ES2607955T3 - Vesículas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas y uso de las mismas - Google Patents

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Abstract

Vesículas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular, siendo las bacterias grampositivas Staphylococcus, en el que las vesículas extracelulares se aíslan de una secreción del cuerpo interno de un animal o un cultivo de dichas bacterias grampositivas.

Description

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Vesteulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas y uso de las mismas Campo de la tecnica
La presente invencion se refiere a vesteulas extracelulares (VE) derivadas de bacterias grampositivas y a los usos de las mismas en un modelo animal de enfermedad, a un procedimiento para deteccion selectiva de un candidate a farmaco, a una vacuna y a un procedimiento para diagnosticar un factor patogenico de una enfermedad.
Tecnica anterior
Las bacterias grampositivas son aquellas que se tinen de color violeta mediante la tincion de Gram y carecen de una membrana externa a diferencia de las bacterias gramnegativas. En la filogenia, las bacterias grampositivas pertenecen a los filos Firmicutes, Actinobacteria y Tenericutes. Tanto Firmicutes como Actinobacteria se caracterizan por la alta cantidad de peptidoglicano en sus paredes celulares. El primero, Firmicutes, son bacterias grampositivas con cantidad baja de G + C, mientras que el segundo, Actinobacteria, son bacterias grampositivas con un contenido alto en G + C. El filo Tenericutes carece de una pared celular.
La mayona de los agentes patogenos en seres humanos se conocen como bacterias grampositivas. Representante entre ellos son Streptococcus y Staphylococcus, ambos cocos (bacterias con forma de esfera). Otros patogenos grampositivos son bacilos (bacterias con forma de varilla) y pueden subdividirse en base a su capacidad para formar esporas. Los que no forman esporas son Corynebacterium y Listeria, mientras que Bacillus y Clostridium producen esporas.
Recientemente, se ha prestado mayor atencion a la correlacion entre las vesteulas extracelulares liberadas por las bacterias gramnegativas y las enfermedades causadas por bacterias gramnegativas [Kuehn, M. J., Kesty, N. C., Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 2005, 19, 2645-2655]. Se sabe que las vesteulas extracelulares derivadas de bacterias gramnegativas salen por gemacion de la membrana externa. Dado que las bacterias grampositivas carecen de la membrana externa, con la membrana plasmatica encerrada por la pared celular, se conoce poco sobre la liberacion de vesteulas extracelulares de bacterias grampositivas, asf como sobre la patogenicidad de las vesteulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
Eda, T. et al., Extracellular Membranous Structures in a Stable L-form of Staphylococcus aureus. J. General Microbiology 1977, 103, 189 to 191, informan sobre la existencia de estructuras de membrana tubulares extracelulares y vesteulas en las preparaciones de la forma L estable de Staphylococcus aureus por medio de microscopia electronica. Sin embargo, los autores no divulgan el aislamiento de vesteulas extracelulares de Staphylococcus aureus.
Dorward, D. W. y Garon, C. F., DNA is Packaged within Membrane-Derived Vesicles of Gram-Negative but Not Gram-Positive Bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 1990, 56, 1960 a 1962, analiza 18 especies de eubacterias gramnegativas y grampositivas para el ADN protegido de la nucleasa asociado a vesteulas de membrana extracelulares. Las vesteulas de bacterias solo el Gramnegativas conteman lineales nucleasa protegido o ADN superenrrollado o ambos. El documento revela que no hay vesteulas en los cultivos de Staphylococcus aureus y Streptococcus sanguis.
Kuehn, M. J. and Kesty, N. C., Bacterial outer membrane vesicles and the host pathogen interaction. Genes Dev. 2005, 19, 2645 a 2655 hacen referencia a vesteulas liberadas de la cubierta de las bacterias en crecimiento que sirven como vehteulos de secrecion para protemas y lfpidos de las bacterias gramnegativas. El documento se refiere a estafilococos con respecto al efecto de vesteulas de P. Gingivalis.
El documento EP 1 602 360 A1 tiene por objeto la obtencion de estructuras cocleares de vesteulas que se encuentran en las membranas externas de los microorganismos, con el fin de emplearlas en la preparacion de adyuvantes y vacunas. La invencion tambien describe un procedimiento para la obtencion de estructuras cocleares.
Divulgacion
Problema tecnico
Es un objeto de la presente invencion proporcionar vesteulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
Es otro objeto de la presente invencion proporcionar un procedimiento para la preparacion de vesteulas extracelulares de bacterias grampositivas.
Es un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar un modelo animal de enfermedad, construido mediante la administracion de vesteulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas a un animal de ensayo.
Es un objeto adicional de la presente invencion proporcionar un procedimiento para la deteccion selectiva de un candidato a farmaco preventivo o terapeutico de una enfermedad, utilizando un modelo animal de enfermedad o un
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sistema de deteccion selectiva ex vivo.Es aun otro objeto de la presente invencion proporcionar una vacuna para la profilaxis o terapia de una enfermedad causada por vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas, que comprende vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
Es todavfa otro objeto de la presente invencion proporcionar una vacuna para la profilaxis o terapia de una infeccion producida por bacterias grampositivas usando vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
Es todavfa un objeto adicional de la presente invencion proporcionar un procedimiento para determinar un factor patogenico de las bacterias grampositivas, usando las vesfculas extracelulares separadas.
Los objetos de la presente invencion no estan limitados a los mencionados anteriormente y los expertos en la tecnica comprenderan claramente otros objetos, ventajas y caractensticas de la presente a partir de la descripcion siguiente.
Solucion de la tecnica
De acuerdo con un primer aspecto de la misma, la presente invencion proporciona vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular, siendo las bacterias grampositivas Staphylococcus, en el que las vesfculas extracelulares se afslan de una secrecion del cuerpo interno de un animal o un cultivo de dicha dichas bacterias grampositivas.
De acuerdo con la presente divulgacion, las bacterias grampositivas incluyen bacterias pertenecientes al filo Firmicutes, pero no estan limitadas a las mismas.
El filo Firmicutes incluye, pero no se limita a, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Croynebacterium, Norcardia, Clostridium, Lactobacillus y Listeria.
De acuerdo con la presente divulgacion, las bacterias grampositivas incluyen bacterias pertenecientes al filo Mollicutes, pero no estan limitadas a las mismas.
La clase Mollicutes incluye, pero no se limita a, Mycoplasma.
De acuerdo con la presente descripcion, las bacterias grampositivas comprenden Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtilis.
En otra realizacion, las vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas son las secretadas por las bacterias grampositivas que viven dentro de un animal. A continuacion, las vesfculas extracelulares se afslan de una secrecion del cuerpo interno de los animales. Las secreciones incluyen fluido del lavado de la piel, lagrimas, flemas, heces, sangre, orina, lfquido sinovial, lfquido cefalorraqmdeo, lfquido pleural y ascitis.
De acuerdo con la presente divulgacion, las vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas incluyen secreciones de bacterias grampositivas que viven en el medio ambiente circundante. El entorno circundante incluye aire interior, aire exterior, la tierra y el mar.
De acuerdo con la presente descripcion, las vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas se pueden aislar de un cultivo de bacterias grampositivas, pero no se limita a ellos.
De acuerdo con la presente descripcion, las vesfculas extracelulares son aquellas que se forman de manera espontanea o se forman de manera artificial.
En relacion con la presente invencion se divulga un procedimiento para preparar vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
En una divulgacion de este procedimiento, comprende la centrifugacion de un cultivo de bacterias grampositivas para dar un sobrenadante y la filtracion del sobrenadante.
En otra divulgacion, el procedimiento comprende las siguientes etapas de: centrifugar un cultivo de bacterias grampositivas para dar un sobrenadante; filtrar el sobrenadante a traves de un primer filtro, para dar un primer filtrado; filtrar el filtrado a traves de un segundo filtro, para dar un segundo filtrado; y ultracentrifugar el segundo filtrado, para dar vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas como un sedimento.
En otra divulgacion, el procedimiento puede comprender, ademas, la concentracion del primer filtrado despues de la filtracion a traves del primer filtro.
En otra divulgacion, el procedimiento puede comprender, ademas, suspender el sedimento despues de la suspension.
Tambien se contempla de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invencion un modelo animal de enfermedad establecido usando vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular.
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En este contexto, las bacterias grampositivas y las vesmulas extracelulares son como se ha descrito respectivamente anteriormente.
En otra realizacion, la enfermedad puede ser una enfermedad localizada, incluyendo, pero sin limitaciones, una enfermedad cutanea, tal como atopia, una enfermedad respiratoria, tal como rinitis, sinusitis, cancer nasofarmgeo, bronquitis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, bronquiectasia, neumoma y cancer de pulmon, una enfermedad digestiva, tal como estomatitis, cancer de la cavidad oral, esofagitis, cancer de esofago, gastritis, cancer de estomago, enfermedad inflamatoria intestinal y cancer colorrectal, y una enfermedad genital, tal como vaginitis, cervicitis, y cancer de cuello uterino.
En otra realizacion, la enfermedad puede ser una enfermedad sistemica, incluyendo, pero sin limitaciones, una enfermedad vascular, tal como sepsis, trombosis/embolia, arteriosclerosis, accidente cerebrovascular, smdrome coronario agudo y enfermedad vascular isquemica, una enfermedad metabolica, tal como diabetes y obesidad, una enfermedad pulmonar, tal como enfisema y smdrome de dificultad respiratoria aguda, una enfermedad osea, tal como artritis y osteoporosis, y una enfermedad de los pares craneales, tal como demencia, enfermedades neurodegenerativas, y depresion.
En otra realizacion, el animal puede ser un raton, pero no estan limitados al mismo.
De acuerdo con aun un aspecto adicional de la misma, la presente invencion proporciona un procedimiento para establecer un modelo animal de enfermedad, que comprende administrar a un animal vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular.
A este respecto, las bacterias grampositivas, las vesmulas extracelulares y la enfermedad son como se ha descrito respectivamente anteriormente.
La administracion incluye administracion transdermica, intranasal, intratraqueal, oral, subcutanea, intraperitoneal, intravascular y rectal.
De acuerdo con aun otro aspecto adicional de la misma, la presente invencion proporciona un procedimiento para descubrir un biomarcador usando un modelo animal de enfermedad, establecido con las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular.
De acuerdo con aun un aspecto adicional de la misma, la presente invencion proporciona un procedimiento para la deteccion selectiva de un candidato a farmaco preventivo o terapeutico de una enfermedad causada por vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular, en el que el procedimiento comprende la administracion de las vesmulas extracelulares a las celulas junto con un farmaco candidato, y determinar el nivel del mediador relacionado con la inflamacion o evaluar una via de senalizacion relacionada con la inflamacion.
A este respecto, las bacterias grampositivas, las vesmulas extracelulares y la enfermedad son como se ha descrito respectivamente anteriormente.
De acuerdo con una realizacion de este aspecto, el procedimiento de deteccion selectiva comprende el tratamiento de celulas con las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas. Las celulas pueden incluir celulas inflamatorias, celulas epiteliales, celulas endoteliales vasculares, celulas fibroblastos, y celulas madre. Las celulas inflamatorias incluyen monocitos, neutrofilos, eosinofilos, basofilos y celulas diferenciadas a partir de los monocitos en los tejidos. Las celulas madre pueden derivar de, pero sin limitaciones, medula osea o tejido adiposo.
De acuerdo con aun otro aspecto de la misma, la presente invencion proporciona una vacuna para la profilaxis o terapia de la infeccion producida por bacterias grampositivas, que comprende vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular, en el que hay bacterias grampositivas en la vacuna y en el que las vesmulas extracelulares se afsla y secrecion del cuerpo interno de un animal o un cultivo de dichas bacterias grampositivas.
En este contexto, las bacterias grampositivas y las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas son como se ha descrito respectivamente anteriormente.
De acuerdo con una realizacion de este aspecto, la infeccion producida por bacterias grampositivas puede incluir, pero no se limita a, infeccion de la piel, infeccion respiratoria, infeccion urogenital, infeccion osea, infeccion del sistema nervioso central y sepsis.
De acuerdo con otra realizacion de este aspecto, la vacuna puede modificarse para mejorar la eficacia medicinal o aliviar los efectos secundarios. La modificacion se puede conseguir mediante el uso de bacterias transformadas o mediante el tratamiento de las bacterias con un compuesto. Este compuesto puede incluir un farmaco.
En otra realizacion, las vesmulas extracelulares pueden modificarse mediante tratamiento con un compuesto con el fin de mejorar la eficacia medicinal o aliviar los efectos secundarios, incluyendo dicho compuesto un farmaco.
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En una realizacion adicional, la vacuna se puede usar en combinacion con un farmaco o un inmunoestimulante para mejorar la eficacia medicinal o aliviar los efectos secundarios, pero la presente invencion no esta limitada por esto.
De acuerdo con otra realizacion, la vacuna puede modificarse para mejorar la eficacia medicinal o aliviar los efectos secundarios. La modificacion se puede conseguir mediante el uso de bacterias transformadas o mediante el tratamiento de las bacterias con un compuesto. Este compuesto puede incluir un farmaco.
En otra realizacion, las vesmulas extracelulares pueden modificarse mediante tratamiento con un compuesto con el fin de mejorar la eficacia medicinal o aliviar los efectos secundarios, incluyendo dicho compuesto un farmaco.
En una realizacion adicional, la vacuna se puede usar en combinacion con un farmaco o un inmunoestimulante para mejorar la eficacia medicinal o aliviar los efectos secundarios, pero la presente invencion no esta limitada por esto.
Se da a conocer de acuerdo con la presente invencion un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad que comprende la administracion a un mairnfero vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas a una dosis subletal.
En este contexto, las bacterias grampositivas y las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas son como se ha descrito anteriormente.
De acuerdo con una realizacion, la enfermedad incluye una enfermedad que esta causada o agravada por vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
En otra realizacion, la enfermedad puede ser una enfermedad localizada, incluyendo, pero sin limitaciones, una enfermedad cutanea, tal como atopia, una enfermedad respiratoria, tal como rinitis, sinusitis, cancer nasofarmgeo, bronquitis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, bronquiectasia, neumoma y cancer de pulmon, una enfermedad digestiva, tal como estomatitis, cancer de la cavidad oral, esofagitis, cancer de esofago, gastritis, cancer de estomago, enfermedad inflamatoria intestinal y cancer colorrectal, y una enfermedad genital, tal como vaginitis, cervicitis, y cancer de cuello uterino.
En otra realizacion, la enfermedad causada o agravada por vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas puede ser una enfermedad sistemica, incluyendo, pero sin limitaciones, una enfermedad vascular, tal como sepsis, trombosis/embolia, arteriosclerosis, accidente cerebrovascular, smdrome coronario agudo y enfermedad vascular isquemica, una enfermedad metabolica, tal como diabetes y obesidad, una enfermedad pulmonar, tal como enfisema y smdrome de dificultad respiratoria aguda, una enfermedad osea, tal como artritis y osteoporosis, y una enfermedad de los pares craneales, tal como demencia, enfermedades neurodegenerativas y depresion.
De acuerdo con una realizacion adicional, la enfermedad incluye infecciones producidas por bacterias grampositivas.
Las infecciones producidas por bacterias grampositivas de la presente invencion pueden incluir infecciones de la piel, infecciones respiratorias, infecciones urogenitales, infecciones oseas, infecciones del sistema nervioso central y sepsis, pero no se limita a las mismas.
En otra realizacion, la administracion incluye la inyeccion subcutanea, aplicacion dermica, inyeccion intravenosa, administracion intranasal, administracion sublingual, inhalacion intratraqueal, administracion oral y administracion intrarrectal.
