KR101979070B1 - 종양 면역 조절 - Google Patents

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Abstract

증식성 장애를 치료하는 방법을 기술한다. 특히, GITR 효능제 및 PD-1 길항제를 이용한 병용 치료법을 제공한다.

Description

종양 면역 조절 {MODULATION OF TUMOR IMMUNITY}
본 발명은 진행성 종양 치료에서의 종양 면역 조절에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 진행성 종양에 대한 항-종양 반응을 증진시키기 위한 GITR의 효능제와 함께 조합되는 PD-1의 길항제를 제공한다.
종양 미세환경은 종양 개시, 종양 진행 및 요법에 대한 반응에 기여하는 암 생물학에 있어 중요한 측면이다. 면역계의 세포 및 분자가 종양 미세환경의 기본 성분이다. 중요하게는, 요법 전략법은 종양 세포를 특이적으로 표적화하는 데 면역계를 이용할 수 있으며, 이는 특히, 암 환자에서 장기간 지속되는 퇴행을 유발할 수 있고, 재발을 예방할 수 있는 종양 특이 면역 기억을 유도할 수 있는 가능성이 있다는 점에서 주목을 끈다.
종양 미세환경의 조성 및 특징은 매우 다양하고, 항-종양 면역 반응을 결정짓는 데 있어 중요하다. 예를 들어, 자연살세포, 수지상 세포 (DC) 및 효과기 T 세포를 비롯한, 면역계의 특정 세포는 강력한 항-종양 반응을 구동시킬 수 있다. 그러나, 종양 세포는 대개 면역 세포의 면역억제 집단, 예컨대, 골수 유래 억제인자 세포 및 조절 T 세포의 발생에 바람직한 면역억제 미세환경을 유도한다. 종양에 의한 면역조절의 복잡성을 이해하는 것이 면역요법 개발을 위해 중요한다. '면역 체크포인트'를 극복하기 위한, DC 기반 백신 및 억제성 신호전달 경로의 길항제를 비롯한 각종 전략법이 항-종양 면역 반응을 증진시키기 위한 것으로서 현재 개발 중에 있다.
TNFR 슈퍼패밀리의 구성원인 글루코코르티코이드-유도성 TNFR-관련 단백질 (GITR)은 선천 및 적응 면역계의 많은 성분들에서 발현된다 (예컨대, [Hanabuchi, et al. (2006) Blood 107:3617-3623]; 및 [Nocentini and Riccardi (2005) Eur . J. Immunol. 2005. 35:1016-1022] 참조). 그의 막 발현은 T 세포 활성화 이후에 증가하고 ([Hanabuchi, 상기 문헌 참조]; 및 [Nocentini and Riccardi, 상기 문헌 참조]); 그가 유발되면, 효과기 T　림프구는 공동으로 활성화되고, 조절 T 세포 (Treg) 활성이 조절된다 (예컨대, [McHugh, et al. (2002) Immunity 2002. 16:311-323]; [Shimizu, et al. (2002) Nat. Immunol.. 3:135-142]; [Ronchetti, et al. (2004) Eur . J. Immunol . 34:613-622]; 및 [Tone, et al. (2003) Proc . Natl . Acad. Sci. USA 100:15059-15064] 참조).
GITR은 APC 상에서 주로 발현되는 GITR 리간드 (GITRL)에 의해 활성화되며, 비록 생화학적 신호전달을 정의하기 위해서는 추가 연구가 필요하지만, 그의 세포질 도메인에 의해 신호가 전달되는 것으로 제안되고 있다 ([Nocentini, 상기 문헌 참조]; [Ronchetti, 상기 문헌 참조]; [Suvas, et al. (2005) J. Virol . 79:11935-11942]; 및 [Shin, et al. (2002) Cytokine 19:187-192]).　
GITR 활성화가 종양 및 바이러스 감염에 대한 저항성을 증가시키고, 이는 자가면역/염증성 과정에 관여하며, 백혈구 유출을 조절한다 ([Nocentini 상기 문헌 참조]; [Cuzzocrea, et al. (2004) J. Leukoc . Biol . 76:933-940]; [Shevach, et al. (2006) Nat. Rev. Immunol . 6:613-618]; [Cuzzocrea, et al. (2006) J. Immunol. 177:631-641]; 및 [Cuzzocrea, et al. (2007) FASEB J. 21:117-129]). 종양 마우스 모델에서, 효능제 GITR 항체인 DTA-1을 길항제 CTLA-4 항체와 조합한 결과, 일부 시험군 마우스에서는 진행성 단계의 종양의 완전한 종양 퇴행을 이끄는 데 있어 시너지 결과를 보였다 (Ko, et al. (2005) J. Exp . Med . 7:885-891).
프로그램된 사멸 수용체 1 (PD-1)은 주로 활성화된 T 및 B 세포 상에서 발현되는 면역억제성 수용체이다. 그의 리간드와의 상호작용이 시험관내 및 생체내 모두에서 T 세포 반응을 약화시키는 것으로 밝혀졌다. PD-1과, 그의 리간드들 중 하나인 PD-L1의 상호작용을 차단한 결과, 종양 특이 CD8+ T 세포 면역은 증진되는 것으로 나타났으며, 따라서, 이는 면역계에 의해 종양 세포를 제거하는 데 있어 도움이 될 수 있다.
(유전자 Pdcd1에 의해 코딩되는) PD-1은 CD28, 및 CTLA-4와 관련된 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원이다. PD-1은 그의 리간드 (PD-L1 및/또는 PD-L2)와의 체결시 항원 수용체 신호전달을 음성적으로 조절하는 것으로 밝혀졌다. 뮤린 PD-1의 구조 뿐만 아니라, 마우스 PD-1과 인간 PD-L1과의 공결정 구조 또한 해석되었다 ([Zhang, X., et al., (2004) Immunity 20: 337-347]; [Lin, et al., (2008) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 105: 3011-6]). PD-1 및 유사 패밀리 구성원은 리간드 결합을 담당하는 Ig 가변형 (V형) 도메인, 및 신호전달 분자의 결합을 담당하는 세포질 테일을 함유하는 I형 막횡단 당단백질이다. PD-1의 세포질 테일은 2개의 티로신 기반 신호전달 모티프인 ITIM (면역수용체 티로신 기반 억제 모티프) 및 ITSM (면역수용체 티로신 기반 스위치 모티프)을 함유한다.
인간에서, 면역조직화학법에 의해 평가된 다수의 원발성 종양 생검에서 (종양 침윤 림프구 상에서의) PD-1 및/또는 (종양 세포 상에서의) PD-L1의 발현이 관찰되었다. 상기 조직으로는 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 결장암, 신경교종, 방광암, 유방암, 신장암, 식도암, 위암, 경구 편평 세포암, 요로 상피 세포암, 및 췌장암 뿐만 아니라, 두경부 종양을 포함한다 ([Brown, J. A., et al., (2003) J. Immunol . 170: 1257-1266]; [Dong H., et al., (2002) Nat. Med . 8: 793-800]; [Wintterle, et al., (2003) Cancer Res. 63: 7462-7467]; [Strome, S. E., et al., (2003) Cancer Res. 63: 6501-6505]; [Thompson, R. H., et al., (2006) Cancer Res. 66: 3381-5]; [Thompson, et al., (2007) Clin . Cancer Res. 13: 1757-61]; [Nomi, T., et al., (2007) Clin . Cancer Res. 13: 2151-7]). 종양 세포 상에서의 PD-리간드 발현은 다수의 종양 유형 간에 걸쳐 암 환자의 불량한 예후와 상관관계가 있다는 점이 더 눈에 띈다 ([Okazaki and Honjo, (2007) Int . Immunol. 19: 813-824]에서 리뷰).
현재까지 PD-1과 그의 리간드 (PD-L1 및 PD-L2) 사이의 상호작용이 시험관내 및 생체내에서 림프구 증식의 억제를 유도하는 것으로 밝혀졌다. PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하면, 종양 특이 T 세포 면역을 증진시킬 수 있고, 따라서, 이는 면역계에 의해 종양 세포를 제거하는 데 도움이 될 수 있다. 이러한 문제를 다루기 위하여, 많은 연구들이 시행되었다. 침습성 췌장암을 앓는 뮤린 모델에서 (Nomi, T., et al. (2007) Clin . Cancer Res. 13: 2151-2157), PD-1/PD-L1 차단의 치료학적 효능이 입증되었다. PD-1 또는 PD-L1에 대한 항체를 투여하였을 때, 종양 성장이 유의적으로 억제되었다. 항체 차단은 종양으로의 종양 반응성 CD8+ T 세포 침윤을 효과적으로 촉진시켰고, 그 결과, IFN 감마, 그랜자임 B 및 퍼포린을 비롯한 항-종양 효과기는 상향 조절되었다. 추가로, PD-1 차단은 시너지 효과를 일으키기 위해서는 화학요법과 효과적으로 병용될 수 있다고 저자는 밝혔다. 또 다른 연구에서, 마우스에서 편평 세포 암종을 앓는 모델을 사용하였을 때, PD-1 또는 PD-L1의 항체 차단이 종양 성장을 유의적으로 억제시켰다 (Tsushima, F., et al., (2006) Oral Oncol . 42: 268-274).
종양 면역을 조절하는 작용제를 사용함으로써 면역 및 증식성 장애, 예컨대, 종양 및 암을 치료하기 위한 개선된 방법 및 조성물이 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 GITR의 효능제와 함께 조합하여 PD-1의 길항제를 제공하여 진행성 단계의 종양을 치료함으로써 상기 요구를 충족시켜준다.
<도면의 간단한 설명>
도 1a-1k는 단독으로 또는 항-PD-1 항체와 함께 조합하여 투약된 항-GITR 항체가 MC38 세포주를 이식받은 마우스의 항-종양 반응에 미치는 효과를 보여주는 것이다 (n=10마리/군). 처리는 종양이 240-360 ㎣에 도달하였을 때 시작하였다.
도 2a-2f는 항-GITR 항체를 단일 투약한 후, 1주 경과하였을 때, 항-PD-1 항체를 단일 투약한 경우 (도 2b), 그 반대의 순서대로 투약한 경우 (도 2c)의 항-종양 효능을 보여주는 것이다. 이를 항체 단독인 것과 비교하였다 (도 2e-2f; n=10마리/군).
도 3a-3d는 CT26 종양 모델에서 두 항체 모두를 공동 투여한 것 (도 3a)과 비교하여 항-GITR 또는 항-PD-1 항체만을 단독으로 투여한 단일요법 (도 3c-3d)의 항-종양 효능을 보여주는 것이다 (n=10마리/군).
도 4a-4d는 단독으로 투약된 항-GITR 및 항-PD-1 항체, 또는 두 항체 모두의 공동 투여가 MB49 세포주를 이식받은 마우스의 항-종양 반응에 미치는 효과를 보여주는 것이다 (n=10마리/군). 처리는 종양이 85-122 ㎣에 도달하였을 때 시작하였다.
도 5a-5b는 혼합 림프구 반응 (MLR)에서 항-GITR (MK-4166) 및 항-PD-1 (MK-3475)의 조합이 Treg (도 5a) 및 Treg:CD8 세포 비 (도 5b)에 미치는 용량 의존적 효과를 보여주는 것이다.
도 6은 MK-4166 및 MK-3475의 조합과 함께 인큐베이션시켰을 때, MLR에서 Treg의 억제 활성은 감소되었다는 것을 보여주는 것이다.
본 발명은 환자에게 PD-1 길항제 및 GITR 효능제를 투여하는 단계로서, 여기서, PD-1 길항제 및 GITR 효능제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것인 단계를 포함하는, 환자에서 종양을 치료하는 방법을 제공함으로써 관련 기술분야 및 추가 분야에서의 상기와 같은 요구를 충족시켜준다. 특정 실시양태에서, PD-1 길항제는 PD-1 또는 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고; GITR 효능제는 GITR에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. GITR 효능제 및 PD-1 또는 PD-L1 길항제는 인간 단백질에 결합한다. 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화된 또는 완전한 인간 항체이다.
추가 실시양태에서, PD-1 길항제는 BMS-936558, MK-3475, 및 MPDL3280A로 이루어진 군으로부터 선택되고; GITR 효능제는 서열 1-66의 하나 이상의 CDR을 가지는 항체; TRX518; 및 TRX385로 이루어진 군으로부터 선택된다. GITR 효능제는 서열 1-11의 중쇄 CDR1, 서열 12-22의 중쇄 CDR2, 및 서열 23-33의 중쇄 CDR3; 및/또는 서열 34-44의 경쇄 CDR1, 서열 45-55의 경쇄 CDR2, 및 서열 56-66의 경쇄 CDR3을 가지는 항체일 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, GITR 효능제는 서열 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 및 87의 가변 중쇄; 및/또는 서열 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 및 88의 가변 경쇄를 가지는 항체이다.
