindungsgemäß) durchgeführt, um das Wachstum zu untersuchen von irgendwelchen, z. B. auf den Frankfurtern schon vorhandenen oder durch unbeabsichtigte Verunreinigung eingeführten Grundorganismen. Die Ergebnisse von Beispiel 29 zeigen, daß keine nennenswerte Anzahl an Listeria während des zweitägigen Testzeitraums nachgewiesen wurde, während die mittlere Plattenzählrate für rein aerobe Bakterien von 2.600 auf geschätzte 590.000 cfu pro Frankfurter anstieg.
Beispiel 30 wurde als angeimpfte Kontrollprobe (nicht erfindungsgemäß) mit entionisiertem Wasser als Testlösung durchgeführt. Dieses Beispiel war identisch mit Beispiel 29, mit der Ausnahme, daß die eingetauchten Frankfurter mit Listeria-Organismen angeimpft wurden. Während des zweitägigen Testzeitraums war das Listeria-Wachstum explosionsartig und erreichte eine geschätzte mittlere Plattenzählrate von 38.000.000 cfu pro Frankfurter. Die Anzahl rein aerober Bakterien zeigte ein ähnlich explosives Wachstum.
In Beispiel 31 beeinflußte eine 3gew.-%ige Lösung aus dem Trinatriumsalz des EDTA das Listeria-Wachstum oder das rein aerobe Wachstum auf den Frankfurtern nicht nennenswert während des zweitägigen Testzeitraums.
In den Beispielen 32 – 35 wurden verschiedene Konzentrationen an Nisin allein und in Kombination mit dem Chelatbildner Na₃EDTA auf Frankfurtern getestet. In diesen Beispielen wurde Nisin als Zubereitung zugegeben, die durch Fermentation von Milch hergestellt wurde. Diese Nisinzubereitung ist im Handel erhältlich unter dem Markennamen "Nisaplin" von Aplin & Barrett in Trowbridge, England. In den Testlösungen war es notwendig, um z. B. 0,01 Gew.-%. Nisin zu erhalten, 0,4 Gew.-%. der Nisinzubereitung (Nisaplin) zuzugeben.
Obwohl alle Frankfurter der Beispiele 30 – 43, die mit der Testlösung überzogen waren, zu Beginn in einer Höhe von mindestens 10.000 cfu pro Frankfurter mit Listeria angeimpft schienen, waren die mittleren anfänglichen Plattenzählraten für Listeria für die Beispiele 32 – 35 alle kleiner als 10 cfu. Diese niedrigen anfänglichen Zählraten scheinen zu zeigen, daß eine wesentliche Anzahl von Listeria nach Kontakt mit dem Nisin-enthaltenden Überzug abgetötet wurden. Alle Nisin-enthaltenden Überzugslösungen waren wirksam bei der Verringerung des Listeria-Wachstums während des zweitägigen Zeitraums, wobei die Lösungen, die große Mengen an Nisin enthielten, noch wirksamer bei der Hemmung von Listeria waren. Beispiel 32, bei dem der Überzug der Frankfurter bei einer Testlösungsmenge von 100 ppm nur Nisin allein enthielt, zeigte sich als am wirkungsvollsten während des zweitägigen Zeitraums. Dies könnte aber entweder auf eine Ausrottung von Anfang an oder eine bedeutende Verringerung zurückzuführen sein, gefolgt von einer sehr wirksamen Hemmung. Die Testergebnisse für die rein aeroben Bakterien deuten darauf hin, daß 100 ppm Nisin und 3,0 Gew.-%. Na₃EDTA synergistisch dazu führen, daß das Wachstum rein aerober Bakterien auf beschichteten, gekochten oder pasteurisierten Fleischoberflächen gering gehalten wird, wie aus dem Vergleich von Beispiel 35 mit den Beispielen 31 und 32 ersichtlich ist.
