TW201545758A

TW201545758A - 腫瘤免疫力之調節

Info

Publication number: TW201545758A
Application number: TW103128185A
Authority: TW
Inventors: Danling Gu; Amy M Beebe
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2013-08-20
Filing date: 2014-08-15
Publication date: 2015-12-16
Also published as: DK3036256T3; EP3770175A3; MA38814A1; IL243986A0; CA2921561C; PT3036256T; CL2016000354A1; CY1123647T1; EP3036256B1; MX360789B; WO2015026684A1; GT201600036A; US10188729B2; CR20160086A; JO3553B1; MY187075A; EA201690429A1; MD20160024A2; MX2016002271A; GEP20186905B

Abstract

本發明闡述治療增殖病症之方法。具體而言，提供利用GITR激動劑及PD-1拮抗劑之組合治療。

Description

腫瘤免疫力之調節

本發明係關於在晚期腫瘤之治療中腫瘤免疫力之調節。具體而言，本發明提供PD-1之拮抗劑與GITR之激動劑的組合以增強晚期腫瘤之抗腫瘤反應。

腫瘤微環境係癌症生物學之重要態樣，其促成腫瘤起始、腫瘤進展及對療法之反應。免疫系統之細胞及分子係腫瘤微環境之基本組份。重要的是，治療策略可利用免疫系統以特定靶向腫瘤細胞且此由於誘導腫瘤特異性免疫記憶之可能性而特別有吸引力，此可引起持久消退且防止癌症患者中之復發。

腫瘤微環境之組成及特性寬泛地變化且在測定抗腫瘤免疫反應中甚為重要。舉例而言，免疫系統之某些細胞(包括自然殺傷細胞、樹突細胞(DC)及效應T細胞)能夠驅動強效抗腫瘤反應。然而，腫瘤細胞通常誘導免疫阻抑微環境，其支持免疫細胞(例如進髓源性阻抑細胞及調控性T細胞)之免疫阻抑群體的發展。瞭解腫瘤之免疫調節之複雜性對於免疫療法之開發甚為重要。已開發各種策略來增強抗腫瘤免疫反應，包括基於DC之疫苗及抑制信號傳導途徑之拮抗劑以克服「免疫檢查點」。

糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)(TNFR超家族之成員)表現於先天性及適應性免疫系統之許多組份中(參見例如Hanabuchi等人，(2006)Blood 107：3617-3623；及Nocentini及Riccardi(2005)Eur.J.Immunol.2005.35：1016-1022)。其膜表現在T細胞活化之後增加(Hanabuchi，如上所述；及Nocentini及Riccardi，如上所述)；其觸發共活化效應子T淋巴球並調節調控性T細胞(Treg)活性(參見例如McHugh等人，(2002)Immunity 2002.16：311-323；Shimizu等人，(2002)Nat.Immunol.3：135-142；Ronchetti等人，(2004)Eur.J.Immunol.34：613-622；及Tone等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：15059-15064)。

GITR係藉由GITR配體(GITRL)活化，該GITR配體主要表現於APC上且已建議藉由其胞質結構域遞送信號，但需要進一步研究以定義生物化學信號傳導(Nocentini，如上所述；Ronchetti，如上所述；Suvas等人，(2005)J.Virol.79：11935-11942；及Shin等人，(2002)Cytokine 19：187-192)。

GITR活化增加對腫瘤及病毒感染之抗性，涉及自體免疫/發炎過程且調控白血球外滲(Nocentini，如上所述；Cuzzocrea等人，(2004)J.Leukoc.Biol.76：933-940；Shevach等人，(2006)Nat.Rev.Immunol.6：613-618；Cuzzocrea等人，(2006)J.Immunol.177：631-641；及Cuzzocrea等人，(2007)FASEB J.21：117-129)。在腫瘤小鼠模型中，激動劑GITR抗體DTA-1與拮抗劑CTLA-4抗體組合，且在一些測試群組小鼠中在晚期階段腫瘤之完全腫瘤消退中顯示協同作用結果(Ko等人，(2005)J.Exp.Med.7：885-891)。

程式性死亡受體1(PD-1)係主要表現於經活化T及B細胞上之免疫抑制受體。其與其配體之相互作用已顯示在活體外及活體內二者減弱T-細胞反應。PD-1與其配體中之一者PD-L1間之相互作用的阻滯已顯示增強腫瘤特異性CD8+T-細胞免疫力且因此可有助於藉由免疫系統清除腫瘤細胞。

PD-1(由基因Pdcd1編碼)係與CD28及CTLA-4相關之免疫球蛋白超家族成員。PD-1已顯示在其配體(PD-L1及/或PD-L2)結合時負性調控抗原受體信號傳導。已經解析出鼠科動物PD-1之結構以及小鼠PD-1與人類PD-L1之共晶體結構(Zhang,X.等人，(2004)Immunity 20：337-347；Lin等人，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：3011-6)。PD-1及類似家族成員係I型跨膜糖蛋白，其含有負責配體結合之Ig可變型(V型)結構域及負責信號傳導分子結合之胞質尾部。PD-1之胞質尾部含有兩個基於酪胺酸之信號傳導基序，即，ITIM(基於免疫受體酪胺酸之抑制基序)及ITSM(基於免疫受體酪胺酸之切換基序)。

在人類中，已於藉由免疫組織化學分析之許多原發性腫瘤活體組織切片中發現PD-1(在腫瘤浸潤淋巴球)及/或PD-L1(於腫瘤細胞上)之表現。該等組織包括肺癌、肝臟癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、結腸癌、神經膠質瘤癌、膀胱癌、乳癌、腎癌、食道癌、胃癌、口腔鱗狀上皮細胞癌，泌尿道上皮細胞癌及胰臟癌以及頭頸腫瘤(Brown,J.A.等人，(2003)J.Immunol.170：1257-1266；DongH.等人，(2002)Nat.Med.8：793-800；Wintterle等人，(2003)Cancer Res.63：7462-7467；Strome,S.E.等人，(2003)Cancer Res.63：6501-6505；Thompson,R.H.等人，(2006)Cancer Res.66：3381-5；Thompson等人，(2007)Clin.Cancer Res.13：1757-61；Nomi,T.等人，(2007)Clin.Cancer Res.13：2151-7)。更突出地，PD配體在腫瘤細胞上之表現已經與癌症患者在多種腫瘤類型範圍內之差預後相關聯(論述於Okazaki及Honjo,(2007)Int.Immunol.19：813-824中)。

迄今為止，許多研究已顯示PD-1與其配體(PD-L1及PD-L2)之相互作用在活體外及活體內均導致淋巴球增殖之抑制。

PD-1/PD-L1相互作用之阻滯將導致增強之腫瘤特異性T-細胞免疫力且有助於藉由免疫系統清除腫瘤細胞。為解決此問題，實施了許多研究。在侵略性胰臟癌之鼠科動物模型(Nomi,T.等人，(2007)Clin.Cancer Res.13：2151-2157)中，證明瞭PD-1/PD-L1阻滯之治療功效。投與PD-1或PD-L1定向抗體顯著抑制腫瘤生長。抗體阻滯有效促進腫瘤反應性CD8+ T細胞浸潤至腫瘤中，此導致抗腫瘤效應子(包括IFNγ、顆粒酶B及穿孔蛋白)之上調。另外，作者顯示PD-1阻滯可有效地與化學療法組合以獲得協同作用效應。在另一研究中，使用小鼠中之鱗狀細胞癌模型，PD-1或PD-L1之抗體阻滯顯著抑制腫瘤生長(Tsushima,F.等人，(2006)Oral Oncol.42：268-274)。

業內需要藉由使用調節腫瘤免疫力之藥劑用於治療免疫及增殖性病症(例如腫瘤及癌症)之改良方法及組合物。本發明藉由提供PD-1之拮抗劑與GITR之激動劑的組合用以治療晚期階段腫瘤來滿足此需求。

本發明藉由提供治療患者之腫瘤的方法滿足此項技術中之該等需求且甚至更多，該方法包含向患者投與PD-1拮抗劑及GITR激動劑，其中PD-1拮抗劑及GITR激動劑係同時或依序投與。在某些實施例中，PD-1拮抗劑係結合PD-1或PD-L1之抗體或其抗原結合片段；且GITR激動劑係結合GITR之抗體或其抗原結合片段。GITR激動劑及PD-1或PD-L1拮抗劑結合至人類蛋白質。抗體或其結合片段經人類化或係全人類的。

在其他實施例中，PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群：BMS-936558、MK-3475及MPDL3280A；且GITR激動劑係選自由以下組成之群：具有SEQ ID NO：1-66之至少一個CDR之抗體；TRX518；及TRX385。GITR激動劑可為具有以下之抗體：SEQ ID NO：1-11之重鏈CDR1、SEQ ID NO：12-22之CDR2及SEQ ID NO：23-33之CDR3；及/或SEQ ID NO：34-44之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：45-55之CDR2及SEQ ID NO：56-66之CDR3。在又一實施例中，GITR激動劑係具有以下之抗體：SEQ ID NO：67、69、71、73、75、77、79、81、83、85及87之可變重鏈；及/或SEQ ID NO：68、70、72、74、76、78、80、82、84、86及88之可變輕鏈。

本發明亦涵蓋PD-1拮抗劑及GITR激動劑同時投與至少1次。在某些實施例中，PD-1拮抗劑及GITR激動劑同時投與至少2次。在某些實施例中，腫瘤係晚期階段腫瘤且可選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(例如肝腫瘤及肝細胞瘤)、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、唾液腺癌、腎癌(例如腎細胞癌及威爾姆斯腫瘤(Wilms' tumor))、基底細胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睾丸癌及食道癌。

本發明提供藉由向患者投與雙特異性抗體治療腫瘤之方法，該抗體包含結合至PD-1或PD-L1且拮抗PD-1活性之第一臂及結合至GITR且激動GITR活性之第二臂。在某些實施例中，第一臂係選自由以下組成之群：來自BMS-936558、MK-3475及MPDL3280A之抗原結合片段；且第二臂係選自由以下組成之群：來自具有SEQ ID NO：1-66之至少一個CDR之抗體；TRX518；及TRX385之抗原結合片段。在又一實施例中，第二臂具有SEQ ID NO：1-11之重鏈CDR1、SEQ ID NO：12-22之CDR2及SEQ ID NO：23-33之CDR3；及/或SEQ ID NO：34-44之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：45-55之CDR2及SEQ ID NO：56-66之CDR3。在某些實施例中，第二臂具有SEQ ID NO：67、69、71、73、75、77、79、81、83、85及87之可變重鏈；及/或SEQ ID NO：68、70、72、74、76、78、80、82、84、86及88之可變輕鏈。

