ES2636480T3 - Derivado de bifenilo y su uso para el tratamiento de trastornos pulmonares - Google Patents

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Abstract

1-[2-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-etilamino]metil}-2-metilfenilcarbamoil)etil] piperidin-4-il ester del ácido bifenil-2-ilcarbámico de fórmula**Fórmula** o una sal farmaéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCION
Derivado de bifenilo y su uso para el tratamiento de trastornos pulmonares Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
5 La presente invencion se refiere a un derivado de bifenilo novedoso que es util para el tratamiento de trastornos pulmonares. Esta invencion tambien se refiere a dicho derivado de bifenilo y a procedimientos para usar un derivado tal de bifenilo para tratar trastornos pulmonares.
Estado de la tecnica
Los trastornos pulmonares, tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), se tratan 10 comunmente con broncodilatadores. Una clase de broncodilatador de uso extendido consiste en agonistas del receptor p2 adrenergico (adrenorreceptor), tales como albuterol, formoterol y salmeterol. Estos compuestos se administran generalmente mediante inhalacion. Los ejemplos adicionales de agonistas del receptor p2 adrenergico se desvelan en el documento WO 99/64031 y tambien en el documento WO 99/64035. Otra clase de broncodilatador consiste en antagonistas del receptor de muscarina (compuestos anticolinergicos), tales como ipratropio y tiotropio. 15 Estos compuestos tambien se administran tipicamente mediante inhalacion. Los ejemplos adicionales de antagonistas del receptor muscarinico se desvelan en el documento WO 01/42212 y el documento WO 01/42213.
Las composiciones farmaceuticas que contienen tanto un agonista de receptor p2 adrenergico como un antagonista del receptor muscarinico tambien se conocen en la tecnica para su uso en el tratamiento de los trastornos pulmonares. Por ejemplo, La patente de EE.UU. n.° 6.433.027 desvela composiciones de medicamentos que contienen un antagonista 20 del receptor muscarinico, tal como bromuro de tiotropio, y un agonista del receptor p2 adrenergico, tal como fumarato de formoterol.
Aunque se conocen compuestos que tienen bien actividad agonista del receptor p2 adrenergico o bien actividad antagonista del receptor muscarinico, no se ha desvelado previamente ningun compuesto que tenga tanto actividad agonista del receptor p2 adrenergico como actividad antagonista del receptor muscarinico. Los compuestos que 25 poseen tanto actividad agonista del receptor p2 adrenergico como actividad antagonista del receptor muscarinico son muy deseables, ya que dichos compuestos bifuncionales proporcionarian broncodilatacion a traves de dos modos de accion independientes, al tiempo que tienen una farmacocinetica molecular unica.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un derivado de bifenilo novedoso que es util para el tratamiento de trastornos 30 pulmonares. Entre otras propiedades, se ha encontrado que el compuesto de esta invencion posee actividad tanto agonista del receptor p2 adrenergico como antagonista del receptor muscarinico.
La presente invencion esta dirigida a un compuesto particular de formula I:
imagen1
en la que:
35 a es 0o un numero entero de 1 a 3;
cada R1 es seleccionado independientemente entre alquilo (Cm), alquenilo (C2-4), alquinilo (C2-4), cicloalquilo (C3-6), ciano, halo, -OR1a, -C(O)OR1b, -SR1c, -S(O)R1d, -S(O)2R1ey NR1fR1g;
cada uno de R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f y R1g es independientemente hidrogeno, alquilo (Cm) o fenil-alquilo (Cm); b es 0 o un numero entero de 1 a 3;
40 cada R2 es seleccionado independientemente entre alquilo (C1-4), alquenilo (C2-4), alquinilo (C2-4), cicloalquilo (C3-6),
5
10
15
20
25
30
35
40
ciano, halo, -OR2a, -C(O)OR2b, -SR2c, -S(O)R2d, -S(O)2R2ey -NR2fR2g;
cada uno de Ra, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f y R2g es independientemente hidrogeno, alquilo (C1.4) o fenil-alquilo (C1.4); W se une en la posicion 3 o 4 con respecto al atomo de nitrogeno en el anillo piperidina y representa 0 o NWa;
Wa es hidrogeno o alquilo (C1-4); c es 0 o un numero entero de 1 a 4;
cada R3 es seleccionado independientemente entre alquilo (Cm), alquenilo (C2-4), alquinilo (C2-4), cicloalquilo (C3.6), ciano, halo, -0R3a, -C(0)0R3b, -SR3c, -S(0)R3d, -S(0)2R3e y -NR3fR3g; o dos grupos R3 se unen para formar alquileno (C1-3), alquenileno (C2-3) o oxiran-2,3-diilo;
cada uno de R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f y R3g es independientemente hidrogeno o alquilo (C1-4);
R4 es un grupo divalente de la formula:
-(R4a)d-(A1 )e-(R4b)f-Q-(R4c)g-(A2)h-(R4d)i-
en la que
d, e, f, g, h e i son seleccionados cada uno independientemente entre 0 y 1;
R4a, R4b, R4c y R4d son seleccionados cada uno independientemente entre alquileno (C1-10), alquenileno (C2-10) y alquinileno (C2-10), en la que cada grupo alquileno, alquenileno o alquinileno esta sin sustituir o sustituido con de 1 a 5 sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo (C1-4), fluor, hidroxi, fenilo y fenil-alquilo (C1-4);
A1 y A2 son seleccionados cada uno independientemente entre cicloalquileno (C3-7), arileno (C6-10), -O-arileno (C6-10), arilen (C6-10)-0-, heteroarileno (C2-9), -O-heteroarileno (C2-9), heteroarilen (C2-g)-0- y heterocicleno (C3-6), en el que cada cicloalquileno esta sin sustituir o sustituido con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo (C1-4), y cada grupo arileno, heteroarileno o heterocicleno esta sin sustituir o sustituido con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo (C1-4), alcoxi (C1-4), -S-alquilo (C1-4), -S(0)-alquilo (C1-4), -S(0)2-alquilo (C1.4), -C(0)0alquilo (C1.4); carboxi, ciano, hidroxi, nitro, trifluorometilo y trifluorometoxi;
Q es seleccionado entre un enlace, -O-, -C(0)0-, -OC(O)-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -N(Qa)C(0)-, -C(0)N(Qb)-, -N(Qc)S(0)2-, -S(0)2N(Qd)-, -N(Qe)C(0)N(Qf)-, -N(Qg)S(0)2N(Qh)-, -0C(0)N(Qi)-, -N(Qj)C(0)0- y -N(Qk);
Qa, Qb, Qc, Qd, Qe, Qf, Qg, Qh, Qi, Qj y Qk son seleccionados cada uno independientemente entre hidrogeno, alquilo (C1-6), A3 y alquilen (C1-4)-A4, en el que el grupo alquilo esta sin sustituir o sustituido con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente entre fluor, hidroxi y alcoxi (C1-4); o junto con el atomo de nitrogeno y el grupo R4b o R4c al que estan unidos, forman un grupo azacicloalquileno de 4 a 6 miembros;
A3 y A4 son seleccionados cada uno independientemente entre cicloalquilo (C3-6), arilo (C6-10), heteroarilo (C2-9) y heterociclilo (C3-6), en el que cada cicloalquilo esta sin sustituir o sustituido con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo (C1-4) y cada grupo arilo, heteroarilo o heterociclilo esta sin sustituir o sustituido con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo (C1-4) y alcoxi (C1-4); con la condicion de que el numero de atomos contiguos en la cadena mas corta entre los dos atomos de nitrogeno a los que R4 se une, este en el intervalo de 4 a 16;
R5 representa hidrogeno o alquilo (C1-4);
R6 es -NR6aCR6b(0) o -CR6cR6d0R6e y R7 es hidrogeno; o R6 y R7 forman juntos -NR7aC(0)-CR7b=CR7c-, -CR7d=CR7e-C(0)-NR7f-, -NR7gC(0)-CR7hR7i-CR7jR7k- o - CR7lR7m-CR7nR7°- C(O) -NR7p-; cada uno de R6a, R6b, R6c, R6d y R6e es independientemente hidrogeno o alquilo (C1-4); y
cada uno de R7a, R7b, R7c, R7d, R7e, R7f, R7g, R7h, R7i, R7j, R7k, R71, R7m, R7n, R7° y R7p es independientemente hidrogeno o alquilo (C1-4);
o una sal o solvato o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo.
En otro de sus aspectos de composicion, esta invencion esta dirigida a un compuesto particular de formula II:
imagen2
en la que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
R4 es como se define en el presente documento (incluyendo cualquier realization espetifica o preferida);
W representa O o NH;
o una sal o solvato o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo.
En otro de los aspectos de su composition, esta invention se dirige a una composition farmaceutica que comprende un vehiculo farmaceuticamente aceptable y a una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion o a una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Dichas composiciones farmaceuticas pueden contener opcionalmente otros agentes terapeuticos. Por consiguiente, en una realizacion, esta invencion se dirige a dicha una composicion farmaceutica tal en la que la composicion comprende ademas una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente antiinflamatorio esteroideo, tal como un corticosteroide.
El compuesto de esta invencion posee tanto actividad agonista del receptor p2 adrenergico como actividad antagonista del receptor muscarrnico. Por consiguiente, el compuesto de la invencion es util para el tratamiento de trastornos pulmonares, tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva cronica.
Por consiguiente, el compuesto de esta invencion es util en un procedimiento para el tratamiento de un trastorno pulmonar, comprendiendo el procedimiento administrar a un paciente en necesidad de tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion o a una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Ademas, el compuesto de esta invencion es util en un procedimiento para proporcionar broncodilatacion en un paciente, comprendiendo el procedimiento la administration a un paciente que requiere broncodilatacion de una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Se describe tambien un procedimiento para tratar la enfermedad pulmonar obstructiva cronica o el asma, comprendiendo el procedimiento la administracion a un paciente en necesidad de tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Dado que el compuesto de esta invencion posee tanto actividad agonista del receptor p2 adrenergico como actividad antagonista del receptor muscarrnico, dicho compuesto tambien es util como una herramienta de investigation. Por consiguiente, aun en otro de sus aspectos del procedimiento, esta invencion se dirige a un procedimiento para el uso del compuesto de la invencion o una sal o solvato o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso como herramienta de investigacion para el estudio de un sistema o muestra biologicos, o para el descubrimiento de nuevos compuestos quimicos que tengan tanto actividad agonista del receptor p2 adrenergico como actividad antagonista del receptor muscarrnico.
Esta invencion tambien se dirige al compuesto de la invencion o a una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia o como medicamento.
Ademas, esta invencion se refiere al uso de un compuesto de formula I o a una sal o solvato o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo, para la fabrication de un medicamento; especialmente para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de un trastorno pulmonar.
Descripcion detallada de la invencion
En uno de aspectos de composicion, esta invencion esta dirigida a un derivado de bifenilo nuevo o sales farmaceuticamente aceptables del mismo. Este compuesto contiene un centro quiral. Cuando un estereoisomero particular se muestra o nombra en el presente documento, se entendera por los expertos en la materia que cantidades menores de otros estereoisomeros pueden presentarse en las composiciones de esta invencion a menos que se indique otra cosa, con la condition de que la utilidad de la composicion no se elimina en su totalidad por la presencia de tales otros isomeros.
En particular, el compuesto de la invencion contiene un centro quiral en el atomo de carbono indicado por el simbolo * en la siguiente formula:
imagen3
El atomo de carbono identificado por el simbolo * tiene la configuration (R). Se prefiere para el compuesto de la invencion tener la configuracion (R) en el atomo de carbono identificado por el simbolo * o enriquecerse en una forma estereoisomerica que tiene la configuracion (R) en este atomo de carbono para optimizar la actividad agonista adrenergico p2 de los compuestos de esta invencion.
El compuesto de la invencion tambien contiene diversos grupos basicos (por ejemplo, grupos amino) y por lo tanto, el
compuesto de la invencion puede existir como la base libre o en diversos formas de sal. Todas estas formas de sales se incluyen dentro del alcance de esta invencion.
Adicionalmente, en los que sea aplicable, se incluyen todos los isomeros cis-trans o E/Z (isomeros geometricos), formas tautomericas y formas topoisomericas del compuesto de la invencion dentro del ambito de esta invencion a 5 menos que se indique otra cosa.
La nomenclatura usada en el presente documento para nombrar el compuesto de esta invencion e intermedios de los mismos generalmente, se obtienen usando el software disponible en el mercado AutoNom (MDL, San Leandro, California). Normalmente, los compuestos de formula I en la que W es O se han nombrado como derivados de ester de acido bifenil-2-ilcarbamico; y los compuestos de formula I en la que W es NWa se han nombrado como derivados de 10 urea.
El compuesto de esta invencion y los compuestos de los Ejemplos Comparativos 1 a 25 son compuestos de formula V:
imagen4
en la que W, R4, R6 y R7 son como se definen en la Tabla I; o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato de los mismos.
15 Tabla I
Ej.
W R4 R6 R7
Comparativo 1
NH -(CH2)g- (racemico)1 -NHC(O)CH=CH-2
Comparativo 2
O -(CH2)g- (racemico) -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 3
O -(CH2)g- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 4
O -(CH2)g- H -NHC(O)H
Comparativo 5
O -(CH2)g- -NHC(O)CH2CH2-
Comparativo 6
O -(CHg)gC(O)NH(CHg)5- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 7
O -(CH2)gN(CHg)C(O)(CHg)5- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 8
O -(CHg)gC(O)NH(fen-1,4-ileno)CHg- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 9
O -(CH2)2NHC(O)(fen-1,4-ileno)CH2- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 10
O -(CHg)gNHC(O)NH(CHg)5- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 11
O -(CH2)aNHC(O)NH(CHg)5- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 12
O -(CH2)g- H -CH2OH
Comparativo 13
NH -(CH)g- H -CH2OH
Comparativo 14
O -(CH2)2C(O)NHCH2(ciclohex-1,3-ileno)CH2- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 15
O -(CH2)2NHC(O)(cis-ciclopent-1,3-ileno)- -NHC(O)CH2CH2-
Comparativo 16
O -(CH2)2C(O)NH(2-clorofen-1,4-ileno)CH2- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 17
O -(CH2)2S(O)2NH(CH2)5- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 18
O -(CH2)2N(CHs)S(O)2(fen-1,4-ileno)CH2- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 19
O -(CH2)2NHC(O)NHCH2(fen-1,3-ileno)CH2- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 20
O -(CH2)a(fen-1,4-ileno)NH(fen-1,4-ileno)(CH2)2- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 21
O 1-[-CH2(2-fluorofen-1,3-ileno)CH2](piperidin-4-il)CH2- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 22
O -(CH2)sO(fen-1,4-ileno)(CH2)2- -NHC(O)CH=CH-
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(continuacion)
Ej.
W R4 R6 R7
Comparativo 23
O -(CH2)2(fen-1,4-ileno)(CH2)2- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 24
O -(CH2)a(tien-2,5-ileno)(CH2)a- -NHC(O)CH=CH-
Comparativo 25
O -(CH2)2C(O)NH(2-cloro-5-metoxifen-1,4-ileno)CH2- -NHC(O)CH=CH-
1
O -(CH2)2C(O)NH(2-metilfen-1,4-ileno)CH2- -NHC(O)CH=CH-
1 En la Tabla I, “(racemico)” significa que el compuesto es racemico en el carbono quiral que lleva el grupo hidroxilo en la formula V.
Definiciones
Cuando se describen el compuesto, composiciones, metodos y procedimientos de esta invencion, los siguientes terminos tienen los siguientes significados a menos que se indique otra cosa.
El termino "alquilo" significa un grupo hidrocarburo saturado monovalente que puede ser lineal o ramificado. A menos que se defina otra cosa, tales grupos alquilo normalmente contienen de 1 a 10 atomos de carbono. Los grupos alquilo representativos incluyen, a modo de ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, ferc-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo y similares.
El termino "alquileno" significa un grupo hidrocarburo saturado divalente que puede ser lineal o ramificado. A menos que se defina otra cosa, tales grupos alquileno normalmente contienen de 1 a 10 atomos de carbono. Los grupos alquileno representativos incluyen, a modo de ejemplo, metileno, etano-1,2-diilo ("etileno"), propano-1,2-diilo, propano-1,3-diilo, butano-1,4-diilo, pentano-1,5-diilo y similares.
El termino "alcoxi" significa un grupo monovalente de la formula (alquil)-O-, en la que alquilo es como se define en el presente documento. Los grupos alcoxi representativos incluyen, a modo de ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, isobutoxi, ferc-butoxi y similares.
El termino "alquenilo" significa un grupo hidrocarburo insaturado monovalente que puede ser lineal o ramificado y que tiene al menos uno, y normalmente 1, 2 o 3, dobles enlaces carbono-carbono. A menos que se defina otra cosa, tales grupos alquenilo normalmente contienen de 2 a 10 atomos de carbono. Los grupos alquenilo representativos incluyen, a modo de ejemplo, etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-but-2-enilo, n-hex-3-enilo y similares. El termino "alquenileno" significa un grupo alquenilo divalente.
El termino "alquinilo" significa un grupo hidrocarburo insaturado monovalente que puede ser lineal o ramificado y que tiene al menos uno, y normalmente 1,2 o 3, triples enlaces carbono-carbono. A menos que se defina otra cosa, tales grupos alquinilo normalmente contienen de 2 a 10 atomos de carbono. Los grupos alquinilo representativos incluyen, a modo de ejemplo, etinilo, n-propinilo, n-but-2-inilo, n-hex-3-inilo y similares. El termino "alquenileno" significa un grupo alquinilo divalente.
El termino "arilo" significa un hidrocarburo aromatico monovalente que tiene un anillo sencillo (es decir, fenilo) o anillos fusionados (es decir, naftaleno). A menos que se defina otra cosa, tales grupos arilo normalmente contienen de 6 a 10 atomos de carbono de anillo. Los grupos arilo representativos incluyen, a modo de ejemplo, fenilo y naftalen-1 -ilo, naftalen-2-ilo, y similares. El termino "arileno" significa un grupo arilo divalente.
El termino "azacicloalquilo" significa heterodclico monovalente que contiene un atomo de nitrogeno, es decir, un grupo cicloalquilo en el que un atomo de carbono se ha reemplazado por un atomo de nitrogeno. A menos que se defina otra cosa, tales grupos azacicloalquilo normalmente contienen de 2 a 9 atomos de carbono. Los ejemplos representativos de un grupo azacicloalquilo son grupos pirrolidinilo y piperidinilo. El termino "azacicloalquileno" significa u grupo azacicloalquilo divalente. Los ejemplos representativos de un grupo azacicloalquileno son grupos pirrolidinileno y piperidinileno.
El termino "cicloalquilo" significa un grupo hidrocarburo carbodclico saturado monovalente. A menos que se defina otra cosa, tales grupos cicloalquilo normalmente contienen de 3 a 10 atomos de carbono. Los grupos cicloalquilo representativos incluyen, a modo de ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares. El termino "cicloalquileno" significa un grupo cicloalquilo divalente.
El termino "halo" significa fluor, cloro, bromo y yodo.
El termino "heteroarilo" significa un grupo aromatico monovalente que tiene un anillo sencillo o dos anillos fusionados y que contiene en el anillo al menos un heteroatomo (normalmente de 1 a 3 heteroatomos) seleccionados entre nitrogeno, oxfgeno y azufre. A menos que se defina otra cosa, tales grupos heteroarilo normalmente contienen en total de 5 a 10 atomos de anillo. Los grupos heteroarilo representativos incluyen, a modo de ejemplo, especies de pirrol, imidazol, tiazol, oxazol, furano, tiofeno, triazol, pirazol, isoxazol, isotiazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina, triazina, indol, benzofurano, benzotiofeno, benzoimidazol, benzotiazol, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina monovalentes y similares, en las que el punto de union esta en cualquier atomo de anillo de carbono o nitrogeno
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disponible. El termino "heteroarileno" significa un grupo heteroarilo divalente.
El termino "heterociclilo" o "heterodclico" significa un grupo (no aromatico) saturado o insaturado, monovalente que tiene un enlace sencillo o multiples anillos condensados y que contiene en el anillo al menos un heteroatomo (normalmente de 1 a 3 heteroatomos) seleccionados entre nitrogeno, ox^geno o azufre. A menos que se defina otra cosa, tales grupos heterodclicos normalmente contienen en total de 2 a 9 atomos de carbono en el anillo. Los grupos heterodclicos representativos incluyen, a modo de ejemplo, especies de pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, piperidina, 1,4-dioxano, morfolina, tiomorfolina, piperazina, 3-pirrolina monovalentes y similares, en las que el punto de union esta en cualquier atomo de anillo de carbono o nitrogeno disponible. El termino "heterocicleno" significa un grupo heterodclico o heterociclilo divalente.
Cuando un numero espedfico de atomos de carbono se destina para un termino en partmulas usado en el presente documento, el numero de atomos de atomos de carbono se muestra entre parentesis precediendo al termino. Por ejemplo, la expresion "alquilo (C1-4)" significa un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 atomos de carbono.
La expresion "sal farmaceuticamente aceptable" significa una sal que es aceptable para la administracion a un paciente, tal como un mairnfero (por ejemplo, sales que tienen una seguridad aceptable en mairnferos para un regimen de dosificacion dado). Tales sales pueden obtenerse a partir de bases inorganicas u organicas farmaceuticamente aceptables y a partir de acidos inorganicos u organicos farmaceuticamente aceptables. Las sales obtenidas a partir de bases inorganicas farmaceuticamente aceptables incluyen amonio, calcio, cobre, ferricas, , litio, magnesio, manganico, manganosas, potasio, sodio, cinc y similares. Son particularmente preferidas las sales amonio, calcio, magnesio, potasicas y sodicas. Las sales obtenidas a partir de bases organicas farmaceuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, que incluyen aminas sustituidas, aminas dclicas, aminas de origen natural y similares, tales como arginina, betama, cafema, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina,
2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N- etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperadina, resinas de poliamina, procama, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares. Las sales obtenidas a partir de acidos farmaceuticamente aceptables incluyen acetico, ascorbico, bencenosulfonico, benzoico, alcanforsulfonico, dtrico, etanosulfonico, edisflico, fumarico, gentfsico, gluconico, glucoronico, glutamico, hipurico, bromtndrico, clorhudrico, isetionico, lactico, lactobionico, maleico, malico, mandelico, metanosulfonico, mucico, naftalenosulfonico, naftalen-1,5-disulfonico, naftalen-2,6-disulfonico, nicotmico, mtrico, orotico, pamoico, pantotenico, fosforico, sucdnico, sulfurico, tartarico, p-toluenosulfonico, xinafoico y similares. Son particularmente preferidos los acidos dtrico, bromtudrico, clortudrico, isetionico, maleico, naftalen-1,5-disulfonico, fosforico, sulfurico y tartarico.
La expresion "sal del mismo" significa un compuesto formado cuando el hidrogeno de un acido se reemplaza por un cation, tal como un cation metalico o un cation organico y similares. Preferentemente, la sal es una sal farmaceuticamente aceptable, aunque esto no se requiere para sales de compuestos intermedios que no se pretenden para la administracion a un paciente.
El termino "solvato" significa un complejo o agregado formado por una o mas moleculas de un soluto, es decir un compuesto de formula I o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y una o mas moleculas de un disolvente. Tales solvatos son normalmente solidos cristalinos que tiene una relacion molar sustancialmente fija de soluto y disolvente. Los disolventes representativos incluyen, a modo de ejemplo, agua, metanol, etanol, isopropanol, acido acetico y similares. Cuando el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato.
Se apreciara que la expresion "o una sal o solvato o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo" pretende incluir todas las permutaciones de sales, solvatos y estereoisomeros, tales como un solvato de una sal farmaceuticamente aceptable de un estereoisomero de un compuesto de formula I.
La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" significa una cantidad suficiente para efectuar un tratamiento cuando se administra a un paciente con necesidad de tratamiento.
La expresion "tratar" o "tratamiento" tal como se usa en el presente documento significa tratar o el tratamiento de una enfermedad o afeccion clmica (tal como una EPOC) en un paciente, tal como un mairnfero, (concretamente un ser humano) que incluya:
(a) evitar que aparezca la enfermedad o afeccion clmica, es decir, tratamiento profilactico de un paciente;
(b) mejorar la enfermedad o afeccion clmica, es decir, eliminar o causar la regresion de la enfermedad o afeccion clmica en un paciente;
(c) suprimir la enfermedad o afeccion clmica, es decir, retrasar o detener el desarrollo de la enfermedad o afeccion clmica en un paciente; o
(d) aliviar los smtomas de la enfermedad o afeccion clmica en un paciente.
La expresion "grupo saliente" significa un grupo o atomo funcional que puede desplazarse por otro grupo o atomo funcional en una reaccion de sustitucion, tales como una reaccion se sustitucion nucleofila. A modo de ejemplo, los grupos salientes representativos incluyen grupos de cloro, bromo y yodo; grupos de ester sulfonico, tales como mesilato, tosilato, brosilato, nosilato y similares; y grupos aciloxi, tales como acetoxi, trifluoroacetoxi y similares.
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La expresion "derivados protegidos de los mismos " significa un derivado del compuesto espedfico en el que uno o mas grupos funcionales del compuesto se protegen de reacciones no deseadas con un grupo protector o de bloqueo. Los grupos funcionales que pueden protegerse incluyen, a modo de ejemplo, grupos de acido carboxflico, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos tiol, grupo carbonilos y similares. Los grupos protectores representativos para acidos carboxflicos incluyen esteres (tal como un p-metoxibencil ester), amidas e hidrazidas; para grupos amino, carbamatos (tal como ferc-butoxicarbonilo) y amidas; para grupos hidroxilo, eteres y esteres; para grupos tiol, tioeteres y tioesteres; para grupos carbonilos, acetales y cetales; y similares. Dichos grupos protectores son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en T. W. Greene y G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Tercera Edicion, Wiley, Nueva York, 1999, y referencias citadas en ese documento.
La expresion "grupo amino protector" significa un grupo protector adecuado para prevenir reacciones no deseadas en un grupo amino. Los grupos amino protectores representativos incluyen, pero sin limitation, ferc-butoxicarbonilo (BOC), tritilo (Tr), benciloxicarbonilo (Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), formilo, trimetilsililo (TMS), ferc-butildimetilsililo (TBS) y similares.
La expresion "grupo carboxi protector" significa un grupo protector adecuado para prevenir reacciones no deseadas en un grupo carboxi. Los grupos carboxi protectores representativos incluyen, pero sin limitacion, esteres, tales como metilo, etilo, ferc-butilo, bencilo (Bn), p-metoxibencilo (PMB), 9-fluroenilmetilo (Fm), trimetilsililo (TMS), ferc-butildimetilsililo (TBS), difenilmetilo (benzhidrilo, DPM) y similares.
La expresion "grupo hidroxilo grupo protector" significa un grupo protector adecuado para prevenir reacciones no deseadas en un grupo hidroxilo. Los grupos hidroxilo protectores representativos incluyen, pero sin limitacion, grupos sililo que incluyen grupos trialquilsililo (Ci_6), tales como trimetilsililo (TMS), trietilsililo (TES), ferc-butildimetilsililo (TBS) y similares; esteres (grupos acilo) que incluyen grupos alquanoilo (Ci_6), tales como formilo, acetilo y similares; grupos arilmetilo, tales como bencilo (Bn), p-metoxibencilo (PMB), 9-fluorenilmetilo (Fm), difenilmetilo (benzhidrilo, DPM) y similares. Adicionalmente, dos grupos hidroxilo tambien pueden protegerse como un grupo alquilideno, tal como prop-2-ilidina, formado, por ejemplo, por reaction con una cetona, tal como acetona.
Procedimientos sinteticos generales
Los derivados de bifenilo de formula (I) pueden prepararse a partir de materiales de partida facilmente disponibles usando los siguientes metodos y procedimientos generales o usando otra information facilmente disponible para los expertos ordinarios en la materia. Aunque una realization particular de la presente divulgation puede mostrarse o describirse en el presente documento, los expertos en la materia reconoceran que todas las realizaciones o aspectos de la presente invention pueden prepararse usando los procedimientos descritos en el presente documento o usando otros procedimientos, reactivos y materiales de partida conocidos para los expertos en la materia. Tambien se apreciara que en las que se dan las condiciones de proceso tipicas o preferidas (es decir, temperaturas de reaccion, tiempos, relaciones molares de los reactivos, disolventes, presiones, etc.), tambien pueden usarse otras condiciones de proceso a menos que se indique otra cosa. Mientras que las condiciones de reaccion optimas pueden variar dependiendo de los reactivos o disolventes particulares usados, tales condiciones pueden determinarse facilmente por un experto en la materia mediante procedimientos de rutina de optimizacion.
Adicionalmente, como apreciaran los expertos en la materia, grupos protectores convencionales pueden ser necesarios o deseados para prevenir a determinados grupos funcionales de someterse a reacciones no deseadas. La election de un grupo protector adecuado para un grupo funcional particular asi como condiciones adecuadas para la protection y la desproteccion de tales grupos funcionales son bien conocidas en la tecnica. Pueden usarse otros grupos protectores distintos de los ilustrados en los procedimientos descritos en el presente documento, si se desea. Por ejemplo, numerosos grupos protectores, y su introduction y retirada, se describen en T. W. Greene y G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Tercera Edicion, Wiley, Nueva York, 1999, y referencias citadas en ese documento.
A modo de ilustracion, los derivados de bifenilo de formula (I) pueden prepararse por un procedimiento que comprende:
(a) hacer reaccionar un compuesto de formula 1:
imagen5
o una sal del mismo; con un compuesto de formula 2:
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imagen6
en la que X1 representa un grupo saliente, y P1 y P2 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo hidroxilo protector;
(b) hacer reaccionar un compuesto de formula 3:
imagen7
o una sal del mismo; con un compuesto de formula 4:
imagen8
en la que X2 representa un grupo saliente, y P3 y P4 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo hidroxilo protector;
(c) acoplar un compuesto de formula 5:
imagen9
con un compuesto de formula 6:
imagen10
en la que XQa y XQb cada uno independientemente representan grupos funcionales que se acoplan para formar un grupo Q, P5a representa un atomo de hidrogeno o un grupo amino protector; y P5b y P6 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo hidroxilo protector;
5 (d) para un compuesto de formula I en la que R5 representa un atomo de hidrogeno, hacer reaccionar un
compuesto de formula 3 con un compuesto de formula 7:
imagen11
o un hidrato del mismo (por ejemplo, un glioxal), en presencia de un agente reductor, en la que P7 representa un atomo de hidrogeno o un grupo hidroxilo protector;
10 (e) hacer reaccionar un compuesto de formula 1 con un compuesto de formula 8:
imagen12
o un hidrato del mismo, en presencia de un agente reductor, en la que P8 y P9 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo hidroxilo protector, P10 representa un atomo de hidrogeno o un grupo amino protector, y R4' representa un residuo que, junto con el carbono al que se une, proporciona un grupo 15 R4 tras la finalization de la reaction;
(f) hacer reaccionar un compuesto de formula 9:
imagen13
en la que X3 representa un grupo saliente, con un compuesto de formula 10:
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imagen14
en la que P11 y P12 cada uno independientemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo hidroxilo protector, y P13 representa un atomo de hidrogeno o un grupo amino protector; o
(g) hacer reaccionar un compuesto de formula 11
imagen15
o un hidrato del mismo; en la que R4 representa un residuo que, junto con el carbono al que se une, proporciona un grupo R4 tras la finalization de la reaction; con un compuesto de formula 10 en presencia de un agente reductor; y despues
la retirada de cualquier grupo protector P1, P2, P3, P4, P5a, P5b, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 o P13 para proporcionar un
compuesto de formula I; y opcionalmente, formar una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Generalmente, si se usa una sal de uno de los materiales de partida en los procedimientos descritos anteriormente, tal como una sal de adicion de acido, la sal normalmente se neutraliza antes o durante el procedimiento de reaccion. Esta reaccion de neutralization normalmente se acopla poniendo en contacto la sal con un equivalente molar de una base para cada equivalente molar de la sal de adicion de acido.
En el procedimiento (a), es decir, la reaccion entre los compuestos de formula 1 y 2, el grupo saliente representado por X1 puede ser, por ejemplo, halo, tal como cloro, bromo o yodo, o un grupo ester sulfonico, tal como mesilato o tosilato. Los grupos P1 y P2 pueden ser, por ejemplo, trimetilsililo y bencilo, respectivamente. Normalmente, esta reaccion se realiza en un diluyente inerte, tal como acetonitrilo, en presencia de una base. Por ejemplo, esta reaccion puede realizarse en presencia de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina. Generalmente, esta reaccion se realiza a una temperatura en el intervalo de entre 0 °C a 100 °C hasta que la reaccion esta sustancialmente completada. Despues, el producto de reaccion se aisla usando procedimientos convencionales, tales como extraction, recristalizacion, cromatografia y similares.
Los compuestos de formula 1 se conocen generalmente en la tecnica o pueden prepararse a partir de materiales de partida y reactivos disponibles en mercado usando procedimientos bien conocidos. Por ejemplo, los compuestos de formula 1 pueden prepararse desprotegiendo un compuesto de formula 12:
imagen16
en la que P14 representa un grupo amino protector, tal como un grupo bencilo. A modo de ilustracion, puede retirarse facilmente un grupo bencilo por reduction usando, por ejemplo, hidrogeno o formiato de amonio y un catalizador de metal del Grupo VIII, tal como paladio sobre carbono. Cuando W representa NWa, la reaccion de hidrogenacion se realiza convenientemente usando catalizador de Pearlman (es decir, Pd(OH)2).
