ES2351392T3

ES2351392T3 - Derivados bifenilo que tienen actividad agonista de receptores beta2-adrenérgicos y actividad antagonista de receptores muscarínicos.

Info

Publication number: ES2351392T3
Application number: ES04711253T
Authority: ES
Inventors: Adam Hughes; Yan Chen; Eric Stangeland; Mathai Mammen; Tae Weon Lee; Sarah Dunham; Craig Husfeld
Original assignee: Theravance Inc
Current assignee: Innoviva Inc
Priority date: 2003-02-14
Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2011-02-03
Anticipated expiration: 2024-02-13
Also published as: CN101239971A; CN101239970B; CN101239969B; CN101239970A; AR098785A2; CN101239968A; CN101239969A; CN101239968B; ZA200506215B; CN100378092C; CN101239971B; CN1759108A

Abstract

Bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilo de la fórmula **(Ver fórmula)**o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Antecedentes de la invención

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo derivado bifenilo que es útil para tratar trastornos pulmonares. Esta invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen dicho derivado bifenilo, a procesos y compuestos intermedios para la obtención de tal derivado bifenilo y a métodos de uso de dicho derivado bifenilo para tratar trastornos pulmonares.

Estado de la técnica

Los trastornos pulmonares, como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), se tratan habitualmente con broncodilatadores. Un grupo de broncodilatadores de uso generalizado consta de los agonistas de receptores ß2adrenérgicos (adrenoceptores), como son el albuterol, formoterol y salmeterol. Estos compuestos normalmente se administran por inhalación. Otros ejemplos de agonistas de receptores ß2-adrenérgicos se describen en el documento WO 99/64 031 y también en WO 99/64 035. Otro grupo de broncodilatadores está formado por los antagonistas de receptores muscarínicos (compuestos anticolinérgicos), por ejemplo el ipratropio y tiotropio. También estos compuestos se administran normalmente por inhalación. Estos ejemplos de antagonistas de receptores muscarínicos se describen en los documentos WO 01/42 212 y WO 01/42 213.

Las composiciones farmacéuticas que contienen tanto un agonista de receptores ß2-adrenérgicos como un antagonista de receptores muscarínicos ya son conocidos en la técnica para el uso en el tratamiento de trastornos pulmonares. Por ejemplo, en la patente US-6,433,027 se describen composiciones medicamentosas que contienen un antagonista de receptores muscarínicos, por ejemplo el bromuro de tiotropio, y un agonista de receptores ß2-adrenérgicos, por ejemplo el fumarato de formoterol.

Aunque ya son conocidos los compuestos que tienen actividad agonista de receptores ß2-adrenérgicos o antagonista de receptores muscarínicos, no se ha descrito previamente ningún compuesto que tenga actividad tanto de agonista de receptores ß2-adrenérgicos como de antagonista de receptores muscarínicos. Los compuestos que poseen tanto actividad agonista de receptores ß2-adrenérgicos como antagonista de receptores muscarínicos son muy deseables, porque estos compuestos bifuncionales proporcionarían una broncodilatación gracias a dos modos independientes de acción, manteniendo la farmacocinética de una molécula única.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un nuevo derivado bifenilo definido en la reivindicación 1, que es útil para el tratamiento de trastornos pulmonares. Entre otras propiedades, se ha constatado que el compuesto de esta invención posee no solo la actividad agonista de receptores ß2adrenérgicos sino también actividad antagonista de receptores muscarínicos.

La presente invención se refiere a un compuesto concre5 to de la fórmula I:

imagen1

en la que: a es el número 0 o un número entero de 1 a 3; cada R1 se elige con independencia entre alquilo(C1-4), al

10 quenilo(C2-4), alquinilo(C2-4), cicloalquilo(C3-6), ciano, halógeno, -OR1a, -C(O)OR1b, -SR1c, -S(O)R1d, -S(O)2R1e y -NR1fR1g; cada uno de R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f y R1g es con independencia hidrógeno, alquilo(C1-4) o fenil-alquilo(C1-4); b es el número 0 o un número entero de 1 a 3;

15 cada R2 se elige con independencia entre alquilo(C1-4), al-quenilo(C2-4), alquinilo(C2-4), cicloalquilo(C3-6), ciano, halógeno, -OR2a, -C(O)OR2b, -SR2c, -S(O)R2d, -S(O)2R2e y -NR2fR2g; cada uno de R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f y R2g es con independencia hidrógeno, alquilo(C1-4) o fenil-alquilo(C1-4);

20 W está unido a la posición 3 ó 4 con respecto al átomo de nitrógeno del anillo piperidina y significa O o NWa; Wa es hidrógeno o alquilo(C1-4); c es el número 0 o un número entero de 1 a 4; cada R3 se elige con independencia entre alquilo(C1-4), al-quenilo(C2-4), alquinilo(C2-4), cicloalquilo(C3-6), ciano, halógeno, -OR3a, -C(O)OR3b, -SR3c, -S(O)R3d, -S(O)2R3e y -NR3fR3g;

o dos grupos R3 se unen para formar un alquileno(C1-3), alquenileno(C2-3) u oxirano-2,3-diilo; cada uno de R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f y R3g es con independencia hidrógeno o alquilo(C1-4); R4 es un grupo divalente de la fórmula:

-(R4a)d-(A1)e-(R4b)f-Q-(R4c)g-(A2)h-(R4d)i-en la que: d, e, f, g, h e i se eligen en cada caso con independencia entre los números 0 y 1; R4a, R4b, R4c y R4d se eligen en cada caso con independencia entre alquileno(C1-10), alquenileno(C2-10) y alquinileno(C2-10), cada uno de dichos grupos alquileno, alquenileno o alquinileno está sin sustituir o sustituido de 1 a 5 veces por sustituyentes elegidos con independencia entre alquilo(C1-4), flúor, hidroxi, fenilo y fenil-alquilo(C1-4); A1 y A2 se eligen en cada caso con independencia entre cicloalquileno(C3-7), arileno(C6-10), -O-arileno(C6-10), arileno(C6-10)-O-, heteroarileno(C2-9), -O-heteroarileno(C2-9), heteroarileno(C2-9)-O-y heterocicleno (C3-6), en los que cada cicloalquileno está sin sustituir o sustituido de 1 a 4 veces por sustituyentes elegidos con independencia entre alquilo(C1-4), y cada grupo arileno, heteroarileno o heterocicleno está sin sustituir o sustituido de 1 a 4 veces por sustituyentes elegidos con independencia entre halógeno, alquilo (C1-4), alcoxi(C1-4), -S-alquilo(C1-4), -S(O)-alquilo (C1-4), - S(O)2-alquilo(C1-4), -C(O)O-alquilo(C1-4), carboxi, ciano, hidroxi, nitro, trifluormetilo y trifluormetoxi; Q se elige entre un enlace, -O-, -C(O)O-, -OC(O)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(Qa)C(O)-, -C(O)N(Qb)-, -N(Qc)S(O)2-, -S(O)2N(Qd)-, -N(Qe)C(O)N(Qf)-, -N(Qg)S(O)2N(Qh)-, -OC(O)N(Qi)-, -N(Qj)C(O)O- y -N(Qk); Qa, Qb, Qc, Qd, Qe, Qf, Qg, Qh, Qi, Qj y Qk se eligen en cada caso con independencia entre hidrógeno, alquilo (C1-6), A3 y alquileno(C1-4)-A4, dicho grupo alquilo está sin sustituir o sustituido de 1 a 3 veces por sustituyentes elegidos con independencia entre flúor, hidroxi y alcoxi(C1-4); o junto con el átomo de nitrógeno y el grupo R4b o R4c al que están unidos forman un grupo azacicloalquileno de 4-6 eslabones; A3 y A4 se eligen en cada caso con independencia entre cicloalquilo(C3-6), arilo(C6-10), heteroarilo(C2-9) y heterociclilo (C3-6), en el que cada cicloalquilo está sin sustituir o sustituido de 1 a 4 veces por sustituyentes elegidos con independencia entre alquilo(C1-4) y cada grupo arilo, heteroarilo o heterociclilo está sin sustituir o sustituido de 1 a 4 veces por sustituyentes elegidos con independencia entre halógeno, alquilo(C1-4) y alcoxi(C1-4); con la condición de que el número de átomos contiguos en la cadena más corta entre los dos átomos de nitrógeno a

los que está unido el R4 se sitúe dentro del intervalo de

4 a 16; R5 significa hidrógeno o alquilo(C1-4); R6 es -NR6aCR5b(O) o -CR6cR6dOR6e y R7 es hidrógeno; o R6 y R7 forman juntos un grupo -N R7aC(O)-CR7b=CR7c-, -CR7c=CR7e-C(O)NR7f-, -NR7gC(O)-CR7hR7i-CR7jR7k- o -CR7lR7m-CR7n R7o-C(O)-NR7p-; cada uno de R6a, R6b, R6c, R6d y R6e es con independencia hidrógeno o alquilo(C1-4); y cada uno de R7a, R7b, R7c, R7d, R7e, R7f, R7g, R7h, R7i, R7j, R7k , R7l, R7m, R7n, R7o y R7p es con independencia hidrógeno o alquilo(C1-4);

o una sal o un solvato o un estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra de sus formas de ejecución, esta invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéutica-mente eficaz del compuesto de la invención o de una sal o de un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Tales composiciones farmacéuticas pueden contener opcionalmente otros agentes terapéuticos. Por consiguiente, en una forma de ejecución, esta invención se refiere a una composición farmacéutica de este tipo, dicha composición contiene además una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente antiinflamatorio esteroideo, por ejemplo un corticosteroide.

El compuesto de esta invención posee actividad no solo agonista de receptores ß2-adrenérgicos sino también antagonista de receptores muscarínicos. Por consiguiente, el compuesto de la invención es útil para tratar trastornos pulmonares, tales como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

Por consiguiente, el compuesto de la invención es útil en un método para tratar un trastorno pulmonar, el método consiste en administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

Además, el compuesto de la invención es útil en un método que proporcione la broncodilatación a un paciente, el método consiste en administrar a un paciente que requiera la broncodilatación una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

Se describe también un método para tratar la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o el asma, el método consiste en administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

Dado que el compuesto de esta invención posee actividad no solo agonista de receptores ß2-adrenérgicos sino también antagonista de receptores muscarínicos, dicho compuesto es también útil como herramienta de investigación. Por consiguiente, en otro aspecto de este método, esta invención se refiere a un método de uso del compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo como herramienta de investigación para estudiar un sistema o una muestra biológica, o para descubrir nuevos compuestos químicos que tengan actividad no solo agonista de receptores ß2-adrenérgicos sino también antagonista de receptores muscarínicos.

5 Esta invención se refiere además al compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso en terapia o como medicamento.

Esta invención se refiere además al uso del compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente

10 aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento; en especial para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un trastorno pulmonar. Descripción detallada de la invención En una de sus formas de ejecución, esta invención se

15 refiere a un nuevo derivado bifenilo o a las sales o solvatos farmacéuticamente aceptables del mismo. Cuando aquí se presenta o se menciona un estereoisómero concreto, los expertos ya saben que también pueden estar presentes cantidades menores de otros estereoisómeros dentro de las composiciones de

20 esta invención, a menos que se indique otra cosa, con la condición de que la utilidad de la composición en su conjunto no se elimine con la presente de dichos isómeros adicionales.

En particular, el compuesto de la invención tiene un centro quiral en el átomo de carbono indicado con el símbolo 25 * en la fórmula siguiente:

imagen1

El átomo de carbono marcado con el símbolo * tiene una configuración (R). Es preferido que el compuesto de la invención tenga la configuración (R) en el átomo de carbono marca

5 do con el símbolo * o que esté enriquecido con una forma estereoisomérica que tenga la configuración (R) en este átomo de carbono, con el fin de optimizar la actividad agonista de receptores ß2-adrenérgicos del compuesto de esta invención.

El compuesto de la invención contiene además varios

10 grupos básicos (p.ej., grupos amino) y por lo tanto el compuesto puede existir en forma de base libre o en varias formas salinas. Todas las formas salinas están incluidas dentro del alcance de esta invención. Se incluyen además dentro del alcance de esta invención los solvatos del compuesto de la

15 invención o las sales del mismo. Además, si procede, se incluyen además dentro del alcance de esta invención todos los isómeros cis-trans (E/Z) (isómeros geométricos), las formas tautómeras y las formas topoisómeras del compuesto de la invención, a menos que se

20 especifique otra cosa. La nomenclatura aquí empleada para nombrar el compuesto de esta invención y sus compuestos intermedios se deriva en general del programa informático AutoNom que es un producto comercial (MDL, San Leandro, California). Por ejemplo, los

compuestos de la fórmula I, en la que W es O, se nombran como derivados éster del ácido bifenil-2-ilcarbámico. El compuesto de esta invención y también los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 son compuestos de la fór5 mula V:

imagen1

en la que W, R4, R6 y R7 tienen los significados definidos en la tabla I; o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

10 Tabla I

ej.: W R4 R5 R6

compar. 3: O (CH2)9 NHC(O)CH=CH

compar. 6: O (CH2)2C(O)NH(CH2)5 NHC(O)CH=CH

25: O (CH2)2C(O)NH(2cloro5metoxifen1,4ileno)CH2 NHC(O)CH=CH

Definiciones

Cuando se describen los compuestos, composiciones, métodos y procesos de esta invención, los términos que siguen tienen los significados que se definen a continuación, a me

15 nos que se indique otra cosa. El término “alquilo” significa un resto hidrocarburo saturado monovalente, que puede ser lineal o ramificado. A

menos que se definan de otro modo, dichos restos alquilo tienen normalmente de 1 a 10 átomos de carbono. Los restos alquilo representativos incluyen a título de ejemplo al metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, tert-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, nnonilo, n-decilo y similares.

El término “alquileno” significa un resto hidrocarburo saturado divalente, que puede ser lineal o ramificado. A menos que se definan de otro modo, dichos restos alquileno tienen normalmente de 1 a 10 átomos de carbono. Los restos alquileno representativos incluyen a título de ejemplo al metileno, etano-1,2-diilo (“etileno”), propano-1,2-diilo, propano-1,3-diilo, butano-1,4-diilo, pentano-1,5-diilo y similares.

El término “alcoxi” significa un resto monovalente de la fórmula (alquil)-O-, en la que alquilo tiene el significado aquí definido. Los restos alcoxi representativos incluyen a título de ejemplo al metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, isobutoxi, tert-butoxi y similares.

El término “alquenilo” significa un resto hidrocarburo insaturado monovalente, que puede ser lineal o ramificado y que tiene por lo menos un doble enlace carbono-carbono y normalmente 1, 2 ó 3 dobles enlaces. A menos que se definan de otro modo, dichos restos alquenilo tienen normalmente de 2 a 10 átomos de carbono. Los restos alquenilo representativos incluyen a título de ejemplo al etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-but-2-enilo, n-hex-3-enilo y similares. El término

“alquenileno” significa un resto alquenilo divalente.

El término “alquinilo” significa un resto hidrocarburo insaturado monovalente, que puede ser lineal o ramificado y que tiene por lo menos un triple enlace carbono-carbono y normalmente 1, 2 ó 3 triples enlaces. A menos que se definan de otro modo, dichos restos alquinilo tienen normalmente de 2 a 10 átomos de carbono. Los restos alquinilo representativos incluyen a título de ejemplo al etinilo, n-propinilo, n-but2-inilo, n-hex-3-inilo y similares. El término “alquinileno” significa un resto alquinilo divalente.

El término “arilo” significa un hidrocarburo aromático monovalente que tiene un solo anillo (p.ej. el fenilo) o tiene anillos fusionados (p.ej. el naftaleno). A menos que se definan de otro modo, dichos restos arilo tienen normalmente de 6 a 10 átomos de carbono en el anillo. Los restos arilo representativos incluyen a título de ejemplo al fenilo y naftalen-1-ilo, naftalen-2-ilo y similares. El término “arileno” significa un resto arilo divalente.

El término “azacicloalquilo” significa un anillo heterocíclico monovalente que tiene un átomo de nitrógeno, p.ej. un resto cicloalquilo, en el que un átomo de carbono se ha reemplazado por un átomo de nitrógeno. A menos que se definan de otro modo, dichos restos azacicloalquilo tienen normalmente de 2 a 9 átomos de carbono. Los ejemplos representativos de restos azacicloalquilo son los grupos pirrolidinilo y piperidinilo. El término “azacicloalquileno” significa un resto azacicloalquilo divalente. Los ejemplos representativos de restos azacicloalquileno son los grupos pirrolidinileno y

piperidinileno.

El término “cicloalquilo” significa un resto hidrocarburo carbocíclico saturado monovalente. A menos que se define de otro modo, dichos grupos cicloalquilo tienen normalmente de 3 a 10 átomos de carbono. Los restos cicloalquilo representativos incluyen a título de ejemplo al ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares. El término “cicloalquileno” significa un resto cicloalquilo divalente.

El término “halógeno” significa flúor, cloro, bromo y yodo.

El término “heteroarilo” significa un resto aromático monovalente que tiene un solo anillo o dos anillos fusionados y contiene en el anillo por lo menos un heteroátomo (por ejemplo de 1 a 3 heteroátomos) elegido entre nitrógeno, oxígeno y azufre. A menos que se definan de otro modo, dichos restos heteroarilo tienen normalmente un total de 5 a 10 átomos en el anillo. Los restos heteroarilo representativos incluyen a título ilustrativo los restos monovalentes del pirrol, imidazol, tiazol, oxazol, furano, tiofeno, triazol, pirazol, isoxazol, isotiazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina, triazina, indol, benzofurano, benzotiofeno, bencimidazol, benzotiazol, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina y similares, en los que el punto de unión está situado en cualquier átomo de carbono o de nitrógeno disponible del anillo. El término “heteroarileno” significa un resto heteroarilo divalente.

El término “heterociclilo” o “heterocíclico” significa un resto no aromático insaturado o saturado, monovalente, que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados y contiene por lo menos un heteroátomo (por ejemplo de 1 a 3 heteroátomos) en el anillo, elegidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre. A menos que se defina de otro modo, dichos restos heterocíclicos tienen un total de 2 a 9 átomos de carbono en el anillo. Los restos heterocíclicos representativos incluyen a título ilustrativo los restos monovalentes de la pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, piperidina, 1,4-dioxano, morfolina, tiomorfolina, piperazina, 3-pirrolina y similares, en los que el punto de unión es cualquier átomo de carbono o de nitrógeno disponible del anillo. El término “heterocicleno” significa un resto heterociclilo o heterocíclico divalente.

Cuando se define un número específico de átomos de carbono para un término concreto aquí empleado, entonces el número de átomos de carbono se indica entre paréntesis después del término en cuestión. Por ejemplo, el término “alquilo(C14)” indica un resto alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono.

El término “sal farmacéuticamente aceptable” significa una sal que es aceptable para la administración a un paciente, por ejemplo a un mamífero (p.ej. las sales que tienen una seguridad aceptable para los mamíferos en un régimen de dosificación determinado). Dichas sales pueden derivarse de bases inorgánicas u orgánicas aceptables y de ácidos inorgánicos u orgánicos aceptables. Las sales derivadas de bases inorgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen las sales amónicas, cálcicas, de cobre, férricas, ferrosas, líticas, magnésicas, mangánicas, manganosas, potásicas, sódicas, de cinc y similares. Son preferidas en especial las sales amónicas, cálcicas, magnésicas, potásicas y sódicas. Las sales derivadas de bases orgánicas farmacéuticamente aceptables incluye a las sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, incluyendo a las aminas sustituidas, las aminas cíclicas, las aminas de origen natural y similares, por ejemplo la arginina, betaína, cafeína, colina, N,N’-dibenciletilenodiamina, dietilamina, 2dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, las resinas de poliamina, la procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares. Las sales derivadas de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen a las sales del ácido acético, ascórbico, bencenosulfónico, benzoico, alcanforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, edisílico, fumárico, gentísico, glucónico, glucurónico, glutámico, hipúrico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, naftalenosulfónico, naftaleno-1,5-disulfónico, naftaleno-2,6-disulfónico, nicotínico, nítrico, orótico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenosulfónico, xinafoico y similares. Son preferidas en especial las sales de los ácidos cítrico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, maleico, naftaleno-1,5disulfónico, sulfúrico y tartárico.