En otra realizacion, las vesmulas extracelulares pueden modificarse para mejorar la eficacia medicinal o aliviar los efectos secundarios. La modificacion se puede conseguir mediante el uso de bacterias transformadas o mediante el tratamiento de las bacterias o vesmulas extracelulares con un compuesto. Este compuesto puede incluir un farmaco.
En una realizacion adicional, las vesmulas extracelulares pueden usarse en combinacion con un farmaco o un inmunoestimulante para mejorar la eficacia medicinal o aliviar los efectos secundarios, pero la presente invencion no esta limitada por esto.
Asimismo, se contempla de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invencion un procedimiento para diagnosticar un factor causal de una enfermedad mediante la aplicacion de vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular.
En este contexto, las bacterias grampositivas y las vesmulas extracelulares son como se ha descrito anteriormente, respectivamente.
En una realizacion de este aspecto, la enfermedad incluye una enfermedad que esta causada o agravada por vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas. La enfermedad causada o agravada por vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas es tal como se ha mencionado anteriormente.
De acuerdo con otra realizacion adicional, la enfermedad incluye infecciones producidas por bacterias grampositivas. Las infecciones producidas por bacterias grampositivas de la presente invencion pueden incluir infecciones de la
piel, infecciones respiratorias, infecciones urogenitales, infecciones oseas, infecciones del sistema nervioso central y sepsis, pero no se limita a las mismas.
De acuerdo con otra realizacion, la aplicacion puede comprender el analisis de las secuencias de bases de un material genetico contenido en las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas. El material 5 genetico puede ser ARNr de 16S, pero no se limita al mismo.
De acuerdo con otra realizacion, la aplicacion puede incluir la determinacion del nivel de protemas en las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas o la determinacion de una respuesta inmunitaria a las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas, pero no se limita a ello. La determinacion de una respuesta inmunitaria puede incluir la determinacion cuantitativa de anticuerpos frente a las vesmulas extracelulares derivadas 10 de bacterias grampositivas, pero no se limita a la misma.
En otra realizacion, el diagnostico se puede determinar con una muestra seleccionada del grupo que consiste en, pero no limitado a, sangre, flemas, lagrimas, heces, orina, lfquido cefalorraqmdeo, lfquido sinovial, lfquido pleural, y ascitis.
Efectos ventajosos
15 Basandose en el hallazgo de que las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, una bacteria grampositiva que coloniza el tracto digestivo o vive en los ambientes circundantes, causan enfermedades locales caracterizadas por inflamacion dermica y mucosa, asf como enfermedad sistemica, tal como sepsis, que se caracteriza por respuestas inflamatorias sistemicas tras la introduccion en la sangre, y trombosis/embolia inducida por coagulacion intravascular, la presente invencion utiliza vesmulas extracelulares derivadas de bacterias 20 grampositivas en el establecimiento de un modelo de enfermedad, un procedimiento para la deteccion selectiva de farmacos candidatos preventivos o terapeuticos de enfermedades, una vacuna para la profilaxis o terapia de enfermedades y un procedimiento para el diagnostico de un factor patogenico de una enfermedad.
En la presente invencion, se encontro que, cuando las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas se aplicaron a las celulas, indujeron la secrecion de un factor inflamatorio de las celulas y, cuando se administran por 25 via topica, causadas por inflamacion dermica o mucosa, y enfermedades sistemicas, incluyendo sepsis,
trombosis/embolia inducida por coagulacion sangumea intravascular cuando se inyectan por via intraperitoneal. Por tanto, la presente invencion se puede utilizar para construir un modelo animal de enfermedad y un procedimiento para la deteccion selectiva eficaz de candidatos a farmacos. Ademas, el modelo de enfermedad o el procedimiento de deteccion selectiva utilizando vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas permite la 30 excavacion eficaz de farmacos preventivos o terapeuticos de enfermedades causadas por las vesmulas
extracelulares derivadas de bacterias grampositivas. Adicionalmente, las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas o sus modificaciones se pueden aplicar al desarrollo de una vacuna preventiva o terapeutica de infecciones producidas por bacterias grampositivas o una enfermedad causada por las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas, ya que pueden inducir respuestas inmunitarias controladas cuando se 35 administran. Por otra parte, las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas tambien se utilizan para desarrollar una tecnologfa utilizada para diagnosticar un factor patogenico de las infecciones producidas por bacterias grampositivas o las enfermedades causadas por las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
Descripcion de los dibujos
40 La figura 1 son imagenes de microscopia electronica de transmision que muestra Staphylococcus aureus de gemacion de vesmulas extracelulares.
La figura 2 son imagenes de microscopia electronica de barrido que muestra Staphylococcus aureus de gemacion de vesmulas extracelulares.
La figura 3 es una imagen de microscopio electronico de transmision (a) y una imagen de microscopio electronico de 45 barrido (b) que muestra vesmulas extracelulares aisladas de Staphylococcus aureus.
La figura 4 es un grafico que muestra una distribucion de tamano de las vesmulas extracelulares aisladas de Staphylococcus aureus.
La figura 5 es una fotograffa que muestra los resultados de SDS-PAGE de protemas de Staphylococcus la celula entera (WC), la pared celular (CW), la membrana plasmatica (MP), el citoplasma (CY) y las vesmulas extracelulares 50 (EV), tenidas con azul de Coomassie.
La figura 6 son imagenes de microscopia electronica de transmision que muestra Staphylococcus epidermis de gemacion de vesmulas extracelulares.
La figura 7 son imagenes de microscopia electronica de barrido que muestra Staphylococcus epidermis de gemacion de vesfculas extracelulares.
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La figura 8 es una imagen de microscopio electronico de transmision (a) y una imagen de microscopio electronico de barrido (b) que muestra vesmulas extracelulares aisladas de Staphylococcus epidermis.
La figura 9 es un grafico que muestra una distribucion de tamano de las vesmulas extracelulares aisladas de Staphylococcus epidermis.
La figura 10 son imagenes de microscopia electronica de transmision que muestra Bacillus subtilis de gemacion de vesmulas extracelulares.
La figura 11 son imagenes de microscopia electronica de barrido que muestra Bacillus subtilis de gemacion de vesmulas extracelulares.
La figura 12 es una imagen de microscopio electronico de transmision (a) y una imagen de microscopio electronico de barrido (b) que muestra vesmulas extracelulares aisladas de Bacillus subtilis.
La figura 13 es un grafico que muestra una distribucion de tamano de las vesmulas extracelulares aisladas de Bacillus subtilis.
La figura 14 es un diagrama de Venn que muestra la identificacion de 90 protemas de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus por analisis proteomico, en el que 41 y 84 protemas se detectan a traves digestion con tripsina en gel y digestion con tripsina en solucion, respectivamente, con 35 protemas solapantes entre las dos digestiones con tripsina.
La figura 15 corresponde a graficos que muestran que los niveles de expresion de las citocinas inflamatorias TNF-a y IL-6 aumentan con un incremento de la concentracion de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus aplicadas a macrofagos de raton.
La figura 16 corresponde a graficos que muestran los niveles de expresion de diversos mediadores inflamatorios en las celulas fibroblastos de raton tratados con vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
La figura 17 es un diagrama que muestra un protocolo experimental para causar un smtoma similar a la dermatitis atopica en el que se aplican vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus tres veces a la semana durante 4 semanas a una piel de raton y se evaluan diversos indices 48 horas despues de la ultima aplicacion.
La figura 18 muestra smtomas similares a la dermatitis atopica que incluyen engrosamiento de la epidermis (drculos rojos) e infiltracion de neutrofilos (cabezas de flecha) despues de aplicar vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus a una piel de raton de acuerdo con el protocolo de la figura 17.
La figura 19 corresponde a graficos que muestran evaluaciones numericas de los smtomas observados en la figura 18, en las que el espesor de la epidermis y los recuentos de la infiltracion de los mastocitos y los neutrofilos se incrementan mediante vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
La figura 20 corresponde a graficos que muestran los niveles de citocinas inflamatorias en la piel de raton tratada con vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus de acuerdo con la figura 17, en los que los niveles de citocinas inflamatorias aumentan con un aumento de la concentracion de las vesmulas.
La figura 21 es un grafico que muestra la presencia de antfgenos caractensticos de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus en un lfquido de lavado de la piel de pacientes con dermatitis atopica, medida mediante ELISA.
La figura 22 es un grafico que muestra que el nivel de anticuerpos de tipo IgE espedficos de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus estaba significativamente elevado en el suero de los pacientes con dermatitis atopica sobre el de los controles sanos.
La figura 23 es un diagrama que muestra un protocolo para la evaluacion de la inmunidad innata inducida tras la administracion intranasal de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
La figura 24 corresponde a graficos que muestran que los niveles de las celulas inflamatorias y la citocina IL-6 estaban significativamente elevados en el fluido de lavado broncoalveolar de los ratones que han inhalado vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus de acuerdo con el protocolo de la figura 13 sobre los de los controles.
La figura 25 es un diagrama que muestra un protocolo para la evaluacion de la inmunidad adaptativa inducida tras la aplicacion intranasal de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
La figura 26 corresponde a graficos que muestran la induccion de inmunidad mediada por Th17 en el moco traqueal, en los que los niveles de las celulas inflamatorias y la citocina IL-7 estaban elevados en el fluido de lavado broncoalveolar de los ratones que han inhalado vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus de acuerdo con el protocolo de la figura 25 sobre los de los controles.
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La figura 27 es un diagrama que muestra un protocolo experimental para confirmar la dosis letal de las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus en ratones.
La figura 28 es un grafico que muestra las tasas de supervivencia de los ratones tratados con vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
La figura 29 es un grafico que muestra la induccion de hipotermia, un mdice para la inflamacion sistemica, por vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
La figura 30 es un diagrama que muestra un protocolo para el establecimiento de un modelo animal de coagulacion intravascular diseminada con vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
La figura 31 corresponde a fotograffas que muestran tejidos pulmonares tenidos con H & E extirpados despues de la aplicacion de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus de acuerdo con el protocolo de la figura. 30.
La figura 32 es un grafico que muestra los niveles plasmaticos del dfmero-D medidos despues de la aplicacion de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus de acuerdo con el protocolo de la figura 30.
La figura 33 muestra los niveles plasmaticos de plaquetas medidos despues de la aplicacion de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus de acuerdo con el protocolo de la figura 30.
La figura 34 es un diagrama esquematico que muestra el descubrimiento de farmacos candidatos utilizando vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
La figura 35 es un grafico que muestra los niveles de IL-6 de los cultivos de macrofagos de raton como porcentajes de los del control positivo cuando los macrofagos de raton fueron tratados con vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y profarmacos.
La figura 36 es un grafico que muestra los niveles de IL-6 en los lfquidos de lavado broncoalveolar obtenidos despues de inyectar por via intraperitoneal los profarmacos Doxepina y haloperidol en ratones inmunizados con las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus por inyeccion intranasal.
La figura corresponde a imagenes del microscopio de fluorescencia que muestra la absorcion de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus por las celulas dendnticas de raton.
La figura 38 es un grafico que muestra que las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus indujeron la secrecion de la citocina IL-12p40 a partir de celulas dendnticas de raton de una manera dependiente de la dosis.
La figura 39 corresponde a graficos que muestran que las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus indujeron la expresion de CD40 y MHCII en la superficie de las celulas dendnticas de raton de una manera dependiente de la dosis.
La figura 40 es un diagrama que muestra un protocolo para medir el nivel de los anticuerpos inducidos por las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
La figura 41 es un grafico que muestra aumento de los niveles de anticuerpos IgG espedficos de las vesfculas extracelulares en los sueros de raton obtenidos de acuerdo con el protocolo de la figura 40.
La figura 42 es un diagrama que muestra un protocolo para la medicion de los indices inmunologicos inducidos en los ratones inmunizados con vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus como una vacuna.
La figura 43 corresponde a graficos que muestran niveles elevados de IFN-y IL-17 en los esplenocitos de raton obtenidos despues de llevar a cabo la inmunizacion segun el protocolo de la figura 42.
La figura 44 es un diagrama que muestra un protocolo para la aplicacion de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus una vez a la semana durante cuatro semanas a traves de un parche en la piel del raton a la que se ha aplicado y retirado cinta adhesiva.
La figura 45 es un grafico que muestra los niveles de anticuerpos IgG en suero despues de la administracion por via transdermica de las vesfcuias extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus de acuerdo con el protocolo de la figura 42, en el que la administracion transdermica de las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus indujo en gran medida la produccion de anticuerpos IgG espedficos de las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, en comparacion con el control.
La figura 46 corresponde a fotograffas que muestran que los niveles de las citocinas de Th1 y Th17 en los esplenocitos aumentaron en respuesta a la estimulacion de las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus despues de tratar a ratones con las vesfculas de acuerdo con el protocolo de la figura 42.
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La figura 47 es un diagrama que muestra un protocolo para la evaluacion de los mdices inmunologicos en los ratones estimulados con Staphylococcus despues de la inmunizacion con una combinacion de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y polyl: C.
La figura 48 es un grafico que muestra niveles incrementados de anticuerpos IgG espedficos de las vesfculas extracelulares en los sueros de raton obtenidos de acuerdo con el protocolo de la figura 47.
La figura 49 es un grafico que muestra niveles incrementados de IFN-y and IL-17 de las vesfculas extracelulares en esplenocitos de raton obtenidos de acuerdo con el protocolo de la figura 47.
La figura 50 es un grafico que muestra las tasas de supervivencia de los ratones a los que se han administrado por via intranasal dos dosis diferentes de Staphylococcus aureus.
La figura 51 es un grafico que muestra una tasa de supervivencia elevada de los ratones en los que se genero neumoma por Staphylococcus despues de que inmunizarlos con una combinacion de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y polyl: C.
La figura 52 es un grafico que muestra niveles elevados de anticuerpos IgG espedficos de las vesfculas en sueros obtenidos despues de administrar a los ratones vesfculas extracelulares derivadas de Enterococcus faecalis.
La figura 53 es un grafico que muestra niveles elevados de IFN-y en los esplenocitos obtenidos despues de administrar a los ratones vesfculas extracelulares derivadas de Enterococcus faecalis.
La figura 54 es una fotograffa que muestra la presencia de ARNr 16S y ADN dentro de las vesfculas extracelulares tal como se analizo mediante RT-PCR y PCR, respectivamente.
Mejor modo
Tal como se utiliza en el presente documento, con el termino "bacterias grampositivas" se pretende abarcar aquellas que pertenecen al filo Firmicutes y al filo Actinobacteria, ambos caracterizados por la falta de la membrana externa y la presencia de una pared celular gruesa, y la clase Mollicutes, que carece de paredes celulares y no se puede tenir con la tincion de Gram, pero parecen haber derivado evolutivamente del filo Firmicutes. Entre las bacterias grampositivas con la pared celular se encuentran Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Norcardia, Clostridium, Lactobacillus, Actinobacteria, y Listeria. El micoplasma es representativo de bacterias grampositivas desprovistas de pared celular.
Tal como se utiliza en el presente documento, se pretende que el termino "cuerpo interno" abarque las superficies de la piel y los lumenes y revestimientos de estructuras tubulares internas en los animales. Por el termino "estructuras tubulares internas" se quiere decir las relacionadas con los tractos, incluyendo el tracto digestivo, el tracto respiratorio y el tracto urogenital. Por ejemplo, "tracto digestivo" incluye la cavidad oral, el esofago, el estomago, el intestino delgado, el intestino grueso, el recto, el ano, el conducto biliar, el conducto dstico y el conducto pancreatico. El "tracto respiratorio" incluye la conjuntiva, la cavidad nasal, los senos paranasales, la nasofaringe, la traquea, los bronquios, los bronquiolos y los alveolos. El "tracto urogenital" incluye el rinon, el ureter, la vejiga, la uretra, la vagina, el cuello uterino y el utero. No obstante, la presente invencion no esta limitada por estos ejemplos.