Los compuestos de formula 12 pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de isocianato de formula 13:
imagen17
con un compuesto de formula 14:
imagen18
Los compuestos de formula 2 pueden prepararse por diversos procedimientos descritos en el presente documento o 5 por procedimientos que son bien conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, el grupo hidroxilo de un compuesto de la formula 23 a continuacion, puede convertirse facilmente en un grupo saliente usando reactivos y procedimientos bien conocidos. A modo de ilustracion, un grupo hidroxilo puede convertirse en un grupo halo usando un haluro de acido inorganico, tal como cloruro de tionilo, tricloruro de fosforo, tribromuro de fosforo, oxicloruro de fosforo y similares, o un halogeno acido, tal como bromuro de hidrogeno.
10 En el procedimiento (b), es decir, la reaccion de un compuesto de formula 3 con un compuesto de formula 4, el saliente representado por X2 puede ser, por ejemplo, halo, tal como cloro, bromo o yodo, o un grupo ester sulfonico, tal como mesilato o tosilato. Los grupos P3 y P4 pueden ser, por ejemplo, ferc-butildimetilsililo y bencilo, respectivamente. Normalmente, esta reaccion se realiza en presencia de una base, tal como bicarbonato sodico, y un yoduro de metal alcalino, tal como yoduro sodico. Generalmente, esta reaccion se realiza en un diluyente inerte, tal como 15 tetrahidrofurano, en un intervalo de temperatura de 25 °C a 100 °C hasta que la reaccion se completa sustancialmente. Despues, el producto de reaccion se afsla usando procedimientos convencionales, tales como extraccion, recristalizacion, cromatograffa y similares.
Los compuestos de formula 3 pueden prepararse desprotegiendo un compuesto de formula 15:
imagen19
20 en la que una o ambas de P15 y P16 representa independientemente un grupo protector, tal como ferc-butoxicarbonilo, y cualquier resto representa un atomo de hidrogeno. Por ejemplo, un grupo ferc-butoxicarbonilo puede retirarse tratando el compuesto protegido con acido trifluoroacetico.
Los compuestos de formula 15 pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de formula 1 con un compuesto de formula 16:
25 X3-R4-NP15P16 16
en la que X3 representa un grupo saliente tal como halo, tal como cloro, bromo o yodo, o un grupo ester sulfonico, tal como mesilato o tosilato. Normalmente, esta reaccion se realiza poniendo en contacto un compuesto de formula 1 con un compuesto de formula 16 en un diluyente inerte, tal como acetonitrilo, DMF o mezclas de los mismos, en un intervalo de temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 100 °C hasta que la reaccion se completa 30 sustancialmente.
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Como alternativa, los compuestos de formula 3 pueden obtenerse por aminacion reductora de un compuesto de formula 11 La aminacion reductora puede llevarse a cabo haciendo reaccionar el compuesto de formula 1_1 con, por ejemplo, bencilamina e hidrogeno en presencia de paladio sobre carbono.
Los compuestos de formula 11 pueden prepararse oxidando el correspondiente alcohol de formula 17:
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usando un agente oxidante adecuado, tal como un complejo trioxido de azufre-piridina y dimetilsulfoxido. Esta reaction de oxidation se realiza normalmente en un diluyente inerte, tal como diclorometano, la presencia de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina, en un intervalo de temperatura de aproximadamente -20 °C a aproximadamente 25 °C.
Los compuestos de formula 17 pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de formula 1 con un compuesto de formula 18:
X4"R4"OH 18
en la que X4 representa un grupo saliente tal como halo, tal como cloro, bromo o yodo, o un grupo ester sulfonico, tal como mesilato o tosilato.
Los compuestos de formula 4 pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de formula 19:
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con un agente reductor, tal como borano. Si se desea, tal reduction puede llevarse a cabo en presencia de un catalizador quiral para proporcionar compuestos de formula 4 en forma quiral. Por ejemplo, los compuestos de formula 19 pueden reducirse en presencia de un catalizador quiral formado a partir de (R)-(+)-a,a-difenil-2-pirrolidinametanol y trimetilboroxina; o como alternativa, a partir de (S)-(-)-a,a-difenil-2-pirrolidinametanol y trimetilboroxina. Despues, el grupo hidroxilo resultante puede protegerse con un grupo hidroxilo protector, P3, por reaccion con, por ejemplo, trifluorometanosulfonato de ferc-butildimetilsililo.
Los compuestos de formula 19 en la que X2 representa un atomo de bromo puede prepararse haciendo reaccionar un compuesto de formula 20:
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con bromo en presencia de un acido de Lewis, tal como dietil eterato de trifluoruro de boro. Los compuestos de formula 20 son bien conocidos en la tecnica o pueden prepararse por procedimientos bien conocidos usando materiales de
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partida y reactivos disponibles en el mercado.
En referencia al procedimiento (c), es dedr, la reaccion de un compuesto de formula 5 con un compuesto de formula 6, se apreciara que los grupos XQa y XQb deben seleccionarse de manera que se proporcione el grupo deseado Q tras la finalizacion de la reaccion. Por ejemplo, cuando el grupo deseado Q es un grupo amida, es decir, -N(Qa)C(O)- o -C(O)N(Qb), uno de XQa y XQb puede ser un grupo amino (es decir, -NHQa o -NHQb) y el otro puede ser un grupo carboxilo (es decir, -COOH) o un derivado reactivo de los mismos (tal como haluro de acilo, tal como un cloruro de acilo o bromuro de acilo). Los grupos P5a, P5b y P6 pueden ser, por ejemplo, bencilo, trimetilsililo y bencilo, respectivamente. Cuando Q es un grupo amida, la reaccion puede llevarse a cabo en condiciones de acoplamiento convencionales. De forma analoga, cuando el grupo deseado Q es una sulfonamida, es decir, -N(Qc)S(O)2- o -S(O)2N(Qd)-, una de XQa y XQb pueden ser un grupo amino, -NHQc o -NHQd y el otro puede ser un grupo sulfonil haluro (tal como cloruro de sulfonilo o bromuro de sulfonilo).
Los compuestos de formula 5 pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de formula 1 con un compuesto de formula 21
X5-(R4a)d-(A1)e-(R4b)rXQa' 21
en la que X5 representa un grupo saliente que incluye halo, tal como cloro, bromo o yodo, y un grupo ester sulfonico, tal como mesilato o tosilato; y XQa' representa XQa, tal como un grupo carboxilo o un grupo amino NHQa, o un derivado protegido de los mismos, tal como un grupo alcoxicarbonilamino (C1-6) o un grupo ferc-butoxicarbonilamino. Normalmente, esta reaccion se realiza por procedimientos analogos a los que se usan para preparar compuestos de formula 3, seguido de la retirada de cualquier grupo protector en XQa'.
Los compuestos de formula 6 pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de formula 4 con un compuesto de formula 22:
XQb'-(R4c)g-(A2)h-(R4d)rX6 22
en la que X6 representa un grupo saliente que incluye halo, tal como cloro, bromo o yodo, y un grupo ester sulfonico, tal como mesilato o tosilato; y XQb' representa XQb, tal como un grupo carboxilo o un grupo amino NHQb, o un derivado protegido de los mismos, tal como un grupo alcoxicarbonilo (C1-6) o un grupo ferc-butoxicarbonilamino. Normalmente, esta reaccion se realiza por un procedimiento analogo al que se usa para preparar compuestos de formula 3, seguido de la retirada de cualquier grupo protector en XQb'.
En referencia al procedimiento (d), es decir, la reaccion de un compuesto de formula 3 con un compuesto de formula 7, puede usarse cualquier agente reductor adecuado en esta reaccion. Por ejemplo, el agente reductor puede ser hidrogeno en presencia de un catalizador de metal del Grupo VIII, tal como paladio sobre carbono; o un reactivo de hidruro de metal, tal como triacetoxiborohidruro sodico. El grupo P7 puede ser, por ejemplo, bencilo. Normalmente, esta reaccion se realiza en un diluyente inerte y un disolvente protico, tal como una mezcla de dicloroetano y metanol, en una temperatura en el intervalo de entre 0 °C a 100 °C hasta que la reaccion se completa sustancialmente.
Los compuestos de formula 7 en forma de un hidrato pueden prepararse por procedimientos convencionales, por ejemplo, por dibromacion de un compuesto de formula 19 (en la que X2 en este caso tambien puede ser hidrogeno), y despues hidrolizando el dibromuro resultante para formar un glioxal o un hidrato de los mismos. Por ejemplo, un compuesto de formula 19 puede hacerse reaccionar bromuro de hidrogeno y despues hidrolizarse con agua para formar el correspondiente hidrato de glioxal.
En referencia al procedimiento (e), es decir, la reaccion de un compuesto de formula 1 con un compuesto de formula 8, puede usarse cualquier agente reductor adecuado en esta reaccion. Por ejemplo, el agente reductor puede ser hidrogeno en presencia de un catalizador de metal del Grupo VIII, tal como paladio sobre carbono; o un reactivo de hidruro de metal, tal como triacetoxiborohidruro sodico. Los grupos P8, P9 y P10 pueden ser, por ejemplo, trimetilsililo, bencilo y bencilo, respectivamente. Normalmente, esta reaccion de reduction se realiza en un diluyente inerte y un disolvente protico, tal como dicloroetano y metanol, en una temperatura en el intervalo de entre 0°Ca 100 °C hasta que la reaccion se completa sustancialmente.
Los compuestos de formula 8 pueden prepararse oxidando un compuesto de formula 23:
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usando cualquier agente oxidante adecuado, tal como un complejo trioxido de azufre-piridina y dimetilsulfoxido. Normalmente, esta reaccion se realiza en presencia de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina, en una temperatura en el intervalo de entre aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C hasta que la oxidacion se completa sustancialmente.
Los compuestos de formula 23 pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de formula 10 con un compuesto de formula 24:
HO-R4-X7 24
en la que X7 representa un grupo saliente que incluye halo, tal como cloro, bromo o yodo, y un grupo ester sulfonico, tal como mesilato o tosilato.
En referencia al procedimiento (f), es decir, la reaccion de un compuesto de formula 9 con un compuesto de formula 10, el grupo saliente representado por X3 puede ser, por ejemplo, halo, tal como cloro, bromo o yodo, o un grupo ester sulfonico, tal como mesilato o tosilato. Los grupos P11, P12 y P13 pueden ser, por ejemplo, trimetilsililo, bencilo y bencilo, respectivamente. Normalmente, esta reaccion se realiza un diluyente inerte, tal como acetonitrilo, en presencia de una base adecuada. Por ejemplo, esta reaccion puede realizarse en presencia de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina. Generalmente, esta reaccion se realiza en una temperatura en el intervalo de entre 0 °C a 100 °C hasta que la reaccion se completa sustancialmente.
Los compuestos de formula 9 pueden prepararse por etapas analogas a las de los procedimientos (a) a (e) en el presente documento, partiendo de un compuesto de formula 1. Adicionalmente, los compuestos de formula 10 pueden prepararse a partir de compuestos de formula 4 por reaccion con una amina de formula P13NH2.
En referencia al procedimiento (g), es decir, la reaccion de un compuesto de formula H con un compuesto de formula 10, puede usarse cualquier agente reductor adecuado en esta reaccion. Por ejemplo, el agente reductor puede ser hidrogeno en presencia de un catalizador de metal del Grupo VIII, tal como paladio sobre carbono; o un reactivo de hidruro de metal, tal como triacetoxiborohidruro sodico. Los grupos P11, P12 y P13 pueden, por ejemplo, terc-butildimetilsililo, bencilo y bencilo, respectivamente. Normalmente, esta reaccion de reduction se realiza en un diluyente inerte y un disolvente protico, tal como dicloroetano y metanol, en una temperatura en el intervalo de entre 0°Ca 100 °C hasta que la reaccion se completa sustancialmente.
Los compuestos de formula H se preparan facilmente por oxidacion del correspondiente alcohol o por hidrolisis del correspondiente acetal. Puede emplearse cualquier agente oxidante adecuado en esta reaccion para proporcionar el aldehido, tal como un complejo trioxido de azufre-piridina y dimetilsulfoxido. El acetal puede hidrolizarse en condiciones convencionales usando acidos acuosos para proporcionar el aldehido.
En una realization particular, ciertos compuestos de formula I se preparan por un procedimiento que comprende:
(h) desproteger un compuesto de formula 25:
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en la que P17 representa un atomo de hidrogeno o un grupo amino protector; y cada uno de P18, P19 y P20 independientemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo hidroxilo protector; con la condition de que al menos uno de P17, P18, P19 o P20 sea un grupo protector;
(i) desproteger un compuesto de formula 26:
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en la que P21 representa un atomo de hidrogeno o un grupo amino protector; y cada uno de P22 y P23 independientemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo hidroxilo protector; con la condition de que al menos uno de P21, P22 o P23 sea un grupo protector; o 5 (j) desproteger un compuesto de formula 27:
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en la que P24 representa un atomo de hidrogeno o un grupo amino protector; y cada uno de P25 y P26 independientemente representan un atomo de hidrogeno o un grupo hidroxilo protector; con la condicion de que al menos uno de P24, P25 o P26 sea un grupo protector.
10 para proporcionar un compuesto de formula I y, opcionalmente, que forman una sal farmaceuticamente aceptable
del compuesto of formula I.
En referencia al procedimiento (h), son ejemplos de valores particulares para P17, P18, P19y P20: para P17, hidrogeno o bencilo; para P18 hidrogeno o ferc-butildimetilsililo; y para P19 y P20 hidrogeno o bencilo, o propilidina junta. En este procedimiento, los grupos protectores bencilo se retiran convenientemente por hidrogenacion catalrtica en presencia 15 de un catalizador de metal del Grupo VIII, tal como paladio sobre carbono; un grupo ferc-butildimetilsililo se retira convenientemente por tratamiento con fluoruro de hidrogeno, tal como trihidrofluoruro de trietilamina; y un grupo propilidina se retira convenientemente por tratamiento con un acido, tal como acido trifluoroacetico.
Los compuestos de formula 25 pueden prepararse por los procedimientos descritos en el presente documento, tales como por los procedimientos (a) a (g). Como alternativa, los compuestos de formula 25 pueden prepararse haciendo 20 reaccionar un compuesto de formula 28:
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en la que R8 representa -CH2OP19, -CHO, -COOH o -C(O)Oalcoxi (C1-6), tal como carbometoxi, R9 representa -OP18 y
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R10 representa un atomo de hidrogeno, o R9 y R10 juntos representan =O, con un agente reductor. Puede usarse en esta reaccion cualquier agente reductor adecuado, que incluye, a modo de ejemplo, agentes reductores de hidruro de metal, tal como borohidruro sodico, hidruro de litio y aluminio y similares.
Los compuestos de formula 28 en los que R9 y R10 juntos representan un grupo =O pueden prepararse facilmente haciendo reaccionar un compuesto de formula 29:
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o una sal del mismo, con un compuesto de formula 30:
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en la que X8 representa un grupo saliente, tal como bromo.
En referencia al procedimiento (i), son ejemplos de valores particulares para P21, P22 y P23: para P21, hidrogeno o bencilo; para P22 hidrogeno o ferc-butildimetilsililo; y para P23 hidrogeno o bencilo. En este procedimiento, grupos protectores bencilo se retiran convenientemente por hidrogenacion catalftica en presencia de un catalizador de metal del Grupo VIII, tal como paladio sobre carbono; y un grupo ferc-butildimetilsililo se retira convenientemente por tratamiento con fluoruro de hidrogeno, tal como trihidrofluoruro de trietilamina. Los compuestos de formula 26 pueden prepararse por los procedimientos descritos en el presente documento, tales como los procedimientos (a) a (g).
En referencia al procedimiento (j), son ejemplos de of valores particulares para P24, P25 y P26: para P24, hidrogeno o bencilo; para P25 hidrogeno o ferc-butildimetilsililo; y para P26 hidrogeno o bencilo. En este proceso, los grupos protectores bencilo se retiran convenientemente por hidrogenacion catalftica en presencia de un catalizador de metal del Grupo VIII, tal como paladio sobre carbono; y un grupo ferc-butildimetilsililo se retira convenientemente por tratamiento con fluoruro de hidrogeno, tal como trihidrofluoruro de trietilamina. Los compuestos de formula 27 pueden prepararse por los procedimientos descritos en el presente documento, tales como los procedimientos (a) a (g).
Adicionalmente, los compuestos de formula I en la que R6 y R7 forman juntos -NR79C(O)-CR7hR7'-CR7jR7k- o -CR7lR7m-CR7nR7o-C(O) -NR7P- pueden prepararse por reduction de un compuesto de formula I correspondiente en la que R6 y R7 forman juntos -NR7aC(O)-CR7b=CR7c- o -CR7d=CR7e-C(O)-NR7f-, por ejemplo por hidrogenacion catalftica como se describe en el Ejemplo 6 en los sucesivo en el presente documento.
Se describen detalles adicionales con respecto a las condiciones de reaccion especficas y otros procedimientos para la preparation de compuestos representativos de formula (I) o intermedios de los mismos en los Ejemplos mostrados a continuation.
Composiciones y formulaciones farmaceuticas
El derivado de bifenilo de esta invention se administra ftpicamente a un paciente en forma de una composition o formulation farmaceutica. Dichas composiciones farmaceuticas pueden administrarse al paciente mediante cualquier via de administration aceptable que incluya, pero no se limite a, modos de administration inhalada, oral, nasal, topica (incluyendo transdermica) y parenteral. Se entendera que cualquier forma del compuesto de esta invencion, (es decir,
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base libre, sal farmaceuticamente aceptable, solvato, etc.) que sea adecuada para el modo concreto de administracion puede usarse en las composiciones farmaceuticas discutidas en el presente documento.
Por consiguiente, en uno de los aspectos de sus composiciones, esta invencion se dirige a una composicion farmaceutica que comprende un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable y a una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la invencion, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Opcionalmente, si se desea, dichas composiciones farmaceuticas pueden contener otros agentes terapeuticos y/o de formulacion.
Las composiciones farmaceuticas de esta invencion contienen tfpicamente una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la presente invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Tfpicamente, dichas composiciones farmaceuticas contendran desde alrededor del 0,01 a alrededor del 95 % en peso del agente activo; incluyendo, desde alrededor del 0,01 a alrededor del 30 % en peso; tal como desde alrededor del 0,01 a alrededor del 10 % en peso del agente activo.
Puede usarse cualquier vetnculo o excipiente convencional en las composiciones farmaceuticas de esta invencion. La eleccion de un vetnculo o excipiente, o combinaciones de vehnculos o excipientes concretos, dependera del modo de administracion que se este usando para tratar a un paciente o tipo de afeccion clmica o estado patologico concretos. En este sentido, la preparacion de una composicion farmaceutica adecuada para un modo de administracion concreto esta dentro del alcance de los expertos en las tecnicas farmaceuticas. Ademas, los ingredientes para dichas composiciones estan disponibles comercialmente de, por ejemplo, Sigma, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. A modo de ilustracion adicional, se describen tecnicas de formulacion convencionales en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edicion, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); y H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Edicion, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).
Los ejemplos representativos de materiales que pueden servir como vehnculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: (1) azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa, (2) almidones, tales como almidon de mafz y almidon de patata; (3) celulosa, y sus derivados tales como carboximetilcelulosa sodica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tales como aceites de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de mafz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y propilenglicol; (12) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidroxido magnesico e hidroxido de aluminio; (15) acido algmico; (16) agua libre de pirogenos; (17) solucion salina isotonica; (18) solucion de Ringer; (19) alcohol etflico; (20) soluciones de tampon fosfato; (21) gases propulsores comprimidos, tales como clorofluorocarbonos o hidrofluorocarbonos; y (22) otras sustancias compatibles atoxicas empleadas en composiciones farmaceuticas.
Las composiciones farmaceuticas de esta invencion se preparan tfpicamente mediante la mezcla o combinacion total y estrecha del compuesto de la invencion con un vetnculo farmaceuticamente aceptable y uno o mas ingredientes opcionales. Si se necesita o se desea, la mezcla combinada uniformemente resultante puede modelarse o cargarse despues en comprimidos, capsulas; pfldoras, envases, cartuchos, dispensadores y similares usando procedimientos y equipos convencionales.
En una realizacion, las composiciones farmaceuticas de esta invencion son adecuadas para la administracion inhalada. Las composiciones farmaceuticas para la administracion inhalada estaran tfpicamente en la forma de un aerosol o un polvo. Dichas composiciones se administran generalmente usando dispositivos de dispensacion bien conocidos, tales como un inhalador nebulizador, un inhalador de dosis medida (IDM), un inhalador de polvo seco (IPS) o un dispositivo de dispensacion similar.
En una realizacion espedfica de esta invencion, la composicion farmaceutica que comprende el agente activo se administra mediante inhalacion usando un inhalador nebulizador. Dichos dispositivos nebulizadores producen tfpicamente una corriente de aire de alta velocidad que provoca que la composicion farmaceutica comprima el agente activo para rociarlo como una neblina que se transporta al interior del tracto respiratorio del paciente. Por consiguiente, cuando se formula para su uso en un inhalador nebulizador, el agente activo se disuelve tfpicamente en un vetnculo adecuado para formar una solucion. De forma alternativa, el agente activo puede micronizarse y combinarse con un vetnculo adecuado para formar una suspension de partfculas micronizadas de tamano respirable, en la que micronizado se define tfpicamente como tener alrededor del 90 % de las partfculas o mas con un diametro de menos de alrededor de 10 pm. Los dispositivos nebulizadores adecuados se proporcionan comercialmente, por ejemplo, por PARI GmbH (Stamberg, Alemania). Otros dispositivos comerciales incluyen Respimat (Boehringer Ingelheim) y los desvelados, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n.° 6.123.068 y en el documento WO 97/12687.
Una composicion farmaceutica representativa para su uso en un inhalador nebulizador comprende una solucion acuosa isotonica que comprende desde alrededor de 0,05 pg/ml hasta alrededor de 10 mg/ml de un compuesto de la invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En otra realizacion espedfica de esta invencion, la composicion farmaceutica que comprende el agente activo se
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administra mediante inhalacion usando un inhalador de polvo seco. Dichos inhaladores de polvo seco administran tipicamente el agente activo como un polvo de flujo libre que se dispersa en la corriente de aire del paciente durante la respiracion. Con el fin de conseguir un polvo de flujo libre, el agente activo se formula tipicamente con un excipiente adecuado tal como lactosa o almidon.
Una composicion farmaceutica representativa para su uso en un inhalador de polvo seco comprende lactosa seca que tiene un tamano de partfcula entre alrededor de 1 pm hasta alrededor de 100 pm y partfculas micronizadas del compuesto de la invencion, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Dicha formulacion en polvo seco puede fabricarse, por ejemplo, combinando la lactosa con el agente activo y despues mezclando en seco los componentes. De forma alternativa, si se desea, el agente activo puede formularse sin un excipiente. La composicion farmaceutica se carga despues tipicamente dentro de un dispensador de polvo seco, o dentro de cartuchos o capsulas de inhalacion para su uso con un dispositivo de dispensacion de polvo seco.
Ejemplos de dispositivos inhaladores de dispensacion de polvo seco incluyen Diskhaler (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, Nc) (vease, p. ej., la Patente de EE.UU. n.° 5.035.237); Diskus (GlaxoSmithKline) (vease, p. ej., la patente de EE.UU. n.° 6.378.519; Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, Alemania) (vease, p. ej., la Patente de EE.UU. n.° 4.524.769); Rotahaler (GlaxoSmithKline) (vease, p. ej., la patente de eE.UU. n.° 4.353.365) y Handihaler (Boehringer Ingelheim). Mas ejemplos de dispositivos IPS adecuados se describen en las patentes de EE.UU. n.° 5.415.162, 5.239.993, y 5.715.8l0 y las referencias citadas en ellas.
En otra realizacion espedfica mas de esta invencion, la composicion farmaceutica que comprende el agente activo se administra mediante inhalacion usando un inhalador de dosis medida. Dichos inhaladores de dosis medida descargan tfpicamente una cantidad medida del agente activo o de una sal farmaceuticamente aceptable del mismo usando gas propulsor comprimido. Por consiguiente, las composiciones farmaceuticas administradas mediante el uso de un inhalador de dosis medida comprenden tfpicamente una solucion o suspension del agente activo en un propulsor licuado. Puede emplearse cualquier propulsor licuado adecuado, incluyendo clorofluorocarbonos, tales como CC^F, e hidrofluoroalcanos (HFA), tales como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) y 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano, (HFA 227). Debido a problemas a cerca de que los clorofluorocarbonos afectan a la capa de ozono, se prefieren generalmente las formulaciones que contienen HFA. Los componentes adicionales opcionales de las formulaciones de HFA incluyen codisolventes, tales como etanol o pentano, y tensioactivos, tales como trioleato de sorbitano, acido oleico, lecitina, y glicerina. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.225.183, el documento EP 0717987 A2, y el documento WO 92/22286.
Una composicion farmaceutica representativa para su uso en un inhalador de dosis medida comprende desde alrededor del 0,01 % a alrededor del 5 % en peso de un compuesto de formula I, o una sal o solvato o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo; desde alrededor del 0 % a alrededor del 20 % en peso de etanol; y desde alrededor del 0 % a alrededor del 5 % en peso de tensioactivo; siendo el resto un propulsor de HFA.
Dichas composiciones se preparan tfpicamente mediante la adicion de hidrofluoroalcano frio o a presion a un contenedor adecuado que contiene el agente activo, etanol (si esta presente) y el tensioactivo (si esta presente). Para preparar una suspension, el agente activo se microniza y despues se combina con el propulsor. La formulacion se carga despues en un envase de aerosol, que forma parte de un dispositivo inhalador de dosis medida. En las patentes de EE.UU. n.° 6.006.745 y 6.143.277 se proporcionan ejemplos de dispositivos inhaladores de dosis medida desarrollados espedficamente para su uso con propulsores de HFA. De forma alternativa, puede prepararse una formulacion en suspension mediante deshidratacion por pulverizacion de un recubrimiento de tensioactivo sobre partfculas micronizadas del agente activo. Veanse, por ejemplo, los documentos WO 99/53901 y WO 00/61108.
Para ejemplos adicionales de los procedimientos de preparacion de partfculas y formulaciones respirables, y dispositivos adecuados para la dosificacion por inhalacion veanse las patentes de eE.UU. n.° 6.268.533, 5.983.956, 5.874.063, y 6.221.398, y los documentos WO 99/55319 y WO 00/30614.
En otra realizacion, las composiciones farmaceuticas de esta invencion son adecuadas para la administracion oral. Las composiciones farmaceuticas para la administracion oral pueden estar en forma de capsulas, comprimidos, pfldoras, pastillas para chupar, obleas grageas, polvos, granulos, o como una solucion o una suspension en un lfquido acuoso o no acuoso; o como una emulsion lfquida de aceite en agua o de agua en aceite; o como un elixir o jarabe; y similar; conteniendo cada una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invencion como agente activo.
Cuando se pretenda la administracion oral en una forma de dosificacion solida (es decir, como capsulas, comprimidos, pfldoras y similar), las composiciones farmaceuticas de esta invencion comprenderan tfpicamente un compuesto de la presente invencion como agente activo y uno o mas veldculos farmaceuticamente aceptables, tales como citrato sodico o fosfato dicalcico. De forma opcional o alternativa, dichas formas de dosificacion solida tambien pueden comprender: (1) cargas o expansores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o acido salidlico;
(2) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arabiga;
(3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato calcico, almidon de patata o tapioca, acido algmico, ciertos silicatos, y/o carbonato sodico; (5) agentes retardantes de la disolucion, tales como parafina; (6) acelerantes de la absorcion, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes
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hidratantes, tales como alcohol cetilico y/o monoestearato de glicerol, (8) absorbentes, tales como caolm y/o arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato calcico, estearato magnesico, polietilenglicoles solidos, lauril sulfato sodico, y/o mezclas de los mismos. (10) agentes colorantes; y (11) agentes tamponadores.
Agentes de liberacion, agentes humectantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saborizantes y aromatizantes, tambien pueden estar presentes conservantes y antioxidantes en las composiciones farmaceuticas de esta invencion. Ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, cloruro de cistema, bisulfato sodico, metabisulfito sodico, sulfito sodico y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA, de butylated hydroxyanisole) hidroxitolueno butilado (BHT, de butylated hydroxytoluene), lecitina, galato de propilo, alfa tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como acido cftrico, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico, y similares. Los agentes de recubrimiento para comprimidos, capsulas; pfldoras y similares, incluyen los usados para recubrimientos entericos, tales como ftalato acetato de celulosa (FAC), ftalato acetato de polivinilo (PVAP, de polyvinyl acetate phthalate), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, copolfmeros de acido metacnlico -esteres de acido metacnlico, trimelitato de acetato de celulosa (TAC), carboximetiletilcelulosa (CMEC), succinato acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS, de hydroxypropyl metil cellulose acetate succinate), y similares.
Si se desea, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion tambien pueden formularse para proporcionar la liberacion lenta o controlada del agente activo usando, a modo de ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables; u otras matrices de polfmero, liposomas y/o microesferas.
Ademas, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden formularse de modo que liberen unicamente el agente activo, o preferentemente, en una porcion determinada del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Ejemplos de composiciones de inclusion que pueden usarse incluyen sustancias polimericas y ceras. Si fuese apropiado, el agente activo tambien puede estar en forma microencapsulada, con uno o mas de los excipientes descritos anteriormente.
Las formas lfquidas de dosificacion adecuadas para la administracion oral incluyen, a modo de ilustracion, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Dichas formas de dosificacion lfquida comprenden tipicamente el agente activo y un diluyente inerte, tal como, por ejemplo, agua y otros disolventes, agentes solubilizadores y emulsionantes. tales como alcohol etflico alcohol isopropflico, carbonato de etilo, acetato de etilo alcohol bendlico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (esp., aceites de semilla de algodon, cacahuete, mafz, germen, oliva, castor y sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofunlico, polietilenglicoles y esteres de acido graso de sorbitano, y mezclas de los mismos. Las suspensiones, ademas del principio activo, pueden contener agentes suspensores tales como, por ejemplo, alcoholes isosteanlicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y esteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
Cuando se planean para la administracion oral, las composiciones farmaceuticas de esta invencion se envasan preferentemente en una forma de dosificacion unitaria. La expresion "forma de dosificacion unitaria" significa una unidad ffsicamente discreta adecuada para dosificar en un paciente, es decir, cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de agente activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado, bien sola o bien en combinacion con una o mas unidades adicionales. Por ejemplo, dichas formas de dosificacion unitaria pueden ser capsulas, comprimidos, pfldoras, y similares.
El compuesto de esta invencion tambien pueden administrarse por via transdermica usando sistemas y excipientes conocidos de liberacion transdermica. Por ejemplo, un compuesto de esta invencion puede mezclarse con potenciadores de la permeacion, tales como polietilenglicol, monolaurato de polietilenglicol, azacicloalcan-2-onas y similares, e incorporarse en un parche o un sistema de liberacion similar. Si se desea, pueden usarse en dichas composiciones transdermicas excipientes adicionales incluyendo agentes gelificantes, emulsionantes y tampones.
Las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden contener tambien otros agentes terapeuticos que se coadministran con el compuesto de la invencion, o una sal o solvato o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden comprender ademas uno o mas agentes terapeuticos seleccionados de entro otros broncodilatadores (p. ej., inhibidores de la FDE3, moduladores de adenosina 2b y agonistas del receptor p2 adrenergico); agentes antiinflamatorios (p. ej., agentes antiinflamatorios esteroideos, tales como corticosteroides; agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE), e inhibidores de la FDE4); otros antagonistas del receptor muscannico (es decir, agentes anticolinergicos); agentes antiinfecciosos (p. ej., antibioticos para grampositivos y gramnegativos o antivirales); antihistammicos; inhibidores de la proteasa; y bloqueantes aferentes (p. ej., agonistas de D2y moduladores de neurocinina). Los otros agentes terapeuticos pueden usarse en forma de sales o solvatos farmaceuticamente aceptables. Ademas, si fuese apropiado, los otros agentes terapeuticos pueden usarse como estereoisomeros opticamente puros.
Agonistas representativos del receptor p2 adrenergico que pueden usarse en combinacion con, y ademas de, el compuesto de esta invencion incluyen, pero no se limitan a, salmeterol, salbutamol, formoterol, salmefamol, fenoterol, terbutalina, albuterol, isoetarina, metaproterenol, bitolterol, pirbuterol, levalbuterol y similares, o sales farmaceuticamente aceptable de los mismos. Otros agonistas del receptor p2 adrenergico que pueden usarse en
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combinacion con el compuesto de esta invencion incluyen, pero no se limitan a,

3-(4-{[6-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)-fenil]etil}amino)-hexil]oxi}butil)bencenosulfonamida y

3-(-3-{[7-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}-amino)heptil]oxi}-propil)bencenosulfonamida y
compuestos relacionados desvelados en el documento WO 02/066422, publicado el 29 de agosto de 2002; 3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}amino)hexil]oxi}butil)-fenil]imidazolidin-2,4-diona y
compuestos relacionados desvelados en el documento WO 02/070490, publicado el 12 de septiembre de 2002; 3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, 3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, 3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida,
W-(ferf-butil)-3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]-oxi}butil)bencenosulfonamida, W-(^ferf-butil)-3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)-hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, W-(^ferf-butil)-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]-oxi}butil)bencenosulfonamida y compuestos relacionados desvelados en el documento WO 02/076933, publicado el 3 de octubre de 2002; 4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6-diclorobencil)oxi]etoxi}hexil)amino]-1-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol y compuestos relacionados desvelados en el documento WO 03/024439, publicado el 27 de marzo de 2003; y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Cuando se emplee, el agonista del adrenorreceptor p2 estara presente en la composicion farmaceutica en una cantidad terapeuticamente eficaz. Tfpicamente, el agonista del adrenorreceptor p2 estara presente en una cantidad suficiente para proporcionar desde alrededor de 0,05 |jg hasta alrededor de 500 |jg por dosis.
