ES2835727T3 - Modulación de la inmunidad tumoral - Google Patents

Abstract

Una combinacion de un antagonista de PD-1 que es un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo que se unen a PD-1 y un agonista de GITR que es un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo que se unen a GITR para usar en un metodo de tratamiento de un tumor en un paciente, en donde el antagonista de PD- 1 y el agonista de GITR se administran simultanea o secuencialmente

Description

DESCRIPCIÓN

Modulación de la inmunidad tumoral

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la modulación de la inmunidad tumoral en el tratamiento de tumores avanzados. En particular, la presente invención proporciona antagonistas de PD-1 en combinación con agonistas de GITR para potenciar respuestas antitumorales a tumores avanzados.

Antecedentes de la invención

El microambiente tumoral es un aspecto importante de la biología del cáncer que contribuye al inicio del tumor, la progresión del tumor y las respuestas a la terapia. Las células y moléculas del sistema inmunitario son un componente fundamental del microambiente tumoral. De manera importante, las estrategias terapéuticas pueden aprovechar el sistema inmunitario para dirigirse específicamente a células tumorales y esto es particularmente interesante debido a la posibilidad de inducir una memoria inmunitaria específica de tumor, que podría causar una regresión duradera y prevenir la recaída en pacientes con cáncer.

La composición y las características del microambiente tumoral varían ampliamente y son importantes para determinar la respuesta inmunitaria antitumoral. Por ejemplo, determinadas células del sistema inmunitario, incluyendo linfocitos citolíticos naturales, células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) y linfocitos T efectores, son capaces de generar potentes respuestas antitumorales. Sin embargo, las células tumorales a menudo inducen un microambiente inmunodepresor, que favorece el desarrollo de poblaciones inmunodepresoras de células inmunitarias, tales como células supresoras procedentes de mieloides y linfocitos T reguladores. Comprender la complejidad de la inmunomodulación de los tumores es importante para el desarrollo de la inmunoterapia. Se están desarrollando diversas estrategias para mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales, incluyendo vacunas basadas en DC y antagonistas de rutas de señalización inhibidoras para superar "puntos de control inmunitarios".

La proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR), un miembro de la superfamilia TNFR, se expresa en muchos componentes del sistema inmunitario innato y adaptativo (véase, por ejemplo, Hanabuchi, et al. (2006) Blood 107:3617-3623; y Nocentini y Riccardi (2005) Eur. J. Immunol. 2005. 35:1016-1022). Su expresión de membrana aumenta después de la activación de linfocitos T (Hanabuchi, mencionado anteriormente; y Nocentini y Riccardi, mencionado anteriormente); su activación activa conjuntamente los linfocitos T efectores y modula la actividad de los linfocitos T reguladores (Treg) (véase, por ejemplo, McHugh, et al. (2002) Immunity 2002. 16:311-323; Shimizu, et al. (2002) Nat. Immunol. 3:135-142; Ronchetti, et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34:613-622; y Tone, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 15059-15064.

GITR es activado por el ligando de GITR (GITRL), que se expresa principalmente en APC y se ha sugerido que suministra señales por su dominio citoplasmático, aunque son necesarios estudios adicionales para definir la señalización bioquímica (Nocentini, mencionado anteriormente; Ronchetti, mencionado anteriormente; Suvas, et al. (2005) J. Virol. 79:11935-11942; y Shin, et al. (2002) Cytokine 19:187-192).

La activación de GITR aumenta la resistencia a tumores e infecciones víricas, está implicada en procesos autoinmunitarios/inflamatorios y regula la extravasación de leucocitos (Nocentini, mencionado anteriormente; Cuzzocrea, et al. (2004) J. Leukoc. Biol. 76:933-940; Shevach et al. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:613-618; Cuzzocrea, et al. (2006) J. Immunol. 177:631-641; y Cuzzocrea et al. (2007) FASEB J. 21:117--129). En modelos de ratones tumorales, el anticuerpo agonista GITR, DTA-1, se combinó con un anticuerpo antagonista CTLA-4 y mostró resultados sinérgicos en la regresión tumoral completa de tumores en estadio avanzado en algunos ratones del grupo de prueba (Ko, et al. (2005) J. Exp. Med. 7:885-891). Schaer et al. (Curr. Opin. Immunol. (2012) 24(2): 217-24) describe la investigación clínica previa que demuestra que dirigirse a GITR mediante anticuerpos agonistas o ligandos naturales puede servir como una terapia antitumoral eficaz y describe el fundamento que ha llevado al inicio de ensayos clínicos de fase 1 dirigidos a GITR como un nuevo enfoque inmunoterapéutico para el cáncer.

El receptor 1 de muerte programada (PD-1, por sus siglas en inglés) es un receptor inmunoinhibidor que se expresa principalmente en linfocitos T y B activados. Se ha demostrado que la interacción con sus ligandos atenúa las respuestas de los linfocitos T tanto in vitro como in vivo. Se ha demostrado que el bloqueo de la interacción entre PD-1 y uno de sus ligandos, PD-L1, mejora la inmunidad de linfocitos T CD8+ específicos del tumor y, por lo tanto, puede ser útil en la eliminación de células tumorales mediante el sistema inmunitario.

PD-1 (codificado por el gen Pdcdl) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas relacionado con CD28 y CTLA-4. Se ha demostrado que PD-1 regula negativamente la señalización del receptor de antígeno tras el acoplamiento de sus ligandos (PD-L1 y/o PD-L2). Se ha resuelto la estructura de PD-1 murino, así como la estructura cristalina conjunta de PD-1 de ratón con PD-L1 humano (Zhang, X., et al., (2004) Immunity 20:337-347; Lin et al., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3011-6). PD-1 y miembros similares de la familia son glucoproteínas transmembrana de tipo I que contienen un dominio de tipo variable de Ig (tipo V) responsable de la unión del ligando y una cola citoplasmática que es responsable de la unión de las moléculas de señalización. La cola citoplasmática de PD-1 contiene dos motivos de señalización basados en tirosina, un ITIM (motivo inmunorreceptor de inhibición basado en tirosina) y un ITSM (motivo inmunorreceptor de cambio basado en tirosina).

En seres humanos, se ha encontrado expresión de PD-1 (en linfocitos infiltrantes del tumor) y/o PD-L1 (en células tumorales) en varias biopsias de tumores primarios evaluadas mediante inmunohistoquímica. Dichos tejidos incluyen cánceres de pulmón, hígado, ovario, cuello del útero, piel, colon, glioma, vejiga, mama, riñón, esófago, estómago, células escamosas orales, células uroteliales y páncreas, así como tumores de cabeza y cuello (Brown, J. A., et al., (2003) J. Immunol. 170: 1257-1266; Dong H., et al., (2002) Nat. Med. 8: 793-800; Wintterle, et al., (2003) Cancer Res.

63: 7462-7467; Strome, S. E., et al., (2003) Cancer Res. 63: 6501-6505; Thompson, R. H., et al., (2006) Cancer Res.

66: 3381-5; Thompson, et al., (2007) Clin. Cancer Res. 13: 1757-61; Nomi, T., et al., (2007) Clin. Cancer Res. 13: 2151-7). Más sorprendentemente, la expresión del ligando de PD en células tumorales se ha correlacionado con un mal pronóstico de pacientes con cáncer en múltiples tipos de tumores (revisado en Okazaki y Honjo, (2007) Int. Immunol. 19: 813-824).

Hasta ahora, numerosos estudios han demostrado que la interacción de PD-1 con sus ligandos (PD-L1 y PD-L2) conduce a la inhibición de la proliferación de linfocitos in vitro e in vivo. El bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 podría conducir a mejorar la inmunidad de linfocitos T específicos de tumores y, por lo tanto, sería útil en la eliminación de células tumorales mediante el sistema inmunitario. Para abordar este problema, se realizaron varios estudios. En un modelo murino de cáncer de páncreas agresivo (Nomi, T., et al. (2007) Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157), se demostró la eficacia terapéutica del bloqueo de PD-1/PD-L1. La administración del anticuerpo dirigido a PD-1 o PD-L1 inhibió significativamente el crecimiento tumoral. El bloqueo de anticuerpos promovió eficazmente la infiltración de linfocitos T CD8+ reactivos al tumor en el tumor, lo que dio como resultado la regulación positiva de efectores antitumorales, incluyendo IFN gamma, granzima B y perforina. Adicionalmente, los autores demostraron que el bloqueo de PD-1 se puede combinar eficazmente con quimioterapia para producir un efecto sinérgico. En otro estudio, utilizando un modelo de carcinoma de células escamosas en ratones, el bloqueo de anticuerpos de PD-1 o PD-L1 inhibió significativamente el crecimiento tumoral (Tsushima, F., et al., (2006) Oral Oncol. 42: 268-274).

Existe la necesidad de mejores métodos y composiciones para el tratamiento de trastornos inmunitarios y proliferativos, por ejemplo, tumores y cánceres, mediante el uso de agentes que modulan la inmunidad tumoral. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando antagonistas de PD-1 en combinación con agonistas de GITR para tratar tumores en estadio avanzado.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1K muestran el efecto de anticuerpos anti-GITR dosificados solos o en combinación con anticuerpos anti-PD-1 sobre la respuesta antitumoral de ratones implantados con la línea celular MC38 (n = 10/grupo). El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron 240-360 mm3.

Las Figuras 2A-2F muestran la eficacia antitumoral de una dosis única de anticuerpos anti-GITR seguida de una dosis única de anticuerpos anti-PD-1 una semana después (Figura 2B), o en la secuencia opuesta (Figura 2C). Esto se comparó con cualquiera de los anticuerpos solos (Figuras 2E-2F; n = 10/grupo)

Las Figuras 3A-3D muestran la eficacia antitumoral de la monoterapia de anticuerpos anti-GITR o anti-PD-1 solos (Figuras 3C-3D), en comparación con la administración conjunta de ambos anticuerpos (Figura 3A) en el modelo de tumor CT26 (n = 10/grupo).