본 발명은 또한 PD-1 길항제 및 GITR 효능제를 공동으로 1회 이상 투여하는 것을 고려한다. 특정 실시양태에서, PD-1 길항제 및 GITR 효능제는 공동으로 2회 이상 투여된다. 특정 실시양태에서, 종양은 진행성 단계의 종양이고, 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 예컨대, 간암종 및 간세포암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 타액선 암종, 신장암, 예컨대, 신세포 암종 및 윌름스 종양, 기저 세포 암종, 흑색종, 전립샘암, 외음부암, 갑상샘암, 고환암, 및 식도암 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 PD-1 또는 PD-L1에 결합하고, PD-1 활성을 길항시키는 제1 아암, 및 GITR에 결합하고, GITR 활성을 효능작용시키는 제2 아암을 포함하는 이중특이성 항체를 환자에게 투여함으로써 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제1 아암은 BMS-936558, MK-3475, 및 MPDL3280A로부터의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제2 아암은 서열 1-66의 하나 이상의 CDR을 가지는 항체; TRX518; 및 TRX385로부터의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 다른 실시양태에서, 제2 아암은 서열 1-11의 중쇄 CDR1, 서열 12-22의 중쇄 CDR2, 및 서열 23-33의 중쇄 CDR3; 및/또는 서열 34-44의 경쇄 CDR1, 서열 45-55의 경쇄 CDR2, 및 서열 56-66의 경쇄 CDR3을 가진다. 특정 실시양태에서, 제2 아암은 서열 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 및 87의 가변 중쇄; 및/또는 서열 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 및 88의 가변 경쇄를 가진다.
본 발명은 종양이 진행성 단계의 종양인 것인, 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 진행성 단계의 종양은 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 예컨대, 간암종 및 간세포암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 타액선 암종, 신장암, 예컨대, 신세포 암종 및 윌름스 종양, 기저 세포 암종, 흑색종, 전립샘암, 외음부암, 갑상샘암, 고환암, 및 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 PD-1 길항제 및 GITR 효능제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 진행성 단계의 종양을 치료하기 위한 GITR 효능제와 함께 조합된 PD-1 길항제의 용도 또한 제공한다.
첨부된 청구범위를 비롯한 본원에서 사용하는 바, 예컨대, "하나"("a," "an") 및 "그"와 같은 단수 형태의 단어는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 그의 상응하는 복수 형태의 지시 대상을 포함한다. 하기 표 15는 본 출원에서 사용된 서열 식별자 목록을 제공한다. 본원에서 인용된 모든 참고 문헌은 마치 각 개별 공개 문헌, 데이터베이스 엔트리 (예컨대, 진뱅크(GenBank) 서열 또는 진ID(GeneID) 엔트리), 특허 출원, 또는 특허가 참조로 포함되었다고 구체적으로 및 개별적으로 제시된 것과 같은 정도로 참조로 포함된다. 본원에서 참고 문헌을 인용하는 것은 상기 중 임의의 것이 관련 선행 기술임을 인정하는 것으로서도 의도되지 않으며, 이들 공개 문헌 또는 문헌의 내용 또는 날짜에 관해 인정하는 것으로 여겨지지 않아야 한다.
I. 정의
본원에서 사용하는 바, TNF 수용체 슈퍼패밀리 18 (TNFRSFl8), TEASR, 및 312C2로도 알려져 있는 "글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체" (본원에서 "GITR"로 약칭됨)라는 용어는 종양 괴사 인자/신경 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원을 지칭한다. GITR은 세포외 도메인 중의 3개의 시스테인 슈도-반복부를 특징으로 하는, 241개의 아미노산으로 이루어진 I형 막횡단 단백질이며, 이는 비록 Fas 유발, 덱사메타손 처리, 또는 UV 조사를 비롯한 다른 아포프토시스성 신호로부터 세포를 보호하지는 못하지만, T 세포 수용체-유도성 아포프토시스는 특이적으로 보호한다 (Nocentini, G., et al. (1997) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:6216-622). 그의 스플라이스 변이체 3개가 존재하는 것인, 인간 GITR (hGITR)의 핵산 및 아미노산 서열이 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 gi:40354198, gi:23238190, gi:23238193, 및 gi:23238196에서 살펴볼 수 있다.
"GITR 효능제"란 GITR 신호전달의 활성화를 통해 면역 반응을 자극하는 임의의 화학 화합물 또는 생물학적 분자를 의미한다. 효능제 항-GITR 항체의 서열 뿐만 아니라, TRX-385 및 TRX-518의 서열도 WO 2011/028683 및 WO 2006/105021에 제공되어 있다. GITR 결합 파트너인 가용성 GITR-L 단백질 또한 고려된다.
"PD-1 길항제"란 암 세포에서 발현된 PD-L1의 면역 세포 (T 세포, B 세포 또는 NKT 세포) 상에서 발현된 PD-1에의 결합을 차단하고, 바람직하게는 또한 암 세포에서 발현된 PD-L2의 면역 세포에서 발현된 PD-1에의 결합을 차단하는 임의의 화학 화합물 또는 생물학적 분자를 의미한다. PD-1 및 그의 리간드에 대한 별칭 또는 동의어로는 PD-1의 경우, 프로그램된 사멸 수용체 1; PDCD1, PD1, CD279 및 SLEB2; PD-L1의 경우, PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 및 B7-H; 및 PD-L2의 경우, 프로그램된 사멸 수용체 리간드 1, PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc 및 CD273을 포함한다. 인간 개체를 치료하는 것인, 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도 중 임의의 것에서, PD-1 길항제는 인간 PD-L1의 인간 PD-1에의 결합을 차단하고, 바람직하게는, 인간 PD-L1 및 PD-L2의 인간 PD-1에의 결합을 차단한다. 인간 PD-1 아미노산 서열은 NCBI 로커스 번호: NP_005009에서 살펴볼 수 있다. 인간 PD-L1 및 PD-L2 아미노산 서열은 각각 NCBI 로커스 번호: NP_054862 및 NP_079515에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도 중 임의의 것에서 유용한 PD-1 길항제로는 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 인간 PD-1 또는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는, 단일클론 항체 (mAb), 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. mAb는 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체일 수 있고, 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직한 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, F(ab')2, scFv 및 Fv 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
인간 PD-1에 결합하고, 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 유용한 mAb의 예는 US7521051, US8008449, 및 US8354509에 기술되어 있다. 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 PD-1 길항제로서 유용한 특이 항-인간 PD-1 mAb로는 문헌 [WHO Drug Information, Vol. 27, No. 2, pages 161-162 (2013)]에 기술되어 있는 구조를 포함하는 인간화된 IgG4 mAb로서, 도 6에 제시되어 있는 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인, MK-3475, 문헌 [WHO Drug Information, Vol. 27, No. 1, pages 68-69 (2013)]에 기술되어 있는 구조를 포함하는 인간 IgG4 mAb로서, 도 7에 제시되어 있는 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인, 니볼루맙 (BMS-936558); 피딜리주맙 (CT-011, 이는 또한 hBAT 또는 hBAT-1로도 공지되어 있다); 및 WO2008/156712에 기술되어 있는 인간화된 항체 h409A11, h409A16 및 h409A17을 포함한다.
인간 PD-L1에 결합하고, 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 유용한 mAb의 예는 WO2013/019906, W02010/077634 A1 및 US8383796에 기술되어 있다. 본 발명의 치료 방법, 의약 및 용도에서 PD-1 길항제로서 유용한 특이 항-인간 PD-L1 mAb로는 MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB0010718C, 및 각각 WO2013/019906의 서열 24 및 서열 21의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다.
본원에서 사용하는 바, "투여하는"이라는 용어는 암 환자에게 GITR 효능제 및 1종 이상의 추가의 암 치료제, 예컨대, PD-1 길항제를 포함하는 조성물의 물리적 도입을 의미한다. 본 발명에 따라 임의의 모든 도입 방법이 고려되며; 본 방법은 임의의 특정 도입 수단에 의존하지 않는다. 도입 수단은 통상의 기술자에게 주지되어 있으며, 그의 예는 본원에 제공되어 있다.
본원에서 사용하는 바, "공동-투여하는"이라는 용어는 GITR 효능제 및 1종 이상의 추가의 암 치료제, 예컨대, PD-1 길항제의 조합물을 동일 환자에게 투여하는 과정을 의미한다. GITR 효능제 및 PD-1 길항제는 공동으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여할 경우, GITR 효능제 및/또는 PD-1 길항제는 주어진 추가의 암 치료제 또는 치료 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. GITR 효능제 및 PD-1 길항제 치료는 같은 비히클에 의해 투여될 필요는 없다. GITR 효능제 및 PD-1 길항제는 1회 이상 투여될 수 있고, 조합물의 각 성분의 투여 횟수는 동일하거나, 또는 상이할 수 있다. 추가로, GITR 효능제 및 PD-1 길항제는 같은 부위에 투여될 필요는 없다.
본원에서 사용하는 바, "치료학상 유효량" 또는 "치료학상 유효 조합물"이라는 용어는 개체의 전신 면역 반응을 조절하는 데, 예컨대, 자극시키는 데 충분한, 양 또는 용량의 예컨대, PD-1 길항제와 같은 추가의 작용제 또는 치료법과 함께 사용되는 GITR 효능제의 양 또는 용량을 의미한다. 주어진 치료학상 유효 조합물 중 각 분자의 양은 다른 개체 및 다른 종양 유형에 대해 상이할 수 있고, 조합물 중에 포함되어 있는 하나 이상의 추가의 작용제 또는 치료법에 의존할 것이다. "호전된 치료학적 결과"를 초래하는 "치료학상 유효량"은 통상의 기술자에 의해 통상적으로 사용되는 방법을 사용하여 결정된다.
본원에서 사용하는 바, 암과 비교하여 "호전된 치료학적 결과" 및 "증진된 치료학적 효능"이라는 용어는 암 세포 또는 고형 종양 성장의 저속화 또는 축소, 또는 암 세포의 총 개수 또는 총 종양 부하량 감소를 지칭한다. 그러므로, "호전된 치료학적 결과" 또는 "증진된 치료학적 효능"이란 예를 들어, 종양 크기 축소, 종양 진행까지의 소요 시간 증가, 무진행 생존 증가, 전체 생존 기간 연장, 기대 수명 연장, 또는 삶의 질 개선을 비롯한, 임의의 임상적으로 허용되는 기준에 따라 환자의 상태가 호전된 것을 의미한다. 특히, "호전된" 또는 "증진된"이란, 치료학적 결과 또는 효능에 관한 임의의 임상적으로 허용되는 지표가 1%, 5%, 10%, 25% 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과로 호전 또는 증진되는 것을 의미한다.
본원에서 사용하는 바, "항체"라는 용어는 원하는 생물학적 활성을 보이는 임의 형태의 항체를 지칭한다. 따라서, 이는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로는, 그가 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 단일클론 항체 (전장의 단일클론 항체 포함), 다중클론 항체, 다중특이성 항체 (예컨대, 이중특이성 항체), 키메라 항체, 인간화된 항체, 완전한 인간 항체 등을 포함한다.
본원에서 사용하는 바, "GITR, PD-1, 또는 PD-L1 결합 단편," "그의 결합 단편" 또는 "그의 항원 결합 단편"이라는 용어는 본원에서 그가 여전히 실질적으로 "GITR 유도 활성"으로도 지칭되는 GITR 신호전달을 유도하는 그의 생물학적 활성을 유지하는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 별법으로, PD-1 또는 PD-L1 결합 단편은 PD-1 활성, 예컨대, PD-L1 또는 PD-L2에의 결합을 억제시키는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. "항체 단편" 또는 GITR, PD-1, 또는 PD-L1 결합 단편이라는 용어는 전장의 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자, 예컨대, sc-Fv; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다. 전형적으로, 결합 단편 또는 유도체는 그의 GITR 효능제 활성의 10% 이상을 유지한다. 바람직하게, 결합 단편 또는 유도체는, 비록 원하는 생물학적 효과를 발휘하는 데 충분한 친화도를 가지는 임의의 결합 단편이 유용하겠지만, 이는 그의 GITR 효능제 또는 PD-1 길항제 활성의 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% (또는 그 초과)를 유지한다. GITR, PD-1, 또는 PD-L1 결합 단편은 그의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 보존적 아미노산 치환을 가지는 변이체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용하는 바, "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 의미하며, 즉, 집단을 이루는 개별 항체들이 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생되는 가능한 돌연변이를 제외하면 동일한 것들이다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일의 항원성 에피토프에 대한 것이다. 대조적으로 종래 (다중클론) 항체 시료는 전형적으로 상이한 에피토프에 대한 (또는 그에 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. "단일클론"이라는 수식어는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되었다는 항체의 특징을 나타내는 것이며, 항체 제조가 어느 특정 방법에 의해 이루어져야 한다는 것으로 해석되서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 문헌 [Kohler, et al. (1975) Nature 256: 495]에 의해 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 [Clackson, et al. (1991) Nature 352: 624-628] 및 [Marks, et al. (1991) J. Mol . Biol. 222: 581-597]에 기술된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원의 단일클론 항체는 구체적으로, 그가 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 또는 그와 상동성인 반면, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 뿐만 아니라, 상기 항체의 단편과 동일하거나, 또는 그와 상동성인 것인 "키메라" 항체 (면역글로불린)를 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; [Morrison, et al. (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81: 6851-6855]).