Agentes antiinflamatorios esteroideos representativos que pueden usarse en combinacion con el compuesto de esta invencion incluyen, pero no se limitan a, metilprednisolona prednisolona, dexametasona, propionato de fluticasona, ester S-fluorometilico de acido 6,9-difluoro-17-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11-hidroxi-l6-metil-3-oxoandrosta -1,4-dien-17-carbotioico, ester S-(2-oxo-tetrahidrofuran-3S4lico de acido 6,9-difluoro-11-hidroxi-16
-metil-3-oxo-17-propioniloxi-androsta-1,4-dien-17-carbotioico, esteres de beclometasona (por ejemplo, el ester de 17-propionato o el ester de 17,21-dipropionato), budesonida, flunisolida, esteres de mometasona (p. ej., el ester furoato), acetonida de triamcinolona, rofleponida, ciclesonida, propionato de butixocort, RPR-106541, ST-126 y similares, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Cuando se emplee, el agente antiinflamatorio esteroideo estara presente en la composicion farmaceutica en una cantidad terapeuticamente eficaz. Tfpicamente, el agente antiinflamatorio esteroideo estara presente en una cantidad suficiente para proporcionar desde alrededor de 0,05 jg hasta alrededor de 500 jg por dosis.
Otras combinaciones apropiadas incluyen, por ejemplo, otros agentes antiinflamatorios, p. ej., AINE (tales como cromoglicato sodico; nedocromil sodico, inhibidores de la fosfodiesterasa (FDE) (por ejemplo, inhibidores de la FDE4 o inhibidores mixtos de FDE3/FDE4), antagonistas de leucotrienos (p. ej., montelukast); inhibidores de la smtesis de leucotrienos; inhibidores de iNOS, inhibidores de la proteasa, tales como inhibidores de triptasa y elastasa, antagonistas de integrina beta-2 y agonistas o antagonistas del receptor de adenosina (p. ej., agonistas de adenosina 2a), agonistas de citocinas (p. ej., antagonistas de quimiocinas tales como, un anticuerpo de interleucina (anticuerpo IL), espedficamente, una terapia de IL-4, una terapia de IL-13, o una combinacion de las mismas); inhibidores de la smtesis de citocinas.
Por ejemplo, los inhibidores de la fosfodiesterasa 4 (FDE4) o inhibidores mixtos de FDE3/FDE4 representativos que pueden usarse en combinacion con el compuesto de esta invencion incluyen, pero no se limitan a acido c/s-4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1-carboxflico, 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4- difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ona; c/s-[4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ol]; acido c/s-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]ciclohexan-1-carboxflico y similares, o sales farmaceuticamente aceptable de los mismos. Otros inhibidores de la FDE4 o inhibidores mixtos de FDE3/FDE4 incluyen AWD-12-281 (elbion); NCS-613 (INSERM); D-4418 (Chiroscience y Schering-Plough; CI-1018 o PD-168787 (Pfizer); compuestos de benzodioxol desvelados en el documento WO99/16766 (Kyowa Hakko); K-34 (Kyowa Hakko); V-11294a (Napp); roflumilast (Byk-Gulden); compuestos de ftalacinona desvelados en el documento WO99/47505 (Byk-Gulden); Pumafentrina (Byk-Gulden, actualmente Altana); arofilina (Almirall-Prodesfarma); VM554/UM565 (Vernalis); T-440 (Tanabe Seiyaku); y T2585 (Tanabe Seiyaku).
Antagonistas muscarmicos representativos (es decir, agentes anticolinergicos) que pueden usarse en combinacion con, y ademas de, el compuesto de esta invencion incluyen, pero no se limitan a, atropina, sulfato de atropina, oxido de atropina, nitrato de metilatropina, bromhidrato de homatropina, hiosciamina (d, l) bromhidrato, bromhidrato de escopolamina, bromuro de ipratropio. bromuro de oxitropio, bromuro de tiotropio, metantelina, bromuro de propantelina, metilbromuro de anisotropina, bromuro de clidinio, copirrolato (Robinul), yoduro de isopropamida, bromuro de mepenzolato, cloruro de tridihexetilo (Pathilone), metilsulfato de hexociclio, clorhidrato de ciclopentolato, tropicamida, clorhidrato de trihexifenidilo, pirenzepina, telenzepina, AF-DX 116 y metoctramina y similares, o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos. o para aquellos compuestos enumerados como una sal, una sal alternativa farmaceuticamente aceptable de los mismos.
Antagonistas muscarmicos representativos (es decir, antagonistas del receptor H1 que pueden usarse en combinacion con el compuesto de esta invencion incluyen, pero no se limitan a, etanolaminas, tales como maleato de carbinoxamina, fumarato de clemastina, dimenhidrato y clorhidrato de difenilhidramina; etilendiaminas, tales como maleato de pirilamina, clorhidrato de tripelenamina y citrato de tripelenamina; alquilaminas, tales como clorfeniramina y
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acrivastina piperazinas, tales como clorhidrato de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, clorhidrato de ciclizina, lactato de ciclizina, clorhidrato de meclizina y clorhidrato de cetirizina; piperidinas, tales como astemizol, clorhidrato de levocabastina, loratadina o su analogo descarboetoxi, clorhidrato de tarfenadina y fexofenadina; clorhidrato de azelastina; y similares, o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos; o, para aquellos compuestos enumerados como una sal, una sal alternativa farmaceuticamente aceptable de los mismos.
Las dosis adecuadas para los otros agentes terapeuticos administrados en combinacion con el compuesto de la invencion estan en el intervalo de alrededor de 0,05 g/dfa a alrededor de 100 mg/dfa.
Las siguientes formulaciones ilustran composiciones farmaceuticas representativas de la presente invencion:
Ejemplo de formulacion A
Se prepara un polvo seco para su administracion mediante inhalacion de la forma siguiente:
Ingredientes Cantidad
Compuesto de la invencion 0,2 mg Lactosa 25 mg
Procedimiento representativo: El compuesto de la invencion se microniza y despues se mezcla con lactosa. Esta combinacion mezclada se carga despues en un cartucho de inhalacion de gelatina. El contenido del cartucho se administra usando un inhalador de polvo.
Ejemplo de formulacion B
Se prepara una formulacion en polvo seco para su uso en un dispositivo de inhalacion de polvo seco de la forma siguiente:
Procedimiento representativo: Se prepara una composicion farmaceutica que tiene una proporcion de volumen de formulacion de compuesto micronizado de la invencion a lactosa de 1:200. La composicion se envasa en un dispositivo de inhalacion de polvo seco capaz de dispensar entre alrededor de 10 jg y alrededor de 100 |jg del compuesto de la invencion por dosis.
Ejemplo de formulacion C
Se prepara un polvo seco para su administracion mediante inhalacion en un inhalador de dosis medida de la forma siguiente:
Procedimiento representativo: Se prepara una suspension que contiene un 5 % en peso de un compuesto de la invencion y 0,1 % en peso de lecitina mediante dispersion de 10 g del compuesto de la invencion como partfculas micronizadas con un tamano medio menor de 10 jm en una solucion formada a partir de 0,2 g de lecitina disuelta en 200 ml de agua desmineralizada. La suspension se deshidrata por pulverizacion y el material resultante se microniza en partfculas que tienen un diametro medio menor de 1,5 jm. Las partfculas se cargan en cartuchos con 1,1,1,2-tetrafluoroetano a presion.
Ejemplo de formulacion D
Se prepara una composicion farmaceutica para su uso en un inhalador de dosis medida de la forma siguiente:
Procedimiento representativo: Se prepara una suspension que contiene un 5 % del compuesto de la invencion, un 0,5 % de lecitina, y un 0,5 % de trehalosa mediante dispersion de 5 g del ingrediente activo como partfculas micronizadas con un tamano medio menor de 10 jm en una solucion coloidal formada a partir de 0,5 g de trehalosa y 0,5 g de lecitina disueltos en in 100 ml de agua desmineralizada. La suspension se deshidrata por pulverizacion y el material resultante se microniza en partfculas que tienen un diametro medio menor de 1,5 jm. Las partfculas se cargan en envases con 1,1,1,2-tetrafluoroetano a presion.
Ejemplo de formulacion E
Se prepara una composicion farmaceutica para su uso en un inhalador nebulizador de la forma siguiente:
Procedimiento representativo: Se prepara una formulacion en aerosol para su uso en un nebulizador mediante la disolucion de 0,1 mg del compuesto de la invencion en 1 ml de una solucion de cloruro sodico al 0,9 % acidificada con acido cftrico. La mezcla se agita y se somete a ultrasonido hasta que el agente activo se disuelva. El pH de la solucion se ajusta a un valor en el intervalo desde 3 hasta 8 mediante la adicion lenta de NaOH.
Ejemplo de formulacion F
Se preparan capsulas duras para su administracion oral de la forma siguiente:
Ingredientes
Cantidad
Compuesto de la invencion
250 mg
Lactosa (deshidratada por pulverizacion)
200 mg
Estearato de magnesio
10 mg
Procedimiento representativo: Los ingredientes se mezclan completamente y despues se cargan dentro de una 5 capsula dura de gelatina (460 mg de composicion por capsula).
Ejemplo de formulacion G
Se prepara una suspension para su administracion oral de la forma siguiente:
Ingredientes
Cantidad
Compuesto de la invencion
1,0 g
Acido fumarico,
0,5 g
Cloruro sodico,
2,0 g
Metilparabeno
0,15 g
Popilparabeno
0,05 g
Azucar granulado
25,5 g
Sorbitol (solucion al 70 %)
12,85 g
Veegum k (Vanderbilt Co.)
1,0 g
Saborizante
0,035 ml
Colorantes
0,5 mg
Agua destilada
c.s. hasta 100 ml
Procedimiento representativo: Los ingredientes se mezclan para formar una suspension que contiene 100 mg de 10 agente activo por 10 ml de suspension.
Ejemplo de formulacion H
Se prepara una formulacion inyectable de la forma siguiente:
Ingredientes
Cantidad,
Compuesto de la invencion
0,2 g
Tampon acetato sodico (0,4 M)
2,0 ml,
HCl (0,5 N) o NaOH (0,5 N)
c.s. hasta pH 4
Agua (destilada esteril)
c.s. hasta 20 ml
Procedimiento representativo: Los ingredientes anteriores se mezclan y el pH se ajusta a 4 ± 0,5 usando HCl 0,5 N o 15 NaOH 0,5 N.
Utilidad
El derivado de bifenilo de esta invencion posee tanto actividad agonista del receptor p2 adrenergico como actividad antagonista del receptor muscarmico, dicho compuesto es util para tratar afecciones clmicas mediadas por receptores p2 adrenergicos o receptores muscarmicos, es decir, afecciones clmicas que mejoran mediante el tratamiento con un 20 agonista del receptor p2 adrenergico o un antagonista del receptor muscarmico. Dichas afecciones clmicas incluyen, a modo de ejemplo, trastornos pulmonares o enfermedades asociadas con obstruccion reversible de las vfas respiratorias, tales como enfermedad pulmonar obstructiva cronica (p. ej., bronquitis cronica y sibilante y enfisema), asma, fibrosis pulmonar y similares Otras afecciones que pueden tratarse incluyen parto prematuro, depresion, insuficiencia cardfaca congestiva, enfermedades dermatologicas (p. ej., enfermedades dermatologicas inflamatorias, 25 alergicas, psoriasicas y proliferativas, afecciones en las que sea deseable reducir la acidez peptica (p. ej., ulcera peptica y gastrica) y atrofia muscular.
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Por consiguiente, en una realizacion, esta invencion se dirige al compuesto de la invencion para su uso en un procedimiento para tratar un trastorno pulmonar, comprendiendo el procedimiento la administracion a un paciente con necesidad de tratamiento de una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion o de una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Cuando se use para tratar un trastorno pulmonar, el compuesto de esta invencion se administraran tfpicamente mediante inhalacion en dosis multiples por dfa, en una dosis individual diaria o en una dosis individual semanal. En general, la dosis para tratar un trastorno pulmonar oscilara desde alrededor de 10 jgMa hasta alrededor de 200 jgMa.
Cuando se administra mediante inhalacion, el compuesto de esta invencion tiene tfpicamente el efecto de proporcionar broncodilatacion. Por consiguiente, en otro de sus aspectos, esta invencion se dirige al compuesto de la invencion para su uso en un procedimiento para proporcionar broncodilatacion en un paciente, comprendiendo el procedimiento la administracion a un paciente que requiere broncodilatacion de una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. En general, la dosis para proporcionar broncodilatacion oscilara desde alrededor de 10 jg/dfa hasta alrededor de 200 jg/dfa.
En una realizacion, esta invencion se dirige al compuesto de la invencion para su uso en un procedimiento para tratar la enfermedad pulmonar obstructiva cronica o el asma, comprendiendo el procedimiento la administracion a un paciente con necesidad de tratamiento de una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion o a una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Cuando se usen para tratar la EPOC o el asma, los compuestos de esta invencion se administraran tfpicamente mediante inhalacion en dosis multiples por dfa o en una dosis individual diaria. En general, la dosis para tratar la EPOC o el asma oscilara desde alrededor de 10 jg/dfa hasta alrededor de 200 jg/dfa.
Tal como se usa en el presente documento, la EPOC incluye bronquitis obstructiva cronica y enfisema (vease, por ejemplo, Barnes, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, N Engl J Med 2000: 343:269-78).
Cuando se usan para tratar un trastorno pulmonar, el compuesto de esta invencion se administra opcionalmente en combinacion con otros agentes terapeuticos. En particular, mediante la combinacion de los compuestos de esta invencion con un agente antiinflamatorio esteroideo (p. ej., un corticosteroide), las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden proporcionar triple terapia, es decir, agonista del receptor p2 adrenergico, antagonista del receptor muscarmico y actividad antiinflamatoria, usando unicamente dos componentes activos. Dado que las composiciones farmaceuticas que contienen dos componentes activos son tfpicamente mas faciles de formular en comparacion con las composiciones que contienen tres componentes activos, dichas composiciones de dos componentes proporcionan una ventaja sobre las composiciones que contienen tres componentes activos. Por consiguiente, en una realizacion particular, las composiciones farmaceuticas y los procedimientos de esta invencion comprenden ademas una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente antiinflamatorio esteroideo.
El compuesto de esta invencion presenta actividad, tanto antagonista del receptor muscarmico como agonista del receptor p2 adrenergico. Por consiguiente, Entre otras propiedades, los compuestos de particular interes son aquellos que demuestran un valor inhibitorio de la constante K para la union al receptor muscarmico M3 y un valor de EC50 para la actividad agonista del receptor p2 adrenergico de menos de alrededor de 100 nM; concretamente, menos de 10 nM. Entre estos compuestos, los compuestos de especial interes incluyen los que tienen actividad muscarmica, expresada en cuanto a la constante de inhibicion Ki para la union al receptor muscarmico M3, que equivale aproximadamente a la actividad agonista del receptor p2 adrenergico del compuesto, expresada en cuanto a la mitad de la concentracion maxima eficaz EC50, determinada en los ensayos in vitro descritos en el presente documento, o en ensayos similares. Por ejemplo, son compuestos de particular interes los que tienen una proporcion de la constante de inhibicion Ki para el receptor muscarmico M3 con respecto a la EC50 para el receptor p2 adrenergico que oscila desde alrededor de 30:1 hasta alrededor de 1:30; incluyendo alrededor de 20:1 hasta alrededor de 1:20; tal como alrededor de 10:1 hasta alrededor de 1:10.
En uno de sus aspectos, la presente invencion tambien proporciona el compuesto de la invencion para su uso en un procedimiento para el tratamiento de un trastorno pulmonar, comprendiendo el procedimiento la administracion a un paciente con necesidad de tratamiento de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto que tiene actividad, tanto antagonista del receptor muscarmico como agonista del receptor p2 adrenergico. En una realizacion particular de este procedimiento, el compuesto administrado tiene una constante de inhibicion Ki para el receptor muscarmico M3 que es menor de alrededor de 100 nM y una mitad de concentracion maxima eficaz EC50 para la actividad agonista del receptor p2 adrenergico que es menor de alrededor de 100 nM. En otra realizacion, el procedimiento para tratar un trastorno pulmonar comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto para el cual la proporcion de la constante de inhibicion Ki para el receptor muscarmico M3 con respecto a la EC50 para la actividad agonista del receptor p2 adrenergico que esta entre alrededor de 30:1 y alrededor de 1:30.
Dado que el compuesto de esta invencion posee tanto actividad agonista p2 adrenergica como actividad antagonista del receptor muscarmico, dicho compuesto tambien es util como una herramienta para la investigacion o el estudio de sistemas o muestras biologicos que tienen receptores p2 adrenergicos o receptores muscarmicos, o para el descubrimiento de nuevos compuestos que tengan tanto actividad agonista del receptor p2 adrenergico como actividad antagonista del receptor muscarmico. Dichos sistemas o muestras biologicos pueden comprender receptores p2 adrenergicos y/o receptores muscarmicos. Cualquier sistema o muestra biologica adecuada que tenga receptores p2
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adrenergicos y/o receptores muscarmicos pueden emplearse en dichos estudios, los cuales pueden llevarse a cabo, bien in vitro o bien in vivo. Los sistemas o muestras biologicos representativos adecuados para dichos estudios incluyen, pero no se limitan a, celulas, extractos celulares, membranas plasmaticas, muestras de tejido, mairnferos (tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, perros, cerdos, etc.), y similares.
En esta realizacion, se pone en contacto un sistema o muestra biologica que comprende un receptor p2 adrenergico o un receptor muscarmico con una cantidad agonista de receptor p2 adrenergico o agonista del receptor muscarmico del compuesto de esta invencion. Los efectos se determinan despues usando procedimientos y equipos convencionales, tales como ensayos de union de radioligando y ensayos funcionales. Dichos ensayos funcionales incluyen cambios mediados por ligando en el de adenosina monofosfato dclico intracelular (AMPc), cambios mediados por ligando en la actividad de la enzima adenilil ciclasa (que sintetiza AMPc), cambios mediados por ligando en la incorporacion de guanosina 5'-O-(-tio)trifosfato ([35S]GTP S) dentro de membranas aisladas por medio del intercambio de [35S]GTP S por GDP catalizado por receptor, cambios mediados por ligando en los iones de calcio intracelular libre (determinados, por ejemplo, con un lector de placas de fluorescencia ligada a imagen o FLIPR® (de fluorescence-linked imaging plate reader) de Molecular Devices, Inc.). El compuesto de esta invencion agonizara o causara la activacion de un receptor p2 adrenergico y antagonizara o reducira la activacion de los receptores muscarmicos en cualquiera de los ensayos funcionales enumerados anteriormente, o los ensayos de naturaleza similar. La cantidad de compuesto usado en estos estudios oscilara tfpicamente desde alrededor de 0,1 nanomolar hasta alrededor de 100 nanomolar.
Ademas, los compuestos de esta invencion pueden usarse como una herramienta de investigacion para el descubrimiento de nuevos compuestos que tengan tanto actividad agonista del receptor p2 adrenergico como actividad antagonista del receptor muscarmico. En esta realizacion, los datos de union a un receptor p2 adrenergico y de union a un receptor muscarmico (por ejemplo, determinados mediante ensayos in vitro de desplazamiento de radioligando) para un compuesto de analisis o un grupo de compuestos de analisis se comparan con los datos de union al receptor p2 adrenergico y al receptor muscarmico para el compuesto de esta invencion para identificar aquellos compuestos de analisis que tengan una union aproximadamente equivalente o superior al receptor p2 adrenergico y/o al receptor muscarmico, en caso de haberlas. Este aspecto de la invencion incluye, como realizaciones separadas, tanto la generacion de datos de comparacion (usando los ensayos apropiados) como el analisis de los datos del ensayo para identificar compuestos de analisis de interes.
Las propiedades y utilidad del compuesto de esta invencion pueden demostrarse usando diversos ensayos in vitro e in vivo bien conocidos para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se describen ensayos representativos con mas detalle en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Las siguientes Preparaciones y Ejemplos se proporcionan para ilustrar realizaciones espedficas de esta invencion.
Las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados a menos que se indique otra cosa y cualquier otra abreviatura usadas en el presente documento y no definida tienen su significado convencional:
AC adenilil ciclasa
Ach acetilcolina
ATCC Coleccion de cultivos tipo americano
BSA albumina de suero bovino
AMPc monofosfato de 3'-5'adenosina dclica
CHO Ovario de hamster chino
cM5 receptor M5 de chimpance clonado
DCM diclorometano (es decir, cloruro de metileno)
DIPEA W,W-diisopropiletilamina
dPBS solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco
DMEM medio de Eagle modificado por Dulbecco
DMSO dimetilsulfoxido
EDTA acido etilendiaminatetraacetico
Emax maxima eficacia
EtOAc acetato de etilo
EtOH etanol
FBS suero bovino fetal
FLIPR lector de placas de imagenes fluorometrico
Gly glicina
hAtU hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazoM-il-W,A/,W,W-tetrametiluronio
HBSS solucion salina tamponada de Hank
HEK celulas de rinon de embriones de seres humanos
HEPES acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfonico
hMi receptor Mi de ser humano clonado
hM2 receptor M2 de ser humano clonado
hM3 receptor M3 de ser humano clonado
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hM4 receptor M4 de ser humano clonado
hMs receptor M5 de ser humano clonado
HPLC cromatograffa ftquida de alto rendimiento
IBMX 3-isobutiI-1-metiIxanthina
%Eff % de eficacia
PBS solucion salina tamponada con fosfato
PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitripirrolidinofosfonio
rpm rotaciones por minuto
TFA acido trifluoroacetico
THF tetrahidrofurano
Tris tris(hidroximetil)aminometano
A menos que se indique otra cosa, reactivos, materiales de partida y disolventes se compraron de proveedores comerciales (tal como Aldrich, Fluka, Sigma y similares) y se usaron sin purificacion adicional.
En los ejemplos descritos a continuacion, el analisis por HPLC se realizo usando un Agilent (Palo Alto, CA) Series 1100 instrument con columnas Zorbax Bonus RP 2,1 x 50 mm, suministradas por Agilent, (una columna C14), que tienen un tamano de partfcula de 3,5 micrometros. La deteccion fue por absorbancia de UV a 214 nm. Se obtuvieron datos HPLC 10-70 con un caudal de 0,5 ml/minuto de B al 10 %-70 % durante 6 minutos. La fase movil A fue del 2 % - 98 % - ACN al 0,1 %-H2O-TFA; y la fase movil B fue del 90 % - 10 % - ACN al 0,1 %-H2O-TFA. Usando las fases moviles Ay B descritas anteriormente, se obtuvieron datos HPLC 5-35 y datos HPLC 10-90 data con un gradiente de 5 minutos.
Se obtuvieron datos por cromatograffa ftquida de espectrometna de masas (CLEM) obtuvieron con un Applied Biosystems (Foster City, CA) model API-150EX instrument. Se obtuvieron datos CLEM 10-90 con una fase movil B del 10 % - 90 % durante un gradiente de 5 minutos.
La purificacion a pequena escala se realizo usando un sistema API 150EX Prep Workstation de Applied Biosystems. La fase movil fue A: agua+ 0,05 % v/v TFA; y B: acetonitrilo + 0,05 % v/v TFA. Para las matrices (normalmente se recuperan aproximadamente de 3 a 50 mg del tamano de la muestra) se usaron las siguientes condiciones: 20 ml/min caudal; gradientes de 15 min y una columna de 20 mm x 50 mm Prism RP con partfculas de 5 micrometres (Thermo Hypersil-Keystone, Bellefonte, PA). Para purificaciones a gran escala (normalmente mayor que 100 mg de muestra en bruto), se usaron las siguientes condiciones: 60 ml/min caudal; gradientes de 30 min y una columna de 41,4 mm x 250 mm Microsorb BDS con partreulas de 10 micrometros (Varian, Palo Alto, CA).
La rotacion espedfica para compuestos quirales (indicado como [a]20D) se midio usando un polanmetro Jasco (Model P-1010) con una fuente de luz halogena de tungsteno y un filtro de 589 nm a 20 °C. Las muestras de los compuestos de ensayo normalmente se midieron a 1 mg/ml de agua.
Preparacion 1
W-1,1'-Bifeml-2-M-W-4-(1-bencM)piperidmNurea
Se disolvio bifenil-2-isocianato (50 g, 256 mmol) en acetonitrilo (400 ml) a temperatura ambiente. Despues de enfriar a 0 °C, se anadio una solucion de 4-amino-W-bencilpiperidina (48,8 g, 256 mmol) en acetonitrilo (400 ml) durante 5 min Inmediatamente se observo un precipitado. Despues de 15 min, se anadio acetonitrilo (600 ml), y la mezcla viscosa resultante se agito durante 12 h a 35 °C. Despues, los solidos se retiraron por filtracion y se lavaron con acetonitrilo frre, despues se secaron al vacfo, produciendo el compuesto del tftulo (100 g, rendimiento del 98 %). EM m/z: [M + H+] calc. para C25H27N3O 386,22; encontrado 386,3.
Preparacion 2
W-1,1'-Bifeml-2-M-W-4-piperidmNurea
El producto de la Preparacion 1 (20 g, 52 mmol) se disolvio en una mezcla de metanol anhidro y DMF anhidra (3:1,800 ml). Se anadio acido clorhftdrico acuoso (0,75 ml de una solucion conc. al 37 %, 7,6 mmol) y se burbujeo gas nitrogeno a traves de la solucion vigorosamente durante 20 min Se anadio un catalizador de Pearlman (Pd(OH)2, 5 g) en una corriente de nitrogeno, antes de colocar la mezcla de reaccion en una atmosfera de hidrogeno (globo). La mezcla de reaccion se dejo en agitacion durante 4 dfas y despues se paso dos veces a traves de lechos de Celite para retirar el catalizador. Despues, el disolvente se retiro a presion reducida para producir el compuesto del tftulo (13 g, rendimiento del 85 %). eM m/z: [M + H+] calc. para C18H21N3O 296,17; encontrado 296,0.
Como alternativa, se sintetizo W-1,1’-bifenil-2-il-W-4-piperidinilurea calentando juntos bifenil-2-isocianato (50 g, 256 mmol) y 4-amino-W-bencilpiperidina (51,1 g, 269 mmol) a 70 °C durante 12 h (la reaccion se controlo por CLEM). La mezcla de reaccion se enfrio a 50 °C y se anadio etanol (500 ml), seguido de adicion lenta de acido clorhfdrico 6 M (95 ml). La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente. Se anadio formiato de amonio (48,4 g, 768 mmol) a la mezcla de reaccion y se burbujeo vigorosamente gas nitrogeno a traves de la solucion durante 20 min, antes de anadir paladio (al 10 % en peso (base seca) sobre carbono activado) (10 g). La mezcla de reaccion se calento a 40 °C durante 12 h, y despues se filtro a traves de una capa de Celite y el disolvente se retiro a presion reducida. Al residuo
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en bruto se le anadio acido clorhndrico 1 M (20 ml) y se anadio hidroxido sodico 10 N para ajustar el pH a 12. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 80 ml), se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido (71,7 g, rendimiento del 95 %). EM m/z: [M + H+] calc. para C18H21N3O 296,17; encontrado 296,0.
Preparacion 3
W-1,1'-Bifeml-2-M-W-4-[1-(9-hidroxmoml)]piperidmNurea
Se anadio 9-bromo-1-nonanol (4,84 g, 21,7 mmol) a una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 2 (5,8 g, 19,7 mmol) y diisopropiletilamina (10,29 ml, 59,1 mmol) en acetonitrilo (99 ml) a 50 °C. La mezcla de reaccion se calento a 50 °C durante 8 h. Despues, la mezcla de reaccion se dejo enfriar y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo se disolvio en diclorometano (100 ml), se lavo con bicarbonato sodico acuoso saturado (2 x 50 ml)y se seco (sulfato de magnesio). El disolvente se retiro a presion reducida. El producto en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (sistema diclorometano:metanol:amoniaco) para producir el compuesto del tftulo (7,1 g, 16,2 mmol, rendimiento del 82 %).
Preparacion 4
W-1,1'-Bifeml-2-M-W-4-[1-(9-oxonoml)]piperidmNurea
Se anadio dimetilsulfoxido (490 pl, 6,9 mmol), seguido de diisopropiletilamina (324 pl 3,45 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 3 (500 mg, 1,15 mmol) en diclorometano (11,5 ml) a -10 °C en una atmosfera de nitrogeno. La mezcla de reaccion se agito a -15 °C durante 15 min, y despues se anadio en porciones un complejo trioxido de azufre-piridina (549 mg, 3,45 mmol). La mezcla de reaccion se agito a -15 °C durante 1 h, y despues se anadio agua (10 ml). Despues, se separo la fase organica, se lavo con agua (10 ml) y se seco (sulfato sodico). El disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (475 mg, 1,09 mmol, rendimiento del 95 %). HPLC (10-70) Tr = 3,39.
Preparacion 5
W-1,1'-Bifeml-2-M-W-4-[1-(9-ammonoml)]piperidmMurea
Se anadio paladio (10 % en peso (base seca) sobre carbono activado) (1,5 g) a una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 4 (1,58 g, 3,63 mmol) y bencilamina (516 pl, 4,72 mmol) en metanol (36,3 ml). La mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno. Despues de agitar durante 12 h, la mezcla de reaccion se filtro a traves de una capa de Celite y se lavo con metanol (10 ml). El disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (1,50 g, 3,45 mmol, rendimiento del 95 %). HPLC (10-70) Tr = 2,35; EM m/z: [M + H+] calc. para C27H40N4O1 437,06; encontrado 437,5.
Preparacion 6
8-Benciloxi-5-(2,2-dihidroxiacetil)-1H-quinolin-2-ona
(a) 8-Acetoxi-1H-quinolin-2-ona
Se calentaron 8-hidroxiquinolina-A/-oxido (160,0 g, 1,0 mol), disponible en el mercado de Aldrich, Milwaukee, WI, y acetico anhftdrido (800 ml, 8,4 mol) a 100 °C durante 3 h y despues se enfrio en hielo. El producto se recogio en un embudo Buchner, se lavo con acetico anhfdrido (2 x 100 ml) y se seco a presion reducida para dar 8-acetoxi-1H- quinolin-2-ona (144 g) en forma de un solido.
(b) 5-Acetil-8-hidroxi-1H-qumolm-2-ona
Una suspension de cloruro de aluminio (85,7 g, 640 mmol) en 1,2-dicloroetano (280 ml) se enfrio en hielo, y se anadio el producto de la etapa (a) (56,8 g, 280 mmol). La mezcla se calento a temperatura ambiente y despues se calento a 85 °C. Despues de 30 min, se anadio cloruro de acetilo (1,5 ml, 21 mmol) y la mezcla se calento 60 min adicionales. Despues, la mezcla de reaccion se enfrio y se anadio a acido clorhfdrico 1 N (3 l) a 0 °C con buena agitacion. Despues de agitar durante 2 h, los solidos se recogieron en un embudo Buchner, se lavo con agua (3 x 250 ml) y se seco a presion reducida. El producto en bruto se aislo a partir de varios lotes (135 g) se combino y se trituro con diclorometano (4 l) durante 6 h. El producto se recogio en un embudo Buchner y se seco a presion reducida para dar 5-acetil-8-hidroxi-2(1H)-quinolinona (121 g).
(c) 5-Acetil-8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona
Al producto de la etapa (b) (37,7 g, 186 mmol) se le anadieron W,W-dimetilformamida (200 ml) y carbonato potasico (34,5 g, 250 mmol), seguido de bromuro de bencilo (31,8 g, 186 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2,25 horas y despues se vertio en cloruro sodico saturado (3,5 l) a 0 °C y se agito durante 1 hora. El producto se recogio y se seco en un embudo Buchner durante 1 hora, y los solidos resultantes se disolvieron en diclorometano (2 l) y esta mezcla se seco sobre sulfato sodico. La solucion se filtro a traves de una capa de Celite que se lavo
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despues con diclorometano (5 x 200 ml). Despues, el filtrado combinado se concentro a sequedad y los solidos resultantes se trituraron con eter (500 ml) durante 2 h. El producto se recogio en un embudo Buchner, se lavo con eter (2 x 250 ml) y se seco a presion reducida para dar 5-acetil-8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona (44 g) en forma de un polvo.
(d) 8-BencMoxi-5-(2,2-dihidroxiacetM)-1H-quinoMn-2-ona
A una suspension del producto de la etapa (c) (10,0 g, 34,1 mmol) en DMSO (60 ml) se le anadio una solucion al 48 % de acido bromhffdrico p/p (11,8 ml, 102,3 mmol). La mezcla se calento a 60 °C durante 16 h, despues se dejo enfriar a temperatura ambiente. Se anadio agua (100 ml) y la suspension resultante se agito a temperatura ambiente durante 0,0 h antes de enfriarse a 0 °C. El producto se recogio en un embudo Buchner, despues se seco a presion reducida para dar 8-benciloxi-5-(2,2-dihidroxi-acetil)-1H-quinolin-2-ona (12,2 g) en forma de un solido.