Por el termino "ambiente circundante" se quiere decir todos los entornos, a excepcion del cuerpo interno, incluyendo, pero sin limitaciones, el aire interior, el aire exterior, el suelo y el mar.
La expresion "vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas", tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a las que se forman de manera espontanea o se secretan de forma artificial por las bacterias grampositivas que viven en el cuerpo interno. Tfpicamente, las vesfculas tienen un tamano mas pequeno que sus celulas de origen, pero esto no limita el alcance de la presente invencion de ninguna manera.
Bacterias grampositivas hacen referencia a las bacterias que se tinen de color violeta mediante tincion de Gram y carecen de membrana externa y contienen cantidades altas de peptidoglicano en sus paredes celulares en oposicion a las bacterias gramnegativas.
Filogeneticamente, las bacterias grampositivas se clasifican en el filo Firmicutes, caracterizado por una pared celular gruesa y un contenido bajo de G + C, que puede tener forma de esfera (cocos), tal como en Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus, o forma de baston (bacilos), tal como en Bacillus, Corynebacterium, Nocardia, Clostridium, Lactobacillus, Listeria.
La clase Mollicutes, aunque carecen de pared celular, parecen haber derivado evolutivamente desde el filo Firmicutes y, por lo tanto, se clasifican como bacterias grampositivas. Es tfpico Mycoplasma.
La mayona de los agentes patogenos en seres humanos son bacterias grampositivas. Entre ellas son representativas Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Listeria, Bacillus y Clostridium.
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En la decada de 1960, la microscopia electronica revelo que las celulas gramnegativas liberan vesmulas extracelulares. Las vesmulas extracelulares liberadas de las bacterias gramnegativas son esfericas con un tamano de 20-200 nm y consisten en bicapas de fosfoKpidos. Las vesmulas extracelulares de bacterias gramnegativas tienen varias protemas de membrana externa, asf como LPS. Recientemente, los presentes inventores informaron por primera vez que las vesmulas extracelulares derivadas de la flora intestinal, cuando se absorben por via sistemica en el cuerpo, causan enfermedades sistemicas, tales como sepsis, coagulacion de la sangre, enfisema, etc.
El conocimiento perjudicial de que las vesmulas extracelulares se liberan en su mayona de la membrana externa como en las bacterias gramnegativas ha bloqueado el descubrimiento de las vesmulas extracelulares liberadas de las bacterias grampositivas, porque las bacterias grampositivas carecen de membrana externa y estan rodeadas por una pared celular gruesa.
En la presente invencion, se informo por primera vez que las bacterias cocos grampositivas Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis liberan vesmulas extracelulares que se descubre que son esfericas en un microscopio electronico y que vanan de tamano de 10 a 100 nm, medido por un procedimiento de dispersion dinamica de la luz.
Asimismo, los presentes inventores informaron por primera vez las vesmulas extracelulares derivadas de las bacterias grampositivas con forma de baston Bacillus subtilis que se ha observado que son esfericas en un microscopio electronico, con un tamano de 10~100 nm medido por un procedimiento de dispersion dinamica de la luz.
En la presente invencion, se realizo un analisis proteomico en vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus mediante digestion con tripsina en gel y digestion con tripsina en solucion, que dio como resultado la identificacion de 41 y 84 protemas, respectivamente. De ellas, 35 protemas se solapaban entre las dos digestiones con tripsina, de manera que se detecto un total de 90 protemas de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
Se identificaron diversas protemas asociadas con enfermedades a partir de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus. En las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus existen los superantfgenos enterotoxina Q de staphylococcus y antfgenos secretores de staphylococcus (ssaA1 ssaA2) que actuan como protemas virulentas responsables de la aparicion de la sepsis o de smdrome de shock toxico. Las vesmulas tambien contienen toxinas, tales como alfa-hemolisina y gamma-hemolisina, que destruyen los eritrocitos y degradan la hemoglobina. Las proteasas estafopama A y ECM extracelular y la protema de union plasmatica, que estan directamente involucradas en la invasion y la penetracion de las bacterias en los tejidos del huesped, tambien se encontraron en las vesmulas. Asimismo, se identificaron protemas relacionadas con la coagulacion de la sangre, tales como estafilocoagulasa y protemas de union al factor de von Willebrand. Estas protemas estan implicadas en la aparicion de sepsis y smdrome de choque toxico, que se caracteriza por coagulacion intravascular de la sangre, asf como enfermedades vasculares, incluyendo smdrome coronario agudo y accidente cerebrovascular, causados por la formacion de trombos dentro de una arteria coronaria, trombosis venosa profunda y embolia pulmonar. En las vesmulas extracelulares tambien se encuentran la protema de union a IgG de S. aureus (SBI) que puede dotar a las bacterias de la funcion de evasion inmunitaria mediante la inhibicion de la fagocitosis de las celulas inmunitarias del huesped que estan implicadas en la aparicion de dermatitis atopica mediante la induccion de la expresion de SIL-18 en celulas de la epidermis y el aumento de los niveles de IgE en suero.
Sobre la base de la presencia de protemas responsables de diversas enfermedades en vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus como se identifica mediante analisis de proteomica, se administraron vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus ex vivo a macrofagos de raton para examinar la secrecion de citocinas inflamatorias. Las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus indujeron la secrecion de las citocinas inflamatorias TNF-a e interleucina-6 (IL-6) de una manera dependiente de la dosis.
La capacidad de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus para inducir la secrecion de mediadores de la inflamacion tambien se examino en celulas fibroblastos de raton. Las celulas fibroblastos tratadas con vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus secretaron linfopoyetina estromal tfmica (TSLP), eotaxina y protema inflamatoria de macrofagos (MIP)-1a asf como TNF (factor de necrosis tumoral)-a e IL-6.
Staphylococcus aureus vive en la piel y casi el 100 %, particularmente en la piel de pacientes con dermatitis atopica. Se realizo una prueba cutanea para examinar si las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus causan inflamacion local, tal como dermatitis atopica. Se observo una inflamacion, tal como en pacientes con dermatitis atopica cuando se aplicaron vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus tres veces a la semana durante 4 semanas para hacer observaciones tras la aplicacion y retirada de cintas adhesivas. Ademas, se descubrio que las vesmulas extracelulares aisladas del lfquido de lavado de la piel de los pacientes con dermatitis atopica se originaban de Staphylococcus aureus, tal como se mide mediante un anticuerpo espedfico de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus. Ademas, los sueros de los pacientes con dermatitis atopica conteman un nivel significativamente mas alto de anticuerpos IgE espedficos de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus que los de las personas normales. A partir de estos resultados, es evidente que
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las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus actuan como factor importante en la generacion o la exacerbacion de la dermatitis atopica.
Staphylococcus aureus se transmite a traves del aire e infecta la mucosa del tracto respiratorio superior. En la presente invencion, se realizo un examen para ver si las vesmulas extracelulares extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus indudan inflamacion local en la mucosa del tracto respiratorio. Cuando las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus se administraron por via intranasal una vez, la poblacion de celulas inflamatorias en fluido de lavado broncoalveolar aumento con un aumento de la concentracion de las vesmulas. El nivel de IL-6, que desempena un papel importante en la diferenciacion de Th17 (T colaborador de tipo 17), se incremento tambien. Cuando las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus se administraron por via intranasal dos veces a la semana durante tres semanas, el recuento total de celulas inflamatorias y, en particular, el recuento de neutrofilos se incrementaron en el fluido de lavado broncoalveolar, con una produccion alta concomitante de IL-17 de Th17. Estos resultados indican que las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus actuan como un factor patogenico de la inflamacion neutrofflica mediada por IL- 17 en la mucosa.
La sepsis se caracteriza por inflamacion sistemica y la presencia de una sustancia patogena en sangre despues de una infeccion bacteriana local. En la presente invencion, se examino la induccion de sepsis mediante inyeccion intravenosa de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus. Aproximadamente el 40 % de los ratones a los que se ha inyectado por via intravenosa una dosis alta de vesmulas extracelulares estaban muertos. Asimismo se observo hipotermia, un criterio de sepsis, despues de la inyeccion de las vesmulas extracelulares, lo que demuestra que las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus pueden causar sepsis cuando se introducen en los vasos sangumeos.
Segun se identifico anteriormente en el analisis proteomico, las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus contienen protemas relacionadas con la coagulacion de la sangre. En la presente invencion, se realizo un examen para ver si las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus causan coagulacion de la sangre y, por lo tanto, forman trombos. Cuando se administran por via intravenosa, subcutanea o intranasal, las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus elevaron el nivel de dfmero D, un mdice para la coagulacion intravascular, en suero y redujeron el recuento de plaquetas, otro mdice, en la sangre periferica. Ademas, se observaron trombos en los vasos sangumeos pulmonares tras la administracion intravenosa, subcutanea o intranasal de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus. Por tanto, estos resultados sugieren que cuando se introducen en los vasos sangumeos, las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus pueden inducir trombosis o embolia a traves de coagulacion intravascular.
Es muy importante aclarar los factores causales exactos de una enfermedad para desarrollar farmacos para la prevencion o el tratamiento de la misma. Por ejemplo, se puede realizar una deteccion selectiva de los farmacos candidatos para determinar la eficacia farmaceutica, ya sea en el curso del tratamiento ex vivo de las celulas con el factor causal o cuando se administran al modelo animal. La presente invencion incluye el desarrollo de un procedimiento para la deteccion selectiva de farmacos candidatos utilizando vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y utilizando el procedimiento o farmacos utiles para la prevencion o el tratamiento de enfermedades causadas por vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas. Por ejemplo, de 102 profarmacos diferentes, la eficacia farmaceutica de 19 farmacos candidatos se selecciono y se evaluo en el modelo animal de enfermedad. Es decir, el procedimiento de deteccion selectiva de acuerdo con la presente invencion se puede utilizar para descubrir farmacos preventivos o terapeuticos de las vesmulas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
Ademas, los adyuvantes inmunologicos, incluyendo el acido lipoteicoico (LTA) y peptidoglicanos, asf como diversas protemas, incluyendo las protemas toxinas (enterotoxina estafilococica Q, K) se encuentran en vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus. Durante el curso del desarrollo de la presente invencion, se analizaron los marcadores inmunologicos en los ratones con el fin de evaluar la utilidad del uso de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus como vacuna para la profilaxis y terapia de infecciones bacterianas. La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para mejorar la eficacia de las vesmulas extracelulares o aliviar los efectos secundarios de las vesmulas extracelulares. Cuando las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus se inyectaron por via subcutanea, junto con el acido sintetico ARNdc poliinosmico-policitidflico (polyl: C), a ratones, los niveles de IgG en sangre se elevaron junto con las citocinas de esplenocitos IFN (interferon)-Y e IL-17. Por lo tanto, las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, cuando se inyectan por via subcutanea, pueden inducir eficazmente respuestas inmunitarias de Th1 (celulas T colaboradoras de tipo °) y Th17, asf como reacciones de anticuerpos.
Se evaluaron las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus para determinar la eficacia farmaceutica como vacuna contra la neumoma causada por Staphylococcus aureus. Cuando se indujo neumoma en ratones, ninguno de los ratones expuestos a la vacuna de vesmulas murio, mientras que aproximadamente el 60 % de los ratones no inmunizados murio de neumoma. Este resultado implica que las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus pueden ser utiles como vacuna que previene las infecciones bacterianas.
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Como se ha descrito anteriormente, se pueden generar diversas enfermedades mediante vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus, lo que indica que las vesfculas extracelulares sirven como agente patogeno importante para las enfermedades cuyas causas han permanecido poco claras. Para proporcionar un procedimiento para el diagnostico de un agente patogeno, se examinaron las vesfculas extracelulares bacterianas para ver si contienen un material genetico. Como resultado, se detectaron ARNr de 16S y ADN medido por PCR. Basandose en esta observacion, el examen de los materiales geneticos en una muestra tal como sangre, que se pueden obtener con facilidad, permite identificar facilmente el agente patogeno de una enfermedad, lo que permite que la enfermedad que se va a diagnosticar.
Se puede obtener una mejor comprension de la presente invencion mediante los ejemplos siguientes que se exponen para ilustrar pero que no deben interpretarse como limitantes de la presente invencion.
EJEMPLO 1: Observacion en microscopio electronico de Staphylococcus aureus
Se cultivo Staphylococcus aureus (ATCC14458) a una D.O. a 600 nm de 1 en caldo nutriente. Despues de la centrifugacion del caldo a 10.000 x g durante 20 minutos, el sedimento de Staphylococcus aureus se fijo durante 2 horas en 2,5 % de glutaraldehfdo y se fijo despues durante 1 hora en 1 % de tetroxido de osmio. A la deshidratacion con una serie de solucion de etanol graduada le siguio inclusion en resina epoxi. El bloque resultante se secciono en laminas ultrafinas de 70 nm de espesor. Las secciones de celulas se adsorbieron durante 3 minutos en una rejilla de cobre recubierta de carbono con descarga luminiscente y se tineron con acetato de uranilo al 2 % y citrato de plomo. Se realizaron observaciones con microscopio electronico de transmision (TEM) (JEM101, Jeol, Japon) de la celula. Como se puede ver en las imagenes de TEM de la figura 1, se observaron vesfculas extracelulares con un tamano de 20 a 100 nm en gemacion desde Staphylococcus aureus.
Del mismo modo, se realizo microscopia electronica de barrido (SEM). En este sentido, se centrifugo el mismo cultivo de Staphylococcus aureus como se ha mencionado anteriormente, despues de lo cual el sedimento de celulas se fijo durante 1 hora en 2,5 % de glutaraldehfdo, despues de la fijacion durante 1 hora en 1 % de tetroxido de osmio y se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol graduado antes de un procedimiento de secado en el punto cntico utilizando un sistema de CO2 (secador en el punto cntico HCP-2, HITACH, Japon). La muestra bacteriana se monto sobre una punta y se recubrio con platino (Pt) para la observacion en un microscopio electronico de barrido JSM-7401F (Jeol, Japon).
Como se puede ver en las imagenes SEM de la figura 2, Staphylococcus aureus liberaron vesfculas extracelulares. Ejemplo 2: Preparacion de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus [Aislamiento de vesfculas extracelulares generales]
Se inoculo Staphylococcus aureus en 3 ml de caldo nutriente en un tubo de ensayo y se cultivo a 37 °C durante 6 horas. Del cultivo, se transfirieron 5 pl a 500 ml de caldo nutritivo en un matraz Erlenmeyer de 2 l y se incubaron a 37 °C durante 4 horas a una D.O. (600 nm) de 1,0. Todo el cultivo se asigno igualmente a tubos de ultracentnfuga de 500 ml y se centrifugo a 4 °C y 10.000 x g durante 20 minutos. Se dejo pasar el sobrenadante una vez a traves de un filtro de membrana con un tamano de poro de 0,45 pm y el filtrado se concentro 25 veces utilizando el sistema Quixstand con 100 kDa de corte. Despues de un pase del concentrado a traves de un filtro de membrana con un tamano de poro de 0,22 pm, el filtrado resultante se ultracentrifugo a 4 °C y 150.000 x g durante 3 horas en tubos de ultracentnfuga de 70 ml. Los sedimentos formados de este modo se resuspendieron en PBS (solucion salina tamponada con fosfato) para separar las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
[Aislamiento de vesfculas extracelulares para su uso en analisis proteomico]
El mismo concentrado como se obtuvo en el aislamiento general de las vesfculas extracelulares se dejo pasar una vez a traves de un filtro de membrana con un tamano de poro de 0,22 pm, seguido de ultracentrifugacion a 4 °C y 150.000 x g durante 3 horas en tubos de ultracentnfuga de 70 ml. El sedimento se suspendio en 2,2 ml de solucion Optiprep al 50 %. La suspension se coloco en un tubo de ultracentnfuga de 5 ml, seguido de la adicion de 2 ml de una solucion Optiprep al 40 % y 0,8 ml de una solucion Optiprep al 10 % a la suspension en ese orden. La ultracentrifugacion a 4 °C y 200.000 xg durante 2 horas formo una capa de vesfculas extracelulares entre la solucion Optiprep al 40 % y la solucion Optiprep al 10 %.