"도메인 항체"는 오직 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역상 기능성인 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에서, 2개 이상의 VH 영역은 펩티드 링커로 공유적으로 연결되어 2가 도메인 항체를 형성한다. 2가 도메인 항체의 두 VH 영역은 동일하거나, 또는 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
"2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에서, 2개의 항원 결합 부위가 동일한 항원 특이성을 가진다. 그러나, 2가 항체는 이중특이성일 수 있다 (하기 참조).
본원에서 사용하는 바, "단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체라는 용어는 항체의 VH 및 VL 도메인이 단일 펩티드 쇄에 존재하는 것인, 상기 도메인을 포함하는 항체 단편을 의미한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. sFv에 대한 리뷰를 위해 문헌 [Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]을 참조할 수 있다.
본원의 단일클론 항체는 또한 카멜화된 단일 도메인 항체를 포함한다. "도메인 항체 단편"은 오직 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역상 기능성인 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에서, 2개 이상의 VH 영역은 펩티드 링커로 공유적으로 연결되어 다가 도메인 항체 단편을 형성한다. 2가 도메인 항체 단편의 두 VH 영역은 동일하거나, 또는 상이한 항원을 표적화할 수 있다. 예컨대, 문헌 [Muyldermans, et al. (2001) Trends Biochem . Sci. 26:230]; [Reichmann, et al. (1999) J. Immunol . Methods 231:25]; WO 94/04678; WO 94/25591; 미국 특허 번호 6,005,079를 참조할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 단일 도메인 항체가 형성되도록 변형된 두 VH 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체를 제공한다.
본원에서 사용하는 바, "디아바디"라는 용어는, 단편이 동일 폴리펩티드 쇄에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 (VH-VL 또는 VL-VH), 두 항원 결합 부위를 포함하는 소형 항체 단편을 의미한다. 동일 쇄 상에서 두 도메인 사이의 쌍 형성이 이루어질 수 있도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 강제로 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하여, 두 항원 결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 예컨대, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Holliger, et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448]에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 조작된 항체 변이체의 리뷰를 위해서는 일반적으로 문헌 [Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136]을 참조할 수 있다.
본원에서 사용하는 바, "인간화된 항체"라는 용어는 비-인간 (예컨대, 뮤린 항체) 뿐만 아니라, 인간 항체로부터의 서열을 함유하는 항체 형태를 의미한다. 상기 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 초가변 루프는 모두 또는 실질적으로 모두 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역은 모두 또는 실질적으로 모두 인간 면역글로불린 서열의 것인, 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화된 항체는 또한 임의적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로, 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다. "hum," "hu" 또는 "h"라는 접두사는 인간화된 항체를 모체 설치류 항체와 구별짓는 것이 필요할 경우에 항체 클론 명칭에 부가된다. 설치류 항체의 인간화된 형태는, 비록 친화도 증가, 인간화된 항체의 안정성 증가 또는 다른 이유에서 특정 아미노산 치환을 포함할 수는 있지만, 일반적으로는 모체 설치류 항체와 동일한 CDR 서열을 포함한다.
"완전한 인간 항체"라는 용어는 오직 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다. 완전한 인간 항체는 마우스에서, 마우스 세포에서, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 제조될 경우, 뮤린 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "래트 항체"란 각각 오직 마우스 또는 래트 면역글로불린 서열만을 포함하는 항체를 의미한다. 완전한 인간 항체는 파지 디스플레이 또는 다른 분자 생물학적 방법에 의해 인간에서, 인간 인간 면역글로불린 생식세포계열 서열을 가지는 트랜스제닉 동물에서 생성될 수 있다. 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 예시적인 기법은 미국 특허 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140에 기술되어 있다. 다른 기법, 예컨대, 라이브러리의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 항체로는 변경된 효과기 기능을 제공하기 위하여 Fc 영역이 변형된 (또는 차단된) 항체를 포함한다. 예컨대, 미국 특허 번호 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; [Presta (2006) Adv . Drug Delivery Rev. 58:640-656]을 참조할 수 있다. 상기 변형은 가능하게는 진단 및 치료에서 유익한 효과가 있는, 면역계의 다양한 반응을 증진시키거나, 또는 억제시키는 데 사용될 수 있다. Fc 영역의 변경으로는 아미노산 변이 (치환, 결실 및 삽입), 글리코실화 또는 탈글리코실화, 및 다중 Fc 부가를 포함한다. Fc 변이는 또한 치료학적 항체에서 항체의 반감기를 변경시킬 수 있으며, 반감기가 장기화됨에 따라 덜 빈번하게 투약할 수 있고, 동시에 더욱 편리해지게 되고, 물질 사용은 감소될 수 있다. 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin . Immunol .116:731 at 734-35]를 참조할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 완전한 효과기 기능을 제공하는 무손상 Fc 영역을 포함하는 항체, 예컨대, 보체 의존성 세포독성 (CDC), 또는 표적화된 세포에서 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 유도하는 이소형 IgG1의 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 또한 세포독성 페이로드, 예컨대, 세포독성제 또는 방사성 핵종에 접합된 항체를 포함한다. 상기 항체 접합체는 그의 표면 상에 특정 항원을 발현하는 세포를 선택적으로 표적화하고, 사멸시키기 위해 항-GITR, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 치료와 함께 면역요법에서 사용될 수 있다. 세포독성제의 예로는 리신, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 슈도모나스(Psuedomonas) 외독소, 사포린, 디프테리아 독소, 시스플라틴, 독소루비신, 아브린 독소, 겔로닌 및 포크위드 항바이러스 단백질을 포함한다. 본 발명의 항체와 함께 면역요법에서 사용하기 위한 방사성 핵종의 예로는 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 211At, 177Lu, 143Pr 및 213Bi를 포함한다. 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0014225를 참조할 수 있다.
이중특이성 항체 또한 본 방법 및 조성물에서 유용하다. 본원에서 사용하는 바, "이중특이성 항체"라는 용어는 2개 이상의 상이한 항원성 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 항체, 전형적으로, 단일클론 항체를 의미한다. 한 실시양태에서, 에피토프는 동일 항원으로부터의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 상이한 두 항원으로부터의 것이다. 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 두 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Milstein, et al. (1983) Nature 305: 537-39]를 참조할 수 있다. 별법으로, 이중특이성 항체는 화학 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Brennan, et al. (1985) Science 229:81]을 참조할 수 있다. 이중특이성 항체는 이중특이성 항체 단편을 포함한다. 예컨대, 문헌 [Holliger, et al. (1993) Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A . 90:6444-48], [Gruber, et al. (1994) J. Immunol . 152:5368]을 참조할 수 있다.
"다중특이성"이라는 용어는 1 초과의 표적 항원에 대한 특이성을 가지는 결합 분자를 포함한다. 상기 분자는, 각 결합 부위가 상이한 표적 분자, 또는 동일 표적 상의 상이한 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 (예컨대, 그와 면역반응하는) 것인, 1 초과의 결합 부위를 가진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이성 결합 분자는 2개 이상의 표적, 예컨대, 1 초과의 표적 분자, 또는 동일 표적 분자 상의 1 초과의 에피토프에 대해 결합 특이성을 가지는 이중특이성 분자 (예컨대, 항체, 미니바디, 도메인 결실 항체, 또는 융합 단백질)이다.
본원에서 사용하는 바, "초가변 영역"이라는 용어는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예컨대, 경쇄 가변 도메인 중 잔기 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) 및 89-97 (CDRL3) 및 중쇄 가변 도메인 중 잔기 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) 및 95-102 (CDRH3) (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 상기 잔기 (예컨대, 경쇄 가변 도메인 중 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 중 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk (1987) J. Mol . Biol. 196: 901-917))를 포함한다. 본원에서 사용하는 바, "프레임워크" 또는 "FR" 잔기라는 용어는 본원에서 CDR 잔기로서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 상기의 잔기 번호매김은 카바트(Kabat) 번호매김 체계에 관한 것이다.
"결합 화합물"은 표적에 결합할 수 있는, 분자, 소분자, 거대분자, 폴리펩티드, 항체 또는 단편 또는 그의 유사체, 또는 가용성 수용체를 지칭한다. "결합 화합물"은 또한 표적에 결합할 수 있는, 예컨대, 인산화, 아실화, 공유 결합, 고리화, 또는 제한 절단에 의해 변형된 공유적으로 또는 비-공유적으로 변형된 분자에, 및 이온화된 분자에의 비-공유 복합체와 같은 분자 복합체를 지칭할 수 있다. 항체와 관련하여 사용될 때, "결합 화합물"이라는 용어는 항체 및 그의 항원 결합 단편, 둘 모두를 지칭한다. "결합"이란, 결합 조성물과 표적과의 회합을 의미하는 것으로서, 여기서, 결합 조성물이 용액 중에 용해 또는 현탁될 수 있는 경우에는, 상기 회합을 통해 결합 조성물의 정규 브라운 운동은 감소되는 것인 회합을 의미한다. "결합 조성물"은 표적에 결합할 수 있는, 안정화제, 부형제, 염, 완충제, 용매, 또는 첨가제와 함께 조합된 분자, 예컨대, 결합 화합물을 의미한다.
본원에서 사용하는 바, ~의 "보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"이란, 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 대개는 생성된 항체의 생물학적 활성은 변경시키지 않으면서, 심지어는 항체의 필수 영역에 대해 이루어질 수 있는 아미노산 치환을 의미한다. 그러한 예시적인 치환은 바람직하게는 하기 표 1에 기재된 것에 따라 이루어진다:
<표 1>
Figure 112016015635315-pct00001
통상의 기술자는 일반적으로 폴리펩티드의 비필수 영역 내의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않을 수 있음을 알고 있다. 예컨대, 문헌 [Watson, et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.　224 (4th Edition)]를 참조할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위 전역에 걸쳐 사용되는 바, "본질적으로 ~으로 이루어지다(consists essentially of)"라는 어구 또는 예컨대, "본질적으로 ~으로 이루어지다(consist essentially of)" 또는 "본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 어미 변형 표현은 임의의 언급된 요소 또는 요소의 군의 포함, 및 명시된 투여 요법, 방법 또는 조성물의 기본적인 또는 신규한 특성을 크게 변경시키지 않는, 언급된 요소 이외의 유사한 또는 상이한 성질을 갖는 다른 요소의 임의의 포함을 나타낸다. 비제한적인 예로서, 본질적으로 언급된 아미노산 서열로 이루어진 결합 화합물은 또한 결합 화합물의 특성에 크게 영향을 주지 않는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
"면역 병증" 또는 "면역 장애"는 예컨대, 병리학적 염증, 염증성 장애, 및 자가면역 장애 또는 질환을 포함한다. "면역 병증"은 또한 면역계에 의한 제거에 저항하는 감염, 종양, 및 암을 비롯한, 감염, 지속 감염, 및 증식성 병증, 예컨대, 암, 종양, 및 혈관신생을 의미한다. "암성 병증"은 예컨대, 암, 암세포, 종양, 혈관신생, 및 전암성 병증, 예컨대, 이형성증을 포함한다.
"증식 활성"은 예컨대, 정상적인 세포 분열 뿐만 아니라, 암, 종양, 이형성증, 세포 형질변환, 전이, 및 혈관신생을 촉진시키는, 즉, 그에 필요하거나, 또는 그와 특이적으로 관련된 활성을 포함한다.