In den Beispielen 36 – 39 wurde eine nicht im Handel erhältliche Nisinzubereitung verwendet. Diese Nisinzubereitung wurde hergestellt durch Züchten des Streptococcus lactis in Magermilch unter Anwendung bekannter Verfahren. In Beispiel 36 wurden Frankfurter getestet, die mit einer Nisinlösung von 52 ppm ohne den Chelatbildner Na₃EDTA überzogen waren. Der Vergleich der Ergebnisse für Beispiel 36 mit den Beispielen 31 und 39 zeigt, daß die Verwendung der Kombination von Nisin und dem Chelatbildner Na₃EDTA eine überraschende und unerwartete Verringerung der mittleren Plattenzählraten für Listeria und rein aerober Bakterien für den zweitägigen Testzeitraum zur Folge hatte.
Bei anderen Chelatbildnern wurde eine unerwartet gute hemmende und abtötende Wirkung gegenüber rein aerober Bakterien für die Kombination von Nisin und entweder Zitronensäure oder Cyclodextrin festgestellt. Die Nisin/Cyclodextrin- und Nisin/Zitronensäure-Kombination zeigte auch eine sehr gute Wirksamkeit gegen Listeria-Wachstum auf Lebensmitteloberflächen. Das in diesen Bei spielen verwendete Cyclodextrin war Beta-Cyclodextrin, welches im Handel erhältlich ist von American Maize-Products Company, Hammond, Indiana.
Die Beispiele 29 – 43 zeigen, daß einen bakterizide Zusammensetzung, die Nisin und einen Chelatbildner, wie Na₂EDTA, Zitronensäure oder Cyclodextrin, enthält, verwendet werden kann, um pathogene Bakterien abzutöten und zu hemmen und die Lebensmittelhaltbarkeit zu verlängern. Die Zusammensetzung, die eine Kombination von Nisin und Chelatbildner enthält, scheint als Konservierungsmittel für Lebensmittel geeignet zu sein. Hier wurde die Lösung auf die Oberfläche der Frankfurter durch Eintauchen aufgebracht, aber es wird angenommen, daß andere Verfahren des Aufbringens eingesetzt werden können, wie zuvor erwähnt, z. B. Sprühen, Vermischen, Zusammenbringen mit einer wieder abziehbaren, beschichteten Folie (Film), und daß die erfindungsgemäße Kombination nicht nur bei behandeltem Fleisch, sondern auch anderen Nahrungsmitteln einschließlich Früchten, Gemüsen, Getreideprodukten, Molkereiprodukten, Eiern sowie Fleisch, Geflügel und Fisch angewendet werden kann. Die Zusammensetzung scheint geeignet für frische, rohe, gekochte, pasteurisierte und sterilisierte Nahrungsmittel. Die synergistische Wirksamkeit beim Abtöten und Hemmen pathogener und Nahrungsmittelverderb hervorrufender Organismen wird dargestellt anhand der obigen Testergebnisse.
Beispiele 44 bis 55:
Verschiedene antimikrobielle Mittel wurden auf Frankfurter aufgebracht, indem jedes in Testlösungen auf Wasserbasis eingetaucht wurde, welche die Mittel enthielten. Die eingetauchten Frankfurter wurden mit Bakterien angeimpft und in Abhängigkeit von der Zeit auf Bakterienwachstum auf der Oberfläche getestet. Die Verfahren bei diesem Test waren im wesentlichen dieselben, wie die in den obigen Beispielen 29 – 43 angewendeten, mit Ausnahme des im folgenden Aufgeführten. Die hier verwendete Fleischemulsion war im wesentlichen dieselbe Rezeptur, die in den Beispielen 29 – 43 verwendet wurde, mit der Ausnahme, daß keine Dextrose in der Fleischemulsion der Beispiele 44 – 45 verwendet wurde. Die Koch/Verfahrensbedingungen bei den Frankfurtern waren dieselben, mit der Ausnahme, daß die relative Feuchtigkeit 25 % betrug und die Frankfurter solange gekocht wurden, bis sie eine Innentemperatur von 162 °F (72 °C) aufwiesen. Ei ne chemische Analyse der nur pasteurisierten Frankfurter ergab einen pH-Wert auf der Oberfläche von 6,36, 56,5 % Feuchtigkeit, 28,7 % Fett, 12,4 % Protein, 2,6 % Asche, 1,94 % Salz und 56 ppm Natriumnitrit. Obwohl kein Rauch zugeführt wurde, wurde eine Rauchanalyse durchgeführt, die 24,6 mg Säure, 0,3 mg Phenol und 7,1 mg Carbonylverbindungen jeweils pro 100 g gekochter Frankfurter ergab. Diese Mengen ergeben sich scheinbar aufgrund einer Restanreicherung von Rauchbestandteilen in der Räucherkammer.
