PT2358745T

PT2358745T - Leucolectinas e suas utilizações

Info

Publication number: PT2358745T
Application number: PT97450902T
Authority: PT
Inventors: Th Walther Bernt; Miftari Mirushe
Original assignee: Leukolect As
Priority date: 2008-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2018-02-28
Also published as: KR20110095274A; GB0819883D0; KR101448573B1; CL2011000947A1; US10124034B2; US9260498B2; ZA201103456B; DK2358745T3; EP2358745A1; RU2011121616A; JP5539372B2; BRPI0920101B1; BRPI0920101A2; EP2358745B1; CN102203127B; US20110280882A1; CN102203127A; ES2658966T3; US20160151454A1; NO2358745T3

Description

DESCRIÇÃO "LEUCOLECTINAS E SUAS UTILIZAÇÕES" A presente invenção refere-se a um polipéptido, nomeadamente uma lectina, sua sequência de ácidos nucleicos codificante e anticorpos para o polipéptido e à sua utilização em várias aplicações médicas. 0 sistema de defesa imune celular é central para sobreviver a desafios microbianos e parasiticos. Este sistema é também muito relevante para controlar células desviantes na carcinogénese, após infeções virais e em doenças autoimunes. 0 reconhecimento intercelular é central em tais funções, mas a origem de tais fenómenos é por si só mal compreendida. Após eras de diversificação da biota sexual primordial, os genes devem ter evoluído para assegurar o reconhecimento específico de espécie de células sexuais ("fecundação"). Caso contrário, a viabilidade das espécies sexuais seria ameaçada. Diversas moléculas de reconhecimento celular evoluíram. Quando a era Câmbrica viu a biota a invadir os biótopos terrestres, tais biótopos áridos favoreceram cada vez mais uma restrição da fecundação sexual para ambientes protegidos com menos possibilidade de confusão de espécie. Assim, os genes para o reconhecimento de gâmetas específico de espécie tenderiam a tornar-se redundantes e, desta forma, livres para adquirirem nova funcionalidade na evolução.

Uma nova função óbvia poderia ser uma capacidade dos organismos para distinguir as suas próprias células (próprias) das células estranhas (não-próprias). É proposto que este mecanismo proporcione uma base racional para a origem do sistema de imunidade celular, um fenómeno que caso contrário é mal explicado. Tal distinção por imunidade inata (Medzhitov & Janeway, 1997, Cell, 91(3), p295-298) é essencial para organismos multicelulares a fim de prevenir a sua canibalização por parasitas e micróbios. 0 mau funcionamento dos sistemas para distinguir "próprio" do "não-próprio" pode formar a base de algumas doenças autoimunes.

Respostas imunes mal direcionadas que são referidas como autoimunidade podem ser demonstradas pela presença de autoanticorpos ou linfócitos T reativos com antigénios do hospedeiro. Embora seja geralmente inofensiva e provavelmente um fenómeno universal da vida dos vertebrados, a autoimunidade pode ser a causa de um largo espectro de doenças humanas, conhecidas como doenças autoimunes. Este conceito de autoimunidade como a causa de doença humana é relativamente nova, e não foi aceite na tendência dominante do pensamento médico até 1950 e 1960. As doenças autoimunes são definidas como doenças em que ocorre progressão de autoimunidade benigna até autoimunidade patogénica. Esta progressão é determinada por influências genéticas e por despoletadores ambientais.

As doenças autoimunes são uma importante ameaça à saúde. Existem mais de oitenta doenças causadas pela autoimunidade. São uma ameaça especial às mulheres; cerca de 75% dos doentes são mulheres. As doenças autoimunes estão entre as dez principais causas de morte entre mulheres em todos os grupos etários até aos 65.

As doenças autoimunes afetam muitas partes diferentes do corpo incluindo a pele (por exemplo, alopecia areata, penfigoide bolhoso, epidermólise bolhosa adguirida, pênfigo foliáceo, pênfigo vulgar, vitiligo, psoríase e acne), rim (por exemplo, nefropatia por IgA), sangue (por exemplo, anemia aplástica, anemias hemoliticas autoimunes, purpura trombocitopénica idiopática e anemia perniciosa) , articulações (por exemplo, espondilite anquilosante), músculos (por exemplo, polimiosite/dermatomiosite), ouvido (por exemplo, perda de audição autoimune e sindrome de Ménière), olho (por exemplo, úlcera de Mooren, sindrome de Reiter e doença de Vogt-Koyanagi-Harada) , coração (por exemplo, miocardite autoimune, sindrome de Churg-Strauss, arterite de células gigantes, doença de Kawasaki, poliarterite nodosa, arterite de Takayasu e granulomatose de Wegener), sistema endócrino (por exemplo, doença de Addison, hipoparatiroidismo autoimune, hipofisite autoimune, ooforite autoimune, orquite autoimune, doença de Greve, tiroidite de Hashimoto, sindrome autoimune poliglandular tipo 1 (PAS-1), síndrome autoimune poliglandular tipo 2 (PAS-2), sindrome autoimune poliglandular tipo 3 (PAS 3) e diabetes mellitus tipo 1), sistema gastrointestinal (por exemplo, hepatite autoimune, doença celiaca, doença inflamatória do intestino e cirrose biliar primária), sistema nervoso (por exemplo, polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, sindrome de Guillan-Barre, esclerose múltipla e miastenia gravis) ou podem afetar o corpo sistemicamente (por exemplo, sindrome antifosfolipidica, linfoproliferativa autoimune, poliendocrinopatia autoimune, doença de Bechet, sindrome de Goodpasture, artrite reumatoide, sarcoidose, escleroderma, sindrome de Sjogren e lúpus eritematoso sistémico).

As doenças autoimunes podem afetar qualquer parte do corpo e, desta forma, os sintomas variam muito, e o diagnóstico e o tratamento são frequentemente difíceis. Algumas doenças autoimunes podem por a vida em risco a menos que corretamente diagnosticadas e tratadas. Os distúrbios autoimunes crónicos como a artrite reumatoide incapacitam o doente e também originam sobrecargas pesadas nas famílias dos doentes. Alguns tipos de uveíte podem causar a cegueira. Doenças tais como a escleroderma requerem tratamento engenhoso durante toda a vida. Ainda outras doenças autoimunes, incluindo a doença de Grave e a tiroidite crónica, podem ser tratadas com sucesso se diagnosticadas corretamente, mas são frequentemente goradas devido a seu início subtil. A inflamação é um processo normal em que os glóbulos brancos e os químicos do corpo protegem o corpo da infeção e de substâncias estranhas, tais como bactérias e virus. Em algumas doenças, contudo, o sistema imunitário do corpo despoleta indevidamente uma resposta inflamatória quando não existe qualquer substância estranha para combater. A inflamação é assim comum em doenças autoimunes, mas nem todos distúrbios inflamatórios são respostas autoimunes. As doenças inflamatórias podem também ser causadas por uma grande variedade de agentes que atacam diretamente o corpo, tais como microrganismos (virus e fungos), toxinas bacterianas, determinados agentes farmacêuticos (antibióticos e esteroides anti-inflamatórios) e agentes químicos (sais biliares, produtos químicos domésticos tóxicos). As doenças que estão associadas com a inflamação incluem a artrite (que é um termo geral que descreva inflamação nas articulações), inflamação do coração (miocardite), inflamação dos pequenos tubos que transportam o ar aos pulmões (que podem causar um ataque de asma), inflamação dos rins (nefrite) e inflamação do intestino grosso (colite).

Os distúrbios inflamatórios gastrointestinais são de particular interesse, por exemplo, as doenças inflamatórias gástricas (tais como a úlcera gástrica, úlcera duodenal e gastrite) e as doenças inflamatórias intestinais (que incluem a doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, sprue tropical e não-tropical, enterite infeciosa, colite, colite ulcerosa, colite pseudomembranosa, diverticulite e doenças inflamatórias alergénicas e radiológicas).

As doenças inflamatórias gastrointestinais são caracterizadas por inflamação, especificamente pela presença de edema, células inflamatórias caracteristicas (isto é, leucócitos, histiócitos e macrófagos) e, em alguns casos, necrose e ulceração do epitélio superficial. Sabe-se que estas doenças inflamatórias são causadas por uma grande variedade de agentes presentes no aparelho gastrointestinal que são conhecidos por atacarem as suas superfícies, produzindo a resposta da doença inflamatória. Tais agentes incluem microrganismos (vírus e fungos), toxinas bacterianas, determinados agentes farmacêuticos (antibióticos e esteroides anti-inflamatórios) e agentes químicos (sais biliares, produtos químicos domésticos tóxicos) . De facto, o próprio ácido gástrico é capaz de atacar o revestimento do estômago e produzir o estado inflamatório.

