PT1615889E - Derivados de bifenilo com actividade agonista do receptor adrenérgico beta2 e antagonista do receptor muscarínico - Google Patents

Derivados de bifenilo com actividade agonista do receptor adrenérgico beta2 e antagonista do receptor muscarínico Download PDF

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PT1615889E
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Mathai Mammen
Sarah Dunham
Adam Hughes
Tae Weon Lee
Eric Stangeland
Yan Chen
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Description

DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE BIFENILO COM ACTIVIDADE AGONISTA DO RECEPTOR ADRENÉRGICO BETA2 E ANTAGONISTA DO RECEPTOR MUSCARÍNICO"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um novo derivado de bifenilo que é útil para o tratamento de distúrbios pulmonares. Esta invenção refere-se também a composições farmacêuticas compreendendo um tal derivado de bifenilo, processos e intermediários para preparar tal derivado de bifenilo e métodos de utilização de um tal derivado de bifenilo para tratar distúrbios pulmonares.
Estado da Técnica
Distúrbios pulmonares, tais como asma e doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD) , são normalmente tratados com broncodilatadores. Uma classe de broncodilatores de utilização frequente consiste em agonistas do receptor adrenérgico β2 (adrenoceptor), tais como albuterol, formoterol e salmeterol. Estes compostos são geralmente administrados por inalação. Outros exemplos de agonistas do receptor adrenérgico β2 são divulgados no documento WO 99/64031 e também no documento WO 99/64035. Outra classe de broncodilatadores consiste de antagonistas do receptor muscarinico (compostos 1 anticolinérgicos), tais como ipratrópio e tiotrópio. Estes compostos são também, tipicamente, administrados por inalação. Outros exemplos de antagonistas do receptor muscarinico são divulgados nos documentos WO 01/42212 e WO 01/42213.
As composições farmacêuticas contendo um agonista do receptor adrenérgico β2 e um antagonista do receptor muscarinico em simultâneo são também conhecidos na técnica para utilização no tratamento de distúrbios pulmonares. Por exemplo, a Patente U.S. N° 6433027 divulga composições de medicamentos contendo um antagonista do receptor muscarinico, tal como brometo de tiotrópio e um agonista do receptor adrenérgico β2, tal como o fumarato de formoterol.
Embora os compostos com actividade como agonistas do receptor adrenérgico β2 ou como antagonistas do receptor muscarinico sejam conhecidos, não foi previamente divulgado nenhum composto com actividade como agonista do receptor adrenérgico β2 e como antagonista do receptor muscarinico em simultâneo. Os compostos possuindo actividade como agonistas do receptor adrenérgico β2 e como antagonistas do receptor muscarinico em simultâneo são altamente desejáveis, uma vez que tais compostos bifuncionais irão proporcionar broncodilatação através de dois modos independentes de acção, embora apresentem farmacocinéticas de uma molécula única.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um novo derivado de bifenilo como definido na reivindicação 1 que é útil para o tratamento de distúrbios pulmonares. Entre outras propriedades, verificou-se 2 que o composto desta invenção possui actividade como agonista do receptor adrenérgico β2 e como antagonista do receptor muscarinico em simultâneo. A presente invenção refere-se a um composto particular de fórmula I:
I em que: a é 0 ou um número inteiro de 1 a 3; cada R1 é seleccionado, independentemente, de alquilo(1-4C), alcenilo(2-4C), alcinilo(2-4C), cicloalquilo(3-6C), ciano, halo, -0Rla, -C (0) 0Rlb, -SRlc, -S(0)Rld, -S(0)2Rle e -NRlfRlg; cada de Rla, Rlb, Rlc, Rld, Rle, Rlf e Rlg é, independentemente, hidrogénio, alquilo(1-4C) ou fenil-alquilo(1-4C); b é 0 ou um número inteiro de 1 a 3; cada R2 é seleccionado, independentemente, de alquilo(1-4C), alcenilo(2-4C), alcinilo(2-4C), cicloalquilo(3-6C), ciano, halo, -0R2a, -C (0) 0R2b, -SR2c, -S (0) R2d, -S(0)2R2e e -NR2fR2g; 3 cada de R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f e R2g é, independentemente, hidrogénio, alquilo(1-4C) ou fenil-alquilo(1-4C); W está ligado na posição 3 ou 4 relativamente ao átomo de azoto no anel de piperidina e representa 0 ou NWa;
Wa é hidrogénio ou alquilo(1-4C); c é 0 ou um número inteiro de 1 a 4; cada R3 é seleccionado, independentemente, de alquilo(1-4C), alcenilo(2-4C), alcinilo(2-4C), cicloalquilo(3-6C), ciano, halo, -0R3a, -C (0) 0R3b, -SR3c, -S(0)R3d, -S(0)2R3e e -NR3fR3g; ou dois grupos R3 são ligados para formar alcileno(1-3C), alcenileno(2-3C) ou oxirano-2,3-diilo; cada de R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f e R3g é, independentemente, hidrogénio ou alquilo(1-4C); R4 é um grupo divalente de fórmula: - (R4a) d- (A1) e- (R4b) f-Q- (R4c) g- (A2) h- (R4d) i-em que d, e, f, g, h e i são, cada, independentemente, seleccionados de 0 e 1; R4a, R4b, r4c e R4d são, cada, seleccionados independentemente de alcileno(1-10C), alcenileno(2-10C) e alcinileno(2-10C), em que cada um do grupo alcinilo, alcenileno ou alcinileno é não substituído ou substituído 4 com de 1 a 5 substituintes seleccionados independentemente de alquilo(1-4C), fluoro, hidroxilo, fenilo e fenil-alquilo(1-4C); A1 e A2 são, cada, seleccionados, independentemente, de cicloalcileno(3-7C), arileno(6-10C), -O-arileno(6-10C), arileno(6-10C)-0-, heteroarileno(2-9C), -O-heteroarileno(2-9C), heteroarileno(2-9C)-0- e heterocicleno(3-6C), em que cada cicloalcileno é não substituído ou substituído com de 1 a 4 substituintes seleccionados, independentemente, de alquilo(1-4C), e cada grupo arileno, heteroarileno ou heterocicleno é não substituído ou substituído com 1 a 4 substituintes seleccionados, independentemente, de halo, alquilo(1-4C), alcoxilo(1-4C), -S-alquilo(1-4C), -S(0)-alquilo(1-4C), —S (0) 2—siquilo(1—4C), -C(0)Oalquilo(1-4C), carboxilo, ciano, hidroxilo, nitro, trifluorometilo e trifluorometoxilo; Q é seleccionado de uma ligação, -0-, -C(0)0-, -0C(0)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -N(Qa)C(0)-, -C(0)N(Qb)-, -N(Qc)S(0)2-, -S (0) 2N (Qd) -, -N (Qe) C (0) N (Qf) -, -N (Qg) S (0) 2N (Qh) - , -00(0)Ν(04)-, -N(Qj)C(0)0- e -N(Qk);
Qa, Qb, Qc, Qd, Qe, Qf, Qg, Qh, Q1, Qj e Q k são, cada, seleccionados, independentemente, de hidrogénio, alquilo(1-6C), A3 e alcileno(1-4C)-A4, em que o grupo alquilo é não substituído ou substituído com 1 a 3 substituintes seleccionados, independentemente, de fluoro, hidroxilo e alcoxilo(1-4C) ; ou em conjunto com o átomo de azoto e o grupo R4b ou R4c ao qual estão ligados, formam um grupo azacicloalcileno de 4-6 membros; 5 A3 e A4 são, cada, seleccionados, independentemente, de cicloalquilo(3-6C), arilo(6-10C), heteroarilo(2-9C) e heterociclilo(3-6C), em que cada cicloalquilo é não substituído ou substituído com 1 a 4 substituintes seleccionados, independentemente, de alquilo(1-4C) e cada grupo arilo, heteroarilo ou heterociclilo é não substituído ou substituído com 1 a 4 substituintes seleccionados, independentemente, de halo, alquilo( 1-4C) e alcoxilo(1-4C); desde que o número de átomos contíguos na cadeia mais curta entre os dois átomos de azoto no qual R4 está ligado esteja na gama de 4 a 16; R5 representa hidrogénio ou alquilo(1-4C);
R6 é -NR6aCR5b(0) ou -CR6cR6dOR6e e R7 é hidrogénio; ou R6 e R7 em conjunto formam -NR7aC (0)-CR7b=CR7c-, -CR7d=CR7e-C(0)-NR7f-, -NR7gC(0)-CR7hR7i-CR7jR7k- OU -CR71R7m-CR7nR7o-C (0) -NR7p-; cada de R6a, R6b, R6c, R6d e R6e é, independentemente, hidrogénio ou alquilo(1-4C); e cada de R7a, R7b, R7c, R7d, R7e, R7f, R7g, R7h, R7i, P7j, R7k, R71, R7m, R7n, R7° e R7p é, independentemente, hidrogénio ou alquilo(1-4C); ou um seu sal ou solvato ou estereoisómero farmaceuticamente aceitável. 6
Noutro dos seus aspectos de composição, esta invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas podem conter, opcionalmente, outros agentes terapêuticos. Consequentemente, numa forma de realização, esta invenção refere-se uma tal composição farmacêutica em que a composição compreende também uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-inflamatório esteróide, tal como um corticosteróide. 0 composto desta invenção possui actividade como agonista do receptor adrenérgico β2 e como antagonista do receptor muscarínico, em simultâneo. Consequentemente, o composto da invenção é útil para o tratamento de distúrbios pulmonares, tais como asma e doença pulmonar obstrutiva crónica.
Consequentemente, o composto da invenção é útil num método para o tratamento de distúrbios pulmonares, o método compreendendo administrar a um doente com necessidade de tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
Além disso, o composto da invenção é útil num método de proporcionar broncodilatação a um doente, o método compreendendo administrar a um doente com necessidade de broncodilatação, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. 7 É também descrito um método de tratamento de doença pulmonar obstrutiva crónica ou asma, o método compreendendo administrar a um doente com necessidade de tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
Uma vez que o composto desta invenção possui actividade como agonista do receptor adrenérgico β2 e actividade como antagonista do receptor muscarinico, um tal composto é também útil como uma ferramenta de investigação. Consequentemente, ainda noutro dos seus aspectos do método, esta invenção refere-se a um método para utilizar o composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, como uma ferramenta de investigação para estudar um sistema biológico ou amostra, ou para descobrir novos compostos químicos com actividade como agonista adrenérgico β2 e actividade como antagonista do receptor muscarinico.
Esta invenção refere-se também ao composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, para utilização em terapia ou como um medicamento.
Além disso, esta invenção refere-se à utilização do composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, para a preparação de um medicamento; especialmente para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio pulmonar.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Num dos seus aspectos de composição, esta invenção refere-se a um novo derivado de bifenilo, ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou seus solvatos. Quando é aqui apresentado ou mencionado um estereoisómero particular, será entendido pelos especialistas na técnica que quantidades menores de outros estereoisómeros podem estar presentes nas composições desta invenção, a não ser que seja indicado o contrário, desde que a utilidade da composição como um todo não seja eliminado pela presença de tais outros isómeros.
Em particular, o composto da invenção contém um centro quiral no átomo de carbono indicado pelo simbolo * na seguinte fórmula:
OH
OH 0 átomo de carbono identificado pelo simbolo * tem a configuração (R) . É preferido para o composto da invenção ter a configuração (R) no átomo de carbono identificado pelo simbolo * ou ser enriquecido numa forma estereoisomérica com a configuração (R) neste átomo de carbono, de modo a optimizar a actividade como agonista adrenérgico β2 do composto desta invenção. 9 0 composto da invenção contém também vários grupos básicos (e. g.r grupos amino) e, deste modo, o composto pode existir como a base livre ou em várias formas de sal. Todas estas formas de sal estão incluídas no âmbito desta invenção. Além disso, os solvatos do composto da invenção ou os seus sais estão incluídos no âmbito desta invenção.
Além disso, quando aplicável, todos os isómeros cis-trans ou isómeros E/Z (isómeros geométricos), formas tautoméricas e formas topoisoméricas do composto da invenção estão incluídas no âmbito desta invenção, a não ser que especificado de outro modo. A nomenclatura aqui utilizada para denominar o composto desta invenção e seus intermediários tem, no geral, sido derivada utilizando o software AutoNom, disponível comercialmente (MDL, San Leandro, Califórnia). Tipicamente, os compostos de fórmula I, em que W é 0, têm sido denominados como derivados éster do ácido bifenil-2-ilcarbâmico. 0 composto desta invenção e também os compostos dos Exemplos comparativos 3 e 6 são compostos de fórmula V:
10 em que W, R4, R6 e R7 são como definido na Tabela I; ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
Tabela I
Ex. W R4 Rb R' Comparativo 3 0 - (ch2 )9- -NHC(0)CH=CH- Comparativo 6 0 -(CH2)2C(0)NH(CH2)5- -NHC(0)CH=CH- 25 0 - (CH2) 2C (O)NH (2-cloro-5-metoxifen-1,4-ileno)CH2- -NHC(0)CH=CH-
Definições
Ao descrever os compostos, composições, métodos e processos desta invenção, os seguintes termos têm os seguintes significados, excepto se indicado de outro modo. 0 termo "alquilo" significa um grupo hidrocarboneto saturado monovalente que pode ser linear ou ramificado. Excepto se definido de outro modo, tais grupos alquilo contêm, tipicamente, de 1 a 10 átomos de carbono. Os grupos alquilo representativos, incluem, a titulo de exemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo e semelhantes. O termo "alcileno" significa um grupo hidrocarboneto saturado divalente que pode ser linear ou ramificado. Excepto se indicado de outro modo, tais grupos alcileno contêm, tipicamente, de 1 a 10 átomos de carbono. Os grupos alcileno 11 representativos, incluem, a titulo de exemplo, metileno, etano-1,2-diilo ("etileno"), propano-1,2-diilo, propano-1,3-diilo, butano-1,4-diilo, pentano-1,5-diilo e semelhantes. 0 termo "alcoxilo" significa um grupo monovalente da fórmula (alquil)-O-, em que alquilo é como aqui definido. Os grupos alcoxilo representativos incluem, a titulo de exemplo, metoxilo, etoxilo, n-propoxilo, isopropoxilo, n-butoxilo, sec-butoxilo, isobutoxilo, tert-butoxilo e semelhantes. 0 termo "alcenilo" significa um grupo hidrocarboneto insaturado monovalente que pode ser linear ou ramificado e que tem, pelo menos, um e, tipicamente, 1, 2 ou 3, duplas ligações carbono-carbono. Excepto se indicado de outro modo, tais grupos alcenilo contêm, tipicamente, de 2 a 10 átomos de carbono. Os grupos alcenilo representativos incluem, a titulo de exemplo, etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-but-2-enilo, n-hex-3-enilo e semelhantes. O termo "alcenileno" significa um grupo alcenilo divalente. O termo "alcinilo" significa um grupo hidrocarboneto insaturado monovalente que pode ser linear ou ramificado e que tem, pelo menos, um e, tipicamente 1, 2 ou 3, triplas ligações carbono-carbono. Excepto se indicado de outro modo, tais grupos alcinilo contêm, tipicamente, de 2 a 10 átomos de carbono. Os grupos alcinilo representativos incluem, a titulo de exemplo, etinilo, n-propinilo, n-but-2-inilo, n-hex-3-inilo e semelhantes. O termo "alcinileno" significa um grupo alcinilo divalente. O termo "arilo" significa um hidrocarboneto aromático monovalente com um anel simples (í. e., fenilo) ou anéis 12 fundidos (í. e., naftaleno). Excepto se indicado de outro modo, tais grupos arilo contêm, tipicamente, de 6 a 10 átomos de carbono no anel. Os grupos arilo representativos incluem, a titulo de exemplo, fenilo e naftaleno-l-ilo, naftaleno-2-ilo e semelhantes. O termo "arileno" significa um grupo arilo divalente. O termo "azacicloalquilo" significa um anel heterocíclico monovalente contendo um átomo de azoto, i. e., um grupo cicloalquilo no qual um átomo de carbono foi substituído com um átomo de azoto. Excepto se indicado de outro modo, tais grupos azacicloalquilo contêm, tipicamente, de 2 a 9 átomos de carbono. Os exemplos representativos de um grupo azacicloalquilo são grupos pirrolidinilo e piperidinilo. O termo "azacicloalcileno" significa um grupo azacicloalquilo divalente. Os exemplos representativos de um grupo azacicloalcileno são grupos pirrolidinileno e piperidinileno. O termo "cicloalquilo" significa um grupo hidrocarboneto carbociclico saturado monovalente. Excepto se indicado de outro modo, tais grupos cicloalquilo contêm, tipicamente, de 3 a 10 átomos de carbono. Os grupos cicloalquilo representativos incluem, a titulo de exemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo e semelhantes. O termo "cicloalcileno" significa um grupo cicloalquilo divalente. O termo "halo" significa fluoro, cloro, bromo e iodo. O termo "heteroarilo" significa um grupo aromático monovalente com um anel simples ou dois anéis fundidos e contendo no anel, pelo menos, um heteroátomo (tipicamente, 1 a 3 heteroátomos) seleccionados de azoto, oxigénio ou enxofre. 13
Excepto se indicado de outro modo, tais grupos heteroarilo contêm, tipicamente, de 5 a 10 átomos no anel no total. Os grupos heteroarilo representativos incluem, a titulo de exemplo, espécies monovalentes de pirrole, imidazole, tiazole, oxazole, furano, tiofeno, triazole, pirazole, isoxazole, isotiazole, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina, triazina, indole, benzofurano, benzotiofeno, benzimidazole, benztiazole, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina e semelhantes, onde o ponto de ligação está em qualquer átomo de carbono ou azoto no anel. O termo "heteroarileno" significa um grupo heteroarilo divalente. O termo "heterociclilo" ou "heterocíclico" significa um grupo insaturado ou saturado monovalente (não-aromático) com um anel simples ou múltiplos anéis condensados e contendo no anel, pelo menos, um heteroátomo (tipicamente, 1 a 3 heteroátomos) seleccionados de azoto, oxigénio ou enxofre. Excepto se indicado de outro modo, tais grupos heterocíclicos contêm, tipicamente, de 2 a 9 átomos de carbono no anel no total. Os grupos heterocíclicos representativos incluem, a titulo de exemplo, espécies monovalentes de pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, piperidina, 1,4-dioxano, morfolina, tiomorfolina, piperazina, 3-pirrolina e semelhantes, onde o ponto de ligação está em qualquer átomo de carbono ou azoto disponível no anel. O termo "heterocicleno" significa um grupo heterocíclico ou heterociclilo divalente.
