ES2806500T3

ES2806500T3 - Moléculas de unión al receptor de la superfamilia de TNF (factor de necrosis tumoral) y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2806500T3
Application number: ES16740686T
Authority: ES
Inventors: Beatrice Tien-Yi Wang; Max Allen Schwarzer; Bruce Alan Keyt; Ramesh Baliga
Original assignee: IGM Biosciences Inc
Current assignee: IGM Biosciences Inc
Priority date: 2015-01-20
Filing date: 2016-01-20
Publication date: 2021-02-17
Anticipated expiration: 2036-01-20
Also published as: SG11201705116SA; EP3247728A4; NZ732922A; WO2016118641A1; US20180009897A1; IL253054A0; IL308212A; JP2018503401A; DK3247728T3; JP7179464B2; AU2020201323B2; US20230203173A1; EP3247728B1; AU2016209324A1; JP2021006044A; CN107207601A; EP3247728A1; US10689449B2; SG10202001779UA; US9938347B2

Abstract

Un anticuerpo IgM pentamérico aislado que comprende cinco conjuntos de unión bivalentes idénticos y una cadena J o un fragmento o variante de una cadena J, donde cada conjunto de unión comprende dos regiones constantes de cadena pesada de IgM, cada una asociada a un dominio de unión al antígeno, donde las regiones constantes de cadena pesada de IgM comprenden cada una un dominio Cμ1, un dominio Cμ2, un dominio Cμ3 y un dominio Cμ4-tp; donde al menos tres de los dominios de unión al antígeno del anticuerpo se unen específica y agonísticamente a una proteína receptora de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF); donde el anticuerpo puede reticular al menos tres proteínas receptoras de la superfamilia del TNF idénticas expresadas en la superficie de una célula, activando así la transducción de señal en la célula; y donde el anticuerpo puede activar la transducción de señal mediada por el receptor de la superfamilia del TNF en una célula que expresa la superfamilia del receptor del TNF a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente que tiene los mismos dominios de unión al antígeno, que también agoniza y se une específicamente a la misma proteína receptora de la superfamilia del TNF.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión al receptor de la superfamilia de TNF (factor de necrosis tumoral) y usos de las mismas ANTECEDENTES

Desde la llegada de los anticuerpos humanizados, el uso terapéutico de anticuerpos como Rituxan® (rituximab), Herceptin® (trastuzumab) y Avastin® (bevacizumab) ha revolucionado los campos de la medicina, incluyendo la oncología, el tratamiento de trastornos inflamatorios, como la artritis reumatoide, y muchas otras indicaciones. En los Estados Unidos, se han aprobado más de 30 anticuerpos humanos o humanizados para uso clínico, y más de 600 nuevos anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos se encuentran en varias etapas de desarrollo. Algunos anticuerpos tienen una función antagonista en moléculas diana solubles, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o el factor de necrosis tumoral (TNF), cuyas acciones son parte del procedimiento patológico de una enfermedad. Alternativamente, los anticuerpos pueden unir, bloquear y/o inducir la destrucción de células patológicas en ciertas enfermedades, como el cáncer. Las funciones principales de estos anticuerpos terapéuticos son la unión a través de la región Fab y el reclutamiento de la función efectora a través del dominio Fc (que también media la larga vida media circulante de los anticuerpos). Una de las principales ventajas de los anticuerpos en comparación con los fármacos de molécula pequeña puede ser su excelente especificidad. Los anticuerpos pueden dirigirse con mucha precisión a antígenos proteicos seleccionados, como los oncogenes, con exclusión de homólogos muy similares, lo que permite perfiles de seguridad benignos. Por tanto, los anticuerpos están bien caracterizados para la función específica de direccionamiento individual.

A medida que el campo ha ido progresando, la función del anticuerpo se mejoró a través de medios creativos de modificación de proteínas, tal como para proporcionar mayor afinidad, una semivida más larga y/o mejor distribución de tejido, así como una combinación de tecnologías de moléculas pequeñas y grandes para un aumento del foco de la destrucción celular mediante el suministro de carga tóxica (por ejemplo, conjugados de anticuerpo y fármaco). Otra estrategia para mejorar la función de los anticuerpos se aprovecha de las capacidades de unión multivalente de la estructura de la inmunoglobulina A (IgA) o la inmunoglobulina M (IgM) que permite que una molécula de IgA o IgM una múltiples antígenos. Los dominios variables de cadena pesada y ligera de interés pueden expresarse como un anticuerpo de isotipo IgA o IgM, creando así una molécula de unión multimérica con la misma especificidad que un anticuerpo monomérico, por ejemplo, un anticuerpo IgG.

La naturaleza multivalente de las moléculas de IgA o IgM presenta una herramienta útil para la aplicación a sistemas biológicos específicos en los que múltiples componentes necesariamente deben unirse simultáneamente para transmitir señales biológicas. Por ejemplo, muchas proteínas receptoras en la superficie de las células eucariotas requieren la activación simultánea de múltiples monómeros o subconjuntos para lograr la activación y transmisión de una señal biológica a través de una membrana celular, al citoplasma de la célula.

Uno de estos sistemas de receptores de proteínas de la superficie celular que requieren multimerización antes de, o según la activación, se encuentra en la superfamilia de proteínas receptoras del factor de necrosis tumoral (TNF). Dentro de esta superfamilia de proteínas receptoras hay miembros que, tras la activación, transmiten una señal al núcleo de la célula que provoca la apoptosis. Otros miembros de la familia de esta superfamilia provocan la activación de NF-^kB, de vías de apoptosis, de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK), de la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (p38MAPK) y de la quinasa de extremo N c-Jun (JNK). Los ejemplos de miembros del receptor de la superfamilia del TNF que regulan la apoptosis de la célula cuando se activan son los siguientes: TNFR1 (DR1), TNFR2, TNFR1/2, CD40 (p50), Fas (CD95, Apo1, DR2), CD30, 4-1BB (CD137, ILA), TRAILR1 (DR4, Apo2), DR5 (TRAILR2), TRAILR3 (DcR1), TRAILR4 (DcR2), OPG (OCIF ), TWEAKR (FN14), LIGHTR (HVEM), DcR3, DR3, EDAR y XEDAR. (Véase, Aggarwal y col., Blood, 119:651-665, 2012).

Más particularmente, se postula que la activación de los miembros de la proteína receptora de la superfamilia del TNF mencionados anteriormente requiere que al menos tres monómeros receptores que no interactúan se reticulen, por ejemplo, mediante un ligando, para formar un trímero receptor estabilizado, lo que resulta en la transducción de señal a través de la membrana celular. Se ha observado la agrupación de estos trímeros de proteínas receptoras de la superfamilia del TNF en "balsas" de trímeros y se ha postulado que la misma conduce a una activación más efectiva de esta cascada de señalización dependiente de proteínas receptoras de la superfamilia del TNF. (Véase, Valley y col., J. Biol. Chem., 287(25):21265-21278, 2012). Se han analizado modos adicionales de activación. (Véase, por ejemplo, Lewis y col., Biophys. J., 106(6):L21-L24, 2014).

La señalización a través de ciertas proteínas receptoras de la superfamilia del TNF mencionadas anteriormente puede conducir a la apoptosis celular. En el tratamiento del cáncer, una estrategia terapéutica es activar una cascada de señalización apoptótica en las células cancerosas, deteniendo así la progresión. Una manera de lograr esto es mediante la unión a proteínas receptoras de la superfamilia del TNF expresadas (o sobreexpresadas) en células cancerosas con una molécula de unión a agonista multivalente o multimérica, que puede promover la trimerización y activación del receptor, lo que conduce a la apoptosis. Una proteína receptora de la superfamilia del TNF que se activa tras la reticulación que resulta en apoptosis es DR5 (TRAILR2).

El interés en DR5 aumenta debido al hallazgo de que se expresa a un nivel más alto en varios tipos de cáncer que en el tejido normal, como el cáncer de vejiga (Y y col., Urology, 79(4):968.e7-15, 2012), el cáncer gástrico (Lim y col., Carcinogen., 32(5):723-732, 2011), el cáncer de ovario (Jiang y col., Mol. Med. Rep., 6(2):316-320, 2012), el adenocarcinoma ductal pancreático (Rajeshkumar y col., Mol. Cancer Ther., 9(9):2583-92, 2010), el carcinoma oral de células escamosas (Chen y col. Oncotarget 4:206-217, 2013) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (Reck y col., Lung Canc., 82(3):441-448, 2013). Es de importancia adicional para la comunidad médica que el mayor nivel de expresión observado de esta familia de proteínas receptoras, especialmente el miembro de la familia DR5, ocurra en algunos de los cánceres más difíciles de detectar y tratar, como el cáncer pancreático y el gástrico.

Si bien se ha hallado que ciertos anticuerpos monoclonales, como Tigatuzumab (CS-1008, Daiichi Sankyo Co. Ltd., descritos en la Patente de los EE.UU. No. 7.244.429, VH y VL, presentados en esta invención como la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente), son efectivos in vitro e in vivo, incluso sin más reticulantes añadidos, estos anticuerpos no han dado como resultado una eficacia clínica significativa. (Véase, Reck y col., 2013). Los ejemplos de tales anticuerpos IgG monoclonales agonistas anti-DR5 son Conatumumab (Amgen, descrito en la Patente de los EE.UU. No. 7.521.048, la VH y VL presentadas en esta invención como la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, respectivamente), Drozitumab (Genentech, como se describe en la Patente de los EE.UU. No. 8.029.783, VH y VL presentadas en esta invención como la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente), y Lexatumumab (Human Genome Sciences, como se describe en la Patente de los EE.UU. No. 2006/0269555, VH y VL presentadas en esta invención como la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente).

Además, Miller y col. (J. Immunol., 170:4854-4861, 2003) describen la construcción de un anticuerpo IgG tetravalente duplicando la región VH-CH1 en la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER2 lgG1, hu405, así como un anti-DR5 tetravalente en el mismo formato de cadena pesada. El documento WO 2014/180754 describe la construcción y la unión de una construcción trímera que contiene 3 regiones de unión a DR5 Fab (monoméricas).

Se necesitan mejores moléculas de unión para lograr los beneficios de la investigación básica realizada que proporcionó una comprensión crítica de este subconjunto de las proteínas receptoras de la superfamilia del TNF. En esta invención, se describen moléculas de unión adicionales que, basándose en la comprensión del mecanismo bioquímico subyacente de la superfamilia de proteínas receptoras del TNF, son capaces de abordar esta necesidad.

RESUMEN

El asunto de la invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo IgM pentamérico aislado que comprende cinco conjuntos de unión bivalentes idénticos y una cadena J o un fragmento o variante de una cadena J, donde cada conjunto de unión comprende dos regiones constantes de cadena pesada de IgM, cada una asociada a un dominio de unión al antígeno, donde las regiones constantes de cadena pesada de IgM comprenden cada una un dominio C ^|j 1, un dominio C^j2, un dominio C^j3 y un dominio Cj4-tp; donde al menos tres de los dominios de unión al antígeno del anticuerpo se unen específica y agonísticamente a una proteína receptora de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF); donde el anticuerpo puede reticular al menos tres proteínas receptoras de la superfamilia del TNF idénticas expresadas en la superficie de una célula, activando así la transducción de señal en la célula; y donde el anticuerpo puede activar la transducción de señal mediada por el receptor de la superfamilia del TNF en una célula que expresa la superfamilia del TNF del receptor a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente que tiene los mismos dominios de unión al antígeno, que también agoniza y se une específicamente a misma proteína receptora de la superfamilia del TNF.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo IgM aislado que comprende seis conjuntos de unión bivalentes idénticos, donde cada conjunto de unión comprende dos regiones constantes de cadena pesada de IgM, cada una asociada a un dominio de unión al antígeno, donde las regiones constantes de cadena pesada de IgM comprenden cada una un dominio C^j1, un dominio C^j2, un dominio C^j3 y un dominio Cj4-tp; donde al menos tres de los dominios de unión al antígeno del anticuerpo se unen específica y agonísticamente a una proteína receptora de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF); donde el anticuerpo puede reticular al menos tres proteínas receptoras de la superfamilia del TNF idénticas expresadas en la superficie de una célula, activando así la transducción de señal en la célula; y donde el anticuerpo puede activar la transducción de señal mediada por el receptor de la superfamilia del TNF en una célula que expresa la superfamilia del receptor del TNF a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente que tiene los mismos dominios de unión al antígeno, que también agoniza y se une específicamente a misma proteína receptora de la superfamilia del TNF.

En una realización, la activación de la transducción de señal puede desencadenar apoptosis, proliferación y/o morfogénesis en la célula en la que se expresa la proteína receptora. Por ejemplo, en una realización

(a) la transducción de señal puede desencadenar la apoptosis, y donde la proteína receptora de la superfamilia del TNF es TNFR1 (DR1), TNFR2, TNFR1/2, CD40 (p50), Fas (CD95, Apo1, DR2), CD30, 4-1BB (CD137, ILA), TRAILR1 (DR4, Apo2), TRAILR2 (DR5), TRAILR3 (DcR1), TRAILR4 (DcR2), OPG (OCIF), TWEAKR (FN14), LIGHTR (HVEM), DcR3, DR3, EDAR, XEDAR, o una combinación de las mismas;

(b) la transducción de señal puede desencadenar la proliferación, y donde la proteína receptora de la superfamilia del TNF es TNFR1/2, GITR (AITR), TACI, BCMA, TWEAKR (FN14), RANK (TRANCER), CD27, CD40 (p50), OX40 (CD134), LT-pR, TNFR1 (Dr 1), TNFR2 o una combinación de las mismas; o

(c) la transducción de señal puede desencadenar la morfogénesis, y donde la proteína receptora de la superfamilia del TNF es Fas (CD95, Apo1, DR2), TRAILR1 (DR4, Apo2), DR5 (TRAILR2), TRAILR3 (DcR1), TRAILR4 (DcR2), OPG (OCIF), CD40 (p50), EDAR, ^xE^dAR, TNFR1/2 o una combinación de las mismas.

En una realización, el anticuerpo comprende diez o doce dominios de unión al antígeno idénticos que se unen específica y agonísticamente al mismo epítopo extracelular de un único tipo de molécula receptora de la superfamilia del TNF expresada en la superficie de la célula, activando así la transducción de señal en la célula.

En una realización, el anticuerpo del primer aspecto comprende al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez dominios de unión al antígeno que se unen específica y agonísticamente a la proteína receptora de la superfamilia del TNF expresada en la superficie de la célula, induciendo así la apoptosis de la célula.

En una realización, el anticuerpo del primer aspecto comprende al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once o doce dominios de unión al antígeno que se unen específica y agonísticamente a la proteína receptora de la superfamilia del TNF expresada en la superficie de la célula, induciendo así la apoptosis de la célula.

En una realización, los cinco o seis conjuntos de unión son conjuntos de unión de inmunoglobulina humana, humanizada o quimérica.

En una realización, las regiones constantes de cadena pesada de IgM son regiones constantes de IgM humana. En una realización, cada conjunto de unión comprende dos cadenas pesadas de IgM que comprenden cada una un extremo amino situado en la VH para la región constante de IgM, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden cada una un extremo amino situado en la VL para una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina.

En una realización, la transducción de señal puede desencadenar la apoptosis, y la proteína receptora de la superfamilia del TNF es DR5. Por ejemplo, en una realización, el anticuerpo comprende diez o doce dominios de unión al antígeno idénticos que se unen específica y agonísticamente a DR5, donde los dominios de unión al antígeno DR5 comprenden cada uno una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), (a) donde VH y VL comprenden seis regiones determinantes de complementariedad de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, y donde HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 comprenden las CDR de un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de VH y VL de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4; la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6; la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8; la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10; a SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12; la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14; la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO 16 la SEQ ID NO 17 y la SEQ ID NO 18 la SEQ ID NO 19 y la SEQ ID NO: 20 ; la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22; la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24; la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26 ; la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28; la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 30; la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 32; la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO 34; la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 36; la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 38; la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 40; la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 42; la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 44 ; la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 46; la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 48; la SEQ ID NO: 49 y la SEQ ID NO: 50; la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO 52; la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 54; la SEQ ID NO: 55 y la ^{SEQ ID NO: 56; la SEQ ID NO: 82 y la SEQ ID NO 83; la SEQ ID NO: 84 y la SEQ ID NO: 85; la SEQ ID NO: 86 y la}SEQ ID NO: 87 o la SEQ ID NO: 88 y la SEQ ID NO: 89; respectivamente, o la secuencia de ScFv de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72 o la SEQ ID NO: 73; o las seis CDR con una o dos sustituciones de aminoácidos en una o más de las CDR; o

(b) donde la VH y la VL comprenden secuencias de aminoácidos idénticas en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el

100% a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO 9 y la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO 16

la SEQ ID NO 21 y la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26

la SEQ ID NO 27 y la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO 31 y la SEQ ID NO: 32

la SEQ ID NO 33 y la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO 37 y la SEQ ID NO: 38

la SEQ ID NO 39 y la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 44

la SEQ ID NO 45 y la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 49 y la SEQ ID NO: 50

la SEQ ID NO 51 y la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO 55 y la SEQ ID NO: 56

la SEQ ID NO 82 y la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 84 y la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO 86 y la SEQ ID NO: 87

o la SEQ ID NO: 88 y la SEQ ID NO: 89, respectivamente; donde la VH y la VL comprenden secuencias de aminoácidos idénticas en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a las secuencias de aminoácidos de VH y VL contenidas dentro de la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID

NO: 18, o la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20, respectivamente; o donde la VH y la VL están contenidas en un ScFv con una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a la SEQ ID NO: 57, la

SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la

SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable, no tóxico y estéril.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo de cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores.