"암," "종양," "암성" 및 "악성"이라는 용어는 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 병증을 나타내거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 예를 들어, 선암종, 림프종, 모세포종, 흑색종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장관암, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 예컨대, 간암종 및 간세포암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 타액선 암종, 신장암, 예컨대, 신세포 암종 및 윌름스 종양, 기저 세포 암종, 흑색종, 전립샘암, 외음부암, 갑상샘암, 고환암, 식도암, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
암성 세포가 성장하고 복제됨에 따라, 이들은 인접해 있는 정상 조직을 침입하여 파괴하는, 즉, 종양인 것인 암성 조직 덩어리를 형성한다. 악성 종양은 암이다. 악성 종양은 대체로 제거될 수 있지만, 다시 성장할 수 있다. 악성 종양으로부터의 세포는 조직 및 기관 주변을 침입하여 손상시킬 수 있다. 또한, 암 세포는 악성 종양으로부터 빠져나와, 암세포가 원발성 종양 (즉, 본래의 암)으로부터 전파되는 길인 혈류 또는 림프계로 진입하여 다른 기관에서 새로운 종양을 형성할 수 있다. 신체에서 암의 전파는 전이로 불린다. (What You Need to Know About Cancer- an Overview, NIH Publication No.　00-1566; posted Sept. 26, 2000, updated Sept. 16, 2002 (2002)).
본원에서 사용되는 바, "고형 종양"이라는 용어는 대체로 낭 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 성장 또는 덩어리를 의미한다. 고형 종양은 양성 (암성이 아님) 또는 악성 (암성)일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 그를 형성하는 세포 유형에 따라 명명된다. 고형 종양의 예로는 육종, 암종, 및 림프종이 있다. 백혈병 (혈액암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다 (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).
또한 "종양 로드로도 지칭되는 "종양 부하량"은 신체 전역에 분포되어 있는 종양 물질의 총량을 의미한다. 종양 부하량이란 림프절 및 골수를 비롯한, 신체 전역의 암 세포의 총 개수 또는 종양(들)의 전체 크기를 의미한다. 종양 부하량은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해, 예컨대, 종양(들)을 예컨대, 캘리퍼를 이용하여 대상체로부터 제거할 때, 또는 신체에 있는 동안 영상화 기법, 예컨대, 초음파, 골 스캔, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 자기 공명 영상 (MRI) 스캔을 사용하여 그의 크기를 측정함으로써 측정될 수 있다.
"종양 크기"는 종양의 길이 및 너비로 측정될 수 있는 종양의 전체 크기를 지칭한다. 종양 크기는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해, 예컨대, 종양(들)을 예컨대, 캘리퍼를 이용하여 대상체로부터 제거할 때, 또는 신체에 있는 동안 영상화 기법, 예컨대, 골 스캔, 초음파, CT 또는 MRI 스캔을 사용하여 그의 크기를 측정함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용하는 바, "원발성 암"이라는 용어는 본래의 종양 또는 최초의 종양을 의미한다. 암은 신체의 임의의 기관 또는 조직에서 시작될 수 있다. 암은 대체로 암이 기원하는 신체의 일부분 또는 세포의 유형을 따라 명명된다 (Metastatic Cancer: Questions and Answers, Cancer Facts 6.20, National Cancer Institute, reviewed Sept. 1, 2004 (2004)).
본원에서 사용하는 바, "계내 암종(carcinoma in situ)"이라는 용어는 그 세포가 성장하기 시작한 조직 내에 계속 함유되어 있고, 아직은 신체 다른 부분으로의 침습성을 띠거나, 그로 전파되지는 않은 암성 세포를 의미한다.
본원에서 사용하는 바, "암종"이라는 용어는 신체의 표면을 덮고, 호르몬을 생산하며, 샘을 구성하는 세포인 상피 세포의 암을 의미한다. 암종의 예로는 피부암, 폐암, 결장암, 위암, 유방암, 전립샘암 및 갑상샘암이 있다.
본원에서 사용하는 바, "단리된 핵산 분자"라는 용어는 항체 핵산의 천연 공급원에서 통상 그와 회합 상태로 있는 1종 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다른 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구분된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 예컨대, 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재할 경우, 항체를 통상적으로 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
"제어 서열"이라는 표현은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 관여하는 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열로는 예를 들어, 프로모터, 임의적으로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 사용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결되어 있는 것이다." 예를 들어, 예비 서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비 단백질로서 발현될 경우, 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 리보솜 결합 부위가 번역을 촉진시키기 위해 배치되는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이라는 것은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있다는 것을 의미하며, 분비 리더인 경우에는, 인접해 있고, 리딩 프레임 내에 존재한다는 것을 의미하는 것이다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 통상의 용례에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용된다.
본원에서 사용하는 바, "세포," "세포주", 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호교환적으로 사용되고, 상기의 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 1차 대상 세포 및 전달 횟수에 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손이 의도적이거나 우연한 돌연변이에 의해 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해하여야 한다. 처음 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이체 자손이 포함된다. 별도의 명칭이 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 분명해질 것이다.
본원에서 사용하는 바, "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 예컨대, 미국 특허 번호 4,683,195에 기술된 바와 같이, 소량의 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특이 조각을 증폭시키는 방법 또는 기법을 의미한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인할 수 있도록 관심 영역 또는 그 이상의 영역의 단부로부터의 서열 정보가 이용가능하여야 하고; 이들 프라이머는 증폭시키고자 하는 주형의 대향 가닥에 대해 동일하거나 유사한 서열일 것이다. 2개의 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭되는 물질의 단부와 일치할 수 있다. PCR은 특이적 RNA 서열, 총 게놈 DNA으로부터의 특이적 DNA 서열, 및 전체 세포성 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌 [Mullis, et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 51:263]; [Erlich, ed., (1989) PCR Technology (Stockton Press, N.Y.)]를 참조할 수 있다. 본원에서 사용하는 바, PCR은 핵산의 특이적 조각을 증폭 또는 생성하기 위해 프라이머 및 핵산 폴리머라제로서 공지된 핵산을 사용하는 것을 포함하는, 핵산 시험 샘플을 증폭시키는 핵산 중합효소 반응 방법 중 하나이지, 유일의 것은 아닌 것으로 간주된다.
본원에서 사용하는 바, "생식세포계열 서열"이라는 용어는 설치류 (예컨대, 마우스) 및 인간 생식세포계열 서열을 비롯한, 재배열되지 않은 면역글로불린 DNA 서열의 서열을 나타낸다. 재배열되지 않은 면역글로불린 DNA의 임의의 적합한 공급원이 사용될 수 있다. 인간 생식세포계열 서열은 예를 들어, 미국 국립보건연구원(United States National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근육골격 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 웹사이트 상의 조인솔버 (JOINSOLVER)® 생식세포계열 데이터베이스로부터 수득할 수 있다. 마우스 생식세포계열 서열은 예를 들어, 문헌 [Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261]에 기술되어 있는 바와 같이 수득할 수 있다.
예컨대, GITR 활성의 증진 정도를 조사하기 위해서, 예컨대, 제시된 단백질, 유전자, 세포, 또는 유기체를 포함하는 샘플 또는 검정물을 잠재적인 활성화제 또는 억제제로 처리하고, 불활성 대조군 분자로 처리된 대조군 샘플과 비교한다. 대조군 샘플의 상대적인 활성 값은 100%인 것으로 배정한다. 억제는 대조군과 비교하여 상대적인 활성 값이 약 90% 이하, 전형적으로 85% 이하, 더욱 전형적으로 80% 이하, 가장 전형적으로 75% 이하, 일반적으로 70% 이하, 더욱 일반적으로 65% 이하, 가장 일반적으로 60% 이하, 전형적으로 55% 이하, 대체로 50% 이하, 더욱 대체로 45% 이하, 가장 대체로 40% 이하, 바람직하게 35% 이하, 더욱 바람직하게 30% 이하, 더욱더 바람직하게 25% 이하, 및 가장 바람직하게 20% 미만일 때 달성된다. 활성화는 대조군과 비교하여 상대적인 활성 값이 약 110%, 일반적으로 120% 이상, 더욱 일반적으로 140% 이상, 더욱 일반적으로 160% 이상, 종종 180% 이상, 더욱 종종 2배 이상, 가장 종종 2.5배 이상, 대체로 5배 이상, 더욱 대체로 10배 이상, 바람직하게 20배 이상, 더욱 바람직하게 40배 이상, 및 가장 바람직하게 40배 초과일때 달성된다.
활성화 또는 억제에서 종점은 하기와 같이 모니터링될 수 있다. 예컨대, 세포, 생리학적 유체, 조직, 기관, 및 동물 또는 인간 대상체의 활성화, 억제, 및 처리에 대한 반응은 종점에 의해 모니터링될 수 있다. 종점은 예컨대, 미리 결정된 양 또는 비율(%)의 염증, 발암성, 또는 세포 탈과립화 또는 분비, 예컨대, 시토카인, 독성 산소, 또는 프로테아제 방출의 표시를 포함할 수 있다. 종점은 예컨대, 미리 결정된 양의 이온 흐름 또는 수송; 세포 이동; 세포 부착; 세포 증식; 전이 가능성; 세포 분화; 및 표현형의 변화, 예컨대, 염증, 아포프토시스, 형질전환, 세포 주기, 또는 전이와 관련된 유전자 발현의 변화를 포함할 수 있다 (예컨대, [Knight (2000) Ann. Clin . Lab. Sci . 30:145-158]; [Hood and Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100]; [Timme, et al. (2003) Curr . Drug Targets 4:251-261]; [Robbins and Itzkowitz (2002) Med . Clin . North Am. 86:1467-1495]; [Grady and Markowitz (2002) Annu . Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128]; [Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243]; [Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126] 참조).
억제의 종점은 일반적으로 대조군의 75% 이하, 바람직하게 대조군의 50% 이하, 더욱 바람직하게 대조군의 25% 이하, 가장 바람직하게 대조군의 10% 이하이다. 일반적으로, 활성화의 종점은 대조군의 150% 이상, 바람직하게 대조군의 2배 이상, 더욱 바람직하게 대조군의 4배 이상, 및 가장 바람직하게 대조군의 10배 이상이다.
"소분자"는 분자량이 10 kDa 미만, 전형적으로 2 kDa 미만, 및 바람직하게 1 kDa 미만인 분자로서 정의된다. 소분자로는 무기 분자, 유기 분자, 무기 성분을 함유하는 유기 분자, 방사성 원자를 포함하는 분자, 합성 분자, 펩티드 모방체, 및 항체 모방체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료제로서, 소분자는 대분자보다 세포로의 더욱 큰 투과성을 가지고, 덜 쉽게 분해되고, 면역 반응 유발 경향이 더 작을 수 있다. 소분자 예컨대, 항체 및 시토카인의 펩티드 모방체, 및 소분자 독소는 문헌에 기술되어 있다. 예컨대, 문헌 [Casset, et al. (2003) Biochem . Biophys. Res. Commun . 307:198-205]; [Muyldermans (2001) J. Biotechnol . 74:277-302]; [Li (2000) Nat. Biotechnol . 18:1251-1256]; [Apostolopoulos, et al. (2002) Curr . Med . Chem . 9:411-420]; [Monfardini, et al. (2002) Curr . Pharm. Des. 8:2185-2199]; [Domingues, et al. (1999) Nat. Struct . Biol . 6:652-656]; [Sato and Sone (2003) Biochem . J. 371:603-608]; 미국 특허 번호 6,326,482를 참조할 수 있다.
리간드/수용체, 항체/항원, 또는 다른 결합 쌍을 언급할 때 "특이적으로" 또는 "선택적으로" 결합한다는 것은 단백질 및 다른 생물학적 물질로 이루어진 불균일한 집단 내에 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 지정된 조건하에서, 명시된 리간드는 특정 수용체에 결합하고, 샘플 내에 존재하는 다른 단백질에는 유의적인 양으로 결합하지 않는다. 본원에서 사용되는 바, 항체는 항체가 GITR의 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하지만, GITR의 서열이 결여된 단백질에는 결합하지 않는다면, 주어진 서열 (본 경우에서는 GITR)을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다고 말할 수 있다. 예를 들어, GITR을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 FLAG®-태깅된 형태의 GITR에 결합할 수 있지만, 다른 FLAG®-태깅된 단백질에는 결합하지 않을 것이다.
"에피토프" 또는 "항원 결정기"라는 용어는 결합 분자가 특이적으로 결합하게 되는 항원 상의 부위를 의미한다. 에피토프는 인접한 아미노산 또는 단백질의 3차원 폴딩에 의해 병치된 비인접한 아미노산, 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성화 용매에의 노출시에도 유지되는 반면, 3차원 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성화 용매 처리시에는 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체구조로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 이상의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체구조를 측정하는 방법으로는 예를 들어, X선 결정학법 및 2-차원 핵 자기 공명법을 포함한다.
