WO2014063368A1

WO2014063368A1 - 抗人死亡受体5胞外区的人源化单克隆抗体

Info

Publication number: WO2014063368A1
Application number: PCT/CN2012/083627
Authority: WO
Inventors: 郑德先; 邱宇鹤; 刘彦信
Original assignee: 中国医学科学院基础医学研究所
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2014-05-01
Also published as: CN104245736A; US20150353638A1; CN104245736B; US9725517B2

Abstract

本发明提供了抗人死亡受体5（DR5）胞外区的人源化单克隆抗体，其包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列同一性至少为90%的轻链可变区氨基酸序列，与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列同一性至少为90%的重链可变区氨基酸序列，以及人抗体功能IgG1的恒定区。本发明还提供了所属人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列，重组真核表达载体，以及所述抗体的生产方法，其组合物以及用途。本发明所述的人源化单克隆抗体在体内外对多种肿瘤细胞具有特异性的凋亡诱导活性，可单独或与DR5的天然配体肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体或其它药物联合使用，用于多种肿瘤和与DR5高表达相关的疾病的治疗。

Description

抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体

技术领域

本发明涉及一种抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体、其编码核苷酸序列、高效表达该人源化单克隆抗体的重组真核表达载体、制备所述人源化单克隆抗体的方法、所述人源化单克隆抗体及其组合物的用途。背景技术

发现于 1995年的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,简称 TRAIL或 Apo2L或 TNFSF10),定位于 3号染色体的 3q26，属于肿瘤坏死因子（TNF) 超家族成员，是由 281个氨基酸组成的 II型跨膜糖蛋白。其 C末端在胞外，具有 TNF家族的同源性序列。 TRAIL受体 2 (简称 TRAIL-R2或死亡受体 5或 DR5 ) 广泛表达于多种肿瘤细胞表面，而不表达或较少表达于正常细胞表面，其胞外区包含其天然配体 TRAIL结合区，胞内区包含死亡结构域（death domain )。 DR5与 TRAIL或其它激动剂结合后可发生同源三聚化，其死亡结构域募集胞内相关蛋白形成死亡诱导信号复合体（death-inducing signal complex, DISC), 激发下游细胞死亡信号转导，从而特异性地诱导肿瘤细胞死亡。前期研究证明，鼠抗人 DR5的激动性单克隆抗体 AD5-10能够诱导体外培养的多种肿瘤细胞死亡，在体内高效抑制裸鼠体内人移植瘤的形成和生长，对正常组织和细胞没有毒性（Guo Y et al.， A novel anti-human DR5 monoclonal antibody with tumoricidal activity induces caspase-dependent and caspase- independent cell death. J Biol Chem 2005 ; 280(51 ) :41940-52; WO2006/017961, ZL200410070093.1 )，显示了良好的临床应用前景。但是，鼠源单克隆抗体作为异种免疫球蛋白，应用于人体可被人免疫系统识别而产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody, HAMA) 反应，削弱其治疗效果，并可能对人体器官产生损伤。因此，将鼠源单克隆抗体进行人源化改造，在保持其亲和力和特异性的基础上降低其对人体的免疫原性，是将所述鼠源抗体成功应用于人类疾病治疗的重要途径。

第一代抗体的人源化改造是将鼠源抗体的可变区和人源抗体的恒定区相连接，组成人-鼠嵌合抗体。由于嵌合抗体的可变区和恒定区在空间结构上相对独立，虽可较好地保持原鼠源抗体的亲和力，但完整的鼠源抗体可变区仍可能引起 HAMA 反应。在嵌合抗体的基础上，进一步采用互补决定区 ( complementarity-determining region, CDR)移植技术，将鼠源单抗可变区中相对保守的骨架区（frame region, FR)替换成人的 FR区，只保留与抗原结合的 CDR区，构建功能性的人源化单克隆抗体，可以最大限度地减少鼠源抗体分子的免疫原性。同时，由于 FR区不仅起到抗体分子的支持骨架作用，还涉及抗原抗体结合时正确构象的形成。因此，对人源化抗体分子 FR区中关键的氨基酸残基还要进行回复突变，以最大限度地保持鼠源抗体的亲和力和特异性。

此外，由于在人源化抗体分子中，只有重链和轻链可变区中互补决定区（CDR) 和框架区（FR) 的数个氨基酸残基来源于所免疫动物的种属，其余部分则全来自于人类的同型抗体，可以在保持鼠源单抗特异性和亲和力的基础上，最大限度地减少人抗鼠抗体反应，延长其在体内的半衰期，改善其药代动力学特性。而且，人源化抗体具有抗体依赖、的细胞毒反应 ( antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC ) 禾口补体依赖的细胞毒反应 ( complement-dependent cellular cytotoxicity, CDCC) 等人类抗体的效应功能，更有利于临床应用。