EJEMPLO 3: Caractensticas de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
Las vesfculas extracelulares que se aislaron a partir de Staphylococcus aureus como en el Ejemplo 2 se adsorbieron durante 3 minutos en una rejilla de cobre recubierta de carbono con descarga luminiscente, que despues se lavaron con agua destilada y se tineron con 2 % de acetato de uranilo antes de la observacion con un microscopio electronico de transmision JEM101.
Como se muestra en la imagen de TEM de la figura 3a, las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus son esferas cerradas con un tamano de 20-100 nm. Las vesfculas extracelulares aisladas se fijaron sobre cubreobjetos de vidrio, se fijaron durante 1 hora en 2,5 % de glutaraldehfdo, se posfijaron durante 1 hora en 1 % de
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tetroxido de osmio, se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol graduado y , despues, se sometieron a secado de punto cntico usando un sistema de CO2. Las vesmulas extracelulares fijadas al cubreobjetos de vidrio se montaron en la punta y se observaron con un microscopio electronico de barrido JSM-7401F.
Como se entiende a partir de la imagen de SEM de la figura 3b, las vesmulas extracelulares son esfericas con tamanos relativamente uniformes (20-100 nm).
Las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus que se aislaron como en el Ejemplo 2 se diluyeron hasta 1 |jg/ml en 1 ml de PBS. Esta PBS se coloco en una cubeta que despues se sometio a analisis de tamano de partmula usando dispersion de luz dinamica. El resultado se representa en la figura 4.
Como se muestra en la figura 4, las vesmulas extracelulares vanan de tamano de 20 a 100 nm, con un tamano medio de partmula de 28,3 nm.
Las protemas de celulas enteras, las protemas de la pared celular, las protemas de membrana y las protemas citosolicas se obtuvieron del siguiente modo. Se cultivo Staphylococcus aureus a una D.O. (600 nm) de 1,0 en 3 ml de caldo nutriente, seguido de centrifugacion a 10.000 x g durante 20 minutos. El sedimento celular formado de este tipo se incubo con 20 jg/ml de tampon de lisostafina ml (Tris-EDTA) a 37 °C durante 15 minutos. A continuacion, se rompieron completamente las celulas con sonicacion y se centrifugaron a 8000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante exento de materiales insolubles se uso como una protema de celulas enteras. Con el fin de formar un protoplasto, por separado, el sedimento celular de Staphylococcus aureus se incubo con 20 jg/ml de tampon lisostafina ml (Tris-EDTA) y sacarosa 1,1 M a 37 °C durante 15 minutos. Despues de centrifugara 10.000 x g durante 20, el sobrenadante se utilizo como protemas de la pared celular. El sedimento resultante se resuspendio en tampon hipotonico y se ultracentrifugo a 40.000 x g durante 1 hora. El sobrenadante se utilizo para las protemas citosolicas, mientras que el sedimento se suspendio en tampon Tris (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) y se utilizo para las protemas de membrana. A 7 jg de cada una de las protemas celulares enteras, la protema de la pared celular, la protema citoplasmatica y la protema de la vesmula extracelular aisladas en el Ejemplo 2 se anadio una cantidad de colorante de carga (Tris-HCl 250 mM, 10 % de SDS, 0,5 %, de azul de bromofenol, 50 % de glicerol) que el colorante de carga se diluyo a 1x antes de ebullicion a 100 °C durante 10 minutos. Las muestras de protema se cargaron en un gel de poliacrilamida al 10 % y se pasaron a 80 V durante 2 horas por electroforesis. El gel se tino durante 2 horas con 0,25 % de azul brillante de Coomassie, seguido de incubacion durante 6 horas en una solucion decolorante (metanol: DDW : acido acetico: 5 : 4 : 1).
La figura 5 muestra los patrones de distribucion de las protemas para las protemas de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus en la celula entera (WC), la pared celular (CW), la membrana plasmatica (MP), el citoplasma (CY) y las vesmulas extracelulares (EV), tenidos con azul de Coomassie. Como puede verse, las protemas espedficas se clasificaron dentro de las vesmulas extracelulares (EV).
EJEMPLO 4: Observacion en microscopio electronico de Staphylococcus epidermis
Se cultivo Staphylococcus epidermis (ATCC12228) a una D.O. a 600 nm de 1 en caldo nutriente. Despues de la centrifugacion del caldo a 10.000 x g durante 20 minutos, el sedimento de Staphylococcus epidermis se fijo durante 2 horas en 2,5 % de glutaraldehfdo y se fijo despues durante 1 hora en 1 % de tetroxido de osmio. A la deshidratacion con una serie de solucion de etanol graduada le siguio inclusion en resina epoxi. El bloque resultante se secciono en laminas ultrafinas de 70 nm de espesor. Las secciones de celulas se adsorbieron durante 3 minutos en una rejilla de cobre recubierta de carbono con descarga luminiscente y se tineron con acetato de uranilo al 2 % y citrato de plomo. Se realizaron observaciones con microscopio electronico de transmision (Jeol, Japon) de la celula. Como se puede ver en las imagenes de TEM de la figura 6, se observaron vesmulas extracelulares con un tamano de 20-100 nm en gemacion desde Staphylococcus epidermis.
Del mismo modo, se realizo microscopia electronica de barrido (SEM). En este sentido, se centrifugo el mismo cultivo de Staphylococcus epidermis como se ha mencionado anteriormente a 10.000 x g durante 20 minutos, despues de lo cual el sedimento de celulas se fijo durante 1 hora en 2,5 % de glutaraldehfdo, despues de la fijacion durante 1 hora en 1 % de tetroxido de osmio y se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol graduado antes de un procedimiento de secado en el punto cntico utilizando un sistema de CO2. La muestra bacteriana se monto sobre una punta y se recubrio con platino para la observacion en un microscopio electronico de barrido. Como se puede ver en las imagenes de SEM de la figura 7, brotaban vesmulas extracelulares de Staphylococcus epidermis.
Ejemplo 5: Preparacion de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus epidermis
Se inoculo Staphylococcus epidermis en 3 ml de caldo nutriente en un tubo de ensayo y se cultivo a 37 °C durante 6 horas. Del cultivo, se transfirieron 5 jl a 500 ml de caldo nutritivo en un matraz Erlenmeyer de 2 l y se incubaron a 37 °C durante 4 horas a una D.O. (600 nm) de 1,0. Todo el cultivo se asigno igualmente a tubos de ultracentnfuga de 500 ml y se centrifugo a 4 °C y 10.000 x g durante 20 minutos. Se dejo pasar el sobrenadante desprovisto de celulas una vez a traves de un filtro de membrana con un tamano de poro de 0,45 jm y el filtrado se concentro 25 veces utilizando el sistema Quixstand con 100 kDa de corte. Despues de un pase del concentrado a traves de un filtro de membrana con un tamano de poro de 0,22 jm, el filtrado resultante se ultracentrifugo a 4 °C y 150.000 x g durante 3
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horas en tubos de ultracentnfuga de 70 ml. Los sedimentos formados de este modo se resuspendieron en PBS para separar las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus epidermis.
Ejemplo 6: Caracteristicas de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus epidermis
Las vesfculas extracelulares que se aislaron a partir de Staphylococcus epidermis como en el Ejemplo 5 se adsorbieron durante 3 minutos en una rejilla de cobre recubierta de carbono con descarga luminiscente, que despues se lavaron con agua destilada y se tineron con 2 % de acetato de uranilo antes de la observacion con un microscopio electronico de transmision JEM101.
Como se muestra en la imagen de TEM de la figura 8a, las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus epidermis son esferas cerradas con un tamano de 20-100 nm.
Las vesfculas extracelulares aisladas se fijaron sobre cubreobjetos de vidrio, se fijaron durante 1 hora en 2,5 % de glutaraldehndo, se posfijaron durante 1 hora en 1 % de tetroxido de osmio, se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol graduado y , despues, se sometieron a secado de punto cntico usando un sistema de CO2. Las vesfculas extracelulares fijadas al cubreobjetos de vidrio se montaron en la punta y se observaron con un microscopio electronico de barrido JSM-7401F.
Como se entiende a partir de la imagen de SEM de la figura 8b, las vesfculas extracelulares son esfericas con tamanos relativamente uniformes (20-100 nm).
Las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus epidermis que se aislaron como en el Ejemplo 2 se diluyeron hasta 1 pg/ml en 1 ml de PBS. Esta PBS se coloco en una cubeta que despues se sometio a analisis de tamano de parrtcula usando dispersion de luz dinamica. El resultado se representa en la figura 9.
Como se muestra en la figura 9, las vesfculas extracelulares vanan de tamano de 20 a 100 nm, con un tamano medio de parrtcula de 34 nm.
EJEMPLO 7: Observacion en microscopio electronico de Bacillus subtilis
Se cultivo Bacillus subtilis (KCTC3729) a una D.O. a 600 nm de 1 en caldo nutriente. Despues de la centrifugacion del caldo a 6.000 x g durante 15 minutos, el sedimento de Bacillus subtilis se fijo durante 2 horas en 2,5 % de glutaraldehfdo y se posfijo durante 1 hora en 1 % de tetroxido de osmio. A la deshidratacion con una serie de soluciones de etanol graduado le siguio inclusion en resina epoxi. El bloque resultante se secciono en laminas ultrafinas de 70 nm de espesor. Las secciones de celulas se adsorbieron durante 3 minutos en una rejilla de cobre recubierta de carbono con descarga luminiscente y se tineron con acetato de uranilo al 2 % y citrato de plomo. Se realizaron observaciones con microscopio electronico de transmision (Jeol, Japon) de la celula.
Como se puede ver en las imagenes de TEM de la figura 10, se observaron vesfculas extracelulares con un tamano de 20~100 nm en gemacion desde Bacillus subtilis.
Del mismo modo, se realizo microscopia electronica de barrido (SEM). En este sentido, se centrifugo el mismo cultivo de Bacillus subtilis como se ha mencionado anteriormente a 6.000 x g durante 15 minutos, despues de lo cual el sedimento de celulas se fijo durante 1 hora en 2,5 % de glutaraldehfdo, despues de la fijacion durante 1 hora en 1 % de tetroxido de osmio y se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol graduado antes de un procedimiento de secado en el punto cntico utilizando un sistema de CO2. La muestra bacteriana se monto sobre una punta y se recubrio con platino para la observacion en un microscopio electronico de barrido. Como se puede ver en las imagenes de SEM de la figura 11, brotaban vesfculas extracelulares de Staphylococcus epidermis.
EJEMPLO 8: Preparacion de vesfculas extracelulares derivadas de Bacillus subtilis
Se inoculo Bacillus subtilis en 3 ml de caldo nutriente en un tubo de ensayo y se cultivo a 37 °C durante 6 horas. Del cultivo, se transfirieron 5 pl a 500 ml de caldo nutritivo en un matraz Erlenmeyer de 2 l y se incubaron a 37 °C durante 4 horas a una D.O. (600 nm) de 1,0. Todo el cultivo se asigno igualmente a tubos de ultracentnfuga de 500 ml y se centrifugo a 4 °C y 6.000 x g durante 20 minutos. Se dejo pasar el sobrenadante desprovisto de celulas una vez a traves de un filtro de membrana con un tamano de poro de 0,45 pm y el filtrado se concentro 25 veces utilizando el sistema Quixstand con 100 kDa de corte. Despues de un pase del concentrado a traves de un filtro de membrana con un tamano de poro de 0,22 pm, el filtrado resultante se ultracentrifugo a 4 °C y 150.000 x g durante 3 horas en tubos de ultracentnfuga de 70 ml. Los sedimentos formados de este modo se resuspendieron en PBS para separar las vesfculas extracelulares derivadas de Bacillus subtilis.
EJEMPLO 9: Caracteristicas de vesiculas extracelulares derivadas de Bacillus subtilis
Las vesiculas extracelulares que se aislaron a partir de Bacillus subtilis como en el Ejemplo 8 se adsorbieron durante 3 minutos en una rejilla de cobre recubierta de carbono con descarga luminiscente, que despues se lavaron con agua destilada y se tineron con 2 % de acetato de uranilo antes de la observacion con un microscopio electronico de transmision JEM101.
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Como se muestra en la imagen de TEM de la figura 12a, las vesfculas extracelulares derivadas de Bacillus subtilis son esferas cerradas con un tamano de 20-100 nm.
Las vesfculas extracelulares aisladas se fijaron sobre cubreobjetos de vidrio, se fijaron durante 1 hora en 2,5 % de glutaraldehndo, se posfijaron durante 1 hora en 1 % de tetroxido de osmio, se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol graduado y , despues, se sometieron a secado de punto cntico usando un sistema de CO2. Las vesfculas extracelulares fijadas al cubreobjetos de vidrio se montaron en la punta y se observaron con un microscopio electronico de barrido JSM-7401F.
Como se entiende a partir de la imagen de SEM de la figura 12b, las vesfculas extracelulares son esfericas con tamanos relativamente uniformes (20-100 nm).
Las vesfculas extracelulares derivadas de Bacillus subtilis que se aislaron como en el Ejemplo 8 se diluyeron hasta 1 |jg/ml en 1 ml de PBS. Esta PBS se coloco en una cubeta que despues se sometio a analisis de tamano de partfcula usando dispersion de luz dinamica. El resultado se representa en la figura 13.
Como se muestra en la figura 13, las vesfculas extracelulares vanan de tamano de 20 a 100 nm, con un tamano medio de partfcula de 30 nm.
En estos ejemplos, se divulga primero la secrecion espontanea de vesfculas extracelulares de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis y Bacillus subtilis, todas representativas de las bacterias grampositivas, durante su crecimiento, junto con diversos caracteres de la vesfcula extracelular aislada. Sin embargo, los expertos en la tecnica entenderan que las bacterias que se pueden usar como fuente para las vesfculas extracelulares de la presente invencion no se limitan unicamente a las mencionadas en los ejemplos anteriores, pero se puede extender a todas las bacterias grampositivas. Ademas, debe ser evidente que los modelos animales de enfermedad, aunque establecidos solamente con Staphylococcus aureus en los Ejemplos, se pueden construir utilizando cualquier bacteria grampositiva patogenica.
EJEMPLO 10: Analisis proteomico de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
[Digestion tnptica en gel]
A 50 jg de las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus aisladas para el analisis proteomico en el Ejemplo 2 se anadio de tal forma que una cantidad de colorante de carga 5x que el colorante de carga se diluyo a 1x, seguido de ebullicion a 100 °C durante 10 minutos. Estas muestras se cargaron a gel al 4-20 % de Tris-glicina Novex (Invitrogen) y se paso a 90 V durante 2 horas mediante electroforesis. Despues de tenir con GelCode Blue Stain Reagent (Pierce), el gel se corto en 11 piezas de gel iguales que, a su vez, se trataron con 13 ng/jl de tripsina (Promega) a 37 °C durante 16 horas.