Las Figuras 4A-4D muestran el efecto de anticuerpos anti-GITR y anti PD-1 dosificados solos o con la administración simultánea de ambos anticuerpos sobre la respuesta antitumoral de ratones implantados con la línea celular MB49 (n = 10/grupo). El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron 85-122 mm3.

Las Figuras 5A-5B muestran el efecto dependiente de la dosis de la combinación de anti-GITR (MK-4166) y anti-PD-1 (MK-3475) en Treg (Figura 5A) y la relación de linfocitos Treg:CD8 (Figura 5B) en una reacción mixta de linfocitos (MLR, por sus siglas en inglés).

La Figura 6 muestra que la incubación con una combinación de MK-4166 y MK-3475 da como resultado una actividad supresora reducida de Treg en una MLR.

Sumario de la invención

La presente invención satisface estas necesidades en la materia y más al proporcionar una combinación de un antagonista de PD-1 y un agonista de GITR para usar en un método de tratamiento de un tumor en un paciente, en donde el antagonista de PD-1 y el agonista de GITR se administran simultáneamente o secuencialmente. El antagonista de PD-1 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PD-1 o PD-L1; y el agonista de GITR es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GITR. En determinadas realizaciones, el agonista de GITR y el antagonista de PD-1 o PD-L1 se unen a las proteínas humanas. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo está humanizado o es completamente humano.

En realizaciones adicionales, el antagonista de PD-1 se selecciona del grupo que consiste en BMS-936558, MK-3475 y MPDL3280A; y el agonista de GITR se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo que tiene al menos una CDR de SEQ ID NO: 1 - 66; TRX518; y TRX385. El agonista de GITR puede ser un anticuerpo que tiene: una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1-11, CDR2 de SEQ ID NO: 12-22, y CDR3 de SEQ ID NO: 23-33; y/o una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34-44, CDR2 de SEQ ID NO: 45-55, y CDR3 de SEQ ID NO: 56-66. En una realización adicional más, el agonista de GITR es un anticuerpo que tiene: una cadena pesada variable de SEQ ID NO: 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 y 87; y/o una cadena ligera variable de SEQ ID NO: 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 y 88.

La presente invención también contempla que el antagonista de PD-1 y el agonista de GITR se administren simultáneamente al menos una vez. En determinadas realizaciones, el antagonista de PD-1 y el agonista de GITR se administran simultáneamente al menos 2 veces. En determinadas realizaciones, el tumor es un tumor en estadio avanzado y se puede seleccionar del grupo que consiste en cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, glioma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado tal como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, mieloma (tal como mieloma múltiple), carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón tal como carcinoma de células renales y tumores de Wilms, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular y cáncer de esófago.

La presente invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer brazo que se une a PD-1 o PD-L1 y antagoniza la actividad de PD-1, y un segundo brazo que se une a GITR y agoniza la actividad de GITR para usar en un método de tratamiento de un tumor. En determinadas realizaciones, el primer brazo se selecciona del grupo que consiste en un fragmento de unión a antígeno de BMS-936558, MK-3475 y MPDL3280A; y el segundo brazo se selecciona del grupo que consiste en un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que tiene al menos una CDR de SEQ ID NO: 1 - 66; TRX518; y TRX385. En una realización adicional más, el segundo brazo tiene una CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1-11, CDR2 de SEQ ID NO: 12-22, y CDR3 de SEQ ID NO: 23-33; y/o una CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 34-44, CDR2 de SEQ ID NO: 45-55, y CDR3 de SEQ ID NO: 56-66. En determinadas realizaciones, el segundo brazo tiene una cadena pesada variable de SEQ ID NO: 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81,83, 85 y 87; y/o una cadena ligera variable de SEQ ID NO: 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 y 88.

La presente invención proporciona una combinación de un antagonista de PD-1 y un agonista de GITR para usar en un método de tratamiento de un tumor en donde el tumor es un tumor en estadio avanzado. En determinadas realizaciones, el tumor en estadio avanzado se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, glioma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado tal como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, mieloma (tal como mieloma múltiple), carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón tal como carcinoma de células renales y tumores de Wilms, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular y cáncer de esófago.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un antagonista de PD-1 y un agonista de GITR. También se proporciona el uso de un antagonista de PD-1 en combinación con un agonista de GITR para tratar un tumor en estadio avanzado.

Descripción detallada

Como se usa en el presente documento, incluyendo en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras tales como "un", "una", "el" y "la" incluyen sus referencias plurales correspondientes a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. La tabla 15 a continuación proporciona un listado de identificadores de secuencia usados en la presente solicitud. La mención de las referencias del presente documento no pretende ser una admisión de que cualquiera de las anteriores sea una técnica anterior pertinente, ni constituye una admisión en cuanto al contenido o la fecha de estas publicaciones o documentos.

I. Definiciones

La expresión "receptor de TNF inducido por glucocorticoides" (abreviado en el presente documento como "GITR"), también conocido como superfamilia 18 de receptor de TNF (TNFRSF18), TEASR y 312C2, como se usa en el presente documento, se refiere a un miembro de la familia de receptor de factor de necrosis tumoral/factor de crecimiento nervioso. GITR es una proteína transmembrana de tipo I de 241 aminoácidos caracterizada por tres pseudorrepeticiones de cisteína en el dominio extracelular y protege de manera específica la apoptosis inducida por el receptor de linfocitos T, aunque no protege a las células frente a otras señales apoptóticas, incluyendo el desencadenamiento por Fas, el tratamiento con dexametasona o la irradiación UV (Nocentini, G., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216-622). Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de GITR humano (hGITR, por sus siglas en inglés), de las cuales hay tres variantes de empalme, son conocidas y se pueden encontrar en, por ejemplo, GenBank n.° de acceso gi:40354198, gi:23238190, gi:23238193 y gi:23238196.

"Agonista de GITR" significa cualquier compuesto químico o molécula biológica que estimula una reacción inmunitaria mediante la activación de la señalización de GITR. Las secuencias de anticuerpos agonistas anti-GITR se proporcionan en los documentos WO 2011/028683 y WO 2006/105021, así como TRX-385 y TRX-518. También se contemplan proteínas GITR-L solubles, un compañero de unión a GITR.

"Antagonista de PD-1" significa cualquier compuesto químico o molécula biológica que bloquea la unión de PD-L1 expresada en una célula cancerosa a PD-1 expresada en una célula inmunitaria (linfocito T, linfocito B o célula NKT) y, preferentemente, también bloquea la unión de PD-L2 expresado en una célula cancerosa a la PD-1 expresada en células inmunitarias. Los nombres o sinónimos alternativos para PD-1 y sus ligandos incluyen: Receptor 1 de muerte programada; PDCD1, PD1, CD279 y SLEB2 para PD-1; PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 y B7-H para PD-L1; Ligando 1 del receptor de muerte programada, PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc y CD273 para PD-L2. En cualquiera de los métodos de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención en los que se está tratando a un individuo humano, el antagonista de PD-1 bloquea la unión de PD-L1 humano a PD-1 humana, y, preferentemente, bloquea la unión de PD-L1 y PD-L2 humanos a PD-1 humana. Las secuencias de aminoácidos de PD-1 humana se pueden encontrar en el locus de NCBI n.°: NP_005009. Las secuencias de aminoácidos de PD-L1 y PD-L2 humanas se pueden encontrar en el locus de NCBI n.°: NP_054862 y NP_079515, respectivamente.

Los antagonistas de PD-1 útiles en cualquiera de los métodos de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención incluyen un anticuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés), o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 o PD-L1, y, preferentemente se une específicamente a PD-1 humana o PD-L1 humano. El mAb puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico, y puede incluir una región constante humana. En algunas realizaciones, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y en realizaciones preferentes, la región constante humana es una región constante de IgG1 o IgG4. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, F(ab')2, scFv y Fv.

Se describen ejemplos de mAb que se unen a PD-1 humana y que son útiles en el método de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención en los documentos US7521051, US8008449 y US8354509. Los mAb específicos anti-PD-1 humana útiles como el antagonista de PD-1 en el método de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención incluyen: MK-3475, un mAb IgG4 humanizado con la estructura descrita en la Información sobre medicamentos de la OMS, Vol. 27, n.° 2, páginas 161-162 (2013) y que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera mostradas en la Figura 6, nivolumab (BMS-936558), un mAb IgG4 humano con la estructura descrita en la Información sobre medicamentos de la OMS, Vol. 27, n.° 1, páginas 68-69 (2013) y que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera mostradas en la Figura 7; pidilizumab (CT-011, también conocido como hBAT o hBAT-1); y los anticuerpos humanizados h409A11, h409A16 y h409A17, que se describen en el documento WO2008/156712.

En los documentos WO2013/019906, WO2010/077634 A1 y US8383796 se describen ejemplos de mAb que se unen a PD-L1 humana y que son útiles en el método de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención. Los mAb específicos anti-PD-L1 humano útiles como el antagonista de PD-1 en el método de tratamiento, medicamentos y usos de la presente invención incluyen MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB0010718C y un anticuerpo que comprende las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 21, respectivamente, del documento WO2013/019906.

El término "administración" como se usa en el presente documento se refiere a la introducción física de una composición que comprende un agonista de GITR y al menos un agente terapéutico contra el cáncer adicional, por ejemplo, un antagonista de PD-1 a un paciente con cáncer. Todos y cada uno de los métodos de introducción se contemplan de acuerdo con la invención; el método no depende de ningún medio particular de introducción. Los expertos en la materia conocen bien los medios de introducción, cuyos ejemplos se proporcionan en el presente documento.