Quando é pretendido um número especifico de átomos de carbono, para um termo em particular aqui utilizado, o número de átomos de carbono é apresentado em parênteses, precedendo o termo. Por exemplo, o termo "alquilo(1-4C)" significa um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono. 14 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" significa um sal que é aceitável para administração a um doente, tal como um mamífero (e. g., sais com segurança aceitável para os mamíferos para um determinado regime de dosagem) . Tais sais podem ser derivados de bases orgânicas ou inorgânicas farmaceuticamente aceitáveis e de ácidos orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais derivados de bases inorgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem amónio, cálcio, cobre, férrico, ferroso, lítio, magnésio, manganico, manganoso, potássio, sódio, zinco e semelhantes. Particularmente preferidos são os sais de amónio, cálcio, magnésio, potássio e sódio. Os sais derivados de bases orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, incluindo aminas substituídas, aminas cíclicas, aminas de ocorrência natural e semelhantes, tais como arginina, betaína, cafeína, colina, Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperadina, resinas de poliamina, procaina, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina e semelhantes. Os sais derivados de ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem acético, ascórbico, benzenossulfónico, benzóico, canfossulfónico, cítrico, etanossulfónico, edisílico, fumárico, gentisico, glucónico, glucorónico, glutâmico, hipúrico, bromídrico, clorídrico, isetiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, mandélico, metanossulfónico, mucico, naftalenossulfónico, naftaleno-1,5-dissulfónico, naftaleno-2,6-dissulfónico, nicotínico, nítrico, orótico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenossulfónico, xinafóico e semelhantes. Particularmente 15 preferidos são o ácido cítrico, bromídrico, clorídrico, isetiónico, maleico, naftaleno-1,5-dissulfónico, fosfórico, sulfúrico e tartárico. 0 termo "seu sal do mesmo" significa um composto formado quando o hidrogénio de um ácido é substituído por um catião, tal como um catião metálico ou um catião orgânico e semelhantes. De um modo preferido, o sal é um sal farmaceuticamente aceitável, embora isto não seja necessário para sais dos compostos intermediários que não sejam para administração a um doente. 0 termo "solvato" significa um complexo ou agregado formado por uma ou mais moléculas de um soluto, i. e. um composto de fórmula I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e uma ou mais moléculas de um solvente. Tais solvatos são, tipicamente, sólidos cristalinos com uma proporção substancialmente fixa de soluto e solvente. Os solventes representativos incluem, a título de exemplo, água, metanol, etanol, isopropanol, ácido acético e semelhantes. Quando o solvente é água, o solvato formado é um hidrato.
Será evidente que o termo "ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou solvato ou estereoisómero" é entendido como incluindo todas as permutações de sais, solvatos e estereoisómeros, tais como um solvato de um sal farmaceuticamente aceitável de um estereoisómero de um composto de fórmula I. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade suficiente para o tratamento eficaz quando administrada a um doente com necessidade de tratamento. 16 0 termo "tratar" ou "tratamento", como aqui utilizado significa o tratamento de uma doença ou estado médico (tal como COPD) num doente, tal como um mamifero (particularmente um humano) que inclui: (a) prevenir a ocorrência de doença ou estado médico, í. e., tratamento profilático de um doente; (b) melhorar a doença ou estado médico, i. e., eliminar ou provocar a regressão da doença ou estado médico num doente; (c) suprimir a doença ou estado médico, i. e., abrandar ou interromper o desenvolvimento da doença ou estado médico num doente; ou (d) aliviar os sintomas da doença ou estado médico num doente. 0 termo "grupo de saída" significa um grupo funcional ou átomo que pode ser substituído por outro grupo funcional ou átomo numa reacção de substituição, tal como uma reacção de substituição nucleofílica. A título de exemplo, os grupos de saída representativos incluem os grupos cloro, bromo e iodo; grupos éster sulfónico, tais como mesilato, tosilato, brosilato, nosilato e semelhantes; e grupos aciloxilo, tais como acetoxilo, trifluoroacetoxilo e semelhantes. 0 termo "seus derivados protegidos" significa um derivado do composto especificado no qual um ou mais grupos funcionais do composto estão protegidos de reacções indesejadas com um grupo de protecção ou de bloqueio. Os grupos funcionais que podem ser protegidos incluem, a título de exemplo, grupos de ácido 17 carboxílico, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos tiol, grupos carbonilo e semelhantes. Os grupos de protecção representativos para ácidos carboxílicos incluem ésteres (tal como um éster p-metoxibenzilico), amidas e hidrazidas; para grupos amino, carbamatos (tal como terc-butoxicarbonilo) e amidas; para grupos hidroxilo, éteres e ésteres; para grupos tiol, tioéteres e tioésteres; para grupos carbonilo, acetais e cetais; e semelhantes. Tais grupos de protecção são bem conhecidos para os especialistas na técnica e são descritos, por exemplo, em T. W. Greene e G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Terceira Edição, Wiley, Nova Iorque, 1999 e referências ai citadas. 0 termo "grupo de protecção amino" significa um grupo de protecção adequado para prevenir reacções indesejadas num grupo amino. Os grupos de protecção amino representativos incluem, mas não estão limitados a, terc-butoxicarbonilo (BOC), tritilo (Tr), benziloxicarbonilo (Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), formilo, trimetilsililo (TMS), terc-butildimetilsililo (TBS), e semelhantes. 0 termo "grupo de protecção carboxilo" significa um grupo de protecção adequado para prevenir reacções indesejadas num grupo carboxilo. Os grupos de protecção carboxilo representativos incluem, mas não estão limitados a, ésteres, tais como metilo, etilo, terc-butilo, benzilo (Bn), p-metoxibenzilo (PMB), 9-fluroenilmetilo (Fm), trimetilsililo (TMS), terc-butildimetilsililo (TBS), difenilmetilo (benzi-hidrilo, dpm) e semelhantes. 0 termo "grupo de protecção hidroxilo" significa um grupo de protecção adequado para prevenir reacções indesejadas num grupo 18 hidroxilo. Os grupos de protecção hidroxilo representativos incluem, mas não estão limitados a, grupos sililo incluindo grupos tri-alquil(1-6C)sililo, tais como trimetilsililo (TMS), trietilsililo (TES), terc-butildimetilsililo (TBS) e semelhantes; ésteres (grupos acilo) incluindo grupos alcanoilo(1-6C), tais como formilo, acetilo e semelhantes; grupos arilmetilo, tais como benzilo (Bn), p-metoxibenzilo (PMB), 9-fluorenilmetilo (Fm), difenilometilo (benzidrilo, DPM) e semelhantes. Além disso, os dois grupos hidroxilo podem também ser protegidos como um grupo alquilideno, tal como prop-2-ilidina, formada, por exemplo, por reacção com uma cetona, tal como a acetona.
Composições Farmacêuticas e Formulações O composto desta invenção é tipicamente administrado a um doente, na forma de uma composição ou formulação farmacêutica. Tais composições farmacêuticas podem ser administradas ao doente através de qualquer via aceitável de administração incluindo, mas não limitado, aos modos de administração por inalação, oral, nasal, tópica (incluindo transdérmica) e parentérica. Será entendido que qualquer forma do composto desta invenção, (i. e., base livre, sal farmaceuticamente aceitável, solvato, etc.), que é adequado para o modo particular de administração, pode ser utilizado nas composições farmacêuticas aqui discutidas.
Consequentemente, num dos seus aspectos da composição, esta invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável ou excipiente e uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, tais 19 composições farmacêuticas podem conter outros agentes de formulação e/ou terapêuticos, se desejado.
As composições farmacêuticas desta invenção contêm, tipicamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da presente invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Tipicamente, tais composições farmacêuticas irão conter desde cerca de 0,01 a cerca de 95% em peso do agente activo; incluindo, desde cerca de 0,01 a cerca de 30% em peso; tal como desde cerca de 0,01 a cerca de 10% em peso do agente activo.
Qualquer veiculo ou excipiente convencional pode ser utilizado nas composições farmacêuticas desta invenção. A escolha de um veiculo ou excipiente particular, ou combinações de veículos ou excipientes, irão depender do modo de administração a ser utilizado para tratar um doente em particular ou tipo de estado médico ou estado de doença. Relativamente a isto, a preparação de uma composição farmaceuticamente adequada para um modo particular de administração está bem integrado no âmbito dos especialistas na técnica farmacêutica. Além disso, os ingredientes para tais composições estão disponíveis comercialmente de, por exemplo, Sigma, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. Como modo de posterior ilusttração, as técnicas de formulação convencionais são descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); e H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Edição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999) . 20
Os exemplos representativos de materiais que podem ser utilizados como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados aos seguintes: (1) açúcares, tais como lactose, glucose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; (9) óleos, tal como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girassol, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal como propilenoglicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietlenoglicol; (12) ésteres, tais como oleato de etilo e laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogénios; (17) solução salina isotónica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções de tampão de fosfatos; (21) gases propulsores comprimidos, tais como clorofluorocarbonos e hidrofluorocarbonos; e (22) outras substâncias não tóxicas compatíveis empregues nas composições farmacêuticas.
As composições farmacêuticas desta invenção são tipicamente preparadas misturando perfeitamente e intimamente ou envolvendo o composto da invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável e um ou mais ingredientes opcionais. Se necessário ou desejado, a mistura envolvida uniformemente resultante pode ser, depois, moldada ou carregada em comprimidos, cápsulas, pílulas, latas, cartuchos, dispensadores e semelhantes, utilizando processos convencionais e equipamentos. 21
Numa forma de realização, as composições farmacêuticas desta invenção são adequadas para administração por inalação. As composições farmacêuticas adequadas para administração por inalação irão, tipicamente, estar na forma de um aerossol ou um pó. Tais composições são, geralmente, administradas utilizando dispositivos de distribuição bem conhecidos, tais como um inalador de nebulização, um inalador de doseador (MDI), um inalador em pó seco (DPI) ou um dispositivo de distribuição semelhante.
Numa forma de realização especifica desta invenção, a composição farmacêutica compreendendo o agente activo é administrada por inalação, utilizando um inalador de nebulização. Tais dispositivos de nebulização produzem, tipicamente, uma corrente de ar de velocidade elevada que faz com que a composição farmacêutica compreendendo o agente activo seja vaporizada como uma névoa que é introduzida no tracto respiratório do doente. Consequentemente, quando formulada para utilização num inalador de nebulização, o agente activo é tipicamente dissolvido num veiculo adequado para formar uma solução. Alternativamente, o agente activo pode ser micronizado e combinado com um veiculo adequado para formar uma suspensão de partículas micronizadas de tamanho passivel de respiração, onde a micronização é, tipicamente, definida como tendo cerca de 90% ou mais de partículas com um diâmetro inferior a 10 pm. Os dispositivos nebulizadores adequados são proporcionados comercialmente, por exemplo, por PARI GmbH (Starnberg, Alemanha). Outros dispositivos de nebulização incluem Respimat (Boehringer Ingelheim) e aqueles diulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. N° 6123068 e WO 97/12687. 22
Uma composição farmacêutica representativa para utilização num inalador de nebulização, compreende uma solução aquosa isotónica compreendendo desde cerca de 0,05 pg/mL a cerca de 10 mg/mL do composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
Noutra forma de realização especifica desta invenção, a composição farmacêutica compreendendo o agente activo é administrada por inalação utilizando um inalador de pó seco. Tais inaladores de pó seco administram, tipicamente, o agente activo como um pó de fluxo livre que é disperso nas vias aéreas de um doente durante a inspiração. De modo a conseguir um pó de fluxo livre, o agente activo é, tipicamente, formulado com um excipiente adequado, tal como a lactose ou amido.
Uma composição farmacêutica representativa para utilização num inalador de pó seco compreende lactose seca, com um tamanho de partícula entre cerca de 1 pm e cerca de 100 pm, e partículas micronizadas do composto da invenção, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
Um tal Tais formulação de pó seco pode ser preparada, por exemplo, por combinação de lactose com o agente activo e, depois, envolvendo os componentes a seco. Alternativamente, se desejado, o agente activo pode ser formulado sem um excipiente. A composição farmacêutica é, depois, tipicamente, carregada num dispensador de pó seco ou em cartuchos de inalação ou cápsulas para utilização com um dispositivo de distribuição de pó seco.
Exemplos de dispositivos de distribuição de inalação de pó seco incluem Diskhaler (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC) (ver, e. g., Patente U.S. N° 5035237); Diskus 23 (GlaxoSmithKline) (ver, e. g., Patente U.S. N° 6378519); Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, DE) (ver, e. g., Patente U.S. N° 4524769); Rotahaler (GlaxoSmithKline) (ver, e. g., Patente U.S. N° 4353365) e Handihaler (Boehringer Ingelheim). Outros exemplos de dispositivos de DPI adequados são descritos na Patente U.S. N° 5415162, 5239993 e 5715810 e referências aqui citadas.
Ainda noutra forma de realização especifica desta invenção, a composição farmacêutica compreendendo o agente activo é administrada por inalação, utilizando um inalador dosimetrado. Tais inaladores doseadores descarregam, tipicamente, uma quantidade medida do agente activo ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, utilizando gás propulsor comprimido. Consequentemente, as composições farmacêuticas administradas utilizando um inalador dosimetrado compreendem, tipicamente, uma solução ou suspensão do agente activo num propulsor liquidificado. Qualquer propulsor liquidificado adequado pode ser empregue incluindo clorofluorocarbonos, tais como CC13F e hidrof luoroalcanos (HFA), tais como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) e 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano, (HFA 227). Devido às preocupações relativamente aos clorofluorocarbonos que afectam a camada do ozono, as formulações contendo HFA são, geralmente preferidas. Os componentes opcionais adicionais de formulações HFA incluem co-solventes, tais como etanol ou pentano e tensioactivos, tais como trioleato de sorbitano, ácido oleico, lecitina e glicerina. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5225183, EP 0717987 A2 e WO 92/22286.
Uma composição farmacêutica representativa para utilização num inalador dosimetrado, compreende desde cerca de 0,01% a 24 cerca de 5% em peso de um composto de fórmula I, ou um sal ou solvato ou estereoisómero farmaceuticamente aceitável; desde cerca de 0% a cerca de 20% em peso de etanol; e desde cerca de 0% a cerca de 5% em peso de tensioactivo; com restante sendo um propulsor de HFA.
Tais composições são, tipicamente, preparadas por adição de hidrofluoroalcano arrefecido ou pressurizado para um recipiente adequado contendo o agente activo, etanol (se presente) e o tensioactivo ( se presente). Para preparar uma suspensão, 0 agente activo é micronizado e, depois, combinado com o propulsor. A formulação é, depois, carregada numa lata de aerossol, que forma uma porção de um dispositivo inalador dosimetrado. São proporcionados exemplos de dispositivos de inalador dosimetrado, desenvolvidos especificamente para utilização com propulsores HFA nas Patentes U.S. N° 6006745 e 6143277. Alternativamente, uma formulação de suspensão pode ser preparada por secagem por vaporização de um revestimento de tensioactivo em partículas micronizadas do agente activo. Ver, por exemplo, documentos WO 99/53901 e WO 00/61108.
Para exemplos adicionais de processos de preparação de partículas passíveis de respiração e formulações e dispositivos adequados para dosagem por inalação ver as Patentes U.S. N° 6268533, 5983956, 5874063 e 6221398 e WO 99/55319 e WO 00/30614.
Noutra forma de realização, as composições farmacêuticas desta invenção são adequadas para administração oral. As composições farmacêuticas adequadas para administração oral podem estar na forma de cápsulas, comprimidos, pílulas, losangos, sinetes, drageias, pós, grânulos; ou como uma solução 25 ou suspensão num líquido aquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou água-em-óleo; ou como um elixir ou xarope; e semelhantes; cada contendo uma quantidade predeterminada de um composto da presente invenção como um ingrediente activo.
Quando se pretende a administração oral numa forma de dosagem sólida (i. e., como cápsulas, comprimidos, pílulas e semelhantes), as composições farmacêuticas desta invenção irão, tipicamente, compreender um composto da presente invenção como o ingrediente activo e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, tal como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio. Opcionalmente ou alternativamente, tais formas de dosagem sólidas podem compreender também: (1) enchimentos ou extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glucose, manitol e/ou ácido sílico; (2) ligandos, tais como carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e/ou acácia; (3) humidificantes, tais como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tais como agar-agar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos e/ou carbonato de sódio; (5) agentes de retardamento de solução, tal como parafina; (6) aceleradores de absorção, tal como compostos de amónio quaternário; (7) agentes de humidificação, tais como álcool cetílico e/ou monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como o caolino e/ou argila de bentonite; (9) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicois sólidos, laurilsulfato de sódio e/ou as suas misturas; (10) agentes corantes; e (11) agentes tamponantes.
Os agentes de libertação, agentes de humidificação, agentes de revestimento, adoçantes, aromatizante e agentes de perfume, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes nas 26 composições farmacêuticas desta invenção. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteina, bissulfato de sódio, metabissulfato de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes. Agentes de revestimento para comprimidos, cápsulas, pílulas e semelhantes; incluindo aqueles utilizados para revestimentos entéricos, tais como ftalato de acetato de celulose (CAP), ftalato de acetato de polivinilo (PVAP), ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, copolímeros de éster de ácido metacrílico-ácido metacrílico, trimelitato de acetato de celulose (CAT), carboximetiletilcelulose (CMEC), sucinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulose (HPMCAS) e semelhantes.
Se desejado, a composição farmacêutica da presente invenção pode também ser formulada para proporcionar libertação lenta ou controlada do ingrediente activo utilizando, a título de exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em várias proporções; ou outras matrizes poliméricas, lipossomas e/ou microesferas.
Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode, opcionalmente, conter agentes opacificantes e podem ser formulados de modo a que libertem apenas o ingrediente activo, ou, de um modo preferido, numa certa porção do tracto gastrointestinal, opcionalmente, de um modo sustido. Exemplos de composições combinadas que podem ser utilizadas incluem 27 substâncias poliméricas e ceras. 0 ingrediente activo pode estar também na forma micro-encapsulada, se apropriado, com um ou mais dos excipientes descritos acima.
As formas de dosagem liquidas adequadas para administração oral incluem, como meio de ilustração, emulsões farmaceuticamente aceitáveis, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Tais formas de dosagem liquidas compreendem, tipicamente, o ingrediente activo e um diluente inerte, tal como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsionantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, óleos (esp., óleos de semente de algodão, nozes, milho, gérmen, azeite, rícino e sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurilo, polietilenoglicois e ésteres de ácido gordo de sorbitano e as suas misturas. As suspensões, além do ingrediente activo, podem conter agentes de suspensão tais como, por exemplo, álcool isosterailo etoxilado, polioxietilenosorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidroxido de alumínio, bentonite, agar-agar e tragacanto e misturas do mesmo.
Quando é pretendida a administração oral, as composições farmacêuticas desta invenção são, de um modo preferido, embaladas numa forma de dosagem unitária. 0 termo "forma de dosagem unitária" significa uma unidade fisicamente discreta, adequada para administração a um doente, i. e., cada unidade contendo uma quantidade predeterminada do agente activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado sozinho ou em combinação com uma ou mais unidades adicionais. Por exemplo, 28 tais formas de dosagem unitária podem ser cápsulas, comprimidos, pilulas e semelhantes. O composto desta invenção pode também ser administrado transdermicamente utilizando sistemas de distribuição transdérmicos conhecidos e excipientes. Por exemplo, um composto desta invenção pode ser misturado com potenciadores de permeação, tais como propilenoglicol, monolaurato de polietilenoglicol, azacicloalcan-2-onas e semelhantes, e incorporados num adesivo ou sistema de distribuição semelhante. Os excipientes adicionais incluindo agentes de gelificação, emulsionantes e tampões, podem ser utilizados em tais composições transdérmicas, se desejado.
As composições farmacêuticas desta invenção podem conter também outros agentes terapêuticos que são co-administrados com o composto da invenção ou o seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, as composições farmacêuticas desta invenção podem compreender também um ou mais agentes terapêuticos seleccionados de outros broncodilatadores (e. g.r inibidores de PDE3, moduladores da adenosina 2b e agonista do receptor adrenérgico β2); agentes anti-inflamatórios (e. g. agentes anti-inflamatórios esteróides, tal como corticosteróides; agentes anti-inflamatórios não-esteróides (NSAID) e inibidores de PDE4) ; outros antagonistas do receptor muscarínico (í. e., agentes anticolinérgicos); agentes anti-infecciosos (e. g., antibióticos Gram positivos e Gram negativos ou antivirais); anti-histaminicos; inibidores da protease; e bloqueadores aferentes (e. g., agonista de d2 e moduladores da neurocinina). Os outros agentes terapêuticos podem ser utilizados na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos. Além disso, se apropriado, os outros 29 agentes terapêuticos podem ser utilizados como estereoisómeros opticamente puros.