[Digestion con tripsina en solucion]
A 100 jg de la muestra de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus preparadas para el analisis proteomico en el Ejemplo 2 se anadieron cuatro volumenes de metanol, seguido de centrifugacion a 9.000 x g durante 10 segundos. A continuacion, esta mezcla se mezclo con un volumen igual de cloroformo y se centrifugo a 9.000 x g durante 10 segundos. Se anadio agua de calidad de HPLC en una cantidad tres veces mayor que el volumen de la muestra y se centrifugo a 16.000 x g durante 1,5 minutos. De las dos capas separadas formadas de este modo, se retiro la capa superior, mientras que el metanol se anadio a la capa restante en una cantidad tres veces mayor que el volumen de la muestra y se centrifugo a 16.000 x g durante 3 minutos. El sedimento formado de esta manera se suspendio en tampon de lisis (urea 6M, bicarbonato de amonio 40 mM), seguido de reduccion mediante Tris 5 mM hidrocloruro de (2-carboxietil)fosfina a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, la muestra se incubo con yodoacetamida 25 mM a temperatura ambiente durante 30 minutos en un estado oscuro a las protemas de alquilato. Finalmente, la muestra se trato con 5 ng/jl de tripsina a 37 °C durante 16 horas. Los peptidos degradados de este modo se han separado con el sistema de fraccionadores OFFGEL (Agilent). Para empezar, una tira de IPG de 24 cm de largo (pH 3-10) fue hidratado con rehidratacion con IPG. Los peptidos degradados se disolvieron en 2,8 ml de tampon fuera del gel y la solucion se cargo en una cantidad de 150 pl por carril. La electroforesis a 50 jA, 8000 V durante 47 horas separo los peptidos de acuerdo con el punto isoelectrico (pi). Las muestras se desalaron utilizando una columna de centrifugacion PepClean C18.
[Espectrometria de Masas con nanoionizacion (Nano-LC-ESI-MS/MS)]
El analisis de masas se realizo usando Nano-LC-ESI-MS/MS. Los peptidos degradados de las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus preparadas mediante ka digestion con tripsina en gel o en solucion se cargaron en una columna (75 m x 12 cm) rellena con resina C18 y despues se separaron del siguiente modo: 3-30 % de tampon, B 70 minutos; 30-40 % de tampon B, 5 minutos; 40-90 % de tampon B, 20 minutos; caudal 0,2 jl/min (composicion del tampon A: 0,1% de acido formico en H2O, composicion del tampon B: 0,1 % de acido formico en ACN). Los peptidos eluidos se introdujeron en un espectrometro de masas LTQ-ion-trap (Thermo Finnigan) con una tension de electropulverizacion de 2,0 kV bajo una energfa de colision normalizada ajustada a 35 % de MS/MS. Todos los espectros Ms/MS se adquirieron mediante barridos dependientes de los datos en los que
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se seleccionaron los cinco picos mas intensos de los barridos de MS completos para la fragmentacion. El numero de repeticiones para la exclusion dinamica se establecio en 1, la duracion de la repeticion a 30 segundos y la duracion de la exclusion dinamica a 180 segundos, la anchura de la masa de exclusion de ± 1,5 Da, y el tamano de la lista dinamica de exclusion a 50.
[Analisis de datos]
Se construyo una base de datos NCBI a partir de 9 bases de datos personalizadas que conteman secuencias de aminoacidos y de bases de Staphylococcus aureus mediante la concatenacion de las combinaciones de secuencias de bases objetivo (directa) y senuelo (inversa). Todos los espectros de masas en bruto se presentaron a la herramienta de motor SEQUEST para las busquedas contra la base de datos del NCBI. Solo se seleccionaron las protemas para las que coincidieron dos peptidos unicos, con las tasas de falsos positivos de los peptidos identificados fijadas en 1 %.
[Resultados]
El analisis proteomico identifico un total de 90 protemas de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, con 35 solapadas entre 41 protemas identificadas por digestion con tripsina en gel y 84 protemas identificadas por digestion con tripsina solucion, como se muestra en la figura 14. La Tabla 1 resume las 90 protemas que se identificaron.
Diversas protemas relacionadas con la enfermedad estaban entre la protema de la vesmula extracelular identificada. En las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus existen los superantfgenos enterotoxina Q de staphylococcus y antigenos secretores de staphylococcus (ssaA1 ssaA2) que actuan como protemas virulentas responsables de la aparicion de la sepsis o de smdrome de shock toxico. Tambien se encontraron en las vesmulas toxinas, tales como alfa-hemolisina y gamma-hemolisina, que destruyen los eritrocitos y degradan la hemoglobina. Las proteasas estafopama A y eCm extracelular y la protema de union plasmatica, que estan directamente involucradas en la invasion y la penetracion de las bacterias en los tejidos del huesped, se detectaron en las vesmulas. Asimismo, se identificaron las protemas relacionadas con la coagulacion de la sangre, tales como estafilocoagulasa y protemas de union al factor de von Willebrand. Estas protemas estan implicadas en la aparicion de sepsis y smdrome de choque toxico, que se caracteriza por coagulacion intravascular de la sangre, asf como enfermedades vasculares, incluyendo smdrome coronario agudo y accidente cerebrovascular, causados por la formacion de trombos dentro de una arteria coronaria, trombosis venosa profunda y embolia pulmonar. En las vesmulas extracelulares tambien se encuentran la protema de union a IgG de S. aureus (SBI) que puede dotar a las bacterias de la funcion de evasion inmunitaria mediante la inhibicion de la fagocitosis de las celulas inmunitarias del huesped que estan implicadas en la aparicion de dermatitis atopica mediante la induccion de la expresion de SIL-18 en celulas de la epidermis y el aumento de los niveles de IgE en suero.
TABLA 1. Proteoma de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
N.° Gi
Protema Funcion Funcion especfica Deteccion selectiva en el metodo en gel Deteccion selectiva en el metodo en solucion
Protema de secrecion extracelular
150375723
Beta-lactamasa Respuesta al estimulo Actividad Beta- lactamasa V V
21282496
ECM extracelular y protema de union plasmatica Proceso de multiples organismos Adhesina V
21282773
Alfa-hemolisina Citolisis de celulas de otro organismo V
81704164
Gamma-hemolisina componente C Hemolisis por simbionte de eritrocitos del huesped V
57650962
Protema de union a IgG Sbl Patogenia V
81704132
Antigeno ssaA2 secretor de estafilococos Patogenia V
81762108
Antigeno ssaA2 secretor de estafilococos Patogenia V
21281935
Precursor de la estafilocoagulasa Coagulacion V
57652487
Precursor de la estafilocoagulasa Coagulacion V
37488995
Estafopama A Proteolisis V
21284294
N-acetilmuramoil-L- alanina amidasa Procesos celulares Organizacion de la pared celular V V
21282322
Protema hipotetica MW0593 Organizacion de la pared celular V
81762626
Autolisina bifuncional Organizacion de la pared celular V V
21284065
Protema hipotetica MW2336 Localizacion Transporte V
21283931
Lipoprotema de union a hidroxamato sideroforo Transporte de iones de hierro de alta afinidad V V
38604669
Lipasa 2 Metabolismo Proceso catabolico de lfpidos V
57651231
5'-nucleotidasa Mal N.A.e) V V
caracterizada
21282013
Protema hipotetica MW0284 N.A. V V
57651320
Protema hipotetica SACL0479 N.A. V
21282306
Protema hipotetica MW0577 N.A. V
21283609
Protema truncada de la superficie celular map- w N.A. V V
Protema de membrana
21282793
Protema de union a penicilina 1 Respuesta al estimulo Procesos celulares Respuesta a antibioticos Biogenesis de la pared celular basada en peptidoglicanos V
21283069
PBP2 Respuesta al estimulo Procesos celulares Respuesta a antibioticos Biogenesis de la pared celular basada en peptidoglicanos V
21283233
Protema de union a penicilina 3 Respuesta al estimulo Procesos celulares Respuesta a antibioticos Biogenesis de la pared celular basada en peptidoglicanos V
21282494
Protema VWbp de union al factor de von Willebrand secretada truncada Proceso de multiples organismos Coagulacion V
21282495
Protema VWbp de union al factor de von Willebrand secretada truncada Coagulacion V
21283671
Protema hipotetica MW1942 Citolisis de celulas de otro organismo V V
21283666
Enterotoxina SeQ de estafilococos Patogenia V
61213890
Protema de membrana de 77 kDa Patogenia V
81704700
N-acetilmuramoil-L- alanina amidasa sle1; precursor Procesos celulares Biogenesis/degradacion de la pared celular V V
81704612
Glicerol fosfato acido lipoteicoico sintasa Biogenesis/degradacion de la pared celular V V
21283316
Subunidad SecD/SecF de la preprotema translocasa bifuncional Localizacion Transporte de protemas V V
60392183
Complejo de protemas del ribosoma unido a la membrana, subunidad de 50 kDa Metabolismo Glicolisis V V
21284194
Protema hipotetica MW2465 Mal caracterizada N.A. V
21284271
Protema hipotetica MW2542 N.A. V
73621231
Protema reguladora msrR N.A. V
Protema citosolica
21283575
ADN helicasa dependiente de ATP Respuesta al estimulo Reparacion del ADN V
81762575
ARN ribosoma Subunidad grande de metiltransferasa N Procesos celulares Respuesta a antibioticos procesamiento del ARNr V
50402228
Enoilpiruvato transferasa 1 Biogenesis de la pared celular basada en peptidoglicano V
38604895
Subunidad A de la ADN girasa Respuesta al estimulo Metabolismo Respuesta al estfmulo Proceso metabolico del ADN V
54036785
Subunidad beta de la ATP sintasa Proceso de biosmtesis de ATP V
59799526
Glutamina sintetasa Proceso de biosmtesis de glutamina V
54037697
Ribosa fosfato pirofosfocinasa Proceso de biosmtesis de nucleotidos V
21283340
Glutamato-1- semialdelddo aminotransferasa Proceso de biosmtesis de porfirina V
60392318
Gliceraldelddo^- fosfato deshidrogenasa 1 Glicolisis V V
21282096
Protema GMP sintasa/glutamina amidotransferasa bifuncional Proceso de biosmtesis de GMP V
21282838
Protema hipotetica MW1109 Proceso metabolico del glicerol V
21283766
Serina hidroximetiltransferasa Proceso metabolico del glicina V V
21283370
Piruvato cinasa Glicolisis V
21283383
Acetato cinasa Fosforilacion V V
21283307
Protema hipotetica MW1578 Proceso metabolico V
81832404
Glutamato deshidrogenasa espedfica de NAD Proceso metabolico de aminoacido V
54038961
CTP sintasa Proceso metabolico de glutamina V
38604707
Subunidad alfa del componente E1 de piruvato deshidrogenasa Glicolisis V V
38604917
Componente de resto dihidrolipolilisina acetiltransferasa del complejo piruvato deshidrogenasa Glicolisis V V
60392857
Subunidad beta del componente E de piruvato deshidrogenasa Glicolisis V V
119390865
Pirimidina-nucleosido fosforilasa Proceso metabolico de base pirimidmica V
21282878
Factor de elongacion de la transcripcion NusA Almacenamiento y procesamiento de informacion Regulacion de la terminacion de la transcripcion V
21282422
Subunidad alfa de ribonucleotido disfosfato reductasa Replicacion del ADN V
21283872
Subunidad alfa de la ARN polimerasa dirigida por ADN Transcripcion V
21282226
Subunidad beta de la ARN polimerasa dirigida por ADN Transcripcion V V
21282227
Subunidad beta de la ARN polimerasa dirigida por ADN Transcripcion V V
21282201
Lisil-ARNt sintetasa Aminoacilacion de Lisil- ARNt V
38258392
Treonil-ARNt sintetasa Aminoacilacion de treonil- ARNt V
21282875
Prolil-ARNt sintetasa Aminoacilacion de Prolil- ARNt V
21283246
Glicil-ARNt sintetasa Aminoacilacion de Glicil- ARNt V
21283570
Subunidad A de glutamil-ARNtGln amidotransferasa Traduccion V
21282868
Protema S2 ribosomica 30S Traduccion V
54039504
Protema S3 ribosomica 34S Traduccion V V
21283391
Protema S4 ribosomica 34S Traduccion V V
54039545
Protema S7 ribosomica 30S Traduccion V
54039108
Protema L1 ribosomica 50S Traduccion V V
21283895
Protema L2 ribosomica 50S Traduccion V V
21283897
Protema L4 ribosomica 50S Traduccion V
50401243
Protema L5 ribosomica 50S Traduccion V
21283883
Protema L6 ribosomica 50S Traduccion V
21283866
Protema L23 ribosomica 50S Traduccion V
21283879
Protema L15 ribosomica 50S Traduccion V
81704219
Protema L16 ribosomica 50S Traduccion V V
21282853
Protema L19 ribosomica 50S Traduccion V
21282326
Protema L21 ribosomica 50S Traduccion V
23821722
Factor de iniciacion de la traduccion IF-2 Traduccion V
21282231
Factor de elongacion G Traduccion V V
54037028
Factor de elongacion Tu Traduccion V V
21282409
Protema hipotetica MW0680 Mal caracterizada N.A. V
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Ribonucleasa J 1 N.A. V
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Protema hipotetica N.A. V V
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Proteina cuya localizacion en la celula no esta determinada
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Probable malato:quinona oxidorreductasa 2 Metabolismo Ciclo del acido tricarboxflico V
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Proteina de tipo NADH deshidrogenasa Oxidacion reduccion V V
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Probable caja DEAD ARN helicasa dependiente de ATP Mal caracterizada N.A. V V
EJEMPLO 11: Respuesta inmunitaria innata ex vivo de macrofagos a vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
Se sembraron macrofagos de raton (RAW 264.7) a una densidad de 1 x 105 celulas/pocillo en placas de 24 pociMos y se mantuvieron durante 24 horas. Las celulas se lavaron una vez con PBS y se incubaron durante 15 horas con 1, 10, 100, 1.000 y 10.000 ng/ml de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus aisladas como en el Ejemplo 2 en 10 % de FBS/RPMI en cada pocillo. Se recogieron los medios de cultivo y se centrifugaron a 4 °C y 500 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se centrifugo de nuevo a 3.000 x g durante 20 minutos. Las citocinas presentes en el sobrenadante resultante se analizaron cuantitativamente mediante ELISA (ensayo de enzima de inmunoabsorcion ligada a enzimas).
La figura 15 muestra los niveles de citocinas. Como se puede ver, los niveles de expresion de las citocinas inflamatorias TNF-a e IL-6 aumentaron con un aumento de la concentracion de las vesfculas extracelulares, lo que indica que las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus provocan la respuesta inmunitaria innata de los macrofagos y, por lo tanto, causa inflamacion en el huesped.
EJEMPLO 12: Respuesta inmunitaria innata ex vivo de fibroblastos dermicos vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
Despues de la retirada de la epidermis de tejidos dermicos de raton, los fibroblastos se liberaron de la dermis restantes mediante tratamiento enzimatico con tripsina. Se sembraron los fibroblastos a una densidad de 1 x 104 celulas/pocillo en placas de 24 pocillos y se mantuvieron durante 24 horas. A continuacion, se incubaron las celulas durante 24 horas con 1 y 10 pg/ml de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus en DMEM. Los medios de cultivo se recogieron y se centrifugaron. Se realizo un ELISA (ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas) con el sobrenadante para determinar los niveles de citocinas inflamatorias (TNF-a, IL-6) y las citocinas (TSLP) y quimiocinas (MIP-1a, eotaxina) que afectan a la inmunidad adaptativa. Los resultados se representan en la figura 16.
La figura 16 muestra que las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus estimulan la expresion de citocinas inmunes e inflamatorias. Como se entiende a partir de los datos de la figura 16, las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus actuan sobre los fibroblastos dermicos para inducir la expresion de citocinas inflamatorias y la atraccion de diversas celulas inmunes, lo que provoca inflamacion.