Preparacion 7
1-(1-{9-[2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)2-hidroxietilamino]nonil}piperidin-4-il)-3-bifenil2-ilurea
Los productos de la Preparacion 5 (183 mg, 0,42 mmol) y la Preparacion 6 (149 mg, 0,46 mmol) se agitaron en dicloroetano (4,2 ml) a temperatura ambiente durante 2 h. Despues, se anadio triacetoxiborohidruro sodico (267 mg, 1,26 mmol) y la mezcla de reaccion se agito durante 12 h mas. Despues, la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (10 ml), se lavo con bicarbonato sodico acuoso saturado (10 ml), se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. La mezcla de reaccion bruta se purifico por cromatograffa ultrarrapida (metanol al 5-10 % en diclorometano, hidroxido de amonio al 0,5 %) para dar el compuesto del tftulo (144 mg, 0,20 mmol, rendimiento del 48 %). HPLC (10-70) Tr = 3,48; EM m/z: [M + H+] calc. para C45H55N5O4 730,4; encontrado 730,7.
Ejemplo Comparativo 1
1-Bifenil-2-il-3-(1-{9-[2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-il)urea
Se anadio (10 % en peso (base seca) sobre carbono activado) (63 mg) a una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 7 (144 mg, 0,20 mmol) en metanol (2 ml) y la mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno. Despues de 12 h de agitacion, la mezcla de reaccion se filtro a traves de una capa de Celite, se lavo con metanol (2 ml) y despues el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo resultante se purifico por HPLC preparativa para dar el compuesto del tftulo (10 mg). HPlC (10-70) Tr = 2,8; EM m/z: [M + H+] calc. para C38H49N5O4 640,3; encontrado 640,5.
Preparacion 8
Piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-Ncarbamico
Bifenil-2-isocianato (97,5 g, 521 mmol) y 4-hidroxi-1 -bencilpiperidina (105 g, 549 mmol), ambos disponibles en el mercado de Aldrich, Milwaukee, WI, se calentaron juntos a 70 °C durante 12 h, tiempo durante el cual la formacion de 1-bencilpiperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico se controlo por CLEM. Despues, la mezcla de reaccion se enfrio a 50 °C y se anadio etanol (1 l), y despues se anadio lentamente acido clorhfdrico 6 M (191 ml). Despues, la mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se anadio formiato de amonio (98,5 g, 1,56 mol) y se burbujeo vigorosamente gas nitrogeno a traves de la solucion durante 20 min Despues, se anadio paladio (10 % en peso (base seca) sobre carbono activado) (20 g). La mezcla de reaccion se calento a 40 °C durante 12 h y despues se filtro a traves de una capa de Celite. Despues, el disolvente se retiro a presion reducida y se anadio acido clorhfdrico 1 M (40 ml) al residuo en bruto. Despues, se anadio hidroxido sodico (10 N) para ajustar el pH a 12. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 150 ml) y se seco (sulfato de magnesio), y despues el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (155 g, 100%). HPLC (10-70) Tr = 2,52; EM m/z: [M + H+] calc. para C18H20N2O2 297,15; encontrado 297,3.
Preparacion 9
W,W-(Di-ferc-butoxicarbonM)-9-bromononilamina
Una solucion de di-ferc-butoxicarbonilamina (3,15 g, 14,5 mmol) en W,W-dimetilformamida (0,28 ml) se enfrio a 0 °C durante aproximadamente 10 min Se anadio hidruro sodico, al 60 % en aceite mineral (0,58 g, 14,5 mmol) y la mezcla de reaccion se agito a 0 °C durante 10 min La mezcla de reaccion se retiro del bano de hielo y se dejo calentar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min Despues, la mezcla de reaccion se enfrio de nuevo a 0 °C y se anadio una solucion de 1,9-dibromononano (2,46 ml, 12,1 mmol) en dimetilformamida (100 ml). La mezcla de reaccion se agito durante una noche a temperatura ambiente. Despues de 24 h, el analisis de EM mostro que la reaccion se completo. La mezcla de reaccion se concentro a sequedad y se diluyo con acetato de etilo (100 ml). La fase organica se lavo con bicarbonato sodico saturado (2 x 100 ml), salmuera (100 ml), se seco (sulfato de magnesio) y se concentro a presion reducida para producir el producto en bruto, que se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice usando acetato de etilo al 5 % en hexanos para proporcionar el compuesto del tftulo. EM m/z: [M + H+] calc. para C19H36N-iO4Br 423,18; encontrado 423.
1-(9-Di-ferc-butoxicarbomlammo)noml]piperidm-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una mezcla de 1:1 acetonitrilo y W,W-dimetilformamida (50 ml) se anadio a los productos de la Preparacion 8 (3,0 g, 10,1 mmol) y la Preparacion 9 (5,1 g, 12,2 mmol) y trietilamina (1,42 ml, 10,1 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 5 temperatura ambiente durante 24 h y se controlo por analisis por CLEM. Despues, la mezcla de reaccion se concentro y se diluyo con acetato de etilo (50 ml). La fase organica se lavo con bicarbonato sodico saturado (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml). Despues, la fase organica se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para producir 6,5 g de aceite en bruto. El aceite se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice usando 1:1 de hexanos/acetato de etilo para proporcionar el compuesto del tftulo (3 g). EM m/z: [M + H+] calc. para C37H55N3O6 638,41; encontrado 639.
10 Preparacion 11
1-(9-Aminononil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio acido trifluoroacetico (11 ml) a una solucion del producto de la Preparacion 10 (7,2 g, 11,3 mmol) en diclorometano (56 ml). Despues de 2 h, el analisis por CLEM mostro que la reaccion se completo. Despues, la mezcla de reaccion se concentro a sequedad y se diluyo con acetato de etilo (75 ml). Despues, se anadio hidroxido sodico 15 (1 N) hasta que el pH de la mezcla alcanzo 14. Despues, la fase organica se recogio y se lavo con bicarbonato sodico
saturado (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml). Despues, la fase organica se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo (5,5 g). EM m/z: [M + H+] calc. para C27H39N3O2 438,30; encontrado 439.
Preparacion 12
1-{9-[2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido 20 bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 11 (196 mg, 0,43 mmol) se disolvio en dicloroetano (4 ml) y se anadio triacetoxiborohidruro sodico (101 mg, 0,48 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 min y despues se anadio 8-benciloxi-5-(2,2-dihidroxiacetil)-1H-quinolin-2-ona (Preparacion 6) (141 mg, 0,43 mmol). El analisis por CLEM mostro que la reaccion se completo despues de 2 h. Se anadio metanol 25 (1 ml) a la mezcla de reaccion y despues se anadio lentamente borohidruro sodico (18 mg, 0,48 mmol). Despues de 1
hora, el analisis por CLEM mostro que la reaccion se completo. Despues, la mezcla de reaccion se inactivo con cloruro de amonio acuoso y esta mezcla se extrajo con diclorometano. La fase organica se lavo con bicarbonato sodico saturado (2 x 50 ml) y salmuera (10 ml). Despues, la fase organica se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para proporcionar 315 mg de un solido de color amarillo. El solido se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice 30 usando metanol al 10 % en diclorometano para proporcionar el compuesto del tftulo (64 mg). EM m/z: [M + H+] calc. para C43H55N4O5 730,40; encontrado 731.
Ejemplo Comparativo 2
Ditrifluoroacetato del 1-{9-[2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
35 Una solucion del producto de la Preparacion 12 (64 mg, 0,09 mmol) en metanol (450 ml) se enjuago con nitrogeno. Despues, se anadio paladio sobre carbono (10 %, 10 mg) y la mezcla de reaccion se puso en un globo que contema hidrogeno y se agito. El analisis por CLEM mostro que la reaccion se completo despues de 9 h. Despues, la mezcla de reaccion se filtro y el filtrado se concentro para proporcionar un solido crujiente de color amarillo. El solido se purifico por HPLC preparativa (5-35 durante 60 min) para proporcionar el compuesto del tftulo (19 mg). EM m/z: [M + H+] calc. 40 para C38H48N4O5 641,36; encontrado 641.
Preparacion 13
8-Benciloxi-5-[(R)-2-bromo-1-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]-1H-qumolm-2-ona
(a) 8-Benciloxi-5-(2-Bromoacetil)-1H-qumolm-2-ona
Se disolvio 5-acetil-8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona (Preparacion 6) (20,0 g, 68,2 mmol) en diclorometano (200 ml) y se 45 enfrio a 0 °C. Se anadio dietileterato de trifluoruro de boro (10,4 ml, 82,0 mmol) mediante una jeringa y la mezcla se calento a temperatura ambiente para dar una solucion espesa. La suspension se calento a 45 °C (bano de aceite) y se anadio una solucion de bromo (11,5 g, 72,0 mmol) en diclorometano (100 ml) durante 40 min La mezcla se mantuvo a 45 °C durante 15 min mas y despues se enfrio a temperatura ambiente. La mezcla se concentro a presion reducida y despues se trituro con carbonato sodico acuoso al 10 % (200 ml) durante 1 hora. Los solidos se recogieron en un 50 embudo Buchner, se lavaron con agua (4 x 100 ml) y se secaron a presion reducida. El producto de dos experimentos se combino para la purificacion. El producto en bruto (52 g) se trituro con metanol al 50 % en cloroformo (500 ml) durante 1 hora. El producto se recogio en un embudo Buchner y se lavo con metanol al 50 % en cloroformo (2 x 50 ml) y metanol (2 x 50 ml). El solido se seco a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (34,1 g) en forma de un polvo.
(b) 8-Benciloxi-5-((R)-2-bromo-1-hidroxietil)-1H-quinolin-2-ona
Se combinaron (R)-(+)-a,a-difenilprolinol (30,0 g, 117 mmol) y trimetilboroxina (11,1 ml, 78 mmol) en tolueno (300 ml) y se agito a temperatura ambiente durante 30 min La mezcla se puso en un bano de aceite a 150 °C y el ftquido se retiro por destilacion. Se anadio tolueno en aftcuotas de 20 ml y la destilacion continuo durante 4 h. Se anadieron un 5 total de 300 ml de tolueno. Despues, la mezcla se enfrio a temperatura ambiente. Una aftcuota de 500 pl se evaporo a sequedad y se peso (246 mg) para determinar que la concentracion del catalizador fue 1,8 M.
Se coloco 8-benciloxi 5-(2-bromoacetil)-1H-quinolin-2-ona (90,0 g, 243 mmol) en atmosfera de nitrogeno y se anadio tetrahidrofurano (900 ml) seguido del catalizador descrito anteriormente (1,8 M en tolueno, 15 ml, 27 mmol). La suspension se enfrio a 10±65 °C en un bano de hielo/isopropanol. Se anadio borano (1,0 M en THF, 294 ml, 294 mmol) 10 durante 4 h. Despues, la reaccion se agito 45 min mas a -10 °C y despues se anadio lentamente metanol (250 ml). La mezcla se concentro al vado y el residuo se disolvio en acetonitrilo en ebullicion (1,3 l), se filtro en caliente y despues se enfrio a temperatura ambiente. Los cristales se filtraron, se lavaron con acetonitrilo y se secaron al vado para dar el compuesto del tftulo (72,5 g, 196 mmol, rendimiento del 81 %, 95 % ee, 95 % puro por HPLC).
(c) 8-Benciloxi-5-[(R)-2-bromo-1-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]-1H-qumolm-2-ona
15 Al producto de la etapa (b) (70,2 g, 189 mmol) se le anadio W,W-dimetilformamida (260 ml) y esta mezcla se enfrio en un bano de hielo en atmosfera de nitrogeno. Se anadio 2,6-lutidina (40,3 g, 376 mmol) durante 5 min y despues se anadio lentamente trifluorometanosulfonato de ferc-butildimetilsililo (99,8 g, 378 mmol) manteniendo la temperatura por debajo de 20 °C. La mezcla se dejo calentar a temperatura ambiente durante 45 min Se anadio gota a gota metanol (45 ml) durante 10 min y la mezcla se repartio entre acetato de etilo/ciclohexano(1:1,500 ml) y agua/salmuera 20 (1:1,500 ml). Los extractos organicos se lavaron dos veces mas con agua/salmuera (1:1, 500 ml cada vez). Los
extractos organicos combinados se evaporaron a presion reducida para dar un aceite de color amarillo claro. Se anadieron dos porciones separadas de ciclohexano (400 ml) al aceite y la destilacion continuo hasta que se formo una suspension espesa de color blanca. Se anadio ciclohexano (300 ml) a la suspension y los cristales de color blanco resultantes se filtraron, se lavaron con ciclohexano (300 ml) y se secaron a presion reducida para dar el compuesto del 25 tftulo (75,4 g, 151 mmol, rendimiento del 80 %, 98,6 % ee).
Preparacion 14
1-{9-[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etilammo]noml}piperidm-4- il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 13 (3,9 g, 8,17 mmol) se anadio a una solucion del producto de la Preparacion 11 (5,0 g, 30 11,4 mmol) en THF (20 ml), seguido de bicarbonato sodico (2,0 g, 24,5 mmol) y yoduro sodico (1,8 g, 12,2 mmol). La
mezcla de reaccion se calento a 80 °C durante 72 h. Despues, la mezcla de reaccion se enfrio, se diluyo con diclorometano (20 ml) y la fase organica se lavo con bicarbonato sodico saturado (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml). Despues, la fase organica se seco (sulfato de magnesio) y se concentro para dar 6,5 g de un producto en bruto. El producto en bruto se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice eluyendo con metanol al 3 % en diclorometano para 35 proporcionar el compuesto del tftulo (1,4 g, rendimiento del 21 %).
Preparacion 15.
1-{9-[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio hidrogenofluoruro de trietilamina (376 pl, 2,3 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 14 (1,3 g, 40 1,5 mmol) en THF (8 ml) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente. Despues de 5 h, la reaccion se
completo como se determina por analisis CLEM: despues la mezcla de reaccion se inactivo con NaOH 1 N hasta que el pH fue 14 y despues se diluyo con acetato de etilo (20 ml) y se lavo con NaOH 1 N(20 ml) y salmuera (20 ml). Despues, la fase organica se separo, se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para producir el compuesto del tftulo (1,1 g).
45 Ejemplo Comparativo 3
Ditrifluoroacetato de 1-{19-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidro-quinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin -4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 15 (1,1 g, 1,5 mmol) se enjuago con nitrogeno y se anadio paladio sobre carbono (10 %, 110 mg). La mezcla de reaccion se agito en hidrogeno en un globo de presion. El analisis por CLEM 50 mostro que la reaccion se completo despues de 9 h. Despues, la mezcla de reaccion se filtro y se concentro para producir un solido de color amarillo. El solido se purifico por HPLC preparativa (5-30 durante 60 min) para proporcionar el compuesto del tftulo (510 mg). EM m/z: [M + H+] calc. para C38H48N4O5 641,36; encontrado 641. Procedimiento HPLC 10-70: 3,207. [a]20D = -23,6 (c = 1,0 mg/ml, agua).
Ejemplo Comparativo 3A
Ditrifluoroacetato 1-{9-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidro-quinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Como alternativa, el compuesto del tftulo se prepare como sigue a continuacion:
(a) 9-Bromononanal
5 A un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado con un agitador magnetico, embudo de adicion y controlador de temperatura, en atmosfera de nitrogeno, se le anadieron 9-bromononanol (8,92 g, 40 mmol) y diclorometano (30 ml). La mezcla resultante se enfrio a 5 °C y se anadio una solucion de bicarbonato sodico (0,47 g, 5,6 mmol) y bromuro potasico (0,48 g, 4 mmol) en agua (10 ml). Se anadio un radical libre 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) (63 mg, 0,4 mmol) y despues se anadio gota a gota una solucion de lejfa del 10 al 13 % (27 ml) a traves del embudo de 10 adicion a una velocidad tal que la temperatura se mantuvo a aproximadamente 8 °C (+/- 2 °C) con un bano de hielo seco (durante aproximadamente 40 min.). Despues de completarse la adicion de la lejfa, la mezcla se agito durante 30 min, manteniendo la temperatura a aproximadamente 0 °C. Se anadio una solucion de bisulfito sodico (1,54 g) en agua (10 ml) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 30 min Despues, las fases de la mezcla se separaron, y la fase acuosa lechosa se extrajo con diclorometano (1 x 20 ml). Las fases de diclorometano 15 combinado se lavaron despues con agua (1 x 30 ml), se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron a presion reducida para proporcionar el intermedio del tftulo (8,3 g, rendimiento del 94 %), que se uso sin purificacion adicional en la siguiente etapa.
(b) 9-Bromo-1,1-dimetoxinonano
A un matraz de fondo redondo de 100 ml se le anadieron 9-bromononanal (7,2 g, 32,5 mmol), metanol (30 ml) y 20 trimetilortoformiato (4 ml, 36,5 mmol). Se anadio una solucion de acido clorhndrico 4 N en dioxano (0,2 ml, 0,8 mmol) y la mezcla resultante se calento a reflujo durante 3 h. Despues, la mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se anadio bicarbonato sodico solido (100 mg, 1,2 mmol). La mezcla resultante se concentro a un cuarto de su volumen original a presion reducida y despues se anadio acetato de etilo (50 ml). La fase organica se lavo con agua (2 x 40 ml), se seco (MgSO4), se filtro y se concentro a presion reducida para proporcionar el intermedio del tftulo (8,44 g, 25 (rendimiento del 97 %)) en forma de un ftquido, que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
(c) 1-(9,9-imetoxinonil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A un matraz de fondo redondo de tres bocas de 50 ml, se le anadieron piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico (1 g, 3,38 mmol) y acetonitrilo (10 ml) para formar una suspension. A esta suspension se le anadieron
9-bromo-1,1-dimetoxinonano (1,1 g, 1,3 mmol) y trietilamina (0,57 g, 4,1 mmol) y la mezcla resultante se calento a 30 65 °C durante 6 h (la reaccion se controlo por HPLC hasta que el material de partida fue < 5 %). Despues, la mezcla de
reaccion se enfrio a temperatura ambiente momento en el cual la mezcla formo una suspension espesa. Se anadio agua (5 ml) y la mezcla se filtro para recoger el solido en un filtro fritado grueso. El solido se lavo con una solucion premezclada de acetonitrilo (10 ml) y agua (5 ml) y despues con otra solucion premezclada de acetonitrilo (10 ml) y agua (2 ml). El solido resultante se seco al aire para proporcionar el intermedio del tftulo (1,37 g, 84 %, pureza >96 % 35 por CL, RMN 1H) en forma de un solido de color blanco.
(d) 1-(9-Oxononil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A un matraz de fondo redondo de 500 ml con un agitador magnetico se le anadieron 1-(9,9-dimetoxinonil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico (7,7 g, 15,9 mmol) y despues acetonitrilo (70 ml) y acido clorhndrico 1 M acuoso (70 ml). La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 h y despues se anadio diclorometano 40 (200 ml). Esta mezcla se agito durante 15 min, y despues las fases se separaron. La fase organica se seco (MgSO4),
se filtro y se concentro a presion reducida para proporcionar el intermedio del tftulo (6,8 g), que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
(e) 1-(9-{Bencil-[(R)-2-(8-benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]ammo}noml) -piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
45 A un matraz de fondo redondo de 300 ml se le anadieron 5-[(R)-2-bencilamino-1- (terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona (5 g, 9,73 mmol), diclorometano (100 ml) y acido acetico glacial (0,6 ml, 10 mmol). Esta mezcla se enfrio a 0 °C usando un bano de hielo y se anadio 1-(9-oxononil)piperidin-4-il ester del acido (4,6 g, 9,73 mmol) con agitacion. Esta mezcla se agito a 0 °C durante 30 minutos y despues se anadio en porciones triacetoxiborohidruro sodico (6,15 g, 29 mmol) durante 15 minutos. La mezcla de reaccion se agito de 0 ° 50 a 10 °C durante 2 horas y despues se anadio solucion saturada acuosa de bicarbonato sodico (50 ml) y esta mezcla se agito durante 15 minutos. Despues las fases se separaron y la fase organica se lavo con una solucion acuosa al 5 % de cloruro sodico (50 ml), se seco (MgSO4), se filtro y se concentro a presion reducida para proporcionar el intermedio del tftulo (8,5 g, 80 % de pureza por HPLC), que se uso sin purificacion adicional.
(f) 1-{9-[(R)-2-(ferc-Butildimetilsilamloxi)-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)etilammo]noml}piperidm
55 -4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
A un matraz de fondo redondo de 200 ml se le anadieron el intermedio de la Etapa E (8,5 g, 9 mmol), etanol (100 ml) y acido acetico glacial (0,54 ml, 18 mmol) y esta mezcla se agito hasta que se disolvio el solido. La mezcla de reaccion se purgo con hidrogeno durante 5 min y despues se anadio paladio al 10 % sobre carbono (1,7 g). Esta mezcla se agito a temperatura ambiente mientras que se burbujeo lentamente hidrogeno a traves de la mezcla de reaccion hasta que se observo una conversion > 95 % por HPLC (aproximadamente 8-9 h). Despues, la mezcla se filtro a traves de una capa de Celite y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice (15 g sflice/1 g en bruto) usando MeOH al 5% en DCM/NH4OH al 0,5% (10 x 150 ml), MeOH al 8% en DCM/NH4OH al 0,5% (10 x 150 ml) y MeOH al 10% en DCM/NH4OH al 0,5% (10 x 150 ml). Las fracciones apropiadas se combinaron y el disolvente se retiro a presion reducida manteniendo la temperatura <35 °C para dar el intermedio del tftulo (4,05 g, 97 % de pureza).
(g) 1-{9-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A un matraz de fondo redondo de 200 ml se le anadio el intermedio de la Etapa F (4,05 g, 5,36 mmol) y diclorometano (80 ml) y la mezcla resultante se agito hasta que se disolvio el solido. Se anadio trihidrofluoruro de trietilamina (2,6 ml, 16 mmol) y la agitacion continuo en nitrogeno durante 18 a 20 h. Se anadio metanol (20 ml) y despues se anadio lentamente bicarbonato sodico acuoso saturado (50 ml) y la mezcla se agito durante 15 min Despues, las fases se separaron y la fase organica se lavo con una solucion acuosa saturada de cloruro sodico (20 ml), se seco (MgSO4), se filtro y se concentro a presion reducida para proporcionar el compuesto del tftulo (3,5 g, 98 % de pureza por HPLC) en forma de un solido de color amarillo.
Ejemplo Comparativo 3B
Sal del acido naftalen-1,5-disulf6nico del 1-{9-[(R)-2-hidroxi-2-(8-Hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il) etilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se disolvio 1-{9-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico (1,0 g, 1,56 mmol, base libre) en metanol (10 ml; contenido de agua inferior). Se anadio una solucion de acido naftalen-1,5-disulfonico (0,45 g, 1,56 mmol) en metanol (5 ml; contenido de agua inferior) y la mezcla de reaccion se agito a 30 °C durante dos horas y despues a temperatura ambiente durante una noche (18 h). La suspension espesa resultante y la torta de filtrado se lavaron con metanol (5 ml) y despues se secaron para dar el compuesto del tftulo (1,16 g, rendimiento del 80 %) en forma de un solido cristalino de color blanquecino.
Preparacion 16
N-{2-Benciloxi-5-[(R)-2-bromo-1-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]feml}-formamida
Se disolvio (R)-2-bromo-1-(3-formamido-4-benciloxifenil)etanol (9,9 g, 28 mmol) en dimetilformamida (36 ml). Se anadieron imidazol (2,3 g, 34 mmol) y cloruro de ferc-butildimetilsililo (4,7 g, 31 mmol). La solucion se agito en atmosfera de nitrogeno durante 72 h. Se anadieron mas imidazol (0,39 g, 5,7 mmol) y cloruro de ferc-butildimetilsililo (0,64 g, 4,3 mmol) y la reaccion se agito durante 20 h mas. Despues, la mezcla de reaccion se diluyo con una mezcla de isopropilo acetato (53 ml) y hexanos (27 ml) y se transfirieron a un embudo de decantacion. La fase organica se lavo dos veces con una mezcla de agua (27 ml) y cloruro sodico acuoso saturado (27 ml), seguido de un lavado final con cloruro sodico acuoso saturado (27 ml). La fase organica se seco sobre sulfato sodico. Se anadieron gel de sflice (23,6 g) y hexanos (27 ml) y la suspension se agito durante 10 min Los solidos se retiraron por filtracion y el filtrado se concentro al vacfo. El residuo se cristalizo en hexanos (45 ml) para proporcionar 8,85 g (19 mmol; 68%) del compuesto del tftulo en forma de un solido. EM m/z: [M + H+] calc. para C22H30NO3SiBr 464,1; encontrado 464,2.
El material de partida, (R)-2-bromo-1-(3-formamido-4-benciloxifenil)etanol, puede prepararse como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 6.268.533 B1; o R. Hett y col., Organic Process Research and Development, 1998, 2:96-99; o usando procedimientos similares a los descritos en Hong y col., Tetrahedron Lett., 1994, 35:6631; o similares a los descritos en la Patente de Estados Unidos n.° 5.495.054.
Preparacion 17
1-{9-[(R)-2-(4-Benciloxi-3-formilaminofenil)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)etilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 16 (500 mg, 1,008 mmol) y yoduro sodico (243 mg, 1,62 mmol) se agitaron en tetrahidrofurano (0,5 ml) durante 15 min a temperatura ambiente. Despues, se anadieron el producto de la Preparacion 11, (564 mg, 1,29 mmol) y bicarbonato sodico (272 mg, 3,24 mmol) y la mezcla de reaccion se calento a 80 °C durante 24 h. Despues, la mezcla de reaccion se dejo enfriar. Despues, se anadio agua (2 ml) y la mezcla se extrajo con diclorometano (2 x 2 ml). Los extractos organicos combinados se lavaron con acido clorhfdrico 1 M (2 x 1 ml), se secaron (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (metanol al 5-10 %/diclorometano) para dar el compuesto del tftulo (360 mg, 0,44 mmol, rendimiento del 41 %). HPLC (10-70) Tr = 4,96; EM m/z: [M + H+] calc. para C49H68N4O5 821,51; encontrado 821,9.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1-{9-KR)-2-(4-Benciloxi-3-formilammofeml)-2-hidroxietilammo]noml}piperidm-4-il ester del acido
bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 17 (360 mg, 0,44 mmol) en tetrahidrofurano (2,2 ml) a temperatura ambiente se le anadio trihidrofluoruro de trietilamina (108 pl, 0,66 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 24 h y despues se diluyo con diclorometano (5 ml) y se lavo con acido clorhndrico 1 M (2 ml) y bicarbonato sodico acuoso saturado (2 ml). La fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El compuesto del tftulo en bruto se uso directamente en la siguiente etapa sin purificacion adicional. HPLC (10-70) Tr = 4,6; EM mlz: [M + H+] calc. para C43H54N4O5 707,43; encontrado 707,8.
Ejemplo Comparativo 4
Ditrifluoroacetato 1-{9-[(R)-2-(3-Formilamino-4-hidroxifenil)-2-hidroxietilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio paladio (10% en peso (base seca) sobre carbono activado) (124 mg) a una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 18 (311 mg, 0,44 mmol) en etanol (4 ml) y la mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno. Despues de agitar durante 12 h, la mezcla de reaccion se filtro a traves de una capa de Celite, se lavo con metanol (2 ml) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo resultante se purifico por HPLC preparativa para dar el compuesto del tftulo (41 mg). HpLC (10-70) Tr = 3,0; EM m/z: [M + H+] calc. para C36H48N4O5 617,39; encontrado 617,5.
Ejemplo Comparativo 5
Ditrifluoroacetato
1-{9-[(R)-2-Hidroxi-2-(8*-hidroxi-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio paladio (10% en peso (base seca) sobre carbono activado) (80 mg) a una solucion en agitacion del producto del Ejemplo Comparativo 3 (80 mg, 0,11 mmol) en etanol (1,1 ml) y la mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno. La mezcla de reaccion se agito durante 12 h, y despues se filtro a traves de una capa de Celite, se lavo con metanol (2 ml) y el disolvente se retiro a presion reducida. El material en bruto se volvio a someter a las anteriores condiciones para asegurar la reaccion completa. El residuo resultante se purifico por HPLC preparativa para producir el compuesto del tftulo (6 mg). HPLC (10-70) Tr = 3,23; EM m/z: [M + H+] calc. para C38H50N4O5 643,39; encontrado 643,7.
Preparacion 19
Metil ester del acido 3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propionico
Se anadio 3-bromopropionato de metilo (553 pl, 5,07 mmol) a una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 8 (1,00 g, 3,38 mmol) y DIPEA (1,76 ml, 10,1 mmol) en acetonitrilo (34 ml) a 50 °C y la mezcla de reaccion se calento a 50 °C durante una noche. Despues, el disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se disolvio en diclorometano (30 ml). La solucion resultante se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (10 ml), se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa en columna (MeOH al 5-10 %/DCM) para dar el compuesto del tftulo (905 mg, 70 %).
Preparacion 20
Acido 3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propionico
Una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 19 (902 mg, 2,37 mmol) y litio hidroxido (171 mg, 7,11 mmol) en THF al 50 %/H2O (24 ml) se calento a 30 °C durante una noche, y despues se acidifico con acido clorhfdrico concentrado y se liofilizo para dar el compuesto del tftulo ( rendimiento de ~100 %, tambien contiene sales LiCl).
Preparacion 21
ferc-Butil ester del acido {5-[(R)-2-(8-benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-M)-2-(ferc-butildimetil-silamloxi) etilamino]pentil}carbamico
El producto de la Preparacion 13 (600 mg, 1,23 mmol) y W-terc-butoxicarbonil-1,5-diaminopentano (622 mg, 3,07 mmol) se disolvieron en dimetilsulfoxido (1,23 ml) y se calento a 105 °C durante 6 h. Despues, la mezcla de reaccion se enfrio y se diluyo con acetato de etilo (10 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (4 ml). La fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa en columna (metanol al 5-10 %/diclorometano) para dar el compuesto del tftulo (rendimiento de ~ 100 %).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
5-[(R)-2-(5-AmmopentNammo)-1-(ferc-butNdimetMsNamloxi)etN]-8-bencNoxi-1H-qumolm-2-ona
Una solucion del producto de la Preparacion 21 (800 mg, 1,31 mmol) en acido trifluoroacetico/diclorometano (25 %, 12 ml) se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues, el disolvente se retiro a presion reducida y el residuo en bruto se disolvio en diclorometano (15 ml) y se lavo con hidroxido sodico 1 N (8 ml). La fase organica se separo, se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (509 mg, rendimiento del 81 % durante 2 etapas).
Preparacion 23
1-(2-{5-[(R)-2-(8-BencNoxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-N)-2-(ferc-butMdimetMsNamloxi)etNammo]pentN- carbamoil}etil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-Ncarbamico
Al producto de la Preparacion 20 (417 mg, 1,13 mmol) y HATU (430 mg, 1,13 mmol) se le anadio el producto de la Preparacion 22 (458 mg, 0,90 mmol) en DMF (1,8 ml), seguido de DIPEA (204 pl, 1,17 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 50 °C durante 12 h, y despues el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se disolvio en diclorometano (10 ml). La solucion resultante se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (4 ml), se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa en columna (metanol al 5-10 %/diclorometano y NH4OH al 0,5%) para dar el compuesto del tftulo (240 mg, rendimiento del 31 %).
Preparacion 24
1-(2-{5-[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 23 (240 mg, 0,28 mmol) en diclorometano (2,8 ml) se le anadio trihidrofluoruro de trietilamina (91 pl, 0,56 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 10 h, y despues se diluyo con diclorometano (10 ml). Despues, la solucion resultante se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml), y despues la fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (209 mg, rendimiento del 100 %).
Ejemplo Comparativo 6
Ditrifluoroacetato1-(2-{5-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]pentilcarbamoil}et il)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 24 (209 mg, 0,28 mmol) en etanol (2,8 ml) se le anadio paladio (10 % en peso (base seca) sobre carbono activado) (81 mg) y la mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno y se agito durante una noche. Despues, la mezcla de reaccion se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLC preparativa para dar el compuesto del tftulo (58 mg). HPLC (10-70) Tr = 2,30; EM m/z: [M + H+] calc. para C37H45N5O6 656,34; encontrado 656,6; [a]20D = -6,5 (c=1,0 mg/ml, agua).
Ejemplo Comparativo 6A
1-(2-{5-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Como alternativa, el compuesto del tftulo puede prepararse como sigue a continuacion:
(a) 5-Cloropentanal
A un matraz de fondo redondo de tres bocas de 2 l, equipado con un agitador magnetico, embudo de adicion y controlador de temperatura en atmosfera de nitrogeno, se le anadieron 5-cloropentanol (53 g, 0,433 mol) y diclorometano (300 ml). Esta mezcla se enfrio a 5 °C y se anadio una solucion de bicarbonato sodico (5 g, 0,059 mol) y bromuro potasico (5,1 g, 0,043 mol) en agua (225 ml). Se anadio un radical libre 2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidiniloxi (TEMPO) (63 mg, 0,4 mmol) y despues se anadio gota a gota una solucion de lejfa del 10 al 13 % (275 ml) a traves del embudo de adicion a una velocidad tal que la temperatura se mantuvo a aproximadamente 8 °C (+/- 2 °C) con un bano de hielo seco (durante aproximadamente 45 min.). Despues de completarse la adicion de la lejfa, la mezcla se agito durante 30 min, manteniendo la temperatura a aproximadamente 5 °C. Una solucion de bisulfito sodico (4 g) en agua (30 ml) se anadio y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 30 min Despues, las fases de la mezcla se separaron, y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (1 x 50 ml). Las fases de diclorometano combinado se lavaron despues con agua (1 x 50 ml), se seco (MgSO4), se filtro y se concentro a presion reducida para proporcionar el compuesto del tftulo (53 g). El producto se destilo a 65 °C/=,01 bar (8 torr) para proporcionar el compuesto del tftulo (31,16 g) en forma de un aceite de color naranja (pureza GC fue de 70 a 80 %).