En una realización, el polinucleótido codifica un primer subconjunto que comprende una región constante de cadena pesada de IgM y al menos una porción VH de anticuerpo del dominio de unión al antígeno del anticuerpo, y un segundo subconjunto de polipéptido que comprende una región constante de cadena ligera y una porción VL de anticuerpo del dominio de unión al antígeno del anticuerpo.

En una realización,

(a) el primer subconjunto polipeptídico comprende una región constante de IgM humana fusionada con el extremo terminal C de una VH que comprende:

(i) regiones HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las CDR contenidas en la secuencia de aminoácidos de

VH en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: SE

11, 13, la SEQ ID NO: 15, 17, Q ID NO: 21, 23, 25, la SEQ

ID NO: 27, 29, Q ID NO: 33, 35, 37, la SEQ

ID NO: 39, 41, Q ID NO: 45, 47,

49, la SEQ ID NO: 51,

53,

Q ID NO: 82, 84, la SEQ ID NO: 86, o la SEQ ID NO: 88, o en la secuencia de aminoácidos de S

SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID SEQ ID NO: 64,

65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SE Q ID NO: 73; o las CDR contenidas en la s de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO la S :

9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, a SE :

21, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 25, la 27, Q ID NO: 31, 33, la SEQ ID NO: 35, la SEQ

ID NO: 37, la 39, Q ID NO: 43, 45, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 49, la

51,

Q ID NO: 55, 82, la SEQ ID NO: 84, la SEQ ID NO: 86 o la SEQ ID NO: 88, o en la secuencia de aminoácidos de ScFv d SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la

SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la

SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72 o la SEQ ID NO: 73 con una o dos sustituciones de aminoácidos individuales en una o más de las HCDR; o

(ii) una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a la SEQ ID NO: 1, la

SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 21, la SEQ

ID NO: 23, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 33, la SEQ

ID NO: 35, la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 53, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 84, la SEQ ID NO: 86 o la SEQ ID NO: 88; la secuencia de aminoácidos de VH contenida dentro de la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID ON: 13, la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 19; o la porción de VH de un ScFv con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72 o la SEQ ID NO: 73; y

(b) el segundo subconjunto polipeptídico comprende una región constante de cadena ligera de lambda o kappa humana fusionada con el extremo terminal C de una VL que comprende:

(i) regiones de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las CDR contenidas en la secuencia de aminoácidos de VL en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 87, o la SEQ ID NO: 89, o en la secuencia de aminoácidos de ScFv de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73; o las CDR contenidas en la secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 87, o la SEQ ID NO: 89, o en la secuencia de aminoácidos de ScFv de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73, con una o dos sustituciones de aminoácidos individuales en una o más de las LCDR; o

(ii) una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 87, o la SEQ ID NO: 89; la secuencia de aminoácidos de VL contenida dentro de la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 18, o la SEQ ID NO: 20; o la porción de VL de un ScFv con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID ⁿO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73.

En un quinto aspecto, la invención proporciona una composición que comprende el polinucleótido de la realización anterior, donde la composición comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena J, o un fragmento de la misma, o una variante de la misma.

En un sexto aspecto, la invención proporciona una célula huésped que comprende el polinucleótido del cuarto aspecto o la composición del quinto aspecto, donde la célula huésped puede expresar el anticuerpo de uno cualquiera de los aspectos primero y segundo, o un subconjunto del mismo.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para producir el anticuerpo de uno cualquiera de los aspectos primero y segundo, que comprende cultivar la célula huésped del sexto aspecto y recuperar el anticuerpo.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro para inducir la apoptosis mediada por el receptor de la superfamilia del TNF, la morfogénesis o la proliferación en una célula que expresa el receptor de la superfamilia del TNF, que comprende poner en contacto a la célula que expresa el receptor de la superfamilia del TNF con el anticuerpo de cualquiera del primero y el segundo aspecto.

En un noveno aspecto, la presente invención proporciona el anticuerpo de cualquiera del primero y el segundo aspecto para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, donde las células cancerosas en el sujeto expresan un receptor de la superfamilia del TNF con actividad apoptótica, y donde el anticuerpo puede activar la apoptosis mediada por el receptor de la superfamilia del TNF en las células cancerosas a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente que tiene los mismos dominios de unión al antígeno, que también agoniza y se une específicamente a la misma proteína receptora de la superfamilia del TNF, donde el sujeto es opcionalmente un sujeto humano.

La descripción proporciona además una composición que incluye uno, dos o más polinucleótidos como se proporciona en esta invención. En ciertos aspectos, se proporciona una composición donde los polinucleótidos están en vectores separados. Se proporcionan dichos vectores. En ciertos aspectos, se proporciona una composición donde los polinucleótidos están en un único vector. Se proporciona dicho vector. En ciertos aspectos, la composición incluye además un polinucleótido que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena J, o un fragmento de la misma, o una variante de la misma.

La descripción también proporciona una célula huésped que incluye un polinucleótido como se proporciona en esta invención, una composición como se proporciona en esta invención, o el vector o vectores proporcionados en esta invención, donde la célula huésped puede expresar una molécula de unión pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención. La descripción proporciona además un procedimiento para producir la molécula de unión como se proporciona en esta invención, donde el procedimiento incluye cultivar la célula huésped y recuperar la molécula de unión.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para inducir apoptosis mediada por un receptor de la superfamilia del TNF en una célula que expresa el receptor de la superfamilia del TNF, donde el procedimiento incluye poner en contacto la célula que expresa el receptor de la superfamilia del TNF con una molécula de unión pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para inducir la formación de la balsa lipídica de un receptor de la superfamilia del ^tN^fen una célula que expresa el receptor de la superfamilia del TNF, lo que incluye poner en contacto la célula que expresa el receptor de la superfamilia del TNF con una molécula de unión pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para tratar el cáncer, donde el procedimiento incluye administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de una molécula de unión pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención, donde las células cancerosas expresan un receptor de la superfamilia del TNF con actividad apoptótica. En ciertos aspectos, la molécula de unión multimérica puede inducir una mayor apoptosis de las células cancerosas que las células no cancerosas, por ejemplo, hepatocitos normales, por ejemplo, hepatocitos humanos normales. En ciertos aspectos, el receptor de la superfamilia del TNF es DR5. En ciertos aspectos, el sujeto es humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS

Figura 1A y Figura 1B: Perfiles de expresión de DR5 en líneas celulares. Figura 1A) Expresión superficial de DR5 humano en células Colo205, medida por citometría de flujo; Figura 1B) Intensidad de fluorescencia media (MFI) de la expresión de DR5 en un panel de líneas celulares.

Figura 2: El mAb anti-DR5 es específico para DR5.El mAb DR5 anti- humano se une específicamente a DR5, y no a los receptores DR4 o señuelo DcR1 y DcR2, según se midió mediante ELISA.

Figura 3: Unión de células de mAb anti-DR5. El mAb DR5 anti-humano o el control de isotipo se incubaron con células Colo205 durante 15 minutos, se lavaron y se tiñeron con un anticuerpo secundario conjugado con aloficocianina. La unión se midió por citometría de flujo.

Figura 4: La IgG Anti-DR5 requiere un reticulante para la citotoxicidad. Las células Colo205 se incubaron con mAb anti-DR5 en ausencia o presencia de reticulante. La viabilidad celular se midió después de 24 horas. El control de isotipo no mostró citotoxicidad con o sin reticulante (datos no mostrados).

Figura 5: La IgG anti-DR5 requiere un reticulante para la apoptosis. Las células Colo205 se incubaron con 5 pg/mL de mAb anti-DR5 en ausencia o presencia de un reticulante. Después de 4 horas de tratamiento, se usó anexina V y 7-AAD para medir las células apoptóticas y muertas, respectivamente.

Figura 6: La IgG anti-DR5 requiere un reticulante para la activación de caspasa. Las células Colo205 se incubaron con 5 |jg/mL de mAb anti-DR5 en ausencia o presencia de un reticulante. La activación de caspasa se midió después de 1, 2, 4 y 24 horas de tratamiento.

Figura 7A-D: El mAb anti-DR5 multimérico es más citotóxico que la IgG monomérica.

Figura 7A: La SDS-PAGE no reductora muestra un mAb anti-DR5 que es predominantemente multimérico (carril 1); el carril 1 corresponde al clon R& D Systems 71903, el carril 2 corresponde al clon BioLegend DJR2-4, el carril 3 corresponde al clon Acris Antibodies B-K29 y el carril 4 corresponde al clon Acris Antibodies B-D37.

Figura 7B: Ensayo de viabilidad celular que muestra que solo el mAb anti-DR5 multimérico provoca citotoxicidad de Colo205 en ausencia de reticulante - clon R& D Systems 71903 (cuadrados rellenos), clon BioLegend DJR2-4 (círculos abiertos, línea discontinua), clon Acris Antibodies B-K29 (diamantes rellenos), clon Acris Antibodies B-D37 (triángulos abiertos, línea discontinua).

Figura 7C: Resultados del ensayo FACS que muestran que, en ausencia de un reticulante, el mAb anti-DR5 multimérico induce apoptosis en las células Colo205, pero no se observan resultados similares para el mAb anti-DR5 monomérico o el control de isotipo.

Figura 7D: Ensayo de luminiscencia de activación de caspasa que muestra que, en ausencia de un reticulante, el mAb anti-DR5 multimérico, pero no monomérico, induce la activación de caspasa en células Colo205.

Figura 8A-B: La IgM Mab DR5 es específica para DR5. La IgG MAb DR5 (Panel A) y la IgM (Panel B) #2 se une específicamente al DR5 humano, y no al DR4 o a los receptores señuelo DcR1 y DcR2, según se midió por ELISA. ^dR5, círculos rellenos; DR4, triángulos rellenos; DcR1, cuadrados abiertos; DcR2, triángulos abiertos.

Figura 9: Unión de células diana de IgM MAb DR5. La IgM MAb DR5 No. 1 (círculos rellenos) o IgG MAb DR5 No. 1 (cuadrados abiertos) se incubaron con células Colo205 durante 15 minutos, se lavaron y se tiñeron con un anticuerpo secundario conjugado con IgM anti-humana o IgG anti-humana Fc Alexa 647. La unión (expresada como el % de células unidas) se midió por citometría de flujo.

Figura 10A-E:Los superagonistas de IgM Mab DR5 son más citotóxicos que la IgG monomérica. La IgM MAb DR5 multimérica No. 1 (Panel A), la IgM No.2 (Panel B), la IgM No. 3 (Panel C) y la IgM No. 4 (Panel D) son más citotóxicas que los equivalentes de IgG en las células Colo205. El panel E muestra que la IgM MAb DR5 No. 1 es más citotóxica que la IgG reticulada. IgM MAb DR5, círculos rellenos; IgG MAb DR5, cuadrados abiertos; IgG MAb DR5 reticulante, triángulos abiertos.

Figura 11A-D: Los superagonistas de IgM MAb DR5 son más citotóxicos en las células tumorales Colo205 que los hepatocitos humanos primarios. La IgM MAb DR5 multimérica No. 1 (Panel A), la IgM MAb DR5 No. 2 (Panel B), la IgM MAb DR5 No. 3 (Panel C) y la IgM MAb DR5 No. 4 (Panel D) se incubaron con células tumorales Colo205 o hepatocitos humanos primarios y se midió la viabilidad celular después de 24 horas. Células Colo205 tratadas con IgM MAb DR5, círculos rellenos; hepatocitos tratados con IgM MAb DR5, círculos abiertos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

Cabe señalar que el término "un" o "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "una molécula de unión" representa una o más moléculas de unión. Como tales, los términos "un" (o "una"), "uno(a) o más" y "al menos uno(a)" se pueden usar de manera indistinta en esta invención.

Además, "y/o" donde se usa en esta invención debe tomarse como una descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por consiguiente, se pretende que el término "y/o", tal como se usa en una expresión tal como "A y/o B" en esta invención, incluya "A y B", "A o B", "A" (sola) y "B" (sola). De manera similar, se pretende que el término "/o", tal como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" abarque cada una de las siguientes realizaciones: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (sola); B (sola); y C (sola).

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que entendería comúnmente un especialista en la materia a la que está relacionada esta descripción. Por ejemplo, el Diccionario conciso de biomedicina y biología molecular, Juo, Pei-Show, 2da ed., 2002, CRC Press; El Diccionario de biología celular y molecular, 3ra ed., 1999, Academic Press; y elDiccionario Oxford de bioquímica y biología molecular, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a una persona con habilidad un diccionario general de muchos de los términos usados en esta descripción.

A menos que se especifique lo contrario, los conjuntos, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi. Los encabezados proporcionados en esta invención no limitan los varios aspectos o relaciones de la descripción, los cuales pueden estar vinculados a la memoria descriptiva en su totalidad como referencia. En consecuencia, los términos definidos a continuación se definen más completamente por referencia a la especificación en su totalidad.

Como se usa en esta invención, el término "polipéptido" pretende incluir un único "polipéptido", así como varios "polipéptidos", y se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos de manera lineal por enlaces de amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por consiguiente, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en vez de, o de manera indistinta con, cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende hacer referencia a los productos de modificaciones post-expresión del polipéptido, incluyendo, entre otros, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación y derivatización por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede derivar de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología de recombinación, pero no es necesariamente traducido a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Puede generarse de cualquier forma, incluyendo mediante síntesis química.

Un polipéptido, como se describe en esta invención, puede tener un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1.000 o más, 2.000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tengan necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que adoptan una gran cantidad de diferentes conformaciones, se denominan no plegados. Como se usa en esta invención, el término glucoproteína se refiere a una proteína acoplada al menos a un resto carbohidrato que está unido a la proteína a través de una cadena lateral que contiene oxígeno o nitrógeno de un aminoácido, por ejemplo, una serina o una asparagina.

Por un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante o derivado del mismo se refiere a un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede retirarse de su entorno original o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante expresados en células huésped se consideran aislados como se describe en esta invención, al igual que los polipéptidos naturales o recombinantes que han sido separados, fraccionados, o parcial o sustancialmente purificados por cualquier técnica adecuada.

Como se usa en esta invención, el término "un polipéptido de origen no natural" o cualquier variante gramatical del mismo, es una definición condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye, aquellas formas del polipéptido que son, o podrían ser, determinadas o interpretadas por un juez u organismo administrativo o judicial como "natural".

Otros polipéptidos descritos en esta invención son fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores, y cualquier combinación de los mismos. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo", como se describen en esta invención, incluyen cualquier polipéptido que retenga al menos algunas de las propiedades del correspondiente anticuerpo o polipéptido nativo, por ejemplo, que se una específicamente a un antígeno. Los fragmentos de polipéptidos incluyen, por ejemplo, fragmentos proteolíticos, así como también fragmentos de deleción, además de fragmentos de anticuerpo específicos descritos en otro punto en esta invención. Las variantes de, por ejemplo, un polipéptido incluyen fragmentos como se ha descrito anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. En ciertos aspectos, las variantes pueden ser de origen no natural. Las variantes de origen no natural pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Las variantes de polipéptidos pueden comprender sustituciones, eliminaciones o adiciones conservativas o no conservativas de aminoácidos. Los derivados son polipéptidos que han sido alterados para exhibir características adicionales que no se encuentran en el polipéptido original. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Las variantes de polipéptidos también pueden denominarse en esta invención "análogos de polipéptidos". Como se usa en esta invención, un "derivado" de un polipéptido también puede hacer referencia al polipéptido de un sujeto que tiene uno o más aminoácidos químicamente derivados por reacción de un grupo lateral funcional. También se incluyen como "derivados" aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de los veinte aminoácidos estándares. Por ejemplo, 4-hidroxiprolina se puede sustituir por prolina, 5-hidroxilisina se puede sustituir por lisina; 3-metilhistidina se puede sustituir por histidina; homoserina se puede sustituir por serina; y ornitina se puede sustituir por lisina.

Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es una en la que un residuo de aminoácidos se remplaza con otro residuo de aminoácidos con una cadena lateral similar. Los aminoácidos ejemplares que pueden estar sustituidos en el polipéptido incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (porejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una tirosina con una fenilalanina es una sustitución conservativa. En determinadas realizaciones, las sustituciones conservativas en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la descripción no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos al antígeno al que se une la molécula de unión. En la técnica, se conocen procedimientos para identificar sustituciones conservativas de nucleótidos y aminoácidos (véase, por ejemplo, Brummell y col., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi y col., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:.412-417 (1997)).

El término "polinucleótido" pretende incluir un único ácido nucleico, así como varios ácidos nucleicos, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aisladas, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ADNc o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace de fosfodiéster convencional o un enlace no convencional ((por ejemplo, un enlace de amida, tal como el encontrado en ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). Los términos "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" hacen referencia a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Por un ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende cualquier forma del ácido nucleico o polinucleótido que se separa de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido purificado en gel o un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se consideraría "aislado". Además, un segmento polinucleotídico, por ejemplo, un producto de PCR, que ha sido modificado para tener sitios de restricción para la clonación, se considera "aislado". Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en una solución no nativa como un amortiguador o un suero. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos, donde la transcripción no es una que se encontraría en la naturaleza. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento de regulación, tal como un promotor, sitio de unión a ribosomas, o un terminador de la transcripción.

Como se usa en esta invención, el término "un polipéptido de origen no natural" o cualquier variante gramatical del mismo, es una definición condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye, aquellas formas del ácido nucleico o polinucleótido que son, o podrían ser, determinadas o interpretadas por un juez u organismo administrativo o judicial como "naturales".