El término “sal del mismo” significa un compuesto for

mado cuando un átomo de hidrógeno de un ácido se reemplaza

por un catión, por ejemplo un catión metálico, un catión orgánico o similares. Con preferencia, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable, aunque este requisito no se aplica a las sales de los compuestos intermedios, que no están destinadas a la administración a un paciente.

El término “solvato” significa un complejo o agregado formado por una o más moléculas de un soluto, es decir, un compuesto de la fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una o más moléculas de un disolvente. Tales solvatos son típicamente sólidos cristalinos que tienen una proporción molar entre soluto y disolvente sustancialmente fija. Los disolventes representativos incluyen por ejemplo al agua, metanol, etanol, isopropanol, ácido acético y similares. Si el disolvente es agua, el solvato que se forma es un hidrato.

Se apreciará que el término “o una sal o un solvato o un estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo” indica todas las permutaciones de sales, solvatos y estereoisómeros, por ejemplo un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable de un estereoisómero de un compuesto de la fórmula

I.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz” indica una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un paciente que necesita dicho tratamiento.

El término “tratar” o “tratamiento” se emplea aquí para indicar el tratamiento de una enfermedad o estado patológico (por ejemplo la COPD) de un paciente, por ejemplo de un mamí

fero (en especial de una persona humana), e incluye:

(a): prevenir la aparición de la enfermedad o estado patológico, es decir, un tratamiento profiláctico del paciente;

(b): mejorar la enfermedad o estado patológico, es decir, eliminar o provocar la regresión de la enfermedad o estado patológico del paciente;

(c): suprimir la enfermedad o estado patológico, es decir, frenar o detener el desarrollo de la enfermedad o estado patológico del paciente; o

(d): aliviar los síntomas de la enfermedad o estado patológico del paciente.

El término “grupo saliente” significa un grupo funcional o un átomo que puede desplazarse con otro grupo funcional

o átomo en una reacción de sustitución, por ejemplo una reacción de sustitución nucleófila. A título de ejemplo, los grupos salientes representativos incluyen al cloro, bromo y yodo; ésteres de ácidos sulfónicos, por ejemplo los mesilatos, tosilatos, brosilatos, nosilatos y similares; y grupos aciloxi, por ejemplo el acetoxi, trifluoracetoxi y similares.

El término “derivados protegidos de los mismos” significa derivados de un compuesto determinado, en los que uno o más grupos funcionales del compuesto están protegidos con grupos protectores o bloqueadores para que no sufran reacciones no deseadas. Los grupos funcionales que pueden protegerse incluyen a título de ejemplo los grupos ácido carboxílico, amino, hidroxilo, tiol, carbonilo y similares. Los grupos protectores representativos de ácido carboxílico incluyen los ésteres (por ejemplo el éster de p-metoxibencilo), amidas y hidrazidas; de grupos amino, los carbamatos (por ejemplo de tert-butoxicarbonilo) y las amidas; de los grupos hidroxilo, los éteres y los ésteres; de los grupos tiol, los tioéteres y tioésteres; de los grupos carbonilo, los acetales y los cetales; y similares. Dichos grupos protectores son bien conocidos de los expertos y se han descrito por ejemplo en T.W. Greene y G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, tercera edición, Wiley, Nueva York, 1999, y en las referencias que allí se citan.

El término “grupo protector de amino” significa un grupo protector idóneo para impedir reacciones no deseadas del grupo amino. Los grupos protectores representativos del grupo amino incluyen, pero no se limitan a: tert-butoxicarbonilo (BOC), tritilo (Tr), benciloxicarbonilo (Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), formilo, trimetilsililo (TMS), tertbutildimetilsililo (TBS) y similares.

El término “grupo protector de carboxi” significa un grupo protector idóneo para impedir reacciones no deseadas de un grupo carboxi. Los grupos protectores representativos del grupo carboxi incluyen, pero no se limitan a grupos metilo, etilo, tert-butilo, bencilo (Bn), p-metoxibencilo (PMB), 9fluorenilmetilo (Fm), trimetilsililo (TMS), tert-butildimetilsililo (TBS), difenilmetilo (benzhidrilo, DPM) y similares.

El término “grupo protector de hidroxilo” significa un grupo protector idóneo para impedir reacciones no deseadas de un grupo hidroxilo. Los grupos protectores representativos del grupo hidroxilo incluyen, pero no se limitan a los grupos sililo, incluido el tri-alquil(C1-6)-sililo, por ejemplo el trimetilsililo (TMS), trietilsililo (TES), tertbutildimetilsililo (TBS) y similares; los ésteres (grupos acilo) incluidos los grupos alcanoílo(C1-C), por ejemplo el formilo, acetilo y similares; los grupos arilmetilo, por ejemplo el bencilo (Bn), p-metoxibencilo (PMB), 9-fluorenilmetilo (Fm), difenilmetilo (benzhidrilo, DPM) y similares. Además, dos grupos hidroxilo pueden protegerse también en forma de alquilideno, formando por ejemplo una prop-2ilidina, por ejemplo, por reacción con una cetona, por ejemplo la acetona.

Composiciones farmacéuticas y formulaciones

Los compuestos de esta invención se administran a un paciente típicamente en forma de composición o formulación farmacéutica. Tales composiciones o formulaciones farmacéuticas pueden administrarse al paciente por cualquier vía de administración aceptable, incluidos los modos de administración siguientes, pero sin limitarse a ellos: el inhalado, oral, nasal, tópico (incluido el transdérmico) y parenteral. Se da por supuesto que cualquier forma del compuesto de esta invención, (es decir, base libre, sal farmacéuticamente aceptable, solvato, etc.), que se idónea para un modo concreto de administración, puede emplearse para las composiciones farmacéuticas aquí descritas.

Por consiguiente, en una de sus formas de ejecución, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Opcionalmente, si se desea, tales composiciones farmacéuticas pueden contener otros agentes terapéuticos y/o agentes de formulación.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención contienen de forma típica una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Por ejemplo, tales composiciones farmacéuticas contienen del 0,01 al 95% en peso del agente activo; con preferencia del 0,01 al 30% en peso; y con mayor preferencia del 0,01 al 10% en peso de agente activo.

En las composiciones farmacéuticas de esta invención puede utilizarse cualquier vehículo o excipiente convencional. La elección de un vehículo o excipiente concreto o de combinaciones de vehículos o excipientes concretos dependerá del modo de administración a aplicar para tratar a un paciente particular o del tipo de estado patológico. A este respecto, la preparación de una composición farmacéutica idónea para un modo particular de administración forma parte de las competencias de los expertos en ciencia farmacéutica. Además, los ingredientes de tales composiciones son productos comerciales, suministrados por ejemplo por Sigma, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. A guisa de ilustración adicional, las técnicas de formulación convencionales se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); y

H.C. Ansel y col., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7ª edición, Lippincott Williams & White, Balti

more, Maryland (1999).

Los ejemplos representativos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a los siguientes: (1) azúcares del tipo lactosa, glucosa y sucrosa; (2) almidones tales como el almidón de maíz y el almidón de la patata; (3) celulosa por ejemplo la celulosa microcristalina y sus derivados, del tipo carboximetilcelulosa sódica, etil-celulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes del tipo manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites del tipo aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles del tipo propilenglicol; (11) polioles, por ejemplo glicerina, sorbita, manita y polietilenglicol; (12) ésteres, por ejemplo oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tampón, por ejemplo hidróxido magnésico e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones tampón de fosfatos; y (21) gases propelentes comprimidos, por ejemplo los hidrocarburos clorofluorados y los hidrocarburos fluorados; y (22) otras sustancias compatibles, no tóxicas, empleadas en las composiciones farmacéuticas.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se fabrican normalmente por mezclado íntimo y a fondo del compuesto de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más ingredientes opcionales. Si fuera necesario o si se desea, la mezcla uniforme resultante puede moldearse o envasarse en tabletas, cápsulas, píldoras, viales, cartuchos, dispensadores o similares, empleando procedimientos y equipos convencionales.

En una forma de ejecución, las composiciones farmacéuticas de esta invención son idóneas para la administración por inhalación.

Las composiciones farmacéuticas idóneas para la administración por inhalación se presentan normalmente en forma de aerosol o de polvo.

Tales composiciones se administran por lo general empleando dispositivos bien conocidos de aplicación, por ejemplo un inhalador de nebulización, un inhalador de dosis calibrada (MDI), un inhalador de polvo seco (DPI) o un dispositivo similar de aplicación.

En una forma específica de ejecución de esta invención, la composición farmacéutica que contiene un agente activo se administra por inhalación empleando un inhalador de tipo nebulizador. Tales dispositivos nebulizadores producen normalmente una corriente de aire de gran velocidad que provoca que la composición farmacéutica que contiene el agente activo se proyecte en forma de neblina, que se introduce en el tracto respiratorio del paciente. Por consiguiente, cuando se formula para el uso en un inhalador nebulizador, el agente activo se disuelve normalmente en un vehículo apropiado para formar una solución. Como alternativa, el agente activo puede micronizarse y combinarse con un vehículo apropiado para formar una suspensión de partículas micronizadas de tamaño respirable, en este caso “micronizado” significa normalmente que aprox. el 90 % o más de las partículas tienen un diámetro de menos de 10 µm. Los dispositivos nebulizadores apropiados son productos comerciales, suministrados por ejemplo por PARI GmbH (Starnberg, Alemania). Otros dispositivos nebulizadores incluyen por ejemplo el Respimat (Boehringer Ingelheim) y los descritos, por ejemplo, en la patente US-6,123,068 y en el documento WO 97/12687.

Una composición farmacéutica representativa para emplear en un inhalador nebulizador consta de una solución acuosa isotónica que contiene de aprox. 0,05 µg/µl a 10 mg/µl del compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra forma específica de ejecución de esta invención, la composición farmacéutica que contiene el agente activo se administra por inhalación empleando un inhalador de polvo seco. Los inhaladores de polvo seco normalmente expenden el agente activo en forma de polvo de buena fluidez, que se dispersa en la corriente de aire que el paciente inspira. Para conseguir un polvo de buena fluidez, el agente activo se formula normalmente con un excipiente idóneo, por ejemplo la lactosa o el almidón.

Una composición farmacéutica representativa para emplear en inhaladores de polvo seco contiene lactosa seca con un tamaño de partícula comprendido entre 1 µm y 100 µm y partículas micronizadas del compuesto de la invención, o una sal

o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Esta formulación de polvo seco puede fabricarse por

ejemplo combinando la lactosa con el agente activo y después

preparando una mezcla seca de los componentes. Como alternativa, si se desea, el agente activo puede formularse sin excipiente. En tal caso, la composición farmacéutica se introduce normalmente en un dispensador de polvo seco o en cartuchos o cápsulas de inhalación que se emplean en un dispositivo de proyección de polvo seco.

Los ejemplos de dispositivos de proyección de polvo seco inhalable incluyen al Diskhaler (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC) (véase, p.ej., la patente US-5,035,237); Diskus (GlaxoSmithKline) (véase, p.ej., la patente US6,378,519); Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, DE) (véase, p.ej., la patente US-4,524,769); Rotahaler (GlaxoSmithKline) (véase, p.ej., la patente US-4,353,365) y Handihaler (Boehringer Ingelheim). Otros ejemplos de dispositivos DPI apropiados se han descrito en las patentes US-5,415,162, 5,239,993, y 5,715,810 y en las referencias que se citan en ellas.

En otra forma específica adicional de ejecución de esta invención, se administra la composición farmacéutica que contiene el agente activo por inhalación empleando un inhalador de dosis calibradas. Estos inhaladores de dosis calibradas descarga normalmente una cantidad medida del agente activo o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo empleando un gas propelente comprimido. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas administradas con un inhalador de dosis calibrada constan normalmente de una solución o de una suspensión del agente activo en el gas propelente licuado. Puede emplearse cualquier gas propelente licuado idóneo, incluidos los hidrocarburos clorofluorados, por ejemplo el CCl3F, y los alcanos fluorados (HFA), por ejemplo el 1,1,1,2-tetrafluoretano (HFA 134a) y el 1,1,1,2,3,3,3-heptafluor-n-propano (HFA 227). Debido a las objeciones relativas a los hidrocarburos clorofluorados que afectan a la capa del ozono, por lo general se prefieren las formulaciones que contienen HFA. Otros componentes opcionales adicionales de las formulaciones de HFA incluyen codisolventes, por ejemplo etanol o pentano, y tensioactivos, p.ej. el trioleato de sorbita, ácido oleico, lecitina y glicerina, véanse, por ejemplo, la patente US5,225,183, EP-0717987 A2 y WO 92/22286.

Una composición farmacéutica representativa que se puede emplear en un inhalador de dosis calibrada consta aprox. del 0,01 % al 5 % en peso de un compuesto de la fórmula I o de una sal de un solvato farmacéuticamente aceptable o de un estereoisómero del mismo; aprox. del 0 % al 20 % en peso de etanol; y aprox. del 0 % al 5 % en peso de un tensioactivo; el resto es el propelente HFA.

Tales composiciones se fabrican normalmente introduciendo el alcano fluorado enfriado o presurizado en un recipiente idóneo, que contiene el agente activo, etanol (si está presente) y el tensioactivo (si está presente). Para preparar una suspensión se microniza el agente activo y después se mezcla con el propelente. La formulación se introduce seguidamente en un vial de aerosol, que forma parte de un dispositivo inhalador de dosis calibrada. Los ejemplos de dispositivos inhaladores de dosis calibrada, en los que se pueden emplear propelentes HFA, se han descrito en las patentes US6,006,745 y 6,143,277. Como alternativa, puede prepararse una formulación de suspensión por secado de atomización de un tensioactivo sobre las partículas micronizadas del agente activo, véanse, por ejemplo, los documentos WO 99/53901 y WO 00/61108.

Véanse ejemplos adicionales de procesos de preparación de partículas respirables y de formulaciones y de dispositivos idóneos para la dosificación por inhalación en las patentes US-6,268,533, 5,983,956, 5,874,063, y 6,221,398 y en los documentos WO 99/55319 y WO 00/30614.

En otra forma de ejecución, las composiciones farmacéuticas de esta invención son idóneas para la administración oral. Las composiciones farmacéuticas idóneas para la administración oral pueden adoptar la forma de cápsulas, tabletas, píldoras, pastillas, sellos, grageas, polvos, gránulos;

o en forma de solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o en forma de elixir o jarabe; y similares; cada una de ellas contiene como ingrediente activo una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención.

Si se destinan a la administración oral en una forma de dosificación sólida (es decir, en forma de cápsulas, tabletas, píldoras y similares), las composiciones farmacéuticas de la invención contendrán de modo típico un compuesto de la presente invención como ingrediente activo y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, del tipo citrato sódico o fosfato dicálcico. Opcionalmente o como alternativa, tales formas sólidas de dosificación pueden contener además: (1) cargas de relleno o materiales de abaratamiento, del tipo almidones, celulosa microcristalina, lactosa, sucrosa, glucosa, manita y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, del tipo carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrosa y/o acacia; (3) hidratantes, del tipo glicerina; (4) agentes desintegrantes, por ejemplo agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y/o carbonato sódico; (5) agentes retardantes de disolución, por ejemplo parafina; (6) acelerantes de absorción, por ejemplo compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, del tipo alcohol cetílico y/o monostearato de glicerina; (8) absorbentes, por ejemplo caolín y/o arcilla de bentonita; (9) lubricantes, por ejemplo talco, estearato cálcico, estearato magnésico, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato sódico y/o mezclas de los mismos; (10) agentes colorantes; y (11) agentes tampón.

Los agentes de liberación, agentes humectantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saborizantes y aromas, los conservantes y antioxidantes pueden estar también presentes en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen:

(1) los antioxidantes solubles en agua, por ejemplo ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfato sódico, sulfito sódico y similares; (2) los antioxidantes solubles en aceite, por ejemplo el palmitato de ascorbilo, el hidroxianisol butilado (BHA), el hidroxitolueno butilado (BHT), la lecitina, el galato de propilo, el alfatocoferol y similares; y (3) los agentes quelantes (secuestrantes) de metales, por ejemplo el ácido cítrico, el ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), la sorbita, el ácido tartárico, el ácido fosfórico y similares. Los agentes de recubrimiento para tabletas, cápsulas, píldoras y similares, incluyen a los empleados para recubrimiento entérico, por ejemplo el acetato-ftalato de celulosa (CAP), el poli(acetatoftalato de vinilo) (PVAP), el ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, los copolímeros de ácido metacrílicometacrilato, el acetato-trimelitato de celulosa (CAT), la carboximetil-etil-celulosa (CMEC), el acetato-succinato de hidroxipropil-metil-celulosa (HPMCAS) y similares.

Si se desea, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse para que proporcionen una liberación lenta o controlada del ingrediente activo, empleando por ejemplo la hidroxipropil-metil-celulosa en proporciones variables; u otras estructuras poliméricas, liposomas y/o microesferas.

Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden formularse de manera que liberen el ingrediente activo solo, o con preferencia, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones englobantes que pueden utilizarse incluyen a las sustancias poliméricas y las ceras. El ingrediente activo puede estar presente también en forma microencapsulada, si fuera apropiado, con uno o más de los excipientes recién nombrados.

Las formas de dosificación líquidas apropiadas para la

administración oral incluyen, a título ilustrativo, las emul

siones farmacéuticamente aceptables, las microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Tales formas líquidas de dosificación contienen de modo típico el ingrediente activo y un diluyente inerte, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, por ejemplo alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (por ejemplo aceite de algodón, aceite de cacahuete, aceites de maíz, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerina, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos con sorbita y mezclas de los mismos. Las suspensiones, además del ingrediente activo, pueden llevar agentes de suspensión, por ejemplo alcohol isoestearílico etoxilado, poli(óxido de etileno)-sorbita y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agaragar y tragacanto y mezclas de los mismos.

Cuando se destinan a la administración oral, las composiciones farmacéuticas de esta invención se envasan con preferencia en una forma de dosificación unitaria. El término “forma de dosificación unitaria” significa una unidad físicamente discreta, idónea para la dosificación a un paciente, es decir, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de agente activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, ya sea sola, ya sea en combinación con una o más unidades adicionales. Por ejemplo, tales formas de dosificación unitarias pueden ser cápsulas, tabletas, píldoras y si

milares.

Los compuestos de la invención pueden administrarse también por vía transdérmica, empleando sistemas de aplicación transdérmica ya conocidos y excipientes apropiados. Por ejemplo, un compuesto de la invención puede mezclarse con intensificadores de penetración, por ejemplo propilenglicol, monolaurato de polietilenglicol, azacicloalcan-2-onas y similares e incorporarse a un emplasto o un sistema similar de aplicación. Los excipientes adicionales incluyen a los agentes gelificantes, emulsionantes y tampones y pueden utilizarse, si se desea, para estas composiciones transdérmicas.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener además otros agentes terapéuticos, que se coadministran con el compuesto de la invención, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener además uno o más agentes terapéuticos elegidos entre otros broncodilatadores (p.ej., inhibidores de PDE3, modula-dores de adenosina 2b y agonistas de receptores ß2adrenérgicos); agentes antiinflamatorios (p.ej. agentes esteroideos antiinflamatorios, por ejemplo los corticosteroides; agentes antiinflamatorios no esteroideos (NSAID) e inhibido-res de PDE4); otros antagonistas de receptores muscarínicos (es decir, agentes anticolinérgicos); agentes antiinfecciosos (p.ej. antibióticos Gram-positivos y Gram-negativos o compuestos antivirales); antihistaminas; inhibidores de proteasas; y bloqueadores aferentes (p.ej., agonistas de D2 y moduladores de neuroquinina). Los agentes terapéuticos adicionales pueden utilizarse en forma de sales o de solvatos farmacéuticamente aceptables. Además, si procede, los agentes terapéuticos adicionales pueden utilizarse en forma de estereoisómeros ópticamente puros.