El producto se purifico adicionalmente anadiendo el material en bruto (4 g) a una mezcla de etanol (920 ml), acetato de
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etilo (12 ml) y agua (4 ml). Se anadio bisulfito sodico (4 g) y la mezcla se calento a reflujo durante 4 h y despues se enfrio a temperatura ambiente y se agito durante 14 h a temperature ambiente para formar una suspension muy espesa. Los solidos se filtraron en un filtro fritado grueso, se lavo con la mezcla de disolvente (5 ml) y los solidos se secaron en el filtro para proporcionar 8,4 g del aducto bisulfito. Este material se anadio despues a MTBE (20 ml) y se anadio hidroxido sodico acuoso 1 N (45 ml) con agitacion vigorosa. La mezcla bifasica resultante se agito vigorosamente hasta que todos los solidos se hubieron disuelto (aproximadamente 15 min) y despues las fases se separaron. La fase acuosa se extrajo con MTBE (20 ml) y las fases de MTBE combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para proporcionar 3,46 g del compuesto del tftulo en forma de un ftquido incoloro (GC pureza >90 %).
(b) 5-[(R)-2-[Bencil-(5-cloropentilo)amiao]-1-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]-8-benciloxi-1H-qumolm-2-ona
A un matraz de fondo redondo de tres bocas de 1 l se le anadieron el producto de la Preparacion 28 (48,4 g, 94 mmol), diclorometano (400 ml) y acido acetico glacial (11,3 ml). Esta mezcla se agito a 0 °C (bano enfriado hielo) y se anadio el producto de la etapa (a) (12,5 g, 103,6 mmol) y la agitacion continuo durante 15 min Despues, se anadio en porciones triacetoxiborohidruro sodico (59,8 g, 282 mmol) durante un periodo de 15 min y la mezcla resultante se agito de 0 °C a 10 °C durante 2 h. Despues, se anadio lentamente (desprendimiento de gas) una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (200 ml) y la agitacion continuo durante 15 min Despues, el pH de la solucion se ajusto con carbonato sodico solido a un pH de aproximadamente 9 y las fases se separaron. La fase organica se lavo con una solucion acuosa al 5 % de cloruro sodico (200 ml), se seco (MgSO4), se filtro y se concentro a presion reducida para proporcionar el compuesto del tftulo (53 g).
(c) 5-[(R)-2-[(5-W,W-Diformilammopentilo)bencilammo]-1-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]-8-benciloxMH- quinolin-2-ona
A una solucion en agitacion del producto de la etapa (b) (26,5 g, 42,8 mmol) en 1 -metil-2-pirrolidinona (175 ml) se le anadieron diformilamida sodica (6,1 g, 64,2 mmol) y yoduro sodico (2,13 g, 14,3 mmol). El matraz de reaccion se enjuago con nitrogeno y despues la mezcla se calento a 65 °C durante 8 h. Despues, la mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se anadieron agua (300 ml) y acetato de etilo (100 ml). Esta mezcla se agito durante 10 min y despues las fases se separaron. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (150 ml) y las fases organicas combinadas se lavaron con agua (300 ml), una solucion acuosa al 50 % de salmuera (300 ml), agua (300 ml), se secaron (MgSO4) se filtraron y se concentraron para proporcionar el compuesto del tftulo (23,3 g).
(d) 5-[(R)-2-[(5-Ammopentilo)bencilammo]-1-(terc-butildimetilsilamloxi)etil]-8-benciloxMH-qumolm-2-ona
A una solucion en agitacion del producto de la etapa (c) (10,5 g, 16 mmol) en metanol (75 ml) se le anadio acido p-toluenosulfonico (7,42 g. 39 mmol). La mezcla resultante se calento a 40 °C durante 15 h y despues se concentro a presion reducida a aproximadamente su mitad de volumen. Se anadio metanol (70 ml) y la mezcla se calento a 50 °C durante 2 h y despues se concentro a presion reducida. Se anadieron agua (100 ml), metanol (50 ml) y MTBE (100 ml) y esta mezcla se agito durante 15 min y despues las fases se separaron. A la fase acuosa se le anadieron hidroxido sodico acuoso 1 N (45 ml) y MTBE (100 ml), y esta mezcla se agito durante 15 min. Despues, las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con MTBE (100 ml). Las fases de MTBE combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de un aceite de color amarillo (7,3 g). Este material contema aproximadamente el 13 % (por HPLC) del correspondiente compuesto des-ferc-butildimetilsililo.
(e) Acido 3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propionico
A una solucion del producto de la Preparacion 8 (50 g, 67,6 mmol) en diclorometano (500 ml) se le anadio acido acnlico (15,05 ml, 100 mmol). La mezcla resultante se calento a 50 °C en reflujo durante 18 h y despues se retiro el disolvente. Se anadio metanol (600 ml) y esta mezcla se calento a 75 °C durante 2 h y despues se enfrio a temperatura ambiente para formar una suspension espesa. El solido se recogio por filtracion, se lavo con metanol (50 ml) y se seco al aire para proporcionar el compuesto del tftulo (61 g, pureza >96 %) en forma de un polvo de color blanco.
(f) 1-[2-(5-{Bencil-[(R)-2-(8-benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]ammo}- pentilcarbamoil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una mezcla del producto de la etapa (e) (3,68 g, 10 mmol) y W,A/-dimetilformamida (50 ml) se calento a 60 °C hasta que el solido se disolvio completamente y despues se enfrio a temperatura ambiente. Se anadieron el producto de la etapa (d) (6 g, 10 mmol) y diisopropiletilamina (3,5 ml) y la mezcla de reaccion se enfrio a 0 °C. Se anadio PyBOP (6,25 g, 12 mmol) en una porcion y la mezcla de reaccion se agito a 0°Ca temperatura ambiente durante 2 horas. Despues, la mezcla de reaccion se vertio en agua fria (500 ml) con agitacion y el pH de la mezcla resultante se ajusto a aproximadamente 2 usando acido clorhfdrico acuoso 1 M. Esta mezcla se agito durante 15 min y despues se filtro para recoger el solido, que se lavo con agua (100 ml) y se seco para proporcionar el compuesto del tftulo (8,7 g, HPLC pureza >95 %) en forma de un solido de color blanquecino.
(g) 1-(2-{5-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
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El producto de la etapa (f) puede desprotegerse usando esencialmente los mismos procedimientos como los descritos en la Preparacion 24 y el Ejemplo Comparativo 6 para proporcionar el compuesto del tftulo.
Preparacion 25
2-(N-Benciloxicarboml-N-metilamino)etanal
(a) 2-(W-Benciloxicarboml-W-metilammo)etanol
Se anadio gota a gota cloroformiato de bencilo (19 g, 111,1 mmol) en THF (20 ml) durante 15 min a una solucion en agitacion de 2-(metilamino)etanol (10 g, 133,3 mmol) en THF (100 ml) y carbonato sodico acuoso (100 ml) a 0 °C. La mezcla de reaccion se agito a 0 °C durante 12 h y despues se extrajo con EtOAc (2 x 200 ml). La fase organica se lavo con carbonato sodico acuoso (200 ml) y se seco (carbonato potasico) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (22,5 g, rendimiento del 97 %).
(b) 2-(W-Benciloxicarboml-W-metilammo)etanal
Se anadieron DMSO (71 ml,1 mol) y DIPEA (87,1 ml, 0,5 mol) a una solucion en agitacion del producto de la etapa (a) (20,9 g, 0,1 mol) en diclorometano (200 ml) a -10 °C. La mezcla de reaccion se agito a-10 °C durante 15 min y despues se anadio un complejo trioxido de azufre-piridina (79,6 g, 0,5 mol) y la mezcla resultante se agito durante 1 hora. La mezcla de reaccion se inactivo con adicion de acido clorhffdrico 1 M (200 ml). La fase organica se separo y se lavo con bicarbonato sodico acuoso saturado (100 ml), salmuera (100 ml), se seco (carbonato potasico) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (20,7 g, -rendimiento del 100 %).
Preparacion 26
1-[2-(Metilamino)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 25 (20,7 g, 100 mmol) y el producto de la Preparacion 8 (25 g, 84,7 mmol) en MeOH (200 ml) se le anadio triacetoxiborohidruro sodico (21,2 g, 100 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 12 h a temperatura ambiente y despues se inactivo con acido clorhffdrico 2 M y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo se disolvio en acetato de etilo (200 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (100 ml) y salmuera (50 ml), y despues se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa en columna (EtOAc al 50-90 %/hexanos) para dar 1-[2-(benciloxicarbonil-metilamino)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico en forma de un aceite.
El aceite se disolvio en metanol (100 ml) y se anadio paladio (10 % en peso (base seca) sobre carbono activado) (5 g). La mezcla de reaccion se agito en hidrogeno (30 psi) durante 12 h y despues se filtro a traves de Celite, que se lavo con metanol y el disolvente se evaporo para dar el compuesto del tftulo (13,2 g, rendimiento del 44 %).
Preparacion 27
1-{2-[(6-Bromohexanoil)metilamino]etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio cloruro de 6-bromohexanoilo (3,23 ml, 21,1 mmol) a una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 26 (6,2 g, 17,6 mmol) y DIPEA (6,13 ml, 35,2 mmol) en dicloroetano (170 ml). La mezcla de reaccion se agito durante 1 hora y despues se diluyo con EtOAc (250 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (2 x 200 ml) y salmuera (200 ml), y despues se seco (sulfato de magnesio). El disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (6,6 g, rendimiento del 73 %).
Preparacion 28
8-Benciloxi-5-[(R)-2-(W-bencilammo)-1-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]-1H-qumolm-2-ona
Una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 13 (1,00 g, 2,05 mmol) y bencilamina (493 pl, 4,51 mmol) en DMSO (1,7 ml) se calento a 105 °C durante 4 h. La mezcla de reaccion se dejo enfriar y despues se diluyo con EtOAc (10 ml) y la fase organica se lavo con una solucion acuosa saturada de cloruro de amonio (5 ml) e hidroxido sodico 1 N (5 ml), se seco (MgSO4) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa en columna (EtOAc al 50 %/hexanos) para dar el compuesto del tftulo (700 mg, 67 %). EM m/z: [M + H+] calc. para C31H38N2OaSi 515,27; encontrado 515,5.
Preparacion 29
1-{2-[(6-{Bencil-[(R)-2-(8-benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]ammo}hexa noil)-metilamino]etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 28 (807 mg, 1,57 mmol) y DIPEA (819 pl, 4,7 mmol) en acetonitrilo (3,14 ml) se le anadio el producto de la Preparacion 27 (995 mg, 1,88 mmol). La mezcla de reaccion se calento a 80 °C durante 24 h. El disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se disolvio en EtOAc (10 ml) y
despues se calento con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml), se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El material en bruto se purifico por cromatograffa en columna (MeOH 4-6 %/DCM) para obtener el compuesto del tftulo (452 mg, rendimiento del 30 %).
Preparacion 30
5 1-{2-[(6-{Bencil-[(R)-2-(8-benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietil]amino}hexanoil)metilamino] etil}piperidm-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 29 (452 mg, 0,47 mmol) en diclorometano (4,7 ml) se le anadio trihidrofluoruro de trietilamina (116 pl, 0,71 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 10 h. y despues se diluyo con diclorometano (10 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml). Despues, la 10 fase organica se seco (MgSO4) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (rendimiento del 100 %).
Ejemplo Comparativo 7
Ditrifluoroacetato de 1-[2-({6-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]hexanoil} metilamino)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
15 A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 30 (400 mg, 0,47 mmol) en etanol (4,7 ml) se le anadio paladio (10% en peso (base seca) sobre carbono activado) (160 mg) y la mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno y se agito durante una noche. Despues, la mezcla de reaccion se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLC preparativa para dar el compuesto del tftulo (73 mg). HPLC (10-70) Tr = 2,33; EM m/z: [M + H+] calc. para C38H47N5O6 670,36; encontrado 670. [a]20D = -9,4 (c = 1,0 mg/ml, 20 agua).
Preparacion 31
1-[2-(4-(Aminometil)fenilcarbamoil)-etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion de 4-(W-terc-butoxicarbonilaminometil)anilina (756 mg, 3,4 mmol), el producto de la Preparacion 20 (1,5 g, 4,08 mmol) y HATU (1,55 g, 4,08 mmol) en DMF (6,8 ml) se le anadio DIPEA (770 pl, 25 4,42 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 50 °C durante una noche y despues el disolvente se retiro a presion
reducida. El residuo resultante se disolvio en diclorometano (20 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (10 ml). Despues, la fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El producto en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (MeOH al 5-10 %/DCM) para dar un solido, que se disolvio en TFA/DCM (25 %, 30 ml) y se agito a temperatura ambiente durante 2 h. Despues, el disolvente se 30 retiro a presion reducida y el residuo en bruto se disolvio en diclorometano (30 ml) y se lavo con hidroxido sodico 1 N (15 ml). La fase organica se separo, se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (1,5 g, 94 % durante 2 etapas).
Preparacion 32
1-[2-(4-{[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etilammo]metil}feml- 35 carbamoil)etil]-piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 31 (489 mg, 1,04 mmol), el producto de la Preparacion 13 (610 mg, 1,25 mmol), bicarbonato sodico (262 mg, 3,12 mmol) y yoduro sodico (203 mg, 1,35 mmol) en THF (0,52 ml) se calentaron a 80 °C durante 12 h. La mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (10 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml). La fase organica se seco (MgSO4) y el disolvente se retiro a presion 40 reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (MeOH al 10 %/DCM) para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido (687 mg, rendimiento del 77 %).
Preparacion 33
1-[2-(4-{[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqurnolin-5-il)-2-hidroxietilamino]metil}fenilcarbamoil)etil]piperidi n-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
45 A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 32 (687 mg, 0,8 mmol) en diclorometano (8 ml) se le anadio trihidrofluoruro de trietilamina (261 pl, 1,6 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 10 h y despues se diluyo con diclorometano (20 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (10 ml). Despues, la fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida para producirel compuesto del tftulo (500 mg, rendimiento del 81 %).
50 Ejemplo Comparativo 8
Ditrifluoroacetato de 1-[2-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)etilammo]metil}feml- carbamoil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
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A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 33 (500 mg, 0,65 mmol) en etanol (6,5 ml) se le anadio paladio (10% en peso (base seca) sobre carbono activado) (200 mg) y la mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno y se agito durante una noche. Despues, la mezcla de reaccion se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLC preparativa para dar el compuesto del tftulo (81 mg, 2 sales TFA). HPLC (10-70) Tr = 2,41; EM mlz: [M + H+] calc. para C39H41N5O6 676,32; encontrado 676,5.
Preparacion 34
1-(2-ferc-Butoxicarbomlammoetil)piperidm-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 8 (2,00 g, 6,76 mmol) y DIPEA (3,54 ml, 20,3 mmol) en acetonitrilo (67,6 ml) a 50 °C se le anadio bromuro de 2-terc-butoxicarbonilaminoetilo (1,82 g, 8,11 mmol) y la mezcla de reaccion se calento a 50 °C durante una noche. Despues, el disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se disolvio en diclorometano (60 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (30 ml). La fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa en columna (MeOH al 5 %/DCM) para producir el compuesto del tftulo en forma de un solido (2,32 g, rendimiento del 78 %).
Preparacion 35
1-(2-Aminoetil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 34 se disolvio en TFA/DCM (25 %, 52 ml) y se agito a temperatura ambiente durante 2 h. Despues, el disolvente se retiro a presion reducida y el residuo en bruto se disolvio en diclorometano (30 ml) y se lavo con hidroxido sodico 1 N (15 ml). La fase organica se separo, se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (1,61 g, rendimiento del 90 %).
Preparacion 36
1-[2-(4-Aminometilbenzoilamino)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 35 (339 mg, 1 mmol), acido 4-(terc-butoxicarbonilaminometil)benzoico (301 mg, 1,2 mmol) y HATU (456 mg, 1,2 mmol) en DMF (2 ml) se le anadio DIPEA (226 |jl, 1,3 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante una noche y despues el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en diclorometano (20 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (10 ml). La fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El producto en bruto se disolvio en TFA/DCM (25 %, 10 ml) y esta mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 h. El disolvente se retiro a presion reducida y el residuo en bruto se disolvio en diclorometano (15 ml) y se lavo con hidroxido sodico 1 N (5 ml). La fase organica se separo, se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida para proporcionar el compuesto del tftulo (472 mg, ~100% durante 2 etapas).
Preparacion 37
1-[2-(4-{[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etilammo]metil}benzoila mino)etil]-piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 36 (520 mg, 1,1 mmol), el producto de la Preparacion 13 (634 mg, 1,3 mmol), bicarbonato sodico (277 mg, 3,3 mmol) y yoduro sodico (215 mg, 1,43 mmol) en THF (0,55 ml) se calento a 80 °C durante 12 h. Despues, la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (10 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml). Despues, la fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (MeOH al 5-10 %/DCM) para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido (316 mg, rendimiento del 33 %).
Preparacion 38
1-[2-(4-{[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]metil}benzoilamino)etil]piperidin- 4-il ester bifenil-2-ilcarbamico del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 37 (316 mg, 0,36 mmol) en diclorometano (3,6 ml) se le anadio trihidrofluoruro de trietilamina (117 jl, 0,72 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 10 h y despues se diluyo con diclorometano (10 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml). La fase organica se seco (MgSO4) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo, que se uso directamente en la siguiente etapa (rendimiento del 100 %).
Ejemplo Comparativo 9
Ditrifluoroacetato de 1-[2-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil} benzoilamino)etil]piperidin-4-il ester del acido
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A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 38 (275 mg, 0,36 mmol) en etanol (3,6 ml) se le anadio paladio (10% en peso (base seca) sobre carbono activado) (275 mg) y la mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno y se agito durante una noche. Despues, la mezcla de reaccion se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLC preparativa para producir el compuesto del tftulo (6 mg, 2 sales TFA). HPLC (10-70) Tr = 2,26; EM mlz: [M + H+] calc. para C39H41N5O6 676,32; encontrado 676,5.
Preparacion 39
1-(2-Aminoetil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio bromuro de 2-terc-butoxicarbonilaminoetilo (1,22 g, 5,44 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 8 (1,46 g, 4,95 mmol) y diisopropiletilamina (1,03 ml, 5,94 mmol) en acetonitrilo (24 ml). La mezcla de reaccion se agito a 65 °C durante 12 horas, momento en el cual el analisis por EM mostro que la reaccion se completo. La mezcla de reaccion se concentro a sequedad y despues se anadio diclorometano (10 ml). Se anadio acido trifluoroacetico a esta mezcla y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 4 horas, momento en el cual el analisis por EM mostro que la reaccion se completo. Despues, la mezcla se concentro a medio volumen y se anadio hidroxido sodico 1 N a la solucion hasta que el pH se ajusto a 14. La fase organica se lavo con salmuera, despues se seco sobre sulfato de magnesio y se filtro. El filtrado se concentro para dar 1,6 g del compuesto del tftulo en forma de un solido. EM m/z: [M + H+] calc. para C20H25N3O2 340,2; encontrado 340.
Preparacion 40
5-[(R)-2-(5-Ammopentilammo)-1-(ferc-butildimetilsilamloxi)etil]-8-benciloxi-1H-qumolm-2-ona
Se anadio A/-terc-butoxicarbonil-1,5-diaminopentano (1,04 g, 5,12 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 13 (1,00 g, 2,05 mmol) en dimetilsulfoxido (2 ml). La solucion se agito a 75 °C durante 12 horas, momento en el cual el analisis por CLEM mostro que la reaccion se completo. Despues, la mezcla de reaccion se concentro al vado a sequedad. Al residuo se le anadio diclorometano (2 ml) y despues se anadio acido trifluoroacetico (1 ml). La solucion se agito a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas, momento en el cual el analisis por EM mostro que la reaccion se completo. La solucion se concentro a medio volumen y se anadio hidroxido sodico 1 N hasta que el pH se ajusto a 14. La fase organica se recogio, se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de magnesio y despues se concentro para producir 782 mg del compuesto del tftulo en forma de un aceite. EM mlz: [M + H+] calc. para C29^3^O3Si 510,8; encontrado 510.
Preparacion 41
1-[2-(3-{5-[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etilammo]pentil}- ureido)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio carbonildiimidazol (127 mg, 0,78 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 39 (266 mg, 0,78 mmol) en dimetilformamida (4 ml) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. Despues de 3 horas, el producto de la Preparacion 40 (399 mg, 0,78 mmol) se anadio a la mezcla de reaccion y esta mezcla se agito durante 12 horas a temperatura ambiente, momento en el cual el analisis por CLEM determino que la reaccion se completo. La mezcla de reaccion se concentro al vado y el residuo se diluyo con acetato de etilo (5 ml). La fase organica se lavo dos veces con bicarbonato sodico saturado (5 ml) y despues salmuera (5 ml). La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y despues se concentro para proporcionar 597 mg del compuesto del tftulo en forma de un solido que se uso sin purificacion adicional. EM mlz: [M + H+] calc. para C50H66N6O6Si 875,5; encontrado 875.
Preparacion 42
1-[2-(3-{5-[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]pentil}ureido)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio trihidrofluoruro de trietilamina (0,16 ml, 1,02 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 41 (597 mg, 0,68 mmol) en tetrahidrofurano (3,4 ml) y esta mezcla se agito a temperatura ambiente durante aproximadamente 12 horas, momento en el cual mediante el analisis por EM se determino que la reaccion se completo. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (5 ml) y esta mezcla se lavo con hidroxido sodico 1 N (5 ml), salmuera, se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para dar 417 mg del compuesto del tftulo en forma de un solido. EM mlz: [M + H+] calc. para C44H41N6O6 760,4; encontrado 760.
Ejemplo Comparativo 10
Ditrifluoroacetato de 1-[2-(3-{5-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]pentil} ureido)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 42 (417 mg, 0,55 mmol) en etanol (3 ml) se purgo con nitrogeno durante aproximadamente 10 minutos. Se anadio paladio (10 % en peso (base seca) sobre carbono activado) (200 mg) y la solucion se enjuago de nuevo con nitrogeno durante aproximadamente 10 minutos. El matraz se purgo al vado y
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despues se lleno con nitrogeno tres veces y despues se coloco un globo lleno de hidrogeno sobre el matraz. La mezcla de reaccion se agito en hidrogeno durante 12 horas, momento en el cual mediante el analisis por EM se determino que la reaccion se completo. Despues, la mezcla de reaccion se filtro y el filtrado organico se concentro y se purifico por HPLC (10-35 % durante 60 minutos) para dar 146 mg del compuesto del tftulo en forma de un polvo. Em mlz: [M + H+] calc. para C37H46N6O6 671,4; encontrado 670. HPLC (10-70) Tr = 2,6 minutos.
Ejemplo Comparativo 11
Ditrifluoroacetato de 1-[3-(3-{5-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]pentil} ureido)propil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Usando el procedimiento descrito anteriormente en las Preparaciones 39-42 y el Ejemplo 10, y sustituyendo bromuro de 2-ferc-butoxicarbonilaminoetilo por bromuro de 3-ferc-butoxicarbonilaminoprop-1-ilo en la Preparacion 39, se preparo el compuesto del tftulo. EM m/z: [M + H+] calc. para C38H48N6O6 685,4; encontrado 684. HPlC (10 70) Tr = 2,6 minutos.
Preparacion 43
6-(2-Bromo-(R)-1-ferc-butNdimetMsiNloxi)etM-2,2-dimetiM,3-benzodioxan
(a) 6-Bromo-2,2-dimetil-4H-benzo[1,3]dioxina
A alcohol de 5-bromo-2-hidroxibencilo (93 g, 0,46 mol, disponible de Sigma-Aldrich) en 2,0 l de 2,2-dimetoxipropano se le anadieron 700 ml de acetona, seguido de cloruro de cinc (170 g). Despues de agitar durante 18 horas, se anadio hidroxido sodico acuoso 1,0 M hasta que la fase acuosa fue basica. Se anadio dietil eter (1,5 l) a la suspension y la fase organica se decanto en un embudo de decantacion. La fase organica se lavo con salmuera, se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo en forma de un aceite.
(b) 6-Acetil-2,2-dimetil-4H-benzo[1,3]dioxina
Al producto de la etapa (a) (110 g, 0,46 mol) en 1,0 l de THF a -78 °C se le anadieron 236 ml (0,51 mol) de 2,14 M n-butillitio en hexanos a traves de un embudo de goteo. Despues de 30 minutos, se anadio W-metil-W-metoxiacetamida (71 g, 0,69 mol, disponible de TRI). Despues de 2 horas, la mezcla de reaccion se inactivo con agua, se diluyo con 2,0 l de tampon fosfato acuoso de 1,0 M (pH = 7,0) y se extrajo una vez con dietil eter. La fase de dietil eter se lavo una vez con salmuera, se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro a presion reducida para dar un aceite de color naranja claro. El aceite se disolvio en un volumen mmimo de etilo acetato, se diluyo con hexanos, y para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido cristalino.
(c) 6-Bromoacetil-2,2-dimetil-4H-benzo[1,3]dioxina
Al producto de la etapa (b) (23,4 g, 0,113 mol) en 600 ml de THF a -78 °C se le anadieron 135 ml de hexametildisilazano sodico 1,0 M en THF (Sigma-Aldrich). Despues de 1 hora, se anadio cloruro de trimetilsililo (15,8 ml, 0,124 mol). Despues de 30 minutos mas, se anadio bromo (5,82 ml, 0,113 mol). Despues de 10 minutos, la reaccion se interrumpio diluyendo la mezcla de reaccion con dietil eter y vertiendola en 500 ml de una premezcla acuosa al 5 % de Na2SO3 con 500 ml de NaHCO3 acuoso al 5 %. Las fases se separaron y la fase organica se lavo con salmuera, se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo en forma de un aceite que se solidifico tras almacenarse en el congelador.
(d) (R)-2-Bromo-1-(2,2-dimetil-4H-benzo[1,3]dioxin-6-il)etanol
Al producto de la etapa (c) (10 g, 35,1 mmol) en 100 ml de THF se le anadio el catalizador solido de la Preparacion 13, etapa (c)(1) (0,97 g, 3,5 mmol). La solucion se enfrio entre -20 °C y -10 °C y se anadio gota a gota BH3-THF (35 ml, 35 mmol) diluido con 50 ml de THF a traves de un embudo de goteo. Despues de completarse la adicion, la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, la mezcla de reaccion se inactivo por adicion lenta de 50 ml de metanol y despues se concentro en un aceite pegajoso. El aceite se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice eluyendo con 1:2 acetato de etilo/hexanos. Las fracciones se combinaron y se concentraron para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido de color blanquecino.
(e) [(Rj-2-Bromo-1-(2,2-dimetN-4H-benzo[1,3]dioxm-6-M)etoxi]-ferc-butildimetNsNano
Al producto de la etapa (d) (10 g, 34,8 mmol) e imidazol (4,7 g, 69,7 mmol) disuelto en 100 ml de DMF se le anadio cloruro de ferc-butildimetilsililo (5,78 g, 38,3 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 18 horas. La mezcla de reaccion se repartio despues entre 200 ml de cloruro sodico saturado y 200 ml de dietil eter. La fase acuosa se extrajo con 200 ml de dietil eter. Despues, las fases organicas se combinaron, se lavaron con cloruro sodico saturado (3 x 100 ml), se secaron sobre MgSO4 y se concentraron. El producto se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice, eluyendo con hexanos seguido de acetato de etilo al 5 % en hexanos. Las fracciones deseadas se combinaron y se concentraron para dar el compuesto del tftulo en forma de un aceite.
Preparacion 44
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1-{9-[2-(ferc-ButNdimetilsNamloxi)-2-(2,2-dimetM-4H-benzo[1,3]dioxm-6-M)etMammo]noml}piperidm-4-M ester
del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 43 (802 mg, 2,00 mmol) y yoduro sodico (300 mg, 2,00 mmol) se agitaron en tetrahidrofurano (0,77 ml) durante 15 min a temperatura ambiente. Se anadieron el producto de la Preparacion 11 (675 mg, 1,54 mmol) y bicarbonato sodico (388 mg, 4,62 mmol) y la mezcla de reaccion se calento a 80 °C durante 24 h. Despues, la mezcla de reaccion se enfrio y se anadio agua (2 ml). Despues la mezcla se extrajo con diclorometano (2 x 2 ml). Los extractos organicos combinados se secaron (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (metanol al 5-10 %/diclorometano) para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido (798 mg, 1,05 mmol, rendimiento del 60 %). EM mlz: [M + H+] calc. para C45H67N3O5Si758,5; encontrado 758,6.
Preparacion 45
1-{9-[2-(2,2-Dimetil-4H-benzo[1,3]dioxin-6-il)-2-hidroxietilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil -2-ilcarbamico
Se anadio trihidrofluoruro de trietilamina (342 pl, 2,10 mmol) a una solucion en agitacion del Producto de la Preparacion 44 (798 mg, 1,05 mmol) en diclorometano (10,5 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se agito durante 24 h y despues se diluyo con diclorometano (20 ml) y se lavo con bicarbonato sodico acuoso saturado (15 ml). La fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El compuesto del tftulo en bruto se aislo en forma de un aceite (659 mg, 1,02 mmol), que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. EM m/z: [M + H+]calc. para C39H53N3O5 644,4; encontrado 644,8.
Ejemplo Comparativo 12
Ditrifluoroacetato de 1-{9-[(R)-2-hidroxi-2-(4-hidroxi-3-hidroximetilfenil)etilamino]nonil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio acido trifluoroacetico (2,80 ml) a una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 45 (600 mg, 0,93 mmol) en THF/H2O (14 ml, 1:1) y la mezcla de reaccion se agito durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se concentro a presion reducida y se disolvio en MeCN al 20 %/H2O, despues se purifico por HPLC preparativa para producir el compuesto del tftulo (200 mg, 2 sales TFA). HPLC (10-70) Tr = 2,76; EM m/z: [M + H+]calc. para C36H49N3O5 604,4; encontrado 604,8.
Preparacion 46
1- [1-(9-Bencilaminononil)piperidin-4-il]-3-bifenil-2-ilurea
Se anadio W-bencilamina (0,903 ml, 8,30 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 4 (2,40 g, 5,52 mmol) en metanol (25 ml) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente. Despues de 10 min, se anadio triacetoxiborohidruro sodico (1,75 g, 8,30 mmol) a la mezcla de reaccion. El progreso de la reaccion se siguio mediante el analisis por HPLC. Despues de 2 h a temperatura ambiente, la reaccion se interrumpio con agua (5 ml) y despues se concentro a medio volumen al vado. La mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (15 ml) y se lavo con hidroxido sodico 1 N (2 x 10 ml) y despues salmuera (5 ml). La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para producir el compuesto del tftulo.
Preparacion 47
Metil ester del acido 2-benciloxi-5-(2-bromoacetil)benzoico
(a) Metil ester del acido 2-benciloxi-5-acetilbenzoico
Se disolvio 5-acetilsalicilato de metilo (100 g, 0,515 mol) en acetonitrilo (1 l) en un matraz de 2 l en condiciones de reflujo y una atmosfera de nitrogeno. Se anadio en porciones carbonato potasico (213,5 g, 1,545 mol) durante 15 min. Se anadio cloruro de bencilo (67,4 ml, 0,566 mol) usando un embudo de goteo durante 15 min La reaccion se calento a 85 °C durante 9 h, y despues se filtro y se aclaro con acetonitrilo (100 ml). La solucion se concentro a aproximadamente 300 ml de volumen a presion reducida y se repartio entre agua (1 l) y acetato de etilo (1 l). La fase organica se lavo con cloruro sodico saturado (250 ml), se seco usando sulfato de magnesio (75 g), y despues se filtro y se aclaro con acetato de etilo (100 ml). La fase organica se concentro para dar metil ester del acido
2- benciloxi-5-acetilbenzoico en forma de un solido (rendimiento del 100 %).
(b) Metil ester del acido 2-benciloxi-5-(2-bromoacetil)benzoico
El producto de la etapa (a) (10,0 g, 35,2 mmol) se disolvio en cloroformo (250 ml) en un matraz de 500 ml en una atmosfera de nitrogeno. Se anadio bromo (1,63 ml, 31,7 mmol) disuelto en cloroformo (50 ml) usando un embudo de goteo durante 30 min La mezcla de reaccion se agito durante 2,2 h y despues se concentro para dar un solido. El solido se disolvio en tolueno (150 ml) con un poco de calor suave, seguido de la adicion de etilo eter (150 ml) para producir el compuesto del tftulo en forma de un solido cristalino (rendimiento del 55 %).
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Metil ester del acido 5-[2-(bencil-{9-[4-(3-bifeml-2-ilureido)piperidm-1-il]noml}ammo)acetil]-2-benciloxi- benzoico
El producto de la Preparacion 47 (371 mg, 1,00 mmol) se anadio a una solucion del producto de la Preparacion 46 (448 mg, 0,85 mmol) en dimetilsulfoxido (4,5 ml), seguido de la adicion de carbonato potasico (234 mg, 1,7 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 40 °C durante 6 h, momento en el cual el producto de la Preparacion 46 ya no se observo mediante el analisis por HPLC. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se filtro, y despues se diluyo con etanol (4 ml). Se anadio borohidruro sodico (63 mg, 1,7 mmol) a la mezcla de reaccion y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de reaccion se inactivo con cloruro de amonio 0,5 M (5 ml) y se extrajo en acetato de etilo (2 x 10 ml). Las fases organicas combinadas se lavaron con bicarbonato sodico saturado (10 ml) y despues con salmuera (5 ml). La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice (metanol al 3 % en cloroformo) para dar el compuesto del tftulo.