Die Frankfurter wurden in den Testlösungen durch Eintauchen für dreißig Sekunden beschichtet, gefolgt von einer Trocknung für dreißig Sekunden. Die beschichteten Frankfurter wurden anschließend mit einem Gemisch aus drei Arten von pathogenen Listeria monocytogenes angeimpft durch pipettieren von 0,05 ml (etwa 100 Zellen) der Impfkultur auf jedes Frankfurter. Die Impfkultur wurde mit einem sterilen Baumwollpinsel verteilt. Die Frankfurter wurden anschließend in zwei Schichten von je vier in im Handel erhältliche PERFLEX^® 51 B-Isolierbeutel (hergestellt von Viskase Corporation in Chicago, Illinois) verpackt. Diese Beutel aus einer thermoplastischen Folie wurden unter hohem Vakuum evakuiert und heiß versiegelt mit einer üblichen Vakuumpumpe/Versiegelungsgerät, um gegenüber der Umgebung eine Sauerstoff- und Feuchtigkeitssperre zu schaffen. Getrennte Sätze von Packungen wurden für die mit jeder Testlösung beschichteten Frankfurter hergestellt. Jede versiegelte Packung mit acht Frankfurtern wurde bei etwa 40 °F (4,4 °C) gelagert. Die Packungen wurden in dreifacher Ausführung am Anfang (Tag 0) und nach 14, 28 und 42 Tagen der Lagerung analysiert. Zum Analysieren wurde ein Frankfurter aseptisch aus jeder Packung, die getestet wird, herausgenommen und in einen Beutel mit 10 ml eines Phosphatpuffers gelegt und anschließend geschüttelt, um die an der Oberfläche des Frankfurters anhaftenden Bakterienzellen abzuspülen. Serielle dezimale Verdünnungen wurden auf LPM-Agar und TGY-Agar wie bei den obigen Beispiele 29 – 43 aufgebracht. Das arithmetische Mittel der Plattenzählrate ergibt sich aus den drei getesteten, einander entsprechenden Packungen und ist in Tabelle 3 dargestellt.
Die Frankfurter der Beispiele 44 und 45 wurden beschichtet, indem jedes Frankfurter in eine Lösung von Butterfield gepuffertem Phosphatverdünner getaucht wurde, welche etwa 42,5 ppm Kaliumorthophosphat in entionisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 7,2 enthielt. Die Beispiele 44 und 45 unterscheiden sich dadurch, daß lediglich die Frankfurter von Beispiel 45 mit Listeria angeimpft wurden. Aus diesem Grund dient Beispiel 44 als nichtangeimpfte Kontrollprobe (nicht erfindungsgemäß) und Beispiel 45 dient als angeimpfte Kontrollprobe (nicht erfindungsgemäß) entsprechend den obigen Beispielen 29 und 30. Butterfields gepufferter Phosphatverdünner wurde verwendet, um irgendeine Zerstörung aufgrund osmotischer Kräfte irgendeines bereits gegenwärtigen oder zugegebenen Bakteriums zu minimieren. Die Ergebnisse zeigen keine nennenswerte Anzahl von Listeria während des 42tägigen Testzeitraums für die nichtangeimpfte Kontrollprobe, während die mittlere Plattenzählrate für rein aerobe Bakterien auf 3.200.000 cfu pro Frankfurter während der 42tägigen Untersuchung anstieg. Frankfurter der angeimpften Kontrollprobe (Beispiel 45) zeigten schnelles Listeria Wachstum von einer anfänglichen mittleren Plattenzählrate von 340 cfu pro Frankfurter bis auf ein Mittel von 1.400.000.000 cfu pro Frankfurter innerhalb 28 Tagen. Die bakterielle Plattenzählrate für die 42tägige Probe wurde aufgrund einer übermäßigen Anzahl an Bakterien nicht bestimmt, was durch optische Untersuchung der Packungen herausgefunden wurde, die eine Trübung