本發明提供治療腫瘤之方法，其中該腫瘤係晚期階段腫瘤。在某些實施例中，晚期階段腫瘤係選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(例如肝腫瘤及肝細胞瘤)、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、唾液腺癌、腎癌(例如腎細胞癌及威爾姆斯腫瘤)、基底細胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睾丸癌及食道癌。

本發明提供包含PD-1拮抗劑及GITR激動劑之醫藥組合物。亦提供PD-1拮抗劑與GITR激動劑之組合治療晚期階段腫瘤之用途。

圖1A-1K顯示抗GITR抗體單獨或與抗PD-1抗體組合投藥對植入有MC38細胞株之小鼠(n=10/群組)的抗腫瘤反應的效應。當腫瘤達到240-360mm³時開始治療。

圖2A-2F顯示單一劑量之抗GITR抗體、隨後一週後單一劑量之抗PD-1抗體(圖2B)或以相反序列(圖2C)之抗腫瘤功效。將此與任一種抗體單獨(圖2E-2F；n=10/群組)相比較。

圖3A-3D顯示在CT26腫瘤模型(n=10/群組)中抗GITR或抗PD-1抗體單獨之單一療法(圖3C-3D)與兩種抗體共同投與(圖3A)相比較之抗腫瘤功效。

圖4A-4D顯示單獨投藥之抗GITR及抗PD-1抗體或兩種抗體同時投與對植入有MB49細胞株之小鼠(n=10/群組)的抗腫瘤反應之效應。當腫瘤達到85-122mm³時開始治療。

圖5A-5B顯示在混合淋巴球反應(MLR)中抗GITR(MK-4166)與抗PD-1(MK-3475)之組合對Treg(圖5A)及Treg：CD8細胞比率(圖5B)之劑量依賴效應。

圖6顯示與MK-4166與MK-3475之組合一起培育使得在MLR中Treg之阻抑活性降低。

如本文(包括隨附申請專利範圍)所用，除非上下文明確表指示，否則單詞之單數形式(例如「一(a、an)」及「該(the)」)包括其相應複數個指示物。下表15提供本申請案中所用序列識別符之列表。本文所引用之所有參考文獻均以引用的方式併入本文中，其併入程度如同每一個別出版物、數據庫條目(例如，GenBank序列或GeneID條目)、專利申請案或專利均特別且個別地指示以引用的方式併入本文中一般。本文中參考文獻之音樂並不意欲承認上述中之任一者係相關先前技術，其亦不欲構成對該等出版物或文件之內容或日期之任何承認。

I.定義

如本文所用，術語「糖皮質激素誘導之TNF受體」(在本文中縮寫為「GITR」)(亦稱為TNF受體超家族18(TNFRSF18)、TEASR及312C2)係指腫瘤壞死因子/神經生長因子受體家族之成員。GITR係以胞外結構域中之三個半胱胺酸假重複為特徵之241胺基酸I型跨膜蛋白且特定保護T-細胞受體誘導之細胞凋亡，但其並不保護細胞免於其他細胞凋亡信號，包括Fas觸發、地塞米松(dexamethasone)治療或UV輻射(Nocentini,G.等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：6216-622)。人類GITR(hGITR)(其存在三種剪接變體)之核酸及胺基酸序列係已知的且可在(例如)GenBank登錄號gi：40354198、gi：23238190、gi：23238193及gi：23238196中找到。

「GITR激動劑」意指藉助GITR信號傳導之活化刺激免疫反應之任何化學化合物或生物分子。激動劑抗GITR抗體之序列以及TRX-385及TRX-518提供於WO2011/028683及WO2006/105021中。亦涵蓋可溶性GITR-L蛋白質，一種GITR結合配偶體。

「PD-1拮抗劑」意指阻斷表現於癌症細胞上之PD-L1與表現於免疫細胞(T細胞、B細胞或NKT細胞)上之PD-1的結合且較佳亦阻斷表現於癌症細胞上之PD-L2與免疫細胞表現之PD-1的結合的任何化學化合物或生物分子。PD-1及其配體之替代名稱或同義詞包括：對於PD-1而言程式性死亡受體1；PDCD1、PD1、CD279及SLEB2；對於PD-L1而言PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274及B7-H；且對於PD-L2而言程式性死亡受體配體1、PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc及CD273。在本發明其中治療人類個體之治療方法、醫藥及用途中之任一者中，PD-1拮抗劑阻斷人類PD-L1與人類PD-1之結合，且較佳阻斷人類PD-L1與PD-L2二者與人類PD-1之結合。人類PD-1胺基酸序列可在NCBI位點編號：NP_005009中發現。人類PD-L1及PD-L2胺基酸序列可分別在NCBI位點編號：NP_054862及NP_079515中發現。

可用於本發明之治療方法、醫藥及用途中之任一者之PD-1拮抗劑包括單株抗體(mAb)或其抗原結合片段，其特異性結合至PD-1或PD-L1、且較佳地特異性結合至人類PD-1或人類PD-L1。mAb可為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體，且可包括人類恆定區。在一些實施例中，人類恆定區係選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4恆定區，且在較佳實施例中，人類恆定區係IgG1或IgG4恆定區。在一些實施例中，抗原結合片段係選自由以下組成之群：Fab、Fab'-SH、F(ab')₂、scFv及Fv片段。

結合至人類PD-1且可用於本發明之治療方法、醫藥及用途中之mAb的實例闡述於US7521051、US8008449及US8354509中。在本發明之治療方法、醫藥及用途中可用作PD-1拮抗劑之特定抗人類PD-1 mAb包括：MK-3475，一種具有闡述於WHO Drug Information，第27卷，第2期，第161-162頁(2013)中之結構且包含圖6中所示重鏈及輕鏈胺基酸序列之人類化IgG4 mAb；尼沃單抗(nivolumab)(BMS-936558)，一種具有闡述於WHO Drug Information，第27卷，第1期，第68-69頁(2013)中之結構且包含圖7中所示重鏈及輕鏈胺基酸序列之人類IgG4 mAb；普迪利珠單抗(pidilizumab)(CT-011，亦稱為hBAT或hBAT-1)；及人類化抗體h409A11、h409A16及h409A17，其闡述於WO2008/156712中。

結合至人類PD-L1且可用於本發明之治療方法、醫藥及用途中之mAb之實例闡述於WO2013/019906、W02010/077634 A1及US8383796中。在本發明之治療方法、醫藥及用途中可用作PD-1拮抗劑之特定抗人類PD-L1 mAb包括MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB0010718C及分別包含WO2013/019906之SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：21之重鏈及輕鏈可變區的抗體。

如本文所用，術語「投與」係指包含GITR激動劑及至少一種額外癌症治療劑(例如PD-1拮抗劑)之組合物物理引入至患癌症之患者中。根據本發明涵蓋任一及所有引入方法；該方法並不依賴於任一具體之引入方式。引入方式已為熟悉此項技術者所熟知，其實例提供於本文中。

如本文所用，術語「共同投與」意指將GITR激動劑與至少一種額外癌症治療劑(例如PD-1拮抗劑)之組合投與給同一患者之過程。GITR激動劑及PD-1拮抗劑可同時或依序投與。若投與係依序實施，則GITR激動劑及/或PD-1拮抗劑可在既定額外癌症治療劑或治療之前或之後投與。GITR激動劑及PD-1拮抗劑治療不需要借助相同媒劑投與。GITR激動劑及PD-1拮抗劑可投與一或多次且組合之每一組份的投與數量可相同或不同。另外，GITR激動劑及PD-1拮抗劑不需要在同一位點投與。

如本文所用，術語「治療有效量」或「治療有效組合」係指足以調節(例如刺激)個體之全身免疫反應之GITR激動劑之量或劑量連同額外藥劑或治療(例如PD-1拮抗劑)之量或劑量。對於不同個體及不同腫瘤類型，既定治療有效組合中每一分子之量可不同，且將取決於組合中所包括之一或多種額外藥劑或治療。「治療有效量」係使用熟悉此項技術者經常採用之程序測定，使得產生「經改良之治療結果」。

如本文所用，涉及癌症之術語「經改良之治療結果」及「增強之治療功效」係指減緩或減少癌症細胞或實體腫瘤之生長或降低癌症細胞之總數量或總腫瘤負荷。因此，「經改良之治療結果」或「增強之治療功效」在本文中意指根據任一臨床上可接受之準則患者狀況之改良，包括(例如)減小之腫瘤大小、至腫瘤進展之時間增加、增加之無進展存活、增加之總體存活時間、預期壽命增加或生活品質改良。具體而言，「改良」或「增強」係指治療結果或功效之任一臨床上可接受之指標1%、5%、10%、25%50%、75%、100%或大於100%的改良或增強。

如本文所用，術語「抗體」係指展現期望生物活性之任一形式的抗體。因此，其以最寬廣意義使用且特定涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、嵌合抗體、人類化抗體、全人類抗體等，只要其展現期望之生物活性即可。

如本文所用，術語「GITR、PD-1或PD-L1結合片段」、「其結合片段」或「其抗原結合片段」涵蓋實質上仍保留其誘導GITR信號傳導之生物活性(在本文中稱為「GITR誘導活性」)之抗體的片段或衍生物。另一選擇為，PD-1或PD-L1結合片段涵蓋抑制PD-1活性(例如結合至PD-L1或PD-L2)之抗體的片段或衍生物。術語「抗體片段」或GITR、PD-1或PD-L1結合片段係指全長抗體之一部分、通常其抗原結合或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂及Fv片段；雙鏈抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如sc-Fv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。通常，結合片段或衍生物保留其GITR激動劑活性之至少10%。較佳地，結合片段或衍生物保留其GITR激動劑或PD-1拮抗劑活性之至少25%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或 100%(或更多)，但具有足夠親和力以發揮期望生物效應之任一結合片段將係有用的。亦期望GITR、PD-1或PD-L1結合片段可包括具有不會實質上改變其生物活性之保守胺基酸取代的變體。