Preparacion 49
1-[1-(9-{Bencil-[2-(4-benciloxi-3-hidroximetilfenil)-2-hidroxietil]amino}nonil)piperidin-4-il]-3-bifenil-2-ilurea
Una solucion del producto de la Preparacion 48 (163 mg, 0,20 mmol) en tetrahidrofurano (1,00 ml) se enfrio a 0 °C. Se anadio gota a gota hidruro de litio y aluminio (1,0 M en THF; 0,50 ml, 0,50 mmol) a la mezcla. Despues de 1 h, la mezcla de reaccion se inactivo con agua (1 ml) y se diluyo con acetato de etilo (2 ml). La fase organica se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de magnesio, y los extractos organicos se combinaron y se concentraron para dar el compuesto del tftulo.
Ejemplo Comparativo 13
Diclorhidrato de 1-bifenil-2-il-3-(1-{9-[2-hidroxi-2-(4-hidroxi-3-hidroximetilfenil)etilamino]nonil}piperidin -4-il)urea
Una solucion del producto de la Preparacion 49 (130 mg, 0,16 mmol) en isopropanol (0,80 ml) se enjuago con nitrogeno durante diez minutos y despues se anadio paladio (10% en peso (base seca) sobre carbono activado (60 mg). El matraz de reaccion se purgo con nitrogeno y despues un globo equipado con hidrogeno se unio al matraz y la mezcla de reaccion se agito en una atmosfera de hidrogeno. Despues de 72 h, la mezcla de reaccion se filtro y se concentro y el residuo se purifico por HPLC preparativa. La sal acido ditrifluoroacetico resultante del compuesto del tftulo se disolvio en acido clorhffdrico 1 N (5 ml) y se liofilizo para producir el compuesto del tftulo en forma de una sal diclorhidrato.
Preparacion 50
5-[(R)-2-[(3-AmmometilciclohexilmetM)ammo]-1-(ferc-butildimetMsilamloxi)etil]-8-benciloxi-1H-qumolm-2-ona
Una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 13 (1,46 g, 3 mmol) y 1,3-ciclohexanobis(metilamina) (426 mg, 3 mmol) en DMSO (3 ml) se calento a 100 °C durante 6 h. La mezcla de reaccion se dejo enfriar y despues se diluyo con diclorometano (20 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (10 ml). La fase organica se seco (MgSO4) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (MeOH al 10 %/DCM y NH4OH al 0,5 %) para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido (775 mg, rendimiento del 50 %). EM m/z: [M + H+] calc. para C32H47N3O3Si 550,3; encontrado 550,6.
Preparacion 51
1-{2-[(3-{[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidro-qumolm-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etilammo]metil}-cicloh exilmetil)carbamoil]etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 50 (552 mg, 1,01 mmol), el producto de la Preparacion 20 (309 mg, 0,84 mmol) y HATU (384 mg, 1,01 mmol) en DMF (1,68 ml) se le anadio DIPEA (190 pl, 1,09 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 50 °C durante una noche y despues el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en diclorometano (20 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (10 ml). La fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El producto en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (MeOH al 5-10 %/DCM) para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido (267 mg, rendimiento del 36 %). CLEM (10-70) Tr = 5,04. EM m/z: [M + H+] calc. para C53H6gN5O6Si 900,5; encontrado 900,6.
Preparacion 52
1-{2-[(3-{[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]metil}ciclohexilmetil)carbamoil] etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
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A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 51 (267 mg, 0,30 mmol) en diclorometano (3 ml) se le anadio trihidrofluoruro de trietilamina (98 pl, 0,6 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 10 h y despues se diluyo con diclorometano (10 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml). La fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido (236 mg, rendimiento del 100 %). EM m/z: [M + H+] calc. para C47H55N5O6 786,4; encontrado 786,5.
Ejemplo Comparativo 14
1-{2-[(3-{[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-ciclohexilmetil)carbamoil] etil}-piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio paladio (10% en peso (base seca) sobre carbono activado) (120 mg) a una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 52 (236 mg, 0,30 mmol) en etanol (3 ml). La mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno y se agito durante una noche. Despues, la mezcla de reaccion se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLc preparativa para dar el compuesto del tftulo (27 mg, 2 sales TFA). HPLC (10-70) Tr = 2,76. EM m/z: [M + H+] calc. para C40H49N5O6 696,4; encontrado 696,6.
Preparacion 53
1-{2-[((1R,3S)-3-Aminociclopentanocarbonil)amino]-etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 39 (318 mg, 0,94 mmol), acido
(1R,3S)-3-ferc-butoxicarbonilaminociclopentanocarboxflico (258 mg, 1,1 mmol) y HATU (428 mg, 1,1 mmol) en DMF (5 ml) se le anadio DIPEA (245 pl, 1,09 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante una noche y despues el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en diclorometano (20 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (10 ml). La fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El producto en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (MeOH al 5-10 %/DCM) y despues se disolvio en una mezcla de acido trifluoroacetico/DCM (1 m/5 ml) y se agito a temperatura ambiente durante 1 h. El disolvente se retiro a presion reducida. El residuo se disolvio en diclorometano (20 ml) y se lavo con hidroxido sodico 1 M (10 ml), se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se redujo para producir el compuesto del tftulo (167 mg, rendimiento del 39 %).
Preparacion 54
1-[2-({(1R,3S)-3-[(R)-2-(8-benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilaniloxi)etilamino]-ciclo pentanocarbonil}amino)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 53 (167 mg, 0,38 mmol) y el producto de la Preparacion 13 (92 mg, 0,19 mmol) en DMSO (0,38 ml) se calento a 90 °C durante 5 h. La solucion se enfrio y se diluyo con acetato de etilo (10 ml) y despues se calento con bicarbonato sodico acuoso saturado (5 ml). La fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida. El producto en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (MeOH al 5-10 %/DCM) para producir el compuesto del tftulo (343 mg, rendimiento del 100 %). CLEM (10-70) Tr = 4,97. EM m/z: [M + H+] calc. para C50H63N5O6Si 858,5; encontrado 858,8.
Preparacion 55
1-[2-({(1R,3S)-3-[(R)-2-(8-benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]ciclopentanocarbonil} amino)etil]-piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 54 (343 mg, 0,4 mmol) en THF (2 ml) se le anadio trihidrofluoruro de trietilamina (130 pl, 0,8 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 10 h y despues se diluyo con EtOAc (10 ml). La mezcla de reaccion se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml) y despues la fase organica se seco (sulfato de magnesio) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido (298 mg, rendimiento del 100 %). HPLC (10-70) Tr = 2,8. EM mlz: [M + H+] calc. para C44H49N5O6 744,4; encontrado 744,4.
Ejemplo Comparativo 15
Ditrifluoroacetato de 1-[2-({(1R,3S)-3-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-5-il)etilamino]- ciclopentanocarbonil}amino)etil]-piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 55 (236 mg, 0,40 mmol) en etanol (3 ml) se le anadio paladio (10 % en peso (base seca) sobre carbono activado (120 mg). La mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno y se agito durante una noche. La mezcla de reaccion se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLC preparativa para dar el compuesto del tftulo (3 mg, 2 sales TFA). HPLC (5-75) Tr = 2,18. EM m/z: [M + H+] calc. para C37H45N5O6 656,3, encontrado 656,2.
Preparacion 56
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4-(ferc-Butoxicarbonilaminometil)-2-clorofenilamina
Una solucion en agitacion de 4-aminometil-2-clorofenilamina (940 mg, 6 mmol) y dicarbonato de di-ferc-butilo (1,44 g, 6,6 mmol) en diclorometano (30 ml) se agito a temperatura ambiente durante 4 h, momento en el cual la reaccion se determino completada mediante CLEM. Despues, la mezcla de reaccion se lavo con bicarbonato sodico acuoso saturado (15 ml) y la fase organica se seco sobre sulfato sodico y el disolvente se retiro a presion reducida. EL solido de color naranja resultante se recristalizo en acetato de etilo para dar el intermedio del fftulo en forma de un solido de color blanco (rendimiento ~ 100 %).
Preparacion 57
N-[4-(ferc-Butoxicarbonilaminometil)-2-clorofenil]acrilamida
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 56 (1,54 g, 6,0 mmol) en una mezcla de dietil eter (35 ml) e hidroxido sodico 1 M (35 ml) se le anadio gota a gota cloruro de acriloMo (687 pl, 8,45 mmol). Despues de 1 h, la fase organica se separo, se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el intermedio del fftulo en forma de un solido de color blanco (1,8 g, rendimiento del 96 %).
Preparacion 58
1- [2-(4-(ferc-Butoxicarbonilaminometil)-2-clorofenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-
2- ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 8 (1,04 g, 3,5 mmol) y el producto de la Preparacion 57 (1,19 g, 3,85 mmol) en una mezcla de diclorometano y metanol (12 ml, 1:1) se calento a 60 °C durante 12 h. La mezcla de reaccion se dejo enfriar y el disolvente se retiro a presion reducida. El material en bruto se purifico por cromatograffa en columna (MeOH al 5-10 %/DCM) para dar el intermedio del tftulo en forma de un solido de color blanco (2,00 g, rendimiento del 94 %).
Preparacion 59
1-[2-(4-Aminometil-2-clorofenilcarbamoil)etil]-piperldin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 58 (2,00 g, 3,3 mmol) se agito en diclorometano (24 ml) y TFA (8 ml) durante 1 h y despues el disolvente se retiro a presion reducida. La mezcla de reaccion bruta se disolvio en diclorometano (30 ml) y se lavo con hidroxido sodico 1 M (2 x 30 ml). La fase organica se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el intermedio del tftulo en forma de un solido oleoso de color blanco (1,46 g, rendimiento del 88 %).
Preparacion 60
1-[2-(4-{[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilaniloxi)etilamino]metil}-2-clorof enilcarbamoil)-etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 59 (1,41 g, 2,79 mmol) y el producto de la Preparacion 13 (680 mg, 1,39 mmol) en DMSO (1,39 ml) se calento a 90 °C durante 8 h y despues se enfrio a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo/cloroformo (20 ml, 1/1) y la fase organica se lavo con bicarbonato sodico acuoso saturado (10 ml), se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto resultante se purifico por cromatograffa en columna (MeOH al 5-10 %/DCM) para dar el intermedio del fftulo en forma de un solido de color blanco (1,12 g, rendimiento del 88 %). EM m/z M+H+ = 914,9.
Preparacion 61
1-[2-(4-{[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]metil}-2-cloro-fenilcarbamoil) etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-il-carbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 60 (1,12 g, 1,23 mmol) en diclorometano (12 ml) se le anadio Et3N.3HF (401 pl, 0,6 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 10 h y despues se diluyo con diclorometano (10 ml). Esta mezcla se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml) y la fase organica se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el intermedio del fftulo en forma de un solido de color blanco (959 mg, rendimiento del 100 %). EM m/z M+H+ =800,5.
Ejemplo Comparativo 16
Ditrifluoroacetato de 1-[2-(2-Cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil} fenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 61 (959 mg, 1,2 mmol) en etanol (12 ml) se le anadio Pd/C (290 mg) y la mezcla de reaccion se puso en una atmosfera de hidrogeno y se agito durante una noche. Despues, la
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mezcla de reaccion se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLC preparativa para dar el compuesto del tftulo (67 mg, 2 sales TFA). HPLC (10-70) Tr = 2,76; EM m/z M+H+ = 710,6.
Preparacion 62
(5-ferc-Butoxicarbomlammopentilo)amida del acido 2-cloroetanosulfonico
A una solucion en agitacion de 5-(terc-butoxicarbonilamino)pentilamina (1,00 g, 4,94 mmol) y trietilamina (689 jl g,
4.94 mmol) en diclorometano (22 ml) a 0 °C se le anadio cloruro de 2-cloro-1-etanosulfonilo (470 jl, 4,50 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 2h a temperatura ambiente y despues se calento con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (15 ml). La fase organica se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (rendimiento del 100 %), que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
Preparacion 63
1-[2-(5-ferc-Butoxicarbomlammopentilsulfamoil)-etil]piperidm-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 8 (1,33 g, 3,5 mmol) y el producto de la Preparacion 62 (1,62 g,
4.94 mmol) en diclorometano y metanol (22 ml, 1:1) se calento a 60 °C durante 5 h. La mezcla de reaccion se dejo enfriar a temperatura ambiente y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se disolvio en diclorometano (20 ml) y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (10 ml). Despues, la fase organica se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por cromatograffa en columna (MeOH al 5-10 %/DCM) para dar el intermedio del tftulo en forma de un solido de color blanco (1,6 g, 55 %). EM m/z M+H+ = 589,6.
Preparacion 64
1-[2-(5-Aminopentilsulfamoil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 63 (1,6 g, 2,72 mmol) se agito en diclorometano (21 ml) y TFA (7 ml) durante 1 h y despues el disolvente se retiro a presion reducida. La mezcla de reaccion bruta se disolvio en diclorometano (30 ml) y se lavo con hidroxido sodico 1 M (2 x 30 ml). La fase organica se seco (Na2SO4) y despues, el disolvente se retiro a presion reducida para dar el intermedio del tftulo en forma de un solido oleoso de color blanco (1,19 g, rendimiento del 90 %).
Preparacion 65
1-(2-{5-[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etilammo] pentilsulfamoil}etil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 64 (917 mg, 1,88 mmol) y el producto de la Preparacion 13 (460 mg, 0,94 mmol) en DMSO (0,92 ml) se calento a 90 °C durante 8 h y despues se enfrio a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo/cloroformo (20 ml,1/1)y la fase organica se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (10 ml), se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto resultante se purifico por cromatograffa en columna (MeOH al 3-6 %/DCM) para dar el intermedio del tftulo en forma de un solido de color blanco (500 mg, rendimiento del 60 %). EM m/z M+H+ = 896,9.
Preparacion 66
1-(2-{5-[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]pentilsulfamoil}etil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 65 (500 mg, 0,56 mmol) en diclorometano (5,6 ml) se le anadio trihidrofluoruro de trietilamina (183 jl, 1,12 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 10 h y se anadio diclorometano (10 ml). La mezcla resultante se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml). La fase organica se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el intermedio del tftulo en forma de un solido de color amarillo (437 mg, rendimiento del 100 %. EM m/z M+H+ = 782,8.
Ejemplo Comparativo 17
Ditrifluoroacetato de 1-(2-{5-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)etilammo]pentil-
sulfamoil}etil)piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 66 (437 mg, 0,56 mmol) en etanol/metanol (5,6 ml, 1/1) se le anadio Pd/C (131 mg) y la mezcla de reaccion se coloco en una atmosfera de hidrogeno y se agito durante una noche. Despues, la mezcla de reaccion se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLC preparativa para dar el compuesto del tftulo en forma de la sal acido ditrifluoroacetico (71 mg). HPLC (10-70) Tr = 2,59; EM m/z M+H+= 692,6.
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1-{2-[(4-Formilbencenosulfonil)metilamino]-etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 26 (350 mg, 1 mmol) y trietilamina (167 pl, 1,2 mmol) en diclorometano (5 ml) se le anadio cloruro de 4-formilbencenosulfonilo (225 mg, 1,1 mmol). Despues de 1 h a temperatura ambiente, la reaccion se completo por EM y despues, la mezcla de reaccion se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico (5 ml). Despues, la fase organica se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el intermedio del tttulo (323 mg, rendimiento del 62 %). EM m/z M+H+= 522,4.
Preparacion 68
1-{2-[(4-{[(R)-2-(ferc-Butildimetilsilamloxi)-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-M)etilammo]metil}benceno- sulfonil)-metilamino]etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion de 5-[(R)-2-amino-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-hidroxi 1H-quinolin-2-ona (293 mg, 0,74 mmol) y el producto de la Preparacion 67 en diclorometano y metanol (6,2 ml, 1/1) se agito a temperatura ambiente durante 1 h y despues se anadio triacetoxiborohidruro sodico (394 mg, 1,86 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 4 h, momento en el cual mediante EM se determino que la reaccion se completo. Despues, la mezcla de reaccion se acidifico con acido clorhndrico concentrado y el disolvente se retiro a presion reducida para proporcionar el compuesto del tttulo, que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. EM m/z M+H+ = 840,8.
Ejemplo Comparativo 18
Ditrifluoroacetato de 1-{2-[(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil} bencenosulfonil)metilamino]etil}-piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 68 (520 mg, 0,62 mmol) en acido clorhndrico 1 M (5 ml) y acetonitrilo (5 ml) se calento a 60 °C durante 8 h. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo en bruto se purifico por HPLC preparativa para dar el compuesto del tttulo en forma de la sal acido ditrifluoroacetico (220 mg). HPLC (10-70) Tr = 2,77; Em m/z M+H+= 726,7.
Preparacion 69
Clorhidrato de (3-aminometilfenil)metanol
(a) (3-ferc-Butoxicarbomlmetilfeml)metanol
Se anadio dimetilsulfuro-borano (2,05 ml, 21,6 mmol) a una solucion de acido
3-(terc-butoxicarbonilaminometil)benzoico (1,81 g, 7,20 mmol) en tetrahidrofurano (24 ml), y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. Despues, la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (20 ml) y las fases se separaron. La fase organica se lavo con saturado bicarbonato sodico, saturado cloruro sodico, se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para dar el compuesto del tttulo en forma de un aceite de color amarillo (1,71 g).
(b) Clorhidrato de (3-aminometilfenil)metanol
Al producto de la etapa (a) (1,71 g, 7,2 mmol) se le anadio una solucion de acido clorhndrico 4 M en dioxano (9 ml, 36 mmol) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 h. Despues, la mezcla de reaccion se concentro y el residuo se diluyo con dietil eter (50 ml) y se filtro para proporcionar el compuesto del tttulo en forma de un solido de color blanco (1,09 g).
Preparacion 70
1-{2-[3-(3-Hidroximetilbencil)ureido]etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion 0,2 M del producto de la Preparacion 35 (760 mg, 2,24 mmol) en W,A/-dimetilformamida se anadio gota a gota a una solucion de 1,1'-carbonildiimidazol (364 mg, 2,24 mmol) y diisopropiletilamina (0,31 ml, 2,24 mmol) en W,W-dimetilformamida (11 ml) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 2 h. Se anadieron diisopropiletilamina (0,31 ml, 2,24 mmol) y el producto de la Preparacion 69 (578 mg, 3,4 mmol) y esta mezcla se agito a 50 °C durante 12 horas. Despues, la mezcla de reaccion se concentro a sequedad y el residuo se diluyo con diclorometano (20 ml) y esta solucion se lavo con bicarbonato sodico saturado (2 x), saturado cloruro sodico, se seco sobre sulfato de magnesio, y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo (1,12 g). CLEM (2-90) Tr = 4,01 min.; EM m/z M+H = 503,5.
Preparacion 71
1-{2-[3-(3-Formilbencil)ureido]etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 70 (1,12 g, 2,23 mmol) en diclorometano (11,1 ml) se enfrio a 0 °C y se
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anadieron diisopropiletilamina (1,17 ml, 6,70 mmol) y dimetilsulfoxido (0,949 ml, 13,4 mmol). Despues de aproximadamente 10 minutos, se anadio un complejo piridina-trioxido de azufre (1,06 g, 6,70 mmol) y la mezcla resultante se agito a 0 °C durante 2 h. Despues, la reaccion se detuvo con agua (15 ml) y la fase organica se lavo con agua fna (3 x), se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo de color amarillo intenso (609 mg). CLEM (2-90) Tr = 4,13 min; EM m/z M+H = 501,3.
Preparacion 72
1-{2-[3-(3-{[(R)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)etilammo]metil}bencil) ureido]etil}-piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio 5-[(R)-2-amino-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-hidroxi-1H-quinolin-2-ona (575 mg, 1,40 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 71 (609 mg, 1,2 mmol) y diisopropilamina (0,25 ml, 1,40 mmol) en diclorometano (6 ml) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 45 min. Despues, se anadio triactetoxiborohidruro sodico (385 mg, 1,80 mmol) y esta mezcla se agito a temperatura ambiente durante 12 h. Despues, la reaccion se detuvo con acido clorhndrico acuoso al 10 % (5 ml) y las fases se separaron. La fase organica se lavo con saturado bicarbonato sodico, cloruro sodico saturado, se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para dar el compuesto del tftulo (1,1 g). HPLC (10-70) Tr = 3,55 min; EM m/z M+H = 819,7.
Ejemplo Comparativo 19
Ditrifluoroacetato de 1-{2-[3-(3-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil} bencil)ureido]etil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio trihidrofluoruro de trietilamina (2,4 ml, 13,6 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 72 (1,1 g, 1,36 mmol) en diclorometano (2 ml) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 15 h. Despues, la mezcla de reaccion se concentro al vado a sequedad y el residuo se disolvio en a 1:1 mezcla de agua y acetonitrilo con TFA al 0,1 % y esta mezcla se purifico por HPLC (5-35 durante 60 min) para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de una sal ditrifluroacetato (296 mg, pureza del 99 %). EM m/z M+H = 705,6.
Preparacion 73
1-[(£)-3-(4-Nitrofenil)alil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 8 (2,96 g, 0,01 mol) y p-nitrocinnamaldelddo (1,77 g, 0,01 mol) se agitaron en 50 ml de diclorometano durante 2 h. Se anadio triacetoxiborohidruro sodico (6,33 g, 0,03 mol) y la mezcla resultante se agito durante 2 h. Despues, la reaccion se detuvo con 10 ml de agua y esta mezcla se diluyo con diclorometano (100 ml). La fase organica se lavo con bicarbonato sodico saturado (2 x), salmuera, se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de una espuma de color amarillo (3,8 g, rendimiento del 80 %).
Preparacion 74
1-[3-(4-Aminofenil)propil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 73 (2,5 g, 5,4 mmol) se disolvio en 100 ml de etanol y la solucion resultante se purgo con nitrogeno durante 30 min. Despues, se anadio paladio sobre carbono (2,5 g; 50 % p/p agua; Pd al 10 %; 1,1 mmol Pd) mientras que se desgasificaba con nitrogeno. Esta mezcla se coloco despues en hidrogeno (0,34 Mpa (50 psi)) hasta que ya no se consuirfta hidrogeno (~30 minutos). Despues, la mezcla se purgo con nitrogeno, se filtro a traves de Celite y se concentro. El residuo se disolvio en acetato de etilo y esta mezcla se lavo con bicarbonato sodico saturado (2 x), salmuera, se seco (Na2SO4), se filtro y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo (2,08 g, rendimiento del 90 %). EM m/z M+H = 430,5.
Preparacion 75
1-{3-[4-(4-{2-[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-M)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)etilammo]etil} fenilamino)-fenil]propil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A un matraz de fondo redondo de 25 ml se le anadieron el producto de la Preparacion 74 (400 mg, 0,8 mmol); 8-benciloxi-5-[(R)-2-[2-(4-bromofenil)etilamino]-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-1H-quinolin-2-ona (769 mg, 1,2 mmol); tris(dibencilidenoacetona)dipaladio (0) (73 mg, 0,08 mmol, Pd al 20 %); y 2-(diciclohexilfosfino)bifenilo (84 mg, 0,24 mmol). Esta mezcla se purgo con nitrogeno y despues se seco, se anadio tolueno desgasificado (8 ml, 0,1 M) y la mezcla resultante se calento a 70 °C durante 30 min. Despues se anadio terc-butoxido sodico (382 mg, 4,0 mmol), y la temperatura se elevo a 95 °C durante 4 h, momento en el cual la CLEM mostro el consumo completo del producto de la Preparacion 74 y un gran pico del producto (M+H = 956,7). Despues, la mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se diluyo con etilo acetato. Esta mezcla se lavo con bicarbonato sodico saturado (2 x), salmuera, se seco (Na2SO4), se filtro y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo (1,5 g), que se uso sin purificacion adicional.
Preparacion 76
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1-{3-[4-(4-{2-[(R)-2-(8-Benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]etil}fenilamino)fenil]propil} piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 75 se disolvio en diclorometano (10 ml) y se anadio trihidrofluoruro de trietilamina (10equiv.). La mezcla de reaccion se agito durante una noche y despues se diluyo con diclorometano y la fase organica se lavo con bicarbonato sodico saturado (2 x), salmuera, se seco (Na2SO4), se filtro y se concentro para proporcionar 1,3 g del producto en bruto. Este material se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice (DCM, de forma gradualmente a metanol al 50 %) para proporcionar el compuesto del tftulo (300 mg, aproximadamente 75 % de pureza), que se uso sin purificacion adicional.
Ejemplo Comparativo 20
Ditrifluoroacetato de
1-{3-[4-(4-{2-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]etil}fenilamino)fenil]propil}pipe ridin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 76 (300 mg) se disolvio en 10 ml de etanol y esta mezcla se purgo con nitrogeno durante 15 minutos. Se anadio paladio sobre carbono (Pd al 10 %, 50 % p/p agua, 0,2 equiv. Pd) mientras se desgasificaba. Despues, la mezcla resultante se coloco en 1 atm. de hidrogeno durante 2 h, momento en el cual la reaccion se completo por CLEM. Despues, la solucion se purgo con nitrogeno durante 15 min y despues se filtro a traves de Celite y se concentro. El residuo resultante se purifico por HPLC prep. para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de una sal ditrifluoroacetato (59 mg, pureza >95 %). EM m/z M+H = 752,8.
Preparacion 77
1-[2-Fluoro-3-(4-hidroximetilpiperidin-1-ilmetil)-bencil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 8 (500 mg, 1,69 mmol), 2,6-bis(bromometil)-1-fluorobenceno (476 mg, 1,69 mmol, piperidin-4-ilmetanol (195 mg, 1,69 mmol) y carbonato potasico (466 mg, 3,37 mmol) se suspendieron en acetonitrilo (5 ml) y se agitaron a temperatura ambiente durante 18 h. Despues, la mezcla de reaccion se concentro y el residuo se disolvio en diclorometano/agua. Las fases se separaron y la fase organica se lavo con agua (2 x), salmuera, se seco (MgSO4) y se concentro. El material en bruto se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice eluyendo con metanol al 3 %/cloroformo para dar el compuesto del tftulo en forma de una espuma de color blanco (282 mg). EM m/z M+H = 532,3.
Preparacion 78
1- [2-Fluoro-3-(4-formilpiperidin-1-ilmetil)bencil]-piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 77 (282 mg, 0,53 mmol) se disolvio en diclorometano y a esta mezcla se le anadieron diisopropiletilamina (280 pl, 1,6 mmol) y dimetilsulfoxido (115 pl, 1,6 mmol). La mezcla de reaccion se enfrio a -15 °C en atmosfera de nitrogeno y se anadio un complejo piridina-trioxido de azufre (255 mg, 1,6 mmol) y la mezcla resultante se agito durante 40 min. Despues, la reaccion se detuvo con agua y las fases se separaron. La fase organica se lavo con NaH2PO4 acuoso (1 M x 3), salmuera, se seco (MgSO4) y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de una espuma (253 mg). EM m/z M+H = 530,4.
Ejemplo Comparativo 21
Ditrifluoroacetato de 1-[2-Fluoro-3-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}piperidin-1-ilmetil)bencil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 78 (253 mg, 0,48 mmol) se disolvio en una mezcla 1:1 de diclorometano y metanol (6 ml) y a esta mezcla se le anadieron acetato de 5-[(R)-2-amino-1-(ferc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-hidroxi-1H-quinolin-2-ona (228 mg, 0,58 mmol) y triacetoxiborohidruro sodico (317 mg, 1,5 mmol). La mezcla de reaccion se agito en nitrogeno a temperatura ambiente durante 18 h y despues se concentro. El residuo se disolvio en una mezcla 2:3 de acetonitrilo y acido clorhffdrico acuoso 6 N, y esta mezcla se calento a 55 °C durante 4 horas. Despues, la mezcla de reaccion se concentro y el residuo se disolvio en agua/acetonitrilo/acido trifluoroacetico (1:1:0,005) y se purifico por cromatograffa en columna en fase inversa para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de un solido de color blanco (175 mg). EM m/z M+H = 734,5.
Preparacion 79
2- [4-(3-Bromopropoxi)fenil]etanol
A una solucion de alcohol de 4-hidroxifenetilo (4,37 g, 31,0 mmol) y carbonato potasico (6,55 g, 47,0 mmol) en acetonitrilo (62,0 ml) se le anadio 1,3 dibromopropano (31,0 ml, 316 mmol). La mezcla de reaccion se calento a 70 °C durante 12 horas y despues se enfrio a temperatura ambiente, se filtro y se concentro al vacfo. El aceite resultante se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice usando una mezcla de 4:1 de hexanos y acetato de etilo para dar el compuesto del tftulo (6,21 g) en forma de un solido de color blanco.
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1-{3-[4-(2-Hidroxietil)fenoxi]propil}piperidm-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion del producto de la Preparacion 79 (1,11 g, 4,30 mmol) y diisopropiletilamina (0,90 ml, 5,10 mmol) en acetonitrilo (21,5 ml) se le anadio el producto de la Preparacion 8 (1,27 g, 4,30 mmol) y la mezcla resultante se agito a 60 °C. durante 12 h. Despues, la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (20 ml) y se lavo con bicarbonato sodico saturado (25 ml), cloruro sodico saturado (25 ml), se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo (1,98 g, 85 % de pureza). EM m/z M+H = 475,5.
Preparacion 81
1-{3-[4-(2-Oxoetil)fenoxi]propil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Una solucion del producto de la Preparacion 80 (723 mg, 1,53 mmol) y diclorometano (75 ml) se enfrio a aproximadamente 5 °C y se anadieron diisopropiletilamina (798 ml, 4,58 mmol) y dimetilsulfoxido (649 ml, 9,15 mmol). Despues se anadio piridina-trioxido de azufre (728 mg, 4,58 mmol) y la mezcla resultante se agito a 5 °C durante 45 min Despues, la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (20 ml) y se lavo con bicarbonato sodico saturado (25 ml), cloruro sodico saturado (25 ml), se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo (604 mg). EM m/z M+H = 473,4.
Preparacion 82
1-[3-(4-{2-[(R)-2-(ferc-butildimetilsilamloxi)-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-il)etilammo]etil}-fenoxi)pr opil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
El producto de la Preparacion 81 (604 mg, 1,28 mmol) se disolvio en metanol (6,4 ml) y se anadieron 5-[(R)-2-amino- 1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-hidroxi-1H-quinolin-2-ona (605 mg, 1,53 mmol) y diisopropiletilamina (0,27 ml, 1,53 mmol). Despues, se anadio triacetoxiborohidruro sodico (405 mg, 1,91 mmol) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 h. Despues, la mezcla de reaccion se concentro a sequedad y el residuo se diluyo con acetato de etilo (20 ml) y esta solucion se lavo con bicarbonato sodico saturado (25 ml), cloruro sodico saturado (25 ml), se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para dar el compuesto del tftulo (704 mg). EM m/z M+H = 791,8.
Ejemplo Comparativo 22
Ditrifluoroacetato de 1-[3-(4-{2-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]etil}fenoxi) propil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se anadio trihidrofluoruro de trietilamina (1,5 ml, 8,87 mmol) a una solucion del producto de la Preparacion 82 (702 mg, 0,89 mmol) en diclorometano (4,5 ml) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 24 h. Despues, la mezcla se concentro al vado y se purifico por HPLC (2-35 durante 90 min) para dar el compuesto del tftulo (92 mg) en forma de un polvo de color blanco. EM m/z M+H = 677,4.
Preparacion 83
4-Yodofenilacetato de metilo
A una solucion en agitacion de acido 4-yodofenilacetico (5,0 g, 19,1 mmol) en MeOH (200 ml) se le anadio acido clorlddrico 4 N en dioxano (10 ml). La mezcla de reaccion se agito durante 24 h a temperatura ambiente y despues el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (5,17 g, rendimiento del 98 %), que se uso sin purificacion adicional.
Preparacion 84
[4-(4-Hidroxibut-1-inil)fenil]acetato de metilo
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 83 (4,5 g, 16,3 mmol) en dietilamina (100 ml) se le anadio but-3-in-1-ol (1,9 ml, 32,6 mmol), Pd(PPh3)2Cl2 (500 mg, 1,63 mmol) y Cul (154 mg, 0,815 mmol) y la mezcla resultante se agito durante 17 h a temperatura ambiente. Despues, el disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se disolvio en dietil eter (200 ml) y esta solucion se filtro para retirar sales. Despues, el disolvente se retiro a presion reducida y el producto en bruto se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice (EtOAc al 60 %/Hexano) para proporcionar el intermedio del tftulo (3,03 g, rendimiento del 91 %).
Preparacion 85
[4-(4-Hidroxibutilo)fenil]acetato de metilo
Una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 84 (2,8 g, 12,8 mmol) en metanol (50 ml) se enjuago con nitrogeno y despues se anadio paladio al 10 % sobre carbono (400 mg, 20 % p/p). Despues, el matraz de reaccion se
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coloco alternativamente al vado y se enjuago con hidrogeno durante ciclos y despues se agito en hidrogeno durante 14 h. La mezcla de reaccion se enjuago con nitrogeno y despues se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (2,75 g, rendimiento del 97 %), que se uso sin purificacion adicional.