Um agonista representativo do receptor adrenérgico β2 que pode ser utilizado em combinação com, e em adição ao composto desta invenção incluem, mas não estão limitados a, salmeterol, salbutamol, formoterol, salmefamol, fenoterol, terbutalina, albuterol, isoetarina, metaproterenol, bitolterol, pirbuterol, levalbuterol e semelhantes, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Outros agonistas do receptor adrenérgico β2 que podem ser utilizados em combinação com o composto desta invenção incluem, mas não estão limitados a, 3-(4—{ [6-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)-fenil]etiljamino)- hexil]oxi}butil)benzenossulfonamida e 3—(—3—{[7—({(2R)—2— hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}-amino)heptil]oxi}-propil)benzenossulfonamida e compostos relacionados divulgados no documento WO 02/066422, publicado a 29 de Agosto, 2002; 3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}amino)hexil]oxi Jbutil)-fenil]imidazolidina-2,4-diona e compostos relacionados divulgados no documento WO 02/070490, publicado a 12 de Setembro, 2002; 3-(4 — {[6-({(2R)-2-[3-(formilamino)-4- hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-benzenossulfonamida, 3—(4—{[6 —({(2 S)-2-[3-(formilamino)-4- hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-benzenossulfonamida, 3 —(4 — {[6 —({(2R/S)-2-[3-(formilamino)-4- hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-benzenossulfonamida, N-terc-butil)-3-(4—{[6-({(2R)-2-[3- (formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]-oxi}butil)benzenossulfonamida, N-(terc-butil)-3-(4 — {[6 —({ (2S)—2 — [3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)-hexil]oxijbutil)-benzenossulfonamida, N-(terc-butil)-3-(4-{[6- 30 ({(2R/S)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2- hidroxietil}amino)hexil]-oxi}butil)benzenossulfonamida e compostos relacionados divulgados no documento WO 02/076933, publicado a 3 de Outubro de 2002; 4-{(IR)-2-[(6 —{2—[(2, 6-diclorobenzil)oxi]etoxi}hexil)amino]-l-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol e compostos relacionados divulgados no documento WO 03/024439, publicado a 27 de Março, 2003; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Quando empregue, o agonista do adrenoreceptor β2 estará presente numa composição farmacêutica, numa quantidade terapeuticamente eficaz.
Tipicamente, o agonista do adrenoreceptor β2 estará presente numa quantidade suficiente para proporcionar desde cerca 0,05 pg a cerca de 500 pg por dose.
Os agentes anti-inflamatórios esteróides representativos que podem ser utilizados em combinação com o composto desta invenção incluem, mas não estão limitados a metilprednisolona, prednisolona, dexametasona, propionato de fluticasona, éster S-fluorometilico do ácido 6,9-difluoro-17-[ (2- furanilcarbonil)oxi]-ll-hidroxi-16-metil-3-oxoandrosta-l,4-dieno-17-carbotióico, éster S-(2-oxo-tetra-hidrofuran-3S-ilico) do ácido 6,9-difluoro-ll-hidroxi-16-metil-3-oxo-17- propioniloxiandrosta-1,4-dieno-17-carbotióico, ésteres de beclometasona (e. g., o éster de 17-propionato ou o éster de 17,21-dipropionato), budesonida, flunisolida, ésteres de mometasona (e. g., o éster de furoato), acetonida de triamcinolona, rofleponida, ciclesonida, propionato de butixocort, RPR-106541, ST-126 e semelhantes ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Quando empregue, o agente anti-inflamatório esteróide estará presente na composição farmacêutica numa quantidade terapeuticamente eficaz. Tipicamente, o agente anti-inflamatório esteróide estará 31 presente numa quantidade suficiente para proporcionar desde cerca de 0,05 pg a cerca de 500 pg por dose.
Outras combinações adequadas incluem, por exemplo, outros agentes anti-inflamatórios, e. g., NSAID (tais como cromoglicato de sódio; nedocromil sódio; inibidores da fosfodiesterase (pde) (e. g. teofilina, inibidores do PDE4 ou inibidores mistos de PDE3/PDE4); antagonistas do leucotrieno (e. g., montelucast); inibidores da síntese do leucotrieno; inibidores de iNOS; inibidores da protease, tais como inibidores da triptase e elastase; antagonistas da beta-2-integrina e agonistas ou antagonistas do receptor da adenosina (e. g., agonistas da adenosina 2a); antagonistas de citocina (e. g., antagonistas da quimocina, tais como um anticorpo da interleucina (anticorpo IL), especificamente, uma terapia com IL-4, uma terapia com IL-13 ou uma sua combinação); ou inibidores da síntese de citocina.
Por exemplo, os inibidores da fosfodiesterase-4 (PDE4) representativos ou inibidores mistos PDE3/PDE4 que podem ser utilizados em combinação com os compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados a ácido cis-4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclo-hexano-l-carboxílico, 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4- difluorometoxifenil)ciclo-hexan-l-ona; cis-[4-ciano-4-(3- ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclo-hexan-l-ol]; ácido cis-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]ciclo-hexano-l-carboxílico e semelhantes ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Outros PDE4 representativos ou inibidores mistos de PDE4/PDE3 incluem AWD-12-281 (elbion); NCS-613 (INSERM); D-4418 (Chiroscience e Schering-Plough); CI-1018 ou PD-168787 (Pfizer); os compostos benzodioxole divulgados no documento W099/16766 32 (Kyowa Hakko); K-34 (Kyowa Hakko) ; V-111294A (Napp); roflumilast (Byk-Gulden); os compostos ftalazinona divulgados no documento WO99/47505 (Byk-Gulden); Pumafentrine (Byk-Gulden, agora Altana) ; arofilina (Almirall-Prodesfarma); VM554/UM565 (Vernalis); T-440 (Tanabe Seiyaku); e T2585 (Tanabe Seiyaku).
Os antagonistas muscarinicos representativos (i. e., agentes anticolinérgicos) que podem ser utilizados em combinação, e em adição ao composto desta invenção incluem, mas não estão limitados a atropina, sulfato de atropina, óxido de atropina, nitrato de metilatropina, bromidrato de homatropina, bromidrato de hiosciamina (d,1), bromidrato de escopolamina, brometo de ipratrópio, brometo de oxitróio, brometo de tiotroópio, metantelina, brometo de propantelina, brometo de metilanisotropina, brometo de clidinio, copirrolato (Robinul), iodeto de isopropamida, brometo de mepenzolato, cloreto de ridi-hexetilo (Pathilone), metilsulfato de hexocíclio, cloridrato de ciclopentolato, tropicamida, cloridrato de tri-hexifenidilo, pirenzepina, telenzepina, AF-DX 116 e metoctramina e semelhantes, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; ou, para aqueles compostos apresentados como um seu sal, sal alternativo farmaceuticamente aceitável.
Os anti-histaminicos representativos (í. e., antagonistas do receptor Ηχ) que podem ser utilizados em combinação com o composto desta invenção incluem, mas não estão limitados a, etanolaminas, tal como maleato de carbinoxamina, fumarato de clemastina, cloridrato de difenil-hidramina e dimenidrinato; etilenodiaminas, tais como maleato de pirilamina, cloridrato de tripelenamina e citrato de tripelenamina; alquilaminas, tais como clorfeniramina e acrivastina; piperazinas, tais como cloridrato de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, cloridrato de 33 ciclizina, lactato de ciclizina, cloridrato de meclizina e cloridrato de cetirizina; piperidinas, tais como astemizole, cloridrato de levocabastina, loratadina ou o seu análogo descarboetoxilo, terfenadina e cloridrato de fexofenadina; cloridrato de azelastina; e semelhantes, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; ou, para aqueles compostos apresentados como um sal, um seu sal alternativo farmaceuticamente aceitável.
As doses adequadas para outros agentes terapêuticos administrados em combinação com o composto da invenção estão na gama de cerca de 0,05 g/dia a cerca de 100 mg/dia.
As formulações seguintes ilustram composições farmacêuticas representativas da presente invenção:
Exemplo de Formulação A
Um pó seco para administração por inalação é preparado como se segue:
Ingredientes Quantidade
Compostos da invenção 0,2 mg
Lactose 25 mg
Processo representativo: O composto da invenção é micronizado e, depois, misturado com lactose. Esta mistura envolvida é, depois, carregada num cartucho de inalação de gelatina. Os conteúdos do cartucho são administrados utilizando um inalador em pó. 34
Exemplo de formulação B
Uma formulação em pó seco para utilização num dispositivo de inalação em pó seco é preparado como se segue:
Processo representativo: Uma composição farmacêutica é preparada com uma proporção de formulação em volume de composto micronizado da invenção relativamente a lactose de 1:200. A composição é embalada num dispositivo de inalação em pó seco capaz de distribuição de entre cerca de 10 pg e cerca de 100 pg do composto da invenção por dose.
Exemplo de formulação C
Um pó seco para administração por inalação num inalador de dose dosimetrado é preparado como se segue:
Processo representativo: Uma suspensão contendo 5% em peso de um composto da invenção e 0,1% em peso de lecitina é preparada por dispersão de 10 g do composto da invenção como partículas micronizadas com tamanho médio inferior a 10 pm numa solução formada por 0,2 g de lecitina dissolvida em 200 mL de água desmineralizada. A suspensão é seca por vaporização e o material resultante é micronizado partículas com diâmetro médio inferior a 1,5 pm. partículas são carregadas em cartuchos com 1,1, tetrafluoroetano pressurizado. 35
Exemplo de formulação D
Uma composição farmacêutica para utilização num inalador de dose dosimetrada é preparada como se segue:
Processo representativo: Uma suspensão contendo 5% do composto da invenção, 0,5% de lecitina e 0,5% de trealose é preparada por dispersão de 5 g do ingrediente active como partículas micronizadas com tamanho médico inferior a 10 m numa solução coloidal formada de 0,5 g de trealose e 0,5 g de lecitina dissolvida em 100 mL de água desmineralizada. A suspensão é seca por vaporização e o material resultante é micronizado em partículas com um diâmetro médio inferior a 1,5 pm. As partículas são carregadas em recipientes com 1,1,1,2-tetrafluoroetano pressurizado.
Exemplo de formulação E
Uma composição farmacêutica para utilização num inalador nebulizador é preparada como se segue:
Processo representativo: Uma formulação aquosa de aerossol para utilização num nebulizador é preparada por dissolução de 0,1 mg do composto da invenção em um 1 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% acidificada com ácido cítrico. A mistura é agitada e sonicada até o ingrediente activo estar dissolvido. O pH da solução é ajustado para um valor na gama de cerca de 3 a 8 pela adição lenta de NaOH. 36
Exemplo de formulação F
As cápsulas de gelatina dura para administração oral são preparadas como se segue: ingredientes Quantidade
Composto da invenção 250 mg
Lactose (seca por vaporização) 200 mg
Estearato de magnésio 10 mg
Processo representativo: Os ingredientes são envolvidos intimamente e, depois, carregados numa cápsula de gelatina dura (460 mg da composição por cápsula).
Exemplo de formulação G
Uma suspensão para administração oral é preparada como se segue:
Ingredientes Quantidade Composto da invenção 1,0 g Ácido fumárico 0,5 g Cloreto de sódio 2,0 g Metilparabeno 0,15 g Propilparabeno 0,05 g Açúcar granulado 25,5 g Sorbitol (solução a 70%) 12,85 g Veegum k (Vanderbilt Co.) 1,0 g Aromatizante 0,035 mL Corantes 0,5 mg Água destilada q.s. para 100 mL 37
Processo representativo: Os ingredientes são misturados de modo a formar uma suspensão contendo 100 mg do ingrediente activo por 10 mL de suspensão.
Exemplo de formulação H
Uma formulação injectável é preparada como se segue:
Quantidade
0,2 g 2,0 mL q. s . para pH 4 q.s. para 20 mL ingredientes Composto da invenção
Solução tampão de acetato de sódio (0,4 M) HC1 (0,5 N) OU NaOH (0,5 N) Água (destilada, estéril)
Processo representativo: Os ingredientes acima são misturados e o pH é ajustado para 4 ± 0,5 utilizando HC1 0,5 N ou NaOH 0,5 N.
Utilidade O composto desta invenção possui actividade como agonista do receptor adrenérgico β2 e actividade como antagonista do receptor muscarinico em simultâneo e, deste modo, tal composto é útil para o tratamento de estados médicos mediados por receptores adrenérgicos β2 ou receptores muscarinicos, i. e., estados médicos que são melhorados por tratamento com um agonista do receptor adrenérgico β2 ou um antagonista do receptor muscarinico. Tais estados médicos incluem, a titulo de exemplo, distúrbios pulmonares ou doenças associadas com obstrução das vias aéreas reversíveis, tal como doença pulmonar obstrutiva 38 crónica (e. g., bronquite asmática e crónica e efisema), asma, fibrose pulmonar e semelhantes. Outros estados que podem ser tratados incluem trabalho de parto prematuro, depressão, insuficiência cardíaca congestiva, doenças de pele (e. g., doenças de pele inflamatórias, alérgicas, psoriáticas e proliferativas, estados em que a acidez péptica mais baixa é desejada (e. g., ulceração péptica e gástrica) e doenças prejudiciais do músculo.
Consequentemente, numa forma de realização, esta invenção é direccionada para o composto da invenção para utilização num método para o tratamento de distúrbio pulmonar, o método compreendendo administrar a um doente com necessidade de tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. Quando utilizado para tratar um distúrbio pulmonar, o composto desta invenção irá, tipicamente, ser administrado por inalação em doses múltiplas por dia, numa dose diária única ou uma dose semanal única. Geralmente, a dose para tratar um distúrbio pulmonar irá variar na gama desde cerca de 10 pg/dia a cerca de 200 pg/dia.
Quando administrado por inalação, o composto desta invenção tem, tipicamente, o efeito de proporcionar a broncodilatação. Consequentemente, noutro dos seus aspectos, esta invenção refere-se ao composto da invenção para utilização num método de proporcionar broncodilatação num doente, o método compreendendo administrar a um doente, com necessidade de brocodilatação, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. Geralmente, a dose para proporcionar broncodilatação irá variar desde cerca de 10 pg/dia a cerca de 200 pg/dia. 39
Numa forma de realização, esta invenção refere-se a um composto da invenção para utilização num método de tratamento de doença pulmonar obstrutiva crónica ou asma, o método compreendendo administrar a um doente com necessidade de tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. Quando utilizado para tratar COPD ou asma, o composto desta invenção irá, tipicamente, ser administrado por inalação em doses múltiplas por dia ou numa dose diária única. Geralmente, a dose para tratar COPD ou asma irá variar na gama desde cerca de 10 pg/dia a cerca de 200 pg/dia.
Como utilizado aqui, COPD inclui bronquite obstrutiva crónica e enfisema (ver, por exemplo, Barnes, Doença pulmonar obstrutiva crónica, N Engl J Med 2000: 343:269-78).
Quando utilizado para tratar um distúrbio pulmonar, o composto desta invenção é, opcionalmente, administrado em combinação com outros agentes terapêuticos. Em particular, por combinação dos compostos desta invenção com um agente anti-inflamatório esteróide (e. g., um corticosteróide), as composições farmacêuticas desta invenção podem proporcionar uma terapia tripla, i. e., agonista do receptor adrenérgico β2, antagonista do receptor muscarinico e actividade anti-inflamatória, utilizando apenas dois componentes activos. Uma vez que as composições farmacêuticas contendo dois componentes activos são, tipicamente, mais fáceis de formular relativamente às composições contendo três componentes activos, tais duas composições de componentes proporcionam uma vantagem significativa relativamente às composições contendo três componentes activos. Consequentemente, numa forma de realização particular, as composições farmacêuticas e métodos desta 40 invenção compreendem também uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-inflamatório esteróide. 0 composto desta invenção exibe actividade como antagonista do receptor muscarinico e actividade como agonista do receptor adrenérgico β2 em simultâneo. Consequentemente, entre outras propriedades, os compostos de particular interesse são aqueles que demonstraram um valor de constante de inibição Ki, para a ligação no receptor muscarinico M3 e um valor de EC50 para a actividade como agonista do receptor adrenérgico β2 inferior a cerca de 100 nM; particularmente inferior a 10 nM. Entre estes compostos, os compostos de interesse especial incluem aqueles com actividade muscarinica, expressa em termos de constante de inibição Ki para a ligação no receptor muscarinico M3, que é quase igual à actividade do composto agonista adrenérgico β2 expressa em termos da metade da concentração eficaz máxima EC50, como determinado nos ensaios in vitro aqui descritos, ou em ensaios semelhantes. Por exemplo, os compostos de particular interesse são aqueles com uma proporção de constante de inibição Ki para o receptor muscarinico M3 relativamente ao EC50 para o receptor adrenérgico β2, a variar desde cerca de 30:1 a cerca de 1:30; incluindo cerca de 20:1 a cerca de 1:20; tal como cerca de 10:1 a cerca de 1:10.
Num dos seus aspectos, a presente invenção proporciona também o composto da invenção para utilização num método de tratamento de um distúrbio pulmonar, o método compreendendo administrar a um doente com necessidade de tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto com actividade como antagonista do receptor muscarinico e como agonista do receptor adrenérgico β2 em simultâneo. Numa forma de realização deste método em particular, o composto administrado tem uma 41 constante de inibição Ki para o receptor muscarínico M3 que é inferior a cerca de 100 nM e metade da concentração eficaz máxima EC50 para agonismo do receptor adrenérgico β2 que é inferior a cerca de 100 nM. Noutra forma de realização, o método para o tratamento de um distúrbio pulmonar compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto para o qual a proporção da constante de inibição Ki para o receptor muscarínico M3 relativamente ao EC50 para agonismo do receptor adrenérgico β2 está entre cerca de 30:1 e cerca de 1:30.
Uma vez que o composto desta invenção possui actividade como agonista do receptor adrenérgico β2 e como antagonista do receptor muscarínico em simultâneo, tal composto é também útil como uma ferramenta de estudo para a investigação ou estudo de sistemas biológicos ou amostras com receptores adrenérgicos β2 ou receptores muscarínicos, ou para a descoberta de novos compostos com actividade como agonista do receptor adrenérgico β2 e como antagonista do receptor muscarínico em simultâneo. Tais sistemas ou amostras biológicas podem compreender receptores andrenérgicos β2 e/ou muscarínicos. Qualquer sistema ou amostra biológica adequada com receptores adrenérgicos β2 e/ou muscarínicos pode ser empregue em tais estudos que podem ser efectuados in vitro ou in vivo.
Os sistemas ou amostras biológicas representativos adequados para tais estudos incluem, mas não estão limitados a, células, extractos celulares, membranas plasmáticas, amostras de tecido, mamíferos (tais como murganhos, ratos; cobaios, coelhos, cães, porcos, etc.) e semelhantes.
Nesta forma de realização, um sistema ou amostra biológica compreendendo um receptor adrenérgico β2 ou um receptor 42 muscarínico, é colocado em contacto com uma quantidade de composto agonista do receptor adrenérgico β2 ou antagonista do receptor muscarínico, desta invenção. Os efeitos são, depois, determinados utilizando processos convencionais e equipamento, tal como ensaios de radioligando e ensaios funcionais. Tais ensaios funcionais incluem alterações mediadas por ligando no monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) extracelular, alterações mediadas por ligando na actividade da enzima adenililciclase (que sintetiza o cAMP), alterações mediadas por ligando na incorporação da guanosina 5'-0-(-tio)trifofato ([35S]GTP S) em membranas isoladas via permuta catalisada por receptor de [35S]GTP S para GDP, alterações mediadas por ligando em iões de cálcio intracelular livres (determinado, por exemplo, com um leitor de placas de imagiologia ligadas com fluorescência ou FLIPR® de Molecular Devices, Inc.). 0 composto da invenção irá agonizar ou provocar activação de um receptor adrenérgico β2 e antagonizar ou diminuir a activação dos receptores muscarínicos em qualquer um dos ensaios funcionais apresentados acima ou ensaios de natureza semelhante. A quantidade de composto utilizada nestes estudos irá, tipicamente, variar de cerca de 0,1 nanomolar a cerca de 100 nanomolar.