der Flüssigkeit ergab, die in der mit einem Vakuum versehenen Packung enthalten war. Diese Trübung ist für den Fachmann in der Lebensmittelmikrobiologie bekannt als Zeichen für eine extrem hohe Anzahl an Bakterien. Die übermäßigen Bakterienzahlen nach 42 Tagen traten in allen Beispielen auf, mit Ausnahme der nichtangeimpften Kontrollprobe (Beispiel 44) und den Beispielen 54 und 55, die im folgenden noch diskutiert werden. Die Ergebnisse der rein aeroben mesophilen Plattenzählung zeigen, daß das Wachstum der rein aeroben Bakterien, darin eingeschlossen sowohl Listeria (ein fakultativ anaerobes Bakterium) als auch jedes zufällige Bakterium, von einem Mittel von 120 cfu pro Frankfurter bis auf ein Mittel von 1.900.000.000 cfu pro Frankfurter während der 28tägigen Untersuchung ansteigt.
In den Beispielen 46 – 53 wurden wasserbasierende Lösungen des Dinatriumsalzes von EDTA getestet. Na₂EDTA in Lösung wurde auf Frankfurtern allein und in Kombination mit Propylenglycol, Natriumbenzoat (Natriumbenzoesäureester), Kaliumsorbat, Lysozym und als Dreikomponentensystem mit Propylenglycol und Parabens getestet. Propylenglycol wurde ebenfalls allein und mit im Handel erhältlichem flüssigen Rauch getestet, der unter dem Markennamen Charsol^®, C-10 von Red Arrow Products Co. in Manitowoc, Wisconsin verkauft wird. Alle Frankfurter, die mit diesen Testlösungen beschichtet wurden, zeigten ein nichtakzeptables, hohes Bakterienwachstum am Ende des 42tägigen Testzeitraums. Dennoch waren die Beispiele 46, 49 – 52 von einigem Nutzen, weil das Wachstum der Bakterien gehemmt war, was die verringerten Zählraten aerober Bakterien während der 28tägigen Untersuchung im Vergleich zu der angeimpften Kontrollprobe zeigten, aber lediglich die Lysozym, Natriumbenzoesäure und Kaliumsorbat enthaltenden Lösungen der Beispiele 52, 50 und 51 zeigten irgendeine Wirkung durch Erzeugen logarithmischer Verringerungen in den mittleren Listeria-Zählraten innerhalb von 28 Tagen.
In den Beispielen 54 und 55 wurden wasserbasierende Lösungen mit 100 ppm und 250 ppm Nisin (das Nisin wurde in Form von Nisaplin zugegeben) in Kombination mit 0,8 Gewichtsprozent Na₂EDTA als antibakterielle Beschichtung für pasteurisierte Frankfurter getestet. Diese Beschichtungen waren wirksam gegen die Animpfung von Frankfurtern mit pathogener Listeria, indem die anfängliche mittlere Plattenzählrate auf weniger als 10 cfu pro Frankfurter verringert wurde und eine mittlere Plattenzählrate von 20 cfu oder weniger pro Frankfurter für den gesamten 42tägigen Testzeitraum beibehalten wurde. Die Verwendung von Listeria-selektivem LPM-Agar könnte, bedingt durch den selektiven Charakter des Agars, die Anzahl von ursprünglich vorhandenen Listeriaorganismen verringern. Aus diesem Grund wurde die Zählung der rein aeroben Bakterien unter Verwendung eines nicht-selektiven Standardverfahren-Agars wie TGY-Agar durchgeführt. Zählraten für rein aerobe Bakterien schließen nicht nur Listeriakolonien, sondern auch beliebige zufällige Kolonien anderer Bakterien ein, die in Konkurrenz mit oder zusätzlich zu Listeria wie Staphylococcus wachsen können. Die mittleren Plattenzählraten für rein aerobe Bakterien für die Beispiele 54 und 55 zeigen eine überraschende logarithmische