같은 에피토프를 인식하는 결합 분자는 또 다른 항체의 표적 항원에의 결합을 차단할 수 있는 한 항체의 능력을 보여주는 단순 면역검정법, 즉, 경쟁적 결합 검정법으로 확인될 수 있다. 경쟁적 결합은 시험되는 결합 분자가 참조 결합 분자의 공통 항원, 예컨대, GITR에의 특이적인 결합을 억제시키는 것인 검정법으로 측정된다. 많은 유형의 경쟁적 결합 검정법이 공지되어 있으며, 그 예로는 고체상 직접 또는 간접 방사성면역검정법 (RIA); 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정법 (EIA) 샌드위치 경쟁 검정법 ([Stahli, et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA ([Kirkland, et al., (1986) J. Immunol. 137:3614] 참조); 고체상 직접 표지화된 검정법, 고체상 직접 표지화된 샌드위치 검정법 ([Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); 1-125 표지를 이용하는 고체상 직접 표지 RIA ([Morel, et al., (1988) MoI . Immunol.25(1):7] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung, et al., (1990) Virology 176:546); 및 직접 표지화된 RIA (Moldenhauer, et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77)가 있다.
전형적으로, 상기와 같은 검정법은 이들 비표지화된 시험 결합 분자 및 표지화된 참조 결합 분자 중 어느 것을 포함하는 고체 표면 또는 세포에 결합하는 정제된 항원을 이용하는 것을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 결합 분자의 존재하에서 고체 표면 또는 세포에 결합한 표지의 양을 측정함으로써 측정된다.
대체로 시험 결합 분자는 과량으로 존재한다. 대체로, 경쟁 결합 분자가 과량으로 존재할 경우, 이는 참조 결합 분자의 공통 항원에의 특이적인 결합을 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 또는 그 초과만큼 억제시킬 것이다.
고려되는 방법의 항체, 또는 항체의 항원-결합 부위로부터 유래된 결합 조성물은 비관련 항원과의 친화도보다 2배 이상 더 큰, 바람직하게 10배 이상 더 큰, 더욱 바람직하게 20배 이상 더 큰, 및 가장 바람직하게 100배 이상 더 큰 친화도로 그의 항원에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 예컨대, 스캐챠드(Scatchard) 분석에 의해 측정될 때, 약 109 리터/몰 초과의 친화도를 가질 것이다 (Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239).
II. 일반
본 발명은 항-GITR 및 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는 GITR 효능제 및 PD-1 길항제의 조합물을 이용하여 진행성 단계의 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
III. 제약 조성물
제약 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, GITR, PD-1, 또는 PD-L1 항체를 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 혼합한다. 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S . Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]를 참조할 수 있다.
치료제 및 진단제 제제는 예컨대, 동결건조된 분제, 슬러리, 수성 액제 또는 수성 현탁제의 형태로 생리학상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY]; [Gennaro (2000) Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY]; [Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY]; [Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY]를 참조할 수 있다.
단독으로 또는 면역억제제와 함께 조합되어 투여되는 항체 조성물의 독성 및 치료학적 효능은 예컨대, LD50 (집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료학상 효과적인 용량)를 측정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량비가 치료 지수이며, 이는 LD50 대 ED50의 비로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 항체가 바람직하다. 이러한 세포 배양물 검정법 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제제화하는 데 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성은 거의 없거나, 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 존재한다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 달라질 수 있다.
투여 모드는 특별히 중요하지 않다. 적합한 투여 경로는 예를 들어, 경구, 직장, 경점막, 또는 장내 투여; 비경구 전달, 예를 들어, 근육내, 피하, 척수내 주사, 및 경막내, 직접적인 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비내, 또는 안내 주사를 포함할 수 있다. 제약 조성물에서 또는 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용되는 항체의 투여는 다양한 종래 방식, 예컨대, 경구 섭취, 흡입, 국소 적용 또는 피부, 피하, 복강내, 비경구, 동맥내 또는 정맥내 주사로 수행될 수 있다.
별법으로, 항체를 전신 방식보다는 국부 방식으로, 예를 들어, 관절염성 관절 또는 면역병상을 특징으로 하는 병원체-유도 병변 내로의 직접적인 항체 주사를 통해, 종종 데포 또는 지효성 제제로 투여할 수 있다. 추가로, 항체를, 예를 들어, 관절염성 관절 또는 면역병상을 특징으로 하는 병원체-유도 병변을 표적화하는 표적화된 약물 전달 시스템, 예를 들어, 조직 특이성 항체로 코팅된 리포솜으로 투여할 수 있다. 리포솜은 이환된 조직으로 표적화되고, 그에 의해 선택적으로 흡수될 것이다.
치료제에 대한 투여 요법을 선택하는 것은 엔티티의 혈청 또는 조직 교체율, 증상의 수준, 엔티티의 면역원성, 및 생물학적 매트릭스 내의 표적 세포의 접근성을 비롯한 수개의 인자에 따라 결정된다. 바람직하게, 투여 요법은 허용가능한 수준의 부작용에 지장 없이 환자에게 전달되는 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물학적 물질의 양은 부분적으로는 특정 엔티티 및 치료되는 병증의 중증도에 따라 결정된다. 항체, 시토카인, 및 소분자의 적절한 용량의 선택을 위한 가이던스가 이용가능하다. 예컨대, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK]; [Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY]; [Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY]; [Baert, et al. (2003) New Engl . J. Med. 348:601-608]; [Milgrom, et al. (1999) New Engl . J. Med . 341:1966-1973]; [Slamon, et al. (2001) New Engl . J. Med . 344:783-792]; [Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl . J. Med . 342:613-619]; [Ghosh, et al. (2003) New Engl . J. Med. 348:24-32]; [Lipsky, et al. (2000) New Engl . J. Med . 343:1594-1602]를 참조할 수 있다.
적절한 용량은 예컨대, 치료에 영향을 주는 것으로 관련 기술분야에 알려져 있거나, 또는 그러한 것으로 의심되거나, 또는 치료에 영향을 줄 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 의사에 의해 결정된다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양으로 시작하여, 이후, 임의의 부작용에 비해 원하는 또는 최적의 효과를 달성할 때까지 소량의 증분량만큼씩 증가된다. 중요한 진단 척도로는 예컨대, 염증의 증상 또는 생산된 염증성 시토카인의 수준을 포함한다. 바람직하게, 사용되는 생물학적 물질은 실질적으로 치료를 위해 표적화된 동물과 동일한 종으로부터 유래됨에 따라 (예를 들어, 인간 대상체의 치료를 위한 경우에는 인간화된 항체), 이에 시약에 대한 임의의 면역 반응을 최소화된다.
항체 및 항체 단편은 연속적인 주입에 의해, 또는 예컨대, 1일, 매주 1-7회, 1주, 2주, 매월, 격월 등의 간격을 두고 투약에 의해 제공될 수 있다. 용량은 정맥내, 피하, 국소적으로, 경구, 비강, 직장, 근육내, 뇌내, 척수내, 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 바람직한 투약 프로토콜은 유의적인 바람직하지 않은 부작용을 방지하는 최대 용량 또는 투약 빈도를 포함하는 것이다. 주당 총 용량은 일반적으로 적어도 0.05 ㎍/kg (체중), 0.2 ㎍/kg (체중), 0.5 ㎍/kg (체중), 1 ㎍/kg (체중), 10 ㎍/kg (체중), 100 ㎍/kg (체중), 0.2 mg/kg (체중), 1.0 mg/kg (체중), 2.0 mg/kg (체중), 10 mg/kg (체중), 25 mg/kg (체중), 50 mg/kg (체중) 또는 그 초과이다. 예컨대, 문헌 [Yang, et al. (2003) New Engl . J. Med . 349:427-434]; [Herold, et al. (2002) New Engl . J. Med . 346:1692-1698]; [Liu, et al. (1999) J. Neurol . Neurosurg . Psych. 67:451-456]; [Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol . Immunother . 52:133-144]를 참조할 수 있다. 소분자 치료제, 예컨대, 펩티드 모방체, 천연 생성물, 또는 유기 화학 물질의 원하는 용량은 몰/kg 기준으로 항체 또는 폴리펩티드에 대한 것과 거의 동일하다.
제2 치료제, 예컨대, 시토카인, 항체, 스테로이드, 화학요법제, 항생제, 항-바이러스제, 또는 방사선 조사와의 공동 투여 또는 치료 방법은 관련 기술분야에 주지되어 있고, 예컨대, 문헌 [Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY]; [Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA]; [Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA]를 참조할 수 있다. 특히, PD-1 또는 PD-L1 항체 투여는 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체를 먼저 투여한 후, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체를 주기적으로 (예컨대, 1주 후 또는 매주) 투약할 수 있다. 별법으로, 항-PD-1 또는 PD-L1 항체로 처리한 후, 이어서, 유사한 스케줄로 항-GITR 항체로 처리할 수 있다. 추가 실시양태에서, 항-GITR 항체는 적어도 단일 치료로 또는 다중 투약으로 (예컨대, 매주 투여) 항-PD-1 또는 항-PD-L1과 함께 공동 투여된다.
GITR, PD-1 또는 PD-L1 항체는 알킬화제, 예컨대, 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대, 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예컨대, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예컨대, 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레틸아민 옥시드 히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대, 엔다이인 항생제 (예컨대, 칼리케아미신, 특히, 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예컨대, [Agnew, Chem . Intl . Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신, 예컨대, 다이네미신 A; 비스포스포네이트, 예컨대, 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소 단백질 엔다이인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐제, 예컨대, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날제, 예컨대, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예컨대, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드, 예컨대, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products: 미국 오레곤주 유진)); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리콜테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대, 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology: 미국 뉴저지주 프린스톤)), 아브락산(ABRAXANE)™ 파클리탁셀의 크레모포르-무함유, 알부민-처리된 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너즈(American Pharmaceutical Partners: 미국 일리노이주 샤움버그)), 및 탁소텔(TAXOTERE)® 독세탁셀 (롱-쁘랑 로러(Rhoene-Poulenc Rorer: 프랑스 안토니)); 클로람부실; 젬자(GEMZAR)® 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다(XELODA)® 카페시타빈; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대, 레티노산; 및 상기 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 비롯한 화학요법제와 함께 조합될 수 있다.
또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대, 항-에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어, 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON) 토레미펜; 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세 (MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐제, 예컨대, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라, 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 이상 세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대, PKC-알파, Ralf, 및 H-Ras; 리보자임, 예컨대, VEGF 발현 억제제 (예컨대, 안지오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예컨대, 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 프롤류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 및 상기 물질 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
병용 요법은 종양 크기가 약 175 ㎣ 이상인 진행성 단계의 종양을 치료하는 데 사용된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 병용 요법은 약 200 ㎣, 300 ㎣, 400 ㎣, 500 ㎣, 750 ㎣ 이상, 최대 1,000 ㎣인 종양을 치료하는 데 사용된다. 본 발명의 병용 요법은 촉진에 의해, 또는 관련 기술분야에 주지되어 있는 영상화 기법, 예컨대, MRI, 초음파, 또는 CAT 스캔에 의해 발견될 수 있을 정도로 큰 종양을 치료하는 데 사용된다.
두 화합물의 "시너지 효과"란 두 작용제의 조합 효과가 그의 개별 효과의 총합보다 더 크고, 대조군 및 단일 약물과 통계학상 상이한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 병용 요법은 상가 효과를 가진다. 두 화합물의 "상가 효과"란 두 작용제의 조합 효과가 그의 개별 효과의 총합이고, 대조군 및/또는 단일 약물과 통계학상 상이한 것이다.
대상 방법을 통해 종양 크기는 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 42% 초과, 약 43% 초과, 약 44% 초과, 약 45% 초과, 약 46% 초과, 약 47% 초과, 약 48% 초과, 약 49% 초과, 약 50% 초과, 약 51% 초과, 약 52% 초과, 약 53% 초과, 약 54% 초과, 약 55% 초과, 약 56% 초과, 약 57% 초과, 약 58% 초과, 약 59% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 또는 약 100% 초과로 억제된다. 한 실시양태에서, GITR 결합 분자를 PD-1 길항제 분자와 함께 투여하면, 진행성 종양은 완전히 퇴행될 수 있다.
항-바이러스 치료제와의 GITR 효능제/PD-1 길항제의 조합의 공동 투여 또한 고려된다. 항-바이러스제로는 바이러스를 파괴하는 임의의 약물을 포함한다. 항-바이러스제로는 바이러스의 복제를 억제하는 기능을 하는 인터페론, 프로테아제 억제제, 및 역전사 효소 억제제 또는 HIV에 대한 고활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)의 조합물에 함유되는 물질을 포함할 수 있다.
전형적인 수의용, 실험용, 또는 연구용 대상체로는 원숭이, 개, 고양이, 래트, 마우스, 토끼, 기니 피그, 말, 및 인간을 포함한다.