As medicações atualmente usadas para tratar a inflamação incluem fármacos anti-inflamatórios não-esteroides (NSAIDs - tais como a aspirina, ibuprofeno ou naproxeno), corticosteroides (tal como a prednisona), medicações antimaláricas (tal como a hidroxicloroquina) e outras medicações, tais como o metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicações anti-TNF, ciclofosfamida e micofenolato. Algumas doenças gastrointestinais, especificamente as doenças gástricas, podem ser tratadas através da inibição de secreção de ácido gástrico que causa a inflamação, tal como pela neutralização dos efeitos do ácido (por exemplo, administração de antiácido), ou pela administração de um agente farmacológico eficaz na inibição da secreção de ácido gástrico. A pele danificada é vulnerável à infeção e pode ter aspeto desagradável e/ou causar dor ou desconforto. Alguns tipos de feridas são resistentes à cicatrização sob condições fisiológicas normais, por exemplo, úlceras crónicas. Quaisquer soluções farmacêuticas para reparar a pele danificada, particularmente para reparar feridas são muito desejáveis.

Persiste uma necessidade para tratamentos adequados para tratar condições e distúrbios autoimunes e inflamatórios ou lesão da pele com efeitos secundários mínimos.

Após muitos anos de exploração de processos potencialmente envolvidos na evolução dos eucariotas, os inventores identificaram uma nova proteína (aqui referida como leucolectina), não apenas nos gâmetas e no zigoto, mas também no embrião inicial (em células especializadas referidas como lectócitos) e durante a ontogenia dos glóbulos sanguíneos e finalmente em leucócitos.

Inicialmente a proteína foi identificada e purificada a partir de peixes (ver os Exemplos). A proteína tem 255 aminoácidos. Esta é a forma propéptido da lectina, que contém um péptido N-terminal de 19 aminoácidos que sugere que seja direcionado ao lisossoma para secreção posterior (isto é, para o espaço perivitelino). A sequência de aminoácidos da lectina permitiu o desenvolvimento de anticorpos específicos de epitopo, que por sua vez permitiram a identificação de muitas (2-8) isoformas aparentes da proteína (Figura 5), dependendo do tecido analisado. Pelo menos dois ARNm foram isolados a partir de salmão (ver o Exemplo 11), que contêm pequenas diferenças de sequência que resultam em apenas 7 mudanças ao nível do polipéptido (Figura 17) . Foram também identificadas formas truncadas da proteína de leucócitos de salmão (ver SEQ ID N°: 2) e peixe-zebra, em que foram identificadas uma forma excretada (como descrito acima, referida como SLL) e uma forma truncada que carece dos primeiros 32 aminoácidos do N-terminal, referida como tLL (ver o Exemplo 9). A proteína tem pouca semelhança com outras proteínas conhecidas, apresentado uma semelhança global de menos de 50% com qualquer proteína conhecida. Alguma semelhança foi observada em pequenos domínios com as taquilolectinas.

Foram identificadas proteínas relacionadas em vários animais, incluindo peixe-zebra, bacalhau, truta- arco-íris, Oikopleura dioica e também galinha e humanos. Os seus ADNc foram identificados (ver os Exemplos) e verificou-se serem extremamente bem conservados. As proteínas codificadas nas espécies que foram examinadas apresentam menos de 4% de variância. Isto aponta para uma função essencial para estas proteínas.

Até agora não foram reportados genes com uma sequência semelhante em quaisquer organismos. Usando sondas para exões ou intrões individuais, estabeleceu-se que existe apenas uma rara semelhança de um exão para partes de outras duas proteínas reportadas, ambas as quais são totalmente distintas da entidade molecular aqui descrita.

Importante, este novo gene é especificamente expresso em leucócitos humanos, apesar do facto de este gene não poder ser encontrado em sequências publicadas do genoma humano. Apenas segmentos muito curtos deste gene podem ser detetados, mas espalhados ao longo de múltiplos cromossomas humanos (ver os Exemplos). A resolução deste mistério não está ainda disponível.

Por último, descobriu-se que a entidade molecular é excretada por células, o que é consistente com a forma propéptido da proteína. Foram isoladas tanto a forma nativa como recombinante do produto génico.

Verificou-se surpreendentemente que estas proteínas têm efeitos pronunciados em distúrbios autoimunes e inflamatórios, particularmente da pele, e de outras condições de pele. Sem se pretender estar limitado pela teoria, crê-se que a leucolectina se liga a recetores específicos que põem em movimento os processos de cicatrização normais e inerentes do corpo humano. A partir dos efeitos observados, nós propomos que a leucolectina participe no processo normal de imunidade celular. A leucolectina parece estar ausente em muitos estados patológicos, pelo que a sua introdução farmacêutica despoleta outras respostas defensivas do sistema imunitário para funcionar normalmente face aos vários desafios: a presença de células estranhas (micróbios, parasitas) e de células modificadas da "própria" que podem associar a leucolectina à etiologia de doenças autoimunes, isto é, tais condições podem ser causadas pela ausência de leucolectina suficiente.

Os leucócitos humanos contêm e expressam proteínas de leucolectina extremamente conservadas. Até aqui, estas proteínas eram proteínas desconhecidas em glóbulos sanguíneos. A leucolectina parece ser um novo membro da família da taquilolectina de proteínas.

Num primeiro aspeto, a invenção proporciona um polipéptido compreendendo: (i) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (iii) um a porção de uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1, 2 ou 5-8, em que a referida porção compreende pelo menos 200 aminoácidos; ou (iv) uma porção de uma sequência de aminoácidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1, 2 ou 5-8 e compreende pelo menos 200 aminoácidos.

Os "polipéptidos" como aqui referidos são moléculas com preferencialmente mais de 200 ou 250 resíduos e/ou menos de 500, 400 ou 300 resíduos ou uma gama daí selecionada. Como aqui referida, uma "porção" compreende preferencialmente pelo menos 200 ou mais aminoácidos da sequência da qual é derivada. A referida porção pode ser obtida de uma porção central ou N-terminal ou C-terminal da sequência. Preferencialmente a referida porção é obtida da extremidade N-terminal, por exemplo, a partir dos primeiros 50, 100 ou 150 resíduos do polipéptido. Aspetos preferidos incluem truncamentos dos referidos polipéptidos, por exemplo, para remover um péptido de sinal ou uma porção ausente em variantes de ocorrência natural. Os truncamentos preferidos ocorrem na extremidade N-terminal e são de 1 a 50, por exemplo, 1 a 10, 20, 30 ou 40, ou 5 a 40, por exemplo, 10 a 35 resíduos de comprimento.

Preferencialmente, a referida sequência é pelo menos 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência com a qual é comparada. A identidade de sequência pode ser determinada através, por exemplo, do uso do banco de dados de sequência de proteína SWISS-PROT usando FASTA pep-cmp com um pamfator variável, e uma penalização de criação de lacuna estabelecida em 12,0 e uma penalização de extensão de lacuna estabelecida em 4,0 e uma janela de 2 aminoácidos. Preferencialmente, a referida comparação é feita ao longo da totalidade do comprimento da sequência, mas pode ser feita sobre uma janela de comparação mais pequena, por exemplo, menos de 200, 100 ou 50 aminoácidos contíguos.

Preferencialmente, tais polipéptidos relacionados por identidade de sequência são funcionalmente equivalentes aos polipéptidos que são apresentados nos N° de sequência citados. Tais polipéptidos funcionalmente equivalentes podem tomar a forma de derivados como mostrado abaixo. De modo semelhante, os polipéptidos com sequências como apresentadas nos N° de sequência podem ser modificados sem afetarem a sequência do polipéptido como descrito abaixo.

Além disso, as "porções" como aqui descritas podem ser equivalentes funcionais. Preferencialmente, estas porções satisfazem as condições de identidade (relativamente a uma região comparável) aqui mencionadas.

Como aqui referido, para conseguir "equivalência funcional" o polipéptido pode mostrar alguma eficácia reduzida ao realizar a função médica relativamente à molécula parental (isto é, a molécula da qual foi derivada, por exemplo, por substituição de aminoácido), mas preferencialmente é tão eficiente ou é mais eficiente. Assim, a equivalência funcional refere-se a um polipéptido que é eficaz para tratar uma doença como aqui referida, isto é, para reduzir um ou mais sintomas do doente, por exemplo, inflamação ou a aparência da pele como aqui descrito em seguida. Isto pode ser testado por comparação dos efeitos do polipéptido derivado relativamente ao polipéptido de que é derivado, de um modo qualitativo ou quantitativo, por exemplo, através da realização das análises in vivo referidas nos Exemplos. Nos casos em que forem possíveis resultados quantitativos, o derivado é pelo menos 30, 50, 70 ou 90% tão eficazes quanto o polipéptido parental. Alternativamente, pode ser realizado teste in vitro, por exemplo, por análise de ligação a células dendríticas ou efeitos em culturas celulares in vitro.