如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群體獲得之抗體，即，除可能存在極少量天然存在之突變外，構成該群體之個別抗體均相同。單株抗體具有高度特異性，針對單一抗原位點。與此相反，習用(多株)抗體製劑通常包括大量針對(或特異性用於)不同表位之抗體。修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上同源之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任一特定方法來產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由首次由Kohler等人，(1975)Nature 256：495闡述之融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法製得(參見例如美國專利第4,816,567號)。「單株抗體」亦可自噬菌體抗體庫使用(例如)Clackson等人，(1991)Nature 352：624-628及Marks等人，(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中所闡述之方法分離。

本文中之單株抗體特定而言包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬特定抗體類別或亞類之抗體的對應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬另一抗體類別或亞類之抗體的對應序列相同或同源；以及此等抗體之片段，只要其展現期望之生物活性即可。美國專利第4,816,567號；Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855。

「結構域抗體」係僅含有重鏈之可變區或輕鏈之可變區的免疫功能免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或更多個V_H區與肽鏈接體共價接合以產生二價結構域抗體。二價結構域抗體之兩個V_H區可靶向相同或不同抗原。

「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性(參見下文)。

如本文所用，術語「單鏈Fv」或「scFv」抗體係指包含抗體之V_H及V_L結構域的抗體片段，其中該等結構域存在於單一多肽鏈中。通常，Fv多肽進一步包含V_H結構域與V_L結構域之間之多肽鏈接體，其使scFv能形成用於抗原結合之期望結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York，第269-315頁。

本文之單株抗體亦包括駱駝化單一結構域抗體。「結構域抗體片段」係僅含有重鏈之可變區或輕鏈之可變區的免疫功能免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或更多個V_H區與肽鏈接體共價接合以產生多價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段之兩個V_H區可靶向相同或不同抗原。參見例如Muyldermans等人，(2001)Trends Biochem.Sci.26：230；Reichmann等人，(1999)J.Immunol.Methods 231：25；WO 94/04678；WO 94/25591；美國專利第6,005,079號)。在一個實施例中，本發明提供包含兩個V_H結構域之單一結構域抗體，其具有修飾使得形成單一結構域抗體。

如本文所用，術語「雙鏈抗體」係指具有2個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈(V_H-V_L或V_L-V_H)中與輕鏈可變結構域(V_L)連接之重鏈可變結構域(V_H)。藉由使用過短而不允許在同一鏈上之兩個結構域之間配對之鏈接體，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。雙鏈抗體更詳細闡述於(例如)EP 404,097；WO 93/11161；及Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中。關於工程化抗體變體之綜述，通常參見Holliger及Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。

如本文所用，術語「人類化抗體」係指含有來自非人類(例如，鼠科動物)抗體以及人類抗體之序列的抗體形式。該等抗體含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列。通常，人類化抗體將包含實質上全部的至少一個且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部超變環對應於非人類免疫球蛋白之超變環，且全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體視情況亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常為人類免疫球蛋白恆定區)的至少一部分。當需要區分人類化抗體與親代齧齒類動物抗體時，將前綴「hum」、「hu」或「h」添加至抗體純系名稱。齧齒類動物抗體之人類化形式通常將包含親代齧齒類動物抗體之相同CDR序列，但可包括某些胺基酸取代以增加親和力、增加人類化抗體之穩定性或用於其他原因。

術語「全人類抗體」係指僅包含人類免疫球蛋白序列之抗體。若全人類抗體係在小鼠、小鼠細胞或源自小鼠細胞之融合瘤中產生，則其可含有鼠科動物碳水化合物鏈。同樣地，「小鼠抗體」或「大鼠抗體」係指僅分別包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列之抗體。全人類抗體可在人類、在具有人類免疫球蛋白生殖系序列之轉基因動物中藉由噬菌體展示或其他分子生物方法生成。可用於製造抗體之實例性技術闡述於美國專利：6,150,584；6,458,592；6,420,140中。其他技術(例如使用文庫)已為此項技術熟知。

本發明之抗體亦包括具有經修飾(或阻斷)Fc區以提供改變之效應子功能之抗體。參見例如美國專利第5,624,821號；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702；Presta(2006)Adv.Drug Delivery Rev.58：640-656。該修飾可用於增強或阻抑免疫系統之各種反應，其在診斷及療法中具有可能有益之效應。Fc區之改變包括胺基酸變化(取代、刪除及插入)、糖基化或去糖基化及添加多個Fc。Fc之變化亦可改變治療性抗體中之抗體半衰期，且較長的半衰期將產生較不頻繁的投藥，隨之而來的具有增加之便利性且減小之材料使用。參見 Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731於第734-35頁處。

本發明之抗體亦包括具有完整Fc區提供完整效應子功能之抗體，例如同型IgG1之抗體，其在靶向細胞中誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。

本發明之抗體亦包括偶聯至細胞毒性負載(例如細胞毒性劑或放射性核素)之抗體。該等抗體偶聯物可與抗GITR、抗PD-1或抗PD-L1治療聯合用於免疫療法中，以選擇性靶向並殺死在其表面上表現某些抗原之細胞。實例性細胞毒性劑包括蓖麻毒素、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、胺甲蝶呤、綠膿桿菌外毒素(Psuedomonas exotoxin)、皂草素、白喉毒素、順鉑、多柔比星(doxorubicin)、相思豆毒素、白樹毒素及美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)。與本發明之抗體用於免疫療法中之實例性放射性核素包括¹²⁵I、¹³¹I、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹¹At、¹⁷⁷Lu、¹⁴³Pr及²¹³Bi。參見例如美國專利申請公開案第2006/0014225號。

雙特異性抗體亦可用於本發明方法及組合物中。如本文所用，術語「雙特異性抗體」係指具有針對至少兩個不同之抗原表位之結合特異性之抗體、通常單株抗體。在一個實施例中，表位係來自相同抗原。在另一實施例中，表位係來自兩個不同抗原。製造雙特異性抗體之方法已為此項技術所知。舉例而言，雙特異性抗體可以重組方式使用兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共表現來產生。參見例如Milstein等人，(1983)Nature 305：537-39。另一選擇為，雙特異性抗體可使用化學鏈接來製備。參見例如Brennan等人，(1985)Science 229：81。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片段。參見例如Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48,Gruber等人，(1994)J.Immunol.152：5368。

術語「多特異性」包括對一個以上之靶標抗原具有特異性之結合分子。該等分子具有一個以上結合位點，其中每一結合位點特異性結合(例如，與其免疫反應)不同靶標分子或同一靶標上之不同抗原位點。在一個實施例中，本發明之多特異性結合分子係對至少兩個靶標(例如一個以上靶標分子或同一靶標分子上之一個以上表位)具有結合特異性之雙特異性分子(例如，抗體、微型抗體、結構域缺失抗體或融合蛋白)。

如本文所用，術語「超變區」係指負責抗原結合之抗體胺基酸殘基。超變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如輕鏈可變結構域中之殘基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)及89-97(CDRL3)及重鏈可變結構域中之殘基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)及95-102(CDRH3)(Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)及/或來自「超變環」之殘基(例如，輕鏈可變結構域中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變結構域中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。如本文所用，術語「框架」或「FR」殘基係指彼等不同於本文定義為CDR殘基之超變區殘基的可變結構域殘基。以上殘基編號涉及Kabat編號系統。

「結合化合物」係指能夠結合至靶標之分子、小分子、巨分子、多肽、抗體或其片段或類似物或可溶性受體。「結合化合物」亦可指能夠結合至靶標之分子複合物(例如非共價複合物)、電離分子及共價或非共價修飾之分子(例如藉由磷酸化、醯化、交聯、環化或有限裂解修飾)。當關於抗體使用時，術語「結合化合物」係指抗體及其抗原結合片段二者。「結合」係指結合組合物與靶標之締合，其中在結合組合物可溶解或懸浮於溶液中之情形中，締合使得結合組合物之正常布朗運動(Brownian motion)降低。「結合組合物」係指與穩定劑、賦形劑、鹽、緩衝劑、溶劑或添加劑組合且能夠結合至靶標之分子(例如結合化合物)。

如本文所用，「保守修飾變體」或「保守取代」係指熟悉此項技術者已知之胺基酸取代且通常甚至可在抗體之必需區中進行而不改變所得抗體之生物活性。該等實例性取代較佳根據下表1中所述進行：

熟悉此項技術者應認識到，一般而言，在多肽之非必需區中之單一胺基酸取代不會實質上改變生物活性。參見例如Watson等人，(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.公司，第224頁(第4版)。

如整個說明書及申請專利範圍所用，片語「基本上由...組成(consists essentially of)」或變化形式(例如「consist essentially of」或「consisting essentially of」)指示包括任何所列舉之成份或成份群組，且視情況包括具有與所列舉之成份類似或不同性質且不會實質上改變特定劑量方案、方法或組合物之基本或新穎性質之其他成份。作為非限制性實例，基本上由所列舉胺基酸序列組成之結合化合物亦可包括一或多種不會實質上影響結合化合物之性質的胺基酸(包括一或多種胺基酸殘基之取代)。

「免疫病況」或「免疫病症」涵蓋(例如)病理性發炎、發炎病症及自體免疫病症或疾病。「免疫病況」亦係指感染、持續性感染及增殖病況(例如癌症、腫瘤及血管生成)，包括由免疫系統抵抗消滅之感染、腫瘤及癌症。「癌性病況」包括(例如)癌症、癌症細胞、腫瘤、血管生成及癌症前期病況(例如發育不良)。

「增殖活性」涵蓋促進(例如)正常細胞分裂、以及癌症、腫瘤、發育不良、細胞轉化、轉移及血管生成、為其所需或特定與其相關之活性。

術語「癌症」、「腫瘤」、「癌性」及「惡性」係指或闡述哺乳動物中通常特徵在於細胞生長失調之生理學病況。癌症之實例包括(但不限於)癌(包括腺癌)、淋巴瘤、胚細胞瘤、黑素瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、霍奇金氏(Hodgkin's)及非霍奇金氏淋巴瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(例如肝腫瘤及肝細胞瘤)、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、唾液腺癌、腎癌(例如腎細胞癌及威爾姆斯腫瘤)、基底細胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睾丸癌、食道癌及各種類型之頭頸癌。