La expresión "administración conjunta", como se usa en el presente documento, significa un proceso mediante el cual la combinación de un agonista de GITR y al menos un agente terapéutico contra el cáncer adicional, por ejemplo, un antagonista de PD-1, se administra al mismo paciente. El agonista de GITR y el antagonista de PD-1 pueden administrarse de forma simultánea o secuencial. Si la administración tiene lugar secuencialmente, el agonista de GITR y/o el antagonista de PD-1 pueden administrarse antes o después de un tratamiento o agente terapéutico contra el cáncer adicional dado. El tratamiento con agonista de GITR y antagonista de PD-1 no necesita administrarse por medio del mismo vehículo. El agonista de GITR y el antagonista de PD-1 se pueden administrar una o más veces y el número de administraciones de cada componente de la combinación puede ser el mismo o diferente. Además, el agonista de GITR y el antagonista de PD-1 no necesitan administrarse en el mismo sitio.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" o "combinación terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad o dosis de un agonista de GITR, junto con la cantidad o dosis de un agente o tratamiento adicional, por ejemplo, un antagonista de PD-1 que es suficiente para modular, por ejemplo, estimular, la respuesta inmunitaria sistémica de un individuo. La cantidad de cada molécula en una combinación terapéuticamente eficaz dada puede ser diferente para diferentes individuos y diferentes tipos de tumores, y dependerá del uno o más agentes o tratamientos adicionales incluidos en la combinación. La "cantidad terapéuticamente eficaz" se determina usando procedimientos empleados habitualmente por los expertos en la materia de manera que se obtenga un "resultado terapéutico mejorado".

Como se usa en el presente documento, las expresiones "resultado terapéutico mejorado" y "eficacia terapéutica mejorada", en relación con el cáncer, se refieren a una desaceleración o disminución del crecimiento de células cancerosas o un tumor sólido, o una reducción en el número total de células cancerosas o masa tumoral total. Por lo tanto, un "resultado terapéutico mejorado" o "eficacia terapéutica mejorada" significa que hay una mejora en la afección del paciente de acuerdo con cualquier criterio clínicamente aceptable, incluyendo, por ejemplo, disminución del tamaño tumoral, un aumento en el tiempo hasta la progresión del tumor, un aumento de la supervivencia libre de progresión, aumento del tiempo de supervivencia global, un aumento de la esperanza de vida o una mejora de la calidad de vida. En particular, "mejorado" o "aumentado" se refiere a una mejora o aumento de un 1 %, 5 %, 10 %, 25 % 50 %, 75 %, 100 % o más del 100 % de cualquier indicador clínicamente aceptable de resultado o eficacia terapéutica.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo que presente la actividad biológica deseada. Por tanto, se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos completamente humanos, etc. siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "fragmento de unión a GITR, PD-1, o PD-L1", "fragmento de unión del mismo" o "fragmento de unión a antígeno del mismo" abarcan un fragmento o un derivado de un anticuerpo que aún conserva sustancialmente su actividad biológica de inducir la señalización de GITR denominada en el presente documento "actividad inductora de GITR". Como alternativa, el fragmento de unión a PD-1 o PD-L1 abarca un fragmento o derivado de anticuerpo que inhibe la actividad de PD-1, por ejemplo, la unión a PD-L1 o PD-L2. La expresión "fragmento de anticuerpo" o fragmento de unión a GITR, PD-1 o PD-L1 se refiere a una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región variable o de unión al antígeno del mismo. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario, por ejemplo, sc-Fv; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Normalmente, un fragmento de unión o derivado conserva al menos 10 % de su actividad agonista de GITR. Preferentemente, un fragmento de unión o derivado conserva al menos 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % (o más) de su actividad agonista de GITR o antagonista de PD-1, aunque cualquier fragmento de unión con suficiente afinidad para ejercer el efecto biológico deseado será útil. También se pretende que un fragmento de unión a GITR, PD-1 o PD-L1 pueda incluir variantes que tengan sustituciones de aminoácidos conservadoras que no alteren sustancialmente su actividad biológica.

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por las posibles mutaciones que tienen lugar de manera natural que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único epítopo antigénico. Por el contrario, las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) normalmente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epítopos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante el método del hibridoma descrito por primera vez en Kohler et al. (1975) Nature 256: 495 o se pueden preparar mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fago usando las técnicas descritas en Clackson, et al. (1991) Nature 352:624-628 y Marks, et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567; Morrison, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855.

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene únicamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones V^h se unen covalentemente con un enlazador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones V^h de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse al mismo antígeno o a antígenos diferentes.

Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades antigénicas. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (véase más adelante).

Como se usa en el presente documento, la expresión anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios V^h y V^l de anticuerpos, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido de Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios V^h y V^l que permite que el sFv forme la estructura deseada para unión a antígeno. Para una revisión de los sFv, véase Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol.

113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315.

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento también incluyen anticuerpos de dominio único camelizados. Un "fragmento de anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene únicamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones V^h se unen covalentemente con un enlazador peptídico para crear un fragmento de anticuerpo de dominio multivalente. Las dos regiones V^h de un fragmento de anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse al mismo antígeno o a antígenos diferentes. Véase, por ejemplo, Muyldermans, et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann, et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; el documento WO 94/04678; el documento WO 94/25591; la patente de Estados Unidos N.° 6.005.079). En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos de dominio único que comprenden dos dominios VH con modificaciones tales que se forman anticuerpos de dominio único.

Como se usa en el presente documento, el término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (V^h) conectado con un dominio variable de cadena ligera (V^l) en la misma cadena polipeptídica (V^h-V^l o V^l-V^h). Usando un enlazador que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Se describen diacuerpos de manera más completa en, por ejemplo, el documento EP 404097; el documento WO 93/11161; y Holliger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Para una revisión de variantes de anticuerpos genomodificadas véase, en general, Holliger y Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) así como anticuerpos humanos. Dichos anticuerpos contienen una secuencia mínima procedente de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente la de una inmunoglobulina humana. El prefijo "hum", "hu" o "h" se añade a las designaciones de clones de anticuerpos cuando sea necesario para distinguir los anticuerpos humanizados de anticuerpos de roedores precursores. Las formas humanizadas de anticuerpos de roedores comprenderán en general las mismas secuencias de CDR de los anticuerpos de roedores precursores, aunque se pueden incluir determinadas sustituciones de aminoácidos para aumentar la afinidad, aumentar la estabilidad del anticuerpo humanizado o por otras razones.

La expresión "anticuerpo completamente humano" se refiere a un anticuerpo que comprende solo secuencias de proteína de inmunoglobulina humana. Un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas de carbohidratos murinos si se produce en un ratón, en una célula de ratón o en un hibridoma procedente de una célula de ratón. De manera similar, "anticuerpo de ratón" o "anticuerpo de rata" se refieren a un anticuerpo que comprende solo secuencias de inmunoglobulina de ratón o rata, respectivamente. Se puede generar un anticuerpo completamente humano en un ser humano, en un animal transgénico que tiene secuencias de línea germinal de inmunoglobulina humana, mediante presentación en fagos u otros métodos de biología molecular. Se describen ejemplos de técnicas que se pueden usar para producir anticuerpos en las patentes de EE.UU.: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140. Otras técnicas, tal como el uso de bibliotecas, se conocen en la materia.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos con regiones Fc modificadas (o bloqueadas) para proporcionar funciones efectoras alteradas. Véanse, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.624.821; el documento WO2003/086310; el documento WO2005/120571; el documento WO2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58: 640-656. Dicha modificación se puede usar para mejorar o suprimir diversas reacciones del sistema inmunitario, con posibles efectos beneficiosos en el diagnóstico y la terapia. Las alteraciones de la región Fc incluyen cambios de aminoácidos (sustituciones, supresiones e inserciones), glucosilación o desglucosilación, y adición de múltiples Fc. Los cambios en el Fc también pueden alterar la semivida de los anticuerpos en anticuerpos terapéuticos y una semivida más larga daría como resultado dosificación menos frecuente, con el consiguiente aumento de la comodidad y disminución del uso de material. Véase Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731 en 734-35.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos con regiones Fc intactas que proporcionan funciones efectoras completas, p. ej., anticuerpos del isotipo IgG 1, que inducen citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en una célula diana.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos conjugados con cargas útiles citotóxicas, tales como agentes citotóxicos o radionúclidos. Dichos conjugados de anticuerpos se pueden usar en inmunoterapia junto con tratamiento anti-GITR, anti-PD-1 o anti-PD-L1, para dirigirse selectivamente a y destruir células que expresan determinados antígenos en su superficie. Los agentes citotóxicos ilustrativos incluyen ricina, alcaloide de la vinca, metotrexato, exotoxina de Pseudomonas, saporina, toxina diftérica, cisplatino, doxorrubicina, toxina abrina, gelonina y proteína antivírica de fitolaca. Los radionúclidos ilustrativos para su uso en inmunoterapia con los anticuerpos de la presente invención incluyen 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 211At, 177Lu, 143Pr y 213Bi. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2006/0014225.

Los anticuerpos biespecíficos también son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo, normalmente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión para al menos dos epítopos antigénicos diferentes. En una realización, los epítopos pueden ser del mismo antígeno. En otra realización, los epítopos son de dos antígenos diferentes. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos biespecíficos de manera recombinante usando la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39. Como alternativa, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando unión química. Véase, por ejemplo, Brennan et al. (1985) Science 229:81. Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Véanse, por ejemplo, Holliger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48, Gruber, et al. (1994) J. Immunol. 152:5368.

El término "multiespecífico" incluye moléculas de unión que tienen especificidad por más de un antígeno diana. Dichas moléculas tienen más de un sitio de unión donde cada sitio de unión se une específicamente a (por ejemplo, inmunorreacciona con) una molécula diana diferente o un sitio antigénico diferente en la misma diana. En una realización, una molécula de unión multiespecífica de la invención es una molécula biespecífica (por ejemplo, anticuerpo, minicuerpo, anticuerpo con dominio eliminado o proteína de fusión) que tiene especificidad de unión para al menos dos dianas, por ejemplo, más de una molécula diana o más de un epítopo en la misma molécula diana.