As proteínas funcionalmente equivalentes que são relacionadas ou derivadas da proteína de ocorrência natural, podem ser obtidas alterando a sequência de aminoácidos nativa por substituição, adição e/ou deleção simples ou múltipla de aminoácidos (desde que satisfaçam os requisitos de identidade de sequência mencionados acima), mas sem destruir a função da molécula. Preferencialmente, a sequência nativa tem menos de 20 substituições, adições ou deleções, por exemplo, menos de 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 de tais modificações. Tais proteínas são codificadas por "moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes" que são geradas por substituição, adição e/ou deleção apropriada de uma ou mais bases.

Os equivalentes funcionais preferidos são variantes de "adição" em que são gerados polipéptidos ou proteínas de fusão do terminal amino e/ou carboxilo, compreendendo um polipéptido ou proteína adicional fundida ao polipéptido parental.

As variantes funcionalmente equivalentes particularmente preferidas são as variações biológicas naturais (por exemplo, variantes alelicas ou variantes geográficas dentro de uma espécie ou alternativamente em diferentes géneros, por exemplo, plantas, animais ou bactérias) e os derivados preparados usando técnicas conhecidas. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas funcionalmente equivalentes podem ser produzidas por síntese química ou em forma recombinante usando as técnicas conhecidas de mutagénese dirigida incluindo deleção, mutagénese aleatória, ou clivagem enzimática e/ou ligação de ácidos nucleicos. A presente invenção também proporciona sequências de nucleótidos que codificam os referidos polipéptidos, a referida molécula de ácido nucleico compreendendo: (i) uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (ii) uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 98% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (iii) uma porção de uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15, em que a referida porção compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas; (iv) uma porção de uma sequência de nucleótidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15 e compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas; ou (v) uma sequência complementar a qualquer das sequências definidas em (i)-(iv).

As "moléculas de ácido nucleico" como aqui referidas são moléculas com preferencialmente mais de 600 ou 750 bases e/ou menos de 1500, 1200 ou 900 bases ou uma gama dai selecionada. As "porções" como referidas acima, compreendem preferencialmente pelo menos 600 bases nucleotidicas da sequência da qual é derivada.

Preferencialmente, as referidas porções codificam péptidos N-terminais, centrais ou C-terminais como descritos mais acima. Como discutido acima relativamente aos polipéptidos, num aspeto preferido estão contemplados truncamentos que resultam da remoção de resíduos da extremidade N-terminal dos polipéptidos reportados. Nas sequências de nucleótidos codificantes, relativamente às sequências aqui apresentadas, o referido truncamento é preferencialmente de 1 a 150, por exemplo, 1 a 30, 60, 90 ou 120, ou 13 a 120, por exemplo, 28 a 105 bases de comprimento.

Preferencialmente, a referida sequência é pelo menos 98 ou 99% idêntica à sequência com a qual é comparada. A identidade de sequência pode ser determinada através, por exemplo, de pesquisa FASTA usando pacotes GCG, com valores de defeito e um pamfator variável, e uma penalização de criação de lacuna estabelecida em 12,0 e uma penalização de extensão de lacuna estabelecida em 4,0 com uma janela de 6 nucleótidos.

Preferencialmente, tais moléculas de ácido nucleico que hibridam ou que estão relacionadas por identidade de sequência são funcionalmente equivalentes às moléculas de ácido nucleico que são apresentadas nos N° de sequência citados. Tais moléculas equivalentes de ácido nucleico funcionalmente podem tomar a forma de derivados como apresentados abaixo e são considerados funcionalmente equivalentes se codificarem polipéptidos que seriam considerados equivalentes funcionais de acordo com os testes aqui descritos anteriormente. Os equivalentes funcionais preferidos são aqueles que codificam os polipéptidos preferidos como apresentados acima, por exemplo, moléculas de ácido nucleico que codificam polipéptidos encontrados em géneros ou espécies diferentes do que as moléculas específicas aqui mencionadas.

Além disso, as "porções" como aqui descritas podem ser equivalentes funcionais. Preferencialmente, estas porções satisfazem as condições de identidade (relativamente a uma região comparável) ou de hibridação aqui mencionadas.

As moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem ser ADN, ADNc ou ARN de cadeia simples ou dupla, preferencialmente ADN e incluem sequências degeneradas, substancialmente idênticas e que hibridam como descritas acima. Idealmente, contudo, as moléculas são ADN ou ADNc.

Os polipéptidos como descritos acima, incluem aqueles que são modificados sem afetarem a sequência do polipéptido, por exemplo, por modificação química, incluindo por desglicosilação ou glicosilação. Tais polipéptidos podem ser preparados por modificação pós-síntese/isolamento do polipéptido sem afetar a funcionalidade, por exemplo, determinada glicosilação, metilação etc. de resíduos particulares.

Os polipéptidos da invenção podem também tomar a forma de peptidomiméticos que podem ser considerados derivados em que as características funcionais do polipéptido são retidas mas apresentadas no contexto de uma estrutura diferente, por exemplo, não-peptídica. Tais peptidomiméticos têm sido desenvolvidos com sucesso e usados para outras aplicações, particularmente médicas.

Os peptidomiméticos, particularmente moléculas não-peptidicas, podem ser gerados através de vários processos, incluindo conceção de fármaco com base na conformação, seleção/rastreio, conceção de biblioteca focada e química médica clássica. Podem ser usados não apenas oligómeros de aminoácidos não naturais ou outros blocos de construção orgânicos, mas podem ser usados também hidratos de carbono, compostos heterocíclicos ou macrocíclicos ou qualquer molécula orgânica que compreenda elementos estruturais e conformação que proporcione uma superfície eletrostática molecular que mimetiza as mesmas propriedades da conformação tridimensional do péptido pelos métodos conhecidos na técnica.

Assim, os peptidomiméticos podem conter pouca ou nenhuma semelhança com uma estrutura peptídica. Os peptidomiméticos podem compreender uma forma não-peptídica inteiramente sintética (por exemplo, baseada numa estrutura de hidrato de carbono com substituintes adequados) ou podem reter um ou mais elementos do péptido do qual são baseados, por exemplo, derivatizando um ou mais aminoácidos ou substituindo um ou mais aminoácidos com componentes não-peptídicos alternativos. Os moldes de tipo peptídico incluem pseudopéptidos e péptidos cíclicos. Os elementos estruturais considerados redundantes para a função do péptido podem ser minimizados para reter apenas uma função de andaime ou serem removidos sempre que apropriado.

Quando os peptidomiméticos retêm um ou mais elementos do péptido, isto é, mais do que um aminoácido, tais aminoácidos pode ser substituídos com um seu análogo estrutural ou não convencional. Os aminoácidos retidos nas sequências podem também ser derivatizados ou modificados (por exemplo, marcados, glicosilados ou metilados) desde que sejam retidas as propriedades funcionais dos polipéptidos da invenção. Os peptidomiméticos são referidos como sendo "deriváveis" de uma determinada sequência polipeptídica. Por isto entende-se que o peptidomimético é concebido com referência a uma sequência polipeptídica definida, de modo que retenha as caracteristicas estruturais do péptido que são essenciais para a sua função. Isto pode ser as cadeias laterais particulares do polipéptido, ou o potencial de pontes de hidroqênio da estrutura. Tais caracteristicas podem ser proporcionadas por componentes não-peptídicos ou um ou mais dos resíduos de aminoácidos ou as ligações que ligam os referidos resíduos de aminoácidos do polipéptido podem ser modificados para melhorar determinadas funções do polipéptido, tais como estabilidade ou resistência a proteases, enquanto retêm as características estruturais do polipéptido que são essenciais para a sua função.

Os exemplos de aminoácidos análogos estruturais ou não convencionais que podem ser usados são D-aminoácidos, isoésteres de amida (tais como, N-metilamida, amida retro-inversa, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinilo, (E)-vinilo, metilenoamino, metilenotio ou alcano), L-N- metilaminoácidos, D-oí-metilaminoácidos, D-N- metilaminoácidos. Os exemplos de aminoácidos não-convencionais são listados na Tabela 1. TABELA 1

Os aminoácidos não convencionais que podem ser usados incluem analógicos conformacionalmente restringidos, tais como, por exemplo, Tie (para substituir F) , Aib (para substituir A) ou ácido pipecólico (para substituir Pro).