哺乳动物细胞表达系统具备完整的转录、翻译和翻译后加工与分泌机制，可以高效产生具有正确的折叠、装配、空间构象和良好生物学效应的完整抗体分子，是人源化抗体最理想的表达体系。因此，真核表达载体的构建对于提高人源化抗体的表达水平非常重要。理想的真核表达载体需要强的启动子和适当的筛选标志，既有利于基因本身的扩增，又有利于阳性细胞的筛选。

因此，本发明的技术目的在于制备抗人 DR5人源化单克隆抗体及其真核表达载体和所述人源化单克隆抗体在治疗多种肿瘤中的应用。发明内容

本发明的技术目的在于提供一种抗人 DR5的人源化单克隆抗体。

因此，本发明的第一方面涉及一种抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体，其包括与 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列同一性至少为 90%的轻链可变区氨基酸序列，与 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列同一性至少为 90%的重链可变区氨基酸序列，和人抗体的恒定区。

优选地，所述人源化单克隆抗体的重链恒定区为人抗体 IgGl的恒定区，轻链恒定区为人抗体的 κ链。

优选地，所述人源化单克隆抗体的轻链可变区 CDRL1、 CDRL2和 CDRL3的氨基酸序列分别为：

CDRL1 : RSSQSLVHSNGNTYLH ( SEQ ID NO: 3 )；

CDRL2: KVSNRFS ( SEQ ID NO: 4);

CDRL3: FQSTHVPHT ( SEQ ID NO: 5 )；禾口 /或

所述人源化单克隆抗体的重链可变区 CDRH1、CDRH2和 CDRH3的氨基酸序列分别为：

CDRH1 : DFSMN ( SEQ ID NO: 6)；

CDRH2: WINTETGEPTYADDFKG ( SEQ ID NO: 7)；

CDRH3: IDY ( SEQ ID NO: 8)。

优选地，所述人源化单克隆抗体的轻链可变区的骨架区 FRL1、 FRL2、 FRL3 和 FRL4的氨基酸序列分别为：

FRL 1： DaVMTQSPLSLPVTPGEPASISC，其中氨基酸 a代表 1或（ SEQ ID NO：

9)；

FRL2: WYLQKPGQSPQLLIY ( SEQ ID NO: 10)；

FRL3: GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbC ,其中氨基酸 b代表 Y 或 F ( SEQ ID NO: 11 )；

FRL3: FGQGTKLEIK ( SEQ ID NO: 12)；禾口 /或

所述人源化抗体的重链可变区的骨架区 FRH1、 FRH2、 FRH3和 FRH4的氨基酸序列分别为：

FRH1： cdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFT , 其中氨基酸 c代表 Q或

E，氨基酸 d代表 V或 I，氨基酸 e代表 S或 P ( SEQ ID NO: 13 )；

FRH2: WVRQ APGQGLfWMG ,其中氨基酸 f代表 E或 K ( SEQ ID NO: 14)； FRH3: RFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkR, 其中氨基酸 g代表 V或 A，氨基酸 h代表 F或 L，氨基酸 i代表 L或 M，氨基酸 j代表 Y或 F，氨基酸 k 代表 A或 V ( SEQ ID NO: 15 )；

FRH4: WGQGTTVTVSS ( SEQ ID NO: 16)。

优选地，所述人源化单克隆抗体包括与 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列同一性至少为 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%和 100%的轻链可变区氨基酸序列，和与 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列同一性至少为 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%和 100%的重链可变区氨基酸序列。优选地，所述人源化单克隆抗体的序列如 SEQ ID NO: 17所示。

优选地，所述人源化单克隆抗体选自 AD10、 AD14或 AD15, 其中 AD10的重链和轻链氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19所示， AD14的重链和轻链氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 20禾 B SEQ ID NO: 21所示， AD15的重链和轻链氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 22和 SEQ ID NO: 23所示。

本发明的第二方面涉及一种如第一方面所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列，优选地，所述编码核苷酸序列分别是在编码重链可变区、恒定区以及轻链可变区、恒定区组成的人源化单克隆抗体的重链和轻链的核苷酸序列之间加入具有自我剪切功能的 Furin/2A肽的编码序列，优选地，所述编码核苷酸序列编码的人源化单克隆抗体的重链、 Furin/2A肽和轻链的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 17所示。

本发明的第三方面涉及一种稳定表达上述第一方面所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体的重组真核表达载体，其中上述第二方面所述的人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列被有效地连接到真核表达载体中以进行表达，优选地，所述重组真核表达载体带有 CAG强启动子（ a cytomegalovirus immediate early enhancer and a chicken beta- actin promoter) 禾口二氢叶酸还原酉每 (dhfr) 蹄选标 i己，优选地，所述真核表达载体质粒为 pcDNA3。