Como se usa en esta invención, una "región codificante" es una porción del ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualesquiera secuencias flanqueantes, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosoma, terminadores de transcripción, intrones y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones de codificación pueden estar presentes en una construcción de un solo polinucleótido, por ejemplo, en un vector individual, o en construcciones de polinucleótido separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector individual puede codificar por separado una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico puede incluir regiones de codificación heterólogas, fusionadas o no fusionadas a otra región de codificación. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, entre otras, aquellas que codifican elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.

En determinadas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso de ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de transcripción o traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operativa es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, está asociada con una o más secuencias reguladoras de tal forma como para poner la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tal como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a la misma) están "asociados de manera operativa" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ^aDⁿno interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de expresión para dirigir la expresión del producto génico o interfiere con la capacidad de la plantilla de ADN de transcribirse. Por consiguiente, una región promotora estaría asociada de manera operativa con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de células que dirige la transcripción sustancial del ADN en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción además del promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden estar asociados de manera operativa con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de células.

Una variedad de regiones de control de transcripción resulta conocida para los expertos en la materia. Estas incluyen, entre otras, regiones de control de transcripción que funcionan en células vertebradas, tales como, entre otras, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón-A), virus simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tales como virus Rous sarcoma). Otras regiones de control de transcripción incluyen las derivadas de genes vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovino y p-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles por linfocina (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).

De manera similar, una variedad de elementos de control de traducción resulta conocida para las personas con un conocimiento ordinario en la materia. Estos incluyen, entre otros, sitios de unión a ribosoma, codones de iniciación y terminación de traducción y elementos que provienen de picornavirus (particularmente un sitio de entrada a ribosoma interno, o IRES, también llamado secuencia CITE).

En otras realizaciones, un polinucleótido puede ser ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia o ARN ribosómico.

Las regiones de codificación de polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden estar asociadas con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido como se describe en esta invención. Según la hipótesis de las señales, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se inició la exportación de la cadena de proteínas de crecimiento a lo largo del retículo endoplasmático rugoso. Los expertos en la técnica son conscientes de que los polipéptidos secretados por células vertebradas pueden tener un péptido de señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido completo o "de longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En ciertas realizaciones, se usa el péptido señal nativo, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o de cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que conserva la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que se asocia operativamente con el mismo. Como alternativa, se puede usar un péptido señal heterólogo de mamífero, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo silvestre puede estar sustituida por la secuencia líder de activador de plasminógeno de tejido humano (TPA) o p-glucuronidasa de ratón.

Como se usan en esta invención, los términos "superfamilia del TNF de proteínas receptoras", "superfamilia del TNF", "familia de receptores ", "receptores de TNF" o cualquier combinación de tales frases, se refieren a la familia de proteínas receptoras transmembrana del factor de necrosis tumoral (TNF) expresadas en la superficie de varias células y tejidos. Los miembros de la familia de esta superfamilia incluyen aquellos que, tras la activación por la unión de ligando desencadenan apoptosis, proliferación y/o morfogénesis en la célula en la que se expresa la proteína receptora. Los miembros de proteínas receptoras de la superfamilia del TNF que desencadenan la apoptosis tras la activación incluyen, entre otros, los siguientes receptores: TNFR1 (DR1), TNFr2, TNFR1/2, CD40 (p50), Fas (CD95, Apo1, DR2), CD30, 4-1BB (CD137, ILA), TRAILR1 (DR4, Apo2), TRAILR2 (DR5), TRAILR3 (DcR1), TRAILR4 (DcR2), OPG (OCIF ), TWEAKR (FN14), LIGHTR (HVEM), DcR3, DR3, EDAR y XEDAR. Los miembros de proteínas receptoras de la superfamilia del TNF que, tras la activación, desencadenan la proliferación incluyen, entre otros, los siguientes receptores: TNFR1/2, GITR (AITR), TACI, BCMA, TWEAKR (FN14), RANK (TRANCER), CD27, CD40 (p50), OX40 (CD134), LT-pP, TNFR1 (DR1) y TNFR2. Los miembros de proteínas receptoras de la superfamilia del t Nf que, tras la activación, se cree que desencadenan la morfogénesis incluyen, entre otros, los siguientes receptores: Fas (CD95, Apo1, DR2), TRAILR1 (DR4, Apo2), DR5 (TRAILR2), TRAILR3 (DcR1), TRAILR4 (DcR2), OPG (OCIF), CD40 (p50), EDAR, XEDAR y TNFR1/2.

En esta invención, se describen ciertas moléculas de unión al antígeno, o fragmentos, variantes o derivados de las mismas, que se unen a ciertas proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, provocando así la apoptosis celular. A menos que se refiera específicamente a anticuerpos de tamaño completo, el término "molécula de unión" comprende anticuerpos de tamaño completo así como también subconjuntos, fragmentos, variantes, análogos o derivados de dichos anticuerpos de unión al antígeno, por ejemplo, moléculas de anticuerpos modificadas o fragmentos que se unen a un antígeno de una manera similar a las moléculas de anticuerpos, pero que usen un andamio diferente.

Como se usa en esta invención, el término "molécula de unión" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un receptor, por ejemplo, un epítopo o un determinante antigénico. Como se describe adicionalmente en esta invención, una molécula de unión puede comprender uno o más de los "dominios de unión al antígeno" descritos en esta invención. Un ejemplo no limitante de una molécula de unión es un anticuerpo o fragmento del mismo que retiene la unión específica al antígeno.

Como se usan en esta invención, los términos "dominio de unión" o "dominio de unión al antígeno" se refieren a una región de una molécula de unión que es necesaria y suficiente para unirse específicamente a un epítopo. Por ejemplo, un "Fv", por ejemplo, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de un anticuerpo, ya sea como dos subconjuntos polipeptídicos separados o como una sola cadena, se considera un "dominio de unión". Otros dominios de unión incluyen, entre otros, la cadena pesada variable (VHH) de un anticuerpo derivado de una especie de camélido o seis regiones determinantes de complementariedad de inmunoglobulina (CDR) expresadas en un armazón de fibronectina. Una "molécula de unión" como se describe en esta invención puede incluir uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más "dominios de unión al antígeno".

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se pueden usar de manera indistinta en esta invención. Un anticuerpo (o un fragmento, variante o derivado del mismo, como se describe en esta invención) incluye al menos el dominio variable de una cadena pesada (para especies de camélidos) o al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras de inmunoglobulina básicas en sistemas vertebrados se comprenden relativamente bien. Véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. 1988). A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" abarca cualquier cosa, desde un pequeño fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo hasta un anticuerpo de tamaño completo, por ejemplo, un anticuerpo IgG que incluye dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas, un anticuerpo IgA que incluye cuatro cadenas pesadas completas y cuatro cadenas ligeras completas y opcionalmente incluye una cadena J y/o un componente secretor, o un anticuerpo IgM que incluye diez o doce cadenas pesadas completas y diez o doce cadenas ligeras completas y opcionalmente incluye una cadena J.

Como se analizará en más detalle a continuación, el término "inmunoglobulina" comprende varias clases amplias de polipéptidos que se pueden distinguir bioquímicamente. Los expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (^y, ^m, a, 8, ^e), con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, ^y1-^y4 o a1-a2)). Es la naturaleza de esta cadena la que determina el "isotipo" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (subtipos) por ejemplo, IgGi, IgG², IgG3, IgG4, IgAi, IgA², etc. están bien caracterizadas y se sabe que otorgan especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas inmunoglobulinas son fácilmente discernibles para el experto en la materia habida cuenta de la presente descripción y, por consiguiente, se encuentran dentro del alcance de esta descripción.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena ligera kappa o lambda indistintamente. En general, las cadenas ligera y pesada están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces covalentes de disulfuro o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son expresadas, por ejemplo, por hibridomas, linfocitos B o células huéspedes modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos transcurren desde el extremo N en los extremos bifurcados de la configuración Y al extremo C al final de cada cadena. La estructura básica de ciertos anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos IgG, incluye dos subconjuntos de cadena pesada y dos subconjuntos de cadena ligera conectados covalentemente mediante enlaces disulfuro para formar una estructura "Y", también denominada en esta invención estructura "H2L2" o "conjunto de unión".

El término "conjunto de unión" se usa en esta invención para referirse a la porción de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que corresponde a una estructura de inmunoglobulina "H2L2" estándar, es decir, dos cadenas pesadas o fragmentos de las mismas y dos cadenas ligeras o fragmentos de las mismas. En ciertos aspectos, por ejemplo, cuando la molécula de unión es un anticuerpo IgG bivalente o un fragmento de unión al antígeno del mismo, los términos "molécula de unión" y "conjunto de unión" son equivalentes. En otros aspectos, por ejemplo, cuando la molécula de unión es un dímero de IgA, un pentámero de IgM o un hexámero de IgM, la molécula de unión comprende dos o más "conjuntos de unión". Dos en el caso de un dímero de IgA, o cinco o seis en el caso de un pentámero o hexámero de IgM, respectivamente. Un conjunto de unión no necesita incluir cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de longitud completa, pero típicamente será bivalente, es decir, incluirá dos "dominios de unión", como se define a continuación. Ciertas moléculas de unión proporcionadas en esta descripción son diméricas e incluyen dos conjuntos de unión bivalentes que incluyen regiones constantes de IgA o fragmentos de las mismas. Ciertas moléculas de unión proporcionadas en esta descripción son pentaméricas o hexaméricas e incluyen cino o seis conjuntos de unión bivalentes que incluyen regiones constantes de IgM o fragmentos de las mismas. Una molécula de unión que comprende dos o más, por ejemplo, dos, cinco o seis conjuntos de unión, se denomina en esta invención como "multimérica".

Los términos "valencia", "bivalente", "multivalente" y equivalentes gramaticales, se refieren al número de dominios de unión en una molécula de unión o conjunto de unión dados. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" en referencia a una molécula de unión dada, por ejemplo, un anticuerpo IgM o fragmento del mismo, denotan la presencia de dos dominios de unión, cuatro dominios de unión y seis dominios de unión, respectivamente. En una molécula de unión derivada de IgM típica, donde cada conjunto de unión es bivalente, la molécula de unión en sí misma puede tener 10 o 12 valencias. Una molécula de unión bivalente o multivalente puede ser monoespecífica, es decir, todos los dominios de unión son iguales, o pueden ser biespecífica o multiespecífica, por ejemplo, cuando dos o más dominios de unión son diferentes, por ejemplo, se unen a diferentes epítopos en el mismo antígeno, o se unen a antígenos completamente diferentes.

El término “epítopo” incluye cualquier determinante molecular capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. En ciertos aspectos, un epítopo puede incluir agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilo o sulfonilo y, en ciertos aspectos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de una diana que está unida por un anticuerpo.

El término "diana" se usa en el sentido más amplio para incluir sustancias que pueden unirse mediante una molécula de unión. Una diana puede ser, por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico, un carbohidrato, un lípido u otra molécula. Además, una "diana" puede ser, por ejemplo, una célula, un órgano o un organismo que comprende un epítopo unido que puede estar unido por una molécula de unión.

Tanto la cadena ligera como la pesada se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se usan funcionalmente. A este aspecto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de cadena ligera variable (VL) y pesada variable (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de cadena ligera (CL) y cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fc, unión al complemento, y similares. Como convención, la numeración de los dominios de región constante aumenta a medida que se alejan más del sitio de unión al antígeno o del extremo amino del anticuerpo. La porción de extremo N es una región variable y la porción de extremo C es una región constante; los dominios CH3 (o CH4 en el caso de la IgM) y CL en realidad comprenden el extremo carboxi de cadena pesada y ligera, respectivamente.

Una "cadena pesada de anticuerpo de IgM de longitud completa" es un polipéptido que incluye en la dirección de extremo N a extremo C, un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio 1 constante de cadena pesada constante de anticuerpo (CM1 o C^j1), un dominio 2 constante de cadena pesada de anticuerpo (CM2 o C ^|j 2), un dominio 3 constante de cadena pesada de anticuerpo (CM3 o C^j3) y un dominio 4 constante de cadena pesada de anticuerpo (CM4 o Cj 4) que puede incluir una pieza de cola.

Una "cadena pesada de anticuerpo de IgA de longitud completa" es un polipéptido que incluye, en la dirección de extremo N a extremo C, un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio 1 constante de cadena pesada constante de anticuerpo (CA1 o Ca1), un dominio 2 constante de cadena pesada de anticuerpo (CA2 o Ca2) y un dominio 3 constante de cadena pesada de anticuerpo (CA3 o Ca3) que puede incluir una pieza de cola.

Como se indicó anteriormente, la(s) región(es) variable(s) permiten que una molécula de unión reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos en antígenos. Es decir, el domino VL y el dominio VH, o el subconjunto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se combinan para formar el dominio de unión al antígeno. Más específicamente, un dominio de unión al antígeno puede definirse por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL. Ciertos anticuerpos forman estructuras más grandes. Por ejemplo, la IgA puede formar una molécula que incluye dos conjuntos de unión de H2L2 y una cadena J conectada covalentemente mediante enlaces disulfuro, que pueden asociarse además con un componente secretor, y la IgM puede formar una molécula pentamérica o hexamérica que incluye cinco o seis uniones de conjuntos de unión de H2L2 y opcionalmente una cadena J conectada covalentemente mediante enlaces disulfuro.

Las seis "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR", presentes en un dominio de unión al antígeno del anticuerpo, son secuencias cortas, no contiguas de aminoácidos que se colocan específicamente para formar el dominio de unión a medida que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión al antígeno, a los que se hace referencia como regiones "marco", muestra menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación p-lámina y las CDR forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura p-lámina. Por consiguiente, las regiones marco actúan para formar un andamiaje que proporciona el posicionamiento de las CDR en una orientación correcta mediante interacciones no covalentes de intercatenarias. El dominio de unión formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo cognado. Los aminoácidos que conforman las CDR y las regiones marco, respectivamente, se pueden identificar fácilmente por un experto en la materia para determinar cualquier región variable de cadena pesada o ligera dada, debido a que se han definido de varias maneras diferentes (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., y col, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).

En el caso en que se utilicen y/o acepten en la técnica dos o más definiciones de un término, la definición del término como se usa en esta invención pretende incluir todos estos significados, a menos que se indique explícitamente otra cosa. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígenos no contiguos encontrados dentro de la región variable de tanto los polipéptidos de cadenas pesadas como ligeras. Estas regiones particulares han sido descritas, por ejemplo, por Kabat y col., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia y col., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Las definiciones de Kabat y Chothia incluyen superposición o subconjuntos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de ya sea la definición (u otras definiciones conocidas para las personas con un conocimiento ordinario en la materia) para referirse a una CDR de un anticuerpo o una variante del mismo, pretende estar dentro del alcance del término, como se define y se usa en esta invención, a menos que se indique lo contrario. Los aminoácidos adecuados que incluyen las CDR, como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la Tabla 1 como una comparación. Las cantidades exactas de aminoácido que incluyen una CDR en particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la materia pueden determinar de manera rutinaria cuáles aminoácidos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Tabla 1 Definiciones de CDR*

*La numeración de las definiciones de todas las CDR de la Tabla 1 es según las convenciones de numeración establecidas en Kabat y col. (véase a continuación).

Kabat y col. también definieron un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que se aplica a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar sin ambigüedad este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ninguna información experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en esta invención, la "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat y col., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Sin embargo, a menos que se indique explícitamente el uso del sistema de numeración de Kabat, se usa una numeración consecutiva para todas las secuencias de aminoácidos en esta descripción.

Las moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanos, humanizados o quiméricos, fragmentos de unión al epítopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')², Fd, Fvs, Fvs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, Fvs enlazados a disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio VL o VH, fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab. Las moléculas de ScFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. No. 5.892.019.

La expresión "se une de manera específica" generalmente significa que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo se une a un epítopo a través de su dominio de unión al antígeno y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítopo. Según esta definición, se dice que una molécula de unión se "une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión al antígeno más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo aleatorio, no relacionado. El término "especificidad" se usa en esta invención para calificar la afinidad relativa mediante la cual una determinada molécula de unión se une un epítopo dado. Se puede considerar, por ejemplo, que la molécula de unión "A" puede tener una mayor especificidad para un epítopo dado que la molécula de unión "B", o se puede decir que la molécula de unión "A" se une al epítopo "C" con una mayor especificidad que la que tiene por el epítopo "D" relacionado. Se puede decir que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, descrito en esta invención, se une a un antígeno diana con una tasa de disociación (k(off)) menor o igual a 5 X 10-2 s-1, 10-2 s-1, 5 X 10-3 s-1, 10-3 s-1, 5 X 10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 X 10-5 s-1, o 10-5 s-15 X 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 X 10-7 s-1 o 10-7 s-1. Se puede decir que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado descrito en esta invención se une a un antígeno diana con una tasa de asociación (k(on)) mayor o igual a 103 M-1 s-1, 5 X 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1, 5 X 104 M-1 s-1, 105 M-1 s-1, 5 X 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, 5 X 106 M-1 s-1 o 107 M-1 s-1. Puede decirse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, inhibe de manera competitiva la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferentemente al del epítopo al punto que bloquea, en cierto grado, la unión del anticuerpo de referencia o el fragmento de unión al antígeno con el epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competencia. Puede decirse que una molécula de unión inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo de referencia o el fragmento de unión al antígeno con un epítopo dado en al menos un 90, 80, 70, 60 o al menos un 50%. Tal como se usa en esta invención, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un epítopo individual con uno o más dominios de unión, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. 1988) en las páginas 27-28. Como se usa en esta invención, el término "avidez" se refiere a la estabilidad general del complejo entre una población de dominios de unión y un antígeno. Véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez se refiere tanto a la afinidad de los dominios de unión individuales en la población con epítopos específicos, como también las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo de alta repetición, tal como un polímero, sería una de alta avidez. Una interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente con un receptor presente a una alta densidad en una superficie celular también sería de gran avidez.