Los agonistas representativos de receptores ß2adrenérgicos que pueden utilizarse en combinación con y en además del compuesto de esta invención incluyen, pero no se limitan a: salmeterol, salbutamoles, formoterol, salmefamoles, fenoterol, terbutalina, albuterol, isoetarina, metaproterenol, bitolterol, pirbuterol, levalbuterol y similares, o sus sales farmacéuticamente aceptables. Otros agonistas de receptores ß2-adrenérgicos que pueden utilizarse en combinación con el compuesto de esta invención incluyen, pero no se limitan a: 3-(4-{[6-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)-fenil]etil}amino)-hexil]oxi}butil)bencenosulfonamida y 3-(-3-{[7-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}-amino)heptil]oxi}-propil)bencenosulfonamida y compuestos afines descritos en WO 02/066422, publicado el 29 de agosto de 2002; 3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi3-(hidroximetil)fenil]etil}amino)hexil]oxi}butil)-fenil]imidazolidina-2,4-diona y compuestos afines descritos en WO 02/070490, publicado el 12 de setiembre de 2002; 3-(4-{[6({(2R)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, 3-(4-{[6-({(2S)-2[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, 3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, N-(tert-butil)-3-(4-{[6-({(2R)-2

[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]

oxi}butil)bencenosulfonamida, N-(tert-butil)-3-(4-{[6-({(2S)2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, N-(tert-butil)-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]-oxi}butil)bencenosulfonamida y compuestos afines descritos en WO 02/076933, publicados el 3 de octubre de 2002; 4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6-diclorobencil)oxi]etoxi}hexil)amino]-1-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol y compuestos afines descritos en WO 03/024439, publicado el 27 de marzo de 2003; y sus sales farmacéuticamente aceptables. Cuando se emplea, el agonista del ß2-adrenorreceptor estará presente en la composición farmacéutica en una cantidad terapéutica-mente eficaz. Por ejemplo, el agonista del ß2-adrenorreceptor estará presente en una cantidad suficiente, para proporcionar de 0,05 µg a 500 µg por dosis.

Los agentes esteroideos antiinflamatorios representativos, que pueden utilizarse en combinación con el compuesto de esta invención incluyen, pero no se limitan a: metilprednisolona, prednisolona, dexametasona, fluticasona propio-nato, 6,9-difluor-17-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11-hidroxi-16metil-3-oxoandrosta-1,4-dieno-17-carbotioato de S-fluormetilo, 6,9-difluor-11-hidroxi-16-metil-3-oxo-17-propioniloxiandrosta-1,4-dieno-17-carbotioato de S-(2-oxo-tetrahidro-furan-3S-ilo), ésteres de beclometasona (p.ej. el éster 17propionato o el éster 17,21-dipropionato), budesonida, flunisolida, ésteres de mometasona (p.ej. el éster furoato), triamcinolona-acetonida, rofleponida, ciclesonida, butixocort propionato, RPR-106541, ST-126 y similares, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Si se emplean, los agentes esteroides antiinflamatorios estarán presentes en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, el agente esteroideo antiinflamatorio estará presente en una cantidad suficiente, proporcionando de aprox. de 0,05 µg a 500 µg por dosis.

Otras combinaciones idóneas incluyen, por ejemplo, otros agentes antiinflamatorios, p.ej., los NSAID (por ejemplo el cromoglicato sódico; nedocromil sodio; inhibidores de fosfodiesterasa (PDE) (p.ej. teofilina, inhibidores de PDE4 o inhibidores mixtos PDE3/PDE4); antagonistas de leucotrienos (p.ej. monteleukast); inhibidores de la síntesis de leucotrieno; inhibidores de iNOS; inhibidores de proteasas, por ejemplo inhibidores de triptasa y elastasa; antagonistas de beta-2-integrina y agonistas o antagonistas de receptores de adenosina (p.ej. agonistas de adenosina 2a); antagonistas de citoquinas (p.ej. antagonistas de quimioquinas, por ejemplo el anticuerpo de interleucina (anticuerpo IL), específicamente, una terapia de IL-4, una terapia de IL-13 o una combinación de las mismas); o inhibidores de la síntesis de citoquinas.

Por ejemplo, Los inhibidores representativos de fosfodiesterasa-4 (PDE4) o los inhibidores mixtos de PDE3/PDE4 que pueden utilizarse en combinación con los compuestos de esta invención incluyen, pero no se limitan a: el ácido cis-4ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexano-1carboxílico, 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4difluormetoxifenil)ciclohexan-1-ona; cis-[4-ciano-4-(3ciclopropilmetoxi-4-difluormetoxifenil)ciclohexan-1-ol]; ácido cis-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]ciclohexano-1-carboxílico y similares, o sus sales farmacéutica-mente aceptables. Otros inhibidores representativos de la PDE4 o inhibidores mixtos de PDE4/PDE3 incluyen al AWD-12-281 (elbion); NCS-613 (INSERM); D-4418 (Chiroscience y Schering-Plough); CI-1018 o PD-168787 (Pfizer); compuestos benzodioxol descritos en el documento WO 99/16766 (Kyowa Hakko); K-34 (Kyowa Hakko); V-111294A (Napp); roflumilast (Byk-Gulden); compuestos de ftalazinona descritos en WO 99/47505 (Byk-Gulden); pumafentrina (Byk-Gulden, ahora Altana); arofilina (Almirall-Prodesfarma); VM554/UM565 (Vernalis); T-440 (Tanabe Seiyaku); y T2585 (Tanabe Seiyaku).

Los antagonistas muscarínicos representativos (es decir, agentes anticolinérgicos) que pueden utilizarse en combinación con y en adición al compuesto de esta invención incluyen, pero no se limitan a: la atropina, atropina sulfato, atropina óxido, metilatropina nitrato, homatropina bromhidrato, hiosciamina (d, l) bromhidrato, escopolamina bromhidrato, bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, bromuro de tiotropio, metantelina, bromuro de propantelina, bromuro de anisotropina-metilo, bromuro de clidinio, copirrolato (robinul), yoduro de isopropamida, bromuro de mepenzolato, cloruro de ridihexetilo (patilona), metilsulfato de hexociclio, ciclopentolato clorhidrato, tropicamida, trihexilfenidilo clorhidrato, pirenzepina, telenzepina, AF-DX 116 y metoctramina y similares, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; o, para los compuestos enumerados en forma de sal, sal alternativa farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Las antihistaminas representativas (es decir, antagonistas de receptor H1) que pueden utilizarse en combinación con el compuesto de esta invención incluyen, pero no se limitan a: etanolaminas, por ejemplo la carbinoxamina maleato, clemastina fumarato, difenilhidramina clorhidrato y dimenhidrinato; etilenodiaminas, por ejemplo la pirilamina maleato, tripelenoamina clorhidrato y tripelenoamina citrato; alquilaminas, por ejemplo la clorfeniramina y acrivastina; piperazinas, por ejemplo la hidroxizina clorhidrato, hidroxizina pamoato, ciclizina clorhidrato, ciclizina lactato, meclizina clorhidrato y cetirizina clorhidrato; piperidinas, por ejemplo el astemizol, levocabastina clorhidrato, loratadina o su análogo descarboetoxi, terfenadina y fexofenadina clorhidrato; azelastina clorhidrato; y similares, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; o, para los compuestos enumerados como sal, las sales alternativas farmacéutica-mente aceptables de los mismos.

Las dosis apropiadas para los agentes terapéuticos adicionales administrados en combinación con el compuesto de la invención se sitúa en el intervalo comprendido entre 0,05 g/día y 100 mg/día.

Las siguientes formulaciones ilustran las composiciones farmacéuticas representativas de la presente invención.

Ejemplo de formulación A

Se fabrica un polvo seco para la administración por in

halación del modo siguiente:

ingredientes: cantidad

compuesto de la invención: 0,2 mg

lactosa: 25 mg

Procedimiento representativo: Se microniza el compuesto de la invención y después se mezcla con la lactosa. Se envasa la mezcla resultante en un cartucho de inhalación de gelatina. El contenido del cartucho de administra empleando un inhalador de polvo.

Ejemplo de formulación B

Se fabrica una formulación de polvo seco para la administración en un dispositivo de inhalación de polvo seco del modo siguiente:

Procedimiento representativo: Se prepara una composición farmacéutica que tiene una proporción de formulación a granel entre el compuesto micronizado de la invención y la lactosa de 1:200. Se envasa la composición en un dispositivo de inhalación de polvo seco, capaz de proyectar de 10 µg a 100 µg de compuesto de la invención por dosis.

Ejemplo de formulación C

Se fabrica una formulación de polvo seco para la administración por inhalación en un inhalador de dosis calibrada del modo siguiente:

Procedimiento representativo: Se prepara una suspensión que contiene un 5 % en peso de un compuesto de la invención y un 0,1 % en peso de lecitina dispersando 10 g del compuesto de la invención en forma de partículas micronizadas que tienen un tamaño medio inferior a 10 µm en una solución formada por 0,2 g de lecitina disuelta en 200 ml de agua desmineralizada. Se seca la suspensión por atomización y se microniza el material resultante hasta obtener partículas de un diámetro medio inferior a 1,5 µm. Se envasan las partículas en cartuchos que contienen 1,1,1,2-tetrafluoretano presurizado.

Ejemplo de formulación D

Se fabrica una composición farmacéutica para el uso en un inhalador de dosis calibrada del modo siguiente:

Procedimiento representativo: Se prepara una suspensión que contiene un 5 % en peso de un compuesto de la invención, un 0,5 % en peso de lecitina y un 0,5 % en peso de trehalosa dispersando 5 g de ingrediente activo en forma de partículas micronizadas que tienen un tamaño medio inferior a 10 µm en una solución formada por 0,5 g de lecitina y 0,5 g de trehalosa disueltas en 100 ml de agua desmineralizada. Se seca la suspensión por atomización y se microniza el material resultante hasta obtener partículas de un diámetro medio inferior a 1,5 µm. Se envasan las partículas en cartuchos que contienen 1,1,1,2-tetrafluoretano presurizado.

Ejemplo de formulación E

Se fabrica una composición farmacéutica para el uso en un inhalador nebulizador del modo siguiente:

Procedimiento representativo: Se prepara una formulación acuosa de aerosol para el uso en un nebulizador disolviendo 0,1 mg del compuesto de la invención en 1 ml de una solución de cloruro sódico al 0,9 % acidificada con ácido cítrico. Se agita la mezcla y se expone a ultrasonidos hasta disolver el ingrediente activo. Se ajusta el pH de la solu

ción a un valor comprendido entre 3 y 8 por adición lenta de

NaOH.

Ejemplo de formulación F

Se fabrican cápsulas de gelatina dura para la adminis

tración oral del modo siguiente:

ingredientes: cantidad

compuesto de la invención: 250 mg

lactosa (secada por atomización): 200 mg

estearato magnésico: 10 mg

Procedimiento representativo:: Se mezclan a fondo los

ingredientes y se envasan en una cápsula de gelatina dura

(460 mg de composición por cápsula). Ejemplo de formulación G Se fabrica una suspensión para la administración oral

del modo siguiente: ingredientes cantidad compuesto de la invención 1,0 g ácido fumárico 0,5 g cloruro sódico 2,0 g metilparaben 0,15 g propilparaben 0,05 g azúcar granulado 25,5 g sorbita (solución al 70%) 12,85 g Veegum K (Vanderbilt Co.) 1,0 g aroma 0,035 ml colorante 0,5 mg agua destilada cant. suf. hasta 100 ml

Procedimiento representativo: se mezclan los ingredientes para formar una suspensión que contiene 100 mg de ingrediente activo por 10 ml de suspensión.

Ejemplo de formulación H Se fabrica una formulación inyectable del modo siguien

te:

ingredientes: cantidad

compuesto de la invención: 0,2 g

solución tampón de acetato sódico (0,4 M): 2,0 ml

HCl (0,5 N) o NaOH (0,5 N), cantidad sufic.: hasta pH 4

agua (destilada, estéril), cantidad sufic.: hasta 20 ml

Procedimiento representativo: Se mezclan los ingredientes recién nombrados y se ajusta el pH a 4 ± 0,5 empleando HCl 0,5 N o NaOH 0,5 N.

Utilidad

El compuesto de esta invención posee actividad no solo agonista de receptores ß2-adrenérgicos sino también antagonista de receptores muscarínicos y por ello este compuesto es útil para tratar estados patológicos mediados por receptores ß2-adrenérgicos o receptores muscarínicos, es decir, estados patológicos que se mejoran mediante el tratamiento con un agonista de receptores ß2-adrenérgicos o un antagonista de receptores muscarínicos. Estos estados patológicos incluyen a título de ejemplo, los trastornos pulmonares o enfermedades asociadas con la obstrucción reversible de las vías respiratorias, por ejemplo la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (p.ej., la bronquitis crónica y jadeante y el enfisema), el asma, la fibrosis pulmonar y similares. Otros estados patológicos que pueden tratarse incluyen el parto prematura, la depresión, el fallo cardíaco congestivo, la enfermedades de la piel (p.ej., enfermedades inflamatorias, alérgicas, psoriáticas y proliferativas de la piel), estados en los que es deseable reducir la acidez péptica (p.ej. la ulceración péptica y gástrica) y la enfermedad del deterioro muscular.

Por consiguiente, en una forma de ejecución, esta invención se refiere al compuesto de la invención para el uso en un método de tratamiento de un trastorno pulmonar, el método consiste en administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando se emplea para tratar un trastorno pulmonar, el compuesto de esta invención se administrará normalmente por inhalación en dos múltiples al día, en una sola dosis al día o una sola dosis a la semana. En general, la dosis para tratar un trastorno pulmonar se situará aprox. entre 10 µg/día y 200 µg/día.

Si se administra por inhalación, el compuesto de esta invención tiene normalmente el efecto de proporcionar la broncodilatación. Por consiguiente, en otro de sus aspecto, esta invención se refiere al compuesto de la invención para el uso en un método de proporcionar la broncodilatación a un paciente, el método consiste en administrar a un paciente que requiera la broncodilatación una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. En general, la dosis para proporcionar la broncodilatación se situará aprox. entre 10 µg/día y 200 µg/día.

En una forma de ejecución, esta invención se refiere al compuesto de la invención para el uso en un método de tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o el asma, el método consiste en administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la invención o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando se emplea para tratar la COPD o el asma, el compuesto de esta invención se administrará normalmente por inhalación en múltiples dosis al día o en una sola dosis al día. En general, la dosis para tratar la COPD o el asma se situará aprox. entre 10 µg/día y 200 µg/día.

Tal como se emplea aquí, la COPD incluye la bronquitis obstructiva crónica y el enfisema (véase, por ejemplo, Barnes, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, N. Engl. J. Med. 343, 269-78, 2000).

Cuando se emplea para tratar un trastorno pulmonar, el compuesto de esta invención se administra opcionalmente en combinación con otros agentes terapéuticos. En particular, combinando los compuestos de esta invención con un agente esteroideo antiinflamatorio (p.ej. un corticosteroide), las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden proporcionar una terapia triple, es decir, actividad agonista de receptores ß2-adrenérgicos, antagonista de receptores muscarínicos y actividad antiinflamatoria, empleando solamente dos componentes activos. Dado que las composiciones farmacéuticas que contienen dos componentes activos son normalmente más fáciles de formular que las composiciones que contienen tres componentes activos, estas composiciones de dos componentes proporcionan una ventaja significativa con respecto a las composiciones que contienen tres componentes activos. Por consiguiente, en una forma especial de ejecución, las composiciones farmacéuticas y los métodos de esta invención contienen además una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente antiinflamatorio esteroideo.

El compuesto de esta invención posee no solo actividad antagonista de receptores muscarínicos sino también agonista de receptores ß2-adrenérgicos. Por consiguiente, entre otras propiedades, los compuestos de especial interés son aquellos que presentan un valor de constante inhibidora Ki de la fijación sobre el receptor muscarínico M3 y un valor EC50 de agonista de receptores ß2-adrenérgicos menor que 100 nM; en especial menor que 10 nM. Entre estos compuestos, los compuestos de interés especial incluyen a aquellos que tienen actividad muscarínica, expresada en términos de constante inhibidora Ki de la fijación sobre el receptor muscarínico M3, que es aprox. igual a la actividad agonista ß2-adrenérgica del compuesto, expresada en términos de concentración eficaz semimáxima EC50, determinada en los ensayos “in vitro” aquí descritos, o en ensayos similares. Por ejemplo, los compuestos de interés especial son los que tienen una relación entre la constante inhibidora Ki del receptor muscarínico M3 y el valor EC50 del receptor ß2-adrenérgico que se sitúa entre aprox. 30:1 y 1:30, incluidos los valores entre 20:1 y 1:20, por ejemplo entre 10:1 y 1:10.

En uno de sus aspectos, la presente invención proporciona además el compuesto de la invención para el uso en un método para tratar un trastorno pulmonar, el método consiste en administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que tenga actividad no solo antagonista de receptores muscarínicos sino también agonista de receptores ß2-adrenérgicos.

En una forma especial de ejecución de este método, el compuesto administrado tiene una constante inhibidora Ki del receptor muscarínico M3 menor que 100 nM y una concentración eficaz semimáxima EC50 del agonismo del agonismo del receptor ß2-adrenérgico menor que 100 nM. En otra forma de ejecución, el método de tratar un trastorno pulmonar consiste en administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto para el que la relación entre la constante inhibidora Ki del receptor muscarínico M3 y el valor EC50 del agonismo del receptor ß2-adrenérgico se sitúe entre 30:1 y 1:30.

Dado que el compuesto de esta invención posee actividad no solo agonista de receptores ß2-adrenérgicos sino también antagonista de receptores muscarínicos, dicho compuesto es también útil como herramienta de investigación o estudio de sistemas o muestras biológicos que tengan receptores ß2adrenérgicos o receptores muscarínicos, o para descubrir nuevos compuestos que tengan no solo actividad agonista de receptores ß2-adrenérgicos sino también actividad antagonista de receptores muscarínicos. Tales sistemas o muestras biológicos pueden contener receptores ß2-adrenérgicos y/o receptores muscarínicos. En tales estudios puede emplearse cualquier sistema o muestra biológicos idóneos que tengan receptores ß2-adrenérgicos y/o receptores muscarínicos, dichos estudios pueden realizarse “in vitro” o “in vivo”.

Los sistemas o muestras biológicos representativos idóneos para tales estudios incluyen, pero no se limitan a: células, extractos celulares, membranas plasmáticas, muestras de tejidos, mamíferos (por ejemplo ratones, ratas, cobayas, conejos, perros, cerdos, etc.) y similares.