Além disso, o composto desta invenção pode ser utilizado como uma ferramenta de pesquisa para descobrir novos compostos que têm actividade como agonistas do receptor adrenérgico β2 e actividade como antagonistas do receptor muscarínico em simultâneo. Nesta forma de realização, os valores de ligação do receptor adrenérgico β2 e receptor muscarínico (por exemplo, como determinado por ensaios de remoção de radioligando in vitro) para um composto de teste ou um grupo de compostos de teste, é comparado com os valores de ligação do receptor adrenérgico β2 e receptor muscarínico para o composto desta invenção, para 43 identificar se estes compostos de teste que têm ligação quase igual ou superior do receptor adrenérgico β2 e/ou receptor muscarínico, se alguma. Este aspecto da invenção inclui, como formas de realização distintas, a geração dos dados comparativos (utilizando ensaios apropriados) e a análise dos dados de teste em simultâneo, para identificar os compostos de teste de interesse.
Estas propriedades e utilidades do composto desta invenção podem ser demonstradas utilizando vários ensaios in vitro e in vivo bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, os ensaios representativos são descritos em maior detalhe nos seguintes Exemplos.
EXEMPLOS
As seguintes Preparações e Exemplos são proporcionados para ilustrar formas de realização específicas desta invenção.
As seguintes abreviaturas têm os seguintes significados, a não ser que seja indicado o contrário e quaisquer outras abreviaturas aqui utilizadas e não definidas têm os seguintes significados convencionais: AC adenililciclase
Ach acetilcolina ATCC American Type Culture Collection BSA albumina de soro bovino 44
CAMP CHO CMS DCM DIPEA dPBS DMEM DMSO EDTA Emáx EtOAc EtOH FBS FLIPR Gly HATU monofosfato de adenosina 3'-5' cíclica
Ovário de hamster chinês receptor M5 de chimpanzé clonado diclorometano (í. e., cloreto de metileno) N, N-diisopropiletilamina solução salina concentrada tamponada com fosfato de Dulbecco
Meio Eagle modificado com Dulbecco sulfóxido de dimetilo ácido etilenodiaminotetraacético eficácia máxima acetato de etilo etanol soro de bovino fetálico leitor de placas de imagiologia fluorométrica glicina 0- (7-azabenzotriazol-l-il-N,Ν,Ν',Ν'-tetrametilurónio hexafluorofosfato 45
HBSS HEK HEPES hMi hM2 hM3 hM4 hM5 HPLC IBMX %Ef f PBS PyBOP rpm TFA THF solução salina tamponada de Hank células de rim embrionário humano ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossul fónico receptor M4 humano clonado receptor M2 humano clonado receptor M3 humano clonado receptor M4 humano clonado receptor M5 humano clonado cromatográfica líquida de elevado desempenho 3-isobutil-l-metilxantina % de eficácia solução salina tamponada com fosfato hexafluorofosfato de benzotriazol-1 iloxitripirrolidinofosfonio rotações por minuto ácido trifluoroacético tetra-hidrofurano
Tris tris(hidroximetil)aminometano
Excepto se indicado de outro modo, os reagentes, materiais de partida e solventes foram adquiridos de fornecedores comerciais (tais como Aldrich, Fluka, Sigma e semelhantes) e foram utilizados sem purificação posterior.
Nos exemplos descritos abaixo, a análise por HPLC foi conduzida utilizando um instrumento da Agilent (Paio Alto, CA) Série 1100 com colunas Zorbax Bonus RP 2,1 x 50 mm, fornecidas pela Agilent, (uma coluna C14), com um tamanho de partícula de 3,5 mícrones. A detecção foi efectuada por absorvância UV a 214 nm. Os dados de HPLC 10-70 foram obtidos com um caudal de 0,5 mL/minuto de 10%-70% de B durante 6 minutos. A fase móvel A foi de 2%-98% - 0,1% ACN-H2O-TFA; e a fase móvel B foi de 90%-10% - 0,1% ACN-H20-TFA. Utilizando as fases móveis A e B descritas acima, os dados de HPLC 5-35 e os dados de HPLC 10-90 foram obtidos com um gradiente de 5 minutos.
Os dados de espectrometria de massa e cromatográfica líquida (LCMS) foram obtidos com um instrumento da Applied Biosystems (Foster City, CA) modelo API-150EX. Os dados de LCMS 10-90 foram obtidos com uma fase móvel de B de 10%-90% durante um gradiente de 5 minutos. A purificação em pequena escala foi efectuada utilizando um sistema Prep Workstation API 150EX da Applied Biosystems. A fase móvel A: água + TFA a 0,05% v/v; e B: acetonitrilo + TFA a 0,05% v/v. Para os arrays (tipicamente, cerca de 3 a 50 mg de tamanho de amostra recuperada), foram utilizadas as seguintes condições: 20 mL/min de caudal; gradientes de 15 min e uma coluna 20 mm x 50 mm Prism RP com partículas de 5 mícrones (Thermo 47
Hypersil-Keystone, Bellefonte, PA) . Para purificações em larga escala (tipicamente superior a 100 mg de amostra em bruto), foram utilizadas as seguintes condições: 60 mL/min de caudal; gradientes de 30 min e coluna de 41,4 mm x 250 mm Microsorb BDS com partículas de 10 mícrones (Varian, Paio Alto, CA). A rotação específica para compostos quirais (indicado como p o [a] D) foi medida utilizando um polarimetro Jasco (Modelo P-1010) com uma fonte de luz de halogéneo de tungsténio e um filtro 589 nm a 20 °C. As amostras dos compostos de teste foram tipicamente determinadas a 1 mg/mL de água.
Preparação 6 8-Benziloxi-5- (2,2-di-hidroxiacetil) -lJí-quinolin-2-ona (a) 8-Acetoxi-lJí-quinolin-2-ona A 8-Hidroxiquinolina-N-óxida (160,0 g, 1,0 mol), comercialmente disponível de Aldrich, Milwaukee, WI e anidrido acético (800 mL, 8,4 mol) foram aquecidos a 100 °C, durante 3 h e, depois, arrefecidos em gelo. 0 produto foi recolhido num funil de Buchner, lavado com anidrido acético (2xl00mL) e seco sob pressão reduzida para proporcionar 8-acetoxi-lfí-quinolin-2-ona (144 g) como um sólido. (b) 5-Acetil-8-hidroxi-lH-quinolin-2-ona
Uma pasta de cloreto de alumínio (85,7 g, 640 mmol) em 1,2-dicloroetano (280 mL) foi arrefecida em gelo e o produto do 48 passo (a) (56,8 g, 280 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida para a temperatura ambiente e, depois, aquecida a 85 °C. Após 30 min, foi adicionado cloreto de acetilo (1,5 mL, 21 mmol) e a mistura foi aquecida durante mais 60 min. A mistura reaccional foi, depois, arrefecida e adicionada a ácido clorídrico 1 N (3 L), a 0 °C com boa agitação. Após agitação durante 2 h, os sólidos foram recolhidos num funil de Buchner, lavados com água (3 x 250 mL) e secos sob pressão reduzida. O produto em bruto isolado de vários lotes (135 g), foi combinado e triturado com diclorometano (4 L) durante 6 h. O produto foi recolhido num funil de Buchner e seco sob pressão reduzida, para proporcionar 5-acetil-8-hidroxi-2(1H)-quinolinona (121 g). (c) 5-Acetil-8-benziloxi-lJí-quinolin-2-ona
Ao produto do passo (b) (37,7 g, 186 mmol) foi adicionada N, N-dimetilformamida (200 mL) e carbonato de potássio (34,5 g, 250 mmol) seguido por brometo de benzilo (31,8 g, 186 mmol). A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 2,25 horas e, depois, vertida em cloreto de sódio saturado (3,5 L), a 0 °C e agitada durante 1 hora. O produto foi recolhido e seco, num funil de Buchner, durante 1 hora e os sólidos resultantes foram dissolvidos em diclorometano (2 L) e esta mistura foi seca sob sulfato de sódio. A solução foi filtrada através de um filtro de Celite que foi, depois, lavado com diclorometano (5 x 200 mL) . O filtrado combinado foi, depois, concentrado até à secura e os sólidos resultantes foram triturados com éter (500 mL) durante 2 h. O produto foi recolhido num funil de Buchner, lavado com éter (2 x 250 mL) e seco sob pressão reduzida para proporcionar 5-acetil-8-benziloxi-lff-quinolin-2-ona (44 g) como um pó. 49 (d) 8-Benziloxi-5-(2,2-di-hidroxiacetil)-lJí-quinolin-2-ona A uma pasta do produto do passo (c) (10,0 g, 34,1 mmol) em DMSO (60 mL) foi adicionada solução de ácido bromídrico a 48% p/p (11,8 mL, 102,3 mmol). A mistura foi aquecida para 60 °C, durante 16 h, depois, foi deixada a arrefecer para a temperatura ambiente. Foi adicionada água (100 mL) e a pasta resultante foi agitada, à temperatura ambiente, durante 0,5 h antes de ser arrefecida para 0 °C. O produto foi recolhido num funil de Buchner, depois, seco sob pressão reduzida para proporcionar 8-benziloxi-5-(2,2-di-hidroxiacetil)-lil-quinolin-2-ona (12,2 g), como um sólido.
Preparação 8 Éster Piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico O bifenil-2-isocianato (97,5 g, 521 mmol) e 4-hidroxi-l-benzilpiperidina (105 g, 549 mmol), ambos comercialmente disponíveis de Aldrich, Milwaukee, WI, foram aquecidos em conjunto a 70 °C, durante 12 h, tempo durante o qual a formação do éster l-benzilpiperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-
ilcarbâmico foi monitorizada por LCMS. A mistura reaccional foi, depois, arrefecida para 50 °C e foi adicionado etanol (1 L) e, depois, foi adicionado, lentamente, ácido clorídrico 6 M (191 mL). A mistura reaccional foi, depois, arrefecida para a temperatura ambiente e foi adicionado formato de amónio (98,5 g, 1,56 mol) e foi borbulhado vigorosamente azoto gasoso na solução durante 20 min. Foi, depois, adicionado paládio (10% em peso (base seca) em carbono activado) (20 g). A mistura reaccional foi aquecida a 40 °C, durante 12 h e, depois, filtrado através 50 de um filtro de Celite. 0 solvente foi, depois, removido sob pressão reduzida e foi adicionado ácido clorídrico 1 M (40 mL) ao resíduo em bruto. Foi, depois, adicionado hidróxido de sódio (10 N) para ajustar o pH para 12. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (2 x 150 mL) e seca (sulfato de magnésio) e, depois, o solvente foi removido sob pressão reduzida, para proporcionar o composto do título (155 g, 100%) . HPLC (10-70) Rt = 2,52; MS m/z: [M + H+] calculado para Ci8H2oN202 297,15; encontrado 297,3.
Preparação 13 8-Benziloxi-5-[(R)-2-bromo-l-(terc-butildimetilsilaniloxi) etil]-lJí-quinolin-2-ona (a) 8-Benziloxi-5-(2-Bromoacetil)-lH-quinolin-2-ona O 5-acetil-8-benziloxi-l/í-quinolin-2-ona (Preparação 6) (20,0 g, 68,2 mmol) foi dissolvido em diclorometano (200 mL) e arrefecido para 0 °C. Foi adicionado dietileterato trifluoreto de boro (10,4 mL, 82,0 mmol) via seringa e a mistura foi aquecida para a temperatura ambiente, para proporcionar uma suspensão espessa. A suspensão foi aquecida a 45 °C (banho de óleo) e foi adicionada uma solução de bromo (11,5 g, 72,0 mmol) em diclorometano (100 mL) durante 40 min. A mistura foi mantida a 45 °C, durante mais de 15 min e, depois, arrefecida para a temperatura ambiente. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e, depois, foi triturada com carbonato de sódio aquoso a 10% (200 mL) durante 1 hora. Os sólidos foram recolhidos num funil de Buchner, lavados com água (4 x 100 mL) e secos sob pressão reduzida. O produto de duas corridas foi combinado para 51 purificação. 0 produto em bruto (52 g) foi triturado com metanol a 50% em clorofórmio (500 mL) durante 1 hora. O produto foi recolhido num funil de Buchner e lavado com metanol a 50% em clorofórmio (2 x 50 mL) e metanol (2 x 50 mL). O sólido foi seco sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título (34,1 g) como um pó. (b) 8-Benziloxi-5-((R)-2-bromo-l-hidroxietil)-lH-quinolin-2- ona O (R)-(+)-a,a-difeniloprolinol (30,0 g, 117 mmol) e trimetilboroxina (11,1 mL, 78 mmol) foram combinados em tolueno (300 mL) e agitados à temperatura ambiente, durante 30 min. A mistura foi colocada num banho de óleo a 150 °C e o líquido foi removido por destilação. Foi adicionado tolueno em aliquotas de 20 mL e a destilação foi continuada durante 4 h. Foi adicionado um total de 300 mL de tolueno. A mistura foi, depois, arrefecida para a temperatura ambiente. Foi evaporada uma aliquota de 500 pL até à secura e foi pesada (246 mg), para determinar que a concentração do catalisador foi de 1,8 M. A 8-benziloxi-5-(2-bromoacetil)-l/í-quinolin-2-ona (90,0 g, 243 mmol) foi colocada sob azoto e foi adicionado tetra-hidrofurano (900 mL) seguido pelo catalisador descrito acima (1,8 M em tolueno, 15 mL, 27 mmol). A suspensão foi arrefecida para -10±5 °C num banho de gelo/isopropanol. Foi adicionado borano (1,0 M em THF, 294 mL, 294 mmol) durante 4 h. A reacção foi, depois, agitada durante mais 45 min a -10 °C e, depois, foi adicionado lentamente metanol (250 mL) . A mistura foi concentrada sob vácuo e o resíduo foi dissolvido em acetonitrilo em ebulição (1,3 L), filtrado enquanto quente e, 52 depois, arrefecido para a temperatura ambiente. Os cristais foram filtrados, lavados com acetonitrilo e secos sob vácuo para proporcionar o composto do título (72,5 g, 196 mmol, 81% de rendimento, 95% ee, 95% puro por HPLC). (c) 8-Benziloxi-5-[(R)-2-bromo-l-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-ltf-quinolin-2-ona
Ao produto do passo (b) (70,2 g, 189 mmol) foi adicionada N, W-dimetilf ormamida (260 mL) e esta mistura foi arrefecida num banho de gelo sob azoto. Foi adicionada 2,6-lutidina (40,3 g, 376 mmol) durante 5 min e, depois, foi adicionado, lentamente, trifluorometanossulfonato de terc-butildimetilsililo (99,8 g, 378 mmol) mantendo a temperatura abaixo dos 20 °C. A mistura foi deixada a aquecer para a temperatura ambiente, durante 45 min. Foi adicionado à mistura, gota a gota, metanol (45 mL) durante 10 min e a mistura foi particionada entre acetato de etilo/ciclo-hexano (1:1, 500 mL) e água/solução salina concentrada (1:1, 500 mL) . Os orgânicos foram lavados mais duas vezes com água/solução salina concentrada (1:1, 500 mL cada). Os orgânicos combinados foram evaporados sob pressão reduzida para proporcionar um óleo amarelo claro. Foram adicionadas duas porções separadas de ciclo-hexano (400 mL) ao óleo e a destilação foi continuada até ser formada uma pasta branca. Foi adicionado ciclo-hexano (300 mL) à pasta e os cristais brancos resultantes foram filtrados, lavados com ciclo-hexano (300 mL) e secos sob pressão reduzida, para proporcionar o composto do título (75,4 g, 151 mmol, 80% de rendimento, 98,6% de ee). 53
Preparação 14 Éster 1—{9—[(R)-2-(8-benziloxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)etilamino]nonil}piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico 0 produto da preparação 13 (3,9 g, 8,17 mmol) foi adicionado a uma solução do produto da preparação 11 (5,0 g, 11,4 mmol) em THF (20 mL), seguido por bicarbonato de sódio (2,0 g, 24,5 mmol) e iodeto de sódio (1,8 g, 12,2 mmol). A mistura reaccional foi aquecida para 80 °C, durante 72 h. A mistura reaccional foi, depois, arrefecida, diluída com diclorometano (20 mL) e a fase orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio saturado (2 x 50 mL) e solução salina concentrada (50 mL). A fase orgânica foi, depois, seca (sulfato de magnésio) e concentrada para proporcionar 6,5 g de um produto em bruto. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em silica gel eluida com metanol a 3% em diclorometano, para proporcionar o composto do titulo (1,4 g, 21% de rendimento).
Preparação 15 Éster 1-(9-[(R)-2-(8-Benziloxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]nonil}piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico O fluoreto de trietilamina de hidrogénio (376 pL, 2,3 mmol) foi adicionado a uma solução do produto da preparação 14 (1,3 g, 1,5 mmol) em THF (8 mL) e a mistura reaccional foi agitada, à temperatura ambiente. Após 5 h, a reacção estava completa, como determinado por análise de LCMS. A mistura reaccional foi, 54 depois, atenuada com NaOH 1 N até o pH ser de 14 e, depois, diluída com acetato de etilo (20 mL) e lavada com NaOH 1 N (20 mL) e solução salina concentrada (20 mL) . A fase orgânica foi, depois, separada, seca sob sulfato de magnésio e concentrada para proporcionar o composto do título (1,1 g).