IV. 용도
암
GITR, PD-1, 또는 PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편은 암을 치료하는 데 (즉, 종양 세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 데) 사용될 수 있다. 본 발명의 항체를 사용함으로써 그의 성장이 억제될 수 있는 것인 바람직한 암으로는 전형적으로는 면역요법에 반응성인 암 뿐만 아니라, 현재까지는 면역요법과 관련이 없는 암을 포함한다. 치료에 바람직한 암에 관한 비제한적인 예로는 흑색종 (예컨대, 전이성 악성 흑색종), 신장암 (예컨대, 투명 세포 암종), 전립샘암 (예컨대, 호르몬 무반응 전립샘 샘암종), 췌장 샘암종, 유방암, 결장암, 폐암 (예컨대, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부의 편평 세포 암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상샘암, 교모세포종, 신경교종, 백혈병, 림프종, 및 다른 신생물성 악성 종양을 포함한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용함으로써 그의 성장이 억제될 수 있는 것인 무반응 또는 재발성 악성 종양을 포함한다.
GITR 효능제/PD-1 길항제 항체 또는 항원 결합 단편은 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 다른 항-신생물성 작용제 또는 면역원성 작용제 (예를 들어, 약독화된 암성 세포, 종양 항원 (재조합 단백질, 펩티드 및 탄수화물 분자 포함), 항원 제시 세포, 예컨대, 종양 유래 항원 또는 핵산으로 펄스된 수지상 세포, 면역 자극 시토카인 (예를 들어, IL-2, IFNa2, GM-CSF), 및 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, GM-CSF와 같은 면역 자극 시토카인을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포); 표준 암 치료법 (예를 들어, 화학요법, 방사선 요법 또는 수술); 또는 다른 항체 (VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 다른 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB, 및 ICOS에 대한 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않음)와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
감염성 질환
GITR 효능제/PD-1 길항제 조합은 또한 감염 및 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. GITR 효능제/PD-1 길항제 조합은 병원체, 독소, 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 자극시키는 데 단독으로, 또는 백신과 함께 사용될 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간에게 감염성을 띠는 바이러스, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스 부류 A, B 및 C, 엡스테인-바르 바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, 인간 유두종 바이러스, 헤르페스 바이러스에 대한 면역 반응을 자극시키는 데 사용될 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 박테리아 또는 진균 기생충, 및 다른 병원체에 의한 감염에 대한 면역 반응을 자극시키는 데 사용될 수 있다.
백신화 애주번트
GITR 효능제/PD-1 길항제 항체 또는 항체 단편 조합은 다른 재조합 단백질 및/또는 펩티드 (예컨대, 종양 항원 또는 암 세포)에 대한 면역 반응을 증가시키기 위해 (즉, 백신화 프로토콜에서) 상기 단백질과 함께 사용될 수 있다.
예를 들어, GITR 효능제/PD-1 길항제 항체 및 그의 항체 단편은 관심 항원 (예컨대, 백신)과 함께 GITR 효능제/PD-1 길항제 조합의 공동 투여에 의해 항원 특이 면역 반응을 자극시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 (i) 항원; 및 (ii) GITR 효능제/PD-1 길항제 조합을 투여함으로써 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 것인, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 항원은 예를 들어, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 병원체로부터의 항원일 수 있다.
T 세포의 생체외 활성화
본 발명의 항체 및 항원 단편은 또한 종양에 대한 항원 특이 T 세포를 증가시키기 위하여 항원 특이 T 세포의 생체외 활성화 및 확장, 및 상기 세포의 수혜자 내로의 양자 전달을 위해 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 감염원, 예컨대, CMV에 대한 T 세포 반응을 활성화시키는 데 사용될 수 있다. GITR 효능제/PD-1 길항제 조합의 존재하에서의 생체외 활성화는 양자 방식으로 전달된 T 세포의 빈도 및 활성을 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
실시예
실시예 1
일반 방법
분자 생물학에서의 표준 방법이 기술되어 있다. 문헌 [Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3 rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA]. 표준 방법은 또한, 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발법 (제1권), 포유동물 및 효모에서의 클로닝 (제2권), 당접합체 및 단백질 발현 (제3권), 및 생물정보학 (제4권)을 기술하는, 문헌 [Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols .1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에도 제시되어 있다.
면역침강, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 비롯한, 단백질 정제 방법이 기술되어 있다. 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]. 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질 생산, 단백질 글리코실화가 기술되어 있다. 예컨대, 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York]; [Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17]; [Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89]; [Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391]을 참조할 수 있다. 다중클론 및 단일클론 항체의 제조, 정제, 및 단편화가 기술되어 있다. 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]; [Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Harlow and Lane, 상기 문헌 참조]. 리간드/수용체 상호작용을 특징 규명하는 표준 기법이 이용가능하다. 예컨대, 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York]를 참조할 수 있다.
단일클론, 다중클론 및 인간화된 항체는 제조될 수 있다 (예컨대, [Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY]; [Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York]; [Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243]; [Carpenter, et al. (2000) J. Immunol . 165:6205]; [He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029]; [Tang, et al. (1999) J. Biol . Chem . 274:27371-27378]; [Baca, et al. (1997) J. Biol . Chem . 272:10678-10684]; [Chothia, et al. (1989) Nature 342:877-883]; [Foote and Winter (1992) J. Mol . Biol . 224:487-499]; 미국 특허 번호 6,329,511 참조).
인간화에 대한 대안은 파지 상에 디스플레이된 인간 항체 라이브러리 또는 트랜스제닉 마우스 중의 인간 항체 라이브러리를 사용하는 것이다 ([Vaughan, et al. (1996) Nature Biotechnol . 14:309-314]; [Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839]; [Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156]; [Hoogenboom and Chames (2000) Immunol . Today 21:371-377]; [Barbas, et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]; [Kay, et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA]; [de Bruin, et al. (1999) Nature Biotechnol . 17:397-399]).
항체를 생성하는 데 있어 항원 정제가 필수적인 것은 아니다. 관심 항원을 포함하는 세포로 동물을 면역화시킬 수 있다. 이어서, 면역화된 동물로부터 비장세포를 단리시킬 수 있고, 비장세포를 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 제조할 수 있다 (예컨대, [Meyaard, et al. (1997) Immunity 7:283-290]; [Wright, et al. (2000) Immunity 13:233-242]; [Preston, et al., 상기 문헌 참조]; [Kaithamana, et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164] 참조).
항체는 예컨대, 소형 약물 분자, 효소, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 접합될 수 있다. 항체는 치료학적 목적, 진단학적 목적, 키트용으로 또는 다른 목적을 위해 유용하고, 예컨대, 염료, 방사성 동위원소, 효소, 또는 금속, 예컨대, 콜로이드 금에 커플링된 항체를 포함한다 (예컨대, [Le Doussal, et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175]; [Gibellini, et al. (1998) J. Immunol . 160:3891-3898]; [Hsing and Bishop (1999) J. Immunol . 162:2804-2811]; [Everts, et al. (2002) J. Immunol . 168:883-889] 참조).
형광 활성화된 세포 분류 검출 시스템 (FACS®)을 비롯한 유세포 분석 방법이 이용가능하다. 예컨대, 문헌 [Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ]; [Givan (2001) Flow Cytometry , 2 nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ]; [Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ] 참조할 수 있다. 예컨대, 진단용 시약으로서 사용하기 위한 것으로, 핵산 프라이머 및 프로브를 비롯한 핵산, 폴리펩티드, 및 항체를 변형시키는 데 적합한 형광성 시약이 이용가능하다. 문헌 [Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR]; [Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO].
면역계 조직학 표준 방법이 기술되어 있다. 예컨대, 문헌 [Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY]; [Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA]; [Louis, et al. (2002) Basic Histology:Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY]를 참조할 수 있다.
예컨대, 항원성 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능성 도메인, 글리코실화 부위, 및 서열 정렬을 측정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용가능하다. 예컨대, 진뱅크, 벡터 NTI® 스위트(GenBank, Vector NTI® Suite) (인포르맥스, 인크.(Informax, Inc.: 미국 메릴랜드주 베데스다)); GCG 위스콘신 패키지(GCG Wisconsin Package) (엑셀리스, 인크.(Accelrys, Inc.: 미국 캘리포니아주 샌디에고)); 데사이퍼(DeCypher)® (타임로직 코포레이션(TimeLogic Corp.: 미국 네바다주 크리스탈 베이)); [Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742]; [Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742]; [Wren et al. (2002) Comput . Methods Programs Biomed . 68:177-181]; [von Heijne (1983) Eur . J. Biochem . 133:17-21]; [von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690]을 참조할 수 있다.
실시예 2
생체내 처리 방법
대략 8 내지 10주령된 암컷 C57Bl/6J 또는 BALB/c/AnN 마우스를 각각 잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories: 미국 메인주 바 하버, 또는 캘리포니아주 새크라멘토) 또는 타코닉 라보라토리(Taconic Laboratory: 미국 캘리포니아주 옥스나드)로부터 입수하였다. 종래의 동물용 사료 및 식수는 임의대로 제공하였다. 동물을 이용하는 모든 프로토콜은 머크 & 컴퍼니, 인크.(Merck & Co., Inc.) 및 머크 리서치 랩스 (MRL) 팔로 알토 동물 실험 관련 위원회(Merck Research Labs (MRL) Palo Alto Animal Use and Care Committee)에 의해 승인을 받았다.
처리 전, 마우스의 체중을 측정하고, 개체 마우스로부터의 종양을 측정하였다. 편향을 막기 위해, 체중 또는 종양 부피에 의한 임의의 이상점을 제거하고, 남은 마우스는 평균 종양 크기가 등가인 다양한 처리군으로 무작위화하였다.
시험 물질 및 이소형 대조군은 냉동된 (-80℃) 스톡으로서 MRL 팔로 알토 프로테인 사이언시스 디파트먼트(MRL Palo Alto Protein Sciences department)로부터 입수하였다. 제제 완충제는 단백질을 안정화시키고, 침전을 막기 위해 각 항체에 대하여 특이적인 것이었고, 그에 대한 상세한 내용은 하기에 제시되어 있다:
제제/희석제는 4℃에서 보관된 것으로서 MRL 팔로 알토 프로테인 사이언시스 디파트먼트로부터 입수하였다. 이소형 대조군 mIgG2a 및 항-PD-1 제제/20 mM Na 아세테이트, 7% 수크로스 (pH 5.5)의 희석제, mIgG1 제제/75 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, 3% 수크로스 (pH 7.3)의 희석제, 및 mDTA-1 (항-mGITR) 제제/20 mM Na아세테이트, 7% 수크로스, 0.02% 트윈 80 저 퍼옥시드 (pH 5.5)의 희석제가 단백질을 안정화시키고, 침전을 막기 위한 것이었다.
실시예 3
종양 세포주 제조 및 이식
MC38 또는 CT26 결장 암종 세포를 10% 열 불활성화된 우태아 혈청으로 보충된 RPMI 배지 중에서 배양하였다. 1 x 1 MB49 방광 암종 세포는 10% 우태아 혈청 및 1%　글루타맥스(GlutaMAX)™으로 보충된 둘베코스 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 중에서 배양하였다. 100 ㎕ 부피의 포스페이트 완충처리된 염수 중의 1 x 106개의 MC38 세포, 3 x 105개의 CT26 세포, 또는 0.5 X 106개의 세포인 MB49 세포를 각 마우스의 좌측 복부 부위 또는 우측 옆구리에 SC 주사하였다. 전형적으로는 먼저 전자 클리퍼를 이용하여 마우스의 이식에 사용되는 부위를 면도하였다.
실시예 4
종양 측정 및 체중
1차 투약 전날 및 이후 매주 2회에 걸쳐 종양을 측정하였다. 전자 캘리퍼를 사용하여 종양 길이 및 너비를 측정하고, 공식 부피 (㎣) = 0.5 x 길이 x 너비2 (여기서, 길이는 더 긴 장축 치수이다)를 이용하여 종양 부피를 측정하였다.
마우스의 체중을 주기적으로 측정하여 일반 건강 상태를 모니터링할 뿐만 아니라, 필요할 경우, 마우스 1마리당 실제 mg/kg의 전달 용량을 예측하였다.
실시예 5
투약 용액 제조, 투여, 및 분석
냉동된 스톡을 해동시키고, 습식 얼음으로 옮겨 놓았다. 반복된 냉동 해동을 막기 위해, 각각의 스톡 바이알을 1회 해동시키고, 1회 사용에 충분한 부피로 분취물을 제조하였다. 본 목적을 위해 폴리프로필렌 저 부착성 튜브를 사용하였다. 분취물을 드라이아이스에서 급냉시키고, -80℃에서 보관하였다. 매회 투약 이전에, 한 분취물을 해동시키고, 적절한 희석제 중에 공칭 농도로 희석시키고, 즉시 투약하였다. 분취량의 투약 용액을 드라이아이스에서 급냉시키고, 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 다중 어레이 기술에 기반한, 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) (MSD®, 미국 메릴랜드주 록빌) 플랫폼; 전기 화학 발광 검출 및 패턴화된 어레이의 조합을 이용하여 투약 용액을 평가하였다.