En esta forma de ejecución se pone en contacto un sistema o muestra biológicos que contenga un receptor ß2adrenérgico o receptor muscarínico con una cantidad de compuesto de esta invención que tenga actividad agonista de receptores ß2-adrenérgicos o antagonista de receptores muscarínicos. Después se determinan los efectos empleando procedimientos y equipos convencionales, por ejemplo ensayos de fijación de radioligando y ensayos funcionales. Estos ensayos funcionales incluyen los cambios mediados por los ligandos en el adenosina-monofosfato cíclico intracelular (cAMP), los cambios mediados por ligandos en la actividad de la enzima adenilil-ciclasas (que sintetiza la cAMP), los cambios mediados por ligandos en la incorporación de guanosina-5’-O-(tio)trifosfato ([35S]GTP-S) a membranas aisladas a través del intercambio catalizado por el receptor de la GTP-S[S35] por la GDP, los cambios mediados por ligandos en los iones calcio intracelulares libres (medidos por ejemplo con un lector de placas de generación de imágenes unidos a fluorescencia o FLIPR® de Molecular Devices, Inc.). El compuesto de la invención tiene actividad agonista o produce la activación de un receptor ß2-adrenérgico y tiene actividad antagonista o disminuye la activación de los receptores muscarínicos en cualquiera de los ensayos funcionales recién mencionados, o en ensayos de índole similar. La cantidad de compuesto empleada en estos estudios se situará normalmente entre 0,1 nanomolar y 100 nanomolar.

Además, el compuesto de esta invención puede emplearse como herramienta de investigación para descubrir nuevos compuestos que tengan no solo actividad agonista de receptores ß2-adrenérgicos sino también antagonista de receptores muscarínicos. En esta forma de ejecución se comparan los datos de fijación de un receptor ß2-adrenérgico y un receptor muscarínico (determinados por ejemplo en ensayos “in vitro” de desplazamiento de radioligando) de un compuesto ensayado o de un grupo de compuestos ensayados con los datos de fijación de receptor ß2-adrenérgico y un receptor muscarínico con el compuesto de esta invención con el fin de identificar los compuestos ensayados que tienen una fijación igual o superior con el receptor ß2-adrenérgico y/o un receptor muscarínico, si es que tienen alguna. Este aspecto de la invención incluye como formas separadas de ejecución, no solo la generación de datos comparativos (efectuando ensayos apropiados) sino también el análisis de los datos experimentales que permiten identificar a los compuestos ensayados de interés.

Las propiedades y utilidad del compuesto de esta inven

ción pueden demostrarse realizado varios ensayos “in vitro” e

“in vivo”, que los expertos conocen bien. Por ejemplo, los ensayos representativos se describen con mayor detalle en los ejemplos que siguen.

Ejemplos

Las siguientes obtenciones y ejemplos se facilitan para ilustrar las formas específicas de ejecución de esta invención.

Las siguientes abreviaturas tienen los significados que se definen, a menos que se indique otra cosa, y las demás abreviaturas que se empleen y no se hayan definido tendrán sus significados convencionales (estándar). AC adenilil-ciclasa Ach acetilcolina ATCC American Type Culture Collection BSA albúmina de suero bovino cAMP adenosina-monofosfato cíclico 3’-5’ CHO ovario de hámster chino cM5 receptor M5 de chimpancé clonado DCM diclorometano (es decir, cloruro de metileno) DIPEA N,N-diisopropiletilamina dPBS solución salina tamponado con fosfato de Dulbecco DMEM medio llamado “Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium” DMSO sulfóxido de dimetilo EDTA ácido etilenodiaminatetraacético Emáx eficacia máxima EtOAc acetato de etilo EtOH etanol FBS suero fetal bovino FLIPR lector de placas de generación de imágenes fluorimétricas Gly glicina HATU hexafluorfosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il-N,N,N’,N’tetrametiluronio HBSS solución salina tamponada de Hank HEK células de riñón embrionario humano HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico hM1 receptor M1 humano clonado hM2 receptor M2 humano clonado hM3 receptor M3 humano clonado hM4 receptor M4 humano clonado hM5 receptor M5 humano clonado HPLC cromatografía de líquidos de alta eficacia IBMX 3-isobutil-1-metilxantina %Eff eficacia en % PBS solución salina tamponada con fosfato PyBOP hexafluorfosfato de benzotriazol-1-iloxitripirrolidinofosfonio rpm rotaciones por minuto TFA ácido trifluoracético THF tetrahidrofurano Tris tris(hidroximetil)aminometano

A menos que se indique otra cosa, los reactivos, materiales de partida y disolventes se adquieren a suministradores comerciales (por ejemplo Aldrich, Fluka, Sigma y similares) y se emplean sin más purificación.

En los ejemplos descritos a continuación, el análisis de HPLC se realiza empleando un instrumento Agilent (Palo Alto, CA) de la serie 1100, con columnas Zorbax Bonus RP 2,1 x 50 mm, suministradas por Agilent (una columna C14), que tienen partículas de un tamaño de 3,5 micras. La detección por absorbancia UV a 214 nm. Los datos de HPLC 10-70 se obtienen con un caudal de 0,5 ml/min con una fase móvil B del 10 % al 70 % en 6 minutos. La fase móvil A es del 2 % -98 % -0,1 % ACN-H2O-TFA; y la fase móvil B es del 90 % -10 % 0,1 % ACN-H2O-TFA. Empleando las fases móviles A y B recién descritas, se obtienen los datos de HPLC 5-35 y de HPLC 10-90 con un gradiente de 5 minutos.

Los datos de cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-EM) se obtienen en un instrumento de Applied Biosystems (Foster City, CA), modelo API-150EX. Los datos de LC-EM 10-90 se obtienen con una fase móvil B del 10 % al 90 % con un gradiente de 5 minutos.

La purificación a pequeña escala se realiza con el sistema llamado API 150EX Prep Workstation de Applied Biosystems. La fase móvil A es: agua + 0,05% v/v de TFA; y la B: acetonitrilo + 0,05% v/v de TFA. Para series (tamaño de muestra recuperado normalmente de 3 a 50 mg) se aplican las condiciones siguientes: caudal = 20 ml/min; gradientes de 15 min y una columna Prism RP 20 mm x 50 mm con partículas de 5 micras (Thermo Hypersil-Keystone, Bellefonte, PA). Para purificaciones de mayor escala (muestra en bruto normalmente mayor que 100 mg), se aplican las condiciones siguientes: caudal = 60 ml/min; gradientes de 30 min y una columna Microsorb BDS 41,4 mm x 250 mm con partículas de 10 micras (Varian, Palo Alto, CA).

La rotación específica de los compuestos quirales (indicada como [α]20 D) se mide con un polarímetro Jasco (modelo P-1010) con un foco luminoso de halógeno-tungsteno y un filtro de 589 nm a 20ºC. Las muestras de los compuestos a ensayar se miden normalmente a razón de 1 mg/ml de agua.

Obtención 6

8-benciloxi-5-(2,2-dihidroxiacetil)-1H-quinolin-2-ona

(a) 8-acetoxi-1H-quinolin-2-ona

Se calientan a 100ºC durante 3 h el N-óxido de 8hidroxiquinolina (160,0 g, 1,0 moles), producto comercial de Aldrich, Milwaukee, WI, y anhídrido acético (800 ml, 8,4 moles) y se enfrían en hielo. Se recoge el producto en un embudo Buchner, se lava con anhídrido acético (2 x 100 ml) y se seca a presión reducida, obteniéndose la 8-acetoxi-1H quinolin-2-ona (144 g) en forma de sólido.

(b) 5-acetil-8-hidroxi-1H-quinolin-2-ona

Se enfría en hielo una suspensión de cloruro de aluminio (85,7 g, 640 mmoles) en 1,2-dicloroetano (280 ml) y se añade el producto del paso (a) (56,8 g, 280 mmoles). Se calienta la mezcla a temperatura ambiente y después a 85ºC. Pasados 30 min, se añade cloruro de acetilo (1,5 ml, 21 mmoles) y se calienta la mezcla durante 60 min más. Se enfría la mezcla reaccionante y se le añade a 0ºC el ácido clorhídrico 1 N (3 l) con buena agitación. Después de agitar durante 2 h, se recogen los sólidos en un embudo Buchner, se lavan con agua (3 x 250 ml) y se secan a presión reducida. Se reúne el producto en bruto aislado de los diferentes lotes (135 g) y se tritura con diclorometano (4 l) durante 6 h. Se recoge el producto en un embudo Buchner y se seca a presión reducida, obteniéndose la 5-acetil-8-hidroxi-2(1H)-quinolinona (121 g).

(c) 5-acetil-8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona

Al producto del paso (b) (37,7 g, 186 mmoles) se le añade la N,N-dimetilformamida (200 ml), el carbonato potásico (34,5 g, 250 mmoles) y posteriormente del bromuro de bencilo (31,8 g, 186 mmoles). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2,25 horas, se vierte a 0ºC sobre una solución saturada de cloruro sódico (3,5 l) y se agita durante 1 hora. Se recoge el producto, se seca en un embudo Buchner durante 1 hora, se disuelven los sólidos resultantes en diclorometano (2 l) y se seca esta mezcla con sulfato sódico. Se filtra la solución a través de un lecho de Celite, que se lava con diclorometano (5 x 200 ml). Se reúne el líquido filtrado, se concentra a sequedad y se trituran los sólidos resultantes con éter (500 ml) durante 2 h. Se recoge el producto en un embudo Buchner, se lava con éter (2 x 250 ml) y se seca a presión reducida, obteniéndose la 5-acetil-8-benciloxi-1Hquinolin-2-ona (44 g) en forma de polvo.

(d) 8-benciloxi-5-(2,2-dihidroxiacetil)-1H-quinolin-2ona

A una suspensión del producto del paso (c) (10,0 g, 34,1 mmoles) en DMSO (60 ml) se le añade una solución de ácido bromhídrico del 48% en p/p (11,8 ml, 102,3 mmoles). Se calienta la mezcla a 60ºC durante 16 h y se deja enfriar a temperatura ambiente. Se le añade agua (100 ml) y se agita la suspensión resultante a temperatura ambiente durante 0,5 h, después se enfría a 0ºC. Se recoge el producto en un embudo Buchner y se seca a presión reducida, obteniéndose la 8benciloxi-5-(2,2-dihidroxiacetil)-1H-quinolin-2-ona (12,2 g) en forma de sólido.

Obtención 8

bifenil-2-ilcarbamato de piperidin-4-ilo

Se calientan juntos a 70ºC durante 12 h el isocianato de 2-bifenilo (97,5 g, 521 mmoles) y la 4-hidroxi-1-bencilpiperidina (105 g, 549 mmoles), ambos productos comerciales de Aldrich, Milwaukee, WI, durante este tiempo se hace el seguimiento por LC-EM la formación del bifenil-2-ilcarbamato de 1-bencilpiperidin-4-ilo. Se enfría la mezcla reaccionante a 50ºC, se le añade etanol (1 l) y después se le añade lentamente ácido clorhídrico 6 M (191 ml). Se enfría la mezcla reaccionante a temperatura ambiente, se le añade formiato amónico (98,5 g, 1,56 moles) y se hace burbujear vigorosamente nitrógeno gaseoso a través de la solución durante 20 min. Se le añade paladio (al 10% en peso (base seca) sobre carbón activo) (20 g). Se calienta la mezcla reaccionante a 40ºC durante 12 h y se filtra a través de un lecho de Celite. Se elimina el disolvente a presión reducida y al residuo en bruto se le añade ácido clorhídrico 1 M (40 ml). Se añade hidróxido sódico (10 N) para ajustar el pH a 12. Se extrae la fase acuosa con acetato de etilo (2 x 150 ml), se seca (sulfato magnésico) y se elimina el disolvente a presión reducida, obteniéndose el compuesto epigrafiado (155 g, 100%). HPLC (10-70) Rt = 2,52; EM m/z: [M + H+] calculado para el

C18H20N2O2 = 297,15; hallado = 297,3. Obtención 13 8-benciloxi-5-[(R)-2-bromo-1-(tert-butildimetilsilanil

oxi)etil]-1H-quinolin-2-ona

(a) 8-benciloxi-5-(2-bromoacetil)-1H-quinolin-2-ona

Se disuelve la 5-acetil-8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona (obtención 6) (20,0 g, 68,2 mmoles) en diclorometano (200 ml) y se enfría a 0ºC. Se le añade con una jeringuilla el eterato de dietilo del trifluoruro de boro (10,4 ml, 82,0 mmoles) y se calienta la mezcla a temperatura ambiente, formándose una suspensión viscosa. Se calienta la suspensión a 45ºC (baño de aceite) y se le añade una solución de bromo (11,5 g, 72,0 mmoles) en diclorometano (100 ml) durante 40 min. Se mantiene la mezcla a 45ºC durante 15 min más y se enfría a temperatura ambiente. Se concentra la mezcla a presión reducida y se tritura con una solución acuosa de carbonato sódico al 10% (200 ml) durante 1 hora. Se recogen los sólidos en un embudo Buchner, se lavan con agua (4 x 100 ml) y se secan a presión reducida. Se reúne el producto de los dos procesos para la purificación. Se tritura el producto en bruto (52 g) con metanol al 50% en cloroformo (500 ml) durante 1 hora. Se recoge el producto en un embudo Buchner y se lava con metanol al 50% en cloroformo (2 x 50 ml) y metanol (2 x 50 ml). Se seca el sólido a presión reducida, obteniéndose el compuesto epigrafiado (34,1 g) en forma de polvo.

(b) 8-benciloxi-5-((R)-2-bromo-1-hidroxietil)-1H

quinolin-2-ona

Se mezclan el (R)-(+)-α,α-difenilprolinol (30,0 g, 117 mmoles) y la trimetilboroxina (11,1 ml, 78 mmoles) en tolueno (300 ml) y se agitan a temperatura ambiente durante 30 min. Se introduce la mezcla en un baño de aceite a 150ºC y se destila líquido. Se añade tolueno en partes alícuotas de 20 ml y se continúa la destilación durante 4 h. Se añade un total de 300 ml de tolueno. Se enfría la mezcla a temperatura ambiente. Se concentra una parte alícuota de 500 µl a sequedad y se pesa (246 mg), determinando que la concentración del catalizador es 1,8 M.

En atmósfera de nitrógeno se introduce la 8-benciloxi5-(2-bromo-acetil)-1H-quinolin-2-ona (90,0 g, 243 mmoles), se añade tetrahidrofurano (900 ml) y posteriormente el catalizador descrito anteriormente (1,8 M en tolueno, 15 ml, 27 mmoles). Se enfría la suspensión a -10±5ºC en un baño de hielo/isopropanol. Se añade el borano (1,0 M en THF, 294 ml, 294 mmoles) durante 4 h. Se agita la mezcla reaccionante a -10ºC 45 min más y se le añade lentamente metanol (250 ml). Se concentra la mezcla con vacío, se disuelve el residuo en acetonitrilo hirviente (1,3 l), se filtra en caliente y se enfría a temperatura ambiente. Se filtran los cristales, se lavan con acetonitrilo y se secan con vacío, obteniéndose el compuesto epigrafiado (72,5 g, 196 mmoles, rendimiento = 81%, ee = 95%, pureza = 95% según HPLC).

(c) 8-benciloxi-5-[(R)-2-bromo-1-(tert-butildimetilsilaniloxi)etil]-1H-quinolin-2-ona

Al producto del paso (b) (70,2 g, 189 mmoles) se le añade la N,N-dimetilformamida (260 ml) y en atmósfera de nitrógeno se enfría esta mezcla en un baño de hielo. Se añade la 2,6-lutidina (40,3 g, 376 mmoles) durante 5 min y después se añade lentamente el trifluormetanosulfonato de tertbutildimetilsililo (99,8 g, 378 mmoles) manteniendo la temperatura por debajo de 20ºC. Se deja calentar la mezcla a temperatura ambiente durante 45 min. Se añade a la mezcla por goteo metanol (45 ml) durante 10 min y se reparte la mezcla entre acetato de etilo/ciclohexano (1:1, 500 ml) y agua/salmuera (1:1, 500 ml). Se lavan las fases orgánicas dos veces más con agua/salmuera (1:1, 500 ml cada uno). Se reúnen las fases orgánicas y se concentran a presión reducida, formándose un aceite ligeramente amarillo. Se añaden al aceite dos porciones separadas de ciclohexano (400 ml) y se continúa destilando hasta que se forma una suspensión viscosa blanca. Se añade ciclohexano (300 ml) a la suspensión, se filtran los cristales blancos resultantes, se lavan con ciclohexano (300 ml) y se secan a presión reducida, obteniéndose el compuesto epigrafiado (75,4 g, 151 mmoles, rendimiento = 80%, ee = 98,6%).

Obtención 14

bifenil-2-ilcarbamato de 1-{9-[(R)-2-(8-benciloxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-(tert-butildimetilsilaniloxi)etilamino]nonil}piperidin-4-ilo

Al producto de la obtención 13 (3,9 g, 8,17 mmoles) se le añade a una solución del producto de la obtención 11 (5,0 g, 11,4 mmoles) en THF (20 ml) y posteriormente el bicarbonato sódico (2,0 g, 24,5 mmoles) y el yoduro sódico (1,8 g, 12,2 mmoles). Se calienta la mezcla reaccionante a 80ºC durante 72 h. Se enfría la mezcla reaccionante, se diluye con diclorometano (20 ml) y se lava la fase orgánica con una solución saturada de bicarbonato sódico (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml). Se seca la fase orgánica (sulfato magnésico) y se concentra, obteniéndose 6,5 g de un producto en bruto. Se purifica el producto en bruto por cromatografía a través de gel de sílice eluyendo con metanol al 3% en diclorometano, obteniéndose el compuesto epigrafiado (1,4 g, rendimiento = 21%).

Obtención 15

bifenil-2-ilcarbamato de 1-(9-[(R)-2-(8-benciloxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]nonil}piperidin-4-ilo

Se añade el fluoruro de hidrógeno de la trietilamina (376 µl, 2,3 mmoles) a una solución del producto de la obtención 14 (1,3 g, 1,5 mmoles) en THF (8 ml) y se agita la mezcla reaccionante a temperatura ambiente. Pasadas 5 h, la reacción ha finalizado según se determina el análisis por LCEM. Se trata la mezcla reaccionante con NaOH 1 N hasta que el pH sea de 14, se diluye con acetato de etilo (20 ml) y se lava con NaOH 1 N (20 ml) y salmuera (20 ml). Se separa la fase orgánica, se seca con sulfato magnésico y se concentra, obteniéndose el compuesto epigrafiado (1,1 g).

Ejemplo comparativo 3

ditrifluoracetato del bifenil-2-ilcarbamato de 1-{9[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-ilo

Se hace burbujear nitrógeno a través de una solución del producto de la obtención 15 (1,1 g, 1,5 mmoles) y se le añade paladio al 10 % sobre carbón (110 mg). Se agita la mezcla reaccionante en atmósfera de hidrógeno que tiene la presión del balón. Pasadas 9 h, el análisis LC-EM indica que la reacción ha finalizado. Se filtra la mezcla reaccionante y se concentra, obteniéndose un sólido amarillo. Se purifica el sólido por HPLC preparativa (5-30 durante 60 min), obteniéndose el compuesto epigrafiado (510 mg). EM m/z: [M + H+] calculado para C38H48N4O5 = 641,36; hallado = 641. Método HPLC 10

70: 3,207. [α]20 D = -23,6 (c = 1,0 mg/ml, agua). Ejemplo comparativo 3A ditrifluoracetato del bifenil-2-ilcarbamato de 1-{9

[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-ilo Como alternativa, el compuesto epigrafiado se obtiene de la siguiente manera:

(a) 9-bromononanal

En un matraz de fondo redondo de 100 ml equipado con un agitador magnético, embudo de adición y controlador de temperatura, en atmósfera de nitrógeno, se introducen el 9-bromononanol (8,92 g, 40 mmoles) y el diclorometano (30 ml). Se enfría la mezcla resultante a 5ºC y se le añade una solución de bicarbonato sódico (0,47 g, 5,6 mmoles) y bromuro potásico (0,48 g, 4 mmoles) en agua (10 ml). Se añade el radical libre 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) (63 mg, 0,4 mmoles) y se añade por goteo una solución blanqueante del 10 al 13% (27 ml) con un embudo de adición a una velocidad tal que se mantenga la temperatura a unos 8ºC (± 2ºC) con un baño de enfriamiento de hielo (durante unos 40 min). Después de completar la adición de la solución blanqueante, se agita la mezcla durante 30 min manteniendo la temperatura alrededor de 0ºC. Se añade una solución de bisulfito sódico (1,54 g) en agua (10 ml) y se agita la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 30 min. Se separan las fases de la mezcla y se extrae la fase acuosa lechosa con diclorometano (1 x 20 ml). Se reúnen las fases del diclorometano, se lavan con agua (1 x 30 ml), se secan (MgSO4), se filtran y se concentran a presión reducida, obteniéndose el compuesto intermedio epigrafiado (8,3 g, rendimiento = 94%), que se usa en el paso siguiente sin más purificación.