隨著癌細胞生長並繁殖，其形成大量癌組織(即，腫瘤)，其侵襲並破壞正常的毗鄰組織。惡性腫瘤係癌症。惡性腫瘤通常可移除，但其可重新長出。來自惡性腫瘤之細胞可侵襲並損害附近組織及器官。而且，癌症細胞可自惡性腫瘤脫離並進入血液或淋巴系統，此係癌症細胞自原發性腫瘤(即，初始癌症)擴散以在其他器官中形成新腫瘤之途徑。癌症在體內之擴散稱為轉移(What You Need to Know About Cancer- an Overview,NIH Publication No.00-1566；2000年9月26日公開，2002年9月16日更新(2002))。

如本文所用，術語「實體腫瘤」係指通常不含有囊或液體區域之組織之異常生長或團塊。實體腫瘤可為良性(非癌性)或惡性的(癌性)。不同類型之實體腫瘤針對形成其之細胞類型來命名。實體腫瘤之實例係肉瘤、癌及淋巴瘤。白血病(血液癌)通常不會形成實體腫瘤(National Cancer Institute,Dictionary of Cancer Terms)。

「腫瘤負荷(Tumor burden)」亦稱為「腫瘤負荷(tumor load)」，係指分佈於整個體內之腫瘤物質之總量。腫瘤負荷係指整個體內之癌症細胞總量或腫瘤之總大小，包括淋巴結及骨髓。腫瘤負荷可藉由各種此項技術中已知之方法測定，例如當腫瘤自個體移除時(例如)使用卡尺、或當在體內時使用成像技術(例如超音波、骨掃描、電腦斷層攝影(CT)或磁共振成像(MRI)掃描)量測其尺寸。

術語「腫瘤大小」係指腫瘤之總大小，其可量測為腫瘤之長度及寬度。腫瘤大小可藉由各種此項技術中已知之方法測定，例如當腫瘤自個體移除時(例如)使用卡尺、或當在體內時使用成像技術(例如骨掃描、超音波、CT或MRI掃描)量測其尺寸。

如本文所用，術語「原發性癌」係指初始腫瘤或第一腫瘤。癌症可在身體之任何器官或組織中開始。其通常針對身體之部分或其發源之細胞類型來命名(Metastatic Cancer：Questions and Answers,Cancer Facts 6.20,National Cancer Institute,2004年9月1日(2004))。

如本文所用，術語「原位癌」係指仍含於其開始生長之組織內且還未變得具有侵襲性或擴散至身體之其他部分之癌細胞。

如本文所用，術語「癌」係指上皮細胞之癌症，其係覆蓋身體之表面、產生激素且構成腺體之細胞。癌之實例係皮膚癌、肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、前列腺癌及甲狀腺癌。

如本文所用，術語「經分離核酸分子」係指自至少一種污染物核酸分子鑑別並分離之核酸分子，其在抗體核酸之天然來源中通常與該污染物核酸分子相結合。經分離之核酸分子不為其在自然界中發現之形式或設置。因此，經分離之核酸分子與存於天然細胞中之核酸分子不同。然而，經分離之核酸分子包括通常表達抗體之細胞中所含之核酸分子，其中(例如)核酸分子位於不同於天然細胞之染色體位置中。

表述「控制序列」係指在特定宿主有機體內涉及可操作地鏈接之編碼序列的表現的DNA序列。舉例而言，適用於原核生物之控制序列包括啟動子、視情況操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞可使用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。

在使核酸與另一核酸序列具有功能性關係時，該核酸係「可操作地鏈接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該DNA可操作地鏈接至該多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操作地鏈接至該序列；或若核糖體結合位點經定位以促進轉譯，則該核糖體結合位點可操作地鏈接至編碼序列。通常，「可操作地鏈接」意指所鏈接DNA序列係鄰接序列，且在分泌前導序列情形下係鄰接序列且位於閱讀框內。然而，增強子無需鄰接。鏈接係藉由在便利的限制位點處接合來實現。若不存在該等位點，則根據習用慣例使用合成性寡核苷酸銜接子或鏈接體。

如本文所用，表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用，且所有此等名稱皆包括子代。因此，詞語「轉化體」及「轉化細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物而不考慮轉移次數。亦應瞭解，所有子代之DNA含量可能由於有意或無意突變而不精確地相同。其包括與原始轉化細胞中所篩選者具有相同功能或生物活性之突變子代。倘若意欲使用不同名稱，則其可自上下文明了。

如本文所用，「聚合酶鏈反應」或「PCR」係指使微量核酸、RNA及/或DNA之特定片段擴增之程序或技術，如(例如)美國專利第4,683,195號中所述。一般而言，需要獲得來自所關注區域之末端或另一端之序列資訊，使得可設計寡核苷酸引物；該等引物的序列將與欲擴增之模板的相反鏈相同或相似。兩個引物之5'端核苷酸可與所擴增物質之末端一致。PCR可用於擴增特定RNA序列、來自全基因組DNA之特定DNA序列及自總細胞RNA、細菌噬菌體或質粒序列轉錄之cDNA等。通常參見Mullis等人，(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。如本文所用，將PCR視為用於擴增核酸測試樣品之核酸聚合酶反應方法的一個(但非唯一)實例，其包含使用已知核酸作為引物及核酸聚合酶以擴增或生成核酸之特定片段。

如本文所用，術語「生殖系序列」係指一系列未重排之免疫球蛋白DNA序列，包括齧齒類動物(例如小鼠)及人類生殖系序列。可使用未重排免疫球蛋白DNA之任一適宜源。可在美國國家衛生研究院之關節炎及肌肉骨骼及皮膚病國家研究院(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes of Health)之網站上自(例如)JOINSOLVER^®生殖系數據庫獲得人類殖系序列。小鼠生殖系序列可如Giudicelli等人，(2005)Nucleic Acids Res.33：D256-D261中所述獲得。

為檢查(例如)GITR活性之增強程度，將包含既定(例如)蛋白質、基因、細胞或有機體之樣品或分析用試樣用潛在活化或抑制劑處理並與用非活性對照分子處理之對照樣品相比較。對照樣品指派100%之相對活性值。當相對於對照之活性值為以下時達成抑制：約90%或以下、通常85%或以下、更通常80%或以下、最通常75%或以下、一般地70%或以下、更一般地65%或以下、最一般地60%或以下、通常55%或以下、經常50%或以下、更經常45%或以下、最經常40%或以下、較佳35%或以下、更佳30%或以下、再更佳25%或以下且最佳小於20%。當相對於對照之活性值為以下時達成活化：約110%、一般地至少120%、更一般地至少140%、更一般地至少160%、時常至少180%、更時常至少2倍、最時常至少2.5倍、經常至少5倍、更經常至少10倍、較佳至少20倍、更佳至少40倍且最佳超過40倍。

活化或抑制之終點可如下監測。舉例而言，細胞、生理液、組織、器官及動物或人類個體之活化、抑制及對治療之反應可藉由終點監測。終點可包含(例如)發炎、致腫瘤性或細胞脫顆粒之標記的預定數量或百分比或細胞因子、毒性氧或蛋白酶之分泌(例如釋放)。終點可包含(例如)預定數量之離子通量或輸送；細胞遷移；細胞黏附；細胞增殖；潛在的轉移；細胞分化；及表型中之變化，例如涉及發炎、細胞凋亡、轉化、細胞週期或轉移之基因表現中之變化(參見例如Knight(2000)Ann.Clin.Lab.Sci.30：145-158；Hood及Cheresh(2002)Nature Rev.Cancer 2：91-100；Timme等人，(2003)Curr.Drug Targets 4：251-261；Robbins及Itzkowitz(2002)Med.Clin.North Am.86：1467-1495；Grady及Markowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.3：101-128；Bauer等人，(2001)Glia 36：235-243；Stanimirovic及Satoh(2000)Brain Pathol.10：113-126)。

一般而言，抑制終點係75%對照或以下、較佳50%對照或以下、更佳25%對照或以下且最佳10%對照或以下。一般而言，活化終點係至少150%對照、較佳至少2倍對照、更佳至少4倍對照且最佳至少10倍對照。

「小分子」定義為分子量小於10kDa、通常小於2kDa且較佳小於1kDa之分子。小分子包括(但不限於)無機分子、有機分子、含有無機組份之有機分子、包含放射性原子之分子、合成分子、肽模擬物及抗體模擬物。作為治療劑，小分子可比大分子更多的滲透至細胞，較不易降解且較不易引發免疫反應。闡述小分子(例如抗體之肽模擬物及細胞因子)以及小分子毒素。參見例如Casset等人，(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.307：198-205；Muyldermans(2001)J.Biotechnol.74：277-302；Li(2000)Nat.Biotechnol.18：1251-1256；Apostolopoulos等人，(2002)Curr.Med.Chem.9：411-420；Monfardini等人，(2002)Curr.Pharm.Des.8：2185-2199；Domingues等人，(1999)Nat.Struct.Biol.6：652-656；Sato及Sone(2003)Biochem.J.371：603-608；美國專利第6,326,482號。

「特異性」或「選擇性」結合當係指配體/受體、抗體/抗體或其他結合對時，指示在蛋白質及其他生物製劑之異質群體中決定蛋白質之存在的結合反應。因此，在所指定條件下，特定配體結合至具體受體且不會以顯著量結合至樣品中存在之其他蛋白質。如本文所用，若抗體結合至包含GITR之多肽但不結合至缺乏GITR序列之蛋白質，則稱抗體特異性結合至包含既定序列之多肽(在此情形中GITR)。舉例而言，特異性結合至包含GITR的多肽之抗體可結合至GITR之FLAG^®-標記形式，但將不結合至其他FLAG^®-標記蛋白。

術語「表位」或「抗原決定位」係指抗原上特異性結合結合分子之位點。表位可自連續胺基酸或由蛋白質之三級摺疊併置之非連續胺基酸形成。自連續胺基酸形成之表位在暴露於變性溶劑時通常保留，而在用變性溶劑處理時通常損失由三級摺疊形成之表位。在獨特空間構象中，表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。確定表位之空間構象的方法包括(例如)X-射線晶體學及2-維核磁共振。