Os polipéptidos e as moléculas de ácido nucleico discutidos acima também incluem derivados que foram modificados, por exemplo, para facilitar a sua utilização em aplicações farmacêuticas (discutidas abaixo), por exemplo, por adição de grupos funcionais ou de direcionamento, por exemplo, para melhorar a lipofilicidade, auxiliar o transporte celular, a solubilidade e/ou a estabilidade. Assim, oligossacáridos, ácidos gordos, álcoois gordos, aminoácidos, péptidos ou polipéptidos podem ser conjugados aos polipéptidos ou as moléculas de ácido nucleico acima mencionados. As moléculas de ácido nucleico podem estar presentes num transportador virai como aqui descrito em seguida.

Os polipéptidos também abrangem derivados sob a forma de "profármacos" ou "propéptidos" de modo que o componente adicionado possa ser removido por clivagem uma vez administrado, por exemplo, por clivagem de um substituinte adicionado através de esterificação que pode ser removido por ação de esterases. Tais profármacos incluem precursores nativos das proteínas de ocorrência natural que são clivados, por exemplo, através de proteólise para produzir o polipéptido de interesse. Tais precursores podem ser inativos na forma de precursor mas podem ser ativados por clivagem proteolitica. As moléculas de ácido nucleico da invenção, de modo semelhante, abrangem assim moléculas que codificam tais profármacos ou precursores. Polipéptidos ou moléculas de ácido nucleico modificados como descritos acima podem ser testados para garantir que retêm a atividade funcional relativamente à molécula não modificada por determinação se têm o mesmos ou semelhantes efeitos médicos.

As moléculas de ácido nucleico descritas acima podem ser ligadas operativamente a uma sequência de controlo de expressão, ou a um vetor ou veiculo de clonagem de ADN recombinante contendo tal molécula de ADN recombinante. Isto permite a expressão intracelular do polipéptido da invenção como um produto génico, cuja expressão é dirigida pelo(s) gene(s) introduzido(s) nas células de interesse. A expressão genética é dirigida a partir de um promotor ativo nas células de interesse e pode ser introduzido em qualquer forma de vetor de ADN linear ou circular para incorporação no genoma ou para replicação independente ou transfecção/expressão transiente. As técnicas adequadas de transformação ou transfecção estão bem descritas na literatura. Alternativamente, a molécula de ADN simples pode ser introduzida diretamente na célula para as utilizações aqui descritas.

Os vetores de expressão adequados incluem sequências de controlo adequadas, tal como, por exemplo, elementos de controlo de tradução (por exemplo, codões de iniciação e de terminação, locais de liqação ribossomal) e transcricionais (por exemplo, reqiões promotoras-operadoras, sequências stop de terminação) liqadas em grelha de leitura condizente com as moléculas de ácido nucleico requeridas para o desempenho do método da invenção como descrito em seguida. Os vetores apropriados podem incluir plasmideos e virus (incluindo bacteriófagos e virus eucarióticos). Os vetores virais adequados incluem baculovirus e também adenovirus, virus adeno-associados, herpes e virus vaccinia/poxvirus. Muitos outros vetores virais são descritos na técnica. Os vetores preferidos incluem os vetores de expressão bacterianos e de mamífero pGEX-KG, pEF-neo e pEF-HA. A molécula de ácido nucleico pode ser convenientemente fundida com ADN que codifica um polipéptido adicional, por exemplo, a glutationo-S-transferase, para produzir uma proteína de fusão aquando da expressão.

Assim, do ponto de vista de um aspeto adicional, a presente invenção proporciona um vetor, preferencialmente um vetor de expressão, compreendendo uma molécula de ácido nucleico como definida acima.

Outros aspetos da invenção incluem métodos para preparar moléculas de ácido nucleico recombinante de acordo com a invenção, compreendendo introduzir sequências de nucleótidos que codificam os polipéptidos da invenção no ácido nucleico vetor.

Em métodos como aqui descritos em seguida, os polipéptidos podem ser administrados a uma célula por transfecção de uma célula com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Como mencionado acima, a presente invenção estende-se assim à moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica os polipéptidos da invenção como aqui descritos e a sua utilização nos métodos aqui descritos. Preferencialmente, as referidas moléculas de ácido nucleico estão contidas num vetor, por exemplo, um vetor de expressão.

As moléculas de ácido nucleico da invenção, contidas preferencialmente num vetor, podem ser introduzidas numa célula por quaisquer meios apropriados. As técnicas adequadas de transformação ou transfecção estão bem descritas na literatura. É conhecida uma variedade de técnicas e estas podem ser usadas para introduzir tais vetores em células procarióticas ou eucarióticas para expressão. As células hospedeiras preferidas para este fim incluem linhas celulares de inseto, linhas celulares eucarióticas ou E. coli, tal como a estirpe BL21/DE3. A invenção também se estende a células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas transformadas ou transfectadas contendo uma molécula de ácido nucleico, particularmente um vetor como definido acima.

Um aspeto adicional da invenção proporciona um método de preparação de um polipéptido da invenção como aqui definido anteriormente, que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico como definida acima, sob condições em que o referido polipéptido é expresso e recuperar a referida molécula assim produzida. 0 polipéptido expresso forma um aspeto adicional da invenção. A invenção também se estende a um polipéptido codificado por uma molécula de ácido nucleico como aqui descrita anteriormente. Este pode ser produzido por expressão numa célula hospedeira como descrito acima.

As células contendo polipéptidos da invenção, mas que foram modificadas relativamente às células nativas por introdução direta dos referidos polipéptidos ou por expressão de material de ácido nucleico codificante formam aspetos adicionais da invenção. Preferencialmente, os referidos polipéptidos ou moléculas de ácido nucleico não aparecem nas referidas células endogenamente, isto é, a referida célula é modificada para conter polipéptidos ou material de ácido nucleico exógeno. A presente invenção também se estende a anticorpos (monoclonais ou policlonais) e aos seus fragmentos de ligação a antigénio (por exemplo, fragmentos F(ab)2, Fab e Fv, isto é, fragmentos da região "variável" do anticorpo, que compreende o local de ligação de antigénio) dirigidos especificamente aos polipéptidos como aqui definidos anteriormente.

Os anticorpos aqui descritos podem ser usados in vitro para identificar a presença ou a quantidade do polipéptido da invenção e podem ser usados em diagnóstico para identificar distúrbios ou lesão da pele como aqui descrito, associado com níveis aberrantes do referido polipéptido, isto é, variação relativamente aos níveis normais, por exemplo, níveis aumentados ou reduzidos do referido polipéptido.

Assim, é aqui divulgado um método de determinação da presença ou da quantidade de um polipéptido da invenção ou de uma sua porção numa amostra, em que um anticorpo como aqui descrito é colocado em contacto com a referida amostra e a extensão da ligação do anticorpo é indicadora da presença ou da quantidade do referido polipéptido ou sua porção. A amostra que é ensaiada pode ser qualquer amostra conveniente, por exemplo, uma amostra sangue ou de tecido ou uma amostra não-biológica. Preferencialmente, a amostra é derivada de um animal como aqui descrito, preferencialmente um humano. É aqui divulgado um método de diagnóstico de um distúrbio ou lesão da pele como aqui descrito num animal, compreendendo pelo menos os passos de determinar a presença ou a quantidade de um polipéptido como aqui descrito numa amostra do referido animal, em que a referida presença ou quantidade é diagnóstica do referido distúrbio ou lesão da pele. 0 polipéptido pode ser detetado usando, por exemplo, os anticorpos aqui descritos anteriormente. A amostra e o animal são preferencialmente como aqui descritos. A quantidade é preferencialmente uma redução no nivel do referido polipéptido comparativamente aos niveis normais. 0 diagnóstico pode ser conseguido por comparação com tabelas padronizadas de indivíduos normais comparativamente àqueles com o distúrbio ou lesão da pele sob investigação.

Os polipéptidos ou as moléculas de ácido nucleico usados nas composições e utilizações da invenção como aqui descrito abaixo podem ser obtidos ou derivados a partir de fontes naturais ou podem ser gerados total ou parcialmente de forma sintética.

Convenientemente, os polipéptidos e as moléculas de ácido nucleico são isolados de acordo com os protocolos descritos nos Exemplos.

Assim, é aqui divulgado um método de isolamento de um polipéptido como aqui descrito a partir de fluido de eclosão (por exemplo, de salmão) compreendendo pelo menos os passos de: a) suspender ovos num volume mínimo de água (por exemplo, equivalente ao volume dos ovos ou menos); b) induzir a eclosão rápida e sincronizada dos referidos ovos (preferencialmente de modo que a eclosão esteja completa dentro de menos de 2 horas para mais de 95% dos embriões); c) filtrar os ovos eclodidos para obter o líquido de eclosão; d) opcionalmente adicionar ureia sólida ao referido fluido de eclosão para permitir a dissociação dos fragmentos de casca de ovo e sujeitar o referido fluido a centrifugação de baixa velocidade; e) realizar um primeiro passo de cromatografia de exclusão, por exemplo, usando uma coluna Superdex 16/60 ou um ultrafiltro Biotex 100; f) opcionalmente realizar um segundo passo de cromatografia de exclusão, por exemplo, usando uma coluna Superdex 16/60, e g) opcionalmente remover proteínas contaminantes, tal como zonase, por cromatografia de afinidade, por exemplo, numa coluna de Benzamidina-Sepharose.