(b) 9-bromo-1,1-dimetoxinonano

En un matraz de fondo redondo de 100 ml se introducen el 9-bromononanal (7,2 g, 32,5 mmoles), el metanol (30 ml) y el ortoformiato de trimetilo (4 ml, 36,5 mmoles). Se añade una solución del ácido clorhídrico 4 N en dioxano (0,2 ml, 0,8 mmoles) y se mantiene la mezcla resultante a reflujo durante 3 h. Se enfría la mezcla reaccionante a temperatura ambiente y se le añade el bicarbonato sódico sólido (100 mg, 1,2 mmoles). Se concentra la mezcla resultante a presión reducida hasta una cuarta parte del volumen original y se le añade acetato de etilo (50 ml). Se lava la fase orgánica con agua (2 x 40 ml), se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a presión reducida, obteniéndose el compuesto intermedio epigrafiado (8,44 g, (rendimiento = 97%)) en forma de líquido,

que se usa en el paso siguiente sin más purificación.

(c): bifenil-2-ilcarbamato de 1-(9,9-dimetoxinonil)piperidin-4-ilo

En un matraz de fondo redondo de tres bocas de 50 ml se introducen el bifenil-2-ilcarbamato de piperidin-4-ilo (1 g, 3,38 mmoles) y el acetonitrilo (10 ml), formando una suspensión. A esta suspensión se le añaden el 9-bromo-1,1-dimetoxinonano (1,1 g, 1,3 mmoles) y la trietilamina (0,57 g, 4,1 mmoles) y se calienta la mezcla resultante a 65ºC durante 6 h (se hace el seguimiento del progreso de la reacción por HPLC hasta que el material inicial sea < 5%). Se enfría la mezcla reaccionante a temperatura ambiente, formándose una suspensión viscosa en este tiempo. Se le añade agua (5 ml) y se filtra la mezcla para recoger el sólido en un filtro de vidrio poroso grueso. Se lava el sólido con una solución premezclada de acetonitrilo (10 ml) y agua (5 ml) y con otra solución premezclada de acetonitrilo (10 ml) y agua (2 ml). Se seca el sólido resultante con aire, obteniéndose el compuesto intermedio epigrafiado (1,37 g, 84%, pureza >96% según LC, RMN-H1) en forma de sólido blanco.

(d): bifenil-2-ilcarbamato de 1-(9-oxononil)piperidin-4ilo

En un matraz de fondo redondo de 500 ml con agitador magnético se introducen el bifenil-2-ilcarbamato de 1-(9,9dimetoxinonil)piperidin-4-ilo (7,7 g, 15,9 mmoles), el acetonitrilo (70 ml) y ácido clorhídrico acuoso 1 M (70 ml). Se agita la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 1 h y se le añade diclorometano (200 ml). Se agita esta mezcla durante 15 min y se separan las fases. Se seca la fase orgánica (MgSO4), se filtra y se concentra a presión reducida, obteniéndose el compuesto intermedio epigrafiado (6,8 g), que se usa en el paso siguiente sin más purificación.

(e): bifenil-2-ilcarbamato de 1-(9-{bencil-[(R)-2-(8benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-(tert-butildimetilsilaniloxi)etil]amino}nonil)-piperidin-4-ilo

En un matraz de fondo redondo de 300 ml se introducen la 5-[(R)-2-bencilamino-1-(tert-butildimetilsilaniloxi)etil]8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona (5 g, 9,73 mmoles), el diclorometano (100 ml) y ácido acético glacial (0,6 ml, 10 mmoles). Se enfría esta mezcla a 0ºC empleando un baño de hielo y se le añade con agitación el bifenil-2-ilcarbamato de 1-(9-oxononil)piperidin-4-ilo (4,6 g, 9,73 mmoles). Se agita esta mezcla a 0ºC durante 30 minutos y se le añade en porciones el triacetoxiborhidruro sódico (6,15 g, 29 mmoles) durante 15 minutos. Se agita la mezcla reaccionante de 0 a 10ºC durante 2 horas, se le añade una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (50 ml) y se agita esta mezcla durante 15 minutos. Se separan las fases, se lava la fase orgánica con una solución acuosa de cloruro sódico al 5% (50 ml), se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a presión reducida, obteniéndose el compuesto intermedio epigrafiado (8,5 g, pureza = 80% según HPLC), que se emplea sin más purificación.

(f): bifenil-2-ilcarbamato de 1-{9-[(R)-2-(tert-butildimetilsilaniloxi)-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]nonil}piperidin-4-ilo

En un matraz de fondo redondo de 200 ml se introducen

el compuesto intermedio del paso E (8,5 g, 9 mmoles), etanol

(100 ml) y ácido acético glacial (0,54 ml, 18 mmoles) y se agita esta mezcla hasta que se disuelve el sólido. Se purga la mezcla reaccionante con hidrógeno durante 5 min y se le añade paladio al 10% sobre carbón (1,7 g). Se agita esta mezcla a temperatura ambiente haciendo burbujear lentamente hidrógeno a través de la mezcla reaccionante hasta que se observa por HPLC que la conversión es de >95% (unas 8-9 h). Se filtra la mezcla a través de un lecho de Celite y se elimina el disolvente a presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía a través de gel de sílice (15 g de gel de sílice/1 g de producto en bruto) empleando MeOH al 5% en DCM/NH4OH al 0,5% (10 x 150 ml), MeOH al 8% en DCM/NH4OH al 0,5% (10 x 150 ml) y MeOH al 10% en DCM/NH4OH al 0,5% (10 x 150 ml). Se reúnen las fracciones adecuadas y se elimina el disolvente a presión reducida manteniendo la temperatura < 35ºC, obteniéndose el compuesto intermedio epigrafiado (4,05 g, pureza = 97%).

(g) bifenil-2-ilcarbamato de 1-{9-[(R)-2-hidroxi-2-(8hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-ilo

En un matraz de fondo redondo de 200 ml se introducen el compuesto intermedio del paso F (4,05 g, 5,36 mmoles) y el diclorometano (80 ml) y se agita la mezcla resultante hasta que se disuelve el sólido. Se añade el trifluorhidrato de la trietilamina (2,6 ml, 16 mmoles) y se continúa agitando en atmósfera de nitrógeno durante un tiempo de 18 a 20 h. Se añade metanol (20 ml), se añade lentamente una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (50 ml) y se agita la mezcla durante 15 min. Se separan las fases, se lava la fase orgánica con una solución acuosa saturada de cloruro sódico (20 ml), se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a presión reducida, obteniéndose el compuesto epigrafiado (3,5 g, pureza = 98% según HPLC) en forma de sólido amarillo.

Ejemplo comparativo 3B

sal naftaleno-1,5-disulfonato del bifenil-2-ilcarbamato de 1-{9-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-ilo

Se disuelve el bifenil-2-ilcarbamato de 1-{9-[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-ilo (1,0 g, 1,56 mmoles, base libre) en metanol (10 ml, de bajo contenido en agua). Se añade una solución del ácido naftaleno-1,5-disulfónico (0,45 g, 1,56 mmoles) en metanol (5 ml, de bajo contenido en agua) y se agita la mezcla reaccionante a 30ºC durante dos horas y a temperatura ambiente durante una noche (18 h). Se filtra la suspensión viscosa resultante, se lava la torta del filtro con metanol (5 ml) y se seca, obteniéndose el compuesto epigrafiado (1,16 g, rendimiento = 80%) en forma de sólido cristalino blanco mate.

Obtención 19

3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propionato de metilo

Se añade el 3-bromopropionato de metilo (553 µl, 5,07 mmoles) a una solución agitada del producto de la obtención 8 (1,00 g, 3,38 mmoles) y la DIPEA (1,76 ml, 10,1 mmoles) en acetonitrilo (34 ml) a 50ºC y se calienta la mezcla reaccionante a 50ºC durante una noche. Se elimina el disolvente a presión reducida y se disuelve el residuo en diclorometano (30 ml). Se lava la solución resultante con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (10 ml), se seca (sulfato magnésico) y se elimina el disolvente a presión reducida. Se purifica el residuo en bruto por cromatografía de columna (MeOH del 5 al 10% en DCM), obteniéndose el compuesto epigrafiado (905 mg, 70%).

Obtención 20

ácido 3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propiónico

Se calienta a 30ºC durante una noche una solución agitada del producto de la obtención 19 (902 mg, 2,37 mmoles) y el hidróxido de litio (171 mg, 7,11 mmoles) en THF del 50%/H2O (24 ml), se acidifica con ácido clorhídrico concentrado y se liofiliza, obteniéndose el compuesto epigrafiado (rendimiento ~ 100%, también contiene sales de LiCl).

Obtención 21

{5-[(R)-2-(8-benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)2-(tert-butildimetilsilaniloxi)etilamino]pentil}carbamato de tert-butilo

Se disuelven el producto de la obtención 13 (600 mg, 1,23 mmoles) y el N-tert-butoxicarbonil-1,5-diaminopentano (622 mg, 3,07 mmoles) en sulfóxido de dimetilo (1,23 ml) y se calienta a 105ºC durante 6 h. Se enfría la mezcla reaccionan-te, se diluye con acetato de etilo (10 ml) y se lava con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (4 ml). Se seca la fase orgánica (sulfato magnésico) y se elimina el disolvente a presión reducida. Se purifica el residuo en bruto por cromatografía de columna (metanol del 5 al 10% en diclorometano), obteniéndose el compuesto epigrafiado (rendimiento ~ 100%).

Obtención 22

5-[(R)-2-(5-aminopentilamino)-1-(tert-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona

Se agita a temperatura ambiente durante 1 hora una solución del producto de la obtención 21 (800 mg, 1,31 mmoles) en ácido trifluoracético/diclorometano (25%, 12 ml). Se elimina el disolvente a presión reducida, se disuelve el residuo en bruto en diclorometano (15 ml) y se lava con hidróxido sódico 1 N (8 ml). Se separa la fase orgánica, se seca (sulfato magnésico) y se elimina el disolvente a presión reducida, obteniéndose el compuesto epigrafiado (509 mg, rendimiento = 81% en 2 pasos).

Obtención 23

bifenil-2-ilcarbamato de 1-(2-{5-[(R)-2-(8-benciloxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-(tert-butildimetilsilaniloxi)etilamino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-ilo

Al producto de la obtención 20 (417 mg, 1,13 mmoles) y el HATU (430 mg, 1,13 mmoles) se le añaden el producto de la obtención 22 (458 mg, 0,90 mmoles) en DMF (1,8 ml) y posteriormente la DIPEA (204 µl, 1,17 mmoles). Se agita la mezcla reaccionante a 50ºC durante 12 h y se elimina el disolvente a presión reducida. Se disuelve el residuo en bruto en diclorometano (10 ml). Se lava la solución resultante con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (4 ml), se seca (sulfato magnésico) y se elimina el disolvente a presión reducida. Se purifica el residuo en bruto por cromatografía de columna (metanol del 5 al 10% en diclorometano y NH4OH al 0,5%), obteniéndose el compuesto epigrafiado (240 mg, rendimiento = 31%).

Obtención 24

bifenil-2-ilcarbamato de 1-(2-{5-[(R)-2-(8-benciloxi-2oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-ilo

A una solución agitada del producto de la obtención 23 (240 mg, 0,28 mmoles) en diclorometano (2,8 ml) se le añade el trifluorhidrato de la trietilamina (91 µl, 0,56 mmoles). Se agita la mezcla reaccionante durante 10 h y se diluye con diclorometano (10 ml). Se lava la solución resultante con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (5 ml), se seca la fase orgánica (sulfato magnésico) y se elimina el disolvente a presión reducida, obteniéndose el compuesto epigrafiado (209 mg, rendimiento = 100%).

Ejemplo comparativo 6

ditrifluoracetato del bifenil-2-ilcarbamato de 1-(2-{5[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-ilo

A una solución agitada del producto de la obtención 24 (209 mg, 0,28 mmoles) en etanol (2,8 ml) se le añade paladio (al 10% en peso (base seca) sobre carbón activo) (81 mg), se mantiene la mezcla reaccionante en atmósfera de hidrógeno y se agita durante una noche. Se filtra la mezcla reaccionante y se elimina el disolvente a presión reducida. Se purifica el residuo en bruto por HPLC preparativa, obteniéndose el compuesto epigrafiado (58 mg). HPLC (10-70) Rt = 2,30; EM m/z: [M + H+] calculado para C37H45N5O6 = 656,34; hallado = 656,6;

[α]20 D = -6,5 (c = 1,0 mg/ml, agua).

Ejemplo comparativo 6A

bifenil-2-ilcarbamato de 1-(2-{5-[(R)-2-hidroxi-2-(8hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-ilo

Como alternativa, el compuesto epigrafiado se puede obtener de la manera siguiente:

(a) 5-cloropentanal

En un matraz de fondo redondo de tres bocas de 2 l, equipado con un agitador magnético, embudo de adición y controlador de temperatura, en atmósfera de nitrógeno, se introducen el 5-cloropentanol (53 g, 0,433 moles) y el diclorometano (300 ml). Se enfría esta mezcla a 5ºC y se le añade una solución de bicarbonato sódico (5 g, 0,059 moles) y bromuro potásico (5,1 g, 0,043 moles) en agua (225 ml). Se añade el radical libre 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) (63 mg, 0,4 mmoles) y se añade por goteo a través del embudo de adición una solución blanqueante al 10-13% (275 ml) a una velocidad tal que se mantenga la temperatura a unos 8ºC (± 2ºC) con un baño de enfriamiento de hielo (durante unos 45 min). Una vez finalizada la adición de la solución blanquean-te, se agita la mezcla durante 30 min manteniendo la temperatura a unos 5ºC. Se añade una solución de bisulfito sódico (4 g) en agua (30 ml) y se agita la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 30 min. Se separan las fases de la mezcla y se extrae la fase acuosa con diclorometano (1 x 50 ml). Se reúnen las fases de diclorometano, se lavan con agua (1 x 50 ml), se secan (MgSO4), se filtran y se concentran a presión reducida, obteniéndose el compuesto epigrafiado (53 g). Se destila el producto a 65ºC/8 torr, obteniéndose el compuesto epigrafiado (31,16 g) en forma de aceite anaranjado (pureza según CG = 70 - 80%).

Se sigue purificando el producto con la adición del material en bruto (4 g) a una mezcla de etanol (920 ml), acetato de etilo (12 ml) y agua (4 ml). Se añade el bisulfito sódico (4 g), se calienta la mezcla a reflujo durante 4 h, se enfría a temperatura ambiente y se agita durante 14 h a temperatura ambiente, formándose una suspensión muy viscosa. Se filtran los sólidos en un filtro sinterizado grueso, se lavan con la mezcla de disolvente (5 ml) y se secan los sólidos en el filtro, obteniéndose 8,4 g del aducto de bisulfito. Se añade a este material el MTBE (20 ml) y se le añade con agitación vigorosa una solución acuosa de hidróxido sódico 1 N (45 ml). Se agita vigorosamente la mezcla bifásica resultante hasta que todos los sólidos se hayan disuelto (unos 15 min) y se separan las fases. Se extrae la fase acuosa con MTBE (20 ml) y se reúnen las fases de MTBE, se secan (MgSO4), se filtran y se concentran, obteniéndose 3,46 g del compuesto epigrafiado en forma de líquido incoloro (pureza según CG >90%).

(b) 5-[(R)-2-[bencil-(S-cloropentil)amino]-1-(tert

butildimetilsilaniloxi)etil]-8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona En un matraz de fondo redondo de tres bocas de 1 l se

introducen el producto de la obtención 28 (48,4 g, 94 mmo

les), el diclorometano (400 ml) y el ácido acético glacial (11,3 ml). Se agita esta mezcla a 0ºC (baño de hielo), se le añade el producto del paso (a) (12,5 g, 103,6 mmoles) y se continúa agitando durante 15 min. Se añade en porciones el triacetoxiborhidruro sódico (59,8 g, 282 mmoles) durante un período de 15 min y se agita la mezcla resultante de 0 a 10ºC durante 2 h. Se añade lentamente una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (200 ml) (desprendimiento de gas) y se continúa agitando durante 15 min. Se ajusta el pH de la solución con carbonato sódico sólido a un pH aprox. 9 y se separan las fases. Se lava la fase orgánica con una solución acuosa de cloruro sódico al 5% (200 ml), se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a presión reducida, obteniéndose el compuesto epigrafiado (53 g).

(c) 5-[(R)-2-[(5-N-N-diformilaminopentil)bencilamino]1-(tert-butildimetil-silaniloxi)etil]-8-benciloxi-1Hquinolin-2-ona

A una solución agitada del producto del paso (b) (26,5 g, 42,8 mmoles) en 1-metil-2-pirrolidinona (175 ml) se le añaden la diformilamida sódica (6,1 g, 64,2 mmoles) y el yo-duro sódico (2,13 g, 14,3 mmoles). Se hace burbujear nitrógeno a través del matraz que contiene la mezcla reaccionante y se calienta la mezcla a 65ºC durante 8 h. Se enfría la mezcla a temperatura ambiente y se le añaden agua (300 ml) y acetato de etilo (100 ml). Se agita esta mezcla durante 10 min y se separan las fases. Se extrae la fase acuosa con acetato de etilo (150 ml), se reúnen las fases orgánicas, se lavan con agua (300 ml), una solución acuosa de salmuera al 50% (300 ml) y agua (300 ml), se secan (MgSO4), se filtran y se concentran, obteniéndose el compuesto epigrafiado (23,3 g).

(d): 5-[(R)-2-[(5-aminopentil)bencilamino]-1-(tertbutildimetilsilaniloxi)etil]-8-benciloxi-1H-quinolin-2-ona

A una solución agitada del producto del paso (c) (10,5 g, 16 mmoles) en metanol (75 ml) se le añade el ácido ptoluenosulfónico (7,42 g, 39 mmoles). Se calienta la mezcla resultante a 40ºC durante 15 h y se concentra a presión reducida hasta aprox. la mitad de su volumen. Se le añade metanol (70 ml), se calienta la mezcla a 50ºC durante 2 h y se concentra a presión reducida. Se le añaden agua (100 ml), metanol (50 ml) y MTBE (100 ml), se agita esta mezcla durante 15 min y se separan las fases. A la fase acuosa se le añade una solución acuosa de hidróxido sódico 1 N (45 ml) y MTBE (100 ml) y se agita esta mezcla durante 15 min. Se separan las fases y se extrae la fase acuosa con MTBE (100 ml). Se reúnen las fases de MTBE, se secan (MgSO4), se filtran y se concentran, obteniéndose el compuesto epigrafiado en forma de aceite amarillo (7,3 g). Este material contiene un 13% (según HPLC) del correspondiente compuesto des-tert-butildimetilsililo.