本发明的第四方面涉及一种制备如第一方面所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：

A) 用如第三方面所述的重组真核表达载体转染 HEK293细胞；

B) 用特异性的亲和层析法对所表达的人源化单克隆抗体进行纯化。

本发明的第五方面涉及一种由活性成分为如第一方面所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体与 TRAIL或其它抗肿瘤药物组成的组合物，优选地，所述抗肿瘤药物是表柔比星（epirubicin)。

本发明的第六方面涉及一种如第一方面所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体、如第二方面所述的第一方面所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列、如第三方面所述的稳定表达第一方面所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体的重组真核表达载体或根据第五方面所述的由活性成分为如第一方面所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体与其它化疗药物组成的组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途，优选地，所述肿瘤为白血病、肝癌、结肠癌、肺癌或卵巢癌。

换言之，为了完成本发明的目的，本发明提供一种人源化单克隆抗体，其轻链和重链可变区的氨基酸序列包括与 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列至少 90% 相同的轻链可变区（VL)氨基酸序列，优选地，至少 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%和 100%相同的轻链可变区（VL)氨基酸序列，和与 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列至少 90%相同的重链可变区（VH)氨基酸序列，优选地，至少 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%和 100%相同的重链可变区（VL) 氨基酸序列。

所述人源化单克隆抗体的轻链可变区 CDRL1、 CDRL2和 CDRL3的氨基酸序列分别为：

CDRL1 (24位到 39位氨基酸）： RSSQSLVHSNGNTYLH ( SEQ ID NO: 3 )，

CDRL2 (55位到 61位氨基酸）： KVSNRFS ( SEQ ID NO: 4)，

CDRL3 (94位到 102位氨基酸）： FQSTHVPHT ( SEQ ID NO: 5 )，所述人源化单克隆抗体的重链可变区 CDRH1、CDRH2和 CDRH3的氨基酸序列分别为：

CDRH1 (31位到 35位氨基酸）： DFSMN ( SEQ ID NO: 6)，

CDRH2 (50位到 66位氨基酸）： WINTETGEPTYADDFKG ( SEQ ID NO: 7)，

CDRH3 (99位到 101位氨基酸）： IDY ( SEQ ID NO: 8)。

所述人源化单克隆抗体的轻链可变区的骨架区 FRL1、 FRL2、 FRL3和 FR4的氨基酸序列分别为：

FRL1的 1位到 23位氨基酸： DaVMTQSPLSLPVTPGEPASISC ,其中氨基酸 a 代表 I或 V ( SEQ ID NO: 9); FRL2的 40位到 54位氨基酸： WYLQKPGQSPQLLIY ( SEQ ID NO: 10)；

FRL3 的 62 位至 IJ 93 位氨基酸： GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYbC, 其中氨基酸 b代表 Y或 F ( SEQ ID NO: 11 )；

FRL3的 103位到 113位氨基酸： FGQGTKLEIK ( SEQ ID NO： 12)；禾口 /或所述人源化单克隆抗体的重链可变区的骨架区 FRH1、 FRH2、 FRH3禾 B FRH4 的氨基酸序列分别为：

FRH1的 1位到 30位氨基酸： cdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKA SGYTFT, 其中氨基酸 c代表 Q或 E，氨基酸 d代表 V或 I，氨基酸 e代表 S或 P( SEQ ID NO: 13 )；

FRH2的 36位到 54位氨基酸： WVRQAPGQGLfWMG, 其中氨基酸 f代表 E 或 K ( SEQ ID NO: 14)；

FRH3的 67位到 98位氨基酸： RFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTA VYjCkR, 其中氨基酸 g代表 V或 A，氨基酸 h代表 F或 L，氨基酸 i代表 L或 M，氨基酸 j 代表 Y或 F，氨基酸 k代表 A或 V ( SEQ ID NO: 15 )；

FRH4的 102位到 112位氨基酸： WGQGTTVTVSS ( SEQ ID NO: 16)。

本发明还提供一种抗 DR5胞外区的人源化单克隆抗体的制备方法，该人源化单克隆抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列包括 SEQ ID NO: 1的轻链可变区 (VL) 的氨基酸序列和 SEQ ID NO: 2的重链可变区（VH) 的氨基酸序列，其轻链恒定区为人抗体的 κ链，重链恒定区亚型为人 IgGl。该制备方法包括以下步骤：通过 PCR和合成引物拼接 PCR分别得到人源化单克隆抗体的重链和轻链可变区 cDNA片段，利用同源重组将所得到的可变区 cDNA片段通过同源重组到 pCP载体中，分别与人 IgGl重链恒定区和 κ链连接后，再用重叠 PCR将人源化单克隆抗体的重链和轻链相连接，并在重链和轻链之间加入具有自我剪切功能的 Furin/2A 肽的编码序列。