Como se usa en el presente documento, la expresión "región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, restos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) en el dominio variable de cadena ligera y restos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en el dominio variable de cadena pesada (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, restos 26-32 (LI), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (HI), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Como se usa en el presente documento, la expresión restos "estructurales" o "FR" se refiere a los restos de dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable definidos en el presente documento como restos de CDR. La numeración de restos anterior se refiere al sistema de numeración de Kabat.

"Compuesto de unión" se refiere a una molécula, molécula pequeña, macromolécula, polipéptido, anticuerpo o fragmento o análogo de los mismos, o receptor soluble, capaz de unirse con una diana. "Compuesto de unión" también puede referirse a un complejo de moléculas, por ejemplo, un complejo no covalente, a una molécula ionizada y a una molécula modificada de manera covalente o no covalente, por ejemplo, modificada por fosforilación, acilación, reticulación, ciclación o escisión limitada, que es capaz de unirse con una diana. Cuando se usa en referencia a anticuerpos, la expresión "compuesto de unión" se refiere tanto a anticuerpos como a fragmentos de unión a antígeno de los mismos. "Unión" se refiere a una asociación de la composición de unión con una diana donde la asociación da como resultado reducción del movimiento browniano normal de la composición de unión, en casos en los que la composición de unión puede disolverse o suspenderse en solución. "Composición de unión" se refiere a una molécula, p. ej., un compuesto de unión, en combinación con un estabilizador, excipiente, una sal, tampón, disolvente o aditivo, capaz de unirse con una diana.

Como se usa en el presente documento, "variantes modificadas de manera conservadora" o "sustitución conservadora" se refiere a sustituciones de aminoácidos que son conocidas por los expertos en esta materia y con frecuencia pueden realizarse incluso en regiones esenciales del anticuerpo sin alterar la actividad biológica del anticuerpo resultante. Dichas sustituciones ilustrativas se realizan preferentemente de acuerdo con las expuestas en la tabla 1 de la siguiente manera:

Tabla 1

continuación

Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido pueden no alterar sustancialmente la actividad biológica. Véase, por ejemplo, Watson, et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., págs. 224 (4a edición).

La expresión "que consiste esencialmente en", o variaciones tales como "consisten esencialmente en" o "consistiendo esencialmente en", tal como se usa a lo largo la memoria descriptiva y las reivindicaciones, indican la inclusión de cualquier elemento o grupo de elementos enumerado y la inclusión opcional de otros elementos, de naturaleza similar o diferente a los elementos enumerados, que no cambian materialmente las propiedades básicas o novedosas del régimen de dosificación, método o composición especificado. Como un ejemplo no limitante, un compuesto de unión que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos enumerada también puede incluir uno o más aminoácidos, incluyendo sustituciones de uno o más restos de aminoácidos, que no afectan materialmente a las propiedades del compuesto de unión.

"Afección inmunitaria" o "trastorno inmunitario" abarca, por ejemplo, inflamación patológica, un trastorno inflamatorio y un trastorno o enfermedad autoinmunitario. "Afección inmunitaria" también se refiere a infecciones, infecciones persistentes y afecciones proliferativas, tales como cáncer, tumores y angiogénesis, incluyendo infecciones, tumores y cánceres que resisten la erradicación por el sistema inmunitario. "Afección cancerosa" incluye, por ejemplo, cáncer, células cancerosas, tumores, angiogénesis y afecciones precancerosas tales como displasia.

La "actividad proliferativa" abarca una actividad que promueve, que es necesario para o que está específicamente asociada con, por ejemplo, la división celular normal, así como cáncer, tumores, displasia, transformación celular, metástasis y angiogénesis.

Los términos "cáncer", "tumor", "canceroso" y "maligno" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por crecimiento celular desregulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma incluyendo adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, cáncer de páncreas, glioblastoma, glioma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado tal como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, mieloma (tal como mieloma múltiple), carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón tal como carcinoma de células renales y tumores de Wilms, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer de esófago y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

A medida que las células cancerosas crecen y se multiplican, forman una masa de tejido canceroso, es decir, un tumor, que invade y destruye tejidos adyacentes normales. Los tumores malignos son cáncer. Los tumores malignos habitualmente se pueden extirpar, pero pueden volver a crecer. Las células de tumores malignos pueden invadir y dañar tejidos y órganos cercanos. Asimismo, las células cancerosas pueden desprenderse de un tumor maligno y entrar en el torrente sanguíneo o el sistema linfático, que es la forma en que las células cancerosas se diseminan desde el tumor primario (es decir, el cáncer original) para formar nuevos tumores en otros órganos. La diseminación del cáncer en el cuerpo se llama metástasis (What You Need to Know About Cancer- an Overview, Publicación de NIH N.° 00-1566; publicada el 26 de septiembre de 2000, actualizada el 16 de septiembre de 2002 (2002)).

Como se usa en el presente documento, la expresión "tumor sólido" se refiere a un crecimiento anómalo o masa de tejido que habitualmente no contiene quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos (no cancerosos) o malignos (cancerosos). Los diferentes tipos de tumores sólidos se nombran por el tipo de células que los forman. Son ejemplos de tumores sólidos sarcomas, carcinomas y linfomas. Las leucemias (cánceres de la sangre) generalmente no forman tumores sólidos (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).

"Masa tumoral" también denominada "carga tumoral", se refiere a la cantidad total de material tumoral distribuido por todo el cuerpo. La carga tumoral se refiere al número total de células cancerosas o al tamaño total del o los tumores, a través del cuerpo, incluyendo ganglios linfáticos y médula ósea. La carga tumoral se puede determinar mediante diversos métodos conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, midiendo las dimensiones del o los tumores al extraerlos del sujeto, por ejemplo, usando calibradores, o mientras está en el cuerpo usando técnicas de imagen, por ejemplo, ultrasonidos, gammagrafía ósea, tomografía computarizada (TC) o imágenes por resonancia magnética (RM).

El término "tamaño del tumor" se refiere al tamaño total del tumor que puede medirse como la longitud y LA anchura de un tumor. El tamaño del tumor se puede determinar mediante diversos métodos conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, midiendo las dimensiones del o los tumores al extraerlos del sujeto, por ejemplo, usando calibradores, o mientras está en el cuerpo usando técnicas de imagen, por ejemplo, gammagrafía ósea, ultrasonidos, CT o RM.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cáncer primario" se refiere al tumor original o al primer tumor. El cáncer puede comenzar en cualquier órgano o tejido del cuerpo. Habitualmente, se nombra por la parte del cuerpo o el tipo de célula en el que se origina (Metastatic Cancer: Questions and Answers, Cancer Facts 6.20, National Cancer Institute, revisado el 1 de septiembre de 2004 (2004)).

Como se usa en el presente documento, la expresión "carcinoma localizado" se refiere a células cancerosas que todavía están contenidas dentro del tejido donde comenzaron a crecer y que aún no se han vuelto invasivas o se han propagado a otras partes del cuerpo.

Como se usa en el presente documento, el término "carcinomas" se refiere a cánceres de células epiteliales, que son células que cubren la superficie del cuerpo, producen hormonas y forman glándulas. Son ejemplos de carcinomas cánceres de piel, pulmón, colon, estómago, mama, próstata y glándula tiroides.

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que normalmente está asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada está en una forma o configuración distinta de en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan normalmente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN implicadas en la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador en particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está unido operativamente con ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificante si se coloca de manera que facilite la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguo y en el marco de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La unión se realiza mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular", se pueden utilizar indistintamente y todas estas denominaciones incluyen la descendencia. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos procedentes de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. Se entiende también que toda la descendencia puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la explorada en la célula transformada originalmente. Cuando se pretenda hacer denominaciones distintas, estas quedaran claras a partir del contexto.

Como se usa en el presente documento, "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o una técnica en la que pequeñas cantidades de un trozo específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se describe en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 4.683.195. En general, debe encontrarse disponible información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá, de manera que puedan diseñarse cebadores oligonucleotídicos; estos cebadores tendrán una secuencia idéntica o similar a las cadenas opuestas del molde para amplificar. Los nucleótidos 5' terminales de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR se puede usar para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas a partir de ADN genómico total y ADNc transcrito a partir de ARN celular total, secuencias de bacteriófago o plásmido, etc. Véase, en general, Mullis, et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Cuant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Como se usa en el presente documento, la PCR se considera uno, pero no el único, ejemplo de un método de reacción de la polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un trozo específico de ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de línea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reordenadas, incluyendo secuencias de línea germinal de roedor (p. ej., ratón) y humanas. Se puede usar cualquier fuente adecuada de ADN de inmunoglobulina no reordenado. Se pueden obtener secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, de las bases de datos de la línea germinal JOINSOLVER® en el sitio web del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Se pueden obtener secuencias de la línea germinal de ratón, por ejemplo, como se describe en Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261.

Para examinar el grado de mejora de, por ejemplo, la actividad de GITR, las muestras o ensayos que comprenden, por ejemplo, una proteína, gen, célula u organismo dado, se tratan con un posible agente activador o inhibidor y se comparan con muestras de control tratadas con una molécula de control inactiva. A las muestras de control se les asigna un valor de actividad relativa del 100 %. Se logra inhibición cuando el valor de actividad en relación con el control es de aproximadamente 90 % o menos, normalmente 85 % o menos, más normalmente 80 % o menos, más normalmente 75 % o menos, en general 70 % o menos, más en general 65 % o menos, más en general 60 % o menos, normalmente 55 % o menos, habitualmente 50 % o menos, más habitualmente 45 % o menos, más habitualmente 40 % o menos, preferentemente 35 % o menos, más preferentemente 30 % o menos, aún más preferentemente 25 % o menos y lo más preferentemente menos de 20 %. Se logra activación cuando el valor de la actividad en relación con el control es de aproximadamente 110 %, en general al menos 120 %, más en general al menos 140 %, más en general al menos 160 %, con frecuencia al menos 180 %, con más frecuencia al menos 2 veces, con más frecuencia al menos 2,5 veces, habitualmente al menos 5 veces, más habitualmente al menos 10 veces, preferentemente al menos 20 veces, más preferentemente al menos 40 veces y lo más preferentemente más de 40 veces mayor.