(e): ácido 3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1il]propiónico

A una solución del producto de la obtención 8 (50 g, 67,6 mmoles) en diclorometano (500 ml) se le añade ácido acrílico (15,05 ml, 100 mmoles). Se calienta la mezcla resultante a reflujo a 50ºC durante 18 h y se elimina el disolvente. Se le añade metanol (600 ml), se calienta esta mezcla a 75ºC durante 2 h y se enfría a temperatura ambiente, formándose una suspensión viscosa. Se recoge el sólido por filtración, se lava con metanol (50 ml) y se seca con aire, obteniéndose el compuesto epigrafiado (61 g, pureza >96%) en forma de polvo blanco.

(f): bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(5-{bencil-[(R)-2-(8benciloxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)-2-(tert-butildimetilsilaniloxi)etil]amino}-pentilcarbamoil)etil]piperidin-4ilo

Se calienta a 60ºC una mezcla del producto del paso (e) (3,68 g, 10 mmoles) y la N,N-dimetilformamida (50 ml) hasta la completa disolución del sólido y se enfría a temperatura ambiente. Se añaden el producto del paso (d) (6 g, 10 mmoles) y la diisopropiletilamina (3,5 ml) y se enfría la mezcla reaccionante a 0ºC. Se añade el PyBOP (6,25 g, 12 mmoles) en una porción y se agita la mezcla reaccionante de 0ºC a temperatura ambiente durante 2 horas. Se vierte la mezcla reaccionante sobre agua fría (500 ml) con agitación y se ajusta el pH de la mezcla resultante aprox. a 2 empleando una solución acuosa de ácido clorhídrico 1 M. Se agita esta mezcla durante 15 min, se filtra para recoger el sólido, que se lava con agua (100 ml) y se seca, obteniéndose el compuesto epigrafiado (8,7 g, pureza según HPLC >95%) en forma de sólido blanco mate.

(g): bifenil-2-ilcarbamato de 1-(2-{5-[(R)-2-hidroxi-2(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-ilo

Se puede desproteger el producto del paso (f) efectuando esencialmente los mismos procesos descritos en la obtención 24 y el ejemplo comparativo 6, obteniéndose el compuesto epigrafiado.

Obtención 28

8-benciloxi-5-[(R)-2-(N-bencilamino)-1-(tert-butildimetilsilaniloxi)etil]-1H-quinolin-2-ona

Se calienta a 105ºC durante 4 h una solución agitada del producto de la obtención 13 (1,00 g, 2,05 mmoles) y la bencilamina (493 µl, 4,51 mmoles) en DMSO (1,7 ml). Se deja enfriar la mezcla reaccionante, se diluye con EtOAc (10 ml), se lava la fase orgánica con una solución acuosa saturada de cloruro amónico (5 ml) e hidróxido sódico 1 N (5 ml), se seca (MgSO4) y se elimina el disolvente a presión reducida. Se purifica el residuo en bruto por cromatografía de columna (EtOAc al 50% en hexanos), obteniéndose el compuesto epigrafiado (700 mg, 67%). EM m/z: [M + H+] calculado para C31H38N2O3Si = 515,27; hallado = 515,5.

Obtención 93

4-amino-5-cloro-2-metoxibenzoato de metilo

A una solución del ácido 4-amino-5-cloro-2-metoxibenzoico (1,008 g, 5,0 mmoles) en una mezcla de tolueno (9 ml) y metanol (1 ml) se le añade por goteo a 0ºC el (trimetilsilil)diazometano (2,0 M en hexano, 3,0 ml, 6,0 mmoles). Se calienta la mezcla reaccionante a temperatura ambiente y se agita durante 16 h. Se neutraliza el exceso de (trimetilsilil)diazometano con la adición de ácido acético hasta que desaparece el color amarillo brillante de la mezcla reaccionante. Se concentra la mezcla con vacío, obteniéndose el compuesto epigrafiado en forma de sólido blanco mate, que se emplea sin más purificación.

Obtención 94

4-acriloilamino-5-cloro-2-metoxibenzoato de metilo

Al producto de la obtención 93 en bruto se le añaden el diclorometano (10 ml, 0,5 M) y la trietilamina (2,1 ml, 15 mmoles). Se enfría esta mezcla a 0ºC y se le añade por goteo y con agitación el cloruro de acriloílo (812 µl, 10 mmoles). Pasadas 2 h, se añade a 0ºC a la mezcla reaccionante el metanol (unos 2 ml), se agita la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 15 min y se concentra con vacío. Se añaden al residuo el diclorometano (30 ml) y agua (30 ml) y se mezclan a fondo. Se separan las fases y se extrae la fase acuosa con diclorometano (20 ml). Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na2SO4), se filtran y se elimina el disolvente con vacío, obteniéndose el compuesto epigrafiado en forma de sólido espumado marrón, que se emplea sin más purificación.

Obtención 95

4-{3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-1-il]propionilamino}-5-cloro-2-metoxibenzoato de metilo

Al producto de la obtención 94 en bruto se le añaden el producto de la obtención 8 (1,33 g, 4,5 mmoles) y una mezcla de THF (22,5 ml) y metanol (2,5 ml). Se calienta esta mezcla con agitación a 50ºC durante 16 h y se elimina el disolvente con vacío. Se cromatografía el residuo (gel de sílice, EtOAc), obteniéndose el compuesto epigrafiado (0,82 g; Rf = 0,4, rendimiento = 29% en 3 pasos) en forma de sólido espumado blanco mate. EM m/z =566,4 (M+H), calculado = 565,20 para

el C30H32ClN3O6).

Obtención 96

bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(2-cloro-4-hidroximetil5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilo

A una solución del producto de la obtención 95 (0,82 mg, 1,45 mmoles) en una mezcla de THF (4,5 ml) y metanol (0,5 ml) se le añade a 0ºC el borhidruro de litio (32 mg, 1,45 mmoles). Se deja calentar la mezcla reaccionante a temperatura ambiente y se agita durante 41 h. Se añade a la mezcla reaccionante a 0ºC el ácido clorhídrico acuoso 1 N hasta que no se observe más burbujeo y se agita esta mezcla durante 10 min. Se elimina el disolvente con vacío y se disuelve el residuo en acetonitrilo (unos 2 ml). Se purifica esta solución por HPLC-RP preparativa (gradiente: acetonitrilo del 2 al 50% en agua con un 0,05 % de TFA). Se recogen las fracciones apropiadas, se reúnen y se liofilizan, obteniéndose el compuesto epigrafiado en forma de una sal trifluoracetato. Se trata esta sal con acetato de isopropilo (10 ml) e hidróxido sódico acuoso 1 N (10 ml), se recoge la fase orgánica, se seca (Na2SO4), se filtra y se elimina el disolvente con vacío, obteniéndose el compuesto epigrafiado (161 mg, rendimiento = 21%) en forma de sólido espumoso blanco. EM m/z = 538,4 (M+H), calculado = 537,20 para el C29H32CN3O5).

Obtención 97

bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(2-cloro-4-formil-5metoxifenilcarbamoil)-etil]piperidin-4-ilo

A una solución del producto de la obtención 96 (161 mg, 0,3 mmoles) en diclorometano (3 ml) se le añaden el sulfóxido de dimetilo (213 µl, 3,0 mmoles) y la diisopropiletilamina (261 µl, 1,5 mmoles). Se enfría esta mezcla a 20ºC y se le añade lentamente un complejo de trióxido de azufre-piridina (238 mg, 1,5 mmoles). Pasados 30 min, se añade agua (unos 3 ml) a la mezcla reaccionante. Se separan las fases, se seca la fase orgánica (Na2SO4), se filtra y se elimina el disolvente con vacío, obteniéndose el compuesto epigrafiado en forma de sólido ligeramente amarillo. EM m/z = 536,3 (M+H), calculado = 535,19 para el C29H30ClN3O5).

Obtención 98

bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(4-{[(R)-2-(tert-butildimetilsilaniloxi)-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5il)etilamino]metil}-2-cloro-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilo

Al producto de la obtención 97 en una mezcla de diclorometano (0,5 ml) y metanol (0,5 ml) se le añade el acetato de la 5-[(R)-2-amino-1-(tert-butildimetilsilaniloxi)etil]-8hidroxi-1H-quinolin-2-ona (124,1 mg, 3,1 mmoles) y se agita la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 1,5 h. Se añade el triacetoxiborhidruro sódico (190,7 mg, 0,9 mmoles) y se agita la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 15 h. Se añade agua (unos 0,2 ml) a la mezcla reaccionante y se concentra la mezcla con vacío, obteniéndose el compuesto epigrafiado, que se emplea sin más purificación. EM m/z = 854,5 (M+H), calculado = 853,36 para el C46H56ClN5O7Si).

Ejemplo 25

ditrifluoracetato del bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(2cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilo

A una suspensión del producto de la obtención 98 en diclorometano (1,0 ml, 0,3 M) se le añade el trifluorhidrato de la trietilamina (245 µl, 1,5 mmoles). Se agita esta mezcla a temperatura ambiente durante 45 h y se concentra con vacío. Se disuelve el residuo en una mezcla de DMF (0,5 ml), acetonitrilo/agua (1:1, con un 0,1 % de TFA, 0,6 ml), TFA (0,3 ml) y acetonitrilo (aprox. 1 ml) y se purifica esta mezcla por HPLC-RP preparativa (gradiente: acetonitrilo del 2 al 50% en agua con un 0,05 % de TFA). Se recogen las fracciones apropiadas, se reúnen y se liofilizan, obteniéndose el compuesto epigrafiado (100 mg, rendimiento = 34%, pureza = 98,7% según HPLC) en forma de sólido blanco mate. EM m/z = 740,5 (M+H), calculado = 739,28 para C40H42ClN5O7).

Preparación A

Cultivo celular y preparación de membrana a partir de células que expresan a los receptores ß1, ß2 o ß3-adrenérgicos humanos

Se cultivan líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), que expresan de modo estable a los receptores ß1, ß2 y ß3-adrenérgicos humanos clonados, respectivamente, hasta casi confluencia en un medio HAM’s F-12 con un 10% de FBS en presencia de 500 µg/ml de geneticina.

Se recoge la monocapa celular con EDTA 2 mM en PBS. Se convierten las células en culotes por centrifugación a 1.000 rpm y se liofilizan los culotes celulares a -80ºC o bien se preparan inmediatamente las membranas para el uso. Para la preparación de membranas que expresen a los receptores ß1 y ß2 se suspenden de nuevo los culotes en tampón de lisis (10 mM HEPES/HCI, 10 mM EDTA, pH 7,4 a 4ºC) y se homogeneízan empleando un homogeneizador de vidrio Dounce de ajuste fuerte (30 golpes) sobre hielo. Para las membranas que expresan al receptor ß3 más sensible a la proteasa se homogeneízan los culotes celulares en el tampón de lisis (10 mM Tris/HCl, pH 7,4) suplementado con una tableta del tipo “Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets with 2 mM EDTA” por 50 ml de tampón (Roche, nº de catálogo 1697498, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Se centrifuga el material homogeneizado a 20.000 x g, se lava una vez el culote resultante con tampón de lisis para la resuspensión y centrifugación como antes. Se suspende de nuevo el culote final en tampón de ensayo de fijación enfriado con hielo (75 mM Tris/HCl, pH 7,4, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Se determina la concentración de proteínas en la suspensión de membrana por los métodos descritos por Lowry y col., Journal of Biological Chemistry 193, 265, 1951; y Bradford, Analytical Biochemistry 72, 248-54, 1976. Todas las membranas se almacenan en partes alícuotas congeladas a -80ºC o bien se emplean inmediatamente.

Preparación B

Cultivo celular y preparación de membrana a partir de

células que expresan a los receptores muscarínicos M1, M2, M3

y M4 humanos

Se cultivan hasta casi confluencia las líneas celulares de CHO que expresan de modo estable los subtipos de muscarínicos hM1, hM2, hM3 y hM4 humanos, respectivamente, en un medio HAM’s F-12 suplementado con un 10% de FBS y 250 µg/ml de geneticina. Se cultivan las células en un incubador a 37ºC con un 5% de CO2 y recogen con EDTA 2 mM en dPBS. Se recogen las células con una centrifugación a 650 x g durante 5 min y los culotes celulares se almacenan congelados a -80ºC o bien se preparan inmediatamente las membranas para el uso. Para la preparación de membranas, los culotes celulares se suspenden de nuevo en tampón de lisis y se homogeneízan con un disruptor de tejidos de tipo Polytron PT-2100 (Kinematica AG; 20 segundos x 2 explosiones). Se centrifugan las membranas en bruto a 4ºC a 40.000 x g durante 15 minutos. Después se suspende de nuevo el culote de membrana con tampón de resuspensión y se homogeneíza de nuevo en el disruptor de tejidos Polytron. Se determina la concentración de proteínas en la suspensión de membrana por el método descrito por Lowry y col., Journal of Biochemistry 193, 265, 1951. Todas las membranas se almacenan en partes alícuotas congeladas a -80ºC o bien se emplean inmediatamente. Las partes alícuotas de membranas de receptor hM5 preparadas se adquieren directamente a Perkin Elmer y se almacenan a -80ºC hasta el momento del uso.

Procedimiento de ensayo A

Ensayo de fijación de radioligando para los receptores ß1, ß2 o ß3-adrenérgicos humanos

Los ensayos de fijación se realizan en placas de microvaloración de 96 hoyos, con un volumen total de ensayo de 100 µl de proteína de membrana que contiene los receptores ß1, ß2

o ß3-adrenérgicos humanos en tampón de ensayo (75 mM Tris/HCl, pH 7,4, a 25ºC, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% de BSA). Los estudios de fijación en saturación para determinar los valores Kd del radioligando se realizan empleando el dihidroalprenolol-[H3] (NET-720, 100 Ci/mmoles, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) para los receptores ß1 y ß2 y el (-)-yodocianopindolol-[I125] (NEX-189, 220 Ci/mmoles, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) en 10 ú 11 concentraciones diferentes, comprendidas entre 0,01 nM y 20 nM. Los ensayos de desplazamiento para determinar los valores de Ki de los compuestos ensayados se realizan con el dihidroalprenolol-[H3] a 1 nM y con el (-)-yodocianopindolol-[I125] a 0,5 nM para 10 ú 11 concentraciones diferentes del compuesto ensayado, comprendidas entre 10 µM y 10 µM. La fijación no específica se determina en presencia de propranolol 10 µM. El material del ensayo se incuba a 37ºC durante 1 hora y las reacciones de fijación se terminan por filtración rápida en placas de filtro de fibra de vidrio GF/B para los receptores ß1 y ß2 y en placas de filtro de fibra de vidrio GF/C para los receptores ß3 (Packard BioScience Co., Meriden, CT), preimpregnadas con un 0,3% de polietilenoimina. Se lavan tres veces las placas del filtro con el tampón de filtración (75 mM Tris/HCl, pH 7,4, a 4ºC, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) para eliminar el material radiactivo no fijado. Después se secan las placas y se les añaden 50 µl del líquido de centelleo Microscint-20 (Packard BioScience Co., Meriden, CT) y se hace el recuento de la radiactividad en un contador del tipo Packard Topcount liquid scintillation counter (Packard BioScience Co., Meriden, CT). Se analizan los datos de fijación con un análisis de regresión no lineal empleando el paquete informático GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) empleando un modelo de 3 parámetros para la competición de un sitio. El mínimo de la curva se fija en el valor de la fijación no específica, determinada en presencia de propranolol 10 µM. Se calculan los valores Ki de los compuestos ensayados a partir de los valores IC50 observados y el valor Kd del radioligando empleando la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng, Y. y Prusoff, W.H., Biochemical Pharmacology 22, 23, 3 099-108, 1973).

En este ensayo, un valor Ki bajo indica que el compuesto ensayado tiene una afinidad de fijación elevada con respecto al receptor empleado en el ensayo. Se ha constatado que los compuestos ilustrativos de la fórmula I empleados en este ensayo presentan normalmente un valor Ki inferior a 300 nM para el receptor ß2-adrenérgico. Por ejemplo, se constata que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tienen valores Ki inferiores a 10 nM.

Si se desea, la selectividad de un compuesto ensayado por un subtipo de receptor puede calcularse en forma de relación Ki(ß1)/Ki(ß2) o Ki(ß3)/Ki(ß2). Se ha constatado que normalmente los compuestos de la fórmula I poseen mayor selectividad de fijación sobre el receptor ß2-adrenérgico que sobre los receptores ß1 o ß3-adrenérgicos, es decir, Ki(ß1) o Ki(ß3) normalmente son mayores que Ki(ß2). En general, son preferidos los compuestos que tienen mayor selectividad con el receptor ß2-adrenérgico que con los receptores ß1 o ß3adrenérgicos; son especialmente preferidos los compuestos que tienen una selectividad mayor que 5; y en particular mayor que 8. A título de ejemplo, los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y tienen una relación Ki(ß1)/Ki(ß2) mayor que

8. Procedimiento de ensayo B Ensayo de fijación de radioligando sobre receptores

muscarínicos

Los ensayos de fijación sobre radioligando de receptores muscarínicos humanos clonados se realizan en placas de microvaloración de 96 hoyos, con un volumen total de ensayo de 100 µl. Se diluyen en tampón de ensayo las membranas de células CHO que expresan de modo estable a los subtipos muscarínicos hM1, hM2, hM3, hM4 o hM5 hasta las siguientes concentraciones de proteínas diana específicas siguientes (µg/hoyo): 10 µg para el hM1, 10-15 µg para el hM2, 10-20 µg para el hM3, 10-20 µg para el hM4 y 10-12 µg para el hM5 para obtener señales similares (cpm). Se homogeneízan brevemente las membranas en el disruptor de tejidos Polytron (10 segundos) y después se introducen en la placa de ensayo. Los estudios de fijación de saturación para determinar los valores KD de los radioligandos se realizan empleando el cloruro de L[N-metil-H3]escopolamina-metilo (NMS-[H3]) (TRK666, 84,0 Ci/mmoles, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) en concentraciones comprendidas entre 0,001 nM y 20 nM. Los ensayos de desplazamiento para la determinación de los valores Ki de los compuestos ensayados se realizan con NMS-[H3] de 1 nM y once concentraciones diferentes del compuesto ensayado. Inicialmente se disuelven los compuestos a ensayar en una concentración de 400 µM en tampón de dilución y después se diluyen en series 5x con tampón de dilución hasta concentraciones finales comprendidas entre 10 µM y 100 µM. El orden de adición y los volúmenes depositados en las placas de ensayo son los siguientes: 25 µl de radioligando, 25 µl de compuesto a ensayar diluido y 50 µl de membrana. Se incuban las placas de ensayo a 37ºC durante 60 minutos. Se terminan las reacciones de fijación mediante una filtración rápida en placas filtrantes de fibra de vidrio GF/B (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) pretratadas con un 1% de BSA. Se enjuagan las placas filtrantes tres veces con tampón de lavado (10 mM HEPES) para eliminar el material radiactivo no fijado. Después se secan las placas con aire y se añaden a cada hoyo 50 µl del líquido de centelleo Microscint-20 liquid (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Se hace el recuento de la radiactividad de las placas en un aparato del tipo PerkinElmer Topcount liquid scintillation counter (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Se analizan los datos de fijación mediante análisis de regresión no lineal con un paquete informático GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) aplicando un modelo de competición de un sitio. Los valores Ki de los compuestos ensayados se calculan a partir de los valores IC50 observados y el valor KD del radioligando empleando la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng, Y., Prusoff, W.H., Biochemical Pharmacology 22(23), 3099-108, 1973). Los valores Ki se convierten en valores pKi para determinar la media geométrica y los intervalos de confianza del 95%. Estos valores estadísticos sumarios pueden convertirse de nuevo en valores Ki para redactar el informe de los datos.