EJEMPLO 13: Establecimiento de un modelo animal de dermatitis atopica con vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
La piel dorsal de ratones (SKH-HR1, mujer) se raspo de cuatro a seis veces usando cinta Durapore (3M). A continuacion, sobre la piel raspada se coloco una gasa (2 cm x 2 cm) empapada con 0,1 pg, 5 pg y 10 pg de vesiculas extracelulares derivadas de S. aureus en 100 pl de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron con cinta bio-oclusiva Tegaderm (3M). Este procedimiento se repitio tres veces a la semana durante cuatro semanas. Se sacrifico a los ratones 24 horas despues de la exposicion final y se extirparon los tejidos dermicos (Figura 17). El analisis histologico mostro que la aplicacion de las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus a la piel sometida a la aplicacion y retirada de la cinta indujo inflamacion de tipo dermatitis atopica, incluyendo engrosamiento epidermico e infiltracion de la dermis por las celulas inflamatorias. Al igual que con la infiltracion dermica por las celulas inflamatorias, se encontro un numero significativamente mayor de eosinofilos y de mastocitos en la dermis de los ratones tratados con vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, en comparacion con los controles tratados con solucion salina. En conjunto, estos datos sugieren que la aplicacion de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus a piel sometida a aplicacion y retirada de cinta induce inflamacion similar a la enfermedad atopica (Figuras 18 y 19). Ademas, el analisis de las respuestas inmunitarias de las celulas T colaboradoras de tipo 2 (Th2), responsables de la dermatitis atopica, en los tejidos dermicos mostro que la estimulacion in vitro de los fibroblastos con EV de S. aureus aumento
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la secrecion de las citocinas de tipo Th2, tales como IL-4 e IL-5, asf como la quimiocina eotoxina, inducida por las citocinas (Figura 20).
EJEMPLO 14: Cuantificacion de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus en el fluido de lavado de la piel de pacientes con dermatitis atopica
Se obtuvieron fluidos de lavado de la piel mediante aclarado de lesiones cutaneas de pacientes con dermatitis atopica varias veces con PBS esteril. Para eliminar las bacterias y otros residuos, se centrifugaron 40 ml del fluido de lavado de la piel a 5.000 x g y 10 000 x g. Despues de la centrifugacion, los sobrenadantes se filtraron a traves de 0,45 pm y 0,22 pm en serie. A continuacion, los fluidos de lavado se concentraron a 1 ml utilizando Centriprep con corte de 100 kDa. Parte del concentrado (fluido de lavado) se almaceno, mientras que el resto se mezclo con el mismo volumen de solucion salina esteril y se ultracentrifugo a 150.000 x g para dar vesfculas extracelulares (fraccion EV) como un sedimento.
Con el fin de examinar si existen vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus (SA_EV) en el fluido de lavado de la piel y en la fraccion EV, se analizaron las protemas caractensticas de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus mediante ELISA utilizando anticuerpos espedficos de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus. En este sentido, las placas de ELISA de 96 pocillos se revistieron con anticuerpos policlonales espedficos anti-vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y se bloquearon con 1 % de BSA (seroalbumina bovina). Los fluidos de lavado concentrados y la fraccion EV se anadieron a cada pocillo. Despues de la incubacion durante 2 horas, los pocillos se lavaron con Tween 20 en PBS. A continuacion se anadieron anticuerpos policlonales espedficos de EV anti-S. aureus a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas. Despues del tratamiento con peroxidasa de rabano picante conjugada con estreptavidina (HRP), los sustratos de quimioluminiscencia (BM-POD) se anadieron para reaccionar con HRP. La luminiscencia se midio y se expreso como ULR.
La figura 21 es un grafico que muestra la presencia de antfgenos caractensticos de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus en el fluido de lavado de la piel del paciente. Asimismo, los datos obtenidos con la fraccion de EV del fluido de lavado confirmaron la presencia de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus en las lesiones de los pacientes con dermatitis atopica.
EJEMPLO 15: Nivel serico de anticuerpos (IgE) espedficos de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus en pacientes con dermatitis atopica
Se tomaron muestras de sangre de un grupo de pacientes con dermatitis atopica y un grupo de control sanos de edad equivalente, cada uno compuesto por 20 personas de 0-10 anos de edad y se centrifugaron a 4 °C y 3.500 x g durante 10 minutos, para dar sueros.
La figura 22 es un grafico que muestra los niveles de anticuerpos IgG1 e IgE contra las vesiculas extracelulares en el suero, medidos mediante ELISA. Como se puede ver, el nivel de anticuerpos de tipo IgE espedficos de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus estaba significativamente elevado en el suero de los pacientes con dermatitis atopica sobre el de los controles sanos.
EJEMPLO 16: Induccion de la inflamacion mediada por Th17 de la mucosa mediante vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
Se anestesio a los ratones con ketamina y Rompun y se les administro 1 pg y 10 pg de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus en 30 pl de pBs a traves de la via nasal. Para examinar el efecto de las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus sobre la inmunidad innata, los fluidos de BAL se obtuvieron mediante lavado de las vfas respiratorias con 1 ml de PBS 24 horas despues de la administracion (Figura 23). Los analisis cuantitativos mostraron que los niveles de las celulas inflamatorias (especialmente neutrofilos) y de IL-6, que es una citocina inflamatoria que induce una respuesta inmunitaria Th17, en el fluido de lavado broncoalvelolar aumento con un aumento de la concentracion de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus (figura 24), lo que indica que las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus induce inflamacion mediata por Th17 en el moco de las vfas respiratorias.
Para examinar la inmunidad adaptativa inducida por vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, se administro a los ratones 1 pg de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus dos veces a la semana durante tres semanas por inhalacion intranasal. Los fluidos de lavado broncoalveolar se obtuvieron 24 horas despues de la inhalacion final y se analizo la inflamacion (Figura 25).
Como se entiende a partir de los datos de la Figura 26, se encontro un gran aumento del nivel de las celulas inflamatorias, especialmente neutrofilos, en los fluidos de lavado broncoalveolar del grupo que inhalo vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, en comparacion con el grupo de control (Figura 26a). Asimismo, inflamacion de la mucosa de las vfas respiratorias se determino midiendo los niveles de citocinas en los fluidos de lavado broncoalveolar, IL-17, que es una citocina liberada por las celulas Th17 y se observo que aumentaba significativamente en el grupo que ha inhalado las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus (Figura 26b).
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A partir de los datos, se puede deducir que cuando se inhalan de forma repetitiva, las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus actuan localmente induciendo inflamacion neutrofflica caracterizada por la respuesta inmunitaria Th17 sobre el moco de las vfas respiratorias.
EJEMPLO 17: Induccion de sepsis por vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
Las vesmulas extracelulares aisladas como en Ejemplo 2, se inyectaron por via intravenosa a una dosis de 15, 25 o 50 |jg en ratones (C57B6, machos), y ratones muertos se contaron cada 12 horas (Figura 27).
Como se puede ver en el grafico de la supervivencia de la figura 28, la tasa de supervivencia se redujo a 66,6 % en los grupos de ratones a los que se ha administrado 25 jg y 50 jg de las vesmulas extracelulares. Es decir, una cierta dosis de las vesmulas extracelulares es letal para ratones.
La figura 29 muestra un cambio en la temperatura corporal durante 12 horas despues de la inyeccion de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus (5 jg) en ratones (C57B6, macho). Las temperaturas corporales se registraron cada dos horas en la pantalla digital de un termometro rectal aplicado a los ratones. Como puede verse, se detectaron temperaturas mas bajas del cuerpo (hipotermia), un mdice para SIRS (smdrome de respuesta inflamatoria sistemica) en los ratones a los que se ha administrado 15, 25, y 50 jg de las vesmulas extracelulares.
EJEMPLO 18: Coagulacion intravascular y trombosis mediante vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
A los ratones (C57B6, macho) se administro tres veces a intervalos regulares de 8 horas 5 jg de las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus aisladas en el Ejemplo 2 a traves de diversas rutas, y fueron sacrificados 6 horas despues de la administracion final, seguido de neumonectoirna (Figura 30). Los ratones a los que se inyecto (i.v.) PBS a traves de la vena de la cola (i.v.) se utilizaron como control negativo. Los pulmones extirpados se tineron con H & E (hematoxilina-eosina) de modo que los nucleos celulares y el citoplasma se tineron de color azul (hematoxilina) y rojo (eosina), respectivamente.
Las fotograffas de la figura 31 son de tejidos tenidos con H & E, que muestran la formacion de un trombo en la vena despues de inyeccion i.v. de las vesiculas extracelulares, la infiltracion de celulas inflamatorias alrededor de los vasos sangumeos despues de la inyeccion subcutanea (s.c.), y la formacion de trombos en los vasos pulmonares despues de la administracion intranasal (i.n.).
Se examinaron los niveles de mdice de la coagulacion intravascular diseminada. En este sentido, las muestras de sangre tomadas del corazon de raton se mezclaron en una proporcion de 9:1 con el agente anticoagulante citrato de sodio agente para dar plasma. La figura 32 muestra los niveles de D-dfmero, un mdice para la coagulacion intravascular diseminada, medida por un kit de diagnostico con D-dfmero. Se observo que el nivel de dfmero D aumentaba en todos los ratones a los que se administraron las vesiculas con independencia de la ruta, en comparacion con el control, pero fue mucho mas alto en la inyeccion i.v. o s.c.. Ademas, se contaron las plaquetas, otro mdice para la coagulacion intravascular diseminada. En este sentido, se diluyo 1 jl de la muestra de sangre en 199 jl de oxalato de amonio al 1 % y se dejaron reposar durante 10 minutos antes de contar las plaquetas. Los resultados se representan en la figura 33.
La figura 33 muestra la aparicion de trombocitopenia en todos los ratones a los que se han administrado vesiculas extracelulares independientemente de la via de administracion.
EJEMPLO 19: Establecimiento de un sistema de deteccion selectiva in vitro para farmacos candidatos para la prevencion o el tratamiento de enfermedad inducida por vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
Los ejemplos anteriores demuestran que las citocinas inflamatorias inducidas por las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus de raton tienen una gran participacion en la generacion de diversas enfermedades. Basandose en este hecho, se establecio un sistema de deteccion selectiva in vitro por el que las sustancias inhibidoras de la actividad de citocinas inflamatorias podfan descubrirse. La figura 34 es un diagrama esquematico que muestra el descubrimiento de sustancias inhibidoras de la liberacion inducida por vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus de citocinas inflamatorias. Los macrofagos de raton (RAW 264.7) mediante el procedimiento del Ejemplo 11, se trataron con las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus(1 jg/ml) por sf solas, por separado mediante el procedimiento del Ejemplo 2 o en combinacion con un candidato a farmaco (10 jM ), durante 15 horas en una incubadora a 37 °C. continuacion, se recogio el medio de cultivo y se centrifugo a 4 °C y 500 x g durante 10 minutos y, posteriormente, a 4 °C y 3.000 x g durante 20 minutos. La IL-6 en el sobrenadante se analizo cuantitativamente mediante ELISA. Estos procedimientos representan, al menos en parte, para un procedimiento para la deteccion selectiva in vitro de candidatos farmaco inhibidores de la secrecion de IL-6 inducida por vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus6, por el cual se pueden proporcionar farmacos candidatos preventivos o terapeuticos de enfermedades causadas por vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
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EJEMPLO 20. Evaluacion de la eficacia farmaceutica in vivo de profarmacos descubiertos por el sistema de deteccion selectiva In vitro
La figura 35 muestra los niveles de IL-6 de los cultivos celulares como porcentajes de los del control positivo cuando los cultivos celulares se trataron con cada uno de 102 profarmacos diferentes (acetaminofeno, acetilcistema, alopurinol, HCl alprenolol, HCl amitriptilina, atropina, tosilato de bretilio, bromfeniramina, budesonida, buspirona HCl, cefuroxima, hidrato de cloral, clorpromazina HCl, cimetidina, clomipramina HCl, clotrimazol, ciclobenzaprina, desipramina HCl, diclofenaco, diflunisal, diltiazem, difenhidramina HCl, disopiramida, disulfiram, D-manitol, doxepina, doxiciclina hidrato, doxilamina succinato, cloruro de edrofonio, maleato de enalaprilo, famotidina, fenbufeno, fenofibrato, fenoprofeno hidrato de sal de calcio, dihidrocloruro flunarizina, dicloruro de flufenazina, flurbiprofeno, furosemida, gemfibrozilo, gliclazida, glipizida, haloperidol, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, HCl de hidroxizina, ibuprofeno, HCl imipramina, indapamida, indol -2-carboxflico, indometacina, ipratropio, ketoprofeno, ketorolaco sal tris, maprotilina HCl, acido meclofenamico, melatonina, metformina, HCl metapirileno, metimazol, metocarbamol, metoclopramida HCl, metronidazol, nabumetona, naproxeno, neostigmina Br, niacina, nicardipina HCl, nifedipina, nitrofurantoina, nizatidina, noretindrona, nortriptilina, HCl orfenadrina, oxibutinina, HCl fenformina, fenilbutazona, fenitoma, piroxicam, prednisona, probenecid, HCl propranolol, piridostigmina, Br, HCl ranitidina, espironolactona, sulfamet, sulpirida, tenoxicam, terfenadina, teofilina, ticlopidina HCl, tolazamida, tolazolina, tolbutamida, acido tolfenamico, tramadol HCl, tranilcipromina, trazodona HCl, triamtereno, triclormetiazida, tripelenamina HCl, verapamilo, warfarina) como en el Ejemplo 19. De ellos, 19 (acetaminofeno, HCl amitriptilina, atropina, tosilato de bretilio, bromfeniramina, HCl de clorpromazina, HCl clomipramina, ciclobenzaprina, HCl desipramina, disulfiram, doxepina, doxiciclina hidrato, succinato de doxilamina, haloperidol, HCl imipramina, HCl nicardipina, nortriptilina, HCl Propranolol , tenoxicam) se descubrieron como candidatos a farmacos, ya que reducfa el nivel de IL-6 por debajo del 50 % del control positivo.
La figura 36 es un grafico que muestra los niveles de IL-6, medida por ELISA, en los fluidos de lavado broncoalveolar que se obtuvieron 12 horas despues de los profarmacos (10 mg/kg) revelados anteriormente se inyectaron por via intraperitoneal en grupos de ratones C57BL/6 (macho, 6 semanas de edad, 4 ratones en cada grupo) inmunizados con 1 |jg de las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus mediante inyeccion intranasal. Se identifico que la doxepina, descubierta por el sistema de deteccion selectiva in vitro, supriirna la actividad de IL-6 y ejercfa un efecto sinergico, junto con el haloperidol, tambien descubierto por el sistema de deteccion selectiva in vitro.
A partir de estos resultados, es evidente que el sistema de deteccion selectiva de farmacos in vitro utilizando las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, establecido en el Ejemplo 19, es un procedimiento muy util por el se pueden seleccionar con eficacia para la prevencion o tratamiento de enfermedades inducidas por vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
EJEMPLO 21: Respuesta inmunitaria in vitro inducida por vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
A partir de los resultados del Ejemplo 11 se entiende que las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus provocan respuestas inmunitarias en celulas huesped mediante la estimulacion de celulas inflamatorias porque los macrofagos de raton (RAW 264.7) tratados con las IL-6 secretaban por las vesfculas, que estimula la diferenciacion de Th17. La microscopia de fluorescencia demostro que seis horas despues de tratarse con vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus marcadas con DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3'3'-
tetrametilindocarbocianina perclorato), celulas dendnticas derivadas de medula osea (BMDC) en volvieron a las vesfculas en la misma (Figura 37).