Preparacion 86
(4-{4-[4-(Bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]butil}fenil)acetato de metilo
(a) {4-[4-(Tolueno-4-sulfoniloxi)butil]fenil}acetato de metilo
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 85 (2,6 g, 12,5 mmol) en THF (100 ml) se le anadio DABCO (2,6 g, 25,0 mmol) y despues cloruro de p-toluenosulfonilo (2,44 g, 13,75 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperature ambiente durante 23 h y despues el disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se disolvio en diclorometano (200 ml). Despues, la fase organica se lavo con agua (2 X 100 ml), acido clorddrico 1 N (100 ml), solucion acuosa saturada de cloruro sodico (100 ml), se seco (MgSO4), se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo, que se uso sin purificacion adicional.
(b) (4-{4-[4-(Bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]butil}fenil)acetato de metilo
Al producto en bruto de la etapa (a) se le anadio DMF (50 ml), diisopropiletilamina (3,0 ml, 17,3 mmol) y el producto de la Preparacion 8 (2,4 g, 8,1 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 18 h y despues el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (3,5 g, 86,rendimiento del 3 %). EM m/z 501,6 (MH4), Fr 4,89 min (10-70 % ACN: H2O, HPLC de fase inversa).
Preparacion 87
1 -{4-[4-(2-Hidroxietil)fenil]butil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 86 (2,0 g, 4,0 mmol) en THF (100 ml) se le anadio gota a gota DIBAL (24 ml, 24 mmol, 1,0 M en THF). Despues de completarse la adicion, la mezcla de reaccion se agito durante 3 h y despues se inactivo por adicion lenta de metanol (hasta que el desprendimiento de gas ceso). Despues, la mezcla se agito durante 30 min y despues se anadieron acetato de etilo (200 ml) e hidroxido sodico acuoso 1 N (200 ml). La fase organica se separo y se lavo con una solucion acuosa saturada de cloruro sodico (100 ml), se seco (MgSO4), se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (1,3 g, rendimiento del 69 %), que se uso sin purificacion adicional. EM m/z 473,4 (MH+), Fr 4,53 min (10-70 % AcN: H2O, HPLC de fase inversa).
Ejemplo Comparativo 23
1-[2-(4-{2-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]etil}fenil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 87 (500 mg, 1,06 mmol) en diclorometano (25 ml) se le anadieron dimetilsulfoxido (0,60 ml, 10,6 mmol) y diisopropiletilamina (0,921 ml, 5,3 mmol). Despues, la mezcla de reaccion se enfrio a -10 °C y se anadio piridina-trioxido de azufre (842 mg, 5,3 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 1 h y despues se inactivo anadiendo agua (100 ml). Esta mezcla se agito durante 10 min y despues la fase organica se retiro y se lavo con una solucion acuosa saturada de cloruro sodico (100 ml), se seco (MgSO4) y despues se filtro.
Al filtrado se le anadieron metanol (25 ml), acetato de 5-[(R)-2-amino-1-(ferc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-hidroxi- 1H-quinolin-2-ona (419 mg, 1,06 mmol) y triacetoxiborohidruro sodico (468 mg, 2,12 mmol). Esta mezcla se agito durante 16 h y despues se condenso y, a la mezcla resultante, se le anadio una mezcla 1:1 de acetonitrilo y acido clorddrico acuoso 4 N (20 ml). Esta mezcla se calento a 50 °C durante 17 h y despues el disolvente se retiro a presion reducida. Al residuo se le anadio una mezcla 1:1 de acido acetico y agua (8,0 ml) y la mezcla se sometio a cromatograffa sobre gel de sflice en fase inversa (gradiente de elucion, ACN al 10-50 %/H2O) para proporcionar el compuesto del tftulo (67 mg, rendimiento del 7 % durante 3 etapas). EM m/z (MH+) 675,5; Fr 3,07 (10-70 % ACN: H2O, HPLC de fase inversa).
Preparacion 88
3-[5-(2-Etoxicarbonilvinil)tiofen-2-il]acrilato de etilo
A una solucion en agitacion de hidruro sodico (2,1 g, 53 mmol, en aceite mineral al 60 %) en THF (200 ml) se le anadio lentamente trietilfosfonoacetato (10 ml, 50 mmol). Se observo desprendimiento de gas hidrogeno y la reaccion se agito hasta que ceso el desprendimiento de gas (aproximadamente 30 min). A esta mezcla de reaccion se le anadio 2,5-tiofenodicarboxaldeddo (3 g, 21 mmol) y la mezcla de reaccion se agito durante 1 h. El disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se disolvio en diclorometano (200 ml). La fase organica se lavo con agua (100 ml), acido clorddrico acuoso 1 N (100 ml), solucion acuosa saturada de cloruro sodico (100 ml), se seco (MgSO4), se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (5,8 g, rendimiento del 98 %), que se uso sin
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Preparacion 89
3-[5-(2-Etoxicarboniletil)tiofen-2-il]propionato de etilo
Una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 88 (5,8 g, 21 mmol) en metanol (200 ml) se enjuago con nitrogeno y se anadio paladio al 10 % sobre carbono (576 mg, 10 % p/p) se anadio. El matraz de reaccion se coloco alternativamente al vado y se enjuago con hidrogeno durante 3 ciclos y despues la mezcla de reaccion se agito en hidrogeno durante 1 h. Despues, la mezcla se enjuago con nitrogeno, se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (5,8 g, rendimiento del 99 %), que se uso sin purificacion adicional.
Preparacion 90
3- [5-(3-Hidroxipropil)tiofen-2-il]propan-1-ol
A una solucion en agitacion de DIBAL (88 ml, 88 mmol, 1,0 M en ciclohexano) en THF (300 ml) a -78 °C se le anadio gota a gota el producto de la Preparacion 89 (5,0 g, 17,6 mmol). Despues de completarse la adicion, la mezcla de reaccion se calento a temperatura ambiente durante 30 min y despues se inactivo por adicion lenta de acido clorhffdrico acuoso 1 N (200 ml). Se anadio diclorometano (400 ml) y las fases se separaron. La fase acuosa se lavo con diclorometano (4 x 100 ml) y las fases organicas combinadas se lavaron con una solucion acuosa saturada de cloruro sodico (100 ml), se secaron (MgSO4), se filtraron y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo (3,0 g, rendimiento del 85 %), que se uso sin purificacion adicional.
Preparacion 91
1-{3-[5-(3-Hidroxipropil)tiofen-2-il]propil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-Mcarbamico
(a) 3-[5-(3-Hidroxipropil)tiofen-2-il]propil ester del acido tolueno-4-sulfonico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 90 (423 mg, 2,1 mmol) en THF (20 ml) se le anadio DABCO (420 mg, 4,2 mmol) y despues cloruro de p-toluenosulfonilo (442 mg, 2,3 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 h y despues el disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se disolvio en diclorometano (200 ml). La fase organica se lavo con agua (2 x 100 ml), solucion acuosa saturada de cloruro sodico (100 ml), se seco MgSO4), se filtro y el disolvente se retiro a presion reducida para dar el compuesto del tftulo, que se uso sin purificacion adicional.
(b) 1-{3-[5-(3-Hidroxipropil)tiofen-2-il]propil}piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Al producto de la etapa (a) se le anadieron acetonitrilo (20 ml), diisopropiletilamina (0,5 ml, 2,8 mmol) y el producto de la Preparacion 8 (626 mg, 2,11 mmol). La mezcla de reaccion se calento a 50 °C durante 20 h y despues se enfrio a temperatura ambiente y el disolvente se retiro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice (MeOH al 5 %/DCM con NH3 al 0,6 % (ac.)) para proporcionar el compuesto del tftulo (450 mg, rendimiento del 44 %). EM m/z (MH+) 479,6; Fr 4,15 min (10-70 % ACN: H2O, HPLC de fase inversa).
Preparacion 92
1-[3-(5-{3-[(R)-2-(ferc-ButNdimetNsNamloxi)-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-M)etMammo]propN}tiofen-2 -il)propil]-piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion en agitacion del producto de la Preparacion 91 (450 mg, 0,94 mmol) en diclorometano (20 ml) se le anadieron dimetilsulfoxido (0,21 ml, 3,7 mmol) y diisopropiletilamina (0,65 ml, 3,7 mmol). Esta mezcla se enfrio a -10 °C y se anadio piridina-trioxido de azufre(444 mg, 2,8 mmol). La mezcla de reaccion se agito durante 3 h y despues se inactivo anadiendo agua (100 ml). Esta mezcla se agito durante 10 min y despues la fase organica se retiro y se lavo con una solucion acuosa saturada de cloruro sodico (100 ml), se seco (MgSO4) y se filtro.
Al filtrado se le anadieron metanol (20 ml), 5-[(R)-2-amino-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-hidroxi- 1H-quinolin-2-ona acetato (368 mg, 0,93 mmol) y despues triacetoxiborohidruro sodico (412 mg, 1,86 mmol). Esta mezcla se agito durante 19 h y despues la mezcla se condenso para dar el compuesto del tftulo, que se uso sin purificacion adicional. EM m/z (MH+) 795,8; Fr4,93 min (ACN al 10-70%: H2O, HPLC de fase inversa).
Ejemplo Comparativo 24
1-[3-(5-{3-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]propil}tiofen-2-il)propil]piperidin-
4- il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Al producto en bruto de la Preparacion 92 se le anadio una mezcla 1:1 de acetonitrilo y acido clorhffdrico 4 N acuoso (25 ml). Esta mezcla se calento a 50 °C durante 17 h y despues el disolvente se retiro a presion reducida. Al residuo se le anadio una mezcla 1:1 de acido acetico y agua (8,0 ml) y esta mezcla se sometio a cromatograffa sobre gel de sflice
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en fase inversa (gradiente de elucion, ACN al 10-50 %/H2O) para proporcionar el compuesto del tftulo (135 mg, rendimiento del 16 % durante 3 etapas). EM m/z (MH+) 681,5; Fr 3,03 (10-70 % ACN: H2O, HPLC de fase inversa).
Preparacion 93
4-Amino-5-cloro-2-metoxibenzoato de metilo
A una solucion de acido 4-amino-5-cloro-2-metoxibenzoico (1,008 g, 5,0 mmol) en una mezcla de tolueno (9 ml) y metanol (1 ml) a 0 °C se le anadio gota a gota (trimetilsilil)diazometano (2,0 M en hexano, 3,0 ml, 6,0 mmol). Despues, la mezcla de reaccion se calento a temperatura ambiente y se agito durante 16 h. El exceso de (trimetilsilil)diazometano se inactivo anadiendo acido acetico hasta que el color amarillo brillante de la mezcla de reaccion desaparecio. Despues, la mezcla se concentro al vado para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido de color blanquecino, que se uso sin purificacion adicional.
Preparacion 94
4-Acriloilamino-5-cloro-2-metoxibenzoato de metilo
Al producto en bruto de la Preparacion 93 se le anadieron diclorometano (10 ml, 0,5 M) y trietilamina (2,1 ml, 15 mmol). Esta mezcla se enfrio a 0 °C y se anadio gota a gota con agitacion cloruro de acrilofto (812 pl, 10 mmol). Despues de 2 h, la reaccion se interrumpio anadiendo metanol (aproximadamente 2 ml) a 0 °C y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 15 min y despues se concentro al vado. Se anadieron diclorometano (30 ml) y agua (30 ml) al residuo y esta mezcla se mezclo vigorosamente. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (20 ml). Las fases organicas se combinaron, se secaron (Na2SO4), se filtraron y el disolvente se retiro al vado para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido espumoso de color pardo, que se uso sin purificacion adicional.
Preparacion 95
4-{3-[4-(Bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propionilamino}-5-cloro-2-metoxibenzoato de metilo
Al producto en bruto de la Preparacion 94 se le anadieron el producto de la Preparacion 8 (1,33 g, 4,5 mmol) y una mezcla de THF (22,5 ml) y metanol (2,5 ml). Esta mezcla se calento a 50 °C con agitacion durante 16 h y despues se retiro el disolvente al vado. El residuo se sometio a cromatograffa (gel de sflice; EtOAc) para dar el compuesto del tftulo (0,82 g; Fr = 0,4, rendimiento del 29 % durante 3 etapas) en forma de un solido espumoso de color blanquecino. EM m/z 566,4 (M+H, esperado 565,20 para C30H32ClN3O6).
Preparacion 96
1-[2-(2-Cloro-4-hidroximetil-5-metoxi-fenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-Ncarbamico
A una solucion del producto de la Preparacion 95 (0,82 mg, 1,45 mmol) en una mezcla de THF (4,5 ml) y metanol (0,5 ml) a 0°C se le anadio borohidruro de litio (32 mg, 1,45 mmol). La mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante 41 h. Despues, la reaccion se detuvo anadiendo acido clorhfdrico acuoso 1 N a 0 °C hasta que no se observo mas burbujeo y esta mezcla se agito durante 10 min El disolvente se retiro al vado y el residuo se disolvio en acetonitrilo (aproximadamente 2 ml). Esta solucion se purifico por RP-HPLC prep. (gradiente: acetonitrilo del 2 al 50 % en agua con TFA al 0,05 %). Las fracciones apropiadas se recogieron y se combinaron y liofilizaron para dar el compuesto del tftulo en forma de una sal trifluoroacetato. Esta sal se trato con acetato de isopropilo (10 ml) e hidroxido sodico acuoso 1 N (10 ml) y la fase organica se recogio, se seco (Na2SO4), se filtro y el disolvente se retiro al vado para dar el compuesto del tftulo (161 mg, rendimiento del 21 %) en forma de un solido espumoso de color blanco. EM m/z 538,4 (M+H, esperado 537,20 para C2gH32ClN3O5).
Preparacion 97
1-[2-(2-Cloro-4-formil-5-metoxifenilcarbamoil)-etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una solucion del producto de la Preparacion 96 (161 mg, 0,3 mmol) en diclorometano (3 ml) se le anadio dimetilsulfoxido (213 pl, 3,0 mmol) y diisopropiletilamina (261 pl, 1,5 mmol). Esta mezcla se enfrio a -20 °C y se anadio lentamente un complejo trioxido de azufre-piridina (238 mg, 1,5 mmol). Despues de 30 min, la mezcla de reaccion se inactivo anadiendo agua (aproximadamente 3 ml). Las fases se separaron y la fase organica se seco (Na2SO4), se filtro y el disolvente se retiro al vado para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido de color amarillo claro. EM m/z 536,3 (M+H, esperado 535,19 para C2gH30ClN3O5).
Preparacion 98
1-[2-(4-{[(R)-2-(ferc-ButNdimetMsNamloxi)-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroqumolm-5-M)etNammo]metN}-2-cloro-5- metoxi-fenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
Al producto de la Preparacion 97 en una mezcla de diclorometano (0,5 ml) y metanol (0,5 ml) se le anadio acetato de
5-[(R)-2-amino-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-hidroxi-1H-quinolin-2-ona (124,1 mg, 3,1 mmol) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1,1 h. Se anadio triacetoxiborohidruro sodico (190,7 mg, 0,9 mmol) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 15 h. La reaccion se interrumpio anadiendo agua (aproximadamente 0,2 ml) y la mezcla se concentro al vacm para dar el compuesto del tftulo, que se uso sin 5 purificacion adicional. EM m/z 854,5 (M+H, esperado 853,36 para C46H56ClN5OySi).
Ejemplo Comparativo 25
Ditrifluoroacetato de 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino] metil}-5-metoxifenil-carbamoil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico
A una suspension del producto de la Preparacion 98 en diclorometano (1,0 ml, 0,3 M) se le anadio trihidrofluoruro de 10 trietilamina (245 pl, 1,5 mmol). Esta mezcla se agito a temperatura ambiente durante 45 h y despues la mezcla se concentro al vacm. El residuo se disolvio en una mezcla de DMF (0,5 ml), acetonitrilo/agua (1:1, con TFA al 0,1 %, 0,6 ml), TFA (0,3 ml) y acetonitrilo (aproximadamente 1 ml) y esta mezcla se purifico por RP-HPLC prep. (gradiente: acetonitrilo del 2 al 50 % en agua con TFA al 0,05 %). Las fracciones apropiadas se recogieron y se combinaron y liofilizaron para dar el compuesto del tftulo (100 mg, rendimiento del 34 %, 98,7 % puro por HPLC) en forma de un 15 solido de color blanquecino. EM m/z 740,5 (M+H, esperado 739,28 para C40H42ClN5Oy).
Usando los procedimientos descritos anteriormente y los materiales de partida apropiados, se preparo el siguiente compuesto.
Ej.
Compuesto EM
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1-{2-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-2-metil-fenilcarba moil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico 690,4
Preparacion A
20 Cultivo celular y preparacion de membrana de celulas que expresan los receptores Pi, P2 o P3 adrenergicos humanos
Lmeas celulares de celulas de ovario de hamster chino (CHO, de Chinese hamster ovary) que expresaban de forma estable los receptores p1, p2 o p3 adrenergicos, respectivamente, se hicieron crecer casi hasta confluencia en medio F-12 de Ham con SBF al 10% en presencia de 500 pg/ml de geneticina. La monocapa celular se levanto con EDTA 25 2 mM en PBS. Las celulas se sedimentaron mediante centrifugacion a 1.000 rpm, y, o bien los sedimentos celulares se
conservaron congelados a -80 °C o bien se prepararon las membranas inmediatamente para su uso. Para la preparacion de membranas que expresaban receptores p1 y p2 , los sedimentos celulares se resuspendieron en tampon de lisis (HEPES/HCl 10 mM, EDTA 10mM, pH 7,4 a 4 °C) y se homogeneizaron usando un homogeneizador de cristal Dounce de ajuste estrecho (30 golpes) en hielo. Para las membranas que expresaban el receptor p3, mas 30 sensibles a proteasa, los sedimentos celulares se homogeneizaron en tampon de lisis (Tris/HCl 10 mM, pH 7,4) complementados con un comprimido de "comprimidos de coctel de inhibidor completo de proteasa" con EDTA 2 mM por 50 ml de tampon (Roche, n.° de catalogo 1697498, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). El homogeneizado se centrifugo a 20.000 x g, y el sedimento resultante se lavo una vez con tampon de lisis mediante resuspension y centrifugacion, como anteriormente. El sedimento final se resuspendio entonces en tampon de ensayo 35 de union (Tris/HCl 75 mM pH 7,4, MgCh 12 mM, EDTA 1 mM). La concentracion de protema de la suspension de membrana se determino mediante los procedimientos descritos en Lowry y col., 1951, Journal of Biological Chemistry, 193, 265; y Bradford, Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-54. Todas las membranas se conservaron congeladas en aftcuotas a -80 °C o se usaron inmediatamente.
Preparacion B
40 Cultivo celular y preparacion de membrana de celulas que expresan los receptores muscarmicos humanos
Mi, M2, M3 y M4
Lmeas celulares CHO que expresaban de forma estable los subtipos clonados hM-i, hM2, hM3 y hM4 del receptor muscarmico humano, respectivamente, se hicieron crecer casi hasta confluencia en medio F-12 de Ham complementado con SBF al 10% y 250 pg/ml de geneticina. Las celulas se hicieron crecer en un incubador de CO2, al 45 5 % a 37 °C y se levantaron con EDTA 2 mM en dPBS. Las celulas se recogieron mediante centrifugaron durante 5
minutos a 650 x g, y, o bien los sedimentos celulares se conservaron congelados a -80 °C o bien se prepararon las membranas inmediatamente para su uso. Para la preparacion de membrana, los sedimentos celulares se resuspendieron en tampon de lisis y se homogeneizaron con un disgregador de tejido Polytron PT- 2100 (Kinematica AG; 20 segundos x 2 rafagas). Las membranas sin procesar se centrifugaron a 40.000 x g durante 15 minutos a 4 °C. 50 El sedimento de membrana se resuspendio despues con tampon de resuspension y se homogeneizo de nuevo con el disgregador de tejido Polytron. La concentracion de protema de la suspension de membrana se determino mediante el procedimiento descrito en Lowry y col., 1951, Journal of Biochemistry, 193, 265. Todas las membranas se conservaron congeladas en aftcuotas a -80 °C o se usaron inmediatamente. Las aftcuotas de las membranas preparadas con
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receptor hMs se obtuvieron directamente de Perkin Elmer y se conservaron a -80 °C hasta su uso.
Procedimiento de ensayo A
Ensayo de union de radioligando para los receptores Pi, P2 y P3 adrenergicos humanos
Los ensayos de union se llevaron a cabo en placas de microtitulacion de 96 pocillos, en un volumen total de ensayo de 100 |jl con 10-15 |jg de protema de membrana que contema los receptores pi, p2 o p3 adrenergicos humanos en tampon de ensayo (Tris/HCl 75 mM, pH 7.4 a 25°C, MgCh 12,5 mM, EDTA 1 mM, bSa al 0,2%); Los estudios de saturacion de la union para la determinacion de los valores de Kd del radioligando se efectuaron usando [3H]-dihidroalprenolol (NET-720, 100 Ci/mmol, (PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) para los receptores p1 y p2 y [125I]-(-)-yodocianopindolol (NEX-189, 220 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) a 10 u 11 concentraciones diferentes que oscilaban desde 0,01 nM hasta 20 nM. Los ensayos de desplazamiento para la determinacion de los valores de of Ki de los compuestos de analisis se efectuaron con [3H]-dihidroalprenolol a 1 nM y [121 I]-(-)-yodocianopindolol a 0,5 nM para 10 u 11 concentraciones diferentes de los compuestos de analisis que oscilaban desde 10 pM hasta 10 jM. La union no espedfica se determino en presencia de propanolol 10 jM. Los ensayos se incubaron durante 1 hora a 37 °C, y despues, las reacciones de union se detuvieron mediante la filtracion rapida sobre GF/B para los receptores p1, y p2 o placas de filtro GF/C de fibra de vidrio para los receptores p3 (Packard BioScience Co., Meriden, CT) presumergidas en polietilenimina al 0,3 %. Las placas de filtro se lavaron tres veces con tampon de filtracion (Tris/HCl 75 mM, pH 7.4 a 4°C, MgCh 12,5 mM, EDTA 1 mM) para eliminar la radiactividad no unida. Las placas se secaron despues y se anadieron 50 jl de lfquido de centelleo Microscint-20 (Packard BioScience Co., Meriden, CT) y las placas se contaron en un contador de centelleo de lfquidos Packard Topcount (Packard BioScience Co., Meriden, CT). Los datos de union se analizaron mediante analisis de regresion no lineal con el paquete informatico GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando el modelo de 3 parametros para un sitio de competicion. El mmimo de la curva se fijo al valor de la union no espedfica, determinada en presencia de propranolol 10 jM. Los valores de Ki para los compuestos de analisis se calcularon a partir de los valores observados de IC50 y el valor de Kd del radioligando usando la ecuacion de Cheng-Prusoff (Cheng Y, y Prusoff WH., Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 23, 3099-108).
En este ensayo, un valor de Ki menor indica que un compuesto de analisis tiene una afinidad de union mayor para el receptor analizado. Se encontro que los compuestos de ejemplo de formula (I) que se analizaron en este ensayo tuvieron tfpicamente valores de Ki de menos de alrededor de 300 nM para el receptor p2 adrenergico. Por ejemplo, se encontro que los compuestos de los ejemplos 3 a 6 tuvieron valores de Ki de menos de 10 nM.
Si se desea, la selectividad del subtipo de receptor por un compuesto de analisis puede calcularse como el cociente de Ki(p1 )/Ki(p2) o Ki(p3)/Ki(p2). Tfpicamente, los compuestos de esta invencion demostraron mayor union al receptor p2 adrenergico en comparacion con el receptor p1 o p3 adrenergico, es decir, Ki(p1) o Ki(p3) es tfpicamente mayor que Ki(p2). En general, los compuestos que tienen selectividad por el receptor p2 adrenergico sobre los receptores p1 o p3 adrenergicos se prefieren; especialmente l compuestos que tienen una selectividad mayor de alrededor de 5; y en particular, mayor de alrededor de 8, A modo de ejemplo, los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tuvieron un cociente de Ki(p1)/Ki(p2) mayor que 8.
Procedimiento de ensayo B
Ensayo de union de radioligando para receptores muscarrnicos
Se llevaron a cabo ensayos de union de radioligando para receptores muscarrnicos humanos clonados en placas de microtitulacion de 96 pocillos en un volumen de ensayo total de 100 jl. Se diluyeron membranas de celulas CHO que expresan de forma estable cualquiera de los subtipos hM1, hM2, hM3, hM4 o hM5 tampon de ensayo a las siguientes concentraciones de protema espedfica diana (jg/pocillo): 10 jg para hM1, 10-15 jg para hM2, 10-20 jg para hM3,
10-20 jg para hM4, y10-12 jg para hM5 para obtener senales similares (cpm). Las membranas se homogeneizaron brevemente usando un disgregador de tejidos Polytron (10 segundos) antes de ensayar la adicion a la placa. Los estudios de saturacion de la union para determinar los valores de Kd del radioligando se llevaron a cabo usando L-[A/-metil-3H]escopolamina metilo cloruro ([3H]-NMS) (TRK666, 84,0 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) a concentraciones que oscilaban desde 0,001 nM hasta 20 nM. Se llevaron a cabo ensayos de desplazamiento para determinar los valores Ki de los compuestos de analisis con [3H]-NMS a 1 nM y once concentraciones diferentes de compuestos de analisis. Los compuestos de analisis se disolvieron inicialmente a una concentracion de 400 jM en tampon de dilucion y despues se diluyeron en serie a 5x con tampon de dilucion hasta concentraciones finales que oscilaron desde 10 pM hasta100 jM. El orden y volumenes de adicion a las placas de ensayo fueron los siguientes: 25 jl de radioligando, 25 jl de compuesto de analisis diluido, y 50 jl de membranas. Las placas de ensayo se incubaron durante 60 minutos a 37 °C. Las reacciones de union se detuvieron mediante filtracion rapida sobre placas de fibra de vidrio GF/B (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) pretratadas con BSA al 1%. Las placas de filtro se lavaron tres veces con tampon de lavado (HEPES 10 mM) para eliminar la radiactividad no unida. Las placas se secaron al aire y se anadieron a cada pocillo 50 jl de lfquido de centelleo Microscint-20 (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Las placas se contaron despues en un contador de centelleo para lfquidos PerkinElmer Topcount (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Los datos de union se analizaron mediante analisis de regresion no lineal con el paquete informatico GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando el modelo de un sitio de
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competicion. Los valores de Ki para los compuestos de analisis se calcularon a partir de los valores observados de IC50 y el valor de Kd del radioligando, usando la ecuacion de Cheng-Prusoff (Cheng Y; Prusoff WH. (1973) Biochemical Pharmacology, 22(23):3099-108). los valores de Ki se convirtieron a valores de pKi para determinar la media geometrica y los intervalo de confianza al 95 %. Estos resumenes estad^sticos volvieron a convertirse a valores de Ki para la publicacion de los datos.
En este ensayo, un valor de Ki menor indica que el compuesto de analisis tiene una afinidad de union mayor para el receptor analizado. Se encontro que los compuestos de ejemplo de formula (I) que se analizaron en este ensayo tuvieron tipicamente un valor de Ki de menos de alrededor de 300 nM para el receptor muscarmico M3. Por ejemplo, se encontro que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 a 6 tuvieron valores de Ki de menos de 10 nM.;
Procedimiento de ensayo C
Ensayo de AMPc Flashplate de celulas enteras en lmeas celulares de CHO que expresan de forma heterologa receptores humanos Pi, P2 o P3 adrenergicos
Los ensayos de AMPc se llevaron a cabo en un formato de radioinmunoensayo usando el sistema de ensayo de activacion de adenililo ciclasa Flashplate con [125I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la determinacion de la potencia agonista de receptor p (EC50), Lmeas celulares CHO que expresaban de forma estable los receptores humanos clonados pi, p2 o p3 adrenergicos se hicieron crecer casi hasta confluencia en medio F-12 de Ham complementado con SBF al 10% y genecitina (250 |jg/ml). Las celulas se lavaron con PBS y se despegaron en dPBS (de Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, solucion salina tamponada con fosfato, sin CaCl2 ni MgCh) que contema EDTA 2 mM o solucion de Tripsina-EDTA (tripsina al 0,05% /EDTA 0,53 mM ). Tras contar las celulas en un contador de celulas Coulter, las celulas se sedimentaron mediante centrifugacion a 1.000 rpm y se resuspendieron en tampon de estimulacion que contema IBMX (PerkinElmer Kit) precalentado a temperatura ambiente a una concentracion de 1,6 x 106 a 2,8 x 106 celulas/ml. En este ensayo se usaron alrededor de 60.000 a 80.000 celulas. Los compuestos de analisis (10 mM en DMSO) se diluyeron en PBS que contema 0,1 % de BSA en Beckman Biomek-2000 y se analizaron a 11 concentraciones diferentes que oscilaron desde 100 jM hasta 1 pM. Las reacciones se incubaron durante 10 min a 37 °C y se detuvieron mediante la adicion de 100 jl de tampon de deteccion fno que contema [125I]-AMPc (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA). La cantidad de AMPc producido (pmol/pocillo) se calculo sobre la base de las cuentas observadas para las muestras y los patrones de AMPc como se describe en el manual del usuario del fabricante. Los datos se analizaron mediante analisis de regresion no lineal con el paquete informatico GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) con la ecuacion sigmoidea. La ecuacion de Cheng-Prusoff (Cheng Y, y Prusoff Wh., Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 23,3099-108) se uso para calcular los valores de EC50.
En este ensayo, un valor de EC50 menor indica que el compuesto de analisis tiene una actividad funcional mayor en el receptor analizado. Se encontro que los compuestos de ejemplo de formula (I) que se analizaron en este ensayo tuvieron tipicamente un valor de EC50 menos de alrededor de 300 nM para el receptor p2 adrenergico. Por ejemplo, se encontro que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 a 6 tuvieron valores de Ki de menos de 10 nM.
Si se desea, la selectividad del subtipo de receptor por un compuesto de analisis puede calcularse como el cociente de EC50(P1)/EC50(P2) o EC50(p3)/EC50(p2). Tfpicamente, los compuestos de formula (I) demostraron mayor actividad funcional en el receptor p2 adrenergico en comparacion con el receptor p1 o p3 adrenergico, es decir, EC50(p1) o EC50(p3) es tfpicamente mayor que EC50(p2). En general, los compuestos que tienen selectividad por el receptor p2 adrenergico sobre los receptores p1 o p3 adrenergicos se prefieren; especialmente los compuestos que tienen una selectividad mayor de alrededor de 5; y en particular, mayor de alrededor de 10, A modo de ejemplo, los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tuvieron cocientes de EC50(p1)/EC50(p2) mayores que 10.
Procedimiento de ensayo D
Ensayos funcionales de antagonismo para subtipos del receptor muscarmico
A. Bloqueo de la inhibicion de la acumulacion de AMPc mediada por agonista
En este ensayo, la potencia funcional de un compuesto de analisis se determina midiendo la capacidad del compuesto de analisis para bloquear la inhibicion por la oxotremorina de la acumulacion de AMPc mediada por forskolina en celulas CHO-K1 que expresan el receptor hM2. Los ensayos de AMPc se llevan a cabo en un formato de radioinmunoensayo usando el sistema de ensayo de activacion de adenililo ciclasa Flashplate con [125I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las celulas se lavan una vez con PBS y se levantan con solucion de tripsina-EDTA (tripsina 0,05 %/ 0,53 mM) como se describen en la seccion de Cultivo celular y preparacion de membrana anterior. Las celulas despegadas se lavan dos veces mediante 650 x g durante cinco minutos en 50 ml de dPBS. El sedimento celular se resuspende despues den 10 ml de PBS, y las celulas se cuentan con un contador de partmulas Coulter Z1 Dual Particle Counter (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Las celulas se centrifugan de nuevo a 650 x g durante cinco minutos y se resuspenden en tampon de estimulacion a una concentracion de ensayo de 1,6 x 106'2,8 x 106 celulas/ml.
El compuesto de analisis se disuelve inicialmente hasta una concentracion de 400 jM en tampon de dilucion (dPBS
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complementado con 1 mg/ml de BSA (0.1%)), y despues se diluyo en serie con tampon de dilucion hasta concentraciones molares finales que oscilaron desde 100 pM hasta 0,1 nM. La oxotremorina se diluye de una manera similar
Para determinar la inhibicion de la actividad adenililo ciclasa (AC) de la oxotremorina, se anaden 25 pl de forskolina (concentracion final 25 pM diluida en dPBS), 25 pl de oxotremorina diluida, y 50 pl de celulas a los pocillos de ensayo del agonista. Para determinar la capacidad de un compuesto de analisis para bloquear la actividad AC inhibida por oxotremorina, se anaden a los pocillos de ensayo restantes 25 pl de forskolina y oxotremorina (concentraciones finales de 25 pM y 5 pM respectivamente, diluidas en dPBS), 25 pl de compuestos de analisis diluidos y 50 pl de celulas.
Las reacciones se incuban durante 10 minutos a 37 °C y se frenan mediante la adicion de 100 pl de tampon de deteccion enfriado en hielo. Las placas se sellan, se incuban durante toda la noche a temperatura ambiente y se cuentan a la manana siguiente en un contador de centelleo de lfquidos PerkinElmer TopCount (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). La cantidad de AMPc producido (pmol/pocillo) se calcula sobre la base de las cuentas observadas para las muestras y los patrones de AMPc como se describe en el manual del usuario del fabricante. Los datos se analizan mediante analisis de regresion no lineal con el paquete informatico GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando la ecuacion de regresion no lineal para un sitio de competicion. La ecuacion de Cheng-Prusoff se usa para calcular la Ki usando la EC50 de la curva de concentracion de oxotremorina-repuesta y la concentracion de ensayo de oxotremorina como la y [L], respectivamente.