識別相同表位之結合分子可在顯示一種抗體阻斷另一抗體結合至靶標抗原之能力(即，競爭結合分析)的簡單免疫分析中鑑別。競爭結合係在其中所測試之結合分子抑制參考結合分子特定結合至共同抗原(例如GITR)之分析中測定。已知若干種類型之競爭結合分析，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)；固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology 9：242)；固相直接生物素-親和素EIA(參見Kirkland等人，(1986)J.Immunol.137：3614)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow及Lane,(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel等人，(1988)MoI.Immunol.25(1)：7)；固相直接生物素-親和素EIA(Cheung等人，(1990)Virology 176：546)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol.32：77)。

通常，此分析涉及使用與固體表面結合之純化抗原或具有該純化抗原或該固體表面中任一者之細胞、未標記之測試結合分子及經標記之參考結合分子。競爭抑制係藉由測定在測試結合分子存在下結合至固體表面或細胞之標記的量來量測。

通常存在過量測試結合分子。通常，當存在過量競爭結合分子時，參考結合分子與共同抗原之特異性結合將受到至少50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%、70%至75%或更多之抑制。

所預期方法之抗體或源自抗體之抗原結合位點的結合組合物以與無關抗原之親和力的至少2倍、較佳至少10倍、更佳至少20倍且最佳至少100倍的親和力結合至其抗原。在較佳實施例中，抗體將具有大於約10⁹公升/mol之親和力，如(例如)藉由斯卡查德分析(Scatchard analysis)所測定。Munsen等人，(1980)Analyt.Biochem.107：220-239。

II.概述

本發明提供利用GITR激動劑與PD-1拮抗劑之組合(包括抗GITR及抗PD-1或抗PD-L1抗體)治療晚期階段腫瘤之方法。

III.醫藥組合物

為製備醫藥或無菌組合物，將GITR、PD-1或PD-L1抗體與醫藥上可接受之載劑或賦形劑混合。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences及U.S.Pharmacopeia：National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。

治療劑及診斷劑之調配物可藉由與生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合成(例如)凍乾粉末、漿液、水溶液或懸浮液之形式來製備。參見(例如)Hardman等人(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(編輯)，(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)，(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)，(1990) Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker有限公司，New York,NY。

抗體組合物單獨或與免疫阻抑劑組合投與時之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序來測定，例如用於測定LD₅₀(群體之50%死亡的劑量)及ED₅₀(對群體之50%具有治療效果的劑量)的程序。毒性與治療效應間之劑量比率為治療指數且其可表示為LD₅₀對ED₅₀之比率。展現高治療指數之抗體較佳。自該等細胞培養分析及動物研究所獲得之數據可用於調配用於人類之劑量範圍。該等化合物之劑量較佳位於具有極低或沒有毒性之循環濃度(包括ED₅₀)範圍內。劑量可在此範圍內端視所用劑型及投與途徑而變。

投與方式並不特別重要。適宜之投與途徑可包括(例如)經口、經直腸、經黏膜或經腸道投與；非經腸遞送，包括經肌內、皮下、髓內注射以及鞘膜內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。用於本發明醫藥組合物中或用以實踐本發明方法之抗體的投與可以各種習用方式實施，例如口服攝取、吸入、局部施用或經皮、皮下、腹膜內、非經腸、動脈內或靜脈內注射。

另一選擇為，可局部而非全身性方式投與抗體，例如常常以儲積或持續釋放調配物之形式經由將抗體直接注射至關節炎關節或以免疫病理學為特徵之病原體誘導之損傷。此外，抗體可在靶向藥物遞送系統中投與，例如在塗佈有靶向(例如)關節炎關節或以免疫病理學為特徵之病原體誘導之損傷的組織特異性抗體的脂質體中。脂質體將靶向受折磨組織並選擇性地由其吸收。

選擇用於治療劑之投與方案取決於若干因素，包括實體之血清或組織轉換率、症狀之程度、實體之免疫原性及生物基質中靶標細胞之易接近性。較佳地，投與方案使與可接受之負效應程度一致之遞送至患者之治療劑的量最大化。因此，所遞送生物製劑之量部分地取決於具體實體及所治療病況之嚴重性。選擇選自抗體、細胞因子及小分子之適當劑量的導則可係獲得的。參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.有限公司，Oxfordshire,UK；Kresina(編輯)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(編輯)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人，(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人，(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人，(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人，(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人，(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人，(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602。

適當劑量之確定係由臨床醫師(例如)使用此項技術中已知或懷疑影響治療或預計影響治療之參數或因素來進行。一般而言，劑量係以稍微小於最佳劑量之量開始且此後以小的增益增加，直至相對於任何不利負效應達成期望或最佳效應為止。重要的診斷手段包括彼等(例如)發炎之症狀或所產生發炎細胞因子之含量。較佳地，將使用之抗體實質上源自與作為治療目標之動物相同之物種(例如人類化抗體用於治療人類個體)，由此最小化對試劑之任一免疫反應。

抗體及抗體片段可藉由連續輸注或藉由以(例如)一天、每週1-7次、一週、兩週、每月、每兩個月等之間隔投藥來提供。劑量可經靜脈內、經皮下、局部、經口、經鼻、經直腸、經肌內、經腦內、經脊柱內或藉由吸入提供。較佳劑量方案係涉及避免不期望負效應之最大劑量或投藥頻率者。總週劑量通常為至少0.05μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0 mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg體重或更多。參見例如Yang等人，(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人，(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人，(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等人，(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144。小分子治療劑(例如肽模擬物、天然產物或有機化學物質)之期望劑量(基於mole/kg)大約與抗體或多肽之劑量相同。

用於利用第二治療劑(例如細胞因子、抗體、類固醇、化學治療劑、抗生素、抗病毒劑或輻射)共同投與或治療之方法已為此項技術熟知，參見例如Hardman等人(編輯)(2001)Goodman及Gilman之The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,New York,NY；Poole及Peterson(編輯)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA；Chabner及Longo(編輯)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA。具體而言，PD-1或PD-L1抗體之投與可同時或依序發生。在具體實施例中，可首先投與抗GITR抗體，隨後週期性(例如一週以後或每週一次)投藥抗PD-1或抗PD-L1抗體。另一選擇為，利用抗PD-1或PD-L1抗體治療可以類似時間表緊接著利用抗GITR抗體治療。在其他實施例中，抗GITR抗體與抗PD-1或抗PD-L1在至少單一治療或多次投藥中(例如，每週一次投與)共同投與。

GITR、PD-1或PD-L1抗體可與化學治療劑組合，其包括烷基化劑，例如噻替派(thiotepa)及CYTOXAN®環磷醯胺；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)及尿多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基蜜胺；番荔枝內酯(acetogenin)(尤其係布拉它辛(bullatacin)及布拉它辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利抑制素(callystatin)；CC-1065(包括其合成類似物阿多來新(adozelesin)、卡澤來新(carzelesin)及比澤來新(bizelesin))；念珠藻素(cryptophycin)(尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡黴素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB 1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、苯乙酸氮芥膽甾醇酯(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)；曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1(例如，參見Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，例如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素髮色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(anthramycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®多柔比星(包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(例如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，例如胺甲蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、胺甲蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺素，例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸；乙醯葡醛酸內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百垂布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatrexate)；地磷醯胺(defosfamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(eflornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美坦辛(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多糖複合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；新月毒素(尤其T-2毒素、黏液黴素A(verracurin A)、漆斑菌素(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethane)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶薩托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷(taxoid)，例如TAXOL®紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及ABRAXANE^TM紫杉醇(paclitaxel)之無克列莫佛(Cremophor)、白蛋白工程化奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)及TAXOTERE®多西紫杉醇(docetaxel)(Rhône-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；GEMZAR®吉西他濱(Gemzar^TM gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲蝶呤；鉑類似物，例如順鉑(順鉑)及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；NAVELBINE®長春瑞濱(Navelbine^TM vinorelbine)；鹽酸米托恩醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；XELODA®卡培他濱(capecitabine)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視黃酸；及上述中任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。

亦包括用於調控或抑制對腫瘤之激素作用的抗激素藥劑，例如抗雌激素製劑及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括(例如)它莫西芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX®它莫西芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON.托瑞米芬(toremifene)；抑制酶芳香酶之芳香酶抑制劑，其調控腎上腺中雌激素產生，例如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE®乙酸甲地孕酮、AROMASIN®依西美坦(exemestane)、福美斯坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR®伏羅唑(vorozole)、FEMARA®來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX®阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄激素製劑(例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二噁烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其彼等抑制黏附細胞增殖中涉及之信號傳導途徑中之基因表現者，例如PKC-α、Ralf及H-Ras；核糖酶，例如VEGF表現抑制劑(例如，ANGIOZYME®核糖酶)及HER2表現抑制劑；疫苗，例如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；及任一上述之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。

使用組合療法來治療尺寸為至少約175mm³之晚期階段腫瘤。在本發明之另一實施例中，使用組合療法來治療至少約200mm³、300mm³、400mm³、500mm³、750mm³、最高1000mm³之腫瘤。使用本發明之組合療法來治療足夠大以藉由觸診或藉由此項技術中熟知之成像技術(例如MRI、超音波或CAT掃描)發現之腫瘤。

兩種化合物之「協同效應」係其中兩種藥劑組合之效應大於其個別效應之總和且統計上不同於對照及單一藥物之效應。在另一實施例中，本發明之組合療法具有加成效應。兩種化合物之「加成效應」係其中兩種藥劑組合之效應係其個別效應之總和且統計上不同於對照及/或單一藥物之效應。

目標方法對腫瘤大小之抑制大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約35%、大於約42%、大於約43%、大於約44%、大於約45%、大於約46%、大於約47%、大於約48%、大於約49%、大於約50%、大於約51%、大於約52%、大於約53%、大於約54%、大於約55%、大於約56%、大於約57%、大於約58%、大於約59%、大於約60%、大於約65%、大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%或大於約100%。在一個實施例中，GITR結合分子與PD-1拮抗劑分子聯合投與可導致晚期腫瘤之完全消退。