以 pcDNA3 为原始载体，将上述人源化单克隆抗体的基因克隆到此载体，构建一个新的含有 CAG启动子和 dhfr筛选标记的抗人 DR5人源化单克隆抗体的真核表达载体。本发明获得的新的表达载体，含有具有自我剪切功能的 Furin/2A肽的编码序列，并将人源化单克隆抗体的重链和轻链连接在一个开放阅读框内。具体而言，所述真核表达载体带有 CAG强启动子和 dhfr筛选标记、来自鼠抗人 DR5 的单克隆抗体 (AD5-10)的重链互补决定区和轻链互补决定区与来自人源抗体的重链骨架区和轻链骨架区分别组成的重链可变区和轻链可变区的编码序列、人源 IgGl重链恒定区和轻链恒定区 κ链的编码序列、以及在重链和轻链之间加入的具有自我剪切功能的 Furin/2A肽的编码序列，被有效地连接以高效表达所述的人源化单克隆抗体。优选地，所述鼠抗人 DR5的单克隆抗体为 AD5-10 (Guo Y et al.， A novel anti-human DR5 monoclonal antibody with tumoricidal activity induces caspase-dependent and caspase-independent cell death. J Biol Chem 2005; 280(51): 41940-52； WO2006/017961, ZL200410070093.1)。

优选地，来自鼠抗人 DR5的单克隆抗体 AD5-10的重链互补决定区和轻链互补决定区与来自人源抗体的重链骨架区和轻链骨架区分别组成的重链可变区和轻链可变区的编码序列、人 IgGl重链恒定区和轻链恒定区 κ链、以及在重链 (H)和轻链 (L)之间加入的具有自我剪切功能的 Furin/2A肽 (F2A)连接起来的核苷酸序列编码的氨基酸序列 (HF2AL)为：

GSMEFGLSWLFLVAILKGVQCcdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFTDFS MNWVRQAPGQGLfWMGWINTETGEPTYADDFKGRFghSiDTSVSTAYLQISSLK

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECZLE ( SEQ ID NO: 17)，

其中：斜体的氨基酸序列为 F2A， F2A之前的序列为该人源化单克隆抗体的重链， F2A之后的序列为该人源化单克隆抗体的轻链；氨基酸 a代表 I或 V，氨基酸 b代表 Y或 F，氨基酸 c代表 Q或 E，氨基酸 d代表 V或 I，氨基酸 e代表 S 或 P，氨基酸 f代表 E或 K，氨基酸 g代表 V或 Α，氨基酸代表 F或 L，氨基酸 i 代表 L或 M，氨基酸 j代表 Y或 F，氨基酸 k代表或。对于上述氨基酸 a到 k的可选项，其分别代表的是相应的人源抗体的氨基酸或者回复突变回的鼠源抗体的氨基酸。由于这些可选项本身就是抗体框架区的组成氨基酸，因此，虽然由这些可选氨基酸组成的抗体可能会存在活性和 /或抗原性的某些差别，但均是本发明所述的抗人 DR5人源化单克隆抗体，相互之间无实质性的差别。

用抗 DR5人源化单克隆抗体的真核表达载体转染 HEK293细胞，经亲和层析纯化获得完整的、具有杀伤多种肿瘤细胞活性的抗人 DR5人源化单克隆抗体，命名为 zaptuzumab。

该人源化单克隆抗体和 DR5的天然配体 TRAIL均可与 DR5结合，但其结合位点不同。

体外研究表明，该抗 DR5人源化单克隆抗体可杀死白血病、肝癌、结肠癌和肺癌等多种肿瘤细胞，杀伤活性呈时间和剂量依赖关系。由于该人源化单克隆抗体通过与 DR5结合而发挥其功能，因此，在本发明实施例中证明了其能杀死上述种类的肿瘤细胞后，有理由相信同样高表达 DR5的其它恶性肿瘤细胞也可以被杀死，继而实现治疗相应的恶性肿瘤的目的。

所述抗 DR5人源化单克隆抗体诱导细胞凋亡和自噬性死亡两种不同的细胞死亡形式。

体内的研究表明，该抗 DR5人源化单克隆抗体能强烈地抑制人结肠癌、肝癌和肺癌等肿瘤细胞在裸鼠体内生长，并且能与 TRAIL或表柔比星等抗肿瘤药物联合应用，达到更好的治疗效果。停药后未见明显的反弹现象。组织学分析未见引起小鼠肝脏和肾脏等器官病理性变化。