Las moléculas de unión o los fragmentos de unión al antígeno, las variantes o derivados de los mismos, tal como se describe en esta invención también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en esta invención, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento, variante o derivado del mismo que es específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medición de la relación entre dos sustancias antigénicas diferentes. Por consiguiente, una molécula de unión tiene reactividad cruzada si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo con reactividad cruzada generalmente contiene muchas de las características estructurales de complementariedad como el epítopo inductor, y en algunos casos, puede ajustarse realmente mejor que el original. Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, una variante o derivado del mismo también puede describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un antígeno. Por ejemplo, una molécula de unión puede unirse a un antígeno con una constante de disociación o K^dno mayor de 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M o 10-15 M.

Los fragmentos de anticuerpos que incluyen anticuerpos de cadena simple u otros dominios de unión pueden existir solos o en combinación con uno o más de los siguientes: región de bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 o CH4, cadena J o componente secretor. También se incluyen fragmentos de unión al antígeno que pueden comprender cualquier combinación de una o más regiones variables con una o más regiones bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 o CH4, una cadena J o un componente secretor. Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, murinos, de burro, conejo, cabra, cobaya, camello, llama, caballo o pollo. En otra realización, la región variable puede tener un origen condrictoide (por ejemplo, de tiburones). Como se usa en esta invención, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y, en algunos casos, pueden expresar inmunoglobulinas endógenas, tal como se describe infra y, por ejemplo, en la Patente de los EE.u U. No. 5.939.598 de Kucherlapati y col.

Como se usa en esta invención, el término "subconjunto de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que comprende un subconjunto de cadena pesada puede incluir al menos uno de los siguientes: un dominio VH, un dominio CH1, una bisagra (por ejemplo, una región de bisagra superior, media, y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4 o una variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede incluir, entre otros, además de un dominio VH:, un dominio CH1; un dominio CH1, una bisagra y un dominio CH2; un dominio CH1 y un dominio CH3; un dominio CH1, una bisagra y un dominio CH3; o un dominio CH1, un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En ciertos aspectos, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede incluir, además de un dominio VH, un dominio CH3 y un dominio CH4; o un dominio CH3, un dominio CH4 y una cadena J. Además, una molécula de unión para su uso en la descripción puede carecer de ciertas porciones de región constante, por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2. Un experto en la materia entenderá que estos dominios (por ejemplo, los subconjuntos de cadena pesada) se pueden modificar de tal manera que varíen en la secuencia de aminoácidos con respecto a la molécula de inmunoglobulina original.

Como se usa en esta invención, el término "subconjunto de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. El subconjunto de cadena ligera incluye al menos una VL, y puede incluir además un dominio CL (por ejemplo, C^ko CA).

Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos, pueden describirse o especificarse en términos del o los epítopos o porciones de un antígeno que reconocen o con que se unen específicamente. La porción de un antígeno diana que interactúa específicamente con el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo es un "epítopo" o un "determinante antigénico". Un antígeno diana puede comprender un único epítopo o al menos dos epítopos, y puede incluir cualquier cantidad de epítopos, dependiendo del tamaño, la conformación y el tipo de antígeno.

Como se indicó antes, las estructuras de subconjuntos y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las varias clases de inmunoglobulina se conocen bien. Como se usa en esta invención, el término "dominio VH" incluye el dominio variable de extremo amino de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio CH1" incluye el primer (extremo más amino) dominio de región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio VH y es extremo amino para la región bisagra de una molécula de cadena pesada de IgG típica.

Como se usa en esta invención, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el aminoácido 244 al aminoácido 360 de un anticuerpo IgG usando esquemas de numeración convencionales (aminoácidos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y aminoácidos 231-340, sistema de numeración de la UE; véase Kabat EA y col. op. cit). También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 al extremo C de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 aminoácidos. Ciertas clases de inmunoglobulinas, por ejemplo, la IgM, incluyen además una región CH4.

Tal como se usa en esta invención, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2 en cadenas pesadas IgG, IgA e IgD. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 aminoácidos y es flexible, permitiendo, por consiguiente, que las dos regiones de unión al antígeno del extremo N se muevan independientemente.

Como se usa en esta invención, el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol.

Tal como se usa en esta invención, la expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que el sitio o región inmunorreactiva se obtiene o deriva de una primera especie y la región constante (que puede estar intacta, parcial o modificada) se obtiene de una segunda especie. En algunas realizaciones, la región o sitio de unión diana será de una fuente no humana (por ejemplo, ratón o primate) y la región constante es humana.

Los términos "anticuerpo multiespecífico" o "anticuerpo biespecífico" se refieren a un anticuerpo que tiene dominios de unión para dos o más epítopos diferentes dentro de una sola molécula de anticuerpo. Se pueden construir otras moléculas de unión además de la estructura de anticuerpos canónicos con dos especificidades de unión. La unión del epítopo por anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos puede ser simultánea o secuencial. Los triomas y los hibridomas híbridos son dos ejemplos de líneas celulares que pueden secretar anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden construir por medios recombinantes. (Strohlein y Heiss, Future Oncol.

6:1387-94 (2010); Mabry y Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)). Un anticuerpo biespecífico también puede ser un diacuerpo.

Tal como se usa en esta invención "anticuerpo modificado" se refiere a un anticuerpo en el que el dominio variable en la cadena pesada o ligera, o en ambas, se altera mediante al menos un reemplazo parcial de uno o más aminoácidos ya sea en la región de CDR o de región marco. En ciertos aspectos, las CDR completas de un anticuerpo de especificidad conocida pueden injertarse en las regiones marco de un anticuerpo heterólogo. Aunque las CDR alternativas pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso de una subclase, como el anticuerpo a partir del cual derivan las regiones marco, las CDR también pueden derivarse de un anticuerpo de una clase diferente, por ejemplo, de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo modificado en el que una o más CDR "donantes" de un anticuerpo no humano de especificidad conocida se injerta en una región marco de cadena pesada o ligera humana en esta invención se denomina "anticuerpo humanizado". En ciertos aspectos, no todas las CDR se reemplazan con las CDR completas de la región variable del donante y, sin embargo, la capacidad de unión al antígeno del donante todavía puede transferirse a los dominios variables del receptor. Dadas las explicaciones expuestas en, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. Nos. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 6.180.370, llevar a cabo la experimentación de rutina o de ensayo y error para obtener un anticuerpo funcional modificado o humanizado será parte de la competencia de los expertos en la materia.

Como se usa en esta invención, el término "modificado(a)" incluye la manipulación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios sintéticos (por ejemplo, mediante técnicas recombinantes, síntesis de péptidos in vitro, mediante acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas).

Como se usa en esta invención, los términos "unido", "fusionado" o "fusión" u otros equivalentes gramaticales se pueden usar indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes adicionales, por cualquier medio incluyendo conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión dentro de la estructura" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abierta de polinucleótido (ORF) para formar un ORF más largo continuo, de manera que se mantenga el marco de lectura traduccional correcto de los ORF originales. Por consiguiente, una proteína de fusión recombinante es una proteína única que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos normalmente no están unidos en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se hace continuo, por consiguiente, en todos los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar separados física o espacialmente, por ejemplo, en una secuencia de enlazador en marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden fusionarse, dentro del marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región marco de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDR "fusionadas" se cotraduzcan como parte de un polipéptido continuo.

Como se usa en esta invención, el término "reticulado" se refiere a la unión de dos o más moléculas por una tercera molécula. Por ejemplo, un anticuerpo bivalente con dos dominios de unión que se unen específicamente al mismo antígeno puede "reticular" dos copias de ese antígeno, por ejemplo, tal como se expresan en una célula. Muchas proteínas receptoras de la superfamilia del TNF requieren la reticulación de tres o más receptores en la superficie de una célula para la activación. La reticulación de las proteínas receptoras de la superfamilia del TNF significa, por ejemplo, poner en contacto una molécula de unión, como se describe en esta invención, con receptores de la superfamilia del TNF expresados en la superficie de una célula, de manera tal que al menos tres de estos miembros de la familia estén unidos simultáneamente por uno o más moléculas de unión, activando así los receptores.

En el contexto de los polipéptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección terminal de amino a carboxilo en la que los aminoácidos que están próximos entre sí en la secuencia son consecutivos en la estructura primaria del polipéptido. Una porción de un polipéptido que es "extremo amino" o "extremo N" para otra porción de un polipéptido es que esa porción que viene antes en la cadena del polipéptido secuencial. De manera similar, una porción de un polipéptido que es "extremo carboxi" o "extremo C" para otra porción de un polipéptido es que esa porción que viene después en la cadena del polipéptido secuencial. Por ejemplo, en un anticuerpo típico, el dominio variable es "extremo N" para la región constante, y la región constante es "extremo C" para el dominio variable.

El término "expresión", como se usa en esta invención, se refiere a un procedimiento por el cual un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un polipéptido. El procedimiento incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula incluyendo, entre otras, la inactivación génica, así como también la expresión transitoria y la expresión estable. El mismo incluye, entre otras, la transcripción del gen a un ARN, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), y la traducción de dicho ARNm en polipéptido(s). Si el producto final deseado es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y de cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico". Como se usa en esta invención, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen o un polipéptido que se traduce de una transcripción. Los productos génicos descritos en esta invención incluyen, además, ácidos nucleicos con modificaciones posteriores a la transcripción, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones posteriores a la traducción, por ejemplo, metilación, glucosilación, adición de lípidos, asociación con otros subconjuntos de proteína, escisión proteolítica y similares.

Los términos tales como "tratar", "tratamiento" o "aliviar" se refieren a medidas terapéuticas que curan, enlentecen, reducen los síntomas y/o detienen la evolución de una condición o un trastorno patológico diagnosticado. Los términos como "prevenir", "prevención", "evitar", "disuasión" y similares se refieren a medidas profilácticas o preventivas que evitan el desarrollo de una condición o trastorno patológico no diagnosticado. Por consiguiente, "aquellos que necesitan tratamiento" incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, aquellos propensos a tener la enfermedad y aquellos en los cuales se va a evitar el trastorno.

"Sujeto", "individuo", "animal", "paciente" o "mamífero" se refiere a cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para el cual se desea el diagnóstico, el pronóstico o la terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, de granja, de zoológico, deportivos o mascotas tales como perros, gatos, cobayos, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, osos, y así sucesivamente.

Como se usa en esta invención, frases como "un sujeto que se beneficiaría de la terapia" y "un animal que necesita tratamiento" incluyen sujetos, como los mamíferos, que se beneficiarían de la administración de una molécula de unión, como un anticuerpo, que comprende uno o más dominios de unión al antígeno. Dichas moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, se pueden usar, por ejemplo, para procedimientos de diagnóstico y/o para el tratamiento o la prevención de una enfermedad.

Moléculas de unión de IgM

La IgM es la primera inmunoglobulina producida por linfocitos B en respuesta a la estimulación por el antígeno, y se encuentra presente a alrededor de 1,5 mg/ml en suero con una semivida de 5 días. La IgM es una molécula pentamérica o hexamérica. Un conjunto de unión de IgM incluye dos cadenas ligeras y dos pesadas. Mientras que la IgG contiene tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3), la cadena pesada (^) de IgM de manera adicional contiene un cuarto dominio constante (CH4), que incluye una "pieza de cola" de extremo C. La región constante de IgM humana típicamente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74. La región C^1 humana varía de aproximadamente el aminoácido 5 a aproximadamente el aminoácido 102 de la SEQ ID NO: 74; la región C^2 humana varía de aproximadamente el aminoácido 114 a aproximadamente el aminoácido 205 de la SEQ ID NO: 74, la región C^3 humana varía de aproximadamente el aminoácido 224 a aproximadamente el aminoácido 319 de la SEQ ID NO: 74, la región C^ 4 varía de aproximadamente el aminoácido 329 a aproximadamente el aminoácido 430 de la SEQ ID NO: 74, y la pieza de cola varía de aproximadamente el aminoácido 431 a aproximadamente el aminoácido 453 de la SEQ ID NO: 74. La SEQ ID NO: 74 se presenta a continuación:

GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSW

K YKNN SDIS S TRGFP S VLRGGK Y A AT S Q YLLP SKD VMQ GT

DEHVV CKV QHPNGNKEKNVPLP VIAELPPK V S VF VPPRDGF

FGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQV

Q AE AKE S GPTT YK VT S TLTIKE SD WLGQ SMF T CRVDHRGLT

FQQN AS SMC VPDQDT AIRVF AIPP SF ASIFLTKSTKLT CL VTD

LTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASI

CEDDWNSGERFTCT YTHTDLP SPLKQTISRPKGY ALHRPD Y

YLLPP AREQLNLRE S ATIT CL VT GF SP AD VF V Q WMQRGQPL

SPEKYVT S APMPEPQ APGRYF AHSILT V SEEEWNT GET YT C

VAHE ALPNRVTERT VDKSTGKPTLYNV SL VMSDT AGT C Y

Cinco conjuntos de unión a IgM pueden formar un complejo con una cadena de polipéptidos pequeña adicional (la cadena J) para formar un anticuerpo IgM. La cadena J humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76. Sin la cadena J, los conjuntos de unión de IgM típicamente se ensamblan en un hexámero. Si bien no se pretende limitarse a la teoría, se cree que el ensamblaje de los conjuntos de unión de IgM en una molécula de unión pentamérica o hexamérica involucra los dominios C^3 y C^4. En consecuencia, una molécula de unión pentamérica o hexamérica proporcionada en esta descripción típicamente incluye regiones constantes de IgM que incluyen al menos los dominios C^3 y C^4. La SEQ ID NO: 76 se presenta a continuación:

MKNHLLFWGVLAVFIKAVHVKAQEDERIVLVDNKCKCARI

T SRIIRS SEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPT SPLRTRF V Y

HLSDLCKKCDPTE VELDN QI VT AT Q SNICDED S ATET C YT Y

DRNKC YT AVVPL V Y GGETKMVET ALTPD AC YPD

Una región constante de cadena pesada de IgM puede incluir adicionalmente un dominio C^2 o un fragmento del mismo, un dominio C^1 o un fragmento del mismo, y/u otros dominios de cadena pesada de IgM. En ciertos aspectos, una molécula de unión como se proporciona en esta invención puede incluir un dominio constante de cadena pesada (^) de IgM completa, por ejemplo, la SEQ ID NO: 74, o una variante, derivado o análogo del mismo.

Moléculas pentaméricas o hexaméricas de unión a la superfamilia del TNF

Esta descripción proporciona una molécula de unión pentamérica o hexamérica, es decir, una molécula de unión con cinco o seis "conjuntos de unión" como se define en esta invención, que puede unirse específicamente a una o más proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, por ejemplo, DR5. Una molécula de unión, como se proporciona en esta invención, puede poseer características de unión o actividad biológica mejoradas en comparación con una molécula de unión compuesta de un único conjunto de unión, por ejemplo, un anticuerpo IgG bivalente. Por ejemplo, una molécula de unión pentamérica o hexamérica puede reticular más eficientemente tres o más moléculas receptoras de la superfamilia del TNF en la superficie de una célula, por ejemplo, una célula tumoral, facilitando así la apoptosis de la célula.

Una molécula de unión, como se proporciona en esta invención, también puede poseer características distintivas en comparación con la molécula de unión multivalente compuesta de estructuras sintéticas o quiméricas. Por ejemplo, el uso de regiones constantes de IgM humana puede proporcionar inmunogenicidad reducida y, por consiguiente, mayor seguridad en relación con una molécula de unión que contiene regiones constantes quiméricas o estructuras sintéticas. Además, una molécula de unión basada en IgM puede formar consistentemente oligómeros hexaméricos o pentaméricos, dando como resultado un producto de expresión más homogéneo. La fijación superior del complemento también puede ser una función efectora ventajosa de las moléculas de unión basadas en IgM.

En ciertos aspectos, la descripción proporciona una molécula de unión pentamérica o hexamérica que comprende cinco o seis conjuntos de unión bivalentes, respectivamente, donde cada conjunto de unión incluye dos regiones constantes de cadena pesada de IgM o fragmentos de las mismas. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgM son regiones constantes de cadena pesada humanas.

Cuando la molécula de unión proporcionada en esta invención es pentamérica, la molécula de unión puede comprender además una cadena J, o un fragmento de la misma, o una variante de la misma.

Una región constante de cadena pesada de IgM puede incluir uno o más de un dominio C ^|j 1, un dominio C ^|j 2, un dominio C^j3, y/o un dominio C^j4, siempre que la región constante pueda cumplir una función deseada en la molécula de unión, por ejemplo, asociarse con una segunda región constante de IgM para formar un dominio de unión, o asociarse con otros conjuntos de unión para formar un hexámero o un pentámero. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgM o sus fragmentos dentro de un conjunto de unión individual comprenden cada uno un dominio Cj 3 o un fragmento del mismo, un dominio Cj 4 o un fragmento del mismo, una pieza de cola (TP) o un fragmento de la misma, o cualquier combinación de un dominio Cj 3 y un dominio Cj , y una TP o un fragmento de los mismos. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgM o sus fragmentos dentro de un conjunto de unión individual comprenden cada uno un dominio Cj 2 o un fragmento del mismo, un dominio Cj 1 o un fragmento del mismo, o un dominio Cj 1 o fragmento del mismo y un dominio Cj 2 o un fragmento del mismo. En ciertos aspectos, cada una de las dos regiones constantes de cadena pesada de IgM en un conjunto de unión dado se asocia a un dominio de unión al antígeno, por ejemplo, una porción Fv de un anticuerpo, por ejemplo, una VH y una VL de un anticuerpo humano o murino, donde la VL puede asociarse con una región constante de cadena ligera. En una molécula de unión como se proporciona en esta invención, al menos un dominio de unión al antígeno de la molécula de unión es un dominio de unión a proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, es decir, un dominio de unión que puede unirse específicamente a un miembro de la superfamilia de proteínas receptoras del TNF, por ejemplo, la DR5 humano.