Exemplo comparativo 3
Ditrifluoroacetato de Éster 1— {9— [ (J?)-2-Hidroxi-2-(8- hidroxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5- il)etilamino]nonil}piperidin-4-ílico do ácido Bifenil-2-ilcarbâmico
Uma solução do produto da preparação 15 (1,1 g, 1,5 mmol) foi enxaguada com azoto e foi adicionado paládio em carbono (10%, 110 mg). A mistura reaccional foi agitada sob hidrogénio à pressão do balão. A análise por LCMS mostrou que a reacção estava completa após 9 h. A mistura reaccional foi, depois, filtrada e concentrada para proporcionar um sólido amarelo. O sólido foi purificado por HPLC preparativa (5-30 durante 60 min) para proporcionar o composto do título (510 mg). MS ml z: [M + H+] calculado para C38H48N4O5 641,36 ; encontrado 641. Método de HPLC 10-70: 3,207. [a] 20D = -23,6 (c = 1,0 mg/mL, água). 55
Exemplo comparativo 3A
Ditrifluoroacetato de Éster 1—{9—[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}pi-peridin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico
Alternativamente, o composto do título foi preparado como se segue: (a) 9-Bromononanal A um frasco de fundo redondo de 100 mL, equipado com um agitador magnético, funil de adição e controlador de temperatura, sob azoto, foi adicionado 9-bromononanol (8,92 g, 40 mmol) e diclorometano (30 mL) . A mistura resultante foi arrefecida para 5 °C e foi adicionada uma solução de bicarbonato de sódio (0,47 g, 5,6 mmol) e brometo de potássio (0,48 g, 4 mmol) em água (10 mL). Foi adicionado o radical livre
2,2,6,6-tetrametil-l-piperidiniloxilo (TEMPO) (63 mg, 0,4 mmol) e, depois, foi adicionada, gota a gota, uma solução de lixívia de 10 a 13% (27 mL) através de um funil de adição a uma taxa de modo a que a temperatura fosse mantida a cerca de 8 °C ( + /- 2 °C) com um banho de gelo (durante cerca de 40 min) . Após ter terminado a adição de lixívia, a mistura foi agitada durante 30 min mantendo a temperatura a cerca de 0 °C. Foi adicionada uma solução de bissulfito de sódio (1,54 g) em água (10 mL) e a mistura resultante foi agitada, à temperatura ambiente, durante 30 min. As camadas da mistura foram, depois, separadas e a camada aquosa leitosa foi extraída com diclorometano (1 x 20 mL). As camadas de diclorometano combinadas foram, depois, lavadas com água (1 x 30 mL), secas (MgSCg), filtradas e concentradas sob pressão reduzida para proporcionar o 56 intermediário do titulo (8,3 g, 94% de rendimento), que foi utilizado sem purificação posterior no passo seguinte. (b) 9-Bromo-l,1-dimetoxinonana A um frasco de fundo Redondo de 100 mL foi adicionado 9-bromononanal (7,2 g, 32,5 mmol), metanol (30 mL) e trimetilortoformato (4 mL, 36,5 mmol). Foi adicionada uma solução de ácido clorídrico 4 N em dioxano (0,2 mL, 0,8 mmol) e a mistura resultante foi submetida a refluxo, durante 3 h. A mistura reaccional foi, depois, arrefecida para a temperatura ambiente e foi adicionado bicarbonato de sódio sólido (100 mg, 1,2 mmol). A mistura resultante foi concentrada para um quarto do volume original sob pressão reduzida e, depois, foi adicionado acetato de etilo (50 mL) . A camada orgânica foi lavada com água (2 x 40 mL), seca (MgS04), filtrada e concentrada sob pressão reduzida para proporcionar o intermediário do título (8,44 g, (97% de rendimento) como um líquido, que foi utilizado no passo seguinte sem purificação posterior. (c) Éster 1-(9,9-Dimetoxinonil)piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico A um frasco de fundo redondo de 50 mL com três tubuladuras foi adicionado éster piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (1 g, 3,38 mmol) e acetonitrilo (10 mL) para formar uma pasta. A esta pasta foi adicionado 9-bromo-l,l- dimetoxinonano (1,1 g, 1,3 mmol) e trietilamina (0,57 g, 4,1 mmol) e a mistura resultante foi aquecida a 65 °C, durante 6 h (a reacção foi monitorizada por HPLC até o material de 57 partida ser < 5%) . A mistura reaccional foi, depois, arrefecida para a temperatura ambiente e nesta altura a mistura formou uma pasta. Foi adicionada água (5 mL) e a mistura foi filtrada para recolher o sólido num polidor de vidro frita grosseiro. 0 sólido foi lavado com solução pré-misturada de acetonitrilo (10 mL) e água (5 mL) e, depois, com outra solução pré-misturada de acetonitrilo (10 mL) e água (2 mL). O sólido resultante foi seco ao ar para proporcionar o intermediário do título (1,37 g, 84%, pureza >96% por LC, RMN de 1H) como um sólido branco. (d) Éster l-(9-Oxononil)piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico A um frasco de fundo redondo de 500 mL, com um agitador magnético, foi adicionado éster 1-(9,9-dimetoxinonil)piperidin-4-ílico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (7,7 g, 15,9 mmol) e, depois, acetonitrilo (70 mL) e ácido clorídrico aquoso 1 M (70 mL) . A mistura resultante foi agitada, à temperatura ambiente, durante lhe, depois, foi adicionado diclorometano (200 mL) . Esta mistura foi agitada durante 15 min e, depois, as camadas foram separadas. A camada orgânica foi seca (MgSCh), filtrada e concentrada sob pressão reduzida para proporcionar o intermediário do título (6,8 g), que foi utilizado no passo seguinte sem purificação posterior. 58 (e) Éster 1-(9-{Benzil-[(R)-2-(8-bemiloxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)-2-(terc- butildimetilsilaniloxi) et il] aminojnonil) -piperidin-4-ílico do ácido Bifenil-2-ilcarbâmico A um frasco de fundo redondo de 300 mL, foi adicionado 5-R)-2-benzylamino-l-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-benziloxi-lH-quinolin-2-ona (5 g, 9,73 mmol), diclorometano (100 mL) e ácido acético glacial (0,6 mL, 10 mmol). Esta mistura foi arrefecida para 0 °C utilizando um banho gelado e foi adicionado éster 1-(9-oxononil)piperidin-4-ilico do ácido bifenil-2-ilcarbâmico (4,6 g, 9,73 mmol), com agitação. Esta mistura foi agitada, a 0 °C, durante 30 minutos e, depois, foi adicionado, em porções, triacetoxiboro-hidreto de sódio (6,15 g, 29 mmol) durante 15 minutos. A mistura reaccional foi agitada, a 0 0 até 10 °C, durante 2 horas e, depois, foi adicionada solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (50 mL) e esta mistura foi agitada durante 15 minutos. As camadas foram, depois, separadas e a camada orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio aquosa a 5% (50 mL), seca (MgS04), filtrada e concentrada sob pressão reduzida, para proporcionar o intermediário do titulo (8,5 g, 80% de pureza por HPLC), que foi utilizado sem purificação posterior. (f) Éster 1—{9—[(R)-2-(terc-Butildimetilsilaniloxi)-2-(8- hidroxilo-2-oxo-l,2-doidroquinolin-5- il)etilamino]nonil}piperidin+4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico A um frasco de fundo redondo de 200 mL, foi adicionado o intermediário do Passo E (8,5 g, 9 mmol), etanol (100 mL) e 59 ácido acético glacial (0,54 mL, 18 mmol) e esta mistura foi agitada, até o sólido estar dissolvido. A mistura reaccional foi purgada com hidrogénio durante 5 min e, depois, foi adicionado, paládio em carbono a 10% (1,7 g) . Esta mistura foi agitada, à temperatura ambiente enquanto foi lentamente borbulhado hidrogénio através da mistura reaccional, até ser observada uma conversão >95% por HPLC (cerca de 8-9 h). A mistura foi, depois, filtrada através de uma almofada de Celite e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatográfia de sílica gel (15 g de sílica/lg em bruto) utilizando MeOH a 5% em DCM/NH4OH a 0,5% (10 x 150 mL), MeOH a 8% em DCM/NH4OH a 0,5% (10 x 150 mL) e MeOH a 10% em DCM/NH4OH a 0,5% (10 x 150 mL). As fracções apropriadas foram combinadas e o solvente foi removido sob pressão reduzida mantendo a temperatura <35 °C para proporcionar o intermediário do título (4,05 g, 97% de pureza). (g) Éster 1-{9-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico A um frasco de fundo redondo de 200 mL foi adicionado o intermediário do Passo F (4,05 g, 5,36 mmol) e diclorometano (80 mL) e a mistura resultante foi agitada, até o sólido se dissolver. Foi adicionado tri-hidrofluoreto de trietilamina (2,6 mL, 16 mmol) e a agitação foi continuada, sob azoto, durante 18 a 20 h. Foi adicionado metanol (20 mL) e, depois, foi adicionado, lentamente, bicarbonato de sódio aquoso saturado (50 mL) e a mistura foi agitada durante 15 min. As camadas foram, depois, separadas e a camada orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio aquosa saturada (20 mL), seca 60 (MgS04), filtrada e concentrada sob pressão reduzida, para proporcionar o composto do título (3,5 g, 98% de pureza por HPLC), como um sólido amarelo.
Exemplo comparativo 3B
Sal do Ácido Naftaleno-1,5-dissulfónico do Éster 1—{9— [ (1¾) — 2-Hidroxi-2-(8-Hidroxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico 0 éster l-{9-[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-l, 2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]nonil}piperidin-4-ílico do ácido bif enil-2-ilcarbâmico (1,0 g, 1,56 mmol, base livre) foi dissolvido em metanol (10 mL; baixo conteúdo em água). Uma solução de ácido naftaleno-1,5-dissulfónico (0,45 g, 1,56 mmol) em metanol (5 mL; baixo teor em água) foi adicionada e a mistura reaccional foi agitada, a 30 °C, durante duas horas e, depois, à temperatura ambiente, de um dia para o outro (18 h) . A mistura pasta espessa resultante foi filtrada e o bolo filtrado foi lavado com metanol (5 mL) e, depois, seco, para proporcionar o composto do título (1,16 g, 80% de rendimento) como um sólido cristalino branco sujo. 61
Preparação 19 Éster Metílico do Ácido 3-[4-(Bifenil-2- ilcarbamoiloxi)piperidin-l-il]propiónico
Foi adicionado 1,3-bromopropionato de metilo (553 pL, 5,07 mmol) a uma solução agitada do produto da
Preparação 8 (1,00 g, 3,38 mmol) e DIPEA (1,76 mL, 10,1 mmol) em
acetonitrilo (34 mL) a 50 °C e a mistura reaccional foi aquecida a 50 °C de um dia para o outro. O solvente foi, depois, removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em diclorometano (30 mL). A solução resultante foi lavada com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (10 mL), seca (sulfato de magnésio) e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia em coluna (5-10% MeOH/DCM) para proporcionar o composto do título (905 mg, 70%) .
Preparação 20 Ácido 3-[4-(Bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-l-il] propiónico
Uma solução agitada do produto da Preparação 19 (902 mg, 2,37 mmol) e hidróxido de lítio (171 mg, 7,11 mmol) em 50% de THF/H20 (24 mL), foi aquecida a 30 °C, de um dia para o outro e, depois, acidificada com ácido clorídrico concentrado e 62 liofilizada para proporcionar o composto do título (~ 100% de rendimento, também contém sais de LiCl).
Preparação 21 Éster terc-Butílico do Ácido {5-[(R)-2-(8-Benziloxi-2-oxo-1,2-di-hidroquinolin-5-il)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)etilamino]pentil}carbâmico O produto da Preparação 13 (600 mg, 1,23 mmol) e N-terc-butoxicarbonil-1,5-diaminopentano (622 mg, 3,07 mmol) foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (1,23 mL) e aquecidos para 105 °C, durante 6 h. A mistura reaccional foi, depois, arrefecida e diluída com acetato de etilo (10 mL) e lavada com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (4 mL). A fase orgânica foi seca (sulfato de magnésio) e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia em coluna (5-10% de metanol/diclorometano), para proporcionar o composto do título (~100% de rendimento). 63
Preparação 22 5-[(R) -2-(5-Aminopentilamino)-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-benziloxi-lH-quinolin-2-ona
Uma solução do produto da Preparação 21 (800 mg, 1,31 mmol) em ácido trifluoroacético/diclorometano (25%, 12 mL), foi agitada, à temperatura ambiente, durante 1 hora. O solvente foi, depois, removido sob pressão reduzida e o resíduo em bruto foi dissolvido em diclorometano (15 mL) e lavado com hidróxido de sódio 1 N (8 mL). A fase orgânica foi separada, seca (sulfato de magnésio) e o solvente foi removido sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título (509 mg, 81% de rendimento durante 2 passo).
Preparação 23 Éster 1-(2—{5—[(R)-2-(8-Benziloxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil-amino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico
Ao produto da preparação 20 (417 mg, 1,13 mmol) e HATU
(430 mg, 1,13 mmol) foi adicionado o produto da Preparação 22 (458 mg, 0,90 mmol) em DMF (1,8 mL), seguida por DIPEA (204 pL, 1,17 mmol). A mistura reaccional foi agitada, a 50 °C, durante 12 h e, depois, o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo em bruto foi dissolvido em diclorometano (10 mL) . A solução resultante foi lavada com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (4 mL), seca (sulfato de
magnésio) e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia em coluna (5-10% de metanol/diclorometano e 0,5% de NH4OH), para proporcionar o composto do título (240 mg, 31% de rendimento).
Preparação 24 Éster 1—(2—{5—[(R)-2-(8-Benziloxi-2-oxo-l,2-di- hidroquinolin-5-il)-2-hidroxietilamino]pentilcarba-moil}etil)piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico A uma solução agitada do produto da Preparação 23 (240 mg, 0,28 mmol) em diclorometano (2,8 mL) foi adicionada tri-hidrofluoreto de trietilamina (91 pL, 0,56 mmol). A mistura reaccional foi agitada durante 10 h e, depois, diluída com diclorometano (10 mL) . A solução resultante foi, depois, lavada com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (5 mL) e, depois, a fase orgânica foi seca (sulfato de magnésio) e o solvente foi removido sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título (209 mg, 100% de rendimento).
Exemplo comparativo 6
Ditrifluoroacetato do Éster 1-(2-{5-[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]pentilcar-bamoiljetil)piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico A uma solução agitada do produto da preparação 24 (209 mg, 0,28 mmol) em etanol (2,8 mL), foi adicionado paládio (10% em peso (base seca) em carbono activado) (81 mg) e a mistura reaccional foi colocada sob uma atmosfera de hidrogénio e 65 agitada de um dia para o outro. A mistura reaccional foi, depois, filtrada e o solvente foi removido sob pressão reduzida. 0 resíduo em bruto foi purificado por HPLC preparativa para proporcionar o composto do título (58 mg) . HPLC (10-70) Rt = 2,30; MS m/z: [M + H+] calculada para C37H45N5O6 656,34; encontrado 656,6; [oí]20d = -6,5 (c=l,0 mg/mL, água).
Exemplo comparativo 6Ά Éster 1-(2—{5—[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-l, 2-di- hidroquinolin-5-il)etilamino]pentilcarbamoil}etil)piperldin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico
Alternativamente, o composto do título pode ser preparado como se segue: (a) 5-Cloropentanal A um frasco de fundo redondo de 2 L com três tubuladuras, equipado com um agitador magnético, funil de adição e temperatura controlada sob azoto, foi adicionado 5-cloropentanol (53 g, 0, 433 mol) e diclorometano (300 mL) . Esta mistura foi arrefecida para 5 °C e foi adicionada uma solução de bicarbonato de sódio (5 g, 0,059 mol) e brometo de potássio (5,1 g, 0,043 mol) em água (225 mL). Foi adicionado radical livre 2,2,6,6-tetrametil-l-piperidiniloxilo (TEMPO) (63 mg, 0,4 mmol) e, depois, foi adicionada, gota a gota, uma solução de lixívia de 10 a 13% (275 mL) através de um funil de adição a uma taxa tal que a temperatura fosse mantida a cerca de 8 °C (+/- 2 °C) com um banho de gelo (durante cerca de 45 min.). Após terminar a 66 adição da lixívia, a mistura foi agitada durante 30 min, mantendo a temperatura a cerca de 5 °C. Foi adicionada uma solução de bissulfito de sódio (4 g) em água (30 mL) e a mistura resultante foi agitada, à temperatura ambiente, durante 30 min. As camadas da mistura foram, depois, separadas e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (1 x 50 mL) . As camadas de diclorometano combinadas foram, depois, lavadas com água (1 x 50 mL), secas (MgS04), filtradas e concentradas sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título (53 g). O produto foi destilado a 65 °C/8 torr para proporcionar o composto do título (31,16 g) como um óleo laranja (pureza por GC de 70 a 80%) . 0 produto foi, depois, purificado por adição do material em bruto (4 g) a uma mistura de etanol (920 mL), acetato de etilo (12 mL) e água (4 mL) . Foi adicionado bissulfito de sódio (4 g) e a mistura foi aquecida para refluxo, durante 4 h e, depois, arrefecida para a temperatura ambiente e agitada durante 14 h à temperatura ambiente para formar uma pasta muito espessa. Os sólidos foram filtrados num filtro de frita grosseira, lavados com a mistura de solvente (5 mL) e os sólidos foram secos num filtro para proporcionar 8,4 g do aducto de bissulfito. Este material foi, depois, adicionado a MTBE (20 mL) e foi adicionado hidróxido de sódio aquoso 1 N (45 mL), com agitação vigorosa. A mistura bifásica resultante foi agitada vigorosamente até todos os sólidos se terem dissolvido (cerca de 15 min) e, depois, as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com MTBE (20 mL) e as camadas de MTBE combinadas foram secas (MgS04), filtradas e concentradas para proporcionar 3,46 g do composto do título, como um líquido incolor (pureza por GC >90%). 67 (b) 5-[(R)-2-[Benzil-(S-cloropentil)amino]-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-benziloxi-lH-quinolin-2-ona A um frasco de fundo redondo de 1 L com três tubuladuras foi adicionado o produto da preparação 28 (48,4 g, 94 mmol), diclorometano (400 mL) e ácido acético glacial (11,3 mL) . Esta mistura foi agitada, a 0 °C (banho de gelo) e o produto do passo (a) (12,5 g, 103,6 mmol) foi adicionado e a agitação continuada durante 15 min. Foi, depois, adicionado triacetoxiboro-hidredo de sódio (59,8 g, 282 mmol) em porções, durante um periodo de 15 min e a mistura resultante foi agitada, a 0 °C a 10°C durante 2 h. Foi, depois, adicionada, lentamente, solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (200 mL) (evolução gasosa) e a agitação foi continuada durante 15 min. O pH da solução foi, depois, ajustado com carbonato de sódio sólido para um pH de cerca de 9 e as camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio aquoso a 5% (200 mL), seca (MgS04), filtrada e concentrada sob pressão reduzida para proporcionar o composto do titulo (53 g). (c) 5-[(R) -2-[(5-N-N-Diformilaminopentil)benzilamino]-1- (terc-butildimetil-silaniloxi)etil]-8-benziloxi-lH-quinolin-2-ona A uma solução agitada do produto do passo (b) (26,5 g, 42,8 mmol) em l-metil-2-pirrolidinona (175 mL) foi adicionado dif ormilamida de sódio (6,1 g, 64,2 mmol) e iodeto de sódio (2,13 g, 14,3 mmol). O frasco reaccional foi enxaguado com azoto e, depois, a mistura foi aquecida para 65 °C, durante 8 h. A mistura foi, depois, arrefecida para a temperatura ambiente e foi adicionada água (300 mL) e acetato de etilo (100 mL) . Esta 68 mistura foi agitada durante 10 min e, depois, as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (150 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (300 mL), solução salina aquosa concentrada a 50% (300 mL), água (300 mL), seca (MgS04) filtrada e concentrada para proporcionar o composto do título (23,3 g) . (d) 5-[(R)-2-[(5-Aminopentil)benzilamino]-1-(terc- butildimetilsilaniloxi)etil]-8-benziloxi-lH-quinolin-2-ona A uma solução agitada do produto do passo (c) (10,5 g, 16 mmol) em metanol (75 mL), foi adicionado ácido p-toluenossulfónico (7,42 g, 39 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 40 °C, durante 15 h e, depois, concentrada sob pressão reduzida para cerca de metade do seu volume. Foi adicionado metanol (70 mL) e a mistura foi aquecida a 50 °C, durante 2 h e, depois, concentrada sob pressão reduzida. Foi adicionada água (100 mL), metanol (50 mL) e MTBE (100 mL) e esta mistura foi agitada durante 15 min e, depois, as camadas foram separadas. À camada aquosa foi adicionado hidróxido de sódio aquoso 1 N (45 mL) e MTBE (100 mL), e esta mistura foi agitada durante 15 min. As camadas foram, depois, separadas e a camada aquosa foi extraída com MTBE (100 mL). As camadas de MTBE combinadas foram secas (MgS04), filtradas e concentradas para proporcionar o composto do título como um óleo amarelo (7,3 g) . Este material continha cerca de 13% (por HPLC) do composto des-terc-butildimetilsililo correspondente. 69 3-[4-(bifenil-2-ilcarbamoiloxi)pipendin-l- (e) Ácido il]propiónico A uma solução do produto da Preparação 8 (50 g, 67,6 mmol) em diclorometano (500 mL), foi adicionado ácido acrílico (15,05 mL, 100 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 50 °C sob refluxo, durante 18 h e, depois, o solvente foi removido. Foi adicionado metanol (600 mL) e esta mistura foi aquecida a 75 °C, durante 2 h e, depois, arrefecida para a temperatura ambiente para formar uma pasta espessa. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com metanol (50 mL) e seco ao ar para proporcionar o composto do título (61 g, >96% de pureza) como um pó branco. (f) Éster 1-[2-(5-{Benzil-[(R)-2-(8-benziloxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)-2-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]amino}-pentilcarbamoil)etil]piperdin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico
Uma mistura do produto do passo (e) (3,68 g, 10 mmol) e N,N-dimetilformamida (50 mL) foi aquecida a 60 °C até o sólido estar completamente dissolvido e foi, depois, arrefecido para a temperatura ambiente. O produto do passo (d) (6 g, 10 mmol) e
foi adicionado diisopropiletilamina (3,5 mL) e a mistura reaccional foi arrefecida para 0 °C. Foi adicionado PyBOP (6,25 g, 12 mmol) numa porção e a mistura reaccional foi agitada, a 0 °C para a temperatura ambiente, durante 2 horas. A mistura reaccional foi, depois, vertida em água fria (500 mL), com agitação, e o pH da mistura resultante foi ajustado para cerca de 2, utilizando ácido clorídrico 1 M aquoso. Esta mistura foi agitada durante 15 min e, depois, filtrada para recolher o 70 sólido, que foi lavado com água (100 mL) e seco para proporcionar o composto do título (8,7 g, pureza por HPLC >95%) como um sólido branco sujo. (g) Éster 1-(2—{5—[(R)-2-Hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]pentilcarbamoil}etil)piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbaâmico O produto do passo (f) pode ser desprotegido utilizando essencialmente os mesmos processos que os descritos para a Preparação 24 e exemplo comparativo 6, para proporcionar o composto do título.