本发明产生的抗 DR5人源化单克隆抗体与 TRAIL或表柔比星等抗肿瘤药物的组合具有协同杀伤多种肿瘤细胞的作用。

本发明还提供本发明所述的人源化单克隆抗体在制备治疗肿瘤药物中的用途。

最后，本发明还提供一种所述的人源化单克隆抗体或其至少具有 80%同源性的抗体，优选地，至少 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、

98%或 99%同源性的抗体与药学上可接受的载体重组后获得的重组表达载体在制备治疗肿瘤的抗体基因治疗药物中的应用。

由此可见，在本发明中，采用基因工程等现代生物学技术和方法，制备了抗人 DR5的人源化单克隆抗体及其真核表载体，进而，将此表达载体转染 HEK293 细胞，能够大量地表达一种新型的抗 DR5的人源化单克隆抗体。在体外，该人源化单克隆抗体具有强烈诱导多种肿瘤细胞凋亡的能力；在体内，该人源化单克隆抗体具有显著抑制人移植瘤细胞在裸鼠体内形成肿瘤和抑制人移植瘤生长的生物学活性；该人源化单克隆抗体可与其它抗癌药物联用，在体内外诱导肿瘤细胞死亡，加强化疗药物的疗效，降低化疗药物的剂量和毒副作用。因此，该人源化单克隆抗体在新型抗肿瘤药物研制与应用中具有重要意义。

本发明的优点与效果是获得了前人没有报道的抗 DR5人源化单克隆抗体及其真核表达载体。在所述真核表达载体中，所述人源化单克隆抗体的重链和轻链被连接在一个开放阅读框内，能够同时、均衡、匹配地表达人源化单克隆抗体的重链和轻链，并自动组装成功能完整的人源化单克隆抗体分子。

该人源化单克隆抗体同 DR5结合的位点与 TRAIL与 DR5结合的位点不同，可与 TRAIL及表柔比星等抗肿瘤药物联合作用，协同增强其抗肿瘤的效果。在体外可诱导多种肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无毒副作用。在体内具有强烈的抑制人移植瘤形成和生长的抗肿瘤活性，对正常小鼠的肝脏和肾脏等器官无毒副作用。显示该人源化单克隆抗体可发展为安全、有效的抗肿瘤药物。以编码该人源化单克隆抗体或进一步的人源化改型抗体的核苷酸序列与药学上可接受的载体重组连接获得的重组表达载体也可用于制备治疗肿瘤的抗体基因治疗药物。

抗 DR5人源化单克隆抗体是利用基因工程技术将鼠源性抗 DR5抗体的可变区与人抗体的恒定区相连接，构建成完整的人源化单克隆抗体，可以在保持原单抗特异性和亲和力的基础上，减少人抗鼠抗体反应，延长其半衰期和改善药代动力学特性，并能有效地活化补体和 Fc受体相关的免疫应答。本发明在已制备的一株鼠源功能性抗人 DR5单克隆抗体（AD5-10 ) 基础上，通过 CDR移植策略建立了人源化单克隆抗体，该抗体在体内外对多种肿瘤细胞具有特异性的凋亡诱导活性，对正常细胞和组织没有毒副作用，可单独或与 TRAIL 或其它抗肿瘤药物联用，用于多种肿瘤和与 DR5高表达相关的其他疾病的治疗。附图说明

图 1 :是带有 CAG启动子和 dhfr筛选标记的抗 DR5人源化单克隆抗体的真核表达载体结构图。 ADHFL(1692)表示抗 DR5 人源化单克隆抗体的重链、 Furin/2A 肽和轻链的编码核苷酸序列。

图 2: 是该人源化单克隆抗体的真核表达载体转染 HEK293细胞后，细胞培养上清经亲和层析纯化获得的抗 DR5人源化单克隆抗体的 SDS-PAGE分析结果。

图 3 : 是使用 Biacore系统和 CM5芯片测定 AD10、 AD 14和 AD15三株该人源化单克隆抗体与其抗原 DR5的亲和力。 A图的四幅图（从左到右，从上往下）分别对应 AD10、 AD14、 AD15和 AD5-10与其抗原 DR5亲和力的 Biacore测定图谱。 B图是根据 A图计算出的相应亲和力。

图 4: 是采用 CCK-8细胞毒检测试剂盒测定该人源化单克隆抗体在体外杀伤肿瘤细胞的活性。显示以不同浓度的该人源化单克隆抗体 AD10、 AD 14和 AD15 处理人 T淋巴细胞白血病细胞 Jurkat、肝癌细胞 BEL-7402、肺癌细胞 H460和结肠癌细胞 HCT116 24小时的细胞存活率。具体实施方式