Los criterios de valoración en la activación o inhibición se pueden supervisar de la siguiente manera. La activación, inhibición y respuesta al tratamiento, por ejemplo, de una célula, líquido fisiológico, tejido, órgano y sujeto animal o humano, se pueden supervisar mediante un criterio de valoración. El criterio de valoración puede comprender una cantidad o porcentaje predeterminado de, por ejemplo, un indicio de inflamación, oncogenicidad o desgranulación o secreción celular, tal como la liberación de una citocina, oxígeno tóxico o una proteasa. El criterio de valoración puede comprender, por ejemplo, una cantidad predeterminada de flujo o transporte de iones; migración celular; adhesión celular; proliferación celular; potencial de metástasis; diferenciación celular; y cambio de fenotipo, por ejemplo, cambio de expresión del gen relacionado con inflamación, apoptosis, transformación, ciclo celular o metástasis (véase, por ejemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood y Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2: 91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4: 251-261; Robbins e Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86: 1467-1495; Grady y Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001) Glia 36: 235-243; Stanimirovic y Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).

Un criterio de valoración de inhibición es, en general, 75 % del control o menos, preferentemente 50 % del control o menos, más preferentemente 25 % del control o menos y lo más preferentemente 10 % del control o menos. En general, un criterio de valoración de activación es al menos 150 % del control, preferentemente al menos dos veces el control, más preferentemente al menos cuatro veces el control y lo más preferentemente al menos 10 veces el control.

"Molécula pequeña" se define como una molécula con un peso molecular que es menor de 10 kDa, normalmente menor de 2 kDa y preferentemente menor de 1 kDa. Las moléculas pequeñas incluyen, aunque sin limitación, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas, moléculas orgánicas que contienen un componente inorgánico, moléculas que comprenden un átomo radioactivo, moléculas sintéticas, peptidomiméticos y miméticos de anticuerpos. Como tratamiento terapéutico, una molécula pequeña puede ser más permeable a las células, menos susceptible a la degradación y menos propensa a inducir una respuesta inmunitaria que las moléculas grandes. Se describen moléculas pequeñas, tales como peptidomiméticos de anticuerpos y citocinas, así como toxinas de moléculas pequeñas. Véase, por ejemplo, Casset, et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos, et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini, et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues, et al. (1999) Nat. Struct. Biol.

6:652-656; Sato y Sone (2003) Biochem. J. 371: 603-608; la patente de EE.UU. N.° 6.326.482.

La unión "específica" o "selectiva", cuando se hace referencia a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno u otro par de unión, indica una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por tanto, en condiciones designadas, un ligando específico se une con un receptor en particular y no se une en una cantidad significativa con otras proteínas presentes en la muestra. Como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo se une específicamente con un polipéptido que comprende una secuencia dada (en este caso GITR) si se une con polipéptidos que comprenden la secuencia de GITR pero no se une a proteínas que carecen de la secuencia de GITR. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido que comprende GITR puede unirse con una forma de GITR marcada con FLAG® pero no se unirá a otras proteínas marcadas con FLAG®.

El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente una molécula de unión. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente están preservados frente a la exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones.

Las moléculas de unión que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo sencillo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se determina en un ensayo en el que la molécula de unión que se está estudiando inhibe la unión específica de una molécula de unión de referencia a un antígeno común, tal como GITR. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida; inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida; ensayo de competición en sándwich (véase Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase Kirkland, et al., (1986) J. Immunol. 137:3614); ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase Harlow y Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcaje directo en fase sólida usando el marcador 1-125 (véase Morel et al.,(1988) Mol. Immunol.25(1):7); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung, et al., (1990) Virology 176:546); y RIA de marcaje directo. (Moldenhauer, et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77).

Normalmente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o a células que portan cualquiera de estos, una molécula de unión de ensayo no marcada y una molécula de unión de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la molécula de unión de ensayo.

Normalmente, la molécula de unión de ensayo está presente en exceso. Normalmente, cuando hay presente un exceso de molécula de unión competitiva, inhibirá la unión específica de una molécula de unión de referencia a un antígeno común en al menos un 50-55 %, 55-60 %, 60-65 %, 65-70 %, 70-75 % o más.

El anticuerpo, o composición de unión procedente del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, del método contemplado se une con su antígeno con una afinidad que es al menos dos veces mayor, preferentemente al menos diez veces mayor, más preferentemente al menos 20 veces mayor y lo más preferentemente al menos 100 veces mayor que la afinidad con antígenos no relacionados. En una realización preferida, el anticuerpo tendrá una afinidad que es mayor de aproximadamente 109 litros/mol, según se determina, por ejemplo, por análisis de Scatchard. Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239.

II. General

La presente invención proporciona métodos para tratar tumores en estadio avanzado con una combinación de agonistas de GITR y antagonistas de PD-1, incluyendo anticuerpos anti-GITR y anti-PD-1 o anti-PD-Ll.

III. Composiciones farmacéuticas

Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles, los anticuerpos GITR, PD-1 o PD-L1 se mezclan con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y Farmacopea de los Estados Unidos: Formulario nacional, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

Se pueden preparar formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico mezclando con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, suspensión acuosa, soluciones o suspensiones acuosas. Véase, por ejemplo, Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY.

La toxicidad y eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpos, administradas solas o en combinación con un agente inmunosupresor, se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, p. ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de DL50 con respecto a DE50. Se prefieren anticuerpos que presenten índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración.

El modo de administración no es particularmente importante. Las vías de administración adecuadas pueden, por ejemplo, incluir administración oral, rectal, transmucosa o intestinal; suministro parenteral, que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. La administración del anticuerpo usado en la composición farmacéutica o para practicar el método de la presente invención se puede llevar a cabo de diversas formas convencionales, tales como ingestión oral, inhalación, aplicación tópica o inyección cutánea, subcutánea, intraperitoneal, parenteral, intraarterial o intravenosa.

Como alternativa, se puede administrar el anticuerpo de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del anticuerpo directamente en una articulación artrítica o una lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología, con frecuencia en una formulación en depósito o de liberación sostenida. Asimismo, se puede administrar el anticuerpo en un sistema de administración de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de tejido, que se dirige, por ejemplo, a la articulación artrítica o la lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología. Los liposomas se dirigirán a y serán captados de manera selectiva por el tejido aquejado.

La selección de un régimen de administración para un producto terapéutico depende de varios factores, incluyendo la tasa de recambio sérico o tisular de la entidad, el nivel de los síntomas, la inmunogenicidad de la entidad y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. Preferentemente, un régimen de administración maximiza la cantidad de producto terapéutico administrado al paciente compatible con un nivel aceptable de efectos secundarios. Por consiguiente, la cantidad de producto biológico administrado depende en parte de la entidad en particular y la gravedad de la afección que se trate. Se dispone de orientación para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos, citocinas y moléculas pequeñas. Véase, por ejemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al. (1999) New Engl. J. Med.

341:1966-1973; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl. J. Med.

342:613-619; Ghosh, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky, et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602.

El médico realiza la determinación de la dosis adecuada, por ejemplo, usando parámetros o factores que se sabe o se sospechosa en la técnica que afectan al tratamiento o que se predice que afectan al tratamiento. En general, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y a continuación se incrementa en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen las de síntomas de, por ejemplo, la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas. Preferentemente, un producto biológico que se usará procede sustancialmente de la misma especie que el animal diana del tratamiento (p. ej., un anticuerpo humanizado para el tratamiento de sujetos humanos), minimizando de este modo cualquier respuesta inmunitaria al reactivo.

Se pueden proporcionar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos mediante infusión continua o mediante dosis a intervalos de, por ejemplo, un día, 1-7 veces a la semana, una semana, dos semanas, mensualmente, bimensualmente, etc. Las dosis pueden proporcionarse por vía intravenosa, subcutánea, por vía tópica, por vía oral, nasal, rectal, intramuscular, por vía intracerebral, por vía intraespinal o por inhalación. Un protocolo de dosis preferido es uno que implica la dosis máxima o frecuencia de dosis que evita efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total es, en general, de al menos 0,05 |jg/kg, 0,2 |jg/kg, 0,5 |jg/kg, 1 |jg/kg, 10 |jg/kg, 100 |jg/kg, 0,2 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg de peso corporal o más. Véase, por ejemplo, Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144. La dosis deseada de una molécula pequeña terapéutica, por ejemplo, un peptidomimético, producto natural o producto químico orgánico, es aproximadamente igual que para un anticuerpo o polipéptido, en moles/kg.

Métodos de administración conjunta o tratamiento con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, una citocina, anticuerpo, esteroides, agente quimioterapéutico, antibiótico, antivírico o radiación, se conocen bien en la técnica, véanse, por ejemplo, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill, Nueva York, nY; Poole y Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila., PA; Chabner y Longo (eds.) (2001) Cáncer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila., PA. En particular, la administración de anticuerpos PD-1 o PD-L1 puede ocurrir de forma simultánea o secuencial. En realizaciones particulares, el anticuerpo anti-GITR puede administrarse primero seguido de una dosificación periódica (por ejemplo, una semana después o semanalmente) de un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-Ll. Como alternativa, el tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 o PD-L1 puede ir seguido de un tratamiento con anticuerpos anti-GITR en un programa similar. En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-GITR se administran conjuntamente con anti-PD-1 o anti-PD-Ll en al menos un tratamiento único o múltiples dosis (por ejemplo, administración semanal).