Preparação 28 8-Benziloxi-5-[(R)-2-(N-benzilamino)-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-lH-quinolin-2-ona
Uma solução agitada do produto da Preparação 13 (1,00 g, 2,05 mmol) e benzilamina (493 pL, 4,51 mmol) em DMSO (1,7 mL) foi aquecida para 105 °C, durante 4 h. A mistura reaccional foi deixada a arrefecer e foi, depois, diluída com EtOAc (10 mL) e a camada orgânica foi lavada com solução de cloreto de amónio aquosa saturada (5 mL) e hidróxido de sódio 1 N (5 mL), seca (MgS04) e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia em coluna (EtOAc/hexanos 50%) para proporcionar o composto do título (700 mg, 67%). MS m/z: [M + H+] calculado para C31H38N2O3SÍ 515,27; encontrado 515,5. 71
Preparação 93 4-Amino-5-cloro-2-metoxibenzoato de metilo A uma solução do ácido 4-amino-5-cloro-2-metoxibenzóico (1, 008 g, 5,0 mmol) numa mistura de tolueno (9 mL) e metanol (1 mL) a 0 °C, foi adicionado, gota a gota, (trimetilsilil)diazometano (2,0 M em hexano, 3,0 mL, 6,0 mmol). A mistura reaccional foi, depois, aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante 16 h. O (trimetilsilil)diazometano em excesso foi atenuado por adição de ácido acético até desaparecer a cor amarelo claro da mistura reaccional. A mistura foi, depois, concentrada in vacuo para proporcionar o composto do titulo como um sólido branco sujo que foi utilizado sem purificação posterior.
Preparação 94 4-Acriloilamino-5-cloro-2-metoxibenzoato de Metilo
Ao produto em bruto da Preparação 93 foi adicionado diclorometano (10 mL, 0,5 M) e trietilamina (2,1 mL, 15 mmol). Esta mistura foi arrefecida para 0 °C e foi adicionado, gota a gota, cloreto de acriloilo (812 pL, 10 mmol), com agitação. Após 2 h, a reacção foi atenuada por adição de metanol (cerca de 2 mL) a 0 °C e a mistura resultante foi agitada, à temperatura ambiente, durante 15 min e, depois, concentrada in vacuo. Foi adicionado diclorometano (30 mL) e água (30 mL) ao resíduo e esta mistura foi misturada intimamente. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (20 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas (Na2S04), 72 filtradas e o solvente foi removido in vacuo para proporcionar o composto do titulo como um sólido espumoso castanho que foi utilizado sem purificação posterior.
Preparação 95 4-{3-[4-(Bifenil-2-ilcarbamoiloxi)piperidin-l-il]propionilamino}-5-cloro-2-metoxibenzoato de metilo
Ao produto em bruto da Preparação 94 foi adicionado o produto da preparação 8 (1,33 g, 4,5 mmol) e uma mistura de THF (22,5 mL) e metanol (2,5 mL) . Esta mistura foi aquecida a 50 °C com agitação durante 16 h e, depois, o solvente foi removido in vacuo. O residuo foi submetido a cromatografia (sílica gel; EtOAc), para proporcionar o composto do título (0,82 g; Rf = 0,4, 29% de rendimento durante 3 passos) como um sólido espumoso branco sujo. MS ml z 566.4 (M+H, esperado 565,20 para C30H32CIN3O6) .
Preparação 96 Éster 1-[2-(2-Cloro-4-hidroximetil-5-metoxifenilocarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico A uma solução do produto da preparação 95 (0,82 mg, 1,45 mmol) numa mistura de THF (4,5 mL) e metanol (0,5 mL) a 0 °C, foi adicionado boro-hidreto de lítio (32 mg, 1,45 mmol). A mistura reaccional foi deixada a aquecer para a temperatura ambiente e foi agitada durante 41 h. A reacção foi, depois, 73 atenuada por adição de ácido clorídrico aquoso 1 N a 0 °C até não ser observado mais borbulhamento e esta mistura foi agitada durante 10 min. O solvente foi removido in vácuo e o resíduo foi dissolvido em acetonitrilo (cerca de 2 mL). Esta solução foi purificada por prep-RP-HPLC (gradiente: 2 para 50% de acetonitrilo em água com 0,05% de tfa). As fracções apropriadas foram recolhidas e combinadas e liofilizadas para proporcionar o composto do título como um sal de trifluoroacetato. Este sal foi tratado com acetato de isopropilo (10 mL) e hidróxido de sódio aquoso 1 N (10 mL) e a camada orgânica foi recolhida, seca (Na2S04), filtrada e o solvente foi removido in vacuo para proporcionar o composto do título (161 mg, 21% de rendimento) como um sólido espumoso branco. MS m/z 538.4 (M+H, esperado 537,20 para C29H32CN3O5) .
Preparação 97 Éster de l-[2-(2-Cloro-4-formil-5-metoxifenilocarbamoíl)-etil]piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico A uma solução do produto da preparação 96 (161 mg, 0,3 mmol) em diclorometano (3 mL), foi adicionado sulfóxido de dimetilo (213 pL, 3,0 mmol) e diisopropiletilamina (261 pL, 1,5 mmol). Esta mistura foi arrefecida para 20 °C e foi adicionado, lentamente, complexo de trióxido sulfuroso de piridina (238 mg, 1,5 mmol). Após 30 min, a mistura reaccional foi atenuada por adição de água (cerca de 3 mL) . As camadas foram separadas e a camada orgânica foi seca (Na2S04), filtrada e o solvente foi removido in vacuo para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo claro. MS m/z 536,3 (M+H, esperado 535,19 para C29H3oC1N305 ) . 74
Preparação 98 Éster 1—[2—(4—{[(R)-2-(terc-Butildimetilsilaniloxi)-2-(8- hidroxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-2-cloro-5-metoxifenilocarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico
Ao produto da Preparação 97 numa mistura de diclorometano (0,5 mL) e metanol (0,5 mL), foi adicionado acetato de 5-[(£)-2-amino-1-(terc-butildimetilsilaniloxi)etil]-8-hidroxi-lH-quinolin-2-ona (124,1 mg, 3,1 mmol) e a mistura resultante foi agitada, à temperatura ambiente, durante 1,5 h. Foi adicionado triacetoxiboro-hidreto de sódio (190,7 mg, 0,9 mmol) e a mistura resultante foi agitada, à temperatura ambiente, durante 15 h. A reacção foi atenuada por adição de água (cerca de 0,2 mL) e a mistura foi concentrada in vacuo para proporcionar o composto do titulo que foi, depois, utilizado sem purificação posterior. MS m/z 854.5 (M+H, esperado 853,36 para C46H56CIN5O7SÍ) .
Exemplo 25
Ditrifluoroacetato do Éster l-[2-(2-Cloro-4-{[(J?)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-l,2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]pipendin-4-ílico do Ácido ifenil-2-ilcarbâmico A uma suspensão do produto da Preparação 98 em diclorometano (1,0 mL, 0,3 M), foi adicionado tri-hidrofluoreto de trietilamina (245 pL, 1,5 mmol). Esta mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 45 h e, depois, a mistura foi concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido numa mistura de 75 DMF (0,5 mL), acetonitrilo/água (1:1, com 0,1% de TFA, 0,6 mL), TFA (0,3 mL) e acetonitrilo (cerca de 1 mL) e esta mistura foi purificada por prep-RP-HPLC (gradiente: 2 a 50% de acetonitrilo em água com TFA a 0,05%). As fracções apropriadas foram recolhidas e combinadas e liofilizadas para proporcionar o composto do titulo (100 mg, 34% de rendimento, 98,7% de pureza por HPLC) como um sólido branco sujo. MS m/z 740,5 (M+H, esperado 739,28 para C40H42CIN50O7) .
Preparação A
Cultura Celular e Preparação de Membranas das Células Expressando Receptores adrenérglcos Humanos βι, β2 ou β3
As linhas celulares de ovário de hamster chinês (CHO) expressando, de um modo estável, os receptores adrenérgicos humanos βι, β2 ou β3 clonados, respectivamente, foram crescidas para perto da confluência em meio Hams F-12 com 10% de FBS na presença de Geneticina a 500 pg/mL. A monocamada de células foi removida com EDTA 2 mM em PBS. As células foram sedimentadas por centrifugação a 1000 rpm e os sedimentos celulares foram armazenados congelados a -80 °C ou foram preparadas membranas para utilização imediata. Para preparação de membranas expressando o receptor βι e β2, os sedimentos celulares foram resuspensos em tampão de lise (HEPES 10 mM /HC1, EDTA 10 mM, pH 7,4 a 4 °C) e homogeneizados utilizando um homogeneizador de vidro Dounce bem ajustado (30 golpes) em gelo. Para as membranas expressando o receptor β3 mais sensíveis a protease, os sedimentos celulares foram homogeneizados em tampão de lise (Tris 10 mM/HCl, pH 7,4) suplementado com uma pastilha de "Pastilhas de Cocktail Inibidor de Protease Completo com EDTA 2 76 mM" por 50 mL de tampão (Catálogo da Roche N° 1697498, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). O homogenato foi centrifugado a 20000 x g e o sedimento resultante foi lavado uma vez com tampão de lise, por ressuspensão e centrifugação, como acima. O sedimento final foi, depois, resuspenso em tampão de ensaio de ligação gelado (Tris 75 mM/HCl pH 7,4, MgCl2 12,5 mM, EDTA 1 mM). A concentração proteica da suspensão de membrana foi determinada pelos métodos descritos em Lowry et al., 1951, Journal of Biological Chemistry, 193, 265; e Bradford, Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-54. Todas as membranas foram armazenadas congeladas em aliquotas a 80 °C ou utilizadas imediatamente.
Preparação B
Cultura Celular e Preparação de Membranas das Células Expressando Receptores Muscarínicos Humanos Mi, m2, M3 e M4
As linhas celulares CHO expressando, de um modo estável, os subtipos de receptores muscarínicos humanos clonados hMx, hM2, hM3 e hM4, respectivamente, foram crescidos para perto da confluência em meio HAM F-12 suplementado com 10% de FBS e Geneticina a 250 pg/mL. As células foram crescidas numa incubadora a 5% de C02, 37 °C e removidos com EDTA 2 mM em dPBS. As células foram recolhidas por uma centrifugação de 5 minutos a 650 x g e os sedimentos celulares foram armazenados congelados a -80 °C ou foram preparadas membranas para utilização imediata. Para a preparação de membranas, os sedimentos celulares foram ressuspensos em tampão de lise e homogeneizados com um disruptor de tecidos Polytron PT-2100 (Kinematica AG; 20 segundos x 2 repetições). As membranas em bruto foram centrifugadas a 40000 77 x g durante 15 minutos a 4 °C. 0 sedimento membranar foi, depois, ressuspenso com tampão de ressuspensão e homogeneizado de novo com o disruptor de tecidos Polytron. A concentração proteica da suspensão membranar foi determinada pelo método descrito em Lowry et al., 1951, Journal of Biochemistry, 193, 265. Todas a membranas foram armazenadas congeladas em aliquotas a -80 °C ou utilizadas imediatamente. As aliquotas das membranas do receptor hM5 preparadas foram adquiridas directamente de Perkin Elmer e armazenadas a -80 °C até utilização.
Processo de Teste do Ensaio A
Ensaio de Ligação de Radioligando para Receptores Adrenérgicos Humanos βι, β2 e β3
Os ensaios de ligação foram efectuados em placas de microtitulação de 96 poços num volume total de ensaio de 100 pL, com 10-15 pg de proteína membranar contendo os receptores adrenérgicos humanos βι, β2 ou β3, em tampão de ensaio (75 mM Tris/HCl pH 7,4 a 25 °C, MgCl2 12,5 mM, EDTA 1 mM, BSA a 0,2%). Os estudos de ligação de saturação para determinação dos valores de Kd do radioligando foram efectuados utilizando [3H]-di-hidroalprenolol (NET-720, 100 Ci/mmol, PerkinElmer Life
Sciences Inc., Boston, MA) para os receptores βι e β2 e [1251] -(-)-iodocianopindolol (NEX-189, 220 Ci/mmol, PerkinElmer
Life Sciences Inc., Boston, MA) a 10 ou 11 concentrações diferentes a variar de 0,01 nM a 20 nM. Os ensaios de remoção para determinação de K, os valores dos compostos de teste foram realizados com [3H]-di-hidroalprenolol a 1 nM e [1251] -(-)-iodocianopindolol a 0,5 nM para 10 ou 11 concentrações diferentes do composto de teste variando de 10 pM a 10 pM. Foi 78 determinada a ligação não especifica na presença de propranolol 10 μΜ. Os ensaios foram incubados durante 1 hora a 37 °C e, depois, as reacções de ligação foram terminadas por filtração rápida sobre GF/B para os receptores βι e β2 ou placas de fibra de vidro GF/C para o receptores β3 (Packard BioScience Co., Meriden, CT), pré-ensopadas em polietileneimina a 0,3%. As placas foram lavadas três vezes com tampão de filtração (Tris 75 mM/HCl pH 7,4 a 4 °C, MgCl2 12,5 mM, EDTA 1 mM) para remover a radioactividade não ligado. As places foram, depois, secas e foram adicionados 50 pL de fluido de cintilação liquido Microscint-20 (Packard BioScience Co., Meriden, CT) e as placas foram contadas num contador de cintilação liquido Packard Topcount (Packard BioScience Co., Meriden, CT). Os dados de ligação foram analisados por análise de regressão linear com o software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) utilizando o modelo dos 3 parâmetros para uma competição por um local. O mínimo da curva foi fixado para o valor para a ligação não específica, como determinado na presença de propranol a 10 μΜ. Os valores de K3 para os compostos de teste foram calculados a partir de valores de IC50 observados e o valor de Kd do radioligando utilizando a equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y, e Prusoff WH., Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 23, 3 099-108).
Neste ensaio, um valor de K2 inferior indica que um composto de teste tem uma afinidade de ligação superior para o receptor testado. Verificou-se que os compostos exemplificados de fórmula I que foram testados neste ensaio apresentavam, tipicamente, valores de K2 inferiores a cerca de 300 nM para o receptor adrenérgico β2. Por exemplo, verificou-se que os compostos dos exemplos comparativos 3 e 6 apresentavam valores de Ki inferiores a 10 nM. 79
Se desejado, a selectividade do subtipo de receptor para um composto de teste pode ser calculada como a proporção de Κχ (βi) /Κι (β2) ou Κι (β3) /Κι (β2) . Tipicamente, os compostos de fórmula I demonstraram ligação superior no receptor adrenérgico β2 relativamente ao receptor adrenérgico βι ou β3, i. e. K± (βi) ou Κι(β3) é tipicamente superior a κ4(β2). Geralmente, são preferidos os compostos com selectividade para o receptor adrenérgico β2 relativamente aos receptores adrenérgicos βι ou β3; especialmente compostos com uma selectividade superior a cerca de 5; e em particular, superior a cerca de 8. A título de exemplo, os compostos dos exemplos comparativos 3 e 6 têm uma proporção de Ki (βι) /Ki (β2) superior a 8.
Processo de Teste do Ensaio B
Ensaio de Ligação de Radioligando para Recpetores Muscarínicos
Os ensaios de ligação de radioligando para receptores muscarínicos humanos clonados foram efectuados em placas de microtitulação de 96 poços, num volume total de ensaio de 100 pL. As membranas de células CHO expressando, de um modo estável, qualquer um dos subtipos muscarínicos hMi hM2, hM3, hM4 ou hM5 foram diluídos em tampão de ensaio nas seguintes concentrações proteicas alvo especificas (pg/poço): 10 pg para hMi, 10-15 pg para hM2, 10-20 pg para hM3, 10-20 para hM4 e 10-12 pg para hM5 para conseguir sinais semelhantes (cpm). As membranas foram homogeneizadas brevemente utilizando um disruptor de tecidos Polytron (10 segundos) antes da adição a uma placa de ensaio. Os estudos de ligação de saturação para determinar os valores de KD do radioligando foram efectuados 80 utilizando cloreto de metil-L-[N-metil-3H]escopolamina de ( [3H]-NMS) (TRK666, 84, 0 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech,
Buckinghamshire, Inglaterra) a concentrações variando de 0,001 nM a 20 nM. Os ensaios de remoção para determinação dos valores de Ki dos compostos de teste foram efectuados com [3H]-NNiS a 1 nM e onze concentrações do composto de teste diferentes. Os compostos de teste foram inicialmente dissolvidos a uma concentração de 400 μΜ em tampão de diluição e, depois, diluídos em série 5x com tampão de diluição para concentrações finais variando de 10 pM a 100 μΜ. A ordem de adição e volumes às placas de ensaio foram como se segue: 25 pL de radioligando, 25 pL de composto de teste diluído e 50 pL de membranas. As placas de ensaio foram incubadas durante 60 minutos a 37 °C. As reacções de ligação foram terminadas por filtração rápida sobre placas de filtro de fibra de vidro GF/B (PerkinHimer Inc., Wellesley, MA) pré-tratada com BSA a 1%. As placas de filtro foram enxaguadas três vezes com tampão (HEPES 10 mM), para remover a radioactividade não ligada. As placas foram, depois, secas ao ar e foram adicionados 50 pL de fluido de cintilação líquido Microscint-20 (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA), a cada poço. As placas foram, depois, contadas num contador de cintilação líquido PerkinElmer Topcount (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) . Os dados de ligação foram analisados por análise de regressão não linear com o software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), utilizando o modelo de competição por um local. Os valores de Kir para os compostos de teste foram calculados a partir dos valores de IC50 observados e o valor de KD do radioligando utilizando a equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y; Prusoff WH. (1973) Biochemical
Pharmacology, 22(23):3099-108). Os valores de Ki foram convertidos em valores de pKi para determinar a média geométrica e intervalos de confiança a 95%. Estas estatísticas apresentadas 81 foram, depois, convertidas de novo em valores de Ki para reportar valores.
Neste ensaio, um valor de Ki inferior indica que o composto de teste tem uma afinidade de ligação superior pelo receptor testado. Verificou-se que os compostos exemplificados de fórmula I que foram testados neste ensaio tinham um valor de Ki inferior a cerca de 300 nM para o receptor muscarinico M3. Por exemplo, verificou-se que os compostos dos Exemplos comparativos 3 e 6 tinham valores de Ki inferior a 10 nM.