下面通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例

实验例 1 人源化抗体的设计与高效表达抗 DR5 人源化单克隆抗体的真核表达载体构建与结果

鼠源的 AD5-10单克隆抗体（中国专利申请号 200410070093.1 ) 的重链和轻链可变区的 CDR 片段用 Kabat numbering system ihttD://www bjoinf.org.uk/abs/#k- abatrmm)找出并标注。重链和轻链可变区 CDR片段的规范（canonical)结构预测根据文献 (1， Kontermann R, Dubel S (2001), Humanising Antibodies by CDR Grafting, p579; 2, Hwang WY, Almagro JC et al.， (2005) Methods, 36:35-42)进行，选择具有相同规范结构的人抗体序列作为接受框架。人源化抗体重链的设计：将支撑 CDR结构及 VH/VL界面的氨基酸找出并回复到鼠源抗体序列。经过回复突变的序列与具有相同规范结构的所有人抗体进行比对，选出最相似的人抗体进行 CDR移植。然后，与 IMGT数据库中所有该类抗体比对，尽量将特殊氨基酸突变成常见氨基酸，以降低免疫原性。 N端的第一个氨基酸如果是 Q，则改变成£。同时，对通过构建模型选定的关键氨基酸进行回复突变。确认人源化抗体序列没有引进糖基化位点。人源化抗体的 J区（J-region)选择完全依据序列的相似程度。

人源化抗体的轻链设计采用与上述相同的方法。

抗体同源模建：分别用 AD10-5的轻链和重链以及 BLAST SEARCH来搜索 PDB蛋白结构数据库，寻找与其序列相似度最高的已知结构的人抗体。根据 BLAST SEARCH的输出结果和序列相似度，将 1DLF、 1I9J、 1NQB 和 1PLG选作 VL模建的模板。将 1IAL、 1NLB、 1A4K和 1FJ1选为 VH的模板，利用 Schrodinger软件包分别对 VH和 VL做同源模建，分别获得轻链和重链的结构模型。再利用 CCP4软件包中的 contact程序来对结构模型进行分析，列出与 CDR loop有相互作用的轻链和重链框架区的氨基酸残基。根据软件分析的结果和人工检视，发现框架区中的以下氨基酸残基对于维持 CDR loop的空间构象较为重要，它们是：轻链的 D60、D70、 Y49、 F71、 M4和 V2; 重链的 K46、 W47、 M48、 F67、 L69、 M71、 W102和 12。所设计的人源化抗体的重链、 Furin/2A肽和轻链的氨基酸序列（如 SEQ ID NO: 17所示）。经优选设计的 3个人源化抗体 AD10、AD14和 AD15重链和轻链的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 18和 19、 SEQ ID NO: 20和 21、 SEQ ID NO: 22和 23所示。

以 pcDNA3 (Invitrogen, A- 150228) 为原始载体，以 pAM/CAG载体（香港大学提供）为模板，以上游引物 5 ' GGCGCAGATCTATTGACG TCAAT3 ' ( SEQ ID NO: 24)和下游引物 5 ' GGCAAGCTTAATTCTTT GCCAAAATG 3 ' ( SEQ ID NO: 25 )扩增 CAG启动子序歹 lj (a modified cytomegaloviras immediate early enhancer and a chicken beta- actin promoter ) o 以 pSV2-dhfr载体 DNA (购自 ATCC， 67110)为模版，以上游引物 5， AATCCCGGGACA GCTCAGGGCTGCG3 ' ( SEQ ID NO: 26) 禾口下游弓 I物 5 ' GGCGGCGC TTCGAAAAAGCCAGCAAAAGC TC3 ' ( SEQ ID NO: 27) 扩增二氢叶酸还原酶（dhfr) 基因片段。通过拼接 PCR扩增或化学合成人源化单克隆抗体的重链和轻链可变区 cDNA片段，利用同源重组技术将得到的可变区 cDNA片段整合到线性化的带有人 IgGl重链恒定区的通用序列的 pCP载体 (上海睿智化学有限公司提供)中。利用 PCR扩增自我剪切位点 Furin/2A肽编码序歹 lj ( F2A ) ( 弓 I物 1： 5， CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAA GGAAGAGGCGAGCACCTGT 3， ( SEQ ID NO : 28 )，引物 2 : 5， GCCC ID NO: 29)并插入上述获得的重组质粒中人源化单克隆抗体的重链和轻链编码核苷酸序列之间，从而依次将 CAG、该人源化抗体重链（H)、 Furin/2A肽（F2A)、该人源化抗体轻链（L) 的编码核苷酸序列（表示为 HF2AL)和编码 dhfr的核苷酸序列组成一个开放阅读框（open reading frame, OPF)。