Quando o polipéptido da invenção for obtido a partir de leucócitos, este é obtido na forma não modificada. Os polipéptidos obtidos a partir de fluido de eclosão de salmão estão modificados (por glicosilação e/ou fosforilação) , mas ambas as formas são igualmente eficazes nos métodos aqui descritos.

Os polipéptidos ou as moléculas de ácido nucleico aqui descritos estão preferencialmente substancialmente isentos de quaisquer componentes contaminantes derivados do material ou materiais de oriqem usados no procedimento de isolamento ou na sua preparação sintética. De um modo especialmente preferido, o composto é purificado até um grau de pureza de mais de 50 ou 60%, por exemplo, >70, 80 ou 90%, preferencialmente mais de 95 ou 99% de pureza como avaliado em p/p (peso seco). Tais níveis de pureza correspondem à molécula específica de interesse, mas incluem os seus produtos de degradação. Sempre que apropriado, podem ser usadas preparações enriquecidas que têm uma pureza mais baixa, por exemplo, contêm mais de 1, 2, 5 ou 10% da molécula de interesse, por exemplo, mais de 20 ou 30%. Os polipéptidos da invenção podem ser purificados, por exemplo, através de cromatografia (por exemplo, HPLC, exclusão de tamanho, permuta iónica, afinidade, interação hidrófoba, fase reversa) ou eletroforese capilar.

Os polipéptidos da invenção podem ser gerados sinteticamente, por exemplo, através de ligação de péptidos mais pequenos gerados sinteticamente ou mais convenientemente por expressão recombinante de uma molécula de ácido nucleico que codifica do referido polipéptido como aqui descrito anteriormente.

As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, através de amplificação de uma sequência de ácido nucleico como aqui descrita tal como a partir de uma biblioteca de ADNc apropriada.

Os polipéptidos, as moléculas de ácido nucleico ou os anticorpos como aqui descritos podem ser usados in vitro, por exemplo, em cultura de células ou órgãos, para afetar as funções imunes em células.

Alternativamente, os polipéptidos, as moléculas de ácido nucleico ou os anticorpos podem ser usados ex vivo, em produtos ou partes de animais, por exemplo, órgãos ou sangue, células ou tecidos recolhidos, particularmente quando for contemplado que estes serão reintroduzidos no corpo de qual são derivados.

Contudo, os polipéptidos, as moléculas de ácido nucleico e os anticorpos são preferidos para utilização in vivo como discutido em mais detalhe abaixo.

Os polipéptidos, as moléculas de ácido nucleico e os anticorpos como aqui descritos têm aplicações para o tratamento de vários distúrbios ou condições como aqui descritos em seguida. A presente invenção estende-se assim a uma composição farmacêutica compreendendo um polipéptido, molécula de ácido nucleico ou anticorpo como aqui descrito anteriormente e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

Por "farmaceuticamente aceitável" ou "fisiologicamente aceitável" entende-se que o ingrediente deve ser compatível com outros ingredientes na composição, assim como fisiologicamente aceitável para o recetor. 0 ingrediente ativo para administração pode ser apropriadamente modificado para utilização numa composição farmacêutica. Por exemplo, os compostos usados de acordo com a invenção podem ser estabilizados contra a degradação através da utilização de derivados como descrito acima. 0 ingrediente ativo pode também ser estabilizado nas composições, por exemplo, através da utilização de aditivos apropriados, tais como sais ou não-eletrólitos, acetato, SDS, EDTA, tampões de citrato ou acetato, manitol, glicina, HSA ou polissorbato. A molécula de ácido nucleico, polipéptido ou anticorpo da invenção pode estar presente nas referidas composições como o único ingrediente ativo ou pode estar combinado com outros ingredientes, particularmente outros ingredientes ativos, por exemplo, para aumentar o efeito terapêutico ou para tornar a composição mais apelativa ao consumidor. A composição compreendendo o polipéptido da invenção pode também compreender zonase ou uma enzima relacionada. Como aqui referido, zonase é uma preparação contendo uma enzima, em que a referida preparação apresenta uma banda de proteína na análise de SDS-PAGE, com um peso molecular em torno de 28kDa, obtenível por um método compreendendo os passos de: a) suspender ovos de salmão num volume mínimo de água; b) induzir a eclosão rápida e sincronizada dos referidos ovos de salmão; c) filtrar os ovos eclodidos de salmão para obter o líquido de eclosão; d) adicionar ureia sólida ao referido fluido de eclosão para permitir a dissociação dos fragmentos da casca de ovo de salmão e sujeitar o referido fluido a centrifugação de baixa velocidade; e) purificar adicionalmente a referida zonase sujeitando o sobrenadante da centrifugação a filtração em gel; e f) purificar adicionalmente a referida zonase por cromatografia de afinidade numa coluna Superose 6B® modificada com benzamidina, em que a referida cromatografia de afinidade é realizada através da execução de lavagens com sal concentrado, seguidas por eluição com dioxano, em solução salina concentrada, para extrair zonases ligadas à matriz da cromatografia ou a estruturas macromoleculares; em que a referida zonase tem as seguintes propriedades: a) cliva o cromozima X; b) é inibida pela benzamidina; c) cliva ligações péptidicas com arginina; d) permanece ativa na presença de 8M ureia, concentrações molares de sal, água destilada e solventes orgânicos, preferencialmente dioxano ou propanol; e e) retém a atividade enzimática em solução à temperatura ambiente durante 50 dias. A zonase pode ser preparada como descrito nos exemplos e adicionada à composição ou pode representar uma "impureza" após preparação do polipéptido da invenção a partir de fontes naturais. Em composições compreendendo o polipéptido da invenção e zonase, o polipéptido pode estar presente na gama de 1-100% do seu peso total combinado e a zonase pode constituir 0 a 99%. Preferencialmente, o polipéptido está presente numa gama de 50-100%, por exemplo, >80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 e a zonase estar presente a 0 a 50%, por exemplo, < 20, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1% do peso combinado.

Num aspeto adicional a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo: (a) um polipéptido compreendendo: (i) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (iii) uma porção de uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8, em que a referida porção compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (iv) uma porção de uma sequência de aminoácidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8 e compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (b) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido como definido em (a) , em que a referida molécula de ácido nucleico compreende: (i' ) uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (ii' ) uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (iii') uma porção de uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15, em que a referida porção compreende pelo menos 300 bases nucleotidicas; ou (iv' ) uma porção de uma sequência de nucleótidos definida em (i') ou (ii'), em que a referida porção é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15 e compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas; ou (c) um anticorpo como acima definido, e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, para utilização em terapia.

Como mencionado acima, os polipéptidos e as moléculas de ácido nucleico da invenção apresentam propriedades terapêuticas no tratamento de vários distúrbios autoimunes e inflamatórios, particularmente da pele, assim como tratamento de pele danificada, por exemplo, pelo sol, frio, irradiação (por exemplo, raios X, tal como quando usados para tratar cancros) ou como resultado de uma ferida.

Como aqui referido, um "distúrbio" refere-se a um distúrbio patológico subjacente num organismo sintomático ou assintomático relativamete a um organismo normal, que possa resultar, por exemplo, de infeção ou de uma imperfeição genética adquirida ou congénita.

Como apresentado nos Exemplos, a utilidade da leucolectina para tratar uma variedade de condições inflamatórias, autoimunes e outras da pele foi ilustrada. Uma eficácia semelhante pode ser esperada para tratar outras condições. Por exemplo, a inflamação gastrointestinal crónica pode ser explicada por uma reação excessiva (ou talvez em alguns casos como uma) falha de reação por células dendriticas a agentes nocivos. A introdução de leucolectina, por exemplo, oralmente, seria consequentemente esperada de tratar a inflamação GIT crónica do mesmo modo que a pele inflamada responde favoravelmente à introdução de leucolectina.

As doenças autoimunes podem ser causadas pela expressão somática especifica de versões mutadas de antigénios de superfície celular normais. Sem se pretender estar limitado pela teoria, as leucolectinas podem servir para proteger células alvo de ataque.