En este ensayo, un valor Ki bajo indica que el compuesto ensayado tiene una afinidad de fijación elevada con respecto al receptor empleado en el ensayo. Se ha constatado que los compuestos ilustrativos de la fórmula I empleados en este ensayo presentan normalmente un valor Ki inferior a 300 nM para el receptor muscarínico M3. Por ejemplo, se constata que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tienen valores Ki inferiores a 10 nM.

Procedimiento de ensayo C

Ensayo cAMP Flashplate de células enteras en líneas celulares CHO que expresan de modo heterólogo a los receptores ß1, ß2 o ß3-adrenérgicos humanos

Los ensayos cAMP se realizan en una forma de radioinmunoensayo empleando el sistema de activación de adenililciclasa Flashplate con cAMP-[I125] (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Para la determinación de la potencia agonista del receptor β (EC50), se cultivan hasta casi confluencia las líneas celulares CHO-K1 que expresan de modo estable a los receptores ß1, ß2 o ß3-adrenérgicos humanos clonados en un medio HAM’s F-12 suplementado con un 10 % de FBS y geneticina (250 µg/ml). Se enjuagan las células con PBS y recogen en dPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, sin CaCl2 ni MgCl2) que contiene 2 mM EDTA o una solución de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina/0,53 mM de EDTA). Después de contar las células en un contador celular Coulter se convierten las células en culotes por centrifugación a 1.000 rpm y suspenden de nuevo en un tampón de estimulación que contiene IBMX (kit de PerkinElmer) precalentado a temperatura ambiente hasta una concentración de 1,6 x 106 a 2,8 x 106 células/ml. En este ensayo se emplean de 60.000 a

80.000 células por hoyo. Se diluyen los compuestos a ensayar (10 mM en DMSO) en PBS que contiene un 0,1% de BSA en un aparato Beckman Biomek-2000 y se ensayan en 11 concentraciones diferentes, comprendidas entre 100 µM y 1 µM. Se incuban las mezclas reaccionantes a 37ºC durante 10 min y se interrumpen las reacciones por adición de 100 µl de una solución tampón de detección frío que contiene cAMP-[I125] (NEN SMP004, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA). Se calcula la cantidad de cAMP producida (pmoles/hoyo) en base a las cuentas observadas en las muestras y los patrones de cAMP del modo descrito en el manual de usuario que facilita el fabricante. Se analizan los datos por regresión no lineal con un paquete informático GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) con la ecuación sigmoidal. Se aplica la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng, Y., Prusoff, W.H., Biochemical Pharmacology 22(23), 3099-108, 1973) para calcular los valores de EC50.

En este ensayo, un valor EC50 bajo indica que el compuesto ensayado tiene una actividad funcional elevada para el receptor ensayado. Normalmente se observa que los compuestos ilustrativos de la fórmula I que se ensayan de este modo tienen valores EC50 inferiores a 300 nM para el receptor β2adrenérgico. Por ejemplo, se ha encontrado que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tienen valores EC50 inferiores a 10 nM.

Si se desea, la selectividad del subtipo de receptor para un compuesto ensayado puede calcularse como relación entre EC50(β1) y EC50(β2) o EC50(β3) y EC50(β2). Normalmente, los compuestos de esta invención demuestran tener un actividad funcional mayor con el receptor β2-adrenérgico que con el receptor β1o β3-adrenérgico, es decir, la EC50(β1) o EC50(β3) normalmente es mayor que la EC50(β2). En general son preferidos los compuestos que tienen mayor selectividad para el receptor β2-adrenérgico que para los receptores β1o β3adrenérgico; en especial, los compuestos que tienen una selectividad mayor que 5; y en particular mayor que 10. A título de ejemplo, los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tienen relaciones entre EC50(β1) y EC50(β2) mayores que 10.

Procedimiento de ensayo D

Ensayos funcionales de antagonismo con los subtipos de receptores muscarínicos

A. Bloqueo de la inhibición mediada por un agonista de la acumulación de cAMP

En este ensayo, se determina la potencia funcional de un compuesto de ensayo midiendo la capacidad de dicho compuesto de ensayo para bloquear la inhibición de la oxotremorina de la acumulación de cAMP mediada por la forskolina en células CHO-K1 que expresan al receptor hM2. Los ensayos de cAMP se realizan en un forma de radioinmunoensayo empleando el sistema Flashplate de activación de la adenilil-ciclasa con cAMP-I125 (NEN SMP004B, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) con arreglo a las instrucciones del fabricante. Se enjuagan las células una vez con dPBS y se recogen en una solución de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina/EDTA 0,53 mM) del modo descrito en la anterior sección de cultivo celular y preparación de membranas. Se lavan dos veces las células separadas por centrifugación a 650 x g durante 5 minutos en 50 ml de dPBS. A continuación se suspende de nuevo el culote celular en 10 ml de dPBS y se cuentas las células con un contador del tipo Coulter Z1 Dual Particle Counter (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Se centrifugan de nuevo las células a 650 x g durante cinco minutos y se suspenden de nuevo en tampón de estimulación hasta una concentración de ensayo de 1,6 x 106 - 2,8 x 106 células/ml.

Inicialmente se disuelve el compuesto a ensayar hasta una concentración de 400 µM en tampón de dilución (dPBS suplementado con 1 mg/ml de BSA (del 0,1 %)) y después se diluyen en series con tampón de dilución hasta concentraciones molares finales comprendidas 100 µM y 0,1 nM. La oxotremorina se diluye de manera similar.

Para medir la inhibición de la actividad de la adenilil-ciclasa (AC), causada por la oxotremorina, se introducen en los hoyos de ensayo agonista 25 µl de forskolina (concentración final = 25 µM, diluida en dPBS), 25 µl de oxotremorina diluida y 50 µl de células. Para medir la capacidad de un compuesto ensayado para bloquear la actividad de la AC inhibida por la oxotremorina, se introducen en los restantes hoyos de ensayo 25 µl de forskolina y oxotremorina (final concentraciones = 25 µM y 5 µM, respectivamente, diluidas en dPBS), 25 µl de compuesto de ensayo diluido y 50 µl de células.

Se incuban las mezclas reaccionantes a 37ºC durante 10 minutos y se interrumpen las reacciones por adición de 100 µl tampón de detección enfriado con hielo. Se sellan las placas, se incuban a temperatura ambiente durante una noche y a la mañana siguiente se hace el recuento en un contador del tipo PerkinElmer TopCount liquid scintillation counter (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Se calcula la cantidad de cAMP producida (pmoles/hoyo) en base a las cuentas observadas en las muestras y los patrones de cAMP, del modo descrito en el manual de usuario que facilita el fabricante. Los datos se analizan mediante regresión no lineal con el paquete informático GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) aplicando una regresión no lineal y una ecuación de competición de un sitio. Se emplea la ecuación de Cheng-Prusoff para calcular la Ki, tomando la EC50 de la curva de concentra-ción-respuesta de la oxotremorina y la concentración de la oxotremorina en el ensayo como valores KD y [L], respectivamente.

En este ensayo, un valor Ki bajo indica que el compuesto ensayado tiene una actividad funcional elevada con respecto al receptor ensayado. Los compuestos ilustrados de la fórmula I sometidos a este ensayo normalmente tienen un valor Ki inferior a 300 nM para el bloqueo de la inhibición causada por la oxotremorina de la acumulación de la cAMP mediada por la forskolina en células CHO-K1 células que expresan al receptor hM2. Por ejemplo, se ha encontrado que el compuesto del ejemplo comparativo 3 tiene un valor Ki menor que 10 nM.

B. Bloqueo de la fijación del GTPγS[S35] mediada por el agonista

En un segundo ensayo funcional puede determinarse la potencia funcional de los compuestos de ensayo midiendo la capacidad de los compuestos para bloquear la fijación del GTPγS[S35], mediada por la oxotremorina, sobre células CHO-K1 que expresan al receptor hM2.

En el momento del empleo, se descongelan las membranas congeladas y se diluyen en tampón de ensayo hasta la concentración final deseada de tejido de 5-10 µg de proteína por hoyo. Se homogeneízan brevemente las membranas en un disruptor de tejidos Polytron PT-2100 y después se introducen en las placas de ensayo.

En cada ensayo se determina el valor EC90 (concentración efectiva para la respuesta máxima del 90%) de la estimulación de la fijación del GTPγS[S35] causada por el agonista oxotremorina.

Para determinar la capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir la fijación del GTPγS[S35] estimulada por la oxotremorina se introducen los siguientes materiales en cada uno de los hoyos de placas de 96 hoyos: 25 µl de tampón de ensayo con GTPγS[S35] (0,4 nM), 25 µl de oxotremorina (EC90) y GDP (3 µM), 25 µl de compuesto de ensayo diluido y 25 µl de membranas de células CHO célula que expresan al receptor hM2.

A continuación se incuban las placas de ensayo a 37ºC durante 60 minutos. Se filtran los materiales de las placas de ensayo a través de filtros GF/B tratados previamente con BSA del 1 % empleando un recolector de 96 hoyos PerkinElmer. Se enjuagan las placas con tampón de lavado enfriado con hielo durante 3 x 3 segundos y se secan con aire o con vacío. Se introduce en cada hoyo el líquido Microscint-20 scintillation liquid (50 µl), se sella cada placa y se determina la radiactividad en un Topcounter (PerkinElmer). Los datos se analizan mediante regresión no lineal con el paquete informático GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) aplicando una regresión no lineal y una ecuación de competición de un sitio. Se emplea la ecuación de Cheng-Prusoff para calcular la Ki, tomando la EC50 de la curva de concentración-respuesta de la oxotremorina y la concentración de la oxotremorina en el ensayo como valores KD y la concentración del ligando [L], respectivamente.

En este ensayo, un valor Ki bajo indica que el compuesto ensayado tiene una actividad funcional elevada con respecto al receptor ensayado. Los compuestos ilustrados de la fórmula I sometidos a este ensayo normalmente tienen un valor Ki inferior a 300 nM para el bloqueo de la fijación del GTPγS[S35] estimulada por la oxotremorina sobre células CHOK1 que expresan al receptor hM2. Por ejemplo, se ha encontrado que el compuesto del ejemplo comparativo 3 tiene un valor Ki menor que 10 nM.

C. Bloqueo de la liberación de calcio mediada por el

agonista mediante ensayos FLIPR

Los subtipos de receptores muscarínicos (receptores M1, M3 y M5), que se unen a las proteínas Gq, activan el mecanismo de la fosfolipasa C (PLC) después de que el agonista se haya unido al receptor. De ello resulta que la PLC hidroliza al difosfato de fosfatidil-inositol (PIP2) convirtiéndolo en diacilglicerina (DAG) y trifosfato de 1,4,5-fosfatidilo (IP3), que a su vez provoca la liberación de calcio de las reservas intracelulares, es decir, del retículo endoplasmático y sarcoplasmático. El ensayo FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) capitaliza en su incremento en calcio intracelular empleando un colorante sensible al calcio (Fluo-4AM, Molecular Probes, Eugene, OR), que emite fluorescencia cuando se une al calcio libre. Este acontecimiento de fluorescencia se mide en tiempo real en el FLIPR, que detecta el cambio de fluorescencia de una monocapa de células clonadas con receptores M1 y M3 humanos y receptores M5 de chimpancé. La potencia antagonista puede determinarse por la capacidad de los antagonistas para inhibir los aumentos de calcio intracelular mediados por los agonistas.

Para los ensayos FLIPR de estimulación de calcio se siembran las células CHO que expresan de modo estables los receptores M1, M3 y M5 en placas FLIPR de 96 hoyos, la noche antes de la realización del ensayo. Se lavan dos veces las células sembradas con Cellwash (MTX Labsystems, Inc.) con tampón FLIPR (10 mM HEPES, pH 7,4, 2 mM cloruro cálcico, 2,5 mM probenecida en solución salina tamponada de Hank (HBSS) sin calcio ni magnesio) para eliminar el medio de cultivo y quedando 50 µl/hoyo de tampón FLIPR. Después se incuban las células con 50 µl/hoyo de 4 µM FLUO-4AM (se prepara una solución 2X) a 37ºC durante 40 minutos con un 5% de dióxido de carbono. Después del período de incubación del colorante se dos veces lavan las células con tampón FLIPR, quedando un volumen final de 50 µl/hoyo.

Para determinar la potencia antagonista, la estimulación dependiente de dosis de la liberación del Ca2+ intracelular se determina en primer lugar de modo que la potencia antagonista pueda medirse después frente a la estimulación de la oxotremorina en una concentración EC90. Las células se incuban en primer lugar con compuesto tampón de dilución durante 20 minutos, después se añade el agonista, lo cual se realiza con el FLIPR. Se genera un valor EC90 para la oxotremorina con arreglo al método detallado en la siguiente sección de medición FLIPR y reducción de datos, en combinación con la fórmula ECF = ((F/100-F)�1/H) * EC50. Se prepara una concentración de oxotremorina de 3 x ECF en las placas de estimulación de modo que se añada una concentración EC90 de oxotremorina a cada hoyo en las placas de ensayo de inhibición de antagonista.

Los parámetros empleados para el FLIPR son: período de exposición de 0,4 segundos, potencia del láser de 0,5 vatios, longitud de onda de excitación de 488 nm y longitud de onda de emisión de 550 nm. La línea de base se determina midiendo el cambio de fluorescencia durante 10 segundos antes de la adición del agonista. Después de la estimulación del agonista, el FLIPR mide en continuo el cambio de fluorescencia cada 0,5 - 1 segundos durante 1,5 minutos para capturar el cambio máximo de fluorescencia.

El cambio de fluorescencia se expresa como fluorescencia máxima menos fluorescencia de la línea base para cada hoyo. Los datos en bruto se analizan frente al logaritmo de la concentración del fármaco por regresión no lineal con el programa informático GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) empleando el modelo intrínseco de dosis-respuesta sigmoidal. Los valores Ki del antagonista se determinan con el Prism empleando el valor EC50 de la oxotremorina como valor KD y el EC90 de la oxotremorina para la concentración de ligando con arreglo a la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng & Prusoff, 1973).

En este ensayo, un valor Ki bajo indica que el compuesto ensayado tiene una actividad funcional elevada con respecto al receptor ensayado. Los compuestos ilustrados de la fórmula I sometidos a este ensayo normalmente tienen un valor Ki inferior a 300 nM para el bloqueo de la inhibición de la liberación de calcio mediada por el agonista en células CHO que expresan de modo estable a los receptores hM1, hM3 y hM5. Por ejemplo, se ha encontrado que el compuesto del ejemplo comparativo 3 tiene un valor Ki menor que 10 nM para los receptores hM1, hM3 y hM5.

Procedimiento de ensayo E

El ensayo Flashplate de cAMP de células enteras con una línea celular epitelial pulmonar que expresa de modo endógeno al receptor β2-adrenérgico humano

Para la determinación de las potencias y eficacias agonistas (actividades intrínsecas) en una línea celular que expresa niveles endógenos del receptor β2-adrenérgico se emplea una línea celular epitelial pulmonar humana (BFAS-2B) (ATCC CRL-9609, American Type Culture Collection, Manassas, VA) (January, B. y col., British Journal of Pharmacology 123, 4.701-11, 1998). Se cultivan las células hasta una confluencia del 75-90% en un medio completo, sin suero (medio LHC-9 que contiene epinefrina y ácido retinoico, nº cat. 181-500, Biosource International, Camarillo, CA). El día antes del ensayo se cambia el medio por el medio LHC-8 (sin epinefrina ni ácido retinoico, nº cat. 141-500, Biosource International, Camarillo, CA). Los ensayos de cAMP se realizan en un forma de radioinmunoensayo empleando el sistema de ensayo de activación de la adenilil-ciclasa Flashplate con cAMP-[I125] (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), con arreglo a las instrucciones del fabricante. El día del ensayo se enjuagan las células con PBS, se recogen por raspado con EDTA 5 mM en PBS y se cuenta. Se someten las células a centrifugación a 1.000 rpm y se suspende el culote de nuevo en tampón de estimulación calentado previamente a 37ºC en una concentración final de 600.000 células/ml. En este ensayo se emplean las células en una concentración final de 100.000 a

120.000 células/hoyo. Se diluyen los compuestos a ensayar en serie con tampón de ensayo (75 mM Tris/HCl, pH 7,4, a 25°C, 12,5 mM MgCl2, 1 mM BETA, 0,2% de BSA) en un aparato Beckman Biomek-2000. Se realizan los ensayos con estos compuestos en 11 concentraciones diferentes, comprendidas entre 10 µM y 10 µM. Se incuban las mezclas reaccionantes a 37ºC durante 10 min y se interrumpen las reacciones por adición de 100 µl de tampón de detección enfriado con hielo. Se sellan las placas, se incuban a 4ºC durante unanoche y se cuentan al día siguiente en un contador de centelleo Topcount (Packard Bio-Science Co., Meriden, CT). Se calcula la cantidad de cAMP producida por ml de mezcla reaccionante en base a las cuentas observadas en las muestras y patrones de cAMP, del modo descrito en el manual de usuario que facilita el fabricante. Se analizan los datos por regresión no lineal con el paquete informático GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) empleando un modelo de 4 parámetros para la dosis-respuesta sigmoidal.

De este modo, un valor EC50 bajo indica que el compuesto ensayado tiene una actividad funcional elevada para el receptor ensayado. Normalmente se observa que los compuestos ilustrativos de la fórmula I que se ensayan de este modo tienen valores EC50 inferiores a 300 nM para el receptor β2adrenérgico. Por ejemplo, se ha encontrado que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tienen valores EC50 inferiores a 10 nM.

Si se desea, la eficacia del compuesto ensayado (%Ef) se calcula a partir del cociente entre el Emáx observado (parte superior de la curva ajustada) y la respuesta máxima obtenida para la curva de dosis-respuesta de isoproterenol y se expresa en forma de %Ef con respecto al isoproterenol. Los compuestos de los ejemplos de esta invención sometidos a este

ensayo presentan por ejemplo un %Ef mayor que 40.

Procedimiento de ensayo F

Duración de la broncoprotección en modelos de bronco-constricción inducida por acetilcolina o inducida por histamina en cobayas

Estos ensayo “in vivo” se realizan para evaluar los efecto broncoprotectores de los compuestos ensayados que poseen no solo actividad antagonista de receptores muscarínicos sino también actividad agonista de receptores ß2adrenérgicos. Para aislar la actividad antagonista muscarínica en el modelo de broncoconstricción inducida con acetilcolina, se administra el propanolol a los animales, un compuesto que bloquea la actividad del receptor β, antes de la administración de la acetilcolina. La duración de la broncoprotección en el modelo de broncoconstricción inducida con histamina es un reflejo de la actividad agonista de receptores ß2-adrenérgicos.

Mediante tarjetas sujetas a las jaulas se identifican individualmente los grupos de 6 cobayas machos (Duncan-Hartley (HsdPoc:DH) Harlan, Madison, WI) que pesan entre 250 y 350 g. A lo largo del estudio se permite que los animales tengan libre acceso al pienso y al agua.

Se administran los compuestos a ensayar por inhalación durante 10 minutos en una cámara de dosificación por exposición del cuerpo entero (R&S Molds, San Carlos, CA). Las cámaras de dosificación están dispuestas de modo que el aerosol se entregue simultáneamente a 6 cámaras individuales a partir de un distribuidor central. Se exponen los cobayas al aerosol de un compuesto de ensayo o de un vehículo (WFI). Estos aerosoles se general a partir de soluciones acuosas empleando un aparato nebulizador llamado LC Star Nebulizer Set (modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc., Midlothian, VA) impulsado por una mezcla de gases (CO2 = 5%, O2 = 21% y N2 = 74%) con una presión de 22 psi. El caudal de gas a través del nebulizador en esta presión de trabajo es de aproximadamente 3 l/minuto. Los aerosoles generados se transportan a las cámaras por presión positiva. No se emplea la dilución con aire durante el transporte de las soluciones aerosolizadas. Durante la nebulización de 10 minutos se nebulizan aproximadamente 1,8 ml de solución. Se mide este valor por gravimetría comparando los pesos del nebulizador lleno antes y después de la nebulización.