Processo de Teste do Ensaio C
Ensaio de Flashplate do cAMP de célula inteira em Linhas de Células CHO Expressando, de um modo Heterólogo, Receptores Adrenérgicos Humanos βι, β2 ou β3
Os ensaios de cAMP foram efectuados num ensaio de formato de radioimunulogia, utilizando o Sistema de Ensaio Flashplate de Activação da AdenililCiclase com [125I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), de acordo com as instruções de utilização do fabricante. Para a determinação da potência do agonista do receptor β (EC50), linhas de células CHO-Kl expressando, de um modo estável, receptores adrenérgicos humanos βι, β2 ou β3 clonados foram crescidas até perto confluência em meio HAM F-12 suplementado com FBS a 10
Geneticina (250 pg/mL). As células foram enxaguadas com PBS e removidas em dPBS (Solução Salina Tamponada com Fosfatos de Dulbecco, sem CaChand MgCl2) contendo EDTA 2 mM ou solução de Tripsina-EDTA (tripsina a 0,05%/EDTA 0,53 mM). Após contagem das células num contador de células Coulter, as células foram 82 sedimentadas por centrifugação a 1000 rpm e ressuspensas em tampão de estimulação contendo IBMX (PerkinElmer Kit) pré- aquecido para a temperatura ambiente a um concentração de 1,6 x 106 a 2,8 x 106 células/mL. Neste ensaio, foram utilizadas cerca de 60000 a 80000 células por poço. Os compostos de teste (10 mM em DMSO) foram diluídos em PBS contendo BSA 0,1% em
Beckman Biomek-2000 e testados a 11 concentrações diferentes variando de 100 μΜ a 1 pM. As reacções foram incubadas durante 10 min a 37 °C e interrompidas por adição de 100 pL de tampão de detecção frio contendo [125i]-cAMP (nen SMP004, PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) . A quantidade de cAMP produzido (pmol/poço) foi calculada com base nas contagens observadas para as amostras e padrões de cAMP como descrito no manual de utilização do fabricante. Os dados foram analisados por análise não linear com o software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) com a equação sigmoidal. A equação de Cheng-Prusoff (Cheng Y, and Prusoff WH., Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 23, 3099-108) foi utilizada para calcular os valores EC50.
Neste ensaio, um valor de EC50 inferior indica que o composto de teste tem uma actividade funcional superior no receptor testado. Verificou-se que os compostos exemplificados de fórmula I que foram testados neste ensaio têm, tipicamente, um valor de EC50 inferior a cerca de 300 nM para o receptor adrenérgico β2. Por exemplo, verificou-se que os compostos dos Exemplos comparativos 3 e 6 tinham valores de EC50 inferiores a 10 nM.
Se desejado, a selectividade do subtipo de receptor para um composto de teste pode ser calculada como a proporção de EC50 (βι)/EC50 (β2) ou EC50 (β3) /EC50 (β2) . Tipicamente, os compostos 83 desta invenção demonstraram uma actividade funcional superior no receptor adrenérgico β2 relativamente ao receptor adrenérgico βι ou β3, i. e. EC5o^i) ou EC50 (β3) é tipicamente superior a EC5o^2). Geralmente, são preferidos os compostos com selectividade para o receptor adrenérgico β2 relativamente aos receptores adrenérgicos βι ou β3; especialmente compostos com uma selectividade superior a cerca de 5; e, em particular, superior a cerca de 10. A titulo de exemplo, os compostos dos Exemplos comparativos 3 e 6 têm proporções de EC50 (βι)/EC50 (β2) superiores a 10.
Processo de Teste do Ensaio D
Ensaios Funcionais de Antagonismo para Subtipos do Receptor Muscarínico
A. Bloqueio da Inibição Mediada por Agonista da Acumulação do CAMP
Neste ensaio, a potência funcional de um composto de teste é determinada por medição da capacidade dos compostos de teste para bloquear a inibição da oxotremorina da acumulação de cAMP mediado por forscolina em células CHO-Kl expressando o receptor hM2. Os ensaios de cAMP são efectuados num formato de radioimunoensaio utilizando o Sistema de Ensaio Flashplate de Activação da AdenililCiclase com 125I-cAMP (NEN SMP004B,
PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), de acordo com as intruções de utilização do fabricante. As células foram enxaguadas uma vez com dPBS e removidas com solução de Tripsina-EDTA (tripsina a 0,05%/ EDTA 0,53 mM) como decrito na Cultura Celular e secção de Preparação de Membranas acima. As células removidas são lavadas duas vezes por centrifugação a 84 650 x g durante cinco minutos em 50 mL de dPBS. O sedimento celular é, depois, ressuspenso em 10 mL de dPBS e as células são contadas com um contador Duplo de Partículas Coulter Z1 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) . As células são centrifugadas de novo a 650 x g durante cinco minutos e ressuspensas em tampão de estimulação a uma concentração de ensaio de 1,6 χ 106 - 2,8 χ 106 células/mL. O composto de teste é inicialmente dissolvido a uma concentração de 400 μΜ em tampão de diluição (dPBS suplementado com BSA a 1 mg/mL (0,1%)) e, depois, diluído em série com tampão de diluição para concentrações molares finais variando de 100 μΜ a 0,1 nM. A oxotremorina é diluída de um modo semelhante.
Para medir a inibição de oxotremorina da actividade da adenililciclase (AC), são adicionados 25 μΒ de forscolina (concentração final de 25 μΜ diluída em dPBS), 25 pL de oxotremorina diluída e são adicionados 50 μΒ de células aos poços de ensaio de agonista. Para determinar a capacidade de um composto de teste para bloquear a actividade da AC inibida por oxotremorina, foram adicionados 25 pL de forscolina e oxotremorina (concentrações finais de 25 μΜ e 5 μΜ, respectivamente, diluído em dPBS), 25 pL de composto de teste diluído e 50 pL de células para os restantes poços de ensaio.
As reacções são incubadas durante 10 minutos a 37 °C e terminadas por adição de 100 pL de tampão de detecção gelado. As placas são seladas, incubadas de um dia para o outro à temperatura ambiente e contadas na manhã seguinte num contador de cintilação líquido PerkinEhner TopCount (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) . A quantidade de cAMP produzida (pmol/poço) é calculada com base nas contagens observadas para as amostras e 85 padrões de cAMP, como descrito no manual de utilização do fabricante. Os dados são analisados por análise de regressão não linear com o software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) utilizando a regressão não linear, equação de competição por um local. A equação de Cheng-Prusoff é utilizada para calcular o Kif utilizando o EC50 da curva de resposta à concentração de oxotremorina e a concentração do ensaio de oxotremorina como o KD e [L], respectivamente.
Neste ensaio, um valor de Ki inferior indica que o composto de teste tem uma actividade funcional superior no receptor testado. Verificou-se que os compostos exemplificados de fórmula I que foram testados neste ensaio apresentam, tipicamente, um valor de κ2 inferior a cerca de 300 nM para bloqueio da inibição da oxotremorina da acumulação do cAMP mediado por forscolina em células de CH0-K1 expressando o receptor hM2. Por exemplo, verificou-se que o composto do Exemplo comparativo 3 apresenta um valor de Ki inferior a 10 nM. B. Bloqueio da Ligação de [35S]GTPyS Mediada por Agonista
Num segundo ensaio funcional, a potência funcional dos compostos de teste pode ser determinada por medição da capacidade dos compostos para bloquear a ligação de [35S]GTPyS estimulada por oxotremorina em células de CHO-Kl expressando o receptor hM2.
Na altura da utilização, as membranas congeladas foram descongeladas e, depois, diluídas em tampão de ensaio com uma concentração de tecido alvo final de 5-10 pg de proteína por poço. As membranas foram brevemente homogeneizadas utilizando um 86 disruptor de tecido Polytron PT-2100 e, depois, adicionadas às placas de ensaio.
Foram determinados os valores de EC90 (concentração eficaz para 90% de resposta máxima) para estimulação da ligação de [35S]GTPyS pelo agonista oxotremorina.
Para determinar a capacidade de um composto de teste para inibir a ligação de [35S]GTPyS estimulada por oxotremorina, foram adicionados os seguintes a cada poço das placas de 96 poços: 25 pL de tampão de ensaio com [35S]GTPyS (0,4 nM), 25 pL de oxotremorinca (EC90) e GDP (3uM), 25 pL de compostos de teste diluido e 25 pL de membranas de células CHO expressando o receptor hM2. As placas de ensaio foram, depois, incubadas a 37 °C, durante 60 minutos. As placas de ensaio foram filtradas sobre 1% de BSA pré-tratado com filtros de GF/B utilizando um colector de 96 de poços PerkinElmer. As placas foram enxaguadas com tampão de lavagem gelado durante 3x3 segundos e, depois, secas ou ar ou a vácuo. Foi adicionado, a cada poço, liquido de cintilação Microscint-20 (50 pL) e cada placa foi selada e a radioactividade contada num Topcounter (PerkinElmer). Os dados foram analisados por análise de regressão não linear com o sofware GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), utilizando a regressão não linear, equação de competição por um local. A equação de Cheng-Prusoff foi utilizada para calcular o Ki utilizando os valores de IC50 da curva de resposta à concentração para o composto de teste e a concentração de oxotremorina nos ensaios como KD e [L], concentração de ligando, respectivamente.
Neste ensaio, um valor de Ki indica que o composto de teste tem uma actividade funcional superior no receptor testado. 87
Verificou-se que os compostos exemplificados de fórmula I que foram testados neste ensaio apresentam, tipicamente, um valor de Ki inferior a cerca de 300 nM para o bloqueio de ligação de [35S]GTPyS estimulado por oxotremoxina em células de CHO-Kl expressando o receptor hM2. Por exemplo, verificou-se que o composto do Exemplo comparativo 3 tem um valor de K3 inferior a 10 nM
C. Bloqueio da Libertação de Cálcio Mediada por Agonista via Ensaio de FLIPR
Os subtipos de receptor muscarinico (receptores Μχ, M3 e M5), que se unem a proteínas Gq, activam a via da fosfolipase C (PLC) após ligação do agonista ao receptor. Como um resultado, o PLC activado hidrolisa a fosfatilinositoldifosfato (PIP2) em diacilglicerol (DAG) e fosfatidil-1,4,5-trifosfato (IP3), que por sua vez gera a libertação do cálcio das reservas intracelulares, í. e.r retículo endoplasmático e sarcoplasmático. Os ensaios de FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) capitalizam este aumento no cálcio intracelular, utilizando um corante sensível ao cálcio (Fluo-4AM, Molecular Probes, Eugene, OR) que fluoresce quando o cálcio livre se liga. Este acontecimento de fluorescência é medido em tempo real pelo FLIPR, que detecta a alteração na fluorescência de uma monocamada de células clonadas com receptores humanos Mi e M3 e M5 de chimpanzé. A potência do antagonista pode ser determinada pela capacidade dos antagonistas para inibir aumentos mediados por agonista n cálcio intracelular.
Para ensaios de estimulação de cálcio por FLIPR, as células CHO expressando de um modo estável dos receptores hMi, hM3 e cM5 88 são semeadas em placas de FLIPR de 96 poços na noite antes do ensaio ser efectuado. As células semeadas são lavadas duas vezes por Cellwash (MTX Labsystems, Inc.) com tampão FLIPR (HEPES 10 mM, pH 7,4, cloreto de cálcio 2 mM, probenecid 2,5 mM em Solução de sal Tamponado de Hank (HBSS) sem cálcio e magnésio) para remover o meio de crescimento e deixando 50 pL/poço de tampão FLIPR. As células são, depois, incubadas com 50 pL/poço de FLUO-4AM 4 pM (foi preparada uma solução 2X), durante 40 minutos a 37 °C, 5% de dióxido de carbono. Após o período de incubação do corante, as células são lavadas duas vezes com tampão FLIPR, deixando um volume final de 50 pL/poço.
Para determinar a potência do antagonista, a estimulação dependente da dose de libertação do Ca2+ intracelular para a oxotremorina é inicialmente determinada de modo a que a potência do antagonista possa, mais tarde, ser medida contra a estimulação da oxotremorina a uma concentração de EC90. As células são inicialmente incubadas com tampão de diluição de composto durante 20 minutos, seguido por adição do agonista que é efectuada por FLIPR. Um valor de EC90 para a oxotremorina é gerado de acordo com o método detalhado na determinação por FLIPR e secção de redução de dados abaixo, em conjunto com a fórmula ECF=((F/100-F)A1/H) * EC5o· Uma concentração de oxotremorina de 3 x ECF é preparada em placas de estimulação de modo a que seja adicionada uma concentração de oxotremorina de EC90 a cada poço nas placas de ensaio de inibição. 89
Os parâmetros utilizados para o FLIPR são: comprimento da exposição de 0,4 segundos, força do laser de 0,5 watts, comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 550 nm. A linha de base é determinada por medição da alteração na fluorescência durante 10 segundos antes da adição do agonista. Após a estimulação do agonista, o flipr mediu continuamente a alteração da fluorescência a cada 0,5 a 1 segundos durante 1,5 minutos para capturar a alteração de fluorescência máxima. A alteração da fluorescência é expressa como a fluorescência máxima menos a fluorescência de linha de base para cada poço. Os dados em bruto são analisados como função do logaritmo da concentração de fármaco por regressão não linear com GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) utilizando o modelo desenvolvido para resposta à dose sigmoidal. Os valores de Ki antagonista são determinados por Prism utilizando o valor de EC5o para a oxotremorina como o KD e o EC9o para a oxotremorina para a concentração do ligando de acordo com a equação de Cheng-Prusoff (Cheng & Prusoff, 1973) .
Neste ensaio, um valor de Ki inferior indica que o composto de teste tem uma actividade funcional superior no receptor testado. Verificou-se que os compostos exemplificados de fórmula I que foram testados neste ensaio apresentam, tipicamente, um valor de Ki inferior a cerca de 300 nM para o bloqueio da libertação de cálcio mediada por agonista em células CHO expressando, de um modo estável, os receptores hMi, hM3 e cM5 . Por exemplo, verificou-se que o composto do Exemplo comparativo 3 tem um valor de Ki inferior a 10 nM para os receptores hMi, hM3 e cM5. 90
Processo de Teste do Ensaio E 0 ensaio Flashplate de cAMP de célula inteira Com uma Linha de Células Epiteliais de Pulmão Expressando Endogenamente o Receptor Andrenérgico Humano β2
Para a determinação das potências de agonista e eficácias (actividades intrínsecas) numa linha celular expressando níveis endógenos do receptor adrenérgico β2, foi utilizada uma linha de células epiteliais de pulmão humano (BFAS-2B) (ATCC CRL-9609, American Type Culture Collection, Manassas, VA) (January B, et al., British Journal of Pharmacology, 1998, 123, 4,701-11). As células foram crescidas para 75-90% de confluência em meio livre de soro completo (meio lhc-9 MÉDIUM contendo Epinefrina e Ácido Retinoico, N° cat. 181-500, Biosource International, Camarillo, CA). No dia antes do ensaio, o meio foi alterado para LHC-8 (sem epinefrina ou ácido retinócio, N° cat. 141-500, Biosource International, Camarillo, CA). Foram efectuados ensaios de cAMP num formato de radioimunoensaio, utilizando o Sistema de Ensaio de activação da AdenililCiclase Flashplate com [125I]-cAMP (NEN SMP004, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), de acordo com as instruções dos fabricantes. No dia do ensaio, as células foram enxaguadas com PBS, removidas por fricção com EDTA 5 mM em PBS e contadas. As células foram sedimentadas por centrifugação a 1000 rpm e ressuspensas em tampão de estimulação pré-aquecido para 37 °C a uma concentração final de 600000 células/mL. As células foram utilizadas a concentração final de 100000 a 120000 células/poço neste ensaio. Os compostos de teste foram diluídos em série num tampão de ensaio (Tris 75 mM/HCl pH 7,4 a 25 °C, MgCl2 12,5 mM, BETA 1 mM, BSA 0,2%) num Beckman Biomek-2000. Os compostos de teste foram testados no ensaio a 11 concentrações diferentes, variando de 10 μΜ a 10 pM. As 91 reacções foram incubadas durante 10 min a 37 °C e interrompidas por adição de 100 pL de tampão de detecção gelado. As placas foram seladas, incubadas, de um dia para o outro, a 4 °C e contadas na manhã seguinte num contador de cintilação da Topcount (Packard BioScience Co., Meriden, CT) . A quantidade de cAMP produzido por mL de reacção foi calculada baseada nas contagens observadas para amostras e padrões cAMP, como descrito no manual do utilizador do fabricante. Os dados foram analisados por análise de regressão não linear com o pacote de software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), utilizando o modelo de 4 parâmetros para a resposta à dose sigmoidal.
Neste ensaio, um valor de EC50 inferior indica que o composto de teste tem uma actividade funcional superior no receptor testado. Verificou-se que os compostos exemplificados de fórmula I que foram testados neste ensaio apresentaram um valor de EC50 inferior a cerca de 300 nM para o receptor adrenérgico β2. Por exemplo, verificou-se que os compostos dos Exemplos comparativos 3 e 6 apresentaram valores de EC50 inferior a 10 nM.
Se desejado, a eficácia do composto de teste (% de Efic) foi calculada a partir da proporção do Emáx observado (TOPO da curva adaptada) e a resposta máxima obtida para a curva de reposta à dose do isoproterenol e foi expressa como a % de Efic relativamente ao isoproterenol. Os compostos exemplificados desta invenção testados neste ensaio, demonstraram, tipicamente, uma % de Efic superior a cerca de 40. 92
Processo de Teste do Ensaio F
Duração da Broncoprotecção em Modelos de Broncoconstricção Induzida por Acetilcolina ou Induzida por Histamina em Cobaios
Estes ensaios in vivo foram utilizados para avaliar os efeitos broncoprotectores dos compostos de teste exibindo actividade como antagonista do receptor muscarinico e como agonista do receptor adrenérgico β2, em simultâneo. Para isolar a actividade como antagonista muscarinico no modelo de broncoconstrição induzido por acetilcolina, foi administrado propanolol aos animais, um composto que bloqueia a actividade do receptor β, antes da administração da acetilcolina. A duração da broncoprotecção no modelo de broncoconstrição induzido por histamina reflecte actividade como agonista do receptor adrenérgico β2.
Grupos de 6 cobaios machos (Duncan-Hartley (HsdPoc:DH) Harlan, Madison, WI) pesando entre 250 e 350 g, foram identificados individualmente por cartões da gaiola. Ao longo do estudo, foi permitido o acesso aos animais a comida e água ad libitum.
Os compostos de teste foram administrados via inalação durante 10 minutos, numa câmara de doseamento por exposição do corpo inteiro (R&S Molds, San Carlos, CA). As câmaras de dosagem foram organizadas de modo a que o aerossol fosse simultaneamente distribuído a 6 câmaras individuais a partir de um colector central. Os cobaios foram expostos a um aerossol de um composto de teste ou veículo (WFI) . Estes aerossóis foram gerados a partir de soluções aquosas utilizando um Conjunto de Nebulizador LC Star (Modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. 93
Midlothian, VA) com uma mistura de gases (C02 = 5%, 02 = 21% e N2 = 74%) a uma pressão de 22 psi. 0 fluxo de gás através do nebulizador a esta pressão de operação foi aproximadamente de 3 L/minuto. Os aerossóis gerados foram conduzidos pelas câmaras por pressão positiva. Não foi utilizado ar diluído durante a distribuição das soluções aerossolizadas. Durante a nebulização de 10 minutos, foram nebulizados aproximadamente 1,8 mL de solução. Este valor foi medido gravimetricamente por comparação dos pesos pré e pós nebulização do nebulizador cheio.
Os efeitos broncoprotectores dos compostos de teste administrados via inalação foram avaliados utilizando um pletismografo de corpo inteiro a 1,5, 24, 48 e 72 horas após dosagem.