Como aqui referido um "distúrbio inflamatório" é um distúrbio em que a inflamação é observada a dada altura durante a progressão do distúrbio e pode ser o único sintoma ou um de vários sintomas. 0 distúrbio inflamatório pode ser agudo ou crónico e pode ser como aqui descrito anteriormente ou em seguida. Os distúrbios inflamatórios incluem inflamação cardiovascular (por exemplo, aterosclerose, acidente vascular cerebral), inflamação gastrointestinal (incluindo úlceras, tais como úlceras gástricas ou duodenais), distúrbios inflamatórios hepáticos, inflamação pulmonar (por exemplo, asma, lesão pulmonar induzida por ventilador), inflamação dos rins, inflamação ocular (por exemplo, uveite), inflamação pancreática, inflamação génito-urinária, distúrbios neuroinflamatórios (por exemplo, esclerose múltipla, doença de Alzheimer), alergia (por exemplo, rinite/sinusite alérgica, distúrbios e alergias da pele (por exemplo, urticária/erupção da pele, angioedema, dermatite atópica, dermatite de contacto, psoríase), alergias alimentares, alergias farmacológicas, alergias a insetos, mastocitose) , inflamação esquelética (por exemplo, artrite, osteoartrite, artrite reumatoide, espondiloartropatias), infeção (por exemplo, infeções bacterianas ou virais; distúrbios inflamatórios orais (isto é, perodontite, gengivite ou somatite); irritação nas membranas mucosas; e transplantação (por exemplo, rejeição de aloenxerto ou xenoenxerto ou tolerância materno-fetal).

Os distúrbios inflamatórios para tratamento de acordo com a presente invenção são distúrbios inflamatórios da pele, tais como eczema, acne, rosácea, psoríase e dermatite de contacto, inflamação gastrointestinal e condições das mucosas, tal como úlceras ou irritações.

Como aqui referido um "distúrbio autoimune" é um em que autoimunidade benigna progrediu para autoimunidade patogénico e pode ser como aqui descrita anteriormente ou em seguida. As doenças autoimunes incluem, a síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA, que é uma doença virai com um componente autoimune), alopecia areata, espondilite anquilosante, sindrome antifosfolipido, doença de Addison autoimune, anemia hemolitica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune do ouvido interno (AIED), sindrome linfoproliferativa autoimune (ALPS), purpura trombocitopénica autoimune (ATP), doença de Behcet, cardiomiopatia, sprue celiaco-dermatite herpetiforme; síndrome da disfunção imune de fadiga crónica (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (CIPD), penfigoide cicatricial, doença da aglutinina fria, síndrome CREST, doença de Crohn, doença de Degos, dermatomiosite-juvenil, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, tiroidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) , nefropatia de IgA, diabetes mellitus dependente de insulina, artrite crónica juvenil (doença de Still), artrite reumatoide juvenil, doença de Ménière, doença de tecido conjuntivo misto, esclerose múltipla, miastenia gravis, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, sindromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoriase, artrite psoriática, fenómenos de Raynaud, sindrome de Reiter, febre reumática, artrite reumatoide, sarcoidose, escleroderma (esclerose sistémica progressiva (PSS), também conhecida como esclerose sistémica (SS)), sindrome de Sjogren, sindrome do homem rigido, lúpus eritematoso sistémico, arterite de Takayasu, arterite temporal/arterite da célula gigante, colite ulcerosa, uveite, vitiligo e granulomatose de Wegener. "Pele danificada" como aqui referido inclui pele que foi danificada por influências externas, tais como calor, irradiação (por luz de vários comprimentos de onda, tais como raios X ou UV), frio, fricção, dilaceração ou uma ferida, por exemplo, resultante de um acidente ou de uma cirurgia. Alternativamente, a pele danificada pode resultar de uma infeção, ou doença ou anomalia genética subjacente. A lesão pode ser apresentada como gretas, vermelhidão, comichão, inflamação, pele calosa, escamação, etc. A presente invenção proporciona a utilização de: (a) um polipéptido compreendendo: (i) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (iii) uma porção de uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8, em que a referida porção compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (iv) uma porção de uma sequência de aminoácidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8 e compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (b) um polipéptido produzido pela expressão numa célula hospedeira como descrito acima; ou (c) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido como definido em (a) , em que a referida molécula de ácido nucleico compreende: (i' ) uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (ii' ) uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (iii') uma porção de uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15, em que a referida porção compreende pelo menos 300 bases nucleotidicas; ou (iv' ) uma porção de uma sequência de nucleótidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12,14 ou 15 e compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas; ou (d) uma composição farmacêutica compreendendo o polipéptido de (a) ou (b) ou o ácido nucleico de (c) e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir um distúrbio autoimune da pele, um distúrbio inflamatório da pele ou de uma membrana mucosa ou uma pele danificada num animal.

Numa exposião alternativa, a invenção proporciona: (a) polipéptido compreendendo: (i) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (iii) uma porção de uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8, em que a referida porção compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (iv) uma porção de uma sequência de aminoácidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8 e compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (b) polipéptido produziu pela expressão numa célula hospedeira como descrito acima; ou (c) molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido como definido em (a), em que a referida molécula de ácido nucleico compreende: (i' ) uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (ii' ) uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (iii') uma porção de uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15, em que a referida porção compreende pelo menos 300 bases nucleotidicas; ou (iv' ) uma porção de uma sequência de nucleótidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15 e compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas; ou (d) composição farmacêutica compreendendo o polipéptido de (a) ou (b) ou o ácido nucleico de (c) e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, para utilização no tratamento ou prevenção de um distúrbio autoimune da pele, um distúrbio inflamatório da pele ou de uma membrana mucosa ou uma pele danificada num animal.

Num aspeto preferido, a invenção proporciona tais utilizações, polipéptidos, moléculas de ácido nucleico ou composições farmacêuticas para administração tópica à pele.

Preferencialmente, o referido distúrbio é eczema, acne, psoríase, inflamação gastrointestinal (como na doença de Crohn, colite ulcerosa e outra inflamação crónica), gengivite e inflamação da cavidade oral e esófago e a referida pele danificada está irritada ou inflamada, gretada pelo frio, queimada pelo sol, danificada pelo calor ou irradiação ou como resultado de uma ferida.

Como aqui usado, "tratar" refere-se à redução, alivio ou eliminação, preferencialmente para níveis normais, de um ou mais dos sintomas ou efeitos do referido distúrbio ou lesão, por exemplo, presença ou extensão da pele danificada, por exemplo, tamanho relativo da ferida, inflamação, vermelhidão, comichão, dor, etc., relativamente aos sintomas ou efeitos presentes numa parte diferente do corpo do referido indivíduo não sujeito ao referido tratamento ou num indivíduo correspondente não sujeito ao referido tratamento. "Prevenir" refere-se à prevenção absoluta, ou à redução ou alívio da extensão ou timing (por exemplo, atraso) do início desse sintoma ou efeito. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por métodos de terapia génica, por exemplo, utilização de sequências anti-ARN ou sem-sentido.

Os polipéptidos e as moléculas de ácido nucleico para utilização de acordo com a invenção podem ser vantajosamente combinados com a administração de um ou mais ingredientes ativos que são eficazes no tratamento ou prevenção de distúrbios ou lesão da pele. Assim, as composições farmacêuticas da invenção podem conter adicionalmente um ou mais de tais ingredientes ativos.

De acordo com um aspeto adicional da invenção, nós proporcionamos produtos contendo um ou mais polipéptidos, moléculas de ácido nucleico ou anticorpos como aqui definidos e um ou mais ingredientes ativos adicionais como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial em terapia humana ou animal.

As composições da invenção podem ser formuladas de modo convencional com um ou mais veículos, excipientes e/ou diluentes fisiologicamente aceitáveis, de acordo com técnicas bem conhecidas no campo técnico usando ingredientes prontamente disponíveis.

Assim, o ingrediente ativo pode ser incorporado, opcionalmente juntamente com outras substâncias ativas como uma preparação combinada, com um ou mais veículos, diluentes e/ou excipientes convencionais, para produzir preparações galénicas convencionais, tais como comprimidos, pílulas, pós, pastilhas, saquetas, hóstias, elixires, suspensões (como fluidos de injeção ou infusão), emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um sólido ou num meio líquido), pomadas, cápsulas de gelatina mole e dura, supositórios, soluções injetáveis estéreis, pós empacotados estéreis, e semelhantes. Podem também ser usados polímeros biodegradáveis (tais como poliésteres, polianidridos, ácido poliláctico ou ácido poliglicólico) para implantes sólidos. As composições podem ser estabilizadas por meio de liofilização, subarrefecimento ou Permazyme.

Os excipientes, veículos ou diluentes adequados são lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma de acácia, fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, lactose de cálcio, amido de milho, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, xarope de água, água, água/etanol, água/glicol, água/polietileno, glicol, propilenoglicol, metilcelulose, metil-hidroxibenzoatos, propil-hidroxibenzoatos, talco, estearato de magnésio, óleo mineral ou substâncias gordas, tal como gordura dura ou suas misturas adequadas. Podem também ser usados agentes para a obtenção de formulações de libertação sustida, tais como carboxipolimetileno, carboximetilcelulose, acetatoftalato de celulose, ou polivinilacetato.