일단 MC38 및 CT26 종양의 평균 크기가 각각 대략 300 ㎣ 및 220 ㎣에 도달하고 나면, 전형적으로는, 이식 후 약 2주 경과하였을 때, 시험 물질을 이용한 투약을 시작하였다. 일단 MB49 종양의 평균 크기가 대략 105 ㎣에 도달하고 나면, 이식 후 1주 경과하였을 때, 시험 물질을 이용한 투약을 시작하였다. 5 mg/kg의 투약 농도에서 (1회 투약 내지 최대 주당 6회 투약 범위의) 투약 빈도의 변동을 시험하였고, 그에 대한 상세한 내용은 하기에 제시되어 있다:
실시예 6
DTA-1 항체의 뮤린화
래트 항-마우스 DTA-1 GITR 항체 (S. 사카구치(S. Sakaguchi), 교토 대학: 일본 교토)를 하기와 같이 뮤린화하였다. 래트 항체 DTA-1의 서열을 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인에 대해 측정하였다. 래트 DTA-1 VH 서열을 이뮤노제네틱스 IMGT 데이터베이스(Immunogenetics IMGT Database) (www.imgt.org)로부터의 마우스 VH 생식세포계열 서열과 비교하였다 (Lefranc, M.-P. et al. (1999) Nuc. Acids Res. 27:209-212). DTA-1 VH 서열을 마우스 VH 생식세포계열 서열과 정렬하고, 이전 인간화 시스템과 유사하게 점수화하였다 (예컨대, WO 2005/047326 참조). 래트 DTA-1 VH가 마우스 생식세포계열 IGVH5-4, IGVH5-6 및 IGVH5-9와 가장 유사하였다. CDR 잔기를 래트 DTA-1 VH에서 마우스 생식세포계열 IGVH5-4로 옮겨 놓았고; 두 IGVH5-4 프레임워크 잔기를 상기 피팅 IGVH5-6으로 변경하고, 마우스 J-영역 IGHJ-4 (IMGT)를 사용하여 마우스 IgG1 및 마우스 IgG2a Fc 영역에 연결하였다.
래트 DTA-1 VL (람다) 서열을 진뱅크: AAH02129.1로부터의 마우스 VL (람다) 서열과 정렬하였다. CDR 잔기를 래트 DTA-1 VL (람다)에서 마우스 AAH02129 프레임워크 서열로 옮겨 놓았다. 래트 및 뮤린화된 VL 도메인의 컴퓨터 그래픽 모델에 기초하여 뮤린화된 DTA1 상의 7개의 프레임워크 잔기를 변경하였다. 뮤린화된 DTA-1 VL (람다) 도메인을 마우스 불변 경쇄 도메인에 융합시켰다.
3개의 구축물 (VH 1개 및 VL (람다) 2개) 모두에 대하여, 코돈 최적화된 유전자를 합성하고, 발현 벡터 내로 삽입하였다. HEK293 세포에서의 일시적 발현에 의해 항체를 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 7
항-GITR/항-PD-1 처리 결과
진행성 MC38 종양을 포함하는 C57BL/6J 마우스를 뮤린화된 항-mGITR (머크 리서치 랩스(Merck Research Labs, Palo Alto, CA: 미국 캘리포니아주 팔로 알토))을 피하로 (SC), 및 뮤린화된 항-mPD-1 (머크 리서치 랩스: 미국 캘리포니아주 팔로 알토)을 복강내로 (IP) 각각 5 mg/kg씩 투약하여 주 1회 또는 2회 주사함으로써 처리하였다. 일단 종양 크기가 240-360 ㎣에 도달하고 나면, 처리를 시작하였다. 매주 2회에 걸쳐 종양을 측정하였다. 종양의 완전 퇴행 (CR)이 항-종양 효능에 대한 판독치로서의 역할을 하였다. 병용 투약을 통해 강력한 시너지 효능을 얻었으며, 매주 2회에 걸친 병용 투약 후 100% CR에 이르렀다. 요법을 각 항체 (Ab.)를 1회 투약하는 것으로 제한하였을 때, CR은 70%까지 감소하였는데, 이는 항-mGITR 투약 후, 1주 후를 시작으로 항-mPD-1을 매주 4회 투여하는 병용법으로 달성된 결과와 유사하였다. 2주 간격을 두고 항-mGITR 및 항-mPD-1을 투여하였을 때에는 그만큼 효과적이지 않았다. 항-mGITR을 이용하여 매주 최대 6회에 걸쳐 처리하거나, 또는 항-mPD-1 Ab를 이용하여 매주 2-4회에 걸쳐 처리하는 단일요법시 단지 20-30% 의 CR만이 관찰되었다 (도 1a-1k 참조).
진행성 MC38 종양을 포함하는 C57BL/6J 마우스를 각각 5 mg/kg으로 투약되는 항-mGITR (SC) 및 항-mPD-1 (IP)로 처리하였다. 일단 종양 크기가 200-350 ㎣에 도달하고 나면, 처리를 시작하였다. 매주 2회에 걸쳐 종양을 측정하였다. 종양의 완전 퇴행 (CR)이 항-종양 효능에 대한 판독치로서의 역할을 하였다. 병용 투약을 통해 강력한 시너지 효능을 얻었으며, 매주 2회에 걸친 병용 투약 후 100% CR에 이르렀다. 이는 상기에 상세하게 설명된 결과와 유사한 결과이다. 그러나, 1주 간격을 두고 별개로 항체를 전달하였을 때, CR은 60% 감소된 것으로 관찰되었다. 항-mGITR 또는 항-mPD-1을 매주 2회에 걸쳐 단일요법으로 투약하였을 때, 종양 성장은 억제되었지만, CR에는 이르지 못하였다 (도 2a-2f 참조).
진행성 CT26 종양을 포함하는 BALB/cAnN 마우스를 각각 5 mg/kg으로 투약되는 항-mGITR (SC) 및 항-mPD-1 (IP)로 처리하였다. 일단 종양 크기가 220 ㎣ (180 - 260 ㎣)에 도달하고 나면, 처리를 시작하였다. 매주 2회에 걸쳐 종양을 측정하였다. 종양의 완전 퇴행 (CR)이 항-종양 효능에 대한 판독치로서의 역할을 하였다. 단일 병용 투약을 통해 70% CR의, 강력한 시너지 효능을 얻었다. 항체 중 하나를 단일요법으로서 전달하였을 때의 항-종양 효능은 0-10% CR이었다 (도 3a-3d 참조).
MB49 종양을 포함하는 C57BL/6J 마우스를 각각 5 mg/kg 및 10 mg/kg으로 단일 투약되는 항-GITR (SC) 및 항-PD-1 (IP)로 처리하였다. 일단 종양 크기가 105 ㎣ (85-122㎣)에 도달하고 나면, 처리를 시작하였다. 매주 2회에 걸쳐 종양을 측정하였다. 종양의 완전 퇴행 (CR)이 항-종양 효능에 대한 판독치로서의 역할을 하였다. 항-GITR 및 항-PD-1 병용 치료법을 통해 40% CR의, 증진된 효능을 얻었다. 단일 작용제 처리군에서는 어떤 CR도 관찰되지 않았다 (도 4a-4d 참조).
실시예 8
항-PD-1 및 항-GITR 조합이 조절 T 세포 및 CD8 세포 비에 미치는 효과
A. 방법
1. 혼합 림프구 반응 배양
1,200 x g로 20분 동안 피콜-플라크 플러스(Ficoll-Paque Plus) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 연막으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리시켰다. 배지:혈장 계면으로부터 말초 혈액 단핵 세포를 수집하고, 둘베코스 포스페이트 완충처리된 염수 (DPBS)로 2회에 걸쳐 세척하였다. 잔류 적혈구 (RBC)는 암모늄-클로라이드-포타슘 RBC 용해용 용액 (RBC 용해용 용액)을 이용하여 용해시켰다.
수지상 세포 (DC)는 하기 방법을 사용하여 CD14+ 단핵구로부터 생성하였다. 먼저 1,200 x g로 20분 동안 피콜-플라크 플러스 밀도 구배 원심분리 및 로제트셉(RosetteSep) 인간 단핵구 농축 칵테일을 사용하여 연막으로부터 단핵구를 단리시켰다. 배지:혈장 계면으로부터 단핵구를 제거하고, DPBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 잔류 RBC는 RBC 용해용 용액을 이용하여 용해시켰다. 농축된 단핵구를 10% 우태아 혈청 (FBS), 1,000 U/mL 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 및 400 U/mL 인터루킨 (IL)-4로 보충된 둘베코스 변형된 이글 배지 중에 2 x 106/mL의 세포 밀도로 배양하였다. 6일째, 0.5 ㎍/mL 지질다당류를 배양물에 첨가한 후; 이어서, 세포를 2일 더 배양하였다.
24-웰 플레이트에 혼합 림프구 반응 배양물을 셋업하였다. 100 U/mL IL-2; 5 ng/mL IL-15; 항-hGITR 항체 (MK-4166), 항-hPD-1 항체 (MK-3475), MK-3475 및 MK-4166의 조합 또는 이소형 대조군 mAb (항-RSV)의 존재하에서 말초 혈액 단핵 세포 (2 x 106/mL)를 γ-방사선 조사된 (30　Gy) 동종이계 DC (0.2 x 106/mL)와 함께 배양하였다. 7일째 유세포 분석법을 이용하여 MLR 배양물 중 조절 T 세포 (Treg)의 개수를 평가하였다.
2. 유세포 분석법에 의한 혼합 림프구 반응 배양물 중 T reg 검출
Treg (CD3+ CD4+ CD25+ FoxP3+) 및 CD8+ T 세포 검출을 위해, MLR 배양물로부터의 1 내지 2 x 106개의 세포를 50 ㎕의 BD 파르미겐(BD Pharmingen) 염색 완충제 중에서 항-CD3, 항-CD4, 항-CD25, 및 항-CD8과 함께 인큐베이션시켰다. 죽은 세포는 픽서블 바이어빌리티 다이 e플루오르 506(Fixable Viability Dye eFluor 506)을 이용하여 배제시켰다. 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8 및 항-CD25 mAb로 표면 염색을 한 후, FoxP3 고정/투과 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 (e바이오사이언스(eBioscience)) 세포내 FoxP3 염색을 수행하였다. LSR II 유세포 분석기 상에서 샘플 획득을 수행하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 버전 10.0.6 (트리 스타, 인크.(Tree Star, Inc.))를 이용하여 데이터를 분석하였다. CD3+ CD4+ 세포에서 게이팅한 후, CD25+ FoxP3+ 세포에서 게이팅하여 Treg를 확인하였다.
3. 조절 T 세포 억제 검정
1,200 x g로 20분 동안 피콜-플라크 플러스 밀도 구배 원심분리 및 로제트셉 인간 인간 CD4+ T 세포 농축 키트를 사용하여 연막으로부터 CD4+ T 세포를 단리시켰다. 배지:혈장 계면으로부터 CD4+ T 세포를 수집하고, DPBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 잔류 RBC는 RBC 용해용 용액을 이용하여 용해시켰다. 인간 CD25-접합된 마이크로비드 II 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 (밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec)) CD4+ CD25+ Treg 및 CD4+ CD25- 효과기 T 세포 (Teff)를 분리시켰다. CD4+ CD25+ CD127- Treg의 순도는 대략 40% 내지 70%였다. 상기 기술된 바와 같이 인간 DC를 생성하였다.
T 세포 억제 검정을 위해, MK-4166, MK-3475, MK-3475 및 MK-4166의 조합 또는 이소형 대조군 mAb (항-RSV)의 존재하에 7일 동안 96-웰 둥근 바닥 플레이트 중에서 웰당 총 1 x 105개의 T 세포 (Treg 및 Teff) 및 2 x 104개의 γ-방사선 조사된 (30　Gy) DC를 배양하였다. CD4+ CD25- Teff 및 CD4+ CD25+ Treg를 4:1의 비로 혼합하였다. 6일째, 삼중 수소로 표지화된 티미딘을 20시간 동안 배양물에 첨가하였다. 삼중 수소로 표지화된 티미딘과 함께 인큐베이션시킨 후, 세포를 수거하고, 물을 이용하여 용해시키고, β 계수기 (퍼킨엘머(PerkinElmer), 2450 마이크로플레이트 계수기)를 이용하여 분석하였다. T 세포 증식 수준이 혼입된 삼중 수소로 표지화된 티미딘 수준에 의해 반영되었다. 모든 검정은 3중으로 수행하였다.