Moléculas de unión de IgA

La IgA juega un papel crítico en la inmunidad de la mucosa y comprende aproximadamente el 15% de la inmunoglobulina total producida. La IgA es una molécula monomérica o dimérica. Un conjunto de unión de IgA incluye dos cadenas ligeras y dos pesadas. La IgA contiene tres dominios constantes de cadena pesada (C al, Ca2 y Ca3) e incluye una "pieza de cola" de extremo C. La IgA humana tiene dos subtipos, IgA1 e IgA2. La región constante de IgA1 humana típicamente comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 78. La región Cal humana oscila desde alrededor del aminoácido 6 a alrededor del aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 78; la región Ca2 humana oscila desde alrededor del aminoácido 125 a alrededor del aminoácido 220 de la SEQ ID NO: 78, región Ca3 humana oscila desde alrededor del aminoácido 228 a alrededor del aminoácido 330 de la SEQ ID NO: 78 y la pieza de cola oscila desde alrededor del aminoácido 331 a alrededor del aminoácido 352 de la SEQ ID NO: 78. La región constante de IgA2 humana típicamente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 79. La región Ca1 humana oscila desde alrededor del aminoácido 6 a alrededor del aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 79; la región Ca2 humana oscila desde alrededor del aminoácido 112 a alrededor del aminoácido 207 de la SEQ ID NO: 79, región Ca3 humana oscila desde alrededor del aminoácido 215 a alrededor del aminoácido 317 de la SEQ ID NO: 79 y la pieza de cola oscila desde alrededor del aminoácido 318 a alrededor del aminoácido 340 de la SEQ ID NO: 79. Las SEQ ID NO: 78 y 79 se presentan a continuación:

SEQ ID NO: 78

ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWS

ESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSV

T CHVKH YTNP S QD VT VPCP VP S TPP TP SP S TPPTP SP S CCHPR

LSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSG

KSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAA

YPE SKTPLT ATL SKS GNTFRPE VHLLPPP SEEL ALNEL VTLT C

LARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTT

TF A VT SILRV A AED WKKGDTF S CM V GHE ALPL AF T QKTIDR

LAGKPTHVNYSYYMAEYDGTCY

SEQ ID NO: 79

ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTW

SE S GQN VT ARNFPP S QD AS GDL YTT S S QLTLP AT QCPDGKS

VTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALED

LLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPER

DLCGC Y S VS S VLPGC AQP WNHGETFTCT AAHPELKTPLT AN

ITKS GNTFRPE VHLLPPP SEEL ALNEL VTLT CL ARGF SPKD VL

VRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAA

ED WKKGDTF SCMV GHE ALPL AFTQKTIDRMAGKPTHVNV S

VVMAEVDGTCY

Dos conjuntos de unión a IgA pueden formar un complejo con dos cadenas de polipéptidos adicionales, la cadena J (SEQ ID NO: 76) y el componente secretor (precursor, SEQ ID NO: 80, maduro, ^sE^qID NO: 81) para formar un anticuerpo secretor IgA (IgAs). Si bien no se pretende limitarse a la teoría, se cree que el ensamblaje de los conjuntos de unión de IgA en una molécula sIgA de unión dimérica involucra los dominios Ca3 y de pieza de cola. En consecuencia, una molécula de unión dimérica IgAs proporcionada en esta descripción típicamente incluye regiones constantes de IgA que incluyen al menos los dominios Ca3 y de pieza de cola. La SEQ ID NO: 80 y la SEQ ID NO: 81 se presentan a continuación:

SEQ ID NO: 80:

MLLF VLT CLL AVFP AISTKSPIF GPEEVN S VEGN S VSIT C YYP

PT S VNRHTRKYWCRQGARGGCITLIS SEGYVS SKYAGRANL

TNFPENGTFVVNIAQLSQDDSGRYKCGLGINSRGLSFDVSLE

VSQGPGLLNDTKVYTVDLGRTVTINCPFKTENAQKRKSLYK

QIGL YP VL VID S S GYVNPN YT GRIRLDIQGT GQLLF S V YIN QL

RLSDAGQYLCQAGDDSNSNKKNADLQVLKPEPELVYEDLR

GSVTFHCALGPEVANVAKFLCRQSSGENCDVVVNTLGKRA

PAFEGRILLNPQDKDGSFSVVITGLRKEDAGRYLCGAHSDG

QLQEGSPIQ AW QLF VNEE S TIPRSPT VVKGV AGGS V AVLCP

YNRKE SKSIK YW CL WEG AQN GRCPLL YD SEGW YK AQ YEG

RLSLLEEPGNGTFTVILNQLTSRDAGFYWCLTNGDTLWRTT

VEIKIIEGEPNLKVPGNVT AVLGETLKVPCHFPCKFS S YEK Y

W CKWNNT GCQ ALP S QDEGP SKAF VNCDEN SRL V SLTLNL V

TRADEGWYWCGVKQGHF Y GET AAVYV AVEERK AAGSRD

V SL AK AD AAPDEKVLD S GFREIENK AIQDPRLF AEEK AV AD

TRDQ ADGSRAS VDSGS SEEQGGS SRALVSTL VPLGLVL AVG

AV AV GV ARARHRKNVDRV SIRS YRTDISMSDFEN SREF G A

NDNMGAS SIT QET SLGGKEEF V ATTE S TTETKEPKK AKRS S

KEEAEMAYKDFLLQSSTVAAEAQDGPQEA

SEQ ID NO: 81:

KSPIFGPEEVNSVEGNSVSITCYYPPTSVNRHTRKYWCRQG

ARGGCITLIS SEGYVS SK Y AGR ANLTNFPEN GTF VVNIAQL S

QDDSGRYKCGLGIN SRGLSFD V SLEV SQGPGLLNDTKVYT V

DLGRTVTINCPFKTENAQKRKSLYKQIGLYPVLVIDSSGYVN

PNYTGRIRLDIQGTGQLLFSVVINQLRLSDAGQYLCQAGDD

SN SNKKN ADLQ VLKPEPEL VYEDLRGS VTFHC ALGPE V AN

V AKFLCRQ S S GEN CD V V VNTLGKRAP AFEGRILLNPQDKD

GSFSVVITGLRKEDAGRYLCGAHSDGQLQEGSPIQAWQLFV

NEE S TIPRSPT VVKGV AGGS V AVLCP YNRKE SKSIK YW CL W

EGAQNGRCPLLVDSEGWVKAQYEGRLSLLEEPGNGTFTVIL

NOT TSRD AGFYWCfTNGDTT,WRTT VETKTTEGEPNT KVPGN

VT AVLGETLK VPCHFP CKF S S YEK YW CKWNNT GCQ ALP S Q

DEGP SKAF VNCDEN SRL V SLTLNL VTRADEGWYWCGVKQ

GHF Y GET A AV Y V AVEERK AAGSRD V SL AK AD AAPDEK VL

D S GFREIENK AIQDPR

Una región constante de cadena pesada de IgA puede incluir adicionalmente un dominio Ca2 o un fragmento del mismo, un dominio Cal o un fragmento del mismo, y/u otros dominios de cadena pesada de IgA. En ciertos aspectos, una molécula de unión, como se proporciona en esta invención, puede incluir un dominio constante de cadena pesada (a) de IgA completa, por ejemplo, (por ejemplo, la SEQ ID NO: 78 o la SEQ ID NO: 79) o una variante, derivado o análogo del mismo.

Moléculas diméricas de unión al receptor de la superfamilia de TNF diméricas

Esta descripción proporciona una molécula de unión DIMÉRICA, por ejemplo, una molécula de unión con dos "conjuntos de unión" de IgA, como se define en esta invención, que puede unirse específicamente a una o más proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, por ejemplo, DR5. Una molécula de unión, como se proporciona en esta invención, puede poseer características de unión o actividad biológica mejoradas en comparación con una molécula de unión compuesta de un único conjunto de unión, por ejemplo, un anticuerpo IgG bivalente. Por ejemplo, una molécula de unión de IgA puede reticular más eficientemente tres o más receptores de la superfamilia del TNF en la superficie de una célula, por ejemplo, una célula tumoral, facilitando así la apoptosis de la célula. Además, una molécula de unión a IgA puede alcanzar sitios de la mucosa proporcionando una mayor distribución de tejido para las moléculas de unión proporcionadas en esta invención. El uso de una molécula de unión basada en IgA puede permitir, por ejemplo, una mayor distribución de tejido para una molécula de unión proporcionada en esta invención. La distribución mucosa puede ser beneficiosa para ciertos cánceres, por ejemplo, cáncer de pulmón, ovárico, colorrectal o carcinoma de células escamosas. Asimismo, una molécula de unión dimérica como se proporciona en esta invención puede poseer características de unión o actividad biológica que se pueden distinguir de una molécula de unión que comprende cinco o seis conjuntos de unión, por ejemplo, un anticuerpo IgM hexamérico o pentamérico. Por ejemplo, una molécula de unión dimérica sería más pequeña y podría, por ejemplo, lograr una mejor penetración de tejido en tumores sólidos.

En ciertos aspectos, la descripción proporciona una molécula de unión dimérica que comprende dos conjuntos de unión bivalentes, donde cada conjunto de unión incluye dos regiones constantes de cadena pesada de IgM o fragmentos de las mismas. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA son regiones constantes de cadena pesada humanas.

Una molécula de unión de IgA dimérica, como se proporciona en esta invención, puede comprender además una cadena J, o un fragmento o variante de la misma. Una molécula de unión de IgA dimérica, como se proporciona en esta invención, puede comprender además un componente secretor, o un fragmento o variante del mismo.

Una región constante de cadena pesada de IgA puede incluir uno o más de un dominio Cal, un dominio Ca2 y/o un dominio Ca3, siempre y cuando la región constante pueda cumplir una función deseada en la molécula de unión, por ejemplo, asociarse a una región constante de cadena ligera, a fin de facilitar la formación de un dominio de unión al antígeno, o asociarse a otro conjunto de unión de IgA para formar una molécula de unión dimérica. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o sus fragmentos dentro de un conjunto de unión individual comprenden cada uno un dominio Ca3 o un fragmento del mismo, una pieza de cola (TP) o un fragmento de la misma, o cualquier combinación de un dominio Ca3, una TP o un fragmento de los mimos. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o sus fragmentos dentro de un conjunto de unión individual comprenden cada uno un dominio Ca2 o un fragmento del mismo, un dominio Cal o un fragmento del mismo, o un dominio Cal o fragmento del mismo y un dominio Ca2 o un fragmento del mismo.

En ciertos aspectos, cada una de las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA en un conjunto de unión dado se asocia a un dominio de unión al antígeno, por ejemplo, una porción Fv de un anticuerpo, por ejemplo, una VH y una VL de un anticuerpo humano o murino, donde la VL puede asociarse con una región constante de cadena ligera. En una molécula de unión, como se proporciona en esta invención, al menos un dominio de unión al antígeno de la molécula de unión es un dominio de unión de una proteína receptora de la superfamilia del TNF, es decir, un dominio de unión que puede unirse específicamente a un miembro de las proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, por ejemplo, DR5 humano.

Dominios de unión al receptor de la superfamilia del TNF

Una molécula de unión a proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, como se proporciona en esta invención puede ser dimérica, pentamérica o hexamérica, y comprender dos, cinco o seis conjuntos de unión bivalentes, respectivamente. Los conjuntos de unión pueden ser de longitud completa o variantes o fragmentos de los mismos que retienen la función de unión.

Cada conjunto de unión comprende dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o IgM o fragmentos de las mismas, cada una asociada con un dominio de unión al antígeno. Como se señaló antes, un dominio de unión al antígeno es una región de una molécula de unión que es necesaria y suficiente para unirse específicamente a un epítopo. Una "molécula de unión" como se describe en esta invención puede incluir uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más "dominios de unión al antígeno".

Una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención puede incluir al menos tres dominios de unión al antígeno que se unen específica y agonísticamente a una proteína receptora de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF). Como se señaló anteriormente, algunas de estas proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, tras la activación, pueden inducir apoptosis de la célula que expresa la proteína receptora de la superfamilia del TNF que estaba unida. La apoptosis ocurrirá, como se entiende actualmente, cuando múltiples proteínas receptoras se unen entre sí, provocando la reticulación de las moléculas receptoras de manera que se transmita una señal a través de la membrana celular al citosol de la célula que expresa la proteína receptora de la superfamilia del TNF.

Una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica. como se proporciona en esta invención puede reticular al menos tres proteínas receptoras de la superfamilia del TNF idénticas expresadas en la superficie de una célula. Debido a la naturaleza dimérica, pentamérica o hexamérica de una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF, como se proporciona en esta invención, puede reticular hasta tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, las proteínas receptoras necesariamente se acercan espacialmente entre sí, lo que contribuye a su reticulación y activación. Cuando los cinco o los seis conjuntos son de unión bivalente, una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF, como se proporciona en esta invención, se une a hasta diez o doce proteínas receptoras de la superfamilia del TNF en una sola célula, respectivamente, puede producirse la reticulación y la activación de los receptores.

Debido a que cada uno de los conjuntos de unión es bivalente, cada molécula de unión puede unirse a un máximo de 10 (para moléculas de unión pentamérica) o 12 (para moléculas de unión hexamérica) proteínas receptoras de la superfamilia del TNF.

Tras la activación de los receptores mediante la unión de una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención, la célula puede sufrir apoptosis, activación o morfogénesis, como se describió anteriormente, dependiendo de qué receptor de la superfamilia se une.

En ciertos aspectos, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se describe actualmente, puede inducir apoptosis mediada por el receptor de la superfamilia del TNF en una célula que expresa la superfamilia del receptor del TNF en una potencia más alta que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG bivalente o fragmento del mismo, que también agoniza y se une específicamente a la misma proteína receptora de la superfamilia del TNF. Sin pretender limitarse a la teoría, dado que una molécula de unión proporcionada es dimérica, pentamérica o hexamérica, y dado que cada conjunto de unión es bivalente, dicha molécula de unión puede inducir funciones mediadas por receptores previamente caracterizadas para esta superfamilia de proteínas receptoras a una potencia superior a la de cualquier conjunto de unión individual solo, como un conjunto de unión de IgG equivalente. Los conjuntos de unión a IgG son bivalentes, contienen dos sitios de unión, pero como lo han demostrado estudios clínicos previos, la unión de dos receptores de esta superfamilia con una sola molécula de IgG puede ser inefectiva sin la adición de otros componentes, como los reticulantes, etc.

Por "potencia" o "características de unión mejoradas" se entiende la menor cantidad de una molécula de unión dada necesaria para lograr un resultado biológico dado, por ejemplo, la activación del 20, el 50 o el 90% de una proteína receptora de la superfamilia del TNF en un ensayo dado, por ejemplo, un ELISA o ensayos de caspasa basados en transferencia Western, tinción con anexina-v como se ve por análisis FACS u otro ensayo como se proporciona en los ejemplos a continuación. Por ejemplo, cuando la proteína receptora de la superfamilia del TNF es aquella que, cuando se activa, provoca la apoptosis de la célula en la que se activa, la potencia se puede expresar como una curva en la que el % de supervivencia de las células está en el eje Y, y la concentración de la molécula de unión (en, por ejemplo, ^{| j} g/ml o ^|j M) está en el eje X.

Debido a que una molécula de unión como se proporciona en esta invención es dimérica, pentamérica o hexamérica, puede contener hasta 4, 10 o 12, respectivamente, dominios de unión al antígeno. Cada uno de los dominios de unión al antígeno puede agonizar y unirse específicamente al receptor de la superfamilia del TNF. Además, cada dominio de unión al antígeno puede ser específico para un epítopo particular de la proteína receptora de la superfamilia del TNF. En ciertos aspectos, la molécula de unión no reacciona de manera cruzada con otras proteínas receptoras de la superfamilia del ^tN^f. Sin embargo, en otros aspectos, dos o más de los dominios de unión al antígeno pueden ser específicos para diferentes epítopos y/o diferentes proteínas receptoras de la superfamilia del TNF.

Por consiguiente, una sola molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica puede: a) unir simultáneamente un único epítopo en muchas proteínas receptoras idénticas, b) unir muchos epítopos diferentes en la misma proteína receptora idéntica, o c) puede unir diferentes epítopos en diferentes proteínas receptoras de la superfamilia del TNF. En la realización a), una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF como se proporciona en esta invención puede unir múltiples copias de un receptor de la superfamilia del TNF idéntico en la misma ubicación para cada copia idéntica, formando así una balsa de tales proteínas receptoras en una única ubicación y probablemente aumentando la probabilidad de que las proteínas receptoras se activen. En otras realizaciones, como la realización c), una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, se puede usar para contactar múltiples proteínas receptoras de la superfamilia del TNF diferentes, activando así más de una ruta a través de los varios receptores dirigidos, para lograr la respuesta biológica deseada en las células. Por supuesto, en estas realizaciones, una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF, como se proporciona en esta invención, puede agonizar y contactar dichos receptores en una sola célula, o en múltiples células. Por consiguiente, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede comprender tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o, en el caso de las moléculas de unión hexamérica, hasta once o doce dominios de unión al antígeno que se unen específica y agonísticamente a una o más proteínas receptoras de la superfamilia del TNF expresadas en la superficie de una o más células, induciendo así la respuesta biológica pretendida o deseada en la(s) célula(s).