将上述获得的编码 OPF核苷酸序列插入原始载体 pcDNA3，经测序鉴定正确，获得新的抗 DR5 的人源化单克隆抗体的真核表达载体（命名为 pcDNA3-CAG-HF2AL-dhfr ) 所获得的重组表达质粒的图谱如附图 1所示。实验例 2 抗 DR5人源化单克隆抗体的表达与纯化

用脂质体转染法将构建的真核表达载体 pcDNA3-CAG-HF2AL- dhfr 转染 HEK293细胞（购自 ATCC， CRL-9096), 于 37°C、 5% C0₂、 120 rpm/min振荡培养，使抗 DR5人源化单克隆抗体在 HEK293真核细胞中表达并分泌到细胞培养液中。转染的细胞培养到细胞活力小于 60%时（约需 6天），收集细胞培养上清。制备 l ml Protein A亲和层析柱，先用 PBS磷酸缓冲液（20 mM磷酸盐、 300 mM氯化钠， pH7.0)平衡，然后加入收集的细胞培养上清，用 PBS磷酸缓冲液洗涤，用 100 mM的柠檬酸（pH 3.0)洗脱。收集的洗脱液立即用 1 M的 Tris-HCl (pH 9.0) 调节到 pH 8.0，并对 PBS缓冲液透析过夜。以 SDS-PAGE分析其中的抗 DR5人源化单克隆抗体的纯度与分子量，结果见附图 2。实验例 3 抗 DR5人源化单克隆抗体与其抗原 DR5结合亲和力的测定在 Biacore X100系统（GE Healthcare, Uppsala, 瑞典)使用的 CM5芯片 (GE Healthcare, BR-1000-14)上选定空白对照通道和样品通道。首先用按 1 :1混合的 50 mM N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide， NHS ) : 200 mM 碳化二亚胺 [l-ethyl-3-3-dimethyl aminopropyl carbodiimide, EDC]以 10 μΐ/min的速度注入空白对照通道和样品通道 7分钟，进行芯片活化。以 5 μΐ /min的速度注入溶在 pH 5.5 醋酸钠溶液中的抗原 DR5 (45 μ_§/ηι1),包被芯片，直至获得目标值 680 Ru的信号。将 1 M乙醇胺以 10 μΐ/min的速度注入 7分钟，封闭芯片上多余的结合位点。结合动力学测试选用 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA 0.005% Surfactant P20) 缓冲液，将纯化的该人源化单克隆抗体 AD10、 AD14和 AD15稀释为不同浓度，分别以 30 μΐ/min 的速度注入空白通道和样品通道 3 分钟。将 HBS-EP缓冲液以 30 μΐ /min的速度注入 5 min, 进行解离。采用 Biacore X100 evaluation 2.0软件进行数据分析和处理，结果见附图 3的 A图和 B图。

结果表明该人源化单克隆抗体保留了亲本鼠源抗人 DR5单克隆抗体 (AD5-10) 的抗原亲和力。实验例 4 抗人 DR5人源化单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的活性测定

在 96孔细胞培养板中进行。在生长至对数生长期的人 T淋巴细胞白血病细胞

Jurkat (ATCC, TIB-152 )、结肠癌细胞 HCT116 (ATCC, CCL-247 )、肝癌细胞 BEL-7402 (中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心， TCHu 10) 和非小细胞肺癌细胞 H460 (ATCC, HTB-177) 中，分别加入不同浓度 (0、 0.5、 1、 2、 4、 8 g/ml) 的该抗人 DR5人源化单克隆抗体 AD10、 AD14禾 B AD15, 处理 24小时，以亲本鼠源抗人 DR5单克隆抗体（AD5-10) 及其人 -鼠嵌合抗体 zaptuximab为对照。按照 CCK-8 细胞毒检测试剂盒 (Dojindo, Gaithersburg, MD)操作规程，加入 CCK-8试剂，反应 2-4小时，在微型酶标板测定仪波长 450 nm处测定 OD值。以无细胞孔的 OD值为空白对照 "0"。细胞存活率 =处理孔的 OD值 /未处理孔 OD值，结果见附图 4。

结果表明上述人源化单克隆抗体具有显著的肿瘤细胞杀伤活性。本领域技术人员知晓，在不改变本发明所述人源化单克隆抗体的亲和性和生物活性的前提下，本发明所公开的所述人源化单克隆抗体的具体序列可以被进行适当的改变。例如，所述序列中的部分氨基酸残基可以被删除、添加和替换而不改变所述序列的亲和性和生物活性。例如，本发明所述 CDR和 FR区的部分氨基酸残基可以被性质类似的氨基酸所替换而不影响其亲和性和生物活性。所述人源化单克隆抗体的编码序列可根据其宿主的密码子偏爱性的不同而进行相应的替换。