As composições podem adicionalmente incluir agentes lubrificantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes, agentes aumentadores de viscosidade, agentes de granulação, agentes desintegrantes, agentes de ligação, agentes ativos osmóticos, agentes de suspensão, agentes conservantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, aumentadores de adsorção (por exemplo, agentes de penetração de superfície ou para distribuição nasal, por exemplo, sais biliares, lecitina, tensioativos, ácidos gordos, quelantes), agentes de escurecimento, solvente orgânico, antioxidante, agentes de estabilização, emolientes, silicone, ácido alfa-hidroxilo, demulcente, agente antiespumante, agente hidratante, vitamina, fragrância, espessantes iónicos ou não-iónicos, tensioativos, enchimento, espessante iónico ou não-iónico, sequestrante, polímero, propulsor, agente acidificante ou alcalinizante, opacificador, agentes corantes e compostos gordos e semelhantes.

As composições da invenção podem ser formuladas para proporcionar libertação rápida, sustida ou retardada do ingrediente ativo após administração ao corpo através da utilização de técnicas bem conhecidas no campo técnico. A composição pode ser em qualquer forma de dosagem apropriada para permitir a distribuição ou para direcionamento a células ou tecidos particulares, por exemplo, como uma emulsão ou em lipossomas, niossomas, microsferas, nanopartículas ou semelhantes, com o qual o ingrediente ativo pode ser absorvido, adsorvido, incorporado ou ligado. Isto pode converter eficazmente o produto numa forma insolúvel. Estas formas particuladas podem ultrapassar os problemas de estabilidade (por exemplo, degradação) e de distribuição.

Estas partículas podem conter moléculas de superfície adequadas para melhorar o tempo de circulação (por exemplo, componentes séricos, tensioativos, polioxamina 908, PEG, etc.) ou unidades para direcionamento específico de local, tal como ligandos para recetores transportados em células particulares. As técnicas apropriadas para distribuição de fármacos e para direcionamento são bem conhecidas na técnica e são descritas em W099/62315. A utilização de soluções, suspensões, géis e emulsões é preferida, por exemplo, o ingrediente ativo pode ser transportado em água, um gás, um líquido à base de água, um óleo, um gel, uma emulsão, uma emulsão de óleo-em-água ou água-em-óleo, uma dispersão ou uma sua mistura.

As composições podem ser para administração tópica (por exemplo, à pele), oral ou parentérica, por exemplo, por injeção. Como mencionado anteriormente, a leucolectina apresenta muito pouca variação entre diferentes espécies. De facto, verificou-se ser invariante numa população humana saudável e isto permite assim a utilização de leucolectina, por exemplo, por administração por injeção em indivíduos, sem despoletar uma resposta de anticorpo humoral, de forma semelhante à proteína insulina que é também invariante na população humana. Consequentemente, uma terapia sistémica por injeção de leucolectina pode ser usada para tratar condições aqui descritas, particularmente distúrbios autoimunes. A administração e composições tópicas são contudo preferidas, e incluem géis, cremes, pomadas, sprays, loções, bálsamos, stick, sabões, pós, filmes, aerossóis, gotas, espumas, soluções, emulsões, suspensões, dispersões, por exemplo, dispersões de vesículas não-iónicas, leites e quaisquer outras formas farmacêuticas convencionais na técnica.

As pomadas, géis e cremes podem ser, por exemplo, formuladas com uma base aquosa ou oleosa com a adição de agentes espessantes e/ou gelantes adequados. As loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa e, geralmente, também contêm um ou mais agentes emulsionantes, dispersantes, de suspensão, espessantes ou corantes. Os pós podem ser formados com o auxílio de qualquer base de pó adequada. As gotas e as soluções podem ser formuladas com uma base aquosa ou não-aquosa compreendendo também um ou mais agentes dispersantes, solubilizantes ou de suspensão. Os sprays de aerossol são convenientemente distribuídos a partir de embalagens pressurizadas, com a utilização de um propulsor adequado.

Alternativamente, as composições podem ser proporcionadas numa forma adaptada para administração oral ou parentérica. As formas farmacêuticas alternativas incluem assim comprimidos simples ou revestidos, cápsulas, suspensões e soluções contendo o componente ativo opcionalmente em conjunto com um ou mais veículos e/ou diluentes convencionais inertes, por exemplo, com amido de milho, lactose, sacarose, celulose microcristalina, estearato de magnésio, polivinilpirrolidona, ácido citrico, ácido tartárico, água, água/etanol, água/glicerol, água/sorbitol, água/polietilenoglicol, propilenoglicol, álcool estearilico, carboximetilcellulose ou substâncias gordas, tais como gordura dura ou suas misturas adequadas. A concentração do ingrediente ativo nas composições da invenção, depende da natureza do composto usado (isto é, polipéptido, molécula de ácido nucleico ou anticorpo), do modo de administração, do curso do tratamento, da idade e peso do doente, da indicação médica, do corpo ou área corporal ser tratada e pode ser variada ou ajustada de acordo com a escolha. Geralmente, contudo, as gamas de concentração para o composto aqui descrito são 0,0001, 0,0005, 0,001 ou 0,01 a 25%, por exemplo, 0,0005-15%, por exemplo, 0,01 a 10%, tal como 0,1 a 5, por exemplo, 1-5% (p/p da preparação final para administração, particularmente para administração tópica). As referidas concentrações são determinadas com referência à quantidade do próprio composto e assim devem ser feitas concessões adequadas para tomar em consideração a pureza da composição. As doses simples eficazes podem estar situadas na gama de 0,1-100 mg/dia, preferencialmente 2-10 mg/dia, dependendo do animal que está a ser tratado, considerada como uma dose única. A administração pode ser por qualquer método adequado conhecido nas técnicas medicinais, incluindo por exemplo administração oral, parentérica (por exemplo, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa), percutânea, bucal, retal ou tópica, ou administração por inalação. As formas de administração preferidas serão administradas oralmente, ou muito preferencialmente topicamente. Como será entendido, a administração oral tem as suas limitações se o ingrediente ativo for digerível. Para ultrapassar tais problemas, os ingredientes podem ser estabilizados como mencionado previamente.

Será entendido que, uma vez que o ingrediente ativo para desempenho da invenção toma uma variedade de formas, por exemplo, molécula de ácido nucleico (que pode estar num vetor) ou polipéptido, a forma da composição e a via de distribuição irá variar. Preferencialmente, contudo serão utilizadas soluções líquidas, cremes ou suspensões, particularmente, por exemplo, para distribuição oral ou administração tópica. 0 polipéptido ou as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser usadas para as indicações médicas acima mencionadas. No último caso dos métodos de terapia génica, as moléculas de ácido nucleico são proporcionadas preferencialmente em vetores que são adequados para transfecção/transformação como descrito acima, por exemplo, vetores virais, tal como adenovirus, usando métodos de terapia génica conhecidos na técnica para aplicações médicas.

Animais aos quais as composições podem ser aplicadas ou administradas incluem mamíferos, répteis, aves, insetos e peixes (por exemplo, salmão ou bacalhau). Preferencialmente, os animais aos quais as composições da invenção são aplicadas são mamíferos, particularmente primatas, animais domésticos, gado e animais de laboratório. Assim, os animais preferidos incluem murganhos, ratos, coelhos, cobaios, gatos, cães, macacos, porcos, vacas, cabras, ovelhas e cavalos. De um modo especialmente preferido, as composições são aplicadas ou administradas a humanos.