Los anticuerpos GITR, PD-1 o PD-L1 se pueden combinar con agentes quimioterapéuticos que incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonatos, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos, adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB 1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente calicamicina gamma 1I y calicamicina omega I1 (véase, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados con cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolin-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ sin Cremophor, formulación de nanopartículas de paclitaxel diseñadas por ingeniería con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.) y doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina XELODA®; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores.

También se incluyen agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores, tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (MSRE), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tal como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanio, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina); oligonucleótidos antisentido, en particular, los que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación celular anómala, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (p. ej., ribozima ANG iOz Y m E®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas tales como vacunas para terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores.

Se usa una terapia de combinación para tratar un tumor en estadio avanzado que tiene dimensiones de al menos aproximadamente 175 mm3. En otra realización de la invención, se usa una terapia de combinación para tratar un tumor que es al menos aproximadamente 200 mm3, 300 mm3, 400 mm3, 500 mm3, 750 mm3, hasta 1000 mm3. Una terapia de combinación de la invención se usa para tratar un tumor que es lo suficientemente grande como para ser encontrado por palpación o por técnicas de formación de imágenes bien conocidas en la técnica, tales como RM, ecografía o tomografía computarizada.

Un "efecto sinérgico" de dos compuestos es aquel en el que el efecto de la combinación de los dos agentes es mayor que la suma de sus efectos individuales y es estadísticamente diferente de los controles y los fármacos individuales. En otra realización, las terapias de combinación de la invención tienen un efecto aditivo. Un "efecto aditivo" de dos compuestos es aquel en el que el efecto de la combinación de los dos agentes es la suma de sus efectos individuales y es estadísticamente diferente de los controles y/o los fármacos individuales.

Los métodos objeto dan como resultado una inhibición del tamaño del tumor superior a aproximadamente el 10 % superior a aproximadamente el 20 % superior a aproximadamente el 30 % superior a aproximadamente el 35 % superior a aproximadamente el 42 % superior a aproximadamente el 43 % superior a aproximadamente el 44 % superior a aproximadamente el 45 % superior a aproximadamente el 46 % superior a aproximadamente el 47 % superior a aproximadamente el 48 % superior a aproximadamente el 49 % superior a aproximadamente el 50 % superior a aproximadamente el 51 % superior a aproximadamente el 52 % superior a aproximadamente el 53 % superior a aproximadamente el 54 % superior a aproximadamente el 55 % superior a aproximadamente el 56 % superior a aproximadamente el 57 % superior a aproximadamente el 58 % superior a aproximadamente el 59 % superior a aproximadamente el 60 % superior a aproximadamente el 65 % superior a aproximadamente el 70 % superior a aproximadamente el 75 % superior a aproximadamente el 80 % superior a aproximadamente el 85 % superior a aproximadamente el 90 %, superior a aproximadamente el 95 % o superior a aproximadamente el 100 %. En una realización, la administración de una molécula de unión a GITR junto con una molécula antagonista de PD-1 puede conducir a la regresión completa de un tumor avanzado.

También se contempla la administración conjunta de la combinación de agonista de GITR/antagonista de PD-1 con agentes terapéuticos antivíricos. Los antivíricos incluyen cualquier fármaco que destruya virus. Los antivíricos pueden incluir interferones, que actúan para inhibir la replicación del virus, inhibidores de proteasa e inhibidores de la transcriptasa inversa o agentes contenidos en la combinación de terapia antirretrovírica de gran actividad (TARGA) para el VIH.

Los sujetos veterinarios, experimentales o de investigación habituales incluyen monos, perros, gatos, ratas, ratones, conejos, cobayas, caballos y seres humanos.

IV. Usos

Cáncer

Los anticuerpos GITR, PD-1 o PD-L1 o los fragmentos de unión a antígeno se pueden usar para tratar cáncer (es decir, para inhibir el crecimiento o la supervivencia de células tumorales). Los cánceres preferidos cuyo crecimiento puede inhibirse usando los anticuerpos de la invención incluyen cánceres normalmente sensibles a inmunoterapia, pero también cánceres que hasta ahora no se han asociado con inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de cánceres preferidos para tratamiento incluyen melanoma (por ejemplo, metastásico melanoma maligno), cáncer renal (p. ej., carcinoma de células claras), cáncer de próstata (p. ej., adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas), adenocarcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón (p. ej., cáncer no microcítico de pulmón), cáncer esofágico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de cuello de útero, cáncer de tiroides, glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma y otras neoplasias malignas. Adicionalmente, la invención incluye neoplasias refractarias o recurrentes cuyo crecimiento se puede inhibir usando los anticuerpos de la invención.

El anticuerpo agonista de GITR/antagonista de PD-1 o fragmentos de unión a antígeno se pueden usar solos o en combinación con: otros agentes antineoplásicos o agentes inmunogénicos (por ejemplo, células cancerosas atenuadas, antígenos tumorales (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas pulsadas con antígeno o ácidos nucleicos derivados de tumores, citocinas inmunoestimulantes (por ejemplo, IL-2, IFNa2, GM-CSF) y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimulantes tales como, pero sin limitación, GM-CSF); tratamientos estándar del cáncer (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia o cirugía); u otros anticuerpos (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos contra VEGF, EGFR, Her2/neu, receptores de VEGF, otros receptores de factores de crecimiento, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB e ICOS).

Enfermedades infecciosas

La combinación de agonista de GITR/antagonista de PD-1 también se puede usar para prevenir o tratar infecciones y enfermedades infecciosas. La combinación de agonista de GITR/antagonista de PD-1 se puede utilizar sola o junto con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas y auto-antígenos. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden utilizar para estimular la respuesta inmunitaria a virus infecciosos para seres humanos, tales como, pero sin limitación, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis de clase A, B y C, virus de Eppstein Barr, citomegalovirus humano, virus del papiloma humano, virus del herpes. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden utilizar para estimular la respuesta inmunitaria a la infección con parásitos bacterianos o fúngicos y otros patógenos.

Adyuvantes de vacunación

La combinación de anticuerpo agonista de GITR/antagonista de PD-1 o fragmento de anticuerpo se puede utilizar junto con otras proteínas y/o péptidos recombinantes (tales como antígenos tumorales o células cancerosas) para aumentar una respuesta inmunitaria a estas proteínas (es decir, en un protocolo de vacunación).

Por ejemplo, los anticuerpos agonista de GITR/antagonista de PD-1 y fragmentos de anticuerpos de los mismos se pueden utilizar para estimular respuestas inmunitarias específicas de antígeno mediante administración conjunta de la combinación de agonista de GITR/antagonista de PD-1 con un antígeno de interés (por ejemplo, una vacuna). Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona un método para potenciar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto, que comprende administrar al sujeto: (i) el antígeno; y (ii) una combinación de agonista de GITR/antagonista de PD-1, de forma que se mejora una respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno vírico, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno.

Activación ex vivo de linfocitos T

Los anticuerpos y fragmentos de antígeno de la invención también se pueden utilizar para la activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos de antígeno y la transferencia adoptiva de estas células a receptores para aumentar los linfocitos T específicos de antígeno contra el tumor. Estos métodos también pueden usarse para activar las respuestas de los linfocitos T a agentes infecciosos tales como CMV. Se puede esperar que la activación ex vivo en presencia de la combinación de agonista de GITR/antagonista de PD-1 aumente la frecuencia y actividad de linfocitos T transferidos adoptivamente.

Ejemplos

Ejemplo 1

Métodos generales

Se describen métodos convencionales en biología molecular. Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA. También aparecen métodos convencionales en Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley y Sons, Inc. Nueva York, NY, que describen la clonación en células bacterianas y la mutagénesis de ADN (vol. 1), la clonación en células de mamífero y levadura (vol. 2), glucoconjugados y expresión de proteínas (vol. 3) y bioinformática (vol. 4).

Se describen métodos de purificación de proteínas, incluida la inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización. Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York. Se describen análisis químico, modificación química, modificación postraduccional, producción de proteínas de fusión, glucosilación de proteínas. Véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley y Sons, Inc., NY, NY, págs. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; págs. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., págs.

384-391. Se describe producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, mencionado anteriormente. Están disponibles técnicas convencionales para caracterizar interacciones de ligando/receptor. Véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales, policlonales y humanizados (véase, por ejemplo, Sheperd y Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, Nueva York, NY; Kontermann y Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, Nueva York; Harlow y Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca, et al. (1997) J. Biol. Chem.

272:10678-10684; Chothia, et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; la patente de Estados Unidos N.° 6.329.511).

Una alternativa a la humanización es utilizar bibliotecas de anticuerpos humanos presentadas en fagotecas o bibliotecas de anticuerpos humanos en ratones transgénicos (Vaughan, et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas, et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Kay, et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin, et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).

La purificación del antígeno no es necesaria para la generación de anticuerpos. Los animales pueden inmunizarse con células que llevan el antígeno de interés. Los esplenocitos pueden aislarse después de los animales inmunizados y los esplenocitos pueden fusionarse con una línea celular de mieloma para producir un hibridoma (véase, por ejemplo, Meyaard, et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright, et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston, et al., mencionados anteriormente; Kaithamana, et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164).

Los anticuerpos se pueden conjugar, por ejemplo, con pequeñas moléculas de fármaco, enzimas, liposomas, polietilenglicol (PEG). Los anticuerpos son útiles para fines terapéuticos, de diagnóstico, de kit u otros, e incluyen anticuerpos acoplados, por ejemplo, a colorantes, radioisótopos, enzimas o metales, por ejemplo, oro coloidal (véase, por ejemplo, Le Doussal, et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini, et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing y Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts, et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

Se encuentran disponibles métodos para citometría de flujo, incluyendo sistemas de detección de clasificación de células activados por fluorescencia (FACS®). Véase, por ejemplo, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley y Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley y Sons, Hoboken, NJ. Se encuentran disponibles reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, incluyendo cebadores y sondas de ácido nucleico, polipéptidos y anticuerpos, para su uso, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico. Catálogo Molecular Probes (2003), Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO.