Claims

权利要求书

1、一种抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体，其包括与 SEQ ID N0: 1所示的氨基酸序列同一性至少为 90%的轻链可变区氨基酸序列、与 SEQ ID NO: 2 所示的氨基酸序列同一性至少为 90%的重链可变区氨基酸序列和人抗体的恒定区。

2、根据权利要求 1所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体，其特征在于所述人源化单克隆抗体的重链恒定区为人抗体 IgGl的恒定区，轻链恒定区为人抗体的 κ链。

3、根据权利要求 1或 2所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体，其特征在于：

CDRL1 : RSSQSLVHSNGNTYLH ( SEQ ID NO: 3 )；

CDRL2: KVSNRFS ( SEQ ID NO: 4);

CDRL3: FQSTHVPHT ( SEQ ID NO: 5 )；禾口 /或

CDRH1 : DFSMN ( SEQ ID NO: 6)；

CDRH2: WINTETGEPTYADDFKG ( SEQ ID NO: 7)；

CDRH3: IDY ( SEQ ID NO: 8)。

4、根据权利要求 1到 3任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体，其特征在于：

所述人源化单克隆抗体的轻链可变区的骨架区 FRL1、 FRL2、 FRL3和 FRL4 的氨基酸序列分别为：

FRL 1： DaVMTQSPLSLPVTPGEPASISC，其中氨基酸 a代表 1或（ SEQ ID NO： 9);

FRL2: WYLQKPGQSPQLLIY ( SEQ ID NO: 10)；

FRL3: FGQGTKLEIK ( SEQ ID NO: 12)；禾口 /或

FRH1 : cdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFT , 其中氨基酸 c代表 Q或 E，氨基酸 d代表 V或 I，氨基酸 e代表 S或 P ( SEQ ID NO: 13 )；

FRH2: WVRQ APGQGLfWMG ,其中氨基酸 f代表 E或 K ( SEQ ID NO: 14)； FRH3: RFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkR, 其中氨基酸 g代表 V或

A，氨基酸 h代表 F或 L，氨基酸 i代表 L或 M，氨基酸 j代表 Y或 F，氨基酸 k 代表 A或 V ( SEQ ID NO: 15 )；

FRH4: WGQGTTVTVSS ( SEQ ID NO: 16)。

5、根据权利要求 1到 4任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体，其特征在于其包括与 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列同一性至少为 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%和 100%的轻链可变区氨基酸序歹 I」，和与 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列同一性至少为 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%和 100%的重链可变区氨基酸序列，优选地，所述人源化单克隆抗体的序列如 SEQ ID NO: 17所示。

6、根据权利要求 1到 5任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体，其选自 AD10、 AD14或 AD15, 其中 AD10的重链和轻链氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19所示， AD14的重链和轻链氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 20和 SEQ ID NO: 21所示， AD15的重链和轻链氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 22禾 B SEQ ID NO: 23所示。

7、一种权利要求 1到 6任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列，优选地，所述编码核苷酸序列是在分别编码重链可变区、恒定区以及轻链可变区、恒定区组成的人源化单克隆抗体的重链和轻链的编码核苷酸序列之间加入具有自我剪切功能的 Furin/2A肽的编码核苷酸序列，优选地，所述编码核苷酸序列编码的人源化单克隆抗体的重链、 Furin/2A和轻链的代表性氨基酸序列如 SEQ ID NO: 17所示。

8、一种稳定表达权利要求 1至 6任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体的重组真核表达载体，其中权利要求 7所述的权利要求 1到 6任一项所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列被有效地连接到真核表达载体中以进行表达，优选地，所述重组真核表达载体带有 CAG强启动子和二氢叶酸还原酶筛选标记，优选地，所述真核表达载体质粒为 pcDNA3。

9、一种制备如权利要求 1至 6任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：

A) 用如权利要求 8所述的重组真核表达载体转染 HEK293细胞；

10、一种由活性成分为如权利要求 1到 6任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体与 TRAIL或其它抗肿瘤药物组成的组合物，优选地，所述抗肿瘤药物是表柔比星。

11、一种如权利要求 1至 6任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体、如权利要求 7所述的权利要求 1到 6任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体的编码核苷酸序列、如权利要求 8 所述的稳定表达权利要求 1至 6任一项所述的抗人死亡受体 5胞外区的人源化单克隆抗体的重组真核表达载体或根据权利要求 10所述的由活性成分为如权利要求 1到 6任一项所述的抗人死亡受体 5 胞外区的人源化单克隆抗体与其它化疗药物组成的组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途，优选地，所述肿瘤为白血病、肝癌、结肠癌、肺癌或卵巢癌。