En este ensayo, un valor de Ki menor indica que el compuesto de analisis tiene una actividad funcional mayor en el receptor analizado. Se encontro que los compuestos de ejemplo de formula (I) que se analizaron en este ensayo tuvieron tfpicamente un valor de Ki de menos de alrededor de 300 nM para el bloqueo de la inhibicion por oxotremorina de la acumulacion de AMPc mediada por forskolina en celulas CHO-K1 que expresan el receptor muscarmico hM2. Por ejemplo, se encontro que el compuesto del ejemplo comparativo 3 tuvo un valor de Ki de menos de 10 nM.
B. bloqueo de la union de [35S]GTPyS mediada por agonista
En un segundo ensayo funcional, la potencia funcional de los compuestos de analisis puede determinarse midiendo la capacidad de los compuestos para bloquear la union de [35S]GTPyS estimulada por oxotremorina en celulas CHO-K1 que expresan el receptor hM2
En el momento de su uso, las membranas congeladas se descongelaron y despues se diluyeron en tampon de ensayo con una concentracion final de tejido diana de 5-10 pg de protema por pocillo. Las membranas se homogeneizaron brevemente usando un disgregador de tejidos Polytron PT-2100 y despues se anadieron a las placas de ensayo.
El valor de EC90 (concentracion eficaz para un 90 % de respuesta maxima) para la estimulacion de la union de [35S]GTPyS por el agonista oxotremorina se determino en cada experimento.
Para determinar la capacidad de un compuesto de analisis para inhibir la union de [35S]GTPyS estimulada por oxotremorina, se anadio lo siguiente a cada pocillo de las placas de 96 pocillos: 25 pl de tampon de ensayo con [35S]GTPyS (0,4 nM), 25 pl de oxotremorina (EC90) y GDP (3 pM), 25 pl de compuesto de ensayo diluido y 25 pl de membranas de celulas CHO que expresan el receptor hM2. Las placas de ensayo se incubaron a 37 °C durante 60 minutos. Las placas de ensayo se filtraron sobre filtros GF/B pretratados con BSA al 1 % usando un cosechador celular PerkinElmer de 96 pocillos. Las placas se lavaron con tampon de lavado enfriado en hielo 3 x 3 segundos y despues se secaron al aire o al vacfo. Se anadio lfquido de centelleo Microscint-20 a cada pocillo (50 pl), y cada placa se sello y su radiactividad se conto en un Topcounter (PerkinElmer). Los datos se analizan mediante analisis de regresion no lineal con el paquete informatico GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando la ecuacion de regresion no lineal para un sitio de competicion. La ecuacion de Cheng-Prusoff se uso para calcular la Ki usando los valores de EC50 de la curva de concentracion-repuesta para el compuesto de ensayo y la concentracion de oxotremorina en el ensayo como la y [L], concentracion de ligando, respectivamente.
En este ensayo, un valor de Ki menor indica que el compuesto de analisis tiene una actividad funcional mayor en el receptor analizado. Se encontro que los compuestos de ejemplo de formula (I) que se analizaron en este ensayo tuvieron tfpicamente un valor de Ki de menos de alrededor de 300 nM para el bloqueo de la union de [35S]GTPyS estimulada por oxotremorina en celulas CHO-K1 que expresan el receptor hM2. Por ejemplo, se encontro que el compuesto del ejemplo comparativo 3 tuvo un valor de Ki de menos de 10 nM.
C. Bloqueo de la liberacion de calcio mediada por agonista por medio de ensayos FLIPR
Los subtipos del receptor muscarmico (receptores M1, M3 y M5), que se acoplan a protemas Gq, activan la via de la fosfolipasa C (FLC) mediante la union de un agonista al receptor. Como resultado, la FLC activada hidroliza el fosfatidil inositol disfosfato (PIP2, de phosphatyl inositol diphosphate) a diacilglicerol (DAG) y fosfatidil-1,4,5-trifosfato (IP3), lo cual, a su vez, genera liberacion de calcio a partir de los almacenes intracelulares, es decir, el retmulo endoplasmico y sarcoplasmico. El ensayo FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) saca rendimiento de este aumento del calcio intracelular mediante el uso de un colorante sensible a calcio (Fluo-4AM, Molecular Probes, Eugene, OR) que fluoresce cuando se une calcio libre. Este suceso de fluorescencia se mide en tiempo real mediante el FLIPR, que detecta el cambio en la fluorescencia de una monocapa de celulas clonadas con los receptores M1 y M3humanos, y M5
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de chimpance. La potencia antagonista puede determinarse mediante la capacidad de los antagonistas de inhibir los aumentos de calcio intracelular mediado por agonistas.
Para los ensayos FLIPR de estimulacion de calcio, se siembran celulas CHO que expresan de forma estable los receptores hM., hM3 y cM5 en placas de FLIPR de 96 pocillos la noche anterior de efectuar el ensayo. Las celulas sembradas se lavan dos veces mediante Cellwash (MTX Lab-systems, Inc.) con tampon de FLIPR (HEpES 10 mM, pH 7,4, cloruro calcico 2 mM, probenecid 2,5 mM en solucion salina tamponada de Hank (HBSS) sin calcio ni magnesio) para eliminar los medios de crecimiento y dejar 50 pl/pocillo de tampon de FLIPR. Las celulas se incuban despues en 50 pl/pocillo de FLUO-4AM4 pM (se hizo una solucion 2X) durante 40 minutos a 37 °C, dioxido de carbono al 5 %. Despues del periodo de incubacion con el colorante, las celulas se lavan dos veces con tampon de FLIPR, dejando un volumen final de 50 pl/pocillo.
Para determinar la potencia antagonista, primero se determina la estimulacion dependiente de la dosis de la liberacion de Ca2+ intracelular para la oxotremorina de modo que pueda medirse mas tarde la potencia antagonista contra la estimulacion por oxotremorina a una concentracion EC90. Las celulas se incuban primero con tampon de dilucion del compuesto durante 20 minutos, seguida de la adicion del agonista que es realizada por el FLIPR. Se genera un valor de EC90 para oxotremorina de acuerdo con el procedimiento detallado en la seccion de determinacion y reduccion de datos de FLIPR de mas adelante, en conjuncion con la formula ECf = ((F/100-F)A1/H) * EC50. Se prepara una concentracion de oxotremorina de 3 x ECf en placas de estimulacion de modo que se anade una concentracion EC90 de oxotremorina a cada pocillo en las placas del ensayo de inhibicion del antagonista.
Los parametros usados para el FLIPR son: longitud de exposicion de 0,4 segundos, potencia del laser de 0,5 watios, longitud de onda de excitacion de 488 nm, longitud de onda de emision de 488 nm. El valor inicial se determina midiendo el cambio en la fluorescencia durante 10 segundos antes de la adicion del agonista. Despues de la estimulacion del agonista, el FLIPR midio de forma continua el cambio de fluorescencia cada 0,5 a 1 segundo durante 1,5 minutos para capturar el maximo cambio de fluorescencia.
El cambio de fluorescencia se expresa como la fluorescencia maxima menos la fluorescencia inicial para cada pocillo. Los datos en bruto se analizan contra el logaritmo de la concentracion de farmaco mediante regresion no lineal con el programa GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando el modelo incorporado para dosis-respuesta sigmoidal. Los valores de Ki del antagonista se determinan mediante Prism usando el valor de EC50 de oxotremorina como la Kd y la EC90 de oxotremorina para la concentracion de ligando de acuerdo con la ecuacion de Cheng-Prusoff (Cheng & Prusoff, 1973).
En este ensayo, un valor de Ki menor indica que el compuesto de analisis tiene una actividad funcional mayor en el receptor analizado. Se encontro que los compuestos de ejemplo de formula (I) que se analizaron en este ensayo tuvieron tipicamente un valor de Ki de menos de alrededor de 300 nM para el bloqueo de la liberacion de calcio mediada por agonista en celulas CHO que expresan de forma estable los receptores hM-i, hM3 y cM5. Por ejemplo, se encontro que el compuesto del ejemplo comparativo 3 tuvo un valor de K de menos de 10 nM para los receptores hM-i,hM3 y cM5.
Procedimiento de ensayo E
Ensayo de AMPc Flashplate con una lrnea celular epitelial de pulmon que expresa de forma endogena el receptor humano P2 adrenergico
Para la determinacion de las potencias y eficacias agonistas (actividades intrmsecas) en una lrnea celular que expresa niveles endogenos del receptor p2 adrenergico, se uso una lrnea celular epitelial de pulmon humano (BEAS-2B) (ATCC CRL-9609, American Type Culture Collection, Manassas, VA) (January B, y col., British Journal of Pharmacology, 1998, 123, 4.701-11). Las celulas se hicieron crecer hasta un 75-90 % de confluencia en medio completo libre de suero (LHC-9 MEDIUM que contema epinefrina y acido retinoico, cat n.° 181-500, Biosource International, Camarillo, CA). El dfa anterior al ensayo, el medio se cambio a LHC- 8 (epinefrina ni acido retinoico, cat n.° 141-500, Biosource International, Camarillo, CA). Los ensayos de AMPc se llevaron a cabo en un formato de radioinmunoensayo usando el sistema de ensayo de activacion de adenililo ciclasa Flashplate con [125I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El dfa del ensayo, las celulas se lavaron con PBS, se levantaron mediante raspado con EDTA 5 mM en PBS, y se contaron. Las celulas se resuspendieron mediante centrifugacion a 1.000 rpm y se resuspendieron en tampon de estimulacion precalentado a 37 °C a una concentracion final de 600.000 celulas/ml. En este ensayo las celulas se usaron a una concentracion final de 100.000 a 120.000 celulas/pocillo. Los compuestos de analisis se diluyeron en serie en tampon de ensayo (Tris/HCl 75 mM, pH 7,4 a 25°C, MgCh 12,5 mM, EDTA 1 mM, BSA al 0,2 % en Beckman Biomek-2000. Los compuestos de analisis se analizaron en el ensayo a 11 concentraciones diferentes, que oscilaron desde 10 pM hasta 10 pM. Las reacciones se incubaron durante 10 min a 37 °C y se frenaron mediante la adicion de of 100 pl de tampon de deteccion enfriado en hielo. Las placas se sellaron, se incubaron durante la noche a 4 °C y se contaron a la manana siguiente en un contador de centelleo Topcount (Packard BioScience Co., Meriden, CT). La cantidad de AMPc producido por ml de reaccion se calculo sobre la base de las cuentas observadas para muestras y patrones de AMPc, como se describe en el manual de usuario del fabricante. Los datos se analizaron mediante analisis de regresion no lineal con el paquete informatico GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando el modelo de 4 parametros para dosis-respuesta
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sigmoidal.
En este ensayo, un valor de EC50 menor indica que el compuesto de analisis tiene una actividad funcional mayor en el receptor analizado. Se encontro que los compuestos de ejemplo de formula (I) que se analizaron en este ensayo tuvieron tipicamente un valor de EC50 de menos de alrededor de 300 nM para el receptor p2 adrenergico. Por ejemplo, se encontro que los compuestos de los ejemplos 3 a 6 tuvieron valores de EC50 de menos de 10 nM.
Si se desea, la eficacia del compuesto de analisis (% Eff) se calculo a partir del cociente de la Emax observada (PARTE SUPERIOR de la curva ajustada) y la respuesta maxima obtenida para la curva de dosis respuesta de isoproterenol y se expreso como %Eff relativo a isoproterenol. Los compuestos de ejemplo de esta invencion analizados en este ensayo demostraron tipicamente un % Eff mayor que alrededor de 40.
Procedimiento de ensayo F
Duracion de la broncoproteccion en modelos de cobaya de broncoconstriccion inducida por acetilcolina o inducida por histamina
Estos ensayos in vivo se usaron para evaluar los efectos brocoprotectores de los compuestos de analisis que presentaban actividad tanto antagonista del receptor muscarmico como agonista del receptor p2 adrenergico. Para aislar la actividad antagonista muscarmica en el modelo de broncoconstriccion inducida por acetilcolina, se administro a los animales propanolol, un compuesto que bloquea la actividad del receptor p, antes de la administracion de acetilcolina. La duracion de la broncoproteccion en el modelo de broncoconstriccion inducido por histamina refleja la actividad agonista del receptor p2 adrenergico.
Grupos de 6 cobayas macho (Duncan-Hartley (HsdPoc:DH) Harlan, Madison, WI) que pesaban entre 250 y 350 g se identificaron de forma individual mediante tarjetas de jaula. A lo largo de todo el estudio, se permitio a los animales libre acceso al agua y al alimento.
Los compuestos de analisis se administraron por medio de inhalacion a lo largo de 10 minutos en una camara de dosificacion de exposicion de cuerpo entero (R&S Molds, San Carlos, CA). Las camaras de dosificacion se dispusieron de modo que el aerosol se liberase de forma simultanea a las 6 camaras individuales desde un colector de distribucion central. Los cobayas se expusieron a un aerosol de un compuesto o vetnculo de analisis (WFI). estos aerosoles se generaron a partir de soluciones acuosas usando un equipo nebulizador LC Star Nebulizer Set (modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) que funciona con una mezcla de gases (CO2 = 5%, O2 = 21 % y N2 = 74%) a una presion de 22 psi. El flujo de gas a traves del nebulizador a esta presion de funcionamiento fue aproximadamente de 3 l/minuto. Los aerosoles generados se llevaron dentro de las camaras mediante presion positiva. No se uso ningun aire de dilucion durante la dispensacion de las soluciones en aerosol. Durante la nebulizacion de 10 minutos, se nebulizaron aproximadamente 1,8 m de solucion. Este valor se determino de forma gravimetrica mediante comparacion de los pesos antes y despues de la nebulizacion del nebulizador marcado.
Los efectos broncoprotectores de los compuestos de analisis administrados por medio de inhalacion se evaluaron usando pletismograffa de cuerpo entero a las 1,5, 24, 48 y 72 horas despues de la dosis.
Cuarenta y cinco minutos antes del inicio de la evaluacion pulmonar, se anestesio a cada cobaya con una inyeccion intramuscular de ketamina (43,75 mg/kg), xilacina (3,50 mg/kg) y acepromacina (1,05 mg/kg). Tras rasurar y limpiar la zona quirurgica con alcohol al 70 %, se efectuo una incision de 2-3 cm en la lmea media de la cara ventral del cuello. Despues, la vena yugular se aislo y se canulo con un cateter de polietileno relleno de suero salino (PE-50, Becton Dickinson, Sparks, MD) para permitir las infusiones intravenosas de acetilcolina (Ach) o histamina en suero salino. Despues la traquea se libero por diseccion y se canulo con un tubo de teflon de 14 G (n.° NE- 014, Small Parts, Miami Lakes, FL). En caso necesario, se mantuvo la anestesia mediante inyecciones intramusculares adicionales de la mezcla anestesica mencionada anteriormente. La profundidad de la anestesia se controlo y se ajusto si el animal respondfa a pellizcos en las garras o si la frecuencia respiratoria era mayor de 100 respiraciones/minuto.
Una vez completadas las canulaciones, se coloco al animal en un pletismografo (n.° PLY3114, Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT) y se inserto una canula de presion esofagica (PE-160, Becton Dickinson, Sparks, MD) para medir la presion motriz pulmonar(presion). El tubo traqueal de teflon se fijo a la abertura del pletismografo para permitir que cobaya respirase aire de la habitacion del exterior de la camara. Despues se sello la camara. Se uso una lampara de calor para mantener la temperatura corporal y los pulmones del cobaya se inflaron 3 veces con 4 ml de aire usando una jeringa de calibracion de 10 ml (n.° de serie 5520, Hans Rudolph, Kansas City, MO) para garantizar que las vfas inferiores no se colapsasen y que el animal no sufriera hiperventilacion.
Una vez se que se determino que los valores iniciales estaban dentro del intervalo de 0,3-0,9 ml/cm H2O para la distensibilidad y dentro del intervalo de 0,1-0,199 cm H2O/ml por segundo para la resistencia, se inicio la evaluacion pulmonar. Un programa informatico Buxco de medicion pulmonar permitio la recoleccion y derivacion de los valores pulmonares.
El inicio de este programa dio comienzo al protocolo experimental y a la recoleccion de datos. Los cambios en el volumen a lo largo del tiempo que se producen dentro del pletismografo con cada respiracion se midieron por medio de
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un transductor de presion Buxco. Mediante la integracion de esta senal a lo largo del tiempo, se calculo una medida del flujo para cada respiracion. Esta senal, junto con los cambios en la presion motriz, que se recogieron usando un transductor de presion Sensym (n.° TRD4100), se conecto por medio de un preamplificador Buxco (MAX 2270) a una interfaz de recoleccion de datos (n.° SFT3400 y SFT3813). Todos los demas parametros pulmonares se obtuvieron a partir de estas dos entradas.
Los valores iniciales se recogieron durante 5 minutos, tras los cuales se estimulo a los cobayas con Ach o histamina. Al evaluar los efectos antagonistas muscarmicos, se administro propanolol (5 mg/Kg, iv) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 15 minutos antes de la estimulacion con Ach. Ach (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (0,1 mg/ml) se infundio por via intravenosa durante 1 minuto desde una bomba de jeringa (sp210iw, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) a las siguientes dosis y tiempos prescritos desde el comienzo del experimento: 1,9 |jg/minuto a los 5 minutos, 3,8 jg/minuto a los 10 minutos, 7,5 jg/minuto a los15 minutos, 15,0 jg/minuto a los 20 minutos, 30 jg/minuto a los 25 minutos y 60 jg/minuto a los 30 minutos. De forma alternativa, la broncoproteccion de los compuestos de analisis se evaluo en el modelo de estimulacion con acetilcolina sin pretratamiento con un compuesto beta bloqueante.
Al evaluar los efectos agonistas del receptor p2 adrenergico de los compuestos de analisis, la histamina (25 jg/ml) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) se infundio por via intravenosa durante 1 minuto desde una bomba de jeringa a las siguientes dosis y tiempos prescritos desde el comienzo del experimento: 0,5 jg/minuto a los 5 minutos, 0,9 jg/minuto a los 10 minutos, 1,9 jg/minuto a los 15 minutos, 3,8 jg/minuto a los 20 minutos, 7,5 jg/minuto a los 25 minutos y 15 jg/minuto a los 30 minutos. Si la resistencia o la distensibilidad no hubieran vuelto a los valores iniciales a los 3 despues de cada dosis de Ach o histamina, los pulmones de los cobayas se inflaron tres veces con 4 ml de aire desde una jeringa de calibracion de 10 ml. Los parametros pulmonares registrados incluyen frecuencia respiratoria (respiraciones/minuto), distensibilidad (ml/cm H2O) y resistencia pulmonar (cm H2O/ ml por segundo). Una vez que se completaron las mediciones de la funcion pulmonar en el minuto 35 de este protocolo, el cobaya se retiro del pletismografo y se eutanasio mediante asfixia con dioxido de carbono.
Los datos se evaluaron de una de dos formas:
(a) La resistencia pulmonar (Rl, cm H2O/ml por segundo) se calculo a partir de la proporcion del "cambio de presion" con respecto al "cambio de flujo". La respuesta de Rl a la ACh (60 jg/min, IH) se computo para los grupos de vehfculo y compuestos de analisis. Se calculo la respuesta media a Ach en los animales tratados con vehfculo, a cada tiempo de pretratamiento, y se uso para computar el % de inhibicion de la respuesta a Ach, al correspondiente tiempo de pretratamiento, a cada dosis del compuesto de analisis. Las curva de inhibicion de dosis-respuesta para 'Rl' se ajustaron con una ecuacion logfstica de cuatro parametros usando la version 3.00 de GraphPad Prism, para Windows (GraphPad Software, San Diego, California) para estimar la dosis broncoprotectora ID50 (dosis requerida para inhibir la respuesta broncoconstrictora a ACh (60 jg/min) en un 50%). La ecuacion usada fue la siguiente:
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en la que X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta (% de inhibicion del aumento de Rl inducido por ACh). Y empieza en el Min y se aproxima de asintoticamente al Max con una forma sigmoidal.
(b) La cantidad de PD2, que se define como la cantidad de Ach o histamina necesaria para causar una duplicacion de la resistencia pulmonar inicial, se calculo usando los valores de resistencia pulmonar procedentes del flujo y la presion a lo largo de un intervalo de estimulaciones con Ach o histamina usando la siguiente ecuacion (derivada de la ecuacion usada para calcular los valores de PC20 en la clinica (vease Am. Thoracic Soc, 2000):
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en la que:
C1 = concentracion de Ach o histamina que precede a C2
C2 = concentracion de Ach o histamina que da lugar a un incremento de al menos 2 veces de la resistencia pulmonar (Rl)
R0 = valor inicial de Rl
R1 = valor de Rl despues de C1
R2 = valor de Rl despues de C2
El analisis estadfstico de los datos se llevo a cabo usando un analisis de la t de Student bilateral. Se considero significativo un valor de P<0,05.
Los compuestos de ejemplo de formula (I) que se analizaron en este ensayo produjeron tipicamente un efecto broncoprotector dependiente de la dosis contra la broncoconstriccion inducida por ACh e His. En general, se prefieren los compuestos de analisis que tienen una potencia (ID50 a 1,5 h despues de la dosis) de menos de alrededor de
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300 jg/ml para la boncoconstriccion inducida por ACh y menos de alrededor de 300 |jg/ml para la broncoconstriccion inducida por His en este ensayo. Por ejemplo, se encontro que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tuvieron una ID50 de menos de alrededor de 100 jg/ml para la broncoconstriccion inducida por ACh y una ID50 de menos de alrededor de 100 jg/ml para la broncoconstriccion inducida por His a las 1,5 horas despues de la dosis.
Ademas, se prefieren generalmente los compuestos de analisis que tienen una duracion de la actividad broncoprotectora (PD T1/2) de al menos alrededor de 24 horas en este ensayo. A modo de ejemplo, se encontro que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 a 6 tuvieron valores de EC1 de menos de alrededor de 24 horas despues de la dosis.
Procedimiento de ensayo G
Modelo de Einthoven para medir los cambios en la ventilacion en cobayas
La actividad broncodilatadora de los compuestos de analisis se evaluo en un modelo de cobaya anestesiado (el modelo de Einthoven), que usa la presion de ventilacion como una medida sustituta de la resistencia de la via aerea. Veanse, por ejemplo, Einthoven (1892) Pfugers Arch. 51: 367 - 445; y Mohammed y col. (2000) Pulm Pharmacol Ther.13(6):287-92. En este modelo, la actividad antagonista muscarmica y agonista p2 se evaluo mediante la determinacion de los efectos protectores contra la brococonstriccion inducida por metacolina (MCh) e histamina (His).
Este ensayo se llevo a cabo usando cobayas Duncan-Hartley (Harlan, Indianapolis, IN), que pesaban entre 300 y 400 g.
El vehfculo o compuesto de analisis (es decir., agua destilada) se dosifico mediante inhalacion (IH) a lo largo de un periodo de tiempo de 10 minutos en una camara de dosificacion de exposicion de cuerpo entero (R+S Molds, San Carlos, CA) usando 5 ml de solucion de dosificacion. Los animales se expusieron a un aerosol, que se genero a partir de un nebulizador LC Star Nebulizer Set (modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) que funciona con una mezcla de gases Bioblend (CO2 = 5%, O2 al 21%; y N2 al 74%) a una presion de 22 psi. La funcion pulmonar se evaluo a diversos momentos despues de la dosis de inhalacion.
Cuarenta y cinco minutos antes del inicio de la evaluacion de la funcion pulmonar, Los cobayas se anestesiaron con una inyeccion intramuscular (IM) de una mezcla de ketamina (13,7 mg/kg/xilacina (3,5 mg/kg)/acepromacina (1,05 mg/kg). Se administro una dosis complementaria de esta mezcla (50 % de la dosis inicial) de la forma necesaria. La vena yugular y la carotida se aislaron y canularon con cateteres de polietileno rellenos con suero salino (Micro-Renathane y PE-50, respectivamente, Beckton Dickinson, Sparks, MD). La arteria carotida se conecto a un transductor de presion para permitir la medicion de la tension y la canula de la vena yugular se uso para la inyeccion IV, bien de Mch o bien de His. Despues la traquea se libero por diseccion y se canulo con una aguja de 14 G (n.° NE-014, Small Parts, Miami Lakes, FL). Una vez completadas las canulaciones, los cobayas se ventilaron usando un respirador (modelo 683, Harvard Apparatus, Inc., MA) ajustado a un volumen sistolico de 1ml/100 g de peso corporal pero sin exceder los 2,5 ml de volumen, y a una frecuencia de 100 latidos por minuto la presion de ventilacion (PV) se midio en la canula traqueal usando un transductor Biopac que se conecto a un preamplificador Biopac (TSD 137C). La temperatura corporal se mantuvo a 37 °C usando almohadilla termica. Antes de iniciar la recoleccion de datos, se administro pentobarbital (25 mg/kg) por via intraperitoneal (IP) para suprimir la respiracion espontanea y obtener un valor inicial estable. Los cambios en la PV se registraron en una interfaz de recoleccion de datos Biopac de Windows. Los valores iniciales se recolectaron durante al menos 5 minutos, tras los cuales se estimulo a los cobayas por via IV de forma no acumulativa con dosis crecientes al doble del broncoconstrictor (MCh o His). Al usar MCh como el agente brococonstrictor, los animales se pretrataron con propanolol (5 mg/kg, IV) para aislarlos efectos antimuscarmicos del compuesto de analisis. Los cambios en la PV se registraron usando el programa informatico Acknowledge Data Collection Software (Santa Barbara, CA). Tras la finalizacion del estudio, los animales se eutanasiaron.
El cambio en la PV se midio en cm de agua. Cambio en la PV (cm H2O) = pico de presion (tras la estimulacion con el broncoconstrictor) -pico de presion inicial. La curva de dosis-respuesta a MCh o His se ajusto a una ecuacion logfstica de 4 parametros usando el programa informatico GraphPad Prism, version 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California) La ecuacion usada fue la siguiente:
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en la que X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta. Y empieza en el Min y se aproxima asintoticamente al Max con una forma sigmoidal.
El porcentaje de inhibicion de la respuesta del broncoconstrictor a una dosis submaxima de MCh o His se calculo a cada dosis del compuesto de analisis usando la siguiente ecuacion: % respuesta de inhibicion = 100-((pico de presion (tras la estimulacion con el broncoconstrictor, tratado)-pico de presion inicial (tratado)*100 %/(pico de presion (tras la estimulacion con el broncoconstrictor, agua)-pico de presion inicial (agua)) Las curvas de inhibicion se ajustaron usando la ecuacion logfstica de cuatro parametros del programa informatico GraphPad software. ID50 (dosis requerida para producir una inhibicion del 50 % de la respuesta al vaso constrictor) y Emax (inhibicion maxima) tambien se estimaron siempre que fue apropiado.
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La magnitud de la broncoproteccion a diferentes momentos tras la inhalacion del compuesto de analisis se uso para estimar la semivida farmacodinamica (PD T1/2). La PD T1/2 se determino usando un ajuste de regresion no lineal usando una ecuacion de decaimiento exponencial de una fase (GraphPad Prism, version 4.00): Y=Periodo*exp(-K*X) + Meseta; empieza en el Periodo+Meseta y decae hasta la meseta con una constante de velocidad K. La PD T1/2 = 0,69/K. La meseta se restringio a 0.
Los compuestos de ejemplo de f que se analizaron en este ensayo produjeron tfpicamente un efecto broncoprotector dependiente de la dosis contra la broncoconstriccion inducida por His. En general, se prefieren los compuestos de analisis que tienen una ID50 de menos de alrededor de 300 pg/ml para la broncoconstriccion inducida por MCh y una ID50 de menos de alrededor de 300 pg/ml para la broncoconstriccion inducida por His a las 1,5 horas despues de la dosis en este ensayo. Ademas, se prefieren generalmente los compuestos de analisis que tienen una duracion de la actividad broncoprotectora (PD T1/2) de al menos alrededor de 24 horas en este ensayo.
Procedimiento de ensayo H
Ensayo de salivacion de inhalacion en cobaya
Los cobayas (Charles River, Wilmington, MA) que pesaban 200-350 g se aclimataron a la colonia interior de cobayas durante al menos 3 dfas despues de su llegada. El compuesto o el vehmulo de analisis se dosificaron por medio de inhalacion (IH) a lo largo de un periodo de tiempo de 10 minutos en una camara de dosificacion en forma de pastel. San Carlos, CA). Las soluciones de analisis se disolvieron en agua destilada esteril y se dispensaron usando un nebulizador relleno con 5,0 ml de solucion de dosificacion. Los cobayas se mantuvieron en la camara de inhalacion durante 30 minutos. Durante este tiempo, los cobayas se limitaron a un area de aproximadamente 110 cm2. Este espacio fue adecuado para que los animales se dieran la vuelta libremente, se reposicionaran ellos mismos, y Despues de 20 min de aclimatacion, los cobayas se expusieron a un aerosol generado a partir de un nebulizador lS Star Nebulizer Set (modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) que funcionaba con aire ambiente a una presion de 22 psi. Al finalizar la nebulizacion, los cobayas se evaluaron a las 1, 5, 6, 12, 24, 48, o 72 horas despues del tratamiento.
Los cobayas se anestesiaron una hora antes del analisis con una inyeccion intramuscular (IM) de una mezcla de ketamina 43,75 mg/kg, xilacina 3,5 mg/kg, y acepromacina 1,05 mg/kg a un volumen de 0,88 ml/kg. Los animales se colocaron con la cara ventral hacia arriba sobre una manta termica (37 °C) con una inclinacion de 20 grados con la cabeza en pendiente descendente. En la boca del cobaya se inserto una almohadilla gasa de 4 capas de 2 x 2 pulgadas (Nu-Gauze esponjas de uso general, Johnson y Johnson, Arlington, TX). Cinco minutos despues, se administro el agonista muscarmico pilocarpina (3,0 mg/kg s.c.) y la almohadilla de gasa se retiro inmediatamente y se reemplazo por otra almohadilla de gasa pesada previamente. La saliva se recogio durante 10 minutos, momento en el que se peso la almohadilla de gasa y se registro la diferencia de peso para determinar la cantidad de saliva acumulada (en mg). Se calculo la cantidad media de saliva recogida para los animales que recibieron el vehmulo y cada dosis de compuesto de analisis. La media del grupo del vehmulo se considero como el 100 % de salivacion. Los resultados se calcularon usando medias de los resultados (n = 3 o mayor). Se calcularon los intervalos de confianza (95%) para cada dosis en cada momento usando ANOVA bidireccional. Este modelo es una version modificada del procedimiento descrito en Rechter, “Estimation of anticholinergic drug effects in mice by antagonism against pilocarpine-induced salivation" Ata Pharmacol Toxicol, 1996, 24:243-254.
Se calculo el peso medio de saliva en los animales tratados con vehmulo, a cada tiempo de pretratamiento, y se uso para computar % de inhibicion de la salivacion en el tiempo correspondiente de pretratamiento, a cada dosis. Los datos de inhibicion de la dosis-respuesta se ajustaron a una ecuacion logfstica de cuatro parametros usando el programa informatico GraphPad Prism, version 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California) para estimar la ID50 de antisialagogo (dosis requerida para inhibir en un 50% la salivacion provocada por pilocarpina). La ecuacion usada fue la siguiente:
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en la que X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta (% inhibicion de la salivacion). Y empieza en el Min y se aproxima asintoticamente al Max con una forma sigmoidal.
La proporcion de la ID50 di antisialagogo con respecto a la ID50 de broncoprotector se uso para computar el mdice de selectividad aparente por el pulmon del compuesto de analisis. En general, se prefieren los compuestos que tuvieron un mdice de selectividad aparente por el pulmon mayor de alrededor 5. En este ensayo, el compuesto del ejemplo comparativo 3 tuvo un mdice de selectividad aparente por el pulmon mayor de 5.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. 1-[2-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-etilamino]metil}-2-metilfenilcarbamoil)etil]
    piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico de formula
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    5 o una sal farmaeuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. 1-[2-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-etilamino]metil}-2-metilfenilcarbamoil)etil]
    piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico de formula
    imagen2
  3. 3. Una composicion farmaceutica que comprende a) 1-[2-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-
    10 etilamino]metil}-2-metilfenilcarbamoil)etil]piperidin-4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico o una sal
    farmaceuticamente aceptable del mismo y b) un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
  4. 4. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 3, en la que la composicion comprende un agente terapeutico adicional.
  5. 5. Una composicion farmaceutica de la reivindicacion 4, en la que la que el agente terapeutico adicional es un agente
    15 antiinflamatorio esteroideo.
  6. 6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que el agente antiinflamatorio esteroideo es un corticosteroide.
  7. 7. 1-[2-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-etilamino]metil}-2-metilfenilcarbamoil)etil]piperidin- 4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.
    20 8. 1-[2-(4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-etilamino]metil}-2-metilfenilcarbamoil)etil]piperidin-
    4-il ester del acido bifenil-2-ilcarbamico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno pulmonar.
  8. 9. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el trastorno pulmonar es enfermedad pulmonar obstructiva cronica o asma.
ES15196303.0T 2003-02-14 2004-02-13 Derivado de bifenilo y su uso para el tratamiento de trastornos pulmonares Expired - Lifetime ES2636480T3 (es)

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