Los conjuntos de unión de una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, tal como se proporciona en esta invención, pueden ser conjuntos de unión a inmunoglobulina humana, humanizada o quimérica. Los procedimientos para humanizar secuencias de inmunoglobulina son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica pueden ser directamente de secuencias humanas, o pueden ser humanizadas o quiméricas, es decir, codificadas por secuencias de múltiples especies diferentes.

Una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede unirse específicamente a cualquiera de las proteínas receptoras de la superfamilia del TNF conocidas. Estas proteínas receptoras pueden agruparse en funciones específicas de desencadenar morfogénesis, apoptosis o proliferación. Por consiguiente, una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF, como se proporciona en esta invención, puede, por ejemplo, unirse específicamente a uno o más de los siguientes receptores: TNFR1 (DR1), TNFR2, TNFR1/2, CD40 (p50), Fas (CD95, Apo1, DR2), CD30, 4-1BB (CD137, ILA), DR4 (TRAILR1, Apo2), DR5 (TRAILR2), DcR1 (TRAILR3), DcR2 (TRAILR4), OPG (OCIF ), TWEAKR (FN14), LIGHTR (HVEM), DcR3, DR3, EDAR y XEDAR.

En una realización, una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF, como se proporciona en esta invención, se une específica y agonísticamente a DR5 pero no se une específicamente a otros receptores, por ejemplo, DR4 (TRAILR1, Apo2), el receptor señuelo DcR1 (TRAILR3) o el receptor señuelo DcR2 (TrA iLR4). En ciertos aspectos, la molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF, como se proporciona en esta invención, puede unirse específica y agonísticamente a DR5 y también puede unirse específicamente a DR4.

Las células que expresan proteínas receptoras de la superfamilia del TNF pueden ser cualquier célula animal. Por ejemplo, en una realización, la célula es una célula humana. Por ejemplo, la célula puede ser una o más de células de primates, de roedores, caninos, equinos, etc. Además, la célula que expresa la proteína receptora de la superfamilia del TNF puede ser una célula cancerosa. Es decir, la célula puede ser una célula en un tumor que es maligno o benigno.

Una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención puede modificarse genéticamente de manera que sus dominios de unión al antígeno estén codificados por secuencias que se sabe que se unen específicamente a una proteína receptora de la superfamilia del TNF. Muchos grupos han publicado secuencias de regiones variables de anticuerpos monoclonales, la mayoría de los isotipos de IgG, que se caracterizan y se sabe que se unen específicamente a un receptor de la superfamilia del TNF, por ejemplo, DR5. En las Tablas 2 y 3, se proporcionan las secuencias de dominio variable de inmunoglobulina no limitantes que se sabe que se unen específicamente a DR5. Se han publicado otras secuencias de anticuerpos monoclonales específicas para otros miembros de la superfamilia de proteínas receptoras del TNF. Un experto en la materia es capaz de modificar estas secuencias publicadas en estructuras de inmunoglobulina, como una estructura IgG, IgA, IgM, o fragmentos biológicamente activos o funcionales de las mismas (como fragmentos scFv y similares, como se analizó anteriormente). Los procedimientos para diseñar genéticamente regiones variables clonadas en dominios de inmunoglobulina, expresar y purificar tales construcciones son publicados y se encuentran dentro de la capacidad de un experto en la materia.

Por consiguiente, en ciertos aspectos, un dominio de unión a proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, como se proprociona en esta invención comprende seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, o las seis regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos individuales en una o más CDR, de un mAb anti-DR5 que comprende las secuencias de aminoácidos de VH y VL de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO 11 y la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO 13 y la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO 15 y la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO 17 y la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO 19 y la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO 33 y la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO 39 y la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 49 y la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO 51 y la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 55 y la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO 82 y la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 84 y la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, o la SEQ ID NO: 88 y la SEQ ID NO: 89; respectivamente, o la secuencia de aminoácidos de ScFv de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73.

En ciertos aspectos, el dominio de unión DR5 comprende una VH y una VL, donde VH y VL comprenden secuencias de aminoácidos que son idénticas en al menos el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: y la SEQ ID NO: 8 la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO 15 y la SEQ ID NO 16, la SEQ ID NO 17 y la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO 33 y la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO 35 y la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO 39 y la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 49 y la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO 51 y la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO 53 y la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 55 y la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO 82 y la SEQ ID NO 83, la SEQ ID NO 84 y la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, o la SEQ ID NO: 88 y la SEQ ID NO: 89 ; respectivamente, o donde VH y VL se sitúan en un ScFv que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73.

Si bien una persona con conocimientos ordinarios en la materia puede contemplar una variedad de diferentes moléculas de unión diméricas, pentaméricas y hexaméricas basadas en esta descripción, y, como tales, las mismas se incluyen en esta descripción, en ciertos aspectos, se proporciona una molécula de unión, como se describió anteriormente, donde cada conjunto de unión comprende dos cadenas pesadas de IgA o IgM que comprenden cada una un extremo amino situado en VH para la región constante de IgA o IgM o un fragmento de la misma, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden cada una un extremo amino situado en VL para una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina.

Además, en ciertos aspectos, al menos un conjunto de unión de la molécula de unión, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión, comprende o comprende dos de los dominios de unión a DR5 como se describió anteriormente. En ciertos aspectos, los dos dominios de unión a DR5 en el al menos un conjunto de unión de la molécula de unión, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión, pueden ser diferentes entre sí, o pueden ser idénticos.

En ciertos aspectos, las dos cadenas pesadas de IgA o IgM dentro del al menos un conjunto de unión de la molécula de unión, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión, son idénticas. En ciertos aspectos, dos cadenas pesadas IgA o IgM idénticas dentro de al menos un conjunto de unión, o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión comprenden las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada, como se describe en las Tablas 2 y 3.

En ciertos aspectos, las dos cadenas ligeras dentro del al menos un conjunto de unión de la molécula de unión, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión son idénticas. En ciertos aspectos, dos cadenas ligeras idénticas dentro de al menos un conjunto de unión o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión son cadenas ligeras kappa, por ejemplo, cadenas ligeras kappa humanas o cadenas ligeras lambda, por ejemplo, cadenas ligeras lambda humanas. En ciertos aspectos, dos cadenas ligeras idénticas dentro de al menos un conjunto de unión, o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión comprenden cada una las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera como se describe en las Tablas 2 y 3.

En ciertos aspectos, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica proporcionada por esta descripción comprende, o cada uno comprende, dos regiones constantes de cadena pesada IgA o IgM idénticas, cada una de las cuales comprende secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada idénticas como se describe en las Tablas 2 y 3, y dos cadenas ligeras idénticas que comprenden secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada idénticas como se describe en las Tablas 2 y 3. Según este aspecto, los dominios de unión a DR5 en el al menos un conjunto de unión de la molécula de unión, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, o al menos seis conjuntos de unión de la unión molécula, pueden ser idénticos. Además, según este aspecto, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención puede comprender al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once o al menos doce copias de un dominio de unión a DR5 como se describió anteriormente. En ciertos aspectos, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis de los conjuntos de unión pueden ser idénticos y, en ciertos aspectos, los conjuntos de unión pueden comprender dominios de unión idénticos, por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once o al menos doce dominios de unión a DR5 pueden ser idénticos.

En ciertos aspectos, una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención puede poseer propiedades estructurales o funcionales ventajosas en comparación con otras moléculas de unión. Por ejemplo, la unión a proteínas receptoras de la superfamilia del t Nf dimérica, pentamérica o hexamérica en relación con una molécula de unión bivalente correspondiente que tiene los mismos dominios de unión al antígeno. Los ensayos biológicos incluyen, entre otros, ELISA y ensayos de caspasa de transferencia Western, y el análisis de FACS usando tinciones indicativas de muerte celular apoptótica, como anexina-v. En ciertos aspectos, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede desencadenar la apoptosis de una célula que expresan la proteína receptora de la superfamilia del TNF a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 monoespecífico y bivalente o un fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de proteína receptora de la superfamilia del TNF, como el dominio de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF. En ciertos aspectos, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica tal como se proporciona en esta invención puede desencadenar la apoptosis de una célula que expresa DR5 a una potencia mayor que una cantidad equivalente de anticuerpo monoclonal anti-DR5 monoespecífico, bivalente o un fragmento del mismo, donde está el anticuerpo, o comprende las mismas regiones de VH y VL que los anticuerpos proporcionados en las Tablas 2 y 3, por ejemplo, Conatumumab (Amgen), Drozitumab (Genentech) o Lexatumumab (HGS/GlaxoSmithKline).

Polinucleótidos, vectores y células huésped

La descripción proporciona además un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido aislado, recombinante y/o de origen no natural que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un subconjunto polipeptídico de una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención. Por "subconjunto polipeptídico" se entiende una porción de una molécula de unión, un conjunto de unión o un dominio de unión que puede traducirse independientemente. Los ejemplos incluyen, entre otros, un anticuerpo VH, un anticuerpo VL, un Fv de cadena simple, una cadena pesada de anticuerpo, una cadena ligera de anticuerpo, una región constante de cadena pesada de anticuerpo, una región constante de cadena ligera de anticuerpo y/o cualquier fragmento de la misma.

La descripción proporciona además una composición que comprende dos o más polinucleótidos, donde los dos o más polinucleótidos colectivamente pueden codificar una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se describió anteriormente. En ciertos aspectos, la composición puede incluir un polinucleótido que codifica una cadena pesada de IgA o IgM o un fragmento de la misma, por ejemplo, una cadena pesada de IgA o IgM humana como se describió anteriormente, donde la cadena pesada de IgA o IgM comprende al menos la VH de un dominio de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF, y un polinucleótido que codifica una cadena ligera o fragmento de la misma, por ejemplo, una cadena ligera kappa o lambda humana que comprende al menos la VL de un dominio de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF. Una composición de polinucleótidos, como se proporciona, puede incluir además un polinucleótido que codifica una cadena J, por ejemplo, una cadena J humana, un fragmento de la misma o una variante de la misma. En ciertos aspectos, los polinucleótidos que forman una composición como se proporciona en esta invención pueden situarse en dos o tres vectores separados, por ejemplo, vectores de expresión. Dicho vector es proporcionado por la descripción. En ciertos aspectos, dos o más de los polinucleótidos que forman una composición, como se proporciona en esta invención, pueden situarse en un único vector, por ejemplo, un vector de expresión. Dicho vector es proporcionado por la descripción.

La descripción proporciona además una célula huésped, por ejemplo, una célula huésped procariota o eucariota, que comprende un polinucleótido o dos o más polinucleótidos que codifican una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención, o cualquier subconjunto de la misma, una composición de polinucleótidos como se proporciona en esta invención, o un vector o dos, tres o más vectores que codifican colectivamente una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica. como se proporciona en esta invención, o cualquier subconjunto de la misma. En ciertos aspectos, una célula huésped proporcionada por la descripción puede expresar una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta descripción, o un subconjunto de la misma.

En un aspecto relacionado, la descripción proporciona un procedimiento para producir una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta descripción, donde el procedimiento comprende cultivar una célula huésped como se describió anteriormente y recuperar la molécula de unión.

Procedimientos de uso

Esta descripción proporciona procedimientos mejorados para desencadenar la apoptosis de las células que expresan proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, por ejemplo, células malignas o inmortalizadas, usando una molécula de unión a proteínas diméricas, pentaméricas o hexaméricas receptoras de la superfamilia del TNF basadas en IgA o IgM según lo dispuesto en esta invención. Los procedimientos descritos a continuación pueden utilizar moléculas de unión que comprenden dominios de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF derivados de cualquier anticuerpo anti-proteína receptora de la superfamilia anti-TNF existente, incluyendo, entre otros, los anticuerpos proporcionados en las Tablas 2 y 3, variantes, derivados o análogos de los mismos, donde la molécula de unión a la proteína dimérica, pentamérica o hexamérica receptora de la superfamilia del TNF puede proporcionar células de expresión de la proteína receptora de la superfamilia del TNF de muerte celular mediada por apoptosis mejorada en comparación con un anticuerpo, fragmento, variante, derivado o análogo bivalente equivalente. En base a esta descripción, la construcción de una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF basada en IgA o IgM dimérica, pentamérica o hexamérica está comprendida dentro de las capacidades de una persona con habilidad ordinaria en la técnica. La actividad mejorada puede, por ejemplo, permitir que se use una dosis reducida, o puede dar como resultado una muerte más efectiva de las células que son resistentes a la muerte por el anticuerpo original. Por "resistente" se entiende cualquier grado de actividad reducida de un anticuerpo anti-proteína receptora de la superfamilia del TNF en la célula que expresa la proteína receptora de la superfamilia del TNF.

En ciertos aspectos, esta descripción proporciona un procedimiento para desencadenar la apoptosis, la morfogénesis o la proliferación en células que expresan proteínas receptoras de la superfamilia del TNF, donde el procedimiento incluye poner en contacto una célula que expresa proteínas receptoras de la superfamilia del TNF con una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se describe en esta invención, donde la molécula de unión desencadena la apoptosis, la morfogénesis o la proliferación de una célula que expresa la proteína receptora de la superfamilia del TNF a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 monoespecífico, bivalente o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de la proteína receptora de la superfamilia del TNF como el dominio de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF.

En incluso otro aspecto, una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF como se proporciona en esta invención puede facilitar el tratamiento del cáncer, por ejemplo, ralentizando el crecimiento tumoral, deteniendo el crecimiento tumoral o reduciendo el tamaño de los tumores existentes, cuando se administra como una dosis efectiva a un sujeto que necesita el tratamiento contra el cáncer. La descripción proporciona un procedimiento para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento una dosis efectiva de una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF como se proporciona en esta invención, por ejemplo, una molécula de unión a DR5, como se proporciona en esta invención.

En ciertos aspectos, la célula que expresa la proteína receptora de la superfamilia del TNF es una línea celular inmortalizada, es decir, una célula cancerosa. Las expresiones "cáncer", "tumor", "canceroso" y "maligno" hacen referencia o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen, entre otros, adenocarcinomas, linfomas, blastomas, melanomas, sarcomas y leucemias. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, cáncer de páncreas, glioblastoma, glioma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama (incluyendo el cáncer de mama mediado por hormonas, véase, por ejemplo, Innes y col. (2006) Br. J. cáncer 94:1057-1065), cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, mieloma (como mieloma múltiple), carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, como carcinoma de células renales y tumores de Wilms, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer de esófago, varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, incluyendo, entre otros, cánceres de células escamosas y cánceres de origen mucinoso, como cáncer de ovario mucinoso, colangiocarcinoma (hígado) y carcinoma papilar renal. La distribución mucosa, por ejemplo, como se proporciona según una molécula de unión basada en IgA, como se proporciona en esta invención, podría ser beneficiosa para ciertos cánceres, por ejemplo, cáncer de pulmón, ovárico, colorrectal o carcinoma de células escamosas.

Esta descripción proporciona además un procedimiento para prevenir o tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, lo que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, una composición o formulación que comprende la molécula de unión, o un polinucleótido, un vector o una célula huésped, como se describe en esta invención.

Las dosis efectivas de las composiciones para el tratamiento del cáncer varían dependiendo de muchos factores diferentes, como los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En ciertos aspectos, los procedimientos de tratamiento proporcionados en esta invención pueden proporcionar una mayor seguridad, ya que la composición exhibe una mayor citotoxicidad (por ejemplo, induce apoptosis en mayor medida) en células cancerosas que en células no cancerosas, por ejemplo, hepatocitos humanos normales. Por lo general, el paciente es un ser humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos, incluyendo los mamíferos transgénicos. Las dosis de tratamiento pueden ajustarse usando procedimientos de rutina conocidos por los expertos en la materia para optimizar la seguridad y la eficacia.

Las composiciones de la descripción pueden administrarse mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, por vía parenteral, intraventricular, oral, mediante pulverización por inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El término "parenteral", como se usa en esta invención, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal.

El sujeto a tratar puede ser cualquier animal, por ejemplo, un mamífero, que necesite tratamiento, en ciertos aspectos, el sujeto es un sujeto humano.

En su forma más simple, una preparación para administrar a un sujeto es una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, administrada en forma de dosificación convencional, que se puede combinar con un excipiente vehículo o diluyente farmacéutico, como se describe en otra parte de esta invención.

Una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF como se proporciona en esta invención o un fragmento de unión al antígeno de la misma puede administrarse mediante cualquier procedimiento adecuado. como se describe en otro lugar de esta invención, por ejemplo, mediante infusión IV. En ciertos aspectos, una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF, como se proporciona en esta invención, o un fragmento de unión al antígeno de la misma, puede introducirse en un tumor o en las proximidades de una célula tumoral.

Todos los tipos de tumores son potencialmente susceptibles de tratamiento mediante esta estrategia, incluyendo, entre otros, el carcinoma de mama, pulmón, páncreas, ovario, riñón, colon y vejiga, así como melanomas, sarcomas y linfomas. La distribución mucosa puede ser beneficiosa para ciertos cánceres, por ejemplo, cáncer de pulmón, ovárico, colorrectal o carcinoma de células escamosas.

Una molécula dimérica, pentamérica o hexamérica para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención es una molécula de unión con dos, cinco o seis "conjuntos de unión", como se define en esta invención, que pueden unirse específicamente a una proteína receptora de la superfamilia del TNF, por ejemplo, un DR5 humano. En ciertos aspectos, una molécula dimérica, pentamérica o hexamérica para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención comprende dos, cinco o seis conjuntos de unión bivalentes, respectivamente, donde cada conjunto de unión incluye dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o IgM o fragmentos de la misma. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o IgM son regiones constantes de cadena pesada humanas.