Los efectos broncoprotectores de los compuestos ensayados administrados por inhalación se evalúan realizando una pletismografía de cuerpo entero en las horas 1,5, 24, 48 y 72 horas después de la dosis.

Cuarenta y cinco minutos antes de iniciar la evaluación pulmonar, cada cobaya se anestesia con una inyección intramuscular de ketamina (43,75 mg/kg), xilazina (3,50 mg/kg) y acepromazina (1,05 mg/kg). Después de afeitar y limpiar el sitio quirúrgico con alcohol del 70 % se realiza una incisión de 2-3 cm en la línea central del aspecto ventral del cuello. Después se aísla la vena yugular y se encanula con un catéter de polietileno que contiene solución salina (PE-50, Becton Dickinson, Sparks, MD) para permitir las infusiones intravenosas de acetilcolina (Ach) o de histamina en solución salina. Después se disecciona la tráquea para que quede libre y se encanula con un tubo de Teflon 14G (nº NE-014, Small Parts, Miami Lakes, FL). Si fuera necesario, se mantendrá la anestesia mediante inyecciones intramusculares adicionales de la mezcla anestésica recién mencionada. Se hace el seguimiento de la intensidad de la anestesia y se ajusta, si el animal respondiera al pinzamiento de su pata o si la velocidad de respiración fuera superior a 100 respiraciones/minuto.

Una vez completadas las encanulaciones se coloca el animal dentro de un pletismógrafo (nº PLY3114, Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT) y se le inserta una cánula de presión esofágica (PE-160, Becton Dickinson, Sparks, MD) para medir la presión pulmonar normal (presión). Se inserta el tubo traqueal de Teflon en la abertura del pletismógrafo para permitir que el cobaya respire aire ambiental del exterior de la cámara. Después se sella la cámara. Se emplea una lámpara calefactora para mantener la temperatura corporal y se hinchan los pulmones del cobaya 3 veces con 5 ml de aire empleando un sistema calibrado de 10 ml (serie nº 5520, Hans Rudolph, Kansas City, MO) para asegurar que las vías respiratorias inferiores no se colapsen y el animal no sufra una hiperventilación.

Una vez se han determinado que los valores de la línea base están dentro del intervalo de 0,3 a 0,9 ml/cm de H2O de conformidad y dentro del intervalo de 0,1 a 0,199 cm de H2O/ml por segundo de resistencia, se inicia la evaluación pulmonar. Un programa informático de medición pulmonar de Buxco permite la recogida la derivación de los valores pulmonares.

La puesta en marcha de este programa inicia el método experimental y la recogida de datos. Con un transductor de presión Buxco se miden los cambios de volumen a lo largo del tiempo que tienen lugar dentro del pletismógrafo con cada respiración. Integrando estas señales a lo largo del tiempo se calcula una medición del caudal de cada respiración. Esta señal, junto con los cambios de presión pulmonar normal, que se recogen en el transductor de presión Sensym (nº TRD4100), se conecta mediante un preamplificador Buxco (MAX 2270) con la interfase de recogida de datos (nº SFT3400 y SFT3813). Todos los demás parámetros pulmonares se derivan de estas dos entradas.

Los valores de la línea base se recogen durante 5 minutos, pasado este tiempo se somete los cobayas a la acción de la Ach o de la histamina. Para evaluar los efectos antagonistas muscarínicos, se administra el propanolol (5 mg/kg, i.v.) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 15 minutos antes del tratamiento con la Ach. Se administra la Ach (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (0,1 mg/ml) por infusión intravenosa durante 1 minuto con una bomba de tipo jeringuilla (sp210iw, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) en las dosis siguientes y los tiempos prescritos desde el inicio del ensayo: 1,9 µg/minuto a los 5 minutos, 3,8 µg/minuto a los 10 minutos, 7,5 µg/minuto a los 15 minutos, 15,0 µg/minuto a los 20 minutos, 30 µg/minuto a los 25 minutos y 60 µg/minuto a los 30 minutos. Como alternativa, la broncoprotección proporcionada por los compuestos ensayados se evalúa con un modelo de exposición a la acetilcolina sin tratamiento previo con un compuesto bloqueador beta.

Para evaluar los efectos agonistas de los receptores ß2-adrenérgicos de los compuestos ensayados, se administra la histamina (25 µg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) por infusión intravenosa durante 1 minuto con una bomba de tipo jeringuilla en las dosis y tiempos prescritos siguientes desde el inicio del ensayo: 0,5 µg/minuto a los 5 minutos, 0,9 µg/minuto a los 10 minutos, 1,9 µg/minuto a los 15 minutos, 3,8 µg/minuto a los 20 minutos, 7,5 µg/minuto a los 25 minutos y 15 µg/minuto a los 30 minutos. Si la resistencia o la conformidad no vuelven a los valores de la línea de base al cabo de 3 minutos después de cada dosis de ACh o de histamina, los pulmones de los cobayas se hinchan 3 veces con 4 ml de aire con una jeringuilla calibrada de 10 ml. Los parámetros pulmonares registrados incluyen la frecuencia de respiración (respiraciones/minuto), la conformidad (ml/cm de H2O) y la resistencia pulmonar (cm de H2O/ml por segundo). Una vez han finalizado las mediciones de la función pulmonar en el minuto 35 de este método, se saca al cobaya del pletismógrafo y se sacrifica por asfixia con dióxido de carbono.

Los datos se evalúan por uno de los dos métodos siguientes:

(a) se calcula la resistencia pulmonar (RL, cm de H2O/ml por segundo) a partir del cociente del “cambio de presión” y el “cambio de caudal”. Se recoge en el ordenador la respuesta RL a la ACh (60 µg/min, IH) para grupos de animales tratados con el vehículo y con el compuesto de ensayo. Se calcula la respuesta media a la ACh en los animales tratados con el vehículo, en cada momento del tratamiento previo, y se emplea para calcular el % de inhibición de la respuesta a la ACh en el correspondiente momento del tratamiento previo de cada dosis de compuesto ensayado. Las curvas de inhibición de la dosis-respuesta para la “RL” se ajustan con una ecuación de cuatro parámetros lógicos empleando el programa informático GraphPad Prism, versión 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California) para estimar la ID50 broncoprotectora (dosis requerida para inhibir en un 50 % la respuesta broncoconstrictora de la ACh (60 µg/min)). La ecuación empleada es la siguiente:

imagen1

en la que X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta (% de inhibición del aumento de la RL inducido por la ACh). Y se inicia en el Mín y se aproxima asintóticamente al Máx con una forma sigmoidal.

(b) La cantidad PD2, que se define como la cantidad de ACh o de histamina que se necesita para provocar el doble de la resistencia pulmonar de la línea base, se calcula empleando los valores de resistencia pulmonar derivados del flujo y la presión a lo largo del intervalo de tratamientos con ACh o histamina aplicando la ecuación siguiente (derivada de la ecuación empleada para calcular los valores PC20 en la clínica (véase Am. Thoracic Soc., 2000):

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en la que: C1 = concentración de la Ach o histamina antes de C2 C2 = concentración de la Ach o histamina que provoca por lo menos un aumento doble de la resistencia pulmonar (RL) R0 = valor de línea base de RL R1 = valor RL después de C1 R2 = valor RL después de C2

El análisis estadístico de los datos se realiza empleando un test t de Student de dos colas. Un valor P <0,05 se considera significativo.

Los compuestos de la fórmula I descritos en los ejemplos que se someten a este ensayo normalmente producen un efecto broncoprotector dependiente de la dosis frente la broncoconstricción inducida por la MCh y la broncoconstricción inducida por la His. En general son preferidos los compuestos ensayados que tienen una potencia (ID50 a las 1,5 h de la dosis) menor que 300 µg/ml para la broncoconstricción inducida por la ACh y menor que 300 µg/ml para la broncoconstricción inducida por la His en este ensayo. Por ejemplo, se ha constatado que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tienen una ID50 menor que 100 µg/ml para la broncoconstricción inducida por la ACh y una ID50 menor que 100 µg/ml para la broncoconstricción inducida por la His a las 1,5 horas después de la dosis.

Además son preferidos en general los compuestos ensayados que tienen una duración (PD T1/2) de actividad broncoprotectora de por lo menos unas 24 horas en este ensayo. A título de ejemplo, se ha observado que los compuestos de los ejemplos comparativos 3 y 6 tienen una PD T1/2 de por lo menos

unas 24 horas después de la dosis.

Procedimiento de ensayo G

Modelo Einthoven para medir los cambios de ventilación en cobayas

La actividad broncodilatadora de los compuestos de ensayo se evalúa en un modelo de cobaya anestesiado (el modelo Einthoven), que emplea la presión de ventilación como medición secundaria de la resistencia de las vías respiratorias, véase, por ejemplo, Einthoven, Pfugers Arch. 51, 367 -445, 1892; y Mohammed y col., Pulm. Pharmacol. Ther. 13(6), 28792, 2000. En este modo se evalúa la actividad antagonista muscarínica y la actividad agonista β2 determinando los efectos protectores contra la broncoconstricción inducida por la metacolina (MCh) y la histamina (His).

Este ensayo se realiza con cobayas Duncan-Hartley (Harlan, Indianapolis, IN), que pesan entre 300 y 400 g.

El compuesto a ensayar o el vehículo (es decir, agua esterilizada) se dosifica por inhalación (IH) durante un período de tiempo de 10 minutos en una cámara de dosificación y exposición corporal entera (R+S Molds, San Carlos, CA) empleando 5 ml de solución dosificada. Se exponen los animales a un aerosol, que se genera con un nebulizador del tipo LC Star Nebulizer Set (modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) que expulsa una mezcla de gases Bioblend (5% de CO2; 21 % de O2; y 74% de N2) a una presión de 22 psi. Se evalúa la función pulmonar en varios momentos después de

la dosificación por inhalación.

Cuarenta y cinco minutos antes del inicio de la evaluación de la función pulmonar se anestesian los cobayas con una inyección intramuscular (i.m.) de una mezcla de ketamina (13,7 mg/kg/ xilazina (3,5 mg/kg)/ acepromazina (1,05 mg/kg).

En caso necesario se administra una dosis suplementaria de esta mezcla (50 % de la dosis inicial). Se aíslan la vena yugular y la arteria carótida y se encanulan con catéteres de polietileno que contienen solución salina (micro-renatano y PE-50, respectivamente, Beckton Dickinson, Sparks, MD). Se conecta la arteria carótida a un transductor de presión que permite medir la presión sanguínea y la cánula de la vena yugular se emplea para la inyección i.v. de MCh o de His. Después se secciona la tráquea para que quede libre y se encanula con una aguja 14G (nº NE-014, Small Parts, Miami Lakes, FL). Una vez finalizadas las encanulaciones se ventilan los cobayas con un respirador (modelo 683, Harvard Apparatus, Inc., MA) que con cada embolada expulsa 1 ml/100 g de peso corporal, pero sin superar un volumen de 2,5 ml y con una velocidad de 100 emboladas por minuto. Se mide la presión de ventilación (VP) en la cánula traqueal con un transductor Biopac que está conectado a un preamplificador Biopac (TSD 137C). Se mantiene la temperatura corporal en 37ºC empleando una almohadilla calefactora. Antes de iniciar la recogida de datos se administra el pentobarbital (25 mg/kg) por vía intraperitoneal (i.p.) para suprimir la respiración espontánea y obtener una línea base estable. Se registran los cambios de la VP con una interfase de recogida de datos Biopac Windows. Los valores de la línea de base se recogen por lo menos durante 5 minutos, después de lo cual se tratan los cobayas por vía i.v. de modo no acumulativo con dosis crecientes 2 veces del broncoconstrictor (MCh o His). Cuando se emplea la MCh como agente broncoconstrictor, los animales se tratan previamente con propranolol (5 mg/kg, i.v.) para aislar los efectos antimuscarínicos del compuesto ensayado. Se registran los cambios de VP empleando el programa informático de Acknowledge Data Collection Software (Santa Barbara, CA). Una vez finalizado el estudio, los animales se sacrifican.

El cambio de VP se mide en cm de agua. El cambio de VP (cm H2O) = presión de pico (después de la exposición al broncoconstrictor) - presión de línea de base de pico. Se ajusta la curva dosis-respuesta a la MCh o a la His a una ecuación lógica de cuatro parámetros empleando el programa informático GraphPad Prism, versión 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California). La ecuación que se emplea es la siguiente:

imagen1

en la que X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta. Y empieza en el Mín y se aproxima asintóticamente al Máx con una forma sigmoidal.

La inhibición porcentual de la respuesta al broncoconstrictor en la dosis submáxima de MCh o de His se calcula para dosis de compuesto ensayado aplicando la ecuación siguiente: % de inhibición de respuesta = 100-((presión de pico (después de la exposición al broncoconstrictor, tratado) - presión de línea de base de pico (tratado) * 100% / (presión de pico (después de la exposición al broncoconstrictor, agua) -presión de línea de base de pico (agua)). Se ajustan las curvas de inhibición empleando una ecuación lógica de cuatro parámetros del programa informático de GraphPad. Cuando proceda se evalúan también los valores ID50 (dosis requerida para producir una inhibición del 50% de la respuesta al broncoconstrictor) y Emáx (inhibición máxima).

La magnitud de la broncoprotección en los diferentes momentos que siguen a la inhalación del compuesto de ensayo se emplea para estimar la vida media farmacodinámica (PD T1/2). Se determina la PD T1/2 realizando un ajuste de regresión no lineal empleando una ecuación de desactivación exponencial de una fase (GraphPad Prism, versión 4.00): Y = Span*exp(-K*X) + meseta; comienza en Span+meseta y desciende a la meseta con una constante de velocidad K. La PD T1/2 = 0,69/K. La meseta se constriñe a 0.

Los compuestos de la fórmula I descritos en los ejemplos sometidos a este ensayo producen normalmente un efecto broncoprotector dependiente de la dosis contra la broncoconstricción inducida por la MCh y contra la broncoconstricción inducida por la His. En general son preferidos los compuestos ensayados que en este ensayo tienen una ID50 menor que 300 µg/ml para la broncoconstricción inducida por la MCh y una ID50 menor que 300 µg/ml para la broncoconstricción inducida por la His al cabo de 1,5 horas después de la aplicación de la dosis. Además son preferidos en general los compuestos de ensayo que en este ensayo tienen una duración (PD T1/2) de la

actividad broncoprotectora por lo menos de 24 horas.

Procedimiento de ensayo H

Ensayo de salivación con cobayas sometidos a inhalación

Se aclimatan los cobayas (Charles River, Wilmington, MA) que pesan 200-350 g para que formen una colonia de cobayas internos por lo menos durante 3 días contados desde el momento de la llegada. Se administra el compuesto a ensayar o el vehículo por inhalación (ih) durante un período de tiempo de 10 minutos en una cámara de dosificación que tiene forma de pastel (R+S Molds, San Carlos, CA). Se disuelven las soluciones a ensayar en agua esterilizada y se administran empleando un nebulizado que se ha llenado con 5,0 ml de la solución a dosificar. Se encajonan los cobayas en la cámara de inhalación durante 30 minutos. Durante este tiempo se obligan los cobayas a permanecer en una zona de aproximadamente 110 cm cuadrados. Este espacio es adecuado para que los animales puedan moverse libremente, descansar y asearse. Pasados 20 minutos de aclimatación, se exponen los cobayas a un aerosol generado por un nebulizador del tipo LS Star Nebulizer Set (modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA), que trabaja con aire ambiental con una presión de 22 psi. Una vez finalizada la nebulización, se evalúa el estado de los cobayas al cabo de 1,5, 6, 12, 24, 48 y 72 h después del tratamiento.

Se anestesian los cobayas una hora antes del ensayo con una inyección intramuscular (i.m.) de una mezcla de ketamina (43,75 mg/kg), xilazina (3,5 mg/kg) y acepromazina (1,05 mg/kg) con un volumen de 0,88 ml/kg. Se colocan los animales con la cara ventral hacia arriba sobre una manta calentada (37ºC) con una inclinación de 20 grados de su cabeza en pendiente hacia abajo. Se inserta en la boca del cobaya una almohadilla de gasa de 4 capas de 2 x 2 pulgadas (esponjas de uso general de gasa Nu, Johnson y Johnson, Arlington, TX). Cinco minutos después se administra el agonista muscarínico pilocarpina (3,0 mg/kg, s.c.) e inmediatamente se desecha la almohadilla de gasa, que se reemplaza por una nueva almohadilla de gasa pesada previamente. Se recoge la saliva durante 10 minutos, en este momento se pesa la almohadilla de gasa y se anota la diferencia de pesos para determinar la cantidad de saliva acumulada (en mg). Se calcula la cantidad media de saliva recogida de los animales que reciben el vehículo y los que reciben cada una de las dosis del compuesto ensayado. Se toma la media del grupo de animales que reciben el vehículo como una salivación del 100 %. Se calculan los resultados empleando las medias resultantes (n = 3 o mayor). Se calculan los intervalos de confianza (95%) para cada dosis y para cada momento temporal empleando un ANOVA de dos vías. Este modelo es una versión modificada del procedimiento descrito por Rechter, “Estimation of anticholinergic drug effects in mice by antagonism against pilocarpine-induced salivation”; Ata Pharmacol. Toxicol. 24, 243-254, 1996.

Se calcula el peso medio de saliva en los animales tratados con el vehículo, en cada momento del tratamiento previo, y se emplea para calcular el % de inhibición de la salivación en el momento correspondiente del tratamiento previo para cada una de las dosis. Los datos de inhibición de la dosis-respuesta se ajustan a una ecuación lógica de cuatro parámetro empleando el programa GraphPad Prism, versión 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California) para estimar la ID50 anti-sialagoga (dosis requerida para inhibir en un 50% la salivación provocada por la pilocarpina). La

5 ecuación aplicada es la siguiente:

imagen1

en la que X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta (% de inhibición de la salivación). Y comienza en el Mín y se aproxima asintóticamente al Máx con una forma sigmoidal.

10 Se emplea el cociente entre la ID50 anti-sialagoga y la ID50 broncoprotectora para calcular el índice de selectividad pulmonar aparente del compuesto ensayado. En general son preferidos en este ensayo los compuestos que tienen un índice de selectividad pulmonar aparente mayor que 5. En este ensayo,

15 el compuesto del ejemplo comparativo 3 tiene un índice de selectividad pulmonar aparente mayor que 5.

Claims

Reivindicaciones

1. Bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilo de

5 la fórmula

imagen1

o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etil

10 amino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilo de la fórmula

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3. Una composición farmacéutica que contiene a) el bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8

15 hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilo o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 3, dicha composición contiene un agente terapéutico adicional.
5. Una composición farmacéutica según la reivindicación

5 4, en la que el agente terapéutico adicional es un agente esteroideo antiinflamatorio.
6. Una composición farmacéutica según la reivindicación 5, en la que el agente esteroideo antiinflamatorio es un corticosteroide.

10 7. El bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilo o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para usos terapéuticos.

15 8. El bifenil-2-ilcarbamato de 1-[2-(2-cloro-4-{[(R)-2hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilo o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso en el tratamiento de un trastorno pulmonar.

20 9. El uso según la reivindicación 8, en el que el trastorno pulmonar es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica

o el asma.