Ademas, despues incubar las celulas dendnticas con las vesfculas extracelulares durante 24 horas, las citocinas liberadas al medio de cultivo se analizaron cuantitativamente mediante ELISA. Como resultado, se detectaron niveles elevados de IL-12, una citocina que estimula la diferenciacion Th1 (Fig. 38) y para CD40 y MHCII, indicativo de la activacion de celulas dendnticas (Fig. 39). En conjunto, estos resultados sugieren que las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus no solo actuan sobre las celulas presentadoras de anticuerpos para mejorar la inmunidad adaptativa, sino que tambien inducen las celulas T a diferenciarse en celulas Th1 y Th1.
EJEMPLO 22: Induccion de la produccion de anticuerpos y respuesta inmunitaria de celulas T mediante inyeccion subcutanea de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
Para evaluar las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus como vacuna para inducir la produccion de anticuerpos, se inyectaron las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus preparadas en el Ejemplo 2 por via subcutanea a una dosis de 1,5 o 20 jg en ratones (C57B6, machos) tres veces a intervalos regulares de una semana. Se tomaron muestras de sangre de los vasos sangumeos oculares las semanas 1, 2 y 3 (Figura 40). Las muestras de sangre se coagulan a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugaron a 4 °C y 3.500 x g durante 10 minutos para tomar el suero como sobrenadante.
La figura 41 es un grafico en el que se representan los niveles mediante ELISA de los anticuerpos IgG, un mdice para la respuesta inmunitaria a las vesiculas extracelulares, frente a la dosis de vacuna, que demuestra que se
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produjeron anticuerpos espedficos para las protemas vesiculares de una manera dependiente de la dosis, con el titulo de anticuerpos amplificado desde la segunda inyeccion. As^ dos o mas inyecciones subcutaneas de vesmulas extracelulares inducen la produccion de anticuerpos espedficos para las protemas de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
Para evaluar las respuestas inmunitarias de celulas T inducidas por las extracelulares de Staphylococcus aureus se inyectaron, vesmulas extracelulares de Staphylococcus aureus por via subcutanea a una dosis de 2, 5 o 10 |jg en ratones (C57B6, macho) tres veces a intervalos regulares de cinco dfas. Las respuestas inmunitarias en esplenocitos se examinaron 24 horas despues de la inyeccion final (Figura 42).
La figura 43 muestra la induccion de respuestas inmunitarias de celulas T por las vesmulas extracelulares. A este respecto, las celulas inmunitarias aisladas del bazo se cultivaron in vitro durante 72 horas y los medios de cultivo se analizaron para determinar el contenido de citocinas. Como puede verse, el IFN-y y la lL-17 que son secretados, respectivamente, por las celulas Th1 y Th17, se detectaron a niveles significativamente aumentados en el grupo al que se administraron vesmulas extracelulares (10 jg).
A partir de los datos, se puede entender que las vesmulas extracelulares de Staphylococcus aureus se pueden usar como vacuna para inducir defensa mediada por Th1 y contra infecciones bacterianas, asf como la produccion de anticuerpos IgG, esenciales para la inmunidad humoral, con lo que se previenen de un modo eficaz las enfermedades causadas por Staphylococcus aureus y las vesmulas extracelulares bacterianas.
EJEMPLO 23: Induccion de la produccion de anticuerpos y respuesta inmunitaria de celulas T tras administracion transdermica (parche) de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
Se evaluo la induccion de inmunidad mediante la administracion transdermica de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus. Con este fin, se administraron 5 jg de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus preparadas en el Ejemplo 13 durante 4 semanas utilizando un parche (Figura 44). La figura 45 es un grafico que muestra los niveles de anticuerpos IgG en suero despues de la administracion transdermica de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus. Como se muestra en el grafico, la administracion transdermica de las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus indujo en gran medida la produccion de anticuerpos IgG espedficos de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, en comparacion con PBS.
Para evaluar las respuestas inmunitarias de celulas T inducidas por las vesmulas extracelulares de Staphylococcus aureus, se separaron las celulas inmunes del bazo y se incubaron in vitro durante 24 horas con 0,1 jg /ml de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y se analizaron los medios de cultivo para determinar el contenido de citocinas. Los resultados se representan en la figura 46.
Como se desprende de los datos de la figura 46, los niveles de IFN-y e IL-17 que son secretados, respectivamente, por las celulas Th1 y Th17 aumentaron considerablemente sobre los del grupo al que se administro PBS.
Por lo tanto, la inmunidad mediada por Th1 y Th17 contra las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus puede inducirse mediante la administracion de vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus. Por lo tanto, las vesmulas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus, incluso cuando se administran por via transdermica, provocan inmunidad mediada por celulas T, asf como la produccion de anticuerpos, de modo que se pueden utilizar para prevenir o tratar infecciones y enfermedades producidas por Staphylococcus aureus causadas por las vesmulas extracelulares derivadas de las bacterias.
EJEMPLO 24: Induccion de la produccion de anticuerpos y respuesta inmunitaria de celulas T mediante la administracion combinada de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus (polyl:C)
Las vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus preparadas en el Ejemplo 2 se inyectaron por via intraperitoneal a una dosis de 5 jg solas o en combinacion con 20 jg del acido poliinosmico-policitidflico de ARNdc sintetico (polyI: C) tres veces a intervalos regulares de una semana a ratones (C57B6, machos). Los dfas 7 y 9 despues de la inmunizacion final, se infecto a los ratones con Staphylococcus aureus (2,4 x 108 celulas) mediante inyeccion intraperitoneal (Figura 47). Se tomaron muestras de sangre, se dejaron coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugaron a 4 °C y 3.500 x g durante 10 minutos para obtener los sueros como sobrenadantes.
La figura 48 es un grafico que muestra los niveles de anticuerpos IgG, un mdice de la respuesta inmunitaria a las vesiculas extracelulares, medidos mediante ELISA. Como puede verse, la inyeccion combinada de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y polyI: C indujo niveles mas altos de anticuerpos espedficos para las protemas presentes en Staphylococcus aureus o sus vesiculas.
Para evaluar las respuestas inmunitarias de celulas T inducidas por la administracion combinada de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y polyI:C, las celulas inmunitarias se separaron del bazo y se incubaron in vitro durante 72 horas, y los medios de cultivo se analizaron para determinar el contenido de citocinas. Los resultados se representan en la figura 49. Como se desprende de los datos de la figura 49, los niveles de IFN-y
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e IL-17 secretados, respectivamente, por las celulas Th1 y Th17 se incrementaron en gran medida en el grupo al que se administro de forma conjunta vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y polyI:C, en comparacion con los otros grupos.
A partir de estos resultados, puede deducirse que la administracion de vesfculas extracelulares de Staphylococcus aureus en combinacion con un inmunoestimulante, tal como polyI:C induce mas eficazmente la produccion de anticuerpos IgG para la inmunidad humoral asf como respuestas inmunitarias mediadas por Th1 y Th17 contra las infecciones bacterianas con respecto ala vacuna vesicular por sf solo, por lo que la vacuna vesicular en combinacion con un inmunoestimulante puede usarse para la prevencion de infecciones y enfermedades producidas por Staphylococcus aureus causadas por vesfculas extracelulares bacterianas.
EJEMPLO 25: Eficacia farmaceutica de una combinacion de una vacuna de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus v polvI en un modelo animal de neumoma inducida por Staphylococcus aureus
Para establecer modelos animales de neumoma inducida por Staphylococcus aureus, se administro Staphylococcus aureus a una dosis de 4 x 108 o 2 x 108 UFC a los ratones por inhalacion intranasal y se examinaron las tasas de supervivencia. Todos los ratones habfan muerto 24 horas despues de la administracion de 4 x 108 UFC, mientras que la tasa de supervivencia de los ratones a los que se administraron 2 x 108 UFC fue del 40 % (Figura 50).
Para confirmar el efecto de la vacuna vascular en el modelo animal de neumoma inducida por Staphylococcus aureus, se inyecto a los ratones por via intraperitoneal tres veces 5 |jg de vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus y 20 jg de polyI:C juntos como en el Ejemplo 23 y despues se expusieron a con 2 x 108 UFC de Staphylococcus aureus por inhalacion intranasal, y se controlaron sus tasas de supervivencia. Veinticuatro horas despues de la exposicion, se observo que la tasa de supervivencia de los ratones era del 100 % cuando fueron inmunizados con la vacuna vesicular, pero la tasa de supervivencia se redujo a 40 % en los ratones que no habfan sido inmunizados (Figura 51).
Estos datos demuestran que la vacuna vesicular puede prevenir de manera muy eficaz la neumoma inducida por Staphylococcus aureus y la muerte.
EJEMPLO 26: Induccion de la produccion de anticuerpos y respuesta inmunitaria de celulas T mediante inyeccion intraperitoneal de vesfculas extracelulares derivadas de Enterococcus, faecalis
Se aislaron vesfculas extracelulares de Enterococcus faecalis como se describe en el Ejemplo 2. Para evaluar las vesfculas extracelulares derivadas de Enterococcus faecalis como vacuna para inducir respuestas inmunitarias, las vesfculas extracelulares derivadas de Enterococcus faecalis se inyectaron por via intraperitoneal a una dosis de 5 o 10 jg en ratones (C57B6, machos) dos veces a intervalos regulares de una semana. Las respuestas inmunitarias se evaluaron 72 horas despues de la inyeccion final.
Se tomaron muestras de sangre, se dejaron coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugaron a 4 °C y 3.500 x g durante 10 minutos para tomar el suero como sobrenadante. La figura 52 es un grafico en el que los niveles mediante ELISA de anticuerpos IgG, un mdice de la respuesta inmunitaria a las vesfculas extracelulares, se representan frente a dosis de la vacuna, que muestra que los anticuerpos espedficos de las protemas vesiculares se produjeron mediante dos inyecciones intraperitoneales de las vesfculas extracelulares.
Para evaluar las respuestas inmunitarias de celulas T inducidas mediante la administracion de Enterococcus faecalis, se separaron las celulas inmunitarias del bazo tras la inyeccion de las vesfculas y se incubaron in vitro durante 72 horas, y los medios de cultivo se analizaron para determinar el contenido de citocinas. Los resultados se representan en la figura 53.
Como se desprende de los datos de la figura 53, los niveles de IFN-y que son secretados de las celulas Th1 se incrementaron en gran medida en el grupo al que se administraron las vesfculas extracelulares (10 jg), en comparacion con los otros grupos.
A partir de los datos, se puede entender que las vesfculas extracelulares de Enterococcus faecalis se pueden usar como vacuna para inducir defensa mediada por Th1 y contra infecciones bacterianas, asf como la produccion de anticuerpos IgG, esenciales para la inmunidad humoral, con lo que se previenen de un modo eficaz las infecciones causadas por Enterococcus faecalis y las enfermedades causadas por las vesfculas extracelulares bacterianas.
EJEMPLO 27: Analisis genetico de ARNr 16S v ADN de vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus
La PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) se realizo sobre Staphylococcus aureus y vesiculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus (0,2, 0,5, 1,0 jg) usando cebadores para ARNr 16S de Staphylococcus (directo: AGCTTGCTTCTCTGATGTTA, inverso: TTTCACTTTTGAACCATGCG) [95 °C, 5 minutos - (94 °C, 30 segundos - 46 °C, 30 segundos, 72 °C, 20 segundos) x 35 ciclos - 72 °C, 7 minutos - 4 °C]. Se uso E. coli como
control negativo en las mismas condiciones. Los productos de la PCR con transcripcion inversa y de la PCR se identificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %. El resultado se representa en la figura 54.
Como se muestra en la figura 54, las bandas se leyeron a 120 pb, lo que demuestra la presencia de ARN y ADN en las vesfculas extracelulares derivadas de Staphylococcus aureus.
5 Aunque las realizaciones preferentes de la presente invencion se han divulgado con fines ilustrativos, los expertos en la tecnica apreciaran que son posibles diversas modificaciones, adiciones y sustituciones, sin apartarse del alcance de la invencion como se divulga en las reivindicaciones adjuntas.
Aplicabilidad industrial
Las vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas de la presente invencion se pueden usar para 10 establecer modelos animales de enfermedad que permitan el descubrimiento eficaz de farmacos preventivos o terapeuticos de enfermedades inducidas por vesfculas extracelulares derivadas por bacterias grampositivas. Asimismo, las propias vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas o sus modificaciones se pueden usar para desarrollar vacunas contra infecciones por bacterias grampositivas o enfermedades causadas por vesfculas extracelulares derivadas por bacterias grampositivas. Ademas, las vesfculas extracelulares derivadas de 15 bacterias grampositivas pueden aplicarse al desarrollo de un procedimiento para el diagnostico de los factores patogenicos responsables de la aparicion de enfermedades causadas por vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular, siendo las bacterias grampositivas Staphylococcus, en el que las vesfculas extracelulares se afslan de una secrecion del cuerpo interno de un animal o un cultivo de dichas bacterias grampositivas.
  2. 2. Un modelo animal de enfermedad establecido utilizando vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular.
  3. 3. El modelo animal de enfermedad de la reivindicacion 2, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad dermica, una enfermedad respiratoria, una enfermedad digestiva, una enfermedad genital, una enfermedad vascular, una enfermedad metabolica, una enfermedad pulmonar, una enfermedad osea y una enfermedad de los nervios craneales.
  4. 4. Un procedimiento para el establecimiento de un modelo animal de enfermedad, que comprende administrar vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular a un animal.
  5. 5. Un procedimiento para el descubrimiento de un biomarcador mediante el uso de un modelo animal de enfermedad establecido con vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular.
  6. 6. Un procedimiento para la deteccion selectiva de un candidato a farmaco preventivo o terapeutico de una enfermedad causada por vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular, en el que el procedimiento comprende la administracion de las vesfculas extracelulares a las celulas junto con un farmaco candidato, y determinar el nivel del mediador relacionado con la inflamacion o evaluar una via de senalizacion relacionada con la inflamacion.
  7. 7. Una vacuna para prevenir o tratar una infeccion por bacterias grampositivas, que comprende vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas que tienen pared celular, en la que no hay bacterias grampositivas en la vacuna y en la que las vesfculas extracelulares se afslan de una secrecion del cuerpo interno de un animal o un cultivo de dichas bacterias grampositivas.
  8. 8. La vacuna de la reivindicacion 7, en la que la vacuna se modifica utilizando bacterias transformadas o mediante el tratamiento de las bacterias con un compuesto.
  9. 9. La vacuna de la reivindicacion 7, en la que la vacuna se modifica mediante el tratamiento de las vesfculas extracelulares con un compuesto.
  10. 10. La vacuna de la reivindicacion 7, en la que la vacuna se usa en combinacion con un farmaco para mejorar la eficacia medicinal o aliviar los efectos secundarios.
  11. 11. Un procedimiento para diagnosticar la presencia de un factor patogenico de bacterias grampositivas que tienen pared celular en una muestra, mediante el uso de la deteccion de las vesfculas extracelulares separadas de las mismas.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 11, que comprende analizar una secuencia de bases de una sustancia genetica presente dentro de las vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
  13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 11, que comprende analizar una protema presente en las vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
  14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 11, que comprende analizar una respuesta inmunitaria frente a las vesfculas extracelulares derivadas de bacterias grampositivas.