Cuando la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención es una molécula de unión dimérica basada en IgA, la molécula de unión puede comprender además una cadena J, un fragmento de la misma o una variante de la misma, y puede comprender además un componente secretor, un fragmento del mismo o una variante del mismo.

Donde la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención es una molécula de unión basada en IgM pentamérica, la molécula de unión puede comprender además una cadena J, o un fragmento o variante de la misma.

Una región constante de cadena pesada de IgA de una molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención puede incluir uno o más de un dominio Cal, un dominio Ca2 y/o un dominio Ca3, siempre y cuando la región constante pueda cumplir una función deseada en la molécula de unión, por ejemplo, asociarse a una región constante de cadena ligera, a fin de facilitar la formación de un dominio de unión, o asociarse a otro conjunto de unión para formar un dímero. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o sus fragmentos dentro de un conjunto de unión individual comprenden cada uno un dominio Ca3 o un fragmento del mismo, una pieza de cola (TP) o un fragmento de la misma, o cualquier combinación de un dominio Ca3 y una TP o un fragmento de los mimos. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o sus fragmentos dentro de un conjunto de unión individual comprenden cada uno un dominio Ca2 o un fragmento del mismo, un dominio Cal o un fragmento del mismo, o un dominio Cal o fragmento del mismo y un dominio Ca2 o un fragmento del mismo.

Una región constante de cadena pesada de IgM de una molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención puede incluir uno o más de un dominio C ^|j 1, un dominio C ^|j 2, un dominio C ^|j 3 y/o un dominio C^ji4, siempre y cuando la región constante pueda cumplir una función deseada en la molécula de unión, por ejemplo, asociarse a una región constante de cadena ligera, a fin de facilitar la formación de un dominio de unión, o asociarse a otros conjuntos de unión para formar un hexámero o pentámero. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgM o sus fragmentos dentro de un conjunto de unión individual comprenden cada uno un dominio C^ji3 o un fragmento del mismo, un dominio C^ji4 o un fragmento del mismo, una pieza de cola (TP) o un fragmento de la misma, o cualquier combinación de un dominio Cji3 y un dominio Cji4, y una TP o un fragmento de los mismos. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgM o sus fragmentos dentro de un conjunto de unión individual comprenden cada uno un dominio Cji2 o un fragmento del mismo, un dominio Cji1 o un fragmento del mismo, o un dominio Cji1 o fragmento del mismo y un dominio Cji2 o un fragmento del mismo. Si bien una persona con conocimientos ordinarios en la materia basados en esta descripción puede contemplar una variedad de diferentes moléculas de unión diméricas, pentaméricas y hexaméricas para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención, y, como tales, las mismas se incluyen en esta descripción, en ciertos aspectos, se proporciona una molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención, donde cada conjunto de unión comprende dos cadenas pesadas de IgA o IgM que comprenden cada una un extremo amino situado en VH para la región constante de IgA o IgM o un fragmento de la misma, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden cada una un extremo amino situado en VL para una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina.

Además, en ciertos aspectos, al menos un conjunto de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención, comprende o comprende dos de los dominios de unión de proteínas receptoras de la superfamilia del TNF como se describió anteriormente. En ciertos aspectos, los dos dominios de unión a proteínas receptoras de la superfamilia del TNF en el al menos un conjunto de unión de la molécula de unión, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención pueden ser diferentes entre sí, o pueden ser idénticos.

En ciertos aspectos, las dos cadenas pesadas de IgA o IgM dentro del al menos un conjunto de unión de la molécula de unión, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención son idénticas.

En ciertos aspectos, las dos cadenas ligeras dentro del al menos un conjunto de unión de la molécula de unión, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención son idénticas. En ciertos aspectos, dos cadenas ligeras idénticas dentro de al menos un conjunto de unión o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis conjuntos de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención son cadenas ligeras kappa, por ejemplo, cadenas ligeras kappa humanas o cadenas ligeras lambda, por ejemplo, cadenas ligeras lambda humanas.

La molécula de unión al receptor del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención puede poseer propiedades estructurales o funcionales ventajosas en comparación con otras moléculas de unión. Por ejemplo, una molécula de unión al receptor del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención puede poseer una actividad mejorada en un ensayo biológico, in vitro o in vivo, en comparación con una molécula de unión correspondiente, por ejemplo, Lexatumumab o una variante, análogo o derivado del mismo. Los ensayos biológicos incluyen, entre otros, ELISA o ensayos de caspasa de transferencia Western, y el análisis de FACS usando tinciones indicativas de muerte celular apoptótica, como anexina-v.

Composiciones farmacéuticas y procedimientos de administración

Los procedimientos de preparación y administración de una molécula de unión al receptor del TNF, de tipo dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, a un sujeto que lo necesita son bien conocidos o fácilmente determinados por los expertos en la materia a la vista de esta descripción. La vía de administración de una molécula de unión al receptor del TNF puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral, tal como se usa en esta invención, incluye, por ejemplo, la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Aunque todas estas formas de administración se contemplan como formas adecuadas, otro ejemplo de una forma de administración sería una solución para inyección, en particular, para una inyección intravenosa o intraarterial, o goteo. Una composición farmacéutica adecuada puede comprender un amortiguador (porejemplo, un amortiguador de acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (porejemplo, polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (por ejemplo, albúmina humana), etc.

Como se analiza en esta invención, una molécula de unión al receptor del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención puede administrarse en una cantidad farmacéuticamente efectiva para el tratamiento in vivo de cánceres que expresan proteínas receptoras de la superfamilia del TNF. A este respecto, se apreciará que las moléculas de unión descritas pueden formularse para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. Las composiciones farmacéuticas según la presente descripción comprenden un vehícuo estéril, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, como solución salina fisiológica, amortiguadores no tóxicos, conservantes y similares. Una cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula de unión al receptor del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, significa una cantidad suficiente para lograr la unión efectiva a un objetivo y lograr un beneficio terapéutico. Las formulaciones adecuadas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16ta ed. (1980).

Determinadas composiciones farmacéuticas, como se describen en esta invención, se pueden administrar oralmente en una forma de dosificación aceptable que incluye, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, suspensiones acuosas o soluciones. Las composiciones farmacéuticas también se pueden administrar mediante aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones se pueden preparar como soluciones en solución salina, usando alcohol bencílico u otros conservantes, promotores de absorción para potenciar la biodisponibilidad y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales adecuados.

La cantidad de una molécula de unión a proteínas receptoras de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica que puede combinarse con materiales portadores para producir una forma de dosificación única variará dependiendo, por ejemplo, del sujeto tratado y el modo particular de administración. La composición puede administrarse como una dosis única, dosis múltiples o durante un período de tiempo establecido en una infusión. Los regímenes de dosificación también se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica).

Según el alcance de la presente descripción, una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede administrarse a un sujeto que necesita terapia en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede administrarse al sujeto en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y convencional, según técnicas conocidas. La forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable pueden ser dictados por la cantidad de ingrediente activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas.

Por "dosis o cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" se entiende una cantidad de una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica, que, cuando se administra, produce una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con cáncer que expresa la proteína receptora de la superfamilia del TNF.

Las dosis terapéuticamente efectivas de las composiciones descritas en esta invención para el tratamiento del cáncer pueden variar dependiendo de muchos factores diferentes, como los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En ciertos aspectos, el sujeto o paciente es un ser humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos, incluyendo los mamíferos transgénicos. Las dosis de tratamiento pueden ajustarse usando procedimientos de rutina conocidos por los expertos en la materia para optimizar la seguridad y la eficacia.

La cantidad de una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica que se va a administrar será fácilmente determinada por una persona con conocimiento ordinario en la materia sin experimentación indebida dada esta descripción. Los factores que influyen en el modo de administración y la cantidad respectiva de una molécula de unión a la proteína receptora de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad, el historial de la enfermedad y la edad, altura, peso, salud y condición física del individuo sometido a la terapia. De manera similar, la cantidad de una molécula de unión al receptor del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica a administrar dependerá del modo de administración y de si el sujeto se someterá a una dosis única o a dosis múltiples de este agente.

Esta descripción también proporciona el uso de una molécula de unión a proteínas receptoras de la superfamilia del TNF dimérica, pentamérica o hexamérica en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o controlar el cáncer, donde el cáncer expresa proteínas receptoras de la superfamilia del TNF.

La puesta en práctica de la descripción usará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran dentro de la especialización en la materia. Dichas técnicas se explican de manera completa en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2da ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook y col., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DⁿA Cloning, Volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis y col. Pat. de los EE.UU. No. 4.683.195; Hames y Higgins, ed. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, ed. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos ed. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu y col., ed., Methods In Enzymology, Vol. 154 y 155; Mayer y Walker, ed. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir y Blackwell, ed., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); y en Ausubel y col. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

Los principios generales de la ingeniería de anticuerpos se exponen en Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2da ed.; Oxford Univ. Press). Los principios generales de la ingeniería de proteínas se exponen en Rickwood y col., ed. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press en Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Los principios generales de la unión de anticuerpos y haptenos de anticuerpos se exponen en: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2da ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); y Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman y Hall, Nueva York, N.Y.). Además, los procedimientos estándares en inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente se pueden seguir como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites y col., ed. (1994) Basic and Clinical Immunology (8va ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) y Mishell y Shiigi (ed.) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

Los trabajos de referencia estándar que establecen principios generales de inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett y col., ed. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden y col., (Elsevier, Amsterdam); Goldsby y col., ed. (2000) Kuby Immunology (4ta ed.; H. Freemand & Co.); Roitt y col. (2001) Immunology (6ta ed.; Londres: Mosby); Abbas y col. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5ta ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann y Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall, 2003); Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach y Dveksler (2003) Pc R Primer (Cold Spring Harbor Press).

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo y no limitativo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Perfil de expresión DR5

La expresión de superficie celular de DR5 se cuantificó mediante análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Brevemente, el amortiguador de tinción FACS (BD Pharmigen, Catálogo No. 554656) se usó para las etapas de tinción y lavado. Las células tumorales (1x105-5x105) se tiñeron con 0,25 |jg de DR5-PE antihumano (eBioscience, Catálogo No. 12-9908-42) o control de isotipo-PE (eBioscience, Catálogo No. 12-4714-42) durante 15 minutos a 4°C, a resguardo de la luz. Las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en un amortiguador de tinción FACS y los resultados se obtuvieron por citometría de flujo. La Figura lA muestra el cambio máximo con el anticuerpo DR5 anti-humano (panel inferior) en oposición al control de isotipo (panel superior). La Figura IB muestra que la expresión de DR5 varía según la línea celular, con las células 293F que expresan la mayor cantidad de DR5 entre este conjunto de líneas celulares.

Ejemplo 2: Especificidad de mAb anti-DR5

ELISA de especificidad

El propósito de este ensayo es demostrar la unión de mAb anti-DR5 a DR5, pero no a DR4 ni a los receptores señuelo DcR1 y DcR2. La proteína soluble DR5, DR4, DcR1 o DcR2 (R&D Systems, Catálogo No. 631-T2-100/CF, 347-DR100/CF, 630-TR-100/CF, 633-TR-100 respectivamente) se revistieron en una placa ELISA a 2 pg/mL en 100 mM de NaHCO3, con un pH 9,5, durante la noche, a 4°C. Una solución de 2% de ^bS^aen PBS se usó para las etapas de bloqueo e incubación de anticuerpos. La placa se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente, a continuación, se incubó con mAb DR5 anti-humano de ratón (Acris Antibodies, Catálogo No. AM31206AF-N) durante 1 hora a temperatura ambiente. El mAb anti-DR5 se diluyó en serie 3 veces en concentraciones que varían de 1 a 200 ng/mL. Después de lavar 3 veces con PBS más Tween-20 al 0,05%, la placa se incubó con kappa-HRP de rata anti-ratón (Southern Biotech, Catálogo No. 1180-05) durante 1 hora a temperatura ambiente, a resguardo de la luz. Después de lavar 3 veces con PBS más Tween-20 al 0,05%, la placa se incubó con sustrato TMB (BD Biosciences, Catálogo No.

555214) durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con H²SO⁴1 M y se determinó la absorbancia a 450 nm usando un lector de placa de microvaloración. La Figura 2 muestra que el mAb DR5 anti humano de ratón se unió a DR5, pero no a DR4, ni a DcR1 ni a DcR2.

Para los ELISA de mAb anti-DR5 humano, se usó 1:2000 Lambda-HRP anti-humano de ratón (Southern Biotech, No.9180-05) o 1:6000 Kappa-HRP anti-humano de ratón (Southern Biotech, Catálogo No. 9230-05), Catálogo para la detección.

Unión de células

Este ejemplo se usó para confirmar la unión de mAb anti-DR5 a las células. Para las etapas de tinción y lavado, se usó un amortiguador de tinción FACS (BD Pharmigen, Catálogo No. 554656). Las células Colo205 (2x105 células del, Catálogo ATCC No. CCL-222) se tiñeron con 10 pg/mL de mAb DR5 anti-humano de ratón (Acris Antibodies, Catálogo No. AM31206AF-N) o un control de isotipo (Invivogen, Catálogo No. hcd20-mab9) durante 15 minutos a 4°C, a resguardo de la luz. Las células se lavaron dos veces, a continuación, se tiñeron con IgG-APC de cabra anti-ratón (Jackson ImmunoResearch, Catálogo No. 115-136-071) a una dilución final de 1:200 durante 15 minutos a 4°C, a resguardo de la luz. Las células se lavaron dos veces, a continuación, se resuspendieron en un amortiguador de tinción FACS y los resultados se obtuvieron por citometría de flujo. Los resultados se proporcionan en la Figura 3, donde el panel inferior muestra el cambio máximo observado para el mAb anti-DR5.

Para la detección, se usó: para la unión del mAb anti-DR5 humano, la IgG Fc-Alexa 647 de cabra anti-humana (Southern Biotech, Catálogo No. 2014-31) o la IgM-Alexa 647 anti-humana de conejo (Abcam, Catálogo No. ab 150191).

Ejemplo 3: Actividad funcional de mAb anti-DR5 y ensayo de citotoxicidad

Este ejemplo demuestra que se requiere una reticulación para lograr la citotoxicidad de mAb DR5. Se sembraron las células Colo205 (Catálogo ATCC No. CCL-222), en 1x104 células por pocillo, en una placa de 96 pocillos y se dejaron unir durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con mAb DR5 anti-humano de ratón diluido en serie (Acris Antibodies, Catálogo No. AM31206AF-N, R&D Systems, Catálogo No. MAB631, BioLegend, Catálogo No.

307402 o Acris Antibodies, Catálogo No. AM31205AF-N) y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Lectura colorimétrica: tres horas antes de la cosecha, se añadió reactivo de viabilidad celular CCK-8 (Dojindo CK04-13) al 10 por ciento del volumen de reacción total y la placa se incubó a 37°C durante las 3 horas restantes. La absorbancia a 450 nm se evaluó en un lector de placas. Los resultados se muestran en la Figura 4(círculos abiertos), que muestran poca o ninguna citotoxicidad en ausencia de un reticulante.

El ensayo, a continuación, se efectuó como se indicó antes, solo que después de la preincubación de las células con mAb d R5 anti-humano de ratón diluido en serie durante 20 minutos a temperatura ambiente, se añadió un agente reticulante de IgG1 Fc antiratón de cabra (Jackson ImmunoResearch, Catálogo No. 115-005-205) en 3 veces a la concentración en la dosis más alta de mAb anti-DR5. Los resultados se proporcionan en la Figura 4 (círculos cerrados), que muestran el 100% de citotoxicidad con el reticulante.

Para la citotoxicidad inducida por el mAb anti-DR5 humano, se usó IgG Fc anti-humana (Biolegend, Catálogo No.

409302) como el agente reticulante. Alternativamente, la IgG anti-humana de cabra más IgM (H+L) Fab2 (Jackson ImmunoResearch, Catálogo No. 109-006-127) se puede usar como reticulante.

Lectura luminiscente: al momento de la cosecha, se agregó el reactivo de viabilidad Cell Titer Glo (Promega G7572) a un volumen igual al del medio en el pocillo. Las células se lisaron durante 10 minutos y la luminiscencia se leyó en un lector de placas.

Ejemplo 4: Ensayos de apoptosis

La apoptosis inducida por anti-DR5 en presencia o ausencia de un reticulante se midió usando los siguientes procedimientos. Las células Colo205 (1x105 células de ATCC, Catálogo No. CCL-222) se trataron con 5 pg/mL de mAb DR5 anti-humano de ratón (Acris Antibodies, Catálogo No. AM31206AF-N o R&D Systems, Catálogo No. MAB631) o un control de isótopo (Invivogen Catálogo No. hcd20-mab9) durante hasta 4 horas a 37°C. Las células se lavaron dos veces con PBS frío, a continuación, se tiñeron con Anexina V-PE y 7-AAD (1 pL cada una por muestra) en el amortiguador de unión suministrado (BD Pharmigen, Catálogo No. 559763) durante 15 minutos a 4°C, al resguardo de la luz. La anexina V y la 7-AAD se usaron para medir las células apoptóticas (eje x) y las células muertas (eje y), respectivamente, usando una citometría de flujo. Los resultados con células no tratadas se muestran en el panel más a la izquierda de la Figura 5 (sin tratar), y los resultados que usan mAb DR5 anti-humano en ausencia de un reticulante se muestran en el segundo panel de la izquierda en la Figura 5 (solo IgG anti-DR5). Se observó poco o ningún cambio en el patrón.