Se describen métodos convencionales de histología del sistema inmunitario. Véase, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nueva York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, NY.

Se encuentran disponibles paquetes de programa informático y bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias líder, plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glucosilación y alineamientos de secuencias. Véase, por ejemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690.

Ejemplo 2

Métodos del tratamiento in vivo

Se obtuvieron ratones hembra C57Bl/6J o BALB/c/AnN de aproximadamente ocho a diez semanas de edad de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine o Sacramento, California) o Taconic Laboratory (Oxnard, California), respectivamente. Se proporcionó alimento y agua convencional para animales a voluntad. Todos los protocolos que utilizan animales han sido aprobados por Merck & Co., Inc. y el Merck Research Labs (MRL) Palo Alto Animal Use and Care Committee.

Antes del tratamiento, se pesaron los ratones y se midieron los tumores de ratones individuales. Para evitar el sesgo, se eliminó cualquier valor atípico por peso o volumen del tumor y los ratones restantes se asignaron al azar en varios grupos de tratamiento con un tamaño tumoral medio equivalente.

Los materiales de prueba y los controles de isotipo se obtuvieron del departamento de MRL Palo Alto Protein Sciences como existencias congeladas (-80 °C). Los tampones de formulación eran específicos para cada anticuerpo para estabilizar proteínas y evitar la precipitación, cuyos detalles se dan a continuación:

Las formulaciones/diluyentes se obtuvieron del departamento de MRL Palo Alto Protein Sciences almacenadas a 4 °C. El control de isotipo mIgG2a y la formulación/diluyente anti-PD-1 de acetato de sodio 20 mM, sacarosa al 7 %, pH 5,5, formulación/diluyente mIgG1 de NaCl 75 mM, fosfato 10 mM, sacarosa al 3 %, pH 7,3 y formulación/diluyente mDTA-1 (anti-mGITR) de acetato de sodio 20 mM, sacarosa al 7 %, peróxido bajo de Tween80 al 0,02 %, pH 5,5, eran para estabilizar las proteínas y evitar la precipitación.

Ejemplo 3

Preparación e implante de la línea celular tumoral

Se cultivaron células de carcinoma de colon MC38 o CT26 en medio RPMI complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %. Se cultivaron 1 x 1 células de carcinoma de vejiga MB49 en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero bovino fetal al 10 % y GlutaMAX™ al 1 %. Se inyectaron SC 1 x 106 células de MC38, 3 x 105 células de CT26 o 0,5 x 106 células de MB49 en un volumen de 100 |jl de solución salina tamponada con fosfato en el área del vientre izquierdo o en el flanco derecho de cada ratón. Normalmente, los ratones se afeitaron primero con tijeras electrónicas en el área que se usaría para el implante.

Ejemplo 4

Medidas de los tumores y pesos corporales

Los tumores se midieron el día antes de la primera dosis y dos veces por semana a partir de entonces. La longitud y el ancho del tumor se midieron usando calibradores electrónicos y el volumen tumoral se determinó usando la fórmula Volumen (mm3) = 0,5 x Largo x Ancho2 donde el largo es la dimensión más larga.

Los ratones se pesaron periódicamente para controlar la salud general, pero también para estimar la dosis real de mg/kg administrada por ratón cuando fue necesario.

Ejemplo 5

Preparación, administración y análisis de la solución de dosificación

Las existencias congeladas se descongelaron y se transfirieron a hielo húmedo. Para evitar la congelación y descongelación repetida, cada vial de existencias se descongeló una vez y se prepararon alícuotas en volúmenes suficientes para un solo uso. Para ello se utilizaron tubos de polipropileno de baja adherencia. Las alícuotas se congelaron instantáneamente en hielo seco y se almacenaron a 80 °C. Antes de cada dosificación, se descongeló una alícuota y se diluyó hasta la concentración nominal en el diluyente apropiado y se dosificó inmediatamente. Se congelaron instantáneamente alícuotas de las soluciones de dosificación en hielo seco y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Las soluciones de dosificación se evaluaron utilizando la plataforma Meso Scale Discovery (MSD®, Rockville, MD) que se basa en la tecnología de múltiples matrices; una combinación de detección de electroquimioluminiscencia y matrices con patrones.

La dosificación con los materiales de prueba comenzó una vez que los tumores MC38 y CT26 alcanzaron un tamaño promedio de aproximadamente 300 mm3 y 220 mm3, respectivamente, normalmente alrededor de dos semanas después del implante. La dosificación con los materiales de prueba comenzó una vez que los tumores MB49 alcanzaron un tamaño promedio de aproximadamente 105 mm3, una semana después del implante. Se probaron variaciones en la frecuencia de dosificación (que varían desde una dosis única hasta 6 dosis semanales) a una concentración de dosificación de 5 mg/kg, cuyos detalles se dan a continuación.

Ejemplo 6

Murinización del anticuerpo DTA-1

Se murinizó el anticuerpo de rata anti-DTA-1 GITR de ratón (S. Sakaguchi, Universidad de Kioto, Kioto, Japón) como sigue. La secuencia del anticuerpo de rata DTA-1 se determinó para los dominios variable pesado (VH) y variable ligero (VL). La secuencia VH de DTA-1 de rata se comparó con las secuencias de línea germinal VH de ratón de la base de datos Immunogenetics IMGT (www.imgt.org) (Lefranc, M.-P. et al. (1999) Nuc. Acids Res. 27:209-212). La secuencia VH de DTA-1 se alineó con las secuencias de línea germinal VH de ratón y se puntuó de forma similar a un sistema de humanización anterior (véase, por ejemplo, el documento WO 2005/047326). La VH de DTA-1 de rata era muy similar a las líneas germinales de ratón IGVH5-4, IGVH5-6 y IGVH5-9. Se transfirieron restos de CDR de VH de DTA-1 de rata a la línea germinal de ratón IGVH5-4; se alteraron dos restos de estructura de IGVH5-4 para que encajaran en IGVH5-6 y se usó IGHJ-4 de región J de ratón (IMGT) para conectar con las regiones Fc de IgG 1 de ratón e IgG2a de ratón.

La secuencia VL de DTA-1 (lambda) de rata se alineó con la secuencia VL de ratón (lambda) de GenBank: AAH02129.1. Se transfirieron restos de CDR de VL de DTA-1 (lambda) de rata a la secuencia marco AAH02129 de ratón. Se alteraron siete restos de estructura en DTA1 murinizado basándose en modelos gráficos de computadora de los dominios VL de rata y murinizados. El dominio VL de DTA-1 (lambda) murinizado se fusionó con el dominio constante ligero de ratón.

Para las tres construcciones (una VH y dos VL (lambda)), se sintetizaron genes con codones optimizados y se insertaron en vectores de expresión. Los anticuerpos se expresaron mediante expresión transitoria en células HEK293 y se purificaron mediante cromatografía de proteína A.

Ejemplo 7

Resultados del tratamiento anti-GITR/Anti-PD-1

Se trataron ratones C57BL/6J que llevaban tumor MC38 avanzado con una o dos inyecciones semanales de antimGITR murinizado (Merck Research Labs, Palo Alto, CA) por vía subcutánea (SC) y anti-mPD-1 murinizado (Merck Research Labs, Palo Alto, CA) por vía intraperitoneal (IP), dosificados a 5 mg/kg cada uno. El tratamiento se inició una vez que el tamaño del tumor alcanzó los 240-360 mm3. Los tumores se midieron dos veces por semana. La regresión completa (RC) de los tumores sirvió como lectura de la eficacia antitumoral. La dosificación combinada dio lugar a una eficacia sinérgica sólida, con una RC del 100 % después de dos dosis combinadas semanales. Limitar el régimen a una dosis de cada anticuerpo (Ac) redujo la RC a un 70 %, similar a la logrado con la combinación de anti-mGITR seguida de cuatro administraciones semanales de anti-mPD-1 comenzando una semana después. Un intervalo de dos semanas entre la administración de anti-mGITR y anti-mPD-1 no fue tan eficaz. Slo se observó una RC de un 20-30 % con la monoterapia de hasta seis tratamientos semanales con anti-mGITR o 2-4 tratamientos semanales de Ac antimPD-1 (Véanse las Figuras 1A-1K).

Se trataron ratones C57BL/6J que llevan tumor MC38 avanzado con anti-mGITR (SC) y anti-mPD-1 (IP) a dosis de 5 mg/kg cada uno. El tratamiento se inició una vez que el tamaño del tumor alcanzó los 200-350 mm3. Los tumores se midieron dos veces por semana. La regresión completa (RC) de los tumores sirvió como lectura de la eficacia antitumoral. La dosificación combinada dio lugar a una eficacia sinérgica sólida, con una RC del 100 % después de dos dosis combinadas semanales. Esto es comparable a los resultados detallados anteriormente. Sin embargo, se observó una RC reducida del 60 % cuando los anticuerpos se administraron por separado con un intervalo de una semana. Dos dosis semanales de monoterapia de anti-mGITR o anti-mPD-1 inhibieron el crecimiento tumoral pero no dieron como resultado RC (véanse las Figuras 2A-2F).

Se trataron ratones BALB/cAnN que llevan tumor CT26 avanzado con anti-mGITR (SC) y anti-mPD-1 (IP) a dosis de 5 mg/kg cada uno. El tratamiento se inició una vez que el tamaño del tumor alcanzó los 220 mm3 (180 - 260 mm3). Los tumores se midieron dos veces por semana. La regresión completa (RC) de los tumores sirvió como lectura de la eficacia antitumoral. Una única dosificación combinada dio lugar a una eficacia sinérgica sólida, con RC del 70 %. La eficacia antitumoral con cualquiera de los anticuerpos administrados como monoterapia fue de un 0-10 % de RC (véase las Figuras 3A-3D).