  15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que el factor patogeno se obtiene de una seleccion de secrecion del grupo que consiste en fluido de lavado de la piel, lagrimas, flema, heces, sangre, orina, lfquido sinovial, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido pleural y ascitis.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12109243B2 (en) 2017-09-08 2024-10-08 Evelo Biosciences, Inc. Bacterial extracellular vesicles

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011151941A1 (ja) 2010-06-04 2011-12-08 国立大学法人東京大学 制御性ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物
FI3978598T3 (fi) 2011-12-01 2024-11-12 Univ Tokyo Ihmisperäisiä bakteereja, jotka indusoivat regulatoristen t-solujen proliferaatiota tai kertymistä
KR101650083B1 (ko) 2013-12-09 2016-08-23 한국기초과학지원연구원 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 및 이를 이용한 폐렴연쇄상구균 매개 질환 진단 방법
KR101599281B1 (ko) * 2013-12-09 2016-03-02 한국기초과학지원연구원 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 포함하는 폐렴연쇄상구균 백신 조성물
KR101798176B1 (ko) 2014-12-16 2017-11-15 주식회사 엠디헬스케어 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법
KR101726488B1 (ko) * 2015-02-23 2017-04-13 이화여자대학교 산학협력단 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 포함하는 임신관련 질환 치료용 조성물
KR20160107632A (ko) * 2015-03-04 2016-09-19 포항공과대학교 산학협력단 뉴클레아제가 처리된 세균 유래 세포밖 소포체를 이용한 세균 동정 방법
WO2016144139A2 (ko) * 2015-03-11 2016-09-15 주식회사 엠디헬스케어 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20160110232A (ko) * 2015-03-11 2016-09-21 주식회사 엠디헬스케어 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR102587334B1 (ko) * 2015-06-30 2023-10-12 (주)아모레퍼시픽 피부 개선용 균주 및 이를 포함하는 피부 개선용 키트
KR102394638B1 (ko) * 2015-09-30 2022-05-09 (주)아모레퍼시픽 유산균 유래의 세포외 소낭을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물
KR101911893B1 (ko) * 2017-01-11 2018-10-29 주식회사 엠디헬스케어 세균유래 세포밖 소포에 의한 기도 면역기능이상 조절제
WO2017123025A1 (ko) * 2016-01-15 2017-07-20 주식회사 엠디헬스케어 세균유래 세포밖 소포에 의한 기도 면역기능이상 조절제
KR102359437B1 (ko) * 2016-05-30 2022-02-09 (주)아모레퍼시픽 항여드름 물질을 스크리닝하는 방법
KR101923969B1 (ko) * 2016-07-08 2018-11-30 주식회사 엠디헬스케어 프로피오니박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102085787B1 (ko) * 2016-08-12 2020-03-06 주식회사 엠디헬스케어 바실러스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
WO2018030732A1 (ko) * 2016-08-12 2018-02-15 주식회사 엠디헬스케어 바실러스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
WO2018034430A1 (ko) * 2016-08-16 2018-02-22 주식회사 엠디헬스케어 락토바실러스 플란타룸 유래 소포를 포함하는 정신질환 예방 또는 치료용 조성물
KR20180019474A (ko) * 2016-08-16 2018-02-26 주식회사 엠디헬스케어 락토바실러스 플란타룸 유래 소포를 포함하는 정신질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2018034457A1 (ko) * 2016-08-16 2018-02-22 주식회사 엠디헬스케어 락토바실러스 속 세균 유래 소포를 포함하는 정신질환 예방 또는 치료용 조성물
KR101940423B1 (ko) * 2016-12-16 2019-01-18 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 심장질환 진단방법
WO2018111028A1 (ko) * 2016-12-16 2018-06-21 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 심장질환 진단방법
KR101833502B1 (ko) * 2016-12-16 2018-03-05 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 위암 진단방법
WO2018124618A1 (ko) * 2016-12-26 2018-07-05 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법
KR101833348B1 (ko) * 2016-12-26 2018-03-02 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 유방암 진단방법
KR20180076308A (ko) * 2016-12-26 2018-07-05 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법
WO2018124619A1 (ko) * 2016-12-26 2018-07-05 주식회사 엠디헬스케어 미생물 메타게놈 분석을 통한 방광암 진단방법
KR101833504B1 (ko) * 2016-12-26 2018-03-05 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 폐암 진단방법
KR101940424B1 (ko) * 2016-12-28 2019-01-18 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 신부전 진단방법
WO2018124735A1 (ko) * 2016-12-28 2018-07-05 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 대장종양 진단 방법
KR101940426B1 (ko) * 2016-12-28 2019-01-18 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 대장종양 진단 방법
KR101942197B1 (ko) 2016-12-28 2019-01-24 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 전립선질환 진단 방법
WO2018124726A1 (ko) * 2016-12-28 2018-07-05 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 신부전 진단방법
WO2018124742A1 (ko) * 2016-12-28 2018-07-05 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 전립선질환 진단 방법
WO2018124744A1 (ko) * 2016-12-28 2018-07-05 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 간질환 진단 방법
KR101940425B1 (ko) * 2016-12-28 2019-01-18 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 간질환 진단 방법
CA3048212A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-12 Mantra Bio, Inc. Systems and methods for algorithmic extracellular vesicle population discovery and characterization
WO2018155967A1 (ko) * 2017-02-24 2018-08-30 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 만성폐쇄성기도질환 진단 방법
KR101940445B1 (ko) * 2017-02-24 2019-01-18 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 당뇨병 진단 방법
JP6914553B2 (ja) * 2017-02-24 2021-08-04 エムディー ヘルスケア インコーポレイテッドＭｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｎｃ． 細菌メタゲノム分析を通した慢性閉塞性気道疾患の診断方法
WO2018155950A1 (ko) * 2017-02-24 2018-08-30 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 당뇨병 진단 방법
KR101940446B1 (ko) * 2017-02-24 2019-01-18 주식회사 엠디헬스케어 미생물 메타게놈 분석을 통한 난소암 진단방법
KR101944664B1 (ko) * 2017-02-24 2019-02-01 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 파킨슨병 진단방법
WO2018155960A1 (ko) * 2017-02-24 2018-08-30 주식회사 엠디헬스케어 미생물 메타게놈 분석을 통한 난소암 진단방법
WO2018216912A1 (ko) * 2017-05-26 2018-11-29 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 자폐증 진단방법
KR102008451B1 (ko) * 2017-05-26 2019-08-07 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 자폐증 진단방법
WO2018225945A1 (ko) * 2017-06-07 2018-12-13 주식회사 엠디헬스케어 미생물 메타게놈 분석을 통한 아토피피부염 진단방법
KR102019646B1 (ko) * 2017-06-07 2019-09-10 주식회사 엠디헬스케어 미생물 메타게놈 분석을 통한 아토피피부염 진단방법
KR102348048B1 (ko) 2017-06-29 2022-01-10 (주)아모레퍼시픽 유산균 유래의 세포밖 베지클을 포함하는 항노화용 조성물
KR102019648B1 (ko) * 2017-06-30 2019-09-10 주식회사 엠디헬스케어 천식환자에서 세균 메타게놈 분석을 통한 폐암 진단방법
WO2019004668A1 (ko) * 2017-06-30 2019-01-03 주식회사 엠디헬스케어 프로테우스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102011375B1 (ko) 2017-06-30 2019-08-16 주식회사 엠디헬스케어 프로테우스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102130485B1 (ko) * 2017-10-13 2020-07-06 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 알츠하이머치매 진단방법
WO2019074216A1 (ko) * 2017-10-13 2019-04-18 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 알츠하이머치매 진단방법
WO2019078434A1 (ko) * 2017-10-18 2019-04-25 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 두경부암 진단방법
WO2019078433A1 (ko) * 2017-10-18 2019-04-25 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 대사증후군 진단방법
KR102008440B1 (ko) * 2017-10-18 2019-08-08 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 대사증후군 진단방법
KR102007783B1 (ko) * 2017-10-18 2019-08-07 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 림프종 진단방법
KR102007786B1 (ko) * 2017-10-18 2019-08-07 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 두경부암 진단방법
WO2019078432A1 (ko) * 2017-10-18 2019-04-25 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 림프종 진단방법
KR102066109B1 (ko) * 2017-11-17 2020-01-15 (주)아모레퍼시픽 엑소좀을 이용한 면역세포 이동 억제용 물질을 스크리닝하는 방법
KR102095355B1 (ko) * 2018-01-12 2020-03-31 주식회사 엠디헬스케어 모르가넬라 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR101940950B1 (ko) 2018-01-23 2019-01-21 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 담관암 진단방법
KR101944660B1 (ko) * 2018-01-29 2019-01-31 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 우울증 진단방법
KR102063196B1 (ko) * 2018-02-06 2020-01-07 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 과민성장증후군 진단방법
KR101944662B1 (ko) * 2018-02-14 2019-02-01 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 뇌졸중 진단방법
US12018337B2 (en) * 2018-02-20 2024-06-25 Md Healthcare Inc. Nano-vesicle derived from catenibacterium bacteria and use thereof
WO2019168327A1 (ko) * 2018-02-28 2019-09-06 주식회사 엠디헬스케어 마이크로코커스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
WO2019169143A1 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer using turicibacter sanguinis
KR102118197B1 (ko) 2018-02-28 2020-06-02 주식회사 엠디헬스케어 마이크로코커스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
WO2019168330A1 (ko) * 2018-02-28 2019-09-06 주식회사 엠디헬스케어 스트렙토코커스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
WO2019169138A1 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer using paraclostridium benzoelyticum
WO2019169160A1 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer using ruminococcus gnavus
WO2019169168A1 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer using agathobaculum
KR102101692B1 (ko) * 2018-03-05 2020-04-20 주식회사 엠디헬스케어 락토바실러스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
WO2019172598A1 (ko) * 2018-03-05 2019-09-12 주식회사 엠디헬스케어 락토바실러스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118989B1 (ko) * 2018-03-05 2020-06-05 주식회사 엠디헬스케어 엔히드로박터 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102118203B1 (ko) * 2018-03-06 2020-06-02 주식회사 엠디헬스케어 코프로코커스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
US20230158082A1 (en) * 2018-03-06 2023-05-25 Md Healthcare Inc. Nanovesicles derived from coprococcus sp. bacteria, and use thereof
WO2019178055A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 Evelo Biosciences, Inc. Extracellular vesicles from burkholderia
WO2019178494A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-19 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer and inflammation using tyzzerella nexilis
WO2019178487A2 (en) * 2018-03-15 2019-09-19 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating disease using klebsiella quasipneumoniae subsp. similipneumoniae
WO2019178490A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-19 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer and inflammation using klebsiella oxytoca
KR102141246B1 (ko) * 2018-05-25 2020-08-04 주식회사 엠디헬스케어 qPCR 분석을 통한 대장암 진단방법
KR102170903B1 (ko) * 2018-06-25 2020-10-28 주식회사 바이오솔루션 유체 샘플로부터 세포 외 소포체를 고농축하는 크기 기반 분리법
KR102183389B1 (ko) * 2018-06-28 2020-11-26 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 염증성장염 진단 방법
KR102356626B1 (ko) * 2018-12-10 2022-01-28 주식회사 엠디헬스케어 웨이셀라 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
WO2020122449A1 (ko) * 2018-12-10 2020-06-18 주식회사 엠디헬스케어 코리네박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
KR102223406B1 (ko) * 2018-12-10 2021-03-05 주식회사 엠디헬스케어 코리네박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
CN113631725A (zh) * 2019-02-08 2021-11-09 得克萨斯州大学系统董事会 用于诊断和治疗目的的对外排体相关微生物组的分离和检测
US20220259640A1 (en) * 2019-07-08 2022-08-18 Md Healthcare Inc. Method for diagnosing brain tumor through bacterial metagenomic analysis
WO2021049834A1 (ko) * 2019-09-10 2021-03-18 주식회사 엠디헬스케어 세포밖 소포의 메타게놈 및 대사체 기반 대장암 진단방법
CN111304049A (zh) * 2019-12-09 2020-06-19 华中科技大学 一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法
IT201900024580A1 (it) 2019-12-18 2021-06-18 Consiglio Nazionale Ricerche Vescicole extracellulari da microalghe
US20240009256A1 (en) * 2020-02-04 2024-01-11 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Use of probiotic bacterium-derived extracellular micro- and/or nanoparticles for the treatment of disease
KR102558281B1 (ko) * 2020-03-04 2023-07-25 주식회사 엠디헬스케어 락토바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 기능 조절용 조성물
BR112022025626A2 (pt) * 2020-06-16 2023-01-17 Md Healthcare Inc Uso de vesículas derivadas de lactobacillus paracasei
KR20220026953A (ko) 2020-08-26 2022-03-07 (주)아모레퍼시픽 유산균 유래의 세포밖 베지클 식별용 바이오마커 및 이의 식별 방법
WO2023062422A1 (en) * 2021-10-11 2023-04-20 Vastu Vihar Biotech Private Limited An anti-inflammatory composition and a method of obtaining the same
TWI802177B (zh) * 2021-12-27 2023-05-11 景岳生物科技股份有限公司 副乾酪乳桿菌gmnl-32之核苷酸用於製備調節免疫能力之醫藥組合物的用途
CN115029258B (zh) * 2022-03-29 2024-05-17 华中科技大学 一种微生物外膜囊泡及其制备、保存方法及应用
JP2024011574A (ja) * 2022-07-15 2024-01-25 住友化学株式会社 細胞外小胞に対して結合性を有する抗体の製造方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5217872A (en) 1990-02-27 1993-06-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for detection of borrelia burgdorferi antigens
BR9609882A (pt) 1995-08-04 1999-07-27 Univ Guelph Vacina processos para preparar a mesma para tratar uma doença infecciosa para inserir uma molécula de ácido nucleico em uma célula de marcaç o para administrar um agente terapêutico a um hospedeiro e para triar um antígeno imunogênico de um patógeno uso de uma vesícula de membrana composição farmacêutica sistema de liberação de drogas e vesícula de membrana
JPH09163896A (ja) * 1995-12-13 1997-06-24 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 胸膜炎病態モデル動物
US6558677B2 (en) 1996-10-15 2003-05-06 Wendell D. Zollinger Vaccine against gram negative bacteria
GB9918319D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB0130123D0 (en) 2001-12-17 2002-02-06 Microbiological Res Agency Outer membrane vesicle vaccine and its preparation
ES2537737T3 (es) 2002-08-02 2015-06-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composiciones de vacuna que comprenden lipooligosacáridos de inmunotipo L2 y/o L3 de Neisseria meningitidis de IgtB
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
CU23313A1 (es) * 2002-11-27 2008-09-25 Inst Finlay Ct De Investigacia Mã0/00todo de obtenciã"n de estructuras cocleares. composiciones vacunales y adyuvantes basados en estructuras cocleares y sus intermediarios
GB0316560D0 (en) * 2003-07-15 2003-08-20 Chiron Srl Vesicle filtration
EP1498144A1 (en) * 2003-07-15 2005-01-19 Universite Pierre Et Marie Curie Paris Vi Extracellular vesicles from non-pathogenic amoebae useful as vehicle for transferring a molecule of interest to an eukaryotic cell
GB0323709D0 (en) 2003-10-09 2003-11-12 Health Prot Agency Modified whole cell,cell extract and omv-based vaccines
CU23377A1 (es) 2003-11-04 2009-05-28 Ct De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Metodo para la incorporacion de antigenos en vesiculas de membrana externa de bacterias y formulaciones resultantes
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
ES2307351B2 (es) * 2005-04-07 2009-06-17 Universidad Complutense De Madrid Cepa viva atenuada de staphylococcus aureus como vacuna en mastitis de rumiantes.
WO2007144316A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
WO2009030093A1 (fr) 2007-09-05 2009-03-12 Zhejiang University Fonctions et utilisations de l'inhibiteur 2 de la protéine phosphatase 1 humaine
US9365885B2 (en) * 2009-06-16 2016-06-14 Puiying Annie Mak High-throughput complement-mediated antibody-dependent and opsonic bactericidal assays
ES2694100T3 (es) 2010-04-07 2018-12-18 California Institute Of Technology Vehículo para distribuir un compuesto en una membrana mucosa y composiciones, procedimientos y sistemas relacionados

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12109243B2 (en) 2017-09-08 2024-10-08 Evelo Biosciences, Inc. Bacterial extracellular vesicles

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Publication number Publication date
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