亦涵蓋GITR激動劑/PD-1拮抗劑組合與抗病毒治療劑的共同投與。抗病毒製劑包括破壞病毒之任一藥物。抗病毒製劑可包括干擾素(其起到抑制病毒之複製的作用)、蛋白酶抑制劑及包含於高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)之組合中用於HIV之逆轉錄酶抑制劑或藥劑。

典型之獸醫、試驗或研究個體包括猴子、狗、貓、大鼠、小鼠、兔子、天竺鼠、馬及人類。

IV.用途癌症

GITR、PD-1或PD-L1抗體或抗原結合片段可用於治療癌症(即，以抑制腫瘤細胞之生長或存活)。可藉由本發明之抗體抑制其生長之較佳癌症包括通常響應免疫療法之癌症以及迄今為止與免疫療法不相關之癌症。用於治療之較佳癌症之非限制性實例包括黑色素瘤(例如，轉移性惡性黑色素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、胰臟腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤及其他贅生惡性腫瘤。另外，本發明包括可使用本發明抗體抑制其生長之難治性或復發性惡性腫瘤。

GITR激動劑/PD-1拮抗劑抗體或抗原結合片段可單獨或與以下各物組合使用：其他抗腫瘤藥劑或免疫原性藥劑(例如，減毒癌細胞、腫瘤抗原(包括重組蛋白質、肽及碳水化合物分子)、抗原呈遞細胞(例如腫瘤源性抗原或核酸脈衝之樹突細胞)、免疫刺激細胞因子(例如，IL-2、IFNa2、GM-CSF)、及經編碼免疫刺激細胞因子(例如但不限於GM-CSF)之基因轉染之細胞；標準癌症治療(例如，化學療法、放射療法或手術)；或其他抗體(包括但不限於針對VEGF、EGFR、Her2/neu、VEGF受體、其他生長因子受體、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-IBB及ICOS之抗體)。

傳染性疾病

GITR激動劑/PD-1拮抗劑組合亦可用於預防或治療感染性及傳染性疾病。GITR激動劑/PD-1拮抗劑組合可單獨或與疫苗組合使用，以刺激對病原體、毒素及自體抗原之免疫反應。抗體或其抗原結合片段可用於刺激對傳染給人類之病毒的免疫反應，例如但不限於人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒A、B及C型、艾司坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus)、人類巨細胞病毒、人類乳突病毒、皰疹病毒。抗體或其抗原結合片段可用於刺激對細菌或真菌寄生蟲或其他病原體之免疫反應。

疫苗接種佐劑

GITR激動劑/PD-1拮抗劑抗體或抗體片段組合可與其他重組蛋白及/或肽(例如腫瘤抗原或癌症細胞)聯合使用以增強對該等蛋白質之免疫反應(即，疫苗接種方案)。

舉例而言，可藉由共同投與GITR激動劑/PD-1拮抗劑組合與所關注抗原(例如，疫苗)使用GITR激動劑/PD-1拮抗劑抗體及其抗體片段以刺激抗原特異性免疫反應。因此，在另一態樣中，本發明提供增強個體中對抗炎之免疫反應的方法，包含將以下投與該個體：(i)抗原；及(ii)GITR激動劑/PD-1拮抗劑組合，使得增強個體中對抗原的免疫反應。抗原可為(例如)腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體之抗原。

T細胞之離體活化

本發明之抗體及抗原片段亦可用於抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及該等細胞授受性轉移至受體中以增加對抗腫瘤之抗原特異性T細胞。該等方法亦可激活T細胞對感染物(例如CMV)之反應。預期在GITR激動劑/PD-1拮抗劑組合存在下之離體活化可增強授受性轉移T細胞之頻率及活性。

實例實例1 一般方法

闡述分子生物學中之標準方法。Maniatis等人，(1982)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press,San Diego,CA。標準方法亦出現於以下中：Ausbel等人，(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley and Sons公司，New York,NY，其闡述在細菌細胞中之選殖及DNA突變誘發(第1卷)、哺乳動物細胞及酵母中之選殖(第2卷)、糖偶聯物及蛋白質表現(第3卷)及生物資訊學(第4卷)。

闡述包括免疫沈澱、層析、電泳、離心及結晶之蛋白質純化之方法。Coligan等人，(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons公司，New York。闡述化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白之產生、蛋白質之糖基化。參見例如Coligan等人，(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley and Sons公司，New York；Ausubel等人，(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第3卷，John Wiley and Sons公司，NY,NY，第16.0.5-16.22.17頁；Sigma-Aldrich公司.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89頁；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.，第384-391頁。闡述多株及單株抗體之產生、純化及裂片。Coligan等人，(2001)Current Protcols in Immunology，第1卷，John Wiley and Sons公司，New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow and Lane，如上所述。用於表徵配體/受體相互作用之標準技術係可獲得的。參見例如Coligan等人，(2001)Current Protcols in Immunology，第4卷，John Wiley公司，New York。

可製備單株、多株及人類化抗體(參見例如Sheperd及Dean(編輯)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY； Kontermann及Dubel(編輯)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow及Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,第139-243頁；Carpenter等人，(2000)J.Immunol.165：6205；He等人，(1998)J.Immunol.160：1029；Tang等人，(1999)J.Biol.Chem.274：27371-27378；Baca等人，(1997)J.Biol.Chem.272：10678-10684；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；Foote及Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487-499；美國專利第6,329,511號)。

人類化之替代方式係使用在噬菌體上展現之人類抗體庫或轉基因小鼠中之人類抗體庫(Vaughan等人，(1996)Nature Biotechnol.14：309-314；Barbas(1995)Nature Medicine 1：837-839；Mendez等人，(1997)Nature Genetics 15：146-156；Hoogenboom及Chames(2000)Immunol.Today 21：371-377；Barbas等人，(2001)Phage Display：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等人，(1996)Phage Display of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人，(1999)Nature Biotechnol.17：397-399)。

抗原之純化並非生成抗體所必需的。可將動物用攜載所關注抗原之細胞進行免疫。然後可將脾細胞自經免疫動物分離，且脾細胞可與骨髓瘤細胞系融合以產生融合瘤(參見例如Meyaard等人，(1997)Immunity 7：283-290；Wright等人，(2000)Immunity 13：233-242；Preston等人，如上所述；Kaithamana等人，(1999)J.Immunol.163：5157-5164)。

抗體可偶聯至(例如)小藥物分子、酶、脂質體、聚乙二醇(PEG)。抗體可用於治療、診斷、套組或其他目的，且包括偶合至(例如)染料、放射性同位素、酶或金屬(例如膠態金)之抗體(參見例如Le Doussal等人，(1991)J.Immunol.146：169-175；Gibellini等人，(1998)J.Immunol.160：3891-3898；Hsing及Bishop(1999)J.Immunol.162：2804-2811；Everts等人，(2002)J.Immunol.168：883-889)。

用於流式細胞術之方法(包括螢光活化之細胞分選檢測系統(FACS®))係可獲得的。參見例如Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ。適用於修飾作為(例如)診斷試劑之核酸之螢光試劑(包括核酸引物及探針、多肽及抗體)係可獲得的。Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes公司，Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO。

闡述免疫系統之組織學之標準方法。參見例如Muller-Harmelink(編輯)(1986)Human Thymus：Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人，(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人，(2002)Basic Histology：Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY。

用於測定(例如)抗原片段、前導序列、蛋白質摺疊、功能結構域、糖基化位點及序列比對之軟體包及數據庫係可獲得的。參見例如GenBank,Vector NTI^® Suite(Informax公司，Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys公司，San Diego,CA)；DeCypher^®(TimeLogic公司，Crystal Bay,Nevada)；Menne等人，(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等人，(2000)Bioinformatics Applications Note 16：741-742；Wren等人，(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690。

實例2 活體內治療方法

大約八至十週齡之雌性C57Bl/6J或BALB/c/AnN小鼠係分別自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine或Sacramento,California)或Taconic Laboratory(Oxnard,California)。隨意提供習用動物食物及水。所有使用動物之方案均已由Merck & Co.公司及Merck Research Labs(MRL)帕羅奧多實驗動物管理及使用委員會(Palo Alto Animal Use and Care Committee)批准。

治療之前，將小鼠稱重並量測個別小鼠之腫瘤。為防止偏差，移除任何重量或腫瘤體積之離群值並將剩餘小鼠隨機化至具有等效平均腫瘤大小之各個治療群組。

測試材料及同型對照係自MRL帕羅奧多蛋白質科學部門(Protein Sciences department)作為冷凍(-80℃)儲積物獲得。用於每一抗體之調配物緩衝液係特定的以穩定蛋白質並防止沈澱，其細節於下文給出：調配物/稀釋劑係自MRL帕羅奧多蛋白質科學部分獲得，儲存在4℃下。同型對照mIgG2a及抗PD-1調配物/稀釋劑20mM乙酸鈉、7%蔗糖(pH5.5)、mIgG1調配物/稀釋劑75mM NaCl、10mM磷酸鹽、3%蔗糖(pH7.3)及mDTA-1(抗mGITR)調配物/稀釋劑20mM乙酸鈉、7%蔗糖、0.02% Tween80(低過氧化物)(pH5.5)用於穩定蛋白質並防止沈澱。

實例3 腫瘤細胞系製備及植入

將MC38或CT26結腸癌細胞在補充有10%熱不活化胎牛血清之RPMI培養基中培養。將MB49膀胱癌細胞在補充有10%胎牛血清及1%GlutaMAX^TM之杜貝克改良鷹氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)中培養。將1×10⁶個MC38細胞、3×10⁵個CT26細胞或0.5×10⁶個MB49細胞於100μL體積之磷酸鹽緩衝鹽水中SC注射於每一小鼠之左側腹脇區或右側腹中。通常，小鼠首先用電動剪毛器在將用於植入之區域剃毛。