Se trataron ratones C57BL/6J que llevaban tumor MB49 con una dosis única de anti-GITR (SC) y anti-PD-1 (IP) a 5 mg/kg y 10 mg/kg respectivamente. El tratamiento se inició una vez que el tamaño del tumor alcanzó los 105 mm3 (85­ 122 mm3). Los tumores se midieron dos veces por semana. La regresión completa (RC) de los tumores sirvió como lectura de la eficacia antitumoral. El tratamiento combinado anti-GITR y anti-PD-1 condujo a una eficacia mejorada con un 40 % de RC. No se observaron RC en los grupos de tratamiento con agente único (véanse las Figuras 4A-4D).

Ejemplo 8

Efecto de la combinación anti-PD-1 y anti-GITR sobre las proporciones de linfocitos T reguladores y células CD8

A. Métodos

1. Cultivos mixtos de reacción de linfocitos

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de las capas leucocíticas usando centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque Plus a 1200 xg durante 20 minutos. Se recogieron células mononucleares de sangre periférica de la interfaz medio:plasma y se lavaron 2 veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Los glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) residuales se lisaron usando solución de lisis de glóbulos rojos de cloruro de amonio-potasio (solución de lisis de RBC).

Se generaron células dendríticas (DC) a partir de monocitos CD14+ usando el siguiente procedimiento. Los monocitos se aislaron en primer lugar de las capas leucocíticas utilizando un cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos RosetteSep y centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque Plus a 1200 xg durante 20 minutos. Los monocitos se eliminaron de la interfaz medio:plasma y se lavaron 2 veces con DPBS. Los glóbulos rojos residuales se lisaron usando una solución de lisis de glóbulos rojos. Los monocitos enriquecidos se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF) a 1000 U/ml e interleucina (IL)-4 a 400 U/ml a una densidad celular de 2 * 106/ml. El día 6, se añadieron al cultivo 0,5 |jg/ml de lipopolisacárido; a continuación, las células se cultivaron durante 2 días más.

Se prepararon cultivos de reacción de linfocitos mixtos en placas de 24 pocillos. Se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (2 x 106/ml) con DC alogénicas irradiadas con y (30 Gy) (0,2 x 106/ml) en presencia de 100 U/ml de IL-2; 5 ng/ml de IL-15; anticuerpo anti-hGITR (MK-4166), anticuerpo anti-hPD-1 (MK-3475), combinación de MK-3475 y MK-4166 o mAb de control de isotipo (anti-RSV). El número de linfocitos T reguladores (Treg) en cultivos MLR se evaluó el día 7 usando citometría de flujo.

2. Detección citométrica de flujo de Treg en cultivos mixtos de reacción de linfocitos

Para la detección de linfocitos T Treg (CD3+ CD4+ CD25+ FoxP3+) y CD8+, se incubaron de 1 a 2 * 106 células de cultivos MLR con anti-CD3, anti-CD4, anti-CD25 y anti-CD8 en 50 pl de tampón de tinción BD Pharmingen. Las células muertas se excluyeron usando el colorante de viabilidad fijo eFluor 506. Después de la tinción de la superficie con mAb anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD25, se realizó una tinción intracelular de FoxP3 utilizando el kit de fijación/permeabilización FoxP3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (eBioscience). La adquisición de la muestra se realizó en un citómetro de flujo LSR II y los datos se analizaron utilizando el programa informático FlowJo versión 10.0.6 (Tree Star, Inc.). Los Treg se identificaron mediante la activación de las células CD3+ CD4+ seguido de la activación de las células CD25+ FoxP3+.

3. Ensayo de inhibición de linfocitos T reguladores

Se aislaron linfocitos T CD4+ de capas leucocíticas usando el kit de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ humanos RosetteSep y centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque Plus a 1200 xg durante 20 minutos. Se recogieron linfocitos T CD4+ de la interfaz medio:plasma y se lavaron 2 veces con DPBS. Los glóbulos rojos residuales se lisaron usando una solución de lisis de glóbulos rojos. Se separaron linfocitos T efectores (Tef) CD4+ CD25+ y Treg CD4+ CD25- usando el kit de microperlas II conjugadas con CD25 humano de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). La pureza de Treg CD4+ CD25+ CD127- fue aproximadamente de un 40 % a un 70 %. Las DC humanas se generaron como se describió anteriormente.

Para los ensayos de inhibición de linfocitos T, se cultivó un total de 1 x 105 linfocitos T (Treg y Tef) y 2 x 104 DC irradiadas con y (30 Gy) por pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos durante 7 días en presencia de MK-4166, MK-3475, combinación de MK-3475 y MK-4166 o mAb de control de isotipo (anti-RSV). Se mezclaron Tef CD4+ CD25- y Treg CD4+ CD25+ en una proporción de 4:1. El día 6, se añadió timidina marcada con tritio a los cultivos durante 20 horas. Después de la incubación con timidina marcada con tritio, las células se recolectaron, se lisaron usando agua y se analizaron usando un contador p (PerkinElmer, contador de microplacas 2450). El nivel de proliferación de linfocitos T se reflejó en los niveles de timidina marcada con tritio incorporada. Todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.

B. Resultados

La capacidad del mAb DTA-1 agonista anti-GITR de ratón para alterar la estabilidad y la acumulación intratumoral de Treg es esencial para el mecanismo de acción de DTA-1 (véase, por ejemplo, Cohen et al (2010) PLoS One 5(e10436): 1-12; y Schaer et al. (2013) Cancer Immunol. Res. 1:320-331). Se investigó la capacidad de MK-4166 solo o en combinación con MK-3475 para afectar la inducción de Treg humanos y su actividad inhibidora usando un ensayo in vitro humano.

La inducción de Treg en MLR está bien documentada (véase, por ejemplo, Levitsky et al (2013) Transplantation 96:689-696). Por tanto, se utilizó MLR para aumentar el número de Treg humanos de origen natural en la sangre y para evaluar el efecto de MK-4166 solo o en combinación con MK-3475 sobre Treg humanos y la relación CD8:Treg. La adición de 10 pg/ml de MK-4166 a cultivos MLR dio como resultado un número reducido de Treg CD4+ CD25+ FoxP3+ después de 7 días (Figura 5A). MK-3475 por sí solo no tuvo ningún efecto sobre el número de Treg. Sin embargo, la combinación de MK-3475 y MK-4166 tuvo el efecto más pronunciado sobre el número de Treg y la relación CD8:Treg (Figura 5B).

Para evaluar el efecto de MK-4166 sobre la actividad inhibidora de Treg humanos, se estableció el ensayo de supresión de Treg. En este ensayo, el nivel de proliferación de linfocitos T se refleja en los niveles de timidina marcada con tritio incorporada. Se observó un aumento dependiente de la dosis en la proliferación de linfocitos T cuando MK-4166 se combinó con MK-3475 (Figura 6). Estos resultados proporcionan evidencia de que la incubación con MK-4166 y MK3475 disminuye el número de Treg inducidos por MLR, aumenta la relación CD8:Treg y disminuye la función inhibidora de Treg humanos in vitro.

La tabla 2 proporciona una breve descripción de las secuencias en el listado de secuencias

continuación

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación de un antagonista de PD-1 que es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a PD-1 y un agonista de GITR que es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a GITR para usar en un método de tratamiento de un tumor en un paciente, en donde el antagonista de PD-1 y el agonista de GITR se administran simultánea o secuencialmente.

2. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde

a. el antagonista de PD-1 es MK3475; y

b. el agonista de GITR es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a GITR, que comprende una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 82

y

una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 81.

3. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el agonista de GITR es un anticuerpo.

4. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo agonista de GITR está humanizado.

5. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antagonista de PD-1 es MK-3475.

6. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el agonista de GITR es un anticuerpo que comprende:

un dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 82 en donde el aminoácido 31 es Q y el aminoácido 57 es Q; y un dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es la secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 81.

7. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antagonista de PD-1 y el agonista de GITR se administran simultánea o secuencialmente al menos una vez.

8. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antagonista de PD-1 y el agonista de GITR se administran simultánea o secuencialmente al menos 2 veces.

9. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tumor es un tumor en estadio avanzado.

10. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el tumor en estadio avanzado se selecciona del grupo que consiste en cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, glioma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, carcinoma hepático, hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, mieloma, mieloma múltiple, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, tumor de Wilms, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular y cáncer de esófago.

11. Un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo para usar en el tratamiento de un tumor en un paciente, que comprende un primer brazo que se une a PD-1 o PD-L1 y antagoniza la actividad de PD-1 que es un fragmento de unión a antígeno de MK-3475, y un segundo brazo que se une a GITR y agoniza la actividad de GITR que es un fragmento de unión a antígeno que comprende una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 82 y una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 81.

12. El anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 13. en donde el segundo brazo tiene:

a) un dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 81; y

b) un dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 82, en donde el aminoácido 31 es Q y el aminoácido 57 es Q.

13. El anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el tumor es un tumor en estadio avanzado.

14. El anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el tumor en estadio avanzado se selecciona del grupo que consiste en cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, glioma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, carcinoma hepático, hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, mieloma, mieloma múltiple, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, tumor de Wilms, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular y cáncer de esófago.

15. Una combinación farmacéutica que comprende un antagonista de PD-1 y un agonista de GITR, en donde: a) el antagonista de PD-1 es MK-3475, y

b) el agonista de GITR es un anticuerpo que comprende:

la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 82; y

la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 81.

16. La combinación farmacéutica de la reivindicación 15, en donde la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos se establece en el SEQ ID NO: 82, en donde el aminoácido 31 es Q y el aminoácido 57 es Q.

17. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antagonista de PD-1 es BMS-936558.