Verringerung an Organismen im Vergleich zu der angeimpften Kontrollprobe von Beispiel 45. Die mittleren Plattenzählraten betrugen am Anfang und nach 14 Tagen nicht nur 10 oder weniger cfu pro Frankfurter, sondern die Zählungen nach den 28 Tagen waren < 10, < 10 und 3.900 cfu pro Frankfurter für Beispiel 54 und <10, 230 und 70.000 cfu pro Frankfurter für Beispiel 55 im Vergleich zu 80 Millionen, 440 Millionen und 5,2 Milliarden cfu pro Frankfurter für die drei angeimpften Kontrollplatten (Mittel – 1,9 Milliarden cfu). Nach 42 Tagen hatten die mit der 100 ppm-Lösung aus Nisin und Na₂EDTA beschichteten Frankfurter eine mittlere Plattenzählrate von weniger als 10 cfu pro Frankfurter, während die drei untersuchten Platten von den mit der 250 ppm-Lösung aus Nisin und Na₂EDTA beschichteten Frankfurtern aus Beispiel 55 mit <10; 270.000; und 1.300.000 cfu pro Frankfurter gezählt wurden. Folglich könnten die 42tägigen Zählraten rein aerober Bakterien für die angeimpften Frankfurter der Beispiele 54 und 55 vorzugsweise mit den drei Plattenzählraten von 130.000; 180.000 und 9.200.000 cfu pro Frankfurter (Mittel – 3.2 Millionen cfu) verglichen werden, die nach 42 Tagen für die nichtangeimpfte Kontrollprobe von Beispiel 44 untersucht wurde. Diese beachtlichen Ergebnisse zeigen weiterhin, daß Zusammensetzungen, die Nisin und einen Chelatbildner enthalten, zum Schutz gegen das Wachstum von pathogenen und Nahrungsmittel verderbenden Bakterien über lange Zeiträume bei verringerten Temperaturen verwendet werden können. Folglich kann die Nahrungsmittelkonservierung durch längere Konservierungszeiten gesteigert werden. Die Zusammensetzungen können zum Aufsprühen auf die Nahrungsmitteloberfläche verwendet werden.

Claims

Verfahren zur Erhöhung der Haltbarkeit verarbeiteter Nahrungsmittel durch Behandlung einer Nahrungsmitteloberfläche mit einer antibakteriellen Zusammensetzung mit gesteigerter antimikrobieller Wirkung, welche eine Kombination aus Nisin und einem Chelatbildner in einer ausreichenden Menge enthält, um pathogene Listeria monocytogenes bei Kontakt abzutöten oder deren Wachstum zu verhindern oder zu inhibieren und um nach Wärmebehandlung ausreichend wirksam zu bleiben, wobei die Nahrungsmittel gekochte und verarbeitete Nahrungsmittel umfassen, wobei das Verfahren ein Auftragen der Zusammensetzung auf die Nahrungsmitteloberfläche in einer Menge, welche ausreicht, pathogene Bakterien Listeria monocytogenes auf der Nahrungsmitteloberfläche abzutöten oder deren Wachstum zu verhindern oder zu inhibieren, umfaßt, wobei das Auftragen durch Aufsprühen der Zusammensetzung auf die Nahrungsmitteloberfläche durchgeführt wird, wobei die Zusammensetzung eine saure Lösung ist, welche das Nisin als gelösten Stoff oder Dispersion in Konzentrationen von 5 bis 250 Gew.-ppm, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung, enthält, und wobei der Chelatbildner EDTA, Zitronensäure oder ihre Salze umfaßt, wobei der Chelatbildner in der Lösung in Mengen von 0,2 bis 3,0 Gew.-% vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung außerdem Additive, wie Bindemittel, Puffer, Emulgatoren und/oder Übertragungsmittel, enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Nahrungsmittel Wurstwaren aller Art umfaßt.