實例4 腫瘤量測及體重

在首次投藥之前一天且之後一周兩次量測腫瘤。使用電子卡尺量測腫瘤長度及寬度且使用公式體積(mm³)=0.5×長度×寬度²測定腫瘤體積，其中長度係最長之尺寸。

小鼠週期性地進行稱重以監測一般健康狀況，而且在需要時估計每小鼠實際mg/kg劑量遞送。

實例5 投藥溶液製備、投與分析

將冷凍儲積液解凍並轉移至濕冰。為避免重複的冷凍解凍，儲積液之每一小瓶解凍一次並製作體積足以用於一次使用之等份試樣。使用聚丙烯低黏著試管用於此目的。將等份試樣在乾冰中快速冷凍並儲存於-80℃下。每次投藥之前，將一份等份試樣解凍並在適當稀釋劑中稀釋至標稱濃度並立即投藥。將投藥溶液之等份試樣在乾冰中快速冷凍並儲存於-80℃下直至分析為止。使用基於多陣列技術(電化學發光與圖案化陣列之組合)之Meso Scale Discovery(MSD^®,Rockville,MD)平臺評價投藥溶液。

當MC38及CT26腫瘤分別達到約300mm³及220mm³之平均大小、通常植入後約2週時開始利用測試材料投藥。當植入後1週MB49腫瘤達到約105mm³之平均大小時開始利用測試材料投藥。在5mg/kg之投藥濃度下改變投藥頻率(自單次投藥至長達每6週一次投藥之範圍內)進行測試，其細節在下文中給出。

實例6 DTA-1抗體之鼠化

如下將大鼠抗-小鼠DTA-1 GITR抗體(S.Sakaguchi,Kyoto University,Kyoto,Japan)進行鼠化。測定大鼠抗體DTA-1之序列的可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)結構域。將大鼠DTA-1 VH序列與來自Immunogenetics IMGT數據庫(www.imgt.org)之小鼠VH生殖系序列相比較(Lefranc,M.-P.等人，(1999)Nuc.Acids Res.27：209-212)。將DTA-1 VH序列與小鼠VH生殖系序列進行比對並類似於先前人類化系統進行評分(參見例如WO2005/047326)。大鼠DTA-1 VH與小鼠生殖系IGVH5-4、IGVH5-6及IGVH5-9最相似。CDR殘基自大鼠DTA-1 VH轉移至小鼠生殖系IGVH5-4；兩個IGVH5-4框架殘基改變為吻合IGVH5-6之彼等且小鼠J-區IGHJ-4(IMGT)用於連接小鼠IgG1與小鼠IgG2a Fc區。

將大鼠DTA-1 VL(λ)序列與來自GenBank：AAH02129.1之小鼠VL(λ)序列進行比對。CDR殘基自大鼠DTA-1 VL(λ)轉移至小鼠AAH02129框架序列。基於大鼠及鼠化VL結構域之電腦圖形模型改變鼠化DTA1上之七個框架殘基。鼠化DTA-1 VL(λ)結構域融合至小鼠恆定輕鏈結構域。

對於所有三個構造體(一個VH及兩個VL(λ))，合成密碼子最佳化基因並插入至表現載體中。抗體係藉由在HEK293細胞中瞬時表現來表現並使用蛋白質-A層析來純化。

實例7 抗GITR/抗PD-1治療結果

具有晚期MC38腫瘤之C57BL/6J小鼠利用單次或每兩週一次皮下(SC)注射鼠化抗mGITR(Merck Research Labs，帕羅奧多，CA)及腹膜內(IP)注射鼠化抗mPD-1(Merck Research Labs，帕羅奧多，CA)來治療，每一者之劑量為5mg/kg。當腫瘤大小達到240-360mm³時開始治療。每週兩次量測腫瘤體積。將腫瘤之完全消退(CR)作為抗腫瘤功效之讀出。組合劑量產生穩健、協同功效，其中每兩週一次組合投藥之後具有100% CR。將投藥方案限制為一個劑量之每一抗體(Ab.)使CR降低至70%，此與抗mGITR、隨後在開始一周之後每4週一次投與抗mPD-1之組合所達成者相似。抗mGITR與抗mPD-1投與之間之2週間隔係無效的。利用抗mGITR長達每6週一次治療或抗mPD-1 Ab之每2-4週一次治療之單一療法僅觀察到20-30% CR(參見圖1A-1K)。

將具有晚期MC38腫瘤之C57BL/6J小鼠用抗mGITR(SC)及抗mPD-1(IP)進行治療，每一者之劑量為5mg/kg。當腫瘤大小達到200-350mm³時開始治療。每週兩次量測腫瘤體積。將腫瘤之完全消退(CR)作為抗腫瘤功效之讀出。組合劑量產生穩健、協同功效，其中每兩週一次組合投藥之後具有100% CR。此與以上詳細闡述之結果相當。然而，當該等抗體以1週間隔單獨投與時，觀察到60%之降低的CR。抗mGITR或抗mPD-1之每2週單一療法投藥抑制腫瘤生長，但並不產生CR(參見圖2A-2F)。

將具有晚期CT26腫瘤之BALB/cAnN小鼠用抗mGITR(SC)及抗mPD-1(IP)進行治療，每一者之劑量為5mg/kg。當腫瘤大小平均為220mm³(180-260mm³)時開始治療。每週兩次量測腫瘤體積。將腫瘤之完全消退(CR)作為抗腫瘤功效之讀出。單一組合投藥產生穩健、協同功效，其中具有70% CR。作為單一療法遞送之任一抗體之抗腫瘤功效為0-10% CR(參見圖3A-3D)。

將具有MB49腫瘤之C57BL/6J小鼠分別以5mg/kg及10mg/kg利用抗GITR(SC)及抗PD-1(IP)之單一劑量來治療。當腫瘤大小平均為105mm³(85-122mm³)時開始治療。每週兩次量測腫瘤體積。將腫瘤之完全消退(CR)作為抗腫瘤功效之讀出。抗GITR及抗PD-1組合治療產生增強之功效，其中具有40%CR。在單一藥劑治療群組中未觀察到CR(參見圖4A-4D)。

實例8

抗PD-1及抗GITR組合對調控性T細胞及CD8細胞比率之效應

A.方法 1.混合淋巴球反應培養物

自膚色血球層使用Ficoll-Paque Plus密度梯度離心在1200×g下20分鐘分離外周血單核細胞(PBMC)。自介質：血漿界面收集外周血單核細胞並用杜貝克氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)洗滌2次。將殘餘紅血球(RBC)使用氯化銨-鉀RBC溶解溶液(RBC溶解溶液)進行溶解。

樹突細胞(DC)係自CD14+單核細胞使用以下程序生成。首先自膚色血球層使用RosetteSep人類單核細胞富集混合物及Ficoll-Paque Plus密度梯度離心在1200×g下20分鐘來分離單核細胞。自介質：血漿界面移除單核細胞並用DPBS洗滌2次。殘餘RBC使用RBC溶解溶液進行溶解。將富集之單核細胞以2×10⁶/mL之細胞密度在杜貝克改良鷹氏培養基中培養，該培養基補充有10%胎牛血清(FBS)、1,000U/mL粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及400U/mL介白素(IL)-4。在第6天，將0.5μg/mL脂多糖添加至培養物中；然後將細胞再培養2天。

將混合淋巴球反應培養物設立於24孔板中。將外周血單核細胞(2×10⁶/mL)與γ-輻照(30Gy)之同種異體DC(0.2×10⁶/mL)一起在100U/mL IL-2；5ng/mL IL-15；抗-hGITR抗體(MK-4166)、抗-hPD-1抗體(MK-3475)、MK-3475與MK-4166之組合或同型對照mAb(抗-RSV)的存在下培養。在第7天使用流式細胞術評估MLR培養物中之調控性T細胞(Treg)之數量。

2.流式細胞術檢測混合淋巴球反應培養物中之Treg

為檢測Treg(CD3+ CD4+ CD25+ FoxP3+)及CD8+ T細胞，將來自MLR培養物之1×10⁶至2×10⁶個細胞與抗-CD3、抗-CD4、抗-CD25及抗-CD8於50μL BD Pharmingen染色緩衝液中一起培育。使用可固定細胞活力染料(Fixable Viability Dye)eFluor 506排除死細胞。利用抗-CD3、抗-CD4、抗-CD8及抗-CD25 mAb進行表面染色之後，使用FoxP3固定/滲透套組(Fixation/Permeabilization kit)根據製造商說明書(eBioscience)實施細胞內FoxP3染色。在LSR II流式細胞儀上實施樣品採集且使用FlowJo軟體版本10.0.6(Tree Star公司)分析數據。Treg係藉由針對CD3+CD4+細胞設門且隨後針對CD25+ FoxP3+細胞設門而鑑別。

3.調控性T-細胞阻抑分析

自膚色血球層使用RosetteSep人類CD4+ T細胞富集套組及Ficoll-Paque Plus密度梯度離心在1200×g下20分鐘來分離CD4+ T。自介質：血漿界面收集CD4+ T細胞並用DPBS洗滌2次。殘餘RBC使用RBC溶解溶液進行溶解。使用人類CD25偶聯之微珠粒II套組根據製造商之說明書(Miltenyi Biotec)分離CD4+CD25+ Treg及CD4+ CD25-效應T細胞(Teff)。CD4+CD25+CD127- Treg之純度為約40%至70%。如上所述生成人類DC。

對於T-細胞阻抑分析，將總計每孔1×10⁵個T細胞(Treg及Teff)與2×10⁴ γ-輻照(30Gy)之DC一起在MK-4166、MK-3475、MK-3475與MK-4166之組合或同型對照mAb(抗-RSV)的存在下在96孔圓底板中培養7天。將CD4+CD25- Teff及CD4+CD25+ Treg以4：1比率混合。在第6天，將氚標記之胸苷添加至培養物中達20小時。與氚標記之胸苷一起培育之後，收穫細胞，用水溶解，並使用β計數器(PerkinElmer,2450微板計數器)進行分析。T-細胞增殖之程度係由納入之氚標記之胸苷的量來反映。所有分析均一式三份實施。

B.結果

抗-小鼠GITR激動mAb DTA-1以改變Treg之穩定性及腫瘤內累積之能力對於DTA-1之作用機制係必需的(參見例如Cohen等人，(2010) PLoS One 5(e10436)：1-12；及Schaer等人，(2013)Cancer Immunol.Res.1：320-331)。MK-4166單獨或與MK-3475組合影響人類Treg及其阻抑活性之能力係使用人類活體外分析進行研究。