El ensayo, a continuación, se efectuó como se indicó antes, solo que después de la preincubación de las células con mAb d R5 anti-humano de ratón diluido en serie durante 20 minutos a temperatura ambiente, se añadió un agente reticulante de IgG1 Fc antiratón de cabra (Jackson ImmunoResearch, Catálogo No. 115-005-205) en 3 veces en la concentración aumentada sobre la dosis más alta de mAb anti-DR5. El tercer panel de la izquierda en la Figura 5 muestra los resultados del reticulante solamente (sin apoptosis). El panel más a la derecha de la Figura 5muestra células teñidas con anexina V significativas, lo que indica que la apoptosis se produjo en presencia del reticulante (IgG anti-DR5 reticulante).

Para la apoptosis inducida por el mAb anti-DR5 humano, se usó IgG Fc anti-humana (Biolegend, Catálogo No.409302) como el agente reticulante. Alternativamente, la IgG anti-humana de cabra más IgM (H+L) Fab2 (Jackson ImmunoResearch, Catálogo No. 109-006-127) se puede usar como reticulante.

Ejemplo 5: Ensayo de activación de caspasa

Este ejemplo muestra la apoptosis inducida por anti-DR5 demostrada por la activación de caspasa. Se sembraron las células Colo205 (Catálogo ATCC No. CCL-222), con 1x104 células por pocillo, en una placa de 96 pocillos y se dejaron unir durante la noche. Al día siguiente, las células fueron tratadas con 5 pg/mL mAb DR5 anti-humano de ratón (Acris Antibodies, Catálogo No.AM31206AF-N o R&D Systems, Catálogo No. MAB631) durante hasta 24 horas a 37°C. En el momento de la cosecha, el reactivo de 3/7 de caspasa (Promega, Catálogo No. G8090) se añadió a un volumen igual al total de medios en cada pocillo. La reacción se incubó con agitación, durante 30 minutos a temperatura ambiente y la luminiscencia se evaluó en un lector de placas. En ausencia de reticulación, se observó poca o ninguna actividad de caspasa (Figura 6, barras de trama cruzada).

El ensayo, a continuación, se efectuó como se indicó antes, solo que después de la preincubación de las células con mAb d R5 anti-humano de ratón diluido en serie durante 20 minutos a temperatura ambiente, se añadió un agente reticulante de IgG1 Fc antiratón de cabra (Jackson ImmunoResearch, Catálogo No. 115-005-205) en 3 veces sobre la concentración de mAb anti-DR5. Los resultados se muestran como barras sólidas en la Figura 6. En presencia de reticulación, se observó una actividad de caspasa significativa.

Para la activación de caspasa inducida por el mAb anti-DR5 humano, se usó IgG Fc anti-humana (Biolegend, Catálogo No. 409302) como el agente reticulante. Alternativamente, la IgG anti-humana de cabra más IgM (H+L) Fab2 (Jackson ImmunoResearch, Catálogo No. 109-006-127) se puede usar como reticulante.

Ejemplo 6: Los anticuerpos multiméricos anti-DR5 tienen una actividad superior

Este ejemplo muestra la actividad superior in vitro de los anticuerpos multiméricos anti-DR5. La Figura 7A es una fotografía de una SDS-PAGE no reductora que muestra un mAb anti-DR5 que es predominantemente multimérico (carril 1, clon R& D Systems 71903), el carril 2 corresponde al clon BioLegend DJR2-4, el carril 3 corresponde al clon Acris Antibodies B-K29 y el carril 4 corresponde al clon Acris Antibodies B-D37.

Actividad funcional de mAb anti-DR5 y ensayo de citotoxicidad

Usando procedimientos similares a los del Ejemplo 3, se muestra que solo el mAb Anti-DR5 multimérico provoca la citotoxicidad de Colo205 en ausencia de un reticulante. (Véase la Figura 7B; clon R&D Systems 71903, cuadrados rellenos; clon BioLegend DJR2-4, círculos abiertos, línea discontinua; clon Acris Antibodies B-K29, diamantes rellenos; clon Acris Antibodies B-D37, triángulos abiertos, línea discontinua).

Ensayos de apoptosis

Usando procedimientos similares a los del Ejemplo 4, se muestra que, en ausencia de un reticulante, el mAb anti-DR5 multimérico induce apoptosis en las células Colo205 con el tiempo, pero no así el mAb anti-DR5 monomérico o el control de isotipo. ((Véase la Figura 7C; se muestran los puntos de tiempo para 1, 2 y 4 horas).

Ensayo de activación de caspasa

Usando procedimientos similares a los proporcionados en el Ejemplo 5, se muestra que, en ausencia de reticulante, el mAb anti-DR5 multimérico, pero no monomérico, induce la activación de caspasa en células Colo205. (Véase la Figura 7D).

Ejemplo 7: Construcción de un anticuerpo Anti-DR5 de IgM

Generación de construcciones de ADN

Las secuencias de VH y VL según la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 (mAb anti-DR5 No. 1), las secuencias de VH y VL según la SEQ ID nO; 5 y la SEQ ID NO: 6 (mAb anti-DR5 No. 2), las secuencias deVH y VL según la SEQ ID NO; 84 y la SEQ ID NO: 85 (mAb anti-DR5 No. 3) y las secuencias de VH y VL según la SEQ ID NO; 88 y la SEQ ID NO: 89 (mAb anti-DR5 No. 4) se insertaron en los vectores de IgG e IgM propiedad de Aragen Biosciences y Lake Pharma mediante procedimientos de clonación estándar.

Transfección

Las células de mamífero se cotransfectan con proporciones molares iguales de diferentes vectores de expresión mediante procedimientos estándares.

Purificación de IgG anti-DR5 humana

La IgG humana anti-DR5 se purifica usando la matriz de afinidad MabSelectSuRe (GE Life Sciences, Catálogo No.17-5438-01) según la recomendación del fabricante

Purificación de IgM anti-DR5 humana.

La IgM anti-DR5 humana con o sin cadena J se purifica usando la matriz de afinidad de IgM Capture Select (BAC, Thermo Fisher, Catálogo No. 2890.05) según la recomendación del fabricante.

Ejemplos 8: El mAb anti-DR5 IgM No. 2 es específico para DR5

Una versión de IgG y una versión de IgM-cadena J pentamérica de mAb anti-DR5 No. 2 se probaron en términos de especificidad de unión mediante ELISA, como se describe en el Ejemplo 2. Como se muestra en la Figura 8A (IgG) y la Figura 8B (IgM), los anticuerpos se unieron al DR5 humano pero no al DR4 humano ni a ninguno de los receptores señuelo DcR1 o DcR2.

Las versiones de IgG e IgM de MAb anti-DR5 No. 1 se probaron en términos de la unión a la célula diana Colo205 mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Figura 9.

Ejemplo 9: Los mAb IgM Anti-DR5 son más citotóxicos que las versiones de IgG correspondientes

Las versiones de IgG y las versiones de IgM-cadena J pentaméricas de MAb Anti-DR5 No. 1, 2, 3, y 4 se probaron para determinar la citotoxicidad en células Colo205 usando el ensayo de bioluminiscencia descrito en el Ejemplo 3. Como se muestra en la Figura 10A-D, las IgM anti-DR5 son más citotóxicas que las contrapartes de IgG. En la Figura 10E, la versión de IgM Mab anti-DR5 No. 1 se comparó con la versión de IgG correspondiente con y sin un reticulante. Incluso con el reticulante, la versión de IgM resultó más citotóxica.

Ensayo de hepatotoxicidad

Además, los superagonistas de IgM MAb DR5 son más citotóxicos en las células tumorales Colo205 que en los hepatocitos humanos primarios. Los ensayos de citotoxicidad de Colo205 se llevaron a cabo usando el ensayo de bioluminiscencia descrito en el Ejemplo 3. Alrededor de 3,5x104 hepatocitos humanos primarios (Bioreclamation, Catálogo No. X008001-P) se sembraron en una placa de 96 pocillos recubierta con colágeno y se dejaron unir durante la noche. Al día siguiente, las células Colo205 y los hepatocitos se trataron con mAb Anti-DR5 IgM No. 1 y No. 4 diluidos en serie y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Al momento de la cosecha, se agregó el reactivo de viabilidad Cell Titer Glo (Promega G7572) a un volumen igual al del medio en el pocillo. Las células se lisaron durante 10 minutos y la luminiscencia se leyó en un lector de placas. Como se muestra en la Figura 11A-D, la citotoxicidad de los cuatro mAb anti-DR5 IgM fue consistentemente mayor en las células tumorales Colo205 (círculos cerrados) que en los hepatocitos humanos primarios (círculos abiertos).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo IgM pentamérico aislado que comprende cinco conjuntos de unión bivalentes idénticos y una cadena J o un fragmento o variante de una cadena J,

donde cada conjunto de unión comprende dos regiones constantes de cadena pesada de IgM, cada una asociada a un dominio de unión al antígeno,

donde las regiones constantes de cadena pesada de IgM comprenden cada una un dominio C ^|j 1, un dominio C ^|j 2, un dominio C^j3 y un dominio Cj4-tp;

donde al menos tres de los dominios de unión al antígeno del anticuerpo se unen específica y agonísticamente a una proteína receptora de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF);

donde el anticuerpo puede reticular al menos tres proteínas receptoras de la superfamilia del TNF idénticas expresadas en la superficie de una célula, activando así la transducción de señal en la célula; y

donde el anticuerpo puede activar la transducción de señal mediada por el receptor de la superfamilia del TNF en una célula que expresa la superfamilia del receptor del TNF a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente que tiene los mismos dominios de unión al antígeno, que también agoniza y se une específicamente a la misma proteína receptora de la superfamilia del TNF.

2. Un anticuerpo IgM aislado que comprende seis conjuntos de unión bivalentes idénticos,

donde las regiones constantes de cadena pesada de IgM comprenden cada una un dominio Cj 1, un dominio Cj2, un dominio Cj 3 y un dominio Cj4-tp;

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde la activación de la transducción de señal puede desencadenar apoptosis, proliferación y/o morfogénesis en la célula en la que se expresa la proteína receptora. 4. El anticuerpo de la reivindicación 3,

(a) donde una transducción de señal puede desencadenar la apoptosis, y donde la proteína receptora de la superfamilia del TNF es TNFR1 (DR1), TNFR2, TNFR1/2, CD40 (p50), Fas (CD95, Apol, DR2), CD30,

4-1BB (CD137, ILA), TRAILR1 (DR4, Apo2), TRAILR2 (DR5), TRAILR3 (DcR1), TRAILR4 (DcR2), OPG (OCIF), TWEAKR (FN14), LI^gH^tR (HVEM), DcR3, ^dR3, EDAR, X^eDAR, o una combinación de las mismas;

(b) donde la transducción de señal puede desencadenar la proliferación, y donde la proteína receptora de la superfamilia del TNF es TNFR1/2, GITR (AITR), TACI, BCMA, TWEAKR (FN14), RANK (TRANCER), CD27, CD40 (p50), OX40 (CD134), LT-pR, TNFR1 (DR1), TNFR2 o una combinación de las mismas; o

(c) donde la transducción de señal puede desencadenar la morfogénesis, y donde la proteína receptora de la superfamilia del TNF es Fas (CD95, Apol, DR2), TRAILR1 (DR4, Apo2), DR5 (TRAILR2), TRAILR3 (DcR1), TRAILR4 (DcR2), OPG (OCIF), CD40 (p50), EDAR, XEDAR, TNFR1/2 o una combinación de las mismas.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende diez o doce dominios de unión al antígeno idénticos que se unen específica y agonísticamente al mismo epítopo extracelular de un único tipo de molécula receptora de la superfamilia del TNF expresada en la superficie de la célula, activando así la transducción de señal en la célula.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez dominios de unión al antígeno que se unen específica y agonísticamente a la proteína receptora de la superfamilia del TNF expresada en la superficie de la célula, induciendo así la apoptosis de la célula.

7. El anticuerpo de la reivindicación 2, que comprende al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once o doce dominios de unión al antígeno que se unen específica y agonísticamente a la proteína receptora de la superfamilia del TNF expresada en la superficie de la célula, induciendo así la apoptosis de la célula.

8. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde los cinco o seis conjuntos de unión son humanos, están humanizados o son conjuntos de unión de inmunogloubulina quiméricos.

9. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde las regiones constantes de cadena pesada de IgM son regiones constantes de IgM humana.

10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde cada conjunto de unión comprende dos cadenas pesadas de IgM, comprendiendo cada una un extremo amino situado en VH para la región constante de IgM, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, comprendiendo cada una un extremo amino situado en VL para una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina

11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, donde la transducción de señal puede desencadenar la apoptosis, y donde la proteína receptora de la superfamilia del TNF es DR5.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, que comprende diez o doce dominios de unión al antígeno idénticos que se unen específica y agonísticamente a DR5, donde los dominios de unión al antígeno DR5 comprenden cada uno una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL),

(a) donde VH y VL comprenden seis regiones determinantes de complementariedad de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, y donde HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 comprenden las CDR de un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácido de VH y VL de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 49 y la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 55 y la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO: 82 y la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 84 y la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, o la SEQ ID NO: 88 y la SEQ ID NO: 89; respectivamente, o la secuencia de ScFv de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73; o las seis CDR con una o dos sustituciones de aminoácidos en una o más de las CDR; o

(b) donde la VH y la VL comprenden secuencias de aminoácidos idénticas en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 49 y la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 55 y la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO: 82 y la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 84 y la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, o la SEQ ID NO: 88 y la SEQ ID NO: 89, respectivamente; donde la VH y la VL comprenden secuencias de aminoácidos idénticas en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a las secuencias de aminoácidos de VH y VL contenidas dentro de la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 18, o la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20, respectivamente; o donde la VH y la VL están contenidas en un ScFv con una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73.

13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vehícuo estéril, no tóxico, farmacéuticamente aceptable.

14. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. El polinucleótido de la reivindicación 14, que codifica un primer subconjunto polipeptídico que comprende una región constante de cadena pesada de IgM y al menos una porción VH de anticuerpo del dominio de unión al antígeno del anticuerpo, y un segundo subconjunto de polipéptido que comprende una región constante de cadena ligera y una porción VL de anticuerpo del dominio de unión al antígeno del anticuerpo.

16. El polinucleótido de la reivindicación 15,

(a) donde el primer subconjunto polipeptídico comprende una región constante de IgM humana fusionada con el extremo terminal C de una VH que comprende:

(i) regiones de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden las CDR contenidas en la secuencia de aminoácidos de VH en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 53, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 84, la SEQ ID NO: 86, o la SEQ ID NO: 88, o en la secuencia de aminoácidos de ScFv de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73; o las CDR contenidas en la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 53, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 84, la SEQ ID NO: 86, o la SEQ ID NO: 88, o en la secuencia de aminoácidos de ScFv de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73 con una o dos sustituciones de aminoácidos individuales en una o más de las HCDR; o

(ii) una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39, la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 53, la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 82, la SEQ ID NO: 84, la SEQ ID NO: 86 o la SEQ ID NO: 88; la secuencia de aminoácidos de VH contenida dentro de la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 19; o la porción de VH de un ScFv con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72 o la SEQ ID NO: 73; y

(b) donde el segundo subconjunto polipeptídico comprende una región constante de cadena ligera de lambda o kappa humana fusionada con el extremo terminal C de una VL que comprende:

(i) regiones de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las CDR contenidas en la secuencia de aminoácidos de VL en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 87 o la SEQ ID NO: 89, o en la secuencia de aminoácidos de ScFv de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72 o la SEQ ID NO: 73; o las CDR contenidas en la secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 87 o la SEQ ID NO: 89, o en la secuencia de aminoácidos de ScFv de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72 o la SEQ ID NO: 73, con una o dos sustituciones de aminoácidos individuales en una o más de las LCDR; o

(ii) una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% a la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 38, la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 42, la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 50, la SEQ ID NO: 52, la SEQ ID NO: 54, la SEQ ID NO: 56, la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 85, la SEQ ID NO: 87 o la SEQ ID NO: 89; la secuencia de aminoácidos de VL contenida dentro de la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 20; o la porción de VL de un ScFv con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, la SEQ ID NO: 58, la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61, la SEQ ID NO: 62, la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64, la SEQ ID NO: 65, la SEQ ID NO: 66, la SEQ ID NO: 67, la SEQ ID NO: 68, la SEQ ID NO: 69, la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71, la SEQ ID NO: 72, o la SEQ ID NO: 73.

17. Una composición que comprende el polinucleótido de la reivindicación 16, donde la composición comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena J o un fragmento de la misma, o una variante de la misma.

18. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, o la composición de las reivindicaciones 17, donde la célula huésped puede expresar el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o un subconjunto del mismo.

19. Un procedimiento para producir el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 18 y recuperar el anticuerpo.

20. Un procedimiento in vitro para inducir la apoptosis mediada por el receptor de la superfamilia del TNF, la morfogénesis o la proliferación en una célula que expresa el receptor de la superfamilia del TNF, que comprende poner en contacto a la célula que expresa el receptor de la superfamilia del TNF con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

21. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, donde las células cancerosas en el sujeto expresan un receptor de la superfamilia del TNF con actividad apoptótica, y donde el anticuerpo puede activar la apoptosis mediada por el receptor de la superfamilia del TNF en las células cancerosas a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente que tiene los mismos dominios de unión al antígeno, que también agoniza y se une específicamente a la misma proteína receptora de la superfamilia del TNF, donde el sujeto es opcionalmente un sujeto humano.