B. 결과
Treg의 안정성 및 종양내 축적을 변경시킬 수 있는 항-마우스 GITR 효능작용 mAb DTA-1의 능력은 DTA-1의 작용 기전에 필수적이다 (예컨대, [Cohen et al (2010) PLoS One 5(e10436): 1-12]; 및 [Schaer et al. (2013) Cancer Immunol . Res. 1:320-331] 참조). 인간 시험관내 검정법을 이용하여 인간 Treg의 유도 및 그의 억제 활성에 영향을 미칠 수 있는 MK-4166 단독, 또는 MK-3475와 조합된 MK-4166의 능력을 조사하였다.
MLR에서의 Treg의 유도는 문헌에 의해 충분히 입증되어 있다 (예컨대, [Levitsky et al (2013) Transplantation 96:689-696] 참조). 따라서, MLR을 이용하여 혈액 중 자연 발생되는 인간 Treg의 개수를 증가시키고, MK-4166 단독, 또는 MK-3475와 조합된 MK-4166이 인간 Treg 및 CD8:Treg 비에 미치는 효과를 평가하였다. 10 ㎍/mL MK-4166을 MLR 배양물에 첨가하였을 때, 7일 경과 후, CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg의 개수는 감소하였다 (도 5a). MK-3475 단독으로는 Treg의 개수에 영향을 미치지 않았다. 그러나, MK-3475 및 MK-4166의 조합은 Treg의 개수 및 CD8:Treg 비에 대하여 가장 뚜렷한 영향을 미쳤다 (도 5b).
MK-4166이 인간 Treg의 억제 활성에 미치는 효과를 평가하기 위해, Treg 억제 검정법을 확립하였다. 본 검정법에서, T 세포 증식의 수준은 혼입된 삼중 수소로 표지화된 티미딘의 수준에 의해 반영된다. MK-4166을 MK-3475와 조합하였을 때, T 세포 증식에서의 용량 의존성 증가가 관찰되었다 (도 6). 본 결과는 MK-4166 및 MK3475를 함께 인큐베이션시키는 것이 시험관내에서 MLR-유도 Treg의 개수를 감소시키고, CD8:Treg 비율을 증가시키고, 인간 Treg의 억제 기능을 감소시킨다는 것을 입증한다.
하기 표 2는 서열 목록 중의 서열에 관한 간단한 설명을 제공한다.
<표 2>
Figure 112016015635315-pct00002
Figure 112016015635315-pct00003
Figure 112016015635315-pct00004
SEQUENCE LISTING <110> Merck, Sharp & Dohme Corp. Gu, Danling Beebe, Amy M. <120> MODULATION OF TUMOR IMMUNITY <130> 23565-WO-PCT <150> US 61/867,976 <151> 2013-08-20 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gly Phe Thr Val Arg Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Trp Asn 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> 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PRT <213> Mus musculus <400> 17 His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Ser Ile Ser Thr Gly Asp Arg Ser Tyr Leu Pro Asp Ser Met Lys Gly 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Gly 1 5 10 15 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser 1 5 10 15 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 21 Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Asn Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Ile His 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 22 Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Val Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 24 Gly Ser Phe Met Tyr Ala Ala Asp Tyr Tyr Ile Met Asp Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Gln Leu Gly Leu Arg Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Lys Val Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Phe 1 5 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Leu Gly Gly Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 1 5 10 15 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 Thr Val Ser Ala 20 <210> 30 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Arg His Leu Gly Ser Gly Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 1 5 10 15 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 20 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Arg His Leu Ile Ser Gly Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 1 5 10 15 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 20 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 32 Ile Lys Glu Pro Arg Asp Trp Phe Phe Glu Phe Trp Gly Pro Gly Thr 1 5 10 15 Met Val Ser Val Ser Ser 20 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 33 Ile Lys Glu Pro Arg Asp Trp Phe Phe Glu Phe Trp Gly Pro Gly Thr 1 5 10 15 Met Val Ser Val Ser Ser 20 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Val Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 35 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Thr Phe Leu Ser 1 5 10 15 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Ser Ala Asn Ser Thr Val Asn Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Phe His 1 5 10 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 40 <211> 11 <212> 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musculus <400> 50 Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 54 Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 55 Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Gln Gln Thr Lys Glu Val Thr Trp Thr 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 57 Phe Gln His Thr His Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 58 Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> 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be A or V <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Xaa Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Xaa Thr Ile Ser Xaa Asp Xaa Ser Lys Asn Thr Xaa 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Xaa Arg Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 68 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 68 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser 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40 45 Trp Xaa Xaa Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Asn Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Ile His Arg Xaa Thr Xaa Ser Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Xaa 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Xaa Ile Lys Glu Pro Arg Asp Trp Phe Phe Glu Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 74 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (46)..(46) <223> Can be L or P <220> <221> VARIANT <222> (49)..(49) <223> Can be Y or F <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> Can be F or Y <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Asn Phe 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Leu Ile 35 40 45 Xaa Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Gly Phe Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 75 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> Can be V or F <220> <221> VARIANT <222> (50)..(50) <223> Can be I or L <220> <221> VARIANT <222> (51)..(51) <223> Can be G or A <220> <221> VARIANT <222> (69)..(69) <223> Can be V or L <220> <221> VARIANT <222> (73)..(73) <223> Can be V or K <220> <221> VARIANT <222> (80)..(80) <223> Can be F or A <220> <221> VARIANT <222> (99)..(99) <223> Can be R or Q <400> 75 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Xaa Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Xaa Xaa Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asn Arg Xaa Thr Ile Ser Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Xaa 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Xaa Ile Lys Glu Pro Arg Asp Trp Phe Phe Glu Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (46)..(46) <223> Can be L or P <220> <221> VARIANT <222> (49)..(49) <223> Can be Y or F <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> Can be F or Y <400> 76 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Leu Ile 35 40 45 Xaa Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Gly Phe Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 77 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (96)..(96) <223> Can be A or Q <400> 77 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Arg Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Asp Arg Ser Tyr Leu Pro Asp Ser Met Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa 85 90 95 Arg Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 78 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 78 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 79 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (47)..(47) <223> Can be W or Y <220> <221> VARIANT <222> (48)..(48) <223> Can be I or M <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> Can be V or R <220> <221> VARIANT <222> (96)..(96) <223> Can be A or S <400> 79 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Xaa Xaa 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Ser Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa 85 90 95 Arg Arg His Leu Gly Ser Gly Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> Can be F or Y <400> 80 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Tyr Thr Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 81 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 82 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> Can be N or Q <220> <221> VARIANT <222> (57)..(57) <223> Can be N or Q <400> 82 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Xaa Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Xaa Gln Gly Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys 85 90 95 Glu Val Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 83 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (47)..(47) <223> Can be W or Y <220> <221> VARIANT <222> (48)..(48) <223> Can be I or M <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> Can be V or I <220> <221> VARIANT <222> (71)..(71) <223> Can be V or R <220> <221> VARIANT <222> (78)..(78) <223> Can be F or Y <220> <221> VARIANT <222> (96)..(96) <223> Can be A or S <400> 83 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Xaa Xaa 35 40 45 Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg 50 55 60 Ser Arg Xaa Thr Ile Ser Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Xaa Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa 85 90 95 Arg Arg His Leu Ile Ser Gly Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Can be D or V <400> 84 Xaa Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Tyr Thr Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 85 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (48)..(48) <223> Can be M or I <220> <221> VARIANT <222> (68)..(68) <223> Can be V or A <220> <221> VARIANT <222> (70)..(70) <223> Can be M or L <220> <221> VARIANT <222> (72)..(72) <223> Can be T or A <220> <221> VARIANT <222> (74)..(74) <223> Can be T or K <400> 85 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Val Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 86 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 86 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 87 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (49)..(49) <223> Can be I or M <220> <221> VARIANT <222> (68)..(68) <223> Can be V or I <220> <221> VARIANT <222> (72)..(72) <223> Can be V or R <400> 87 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Xaa Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Xaa Thr Ile Ser Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Leu Gly Leu Arg Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 88 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence <220> <221> VARIANT <222> (45)..(45) <223> Can be L or P <220> <221> VARIANT <222> (46)..(46) <223> Can be L or C <400> 88 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Asn Ser Thr Val Asn Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Xaa Xaa Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims (19)

  1. GITR 효능제와 조합하여 환자에서 종양을 치료하기 위한, MK-3475인 PD-1 길항제를 포함하는 제약 조성물이며,
    여기서 GITR 효능제가
    서열 82에 개시된 아미노산 서열(여기서, 아미노산 31이 Q이고, 아미노산 57이 Q임)을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; 및
    서열 81에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역
    을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이고,
    상기 PD-1 길항제 및 GITR 효능제가 동시에 또는 순차적으로 투여되며,
    시험관내 혼합 림프구 반응(MLR) 배양물 검정 및 조절 T 세포 억제 검정에서 측정시, 상기 조성물이 MLR-유도 Treg의 개수를 감소시키고, CD8:Treg 비율을 증가시키고, 인간 Treg의 억제 기능을 감소시키는 것인, 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편인 GITR 효능제가 항체인 것인, 제약 조성물.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 GITR 효능제가 인간화된 항체인 것인, 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 환자가 인간인 것인, 제약 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, PD-1 길항제 및 GITR 효능제가 동시에 1회 이상 투여되는 것인 제약 조성물.
  9. 제1항에 있어서, PD-1 길항제 및 GITR 효능제가 동시에 2회 이상 투여되는 것인 제약 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 종양이 진행성 단계의 종양인 제약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 진행성 단계의 종양이 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 간암종, 간세포암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 골수종, 다발성 골수종, 타액선 암종, 신장암, 신세포 암종, 윌름스 종양, 기저 세포 암종, 흑색종, 전립샘암, 외음부암, 갑상샘암, 고환암, 및 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  12. PD-1 또는 PD-L1에 결합하고 PD-1 활성을 길항시키는 제1 아암, 및 GITR에 결합하고 GITR 활성을 효능작용시키는 제2 아암을 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고,
    여기서 상기 제1 아암이 MK-3475의 항원-결합 단편이고,
    상기 제2 아암이
    서열 82에 개시된 아미노산 서열(여기서, 아미노산 31이 Q이고, 아미노산 57이 Q임)을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; 및
    서열 81에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역
    을 포함하는 항원-결합 단편인,
    환자에서 종양을 치료하기 위한 제약 조성물이며,
    시험관내 혼합 림프구 반응(MLR) 배양물 검정 및 조절 T 세포 억제 검정에서 측정시, 상기 조성물이 MLR-유도 Treg의 개수를 감소시키고, CD8:Treg 비율을 증가시키고, 인간 Treg의 억제 기능을 감소시키는 것인, 제약 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제12항에 있어서, 종양이 진행성 단계의 종양인 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 진행성 단계의 종양이 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 간암종, 간세포암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 골수종, 다발성 골수종, 타액선 암종, 신장암, 신세포 암종, 윌름스 종양, 기저 세포 암종, 흑색종, 전립샘암, 외음부암, 갑상샘암, 고환암, 및 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  18. PD-1 길항제 및 GITR 효능제를 포함하고, 여기서
    a) PD-1 길항제가 MK-3475이고;
    b) GITR 효능제가
    서열 82에 개시된 아미노산 서열(여기서, 아미노산 31이 Q이고, 아미노산 57이 Q임)을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; 및
    서열 81에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역
    을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편인,
    종양을 치료하기 위한 제약 조합물이며,
    시험관내 혼합 림프구 반응(MLR) 배양물 검정 및 조절 T 세포 억제 검정에서 측정시, 상기 조합물이 MLR-유도 Treg의 개수를 감소시키고, CD8:Treg 비율을 증가시키고, 인간 Treg의 억제 기능을 감소시키는 것인, 제약 조합물.
  19. PD-1 길항제 및 GITR 효능제를 포함하고, 여기서
    a) PD-1 길항제가 MK-3475이고;
    b) GITR 효능제가
    서열 82에 개시된 아미노산 서열(여기서, 아미노산 31이 Q이고, 아미노산 57이 Q임)을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; 및
    서열 81에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역
    을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편인,
    진행성 단계의 종양을 치료하기 위한 제약 조성물이며,
    시험관내 혼합 림프구 반응(MLR) 배양물 검정 및 조절 T 세포 억제 검정에서 측정시, 상기 조성물이 MLR-유도 Treg의 개수를 감소시키고, CD8:Treg 비율을 증가시키고, 인간 Treg의 억제 기능을 감소시키는 것인, 제약 조성물.
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