在MLR中Treg之誘導係有據可查的(參見例如Levitsky等人(2013)Transplantation 96：689-696)。因此，利用MLR以增加天然存在於血液中之人類Treg之數量並以評價MK-4166單獨或與MK-3475組合對人類Treg及CD8：Treg比率之影響。將10μg/mL MK-4166添加至MLR培養物在7天後使得CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg之數量減小(圖5A)。MK-3475單獨並不會影響Treg之數量。然而，MK-3475與MK-4166之組合對Treg之數量及CD8：Treg比率具有最為明顯之效應(圖5B)。

為評估MK-4166對人類Treg之阻抑活性的效應，建立Treg阻抑分析。在此分析中，T-細胞增殖之程度係藉由納入之氚標記之胸苷來反映。當MK-4166與MK-3475組合時觀察到T細胞增殖之劑量依賴性增加(圖6)。該等結果提供與MK-4166及MK3475一起培育減小MLR誘導之Treg之數量、增加CD8：Treg比率且使人類Treg活體外之阻抑功能減小之證據。

<110> 美商默沙東藥廠丹霖谷艾咪 M 畢本

<120> 腫瘤免疫力之調節

<130> 23565-WO-PCT

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<151> 2013-08-20

<160> 88

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<213> 家鼷鼠

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<213> 褐鼠

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<213> 人工序列

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<223> 人類化抗體序列

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<221> VARIANT

<222> (24)..(24)

<223> 可為A或F

<220>

<221> VARIANT

<222> (69)..(69)

<223> 可為F或L

<220>

<221> VARIANT

<222> (73)..(73)

<223> 可為R或K

<220>

<221> VARIANT

<222> (75)..(75)

<223> 可為N或T

<220>

<221> VARIANT

<222> (80)..(80)

<223> 可為L或V

<220>

<221> VARIANT

<222> (98)..(98)

<223> 可為A或V

<400> 67

<210> 68

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人類化抗體序列

<400> 68

<210> 69

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (97)..(97)

<223> 可為A或T

<220>

<221> VARIANT

<222> (98)..(98)

<223> 可為R或T

<400> 69

<210> 70

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<400> 70

<210> 71

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (48)..(48)

<223> 可為M或I

<220>

<221> VARIANT

<222> (68)..(68)

<223> 可為V或A

<220>

<221> VARIANT

<222> (70)..(70)

<223> 可為M或F

<220>

<221> VARIANT

<222> (72)..(72)

<223> 可為T或A

<400> 71

<210> 72

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (48)..(48)

<22> 可為L或W

<220>

<221> VARIANT

<222> (72)..(72)

<223> 可為F或Y

<400> 72

<210> 73

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (24)..(24)

<223> 可為V或F

<220>

<221> VARIANT

<222> (50)..(50)

<223> 可為I或L

<220>

<221> VARIANT

<222> (51)..(51)

<223> 可為G或A

<220>

<221> VARIANT

<222> (69)..(69)

<223> 可為V或L

<220>

<221> VARIANT

<222> (71)..(71)

<223> 可為I或V

<220>

<221> VARIANT

<222> (73)..(73)

<223> 可為V或K

<220>

<221> VARIANT

<222> (80)..(80)

<223> 可為F或A

<220>

<221> VARIANT

<222> (99)..(99)

<223> 可為R或Q

<400> 73

<210> 74

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (46)..(46)

<223> 可為L或P

<220>

<221> VARIANT

<222> (49)..(49)

<223> 可為Y或F

<220>

<221> VARIANT

<222> (71)..(71)

<223> 可為F或Y

<400> 74

<210> 75

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (24)..(24)

<223> 可為V或F

<220>

<221> VARIANT

<222> (50)..(50)

<223> 可為I或L

<220>

<221> VARIANT

<222> (51).(51)

<223> 可為G或A

<220>

<221> VARIANT

<222> (69)..(69)

<223> 可為V或L

<220>

<221> VARIANT

<222> (73)..(73)

<223> 可為V或K

<220>

<221> VARIANT

<222> (80)..(80)

<223> 可為F或A

<220>

<221> VARIANT

<222> (99)..(99)

<223> 可為R或Q

<400> 75

<210> 76

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (46)..(46)

<223> 可為L或P

<220>

<221> VARIANT

<222> (49)..(49)

<223> 可為Y或F

<220>

<221> VARIANT

<222> (71)..(71)

<223> 可為F或Y

<400> 76

<210> 77

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (96)..(96)

<223> 可為A或Q

<400> 77

<210> 78

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<400> 78

<210> 79

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (47)..(47)

<223> 可為W或Y

<220>

<221> VARIANT

<222> (48)..(48)

<223> 可為I或M

<220>

<221> VARIANT

<222> (71)..(71)

<223> 可為V或R

<220>

<221> VARIANT

<222> (96)..(96)

<223> 可為A或S

<400> 79

<210> 80

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (71)..(71)

<223> 可為F或Y

<400> 80

<210> 81

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<400> 81

<210> 82

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (31)..(31)

<223> 可為N或Q

<220>

<221> VARIANT

<222> (57)..(57)

<223> 可為N或Q

<400> 82

<210> 83

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (47)..(47)

<223> 可為W或Y

<220>

<221> VARIANT

<222> (48)..(48)

<223> 可為I或M

<220>

<221> VARIANT

<222> (67)..(67)

<223> 可為V或I

<220>

<221> VARIANT

<222> (71)..(71)

<223> 可為V或R

<220>

<221> VARIANT

<222> (78)..(78)

<223> 可為F或Y

<220>

<221> VARIANT

<222> (96)..(96)

<223> 可為A或S

<400> 83

<210> 84

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> 可為D或V

<400> 84

<210> 85

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (48)..(48)

<223> 可為M或I

<220>

<221> VARIANT

<222> (68)..(68)

<223> 可為V或A

<220>

<221> VARIANT

<222> (70)..(70)

<223> 可為M或L

<220>

<221> VARIANT

<222> (72)..(72)

<223> 可為T或A

<220>

<221> VARIANT

<222> (74)..(74)

<223> 可為T或K

<400> 85

<210> 86

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<400> 86

<210> 87

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (49)..(49)

<223> 可為I或M

<220>

<221> VARIANT

<222> (68)..(68)

<223> 可為V或I

<220>

<221> VARIANT

<222> (72)..(72)

<223> 可為V或R

<400> 87

<210> 88

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (45)..(45)

<223> 可為L或P

<220>

<221> VARIANT

<222> (46)..(46)

<223> 可為L或C

<400> 88

Claims

一種PD-1拮抗劑及GITR激動劑組合之用途，其用於製造治療腫瘤之藥劑，其中該PD-1拮抗劑及GITR激動劑係同時或依序投與。
如請求項1之用途，其中a.該PD-1拮抗劑係結合PD-1或PD-L1之抗體或其抗原結合片段；且b.該GITR激動劑係結合GITR之抗體或其抗原結合片段。
如請求項1或2之用途，其中a.該PD-1拮抗劑係結合至人類PD-1或PD-L1之抗體或其抗原結合片段；且b.該GITR激動劑係結合至人類GITR之抗體或其抗原結合片段。
如請求項3之用途，其中該抗體或其結合片段經人類化或係全人類的。
如請求項1或2之用途，其中a.該PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群：BMS-936558、MK-3475及MPDL3280A；且b.該GITR激動劑係選自由以下組成之群：i.具有SEQ ID NO：1-66之至少一個CDR之抗體；ii.TRX518；及iii.TRX385。
如請求項5之用途，其中該GITR激動劑係具有以下之抗體：a)SEQ ID NO：1-11之重鏈CDR1、SEQ ID NO：12-22之CDR2及SEQ ID NO：23-33之CDR3；及/或 b)SEQ ID NO：34-44之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：45-55之CDR2及SEQ ID NO：56-66之CDR3。
如請求項5之用途，其中該GITR激動劑係具有以下之抗體：a)SEQ ID NO：67、69、71、73、75、77、79、81、83、85及87之可變重鏈；及/或b)SEQ ID NO：68、70、72、74、76、78、80、82、84、86及88之可變輕鏈。
如請求項1或2之用途，其中該PD-1拮抗劑及GITR激動劑同時投與至少1次。
如請求項1或2之用途，其中該PD-1拮抗劑及GITR激動劑同時投與至少2次。
如請求項1或2之用途，其中該腫瘤係晚期階段腫瘤。
如請求項10之用途，其中該晚期階段腫瘤係選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(例如肝腫瘤及肝細胞瘤)、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、唾液腺癌、腎癌(例如腎細胞癌及威爾姆斯腫瘤(Wilms' tumor))、基底細胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睾丸癌及食道癌。
一種雙特異性抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造治療腫瘤之藥劑，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段包含結合至PD-1或PD-L1且拮抗PD-1活性之第一臂及結合至GITR且激動GITR活性之第二臂。
如請求項12之用途，其中a.該第一臂係選自由以下組成之群：來自BMS-936558、MK-3475及MPDL3280A之抗原結合片段；且 b.該第二臂係選自由以下組成之群：來自以下之抗原結合片段i.具有SEQ ID NO：1-66之至少一個CDR之抗體；ii.TRX518；及iii.TRX385。
如請求項12或13之用途，其中該第二臂具有：a)SEQ ID NO：1-11之重鏈CDR1、SEQ ID NO：12-22之CDR2及SEQ ID NO：23-33之CDR3；及/或b)SEQ ID NO：34-44之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：45-55之CDR2及SEQ ID NO：56-66之CDR3。
如請求項12或13之用途，其中該第二臂具有：a)SEQ ID NO：67、69、71、73、75、77、79、81、83、85及87之可變重鏈；及/或b)SEQ ID NO：68、70、72、74、76、78、80、82、84、86及88之可變輕鏈。
如請求項12或13之用途，其中該腫瘤係晚期階段腫瘤。
如請求項16之用途，其中該晚期階段腫瘤係選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(例如肝腫瘤及肝細胞瘤)、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、唾液腺癌、腎癌(例如腎細胞癌及威爾姆斯腫瘤)、基底細胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睾丸癌及食道癌。
一種醫藥組合，其包含PD-1拮抗劑及GITR激動劑，其中：a)該PD-1拮抗劑係選自由以下組成之群：BMS-936558、MK-3475及MPDL3280A；且b)該GITR激動劑係選自由以下組成之群： i.具有SEQ ID NO：1-66之至少一個CDR之抗體；ii.TRX518；及iii.TRX385。