Quarenta e cinco minutos antes do inicio da avaliação dos pulmões, cada cobaio foi anestesiado com uma injecção intramuscular de cetamina (43,75 mg/kg), xilazina (3,50 mg/kg) e acepromazina (1,05 mg/kg). Após o local cirúrgico ter sido rapado e limpo com álcool a 70%, foi efectuada uma incisão mediana com 2-3 cm de aspecto ventral do pescoço. Depois, a veia jugular foi isolada e canulada com um catéter de polietileno com solução salina (PE-50, Becton Dickinson, Sparks, MD) para permitir infusões intravenosas de acetilcolina (Ach) ou histamina em solução salina. A traqueia foi dissecada livremente e canulada com um tubo de teflon de 14 G (N° NE- 014, Small Parts, Miami Lakes, FL) . Se necessário, a anestesia é mantida por injecções intramusculares adicionais da mistura anestésica mencionada acima. A carga da anestesia foi monitorizada e ajustada caso animal respondesse ao beliscar da sua pata ou se a taxa de respiração fosse superior a 100 inspirações/minuto. 94
Após estar completa a canulação, o animal foi colocado num pletismografo (N° PLY3114, Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT) e foi inserida uma canula de pressão esofágica (PE-160, Becton Dickinson, Sparks, MD) para determinar a diferença de pressão pulmonar (pressão) . 0 tubo traqueal de teflon foi ligado para a abertura do pletismografo para permitir que os cobaios respirem ar ambiental do exterior da câmara. A câmara foi, depois, selada. Foi utilizada uma lâmpada de aquecimento para manter a temperatura do corpo e os pulmões dos cobaios foram inflados 3 vezes com 4 mL de a utilizando uma seringa de calibração de 10 mL (#5520 Series, Hans Rudolph, Kansas City, MO) para garantir que as vias respiratórias inferiores não se colapsem e que o animal não sofra de hiperventilação.
Após ter sido determinado que os valores de linha de base estavam na gama de 0,3-0,9 mL/cm de H20 para conformidade e na gama de 0,1 - 0,199 cm de H20/mL por segundo para resistência, deu-se inicio à avaliação pulmonar. Um programa de computador de medição pulmonar Buxco permitiu que a colecção e derivação dos valores pulmonares.
Começando este programa inicia-se o protocolo experimental e a recolha de dados. As alterações no volume ao longo do tempo que ocorre dentro do pletismografo com cada inspiração foram medidas via um tranductor de pressão Buxco. Por integração deste sinal ao longo do tempo, foi calculada uma medição do fluxo para cada inspiração. Este sinal, em conjunto com as alterações nas diferenças de pressão pulmonar, que foram recolhidas utilizando um transductor de pressão Sensym (N° TRD4100), foi ligado via um pré-amplificador Buxco (MAX 2270) a uma interface de recolha de dados (N° SFT3400 e SFT3813) . Todos os parâmetros foram derivados destas duas entradas. 95
Os valores de linha de base foram recolhidos durante 5 minutos, após os quais os cobaios foram desafiados com Ach ou histamina. Ao avaliar os efeitos antagonistas muscarinicos, foi administrado propanol (5 mg/Kg, iv) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 15 minutos antes da estimulação com Ach. Ach (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (0,1 mg/mL) foi infundido intravenosamente durante 1 minuto a partir de uma bomba de seringa (sp210iw, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) às seguintes doses e tempos rescritos a partir do inicio da experiência: 1,9 pg/minuto a 5 minutos, 3,8 pg/minuto a 10 minutos, 7,5 pg/minuto a 15 minutos, 15,0 pg/minuto a 20 minutos, 30 pg/minuto a 25 minutos e 60 pg/minuto a 30 minutos.
Alternativamente, foi avaliada a broncoprotecção dos compostos de teste no modelo de estimulação de acetilcolina sem pré-tratamento com um composto de bloqueio beta.
Ao avaliar os efeitos do agonista do receptor adrenérgico β2 dos compostos de teste, foi administrada histamina por infusão intravenosamente (25 pg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 1 minuto a partir de uma bomba de seringa às seguintes doses e tempos prescritos a partir do inicio da experiência: 0,5 pg/minuto a 5 minutos, 0,9 pg/minuto a 10 minutos, 1,9 pg/minuto a 15 minutos, 3,8 pg/minutos a 20 minutos, 7,5 pg/minuto a 25 minutos e 15 pg/minuto a 30 minutos. Se a resistência ou conformidade não regressar aos valores de linha de base aos 3 minutos, após cada dose de Ach ou histamina, os pulmões dos cobaios eram insuflados 3 vezes com 4 mL de ar a partir de uma seringa de calibração de 10 mL. Os parâmetros pulmonares registados incluem a frequência de respiração (inspirações/minuto), conformidade (mL/cm H20) e resistência pulmonar (cm H20/mL por segundo). Após completas as medições das funções pulmonares ao minuto 35 deste protocolo, o cobaio foi 96 removido do pletismogrado e eutanaziados por asfixia com dióxido de carbono.
Os dados foram avaliados de uma ou duas maneiras: (a) A resistência pulmonar (RL, cm H20/mL por segundo) foi calculada a partir da proporção de "alteração na pressão" para "alteração no fluxo". A resposta RL ao ACh (60 pg/min, IH) foi computorizada para o veiculo e os grupos do composto de teste. A resposta média a ACh nos animais tratados com veículo, a cada tempo de pré-tratamento, foi calculada e utilizada para computorizar a % de inibição da resposta a ACh, no tempo de pré-tratamento correspondente, cada dose do composto de teste. As curvas de inibição de resposta à dose para ' RL' foram efectuadas a partir de uma equação de logística de quatro parâmetros utilizando o GraphPad Prism, versão 3.00 para o Windows (GraphPad Software, San Diego, Califórnia) para estimar o ID50 broncoprotector (dose necessária para inibir a resposta do broncoconstrictor ACh (60 pg/min) em 50%). A equação utilizada é como se segue: Y => Min + (Max-Min)/(1 + 10((U,S Hinslopo1) onde X é o logaritmo da dose, Y é a resposta (% de aumento da Inibição do ACh induzida em RL) . Y começa em Min e aproxima-se assimptoticamente para Máx com uma forma sigmoidal. (b) A quantidade PD2, que é definida como a quantidade de Ach ou histamina necessária para provocar uma duplicação da resistência pulmonar de linha de base, foi calculada 97 utilizando os valores de resistência pulmonar derivados do fluxo e da pressão ao longo de uma gama de desafios de Ach ou histamina utilizando a seguinte equação (derivado da equação utilizada para calcular os valores de PC20 na clinica (ver Am. Thoracic Soc, 2000) : PDa· antilog [ log Ci+ gjSggg··*1 , 1
Rí-Rl J onde:
Ci = concentração de Ach ou histamina a preceder C2 C2 = concentração de Ach ou histamina resultando em, pelo menos, duas vezes mais na resistência pulmonar (RL) R0 = valor de RL de linha de base
Ri = valor de RL antes de de Cx R2 = valor de RL antes de C2 A análise estatística dos dados foi efectuada utilizando um teste t de Student de dois parâmetros. Um valor de P <0,05 foi considerado significativo.
Os compostos exemplificados de fórmula I que foram testados neste ensaio produziram, tipicamente, um efeito broncoprotector dependente de dose contra a broncoconstricção induzida por MCh e broncoconstricção induzida por His. Geralmente, os compostos de teste com uma potência (ID50 a 1,5 h pós dose) inferior a cerca 98 de 300 pg/mL para broncoconstricção induzida por ACh e inferior a cerca de 300 pg/mL para broncoconstricção induzida por His neste ensaio são geralmente preferidos. Por exemplo, verificou-se que os compostos dos Exemplos comparativos 3 e 6 apresentavam um ID50 inferior a cerca de 100 pg/mL para broncoconstricção induzida por ACh e um ID50 inferior a cerca de 100 pg/mL para broncoconstricção induzida por His a 1,5 horas após dose.
Além disso, os compostos de teste com uma duração (PD Ti/2) de actividade de broncoprotector de, pelo menos, 24 horas neste ensaio são geralmente preferidos. A titulo de exemplo, verificou-se que os compostos dos Exemplos comparativos 3 e 6 apresentavam um PD Ti/2 de, pelo menos, cerca de 24 horas após dosagem.
Processo de Teste do Ensaio G O Modelo de Einthoven Para Alterações na Medição de Ventilação em Cobaios A actividade de broncodilatador dos compostos de teste foi avaliada num modelo de cobaio anestesiado (o modelo de
Einthoven), que utiliza pressão de ventilação como uma medida substituta de resistência das vias respiratórias. Ver, por exemplo, Einthoven (1892) Pfugers Arch. 51: 367 - 445; e Mohammed et al. (2000) Pulm Pharmacol Ther. 13(6):287-92. Neste modelo, foi avaliada a actividade como antagonista muscarinico e como agonista de β2 por determinação dos efeitos protectores relativamente a broncoconstrição induzida por metacolina (MCh) e histamina (His). 99
Este ensaio foi conduzido utilizando cobaios Duncan-Hartley (Harlan, Indianapolis, IN), pesando entre 300 e 400 g. O composto ou veiculo de teste (í. e., água estéril) foi doseado por inalação (IH) durante um período de tempo de 10 minutos numa câmara de dosagem de exposição de corpo inteiro (Modelos R+S, San Carlos, CA), utilizando 5 mL de solução de dosagem. Os animais foram expostos a um aerossol, que foi gerado a partir de um Conjunto de Nebulizador LC Star (Modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) a funcionar por Biomistura de uma mistura de gases (5% de C02; 21% de 02; e 74% de n2) a uma pressão de 22 psi. A função pulmonar foi avaliada a vários pontos de tempo após dosagem por inalação.
Quarenta e cinco minutos antes do inicio da avaliação da função pulmonar, os cobaios foram anestesiados com uma injecção intramuscular (IM) de uma mistura de cetamina (13,7 mg/kg/xilazina (3,5 mg/kg)/acepromazina (1,05 mg/kg). Uma dose suplementar desta mistura (50% dose inicial) foi administrada consoante necessário. A veia jugular e artéria carótida foram isoladas e canuladas com cateteres de poletileno cheias com solução salina (micro-renatano e PE-50, respectivamente, Beckton Dickinson, Sparks, MD). A artéria carótida foi ligada a um transdutor de pressão para permitir a determinação da pressão sanguínea e a foi utilizada uma canula na aveia jugular para injecção IV para MCh ou His. A traqueia foi, depois, dissecada livremente e canulada com uma agulha 14 G (N° NE-014, Small Parts, Miami Lakes, FL) . Após as canulações estarem completas, os cobaios foram ventilados utilizando um respirador (Modelo 683, Harvard Apparatus, Inc., MA) programado para um volume de golpe de 1 mL/100 g de peso corporal mas não excedendo os 2,5 mL de volume e a uma taxa de 100 golpes por 100 minuto. A pressão de ventilação (VP) foi medida na cânula da traqueia, utilizando um transdutor Biopac que foi liqado a um pré-amplificador Biopac (TSD 137C). A temperatura do corpo foi mantida a 37 °C, utilizando uma almofada de aquecimento. Antes de iniciar a recolha dos dados, foi administrado intraperitonealmente (IP), pentobarbital (25 mg/kg), para suprimir a respiração espontânea e obter uma linha de base estável. As alterações em VP foram registadas numa interface de recolha de dados Biopac Windows. Os valores de linha de base foram recolhidos durante, pelo menos, 5 minutos, tempo após o qual os cobaios foram desafiados IV, não cumulativo, com doses incrementadas 2 vezes do broncoconstrictor (MCh ou His). Quando foi utilizado MCh como o agente broncoconstrictor, os animais foram pré-tratados com propranolol (5 mg/kg, IV) para isolar os efeitos antimuscarinicos do compostos de teste. As alterações em VP foram registadas utilizando o Software Acknowledge Data Collection (Santa Barbara, CA). Após completar o estudo, os animais foram eutanasiados. A alteração em VP foi medida em cm de água. A alteração em VP (cm de H20) = pressão máxima (após estimulo com broncoconstrictor) - pressão de linha de base máxima. A curva de resposta à dose a MCh ou His foi efectuada através de uma equação logística de quatro parâmetros, utilizando GraphPad Prism, versão 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, Califórnia). A equação foi utilizada como se segue: Y = Min + (Max-Min)/(1 + LO<(loe ,W0_X)* ) onde X é o logaritmo de dose, Y é a resposta. Y começa em Min e aproxima-se assimptoticamente para Max com uma forma sigmoidal. 101 A percentagem de inibição da resposta a broncoconstrictor a uma dose submáxima de MCh ou His foi calculada a cada dose do composto de teste utilizando a seguinte equação: % de Inibição de resposta = 100-((pressão máxima após estímulo com broncoconstrictor, tratado) - pressão de linha de base máxima (tratado) * 100%/(pressão máxima (após estimulo com broncoconstrictor, água) - pressão de linha de base máxima (água)). As curvas de inibição foram efectuadas utilizando a equação logística de quatro parâmetros do software GraphPad. Foi também estimado o ID50 (dose necessária para produzir 50% de inibição da resposta ao broncoconstrictor) e Emáx (inibição máxima) foram também estimados sempre que apropriado. A magnitude da broncoprotecção a diferentes pontos de tempo após inalação do composto de teste foi utilizada para estimar o tempo de meia vida farmacodinâmico (PD Ti/2) . O PD Ti/2 foi determinado utilizando uma regressão não-linear ajustada utilizando uma equação de decaimento exponencial de uma fase (GraphPad Prism, Versão 4.00): Y=Span*exp(-K*X) + Plataforma; Começam a Span+Plataforma e diminui até plataforma com uma taxa constante K. O PD T1/2 = 0,69/K. A Plataforma foi transposta para 0.
Os compostos exemplificados de fórmula I que foram testados neste ensaio produziram, tipicamente, um efeito broncoprotector dependente de dose relativamente à broncoconstrição induzida por MCh e broncoconstrição induzida por His. Geralmente, são preferidos os compostos de teste com um ID50 inferior a cerca de 300 pg/mL para broncoconstrição induzida por MCh e ID50 inferior a cerca de 300 pg/mL para broncoconstrição induzida por His 1,5 horas após dosagem neste ensaio. Além disso, os compostos de teste com uma duração (PD T1/2) de actividade broncoprotectora de 102 pelo menos, cerca de 24 horas neste ensaio, são geralmente preferidos.
Processo de Teste do Ensaio H
Ensaio de Salivação de Cobaios por Inalação
Os cobaios (Charles River, Wilmington, MA) pesando 200-350 g foram colocados na gaiola da colónia de cobaios durante, pelo menos, 3 dias após terem chegado. O composto de teste ou veiculo foi doseado via inalação (IH) durante um período de tempo de 10 minutos numa câmara de dosagem com forma de empada (Moldes R+S, San Carlos, CA) . As soluções de teste foram dissolvidas em água estéril e distribuídas utilizando um nebulizador cheio com 5,0 mL de solução de dosagem. Os cobaios foram contidos na câmara de inalação durante 30 minutos. Durante este tempo, os cobaios foram contidos numa área de aproximadamente 110 cm2. Este espaço foi adequado para os animais se movimentarem livremente, reporem-se e permitir que se lavem. Após 20 minutos de acomodação, os cobaios foram expostos a um aerossol gerado de um Conjunto de Nebulizador LS Star (Modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) movido por ar da gaiola a uma pressão de 22 psi. Após completa a nebulização, os cobaios foram avaliados a 1,5, 6, 12, 24, 48 ou 72 h após tratamento.
Os cobaios foram anestesiados uma hora antes do teste, com uma injecção intramuscular (IM) de uma mistura de ofcetamina a 43,75 mg/kg, xilazina a 3,5 mg/kg e acepromazina a 1,05 mg/kg a um volume de 0,88 mL/kg. Os animais foram colocados de um modo ventral para cima, numa manta aquecida (37 °C), com 20 graus de inclinação, com a sua cabeça num declive descendente. Foi 103 inserida uma almofada de gaze com 4 ply 2x2 polegadas (Nu-Gauze General-use sponges, Johnson and Johnson, Arlington, TX) na boca do cobaio. Cinco minutos depois, o agonista muscarinico pilocarpina (3,0 mg/kg, s.c.) foi administrado e a almofada de gaze foi imediatamente removida e substituída por uma nova almofada de gaze pesada previamente. A saliva foi recolhida durante 10 minutos, ponto no qual a gaze foi pesada e a diferença no peso foi registada para determinar a quantidade de saliva acumulada (em mg). A quantidade média de saliva recolhida para os animais recebendo o veículo foi calculada para cada dose do composto de teste. A média do grupo de veículo foi considerada como sendo 100% de salivação. Os resultados foram calculados utilizando médias de resultado (n = 3 ou superior). Os intervalos de confiança (95%) foram calculados para cada dose, a cada ponto de tempo, utilizando ANOVA de dois componentes. Este modelo é uma versão modificada do processo descrito em Rechter, "Estimation of anticholinergic drug effects in mice by antagonism against pilocarpine-induced salivation" Ata Pharmacol Toxicol, 1996, 24:243-254. O peso médio de saliva em animais tratados com veículo, a cada tempo de pré-tratamento, foi calculado e utilizado para computorizar a % de inibição de salivação no tempo de pré-tratamento correspondente, a cada dose. Os dados de inibição de resposta à dose foram ajustados numa equação de logística de quatro parâmetros utilizando GraphPad Prism, versão 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, Califórnia), para estimar o ID50 anti-sialagogue (dose necessária para inibir 50% de salivação provocada por pilocarpina). A equação utilizada foi como se segue: Y = Min + (Max-Min)/(1 + 10 ((l°8 IW0_X)*KilWope)) 104 onde X é o logaritmo de dose, Y é a resposta (% de inibição de salivação). Y começa em Min e aproxima-se assimptoticamente para Máx com uma forma sigmoidal. A proporção de ID50 anti-sialagogue para ID50 do broncoprotector foi utilizada para computorizar o indice de selectividade dos pulmões aparente do composto de teste. No geral, são preferidos os compostos com um indice de selectividade dos pulmões aparente superior a cerca de 5. Neste ensaio, o composto do Exemplo comparativo 3 tem um indice de selectividade dos pulmões aparente superior a 5.
Lisboa, 30 de Novembro de 2010 105

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Éster 1-[2-(2-Cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-1,2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico de fórmula
    ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
  2. 2. Ester 1-[2-(2-Cloro-4-{[{R)—2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo— 1,2-di-hidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5-metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilico do Ácido Bifenil-2-ilcarbâmico de fórmula
  3. 3. Composição farmacêutica compreendendo a) Ester 1—[2— (2— Cloro-4-{[(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo-l, 2-di- hidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5- metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do Ácido Bif enil-2-ilcarbâmico ou um seu sal ou solvato 1 farmaceuticamente aceitável, e b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
  4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que a composição compreende também um agente terapêutico.
  5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, em que o outro agente terapêutico é um agente anti-inflamatório esteróide.
  6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, em que o agente anti-inflamatório esteróide é um corticosteróide.
  7. 7. Éster l-[2-(2-Cloro-4-{[{R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2-oxo- 1.2- di-hidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5- metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ílico do Ácido Bif enil-2-ilcarbâmico ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, para utilização em terapia.
  8. 8. Éster 1-[2-(2-Cloro-4-{[(R)-2—hidroxi-2-(8-hidroxi—2-oxo— 1.2- di-hidroquinolin-5-il)etilamino]metil}-5- metoxifenilcarbamoil)etil]piperidin-4-ilico do Ácido Bif enil-2-ilcarbâmico ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de um distúrbio pulmonar.
  9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o distúrbio pulmonar é a doença pulmonar obstrutiva crónica ou asma. Lisboa, 30 de Novembro de 2010 2
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