Os seguintes Exemplos são dados apenas a título ilustrativo em que as Figuras referidas são como se seguem: A Figura 1 mostra (A) filtração em gel de zonase de salmão parcialmente purificada para produzir leucolectina. Um coluna Superdex 16/60 (GE Healthcare) foi ligada a um sistema de FPLC e usada com um fluxo de tampão de 1 mL/min durante 120 mL. A eluição das proteínas a partir da coluna foi monitorizada por UV 280 nm (eixo dos y da direita) e recolhida em frações de 1 mL. A atividade da zonase foi medida por clivagem de Cromozima X a OD406. O peso molecular nativo da zonase abrange uma vasta gama com um pico de cerca de 50 kDa. PM Lectina = 30 kDa, e (B) identificação de (leuco-)lectina de salmão por imunotransferência. As análises proteicas de imunotransferência de frações selecionadas obtidas da filtração em gel acima usando um anticorpo anti-leuko-) lectina a base de epitopo (ver Fig. 3). Os números de fração são mostrados acima das imunotransferências. Os marcadores de peso molecular (kDa) são indicados à esquerda. 0 peso molecular estimado da lectina corresponde àquele obtido por outros métodos (ver Fig.3) . A Figura 2 mostra a identificação de células produtoras de lectina (lectócitos) em embriões de salmão do Atlântico, em que os painéis A, B & C representam seções transversais através do corpo dos embriões de salmão do Atlântico que tinham sido fixados em formalina e incluídos em parafina. A presença de leucolectina foi determinada por meio de um anticorpo policlonal de coelho anti-LL usando o método (A) de coloração com imunoperoxidase ou imunofluorescência indireta (B e C) . As células que reagem ao anticorpo de antilectina podem ser observadas como escuras (A) , ou claras (B e C) relativamente ao fundo, respetivamente. São observadas numerosas células individuais imunorreativas com características citológicas especificas na epiderme sem restrições espaciais ao longo do eixo anterior-posterior embrionário. As setas em A&B apontam para células relativamente grandes (lectócitos), facilmente distinguíveis das células epidérmicas circundantes. Os seus núcleos são basais, enquanto o citoplasma é cheio com leucolectina de modo que as células formam protuberâncias como cogumelos no espaço perivitelino. 0 painel 2C apresenta os seus conteúdos granulados. A Figura 3 mostra o alinhamento de leucolectinas de humano, salmão, galinha, bacalhau e duas traduções de dois contigs que compõem a Família UniGene Ssa.23163, uma coleção EST de salmão. Dos dois contigs, o contig 1 é aquele que se assemelha mais à estrutura primária das leucolectinas. Contudo, a diferença entre os dois contigs não é grande, apenas cerca de 80%. A Figura 4 mostra (A) domínios SMART de sequências semelhantes à leucolectina humana. São apresentadas as sequências de mais alta pontuação de uma pesquisa BLASTP usando WU-BLAST 2. As sequências são listadas das mais para as menos semelhantes. a leucolectina humana, b - leucolectina embrionária de salmão, c - leucolectina leucocítica de salmão (fragmento), d - leucolectina de galinha (fragmento), e - leucolectina de bacalhau (fragmento), f - lectina de ovas de carpa comum (Ac#-P68512), g - ranaspumina-6 de rã tungara (Ac#: B5DCK6), h - Zgc de peixe-zebra: proteína 173443 (Ac#: A8E4Z1). Note-se que as sequências de leucolectinas de salmão leucocítico, galinha leucocítica e bacalhau leucocítico são apenas parciais, e não sequências de tamanho total. A versão de tamanho total destas sequências assemelhar-se-á provavelmente à estrutura global encontrada em leucolectina de leucócitos humanos (a) e de embriões de salmão (b) . Além disso, o padrão da leucolectina, com 5 domínios TECPR consecutivos, ainda se mantém na sequência da rã tungara, mas não para a sequência de peixe-zebra onde são apenas encontrados 4 domínios TECPR, e (B) uma representação gráfica da leucolectina com 5 domínios TECPR. Os domínios TECPR são compostos muito provavelmente de 4 cadeias beta que geram 2 folhas beta. Existem TRÊS ligações persulfureto: uma é interna em TECPR #4, as outras duas estão em ansas de ligação, como indicado. Em geral, os locais de reconhecimento de açúcar são encontrados em tais lectinas nas áreas entre os domínios TECPR. A lectina mais estreitamente relacionada com a leucolectina tem uma especificidade de açúcar conhecida principalmente para a N-Acetilglucosamina. A putativa especificidade de reconhecimento de açúcar para a leucolectina permanece por estabelecer. A Figura 5 mostra a presença de lectina perivitelina em leucócitos. Uma tira de IPG que abrange a gama de pH de 4-7 foi usada na primeira dimensão, enquanto um gel de poliacrilamida de 12,5% foi utilizado durante a eletroforese de segunda dimensão. A: Em leucócitos de salmão, verificou-se que apenas duas manchas reagiram positivamente ao anticorpo policlonal de anti-lectina. 0 seu peso molecular era em torno de 26 kDa, com um pi em torno de 6,5. A leucolectina pode também ser identificada em preparações de leucócitos noutras espécies. B: Numa preparação de salmão, nós encontramos um número de manchas imunorreativas (numeradas 1-8), com um peso molecular em torno de 30 kDa, que abarcava uma gama de pH de pi de 4,9 a 6,5. A Figura 6 mostra a co-expressão de leucolectina na linhagem mieloide, especificamente na linhagem de monócito-macrófago em peixe-zebra. (A) perfil de expressão do gene de lectina e L-plastina. Verificou-se que o peixe-zebra expressa a mesma lectina que nós encontrámos em salmão. Uma sonda de ARNm de lectina marcada com fluoresceina foi usada juntamente com uma sonda marcada com DIG para a sonda de ARNmd L-plastina, que é um marcador especifico da linhagem de monócitos-macrófagos. A hibridação in situ duplamente marcada revela co-expressão de ARNm de lectina e L-plastina nas mesmas células durante a embriogénese de peixe-zebra. Idade dos embriões em horas pós-fecundação (pf) nos cantos inferiores esquerdos. Sinais mais claros indicam a expressão do gene da L-plastina; os sinais mais escuros indicam expressão de lectina. 0 painel A (vista lateral) mostra a co-expressão de ARNm de lectina e L-plastina nas mesmas células, que formam uma população axial e paraxial dispersa na gema anterior e lateral. Uma ampliação mais elevada (A2) revela uma morfologia de leucócito típica destas células. Os dados em Al demonstram a expressão destes dois genes em bandas bilaterais de células na mesoderma da placa lateral anterior (setas). 0 painel B revela os mesmos resultados em 21h. 0 painel C (24h pf) demonstra a co-expressão dos genes de L-plastina e lectina na massa celular intermédia posterior (duas setas superiores), na região da veia ventral (seta inferior), em número significativo de células dispersadas ao longo do corpo e cabeça embrionários. Às 24 h pf (C2) uma maioria de células co-expressam estes dois genes (ver setas), mas muitas células parecem expressar apenas um ou o outro gene. As setas em C3 indicam células que expressam apenas ARNm de L-plastina, e (B) co-localização celular da proteína lectina e ARNm de L-plastina. Os embriões de peixe-zebra (22 h pf) foram analisados por imuno-histoquimia combinada com ensaio de hibridação in situ para a proteína lectina (sinal mais escuro) e ARNm de L-plastina (sinal mais claro) . A hibridação in situ usou ARNc marcado com DIG específico para o gene da L-plastina, combinada com imuno-histoquímica com anticorpo policlonal de coelho anti-lectina.

Painel A: vista frontal do embrião. As setas apontam para um aglomerado de células marcadas por expressão comum da proteína lectina e ARNm de L-plastina. Al: ampliação mais elevada do aglomerado que demonstra a co-expressão do gene da L-plastina e da proteína lectina na mesma célula (setas pretas). Observam-se algumas células, pequenas em tamanho com forma arredondada que se assemelham a linfócitos maduros ao lado de uma outra célula com um núcleo segmentado, uma característica morfológica típica de leucócitos neutrófilos maduros. Os painéis B, C, D, E ilustram populações célulars dispersas ao longo do embrião de peixe-zebra que co-expressam a proteína lectina e o ARNm de L-plastina (seta). A Figura 7 mostra a família da leucolectina. Proteínas de leucolectina disponíveis de humano, salmão, galinha e bacalhau foram montadas (alinhamento weblogo). A correspondência total de resíduos de AA numa posição é representada por letras grandes, com o tamanho decrescente a indicar pouco grau de correspondência. Múltiplas letras indicam variações. A Figura 8 mostra frações coradas com coomassie após purificação da leucolectina recombinante por cromatografia em coluna. As pistas são 1 - sobrenadante, 2 - fração de passagem, 3 - lavagem, 4 - Fl, 5 - F2, 6 -mistura de F3, F4 e F5, 7 - F6 e 8 - padrões. A Figura 9 mostra (A) experiências para identificar e estabelecer uma sequência génica para leucolectina de salmão. 0 painel A ilustra duas manchas positivas duplicadas identificadas no filtro n° 6, painéis #5 e 2, que correspondem aos números de placa 257 e 176, e coordenadas dos poços do clone L-7 e F-7, respetivamente. 0 painel B demonstra uma mancha positiva duplicada identificado no filtro n° 3, painel #6, que corresponde ao número exato de placa 144 (com base na folha localizadora de placas), e nas coordenadas dos poços do clone A-12, e (B) mostra a sequência genómica deduzida do gene da leucolectina (2323 pb) . 0 local dos 5 exões é indicado, e consequentemente, também dos intrões. A localização do inicio de transcrição para este gene (previsão de promotor, com base na Previsão de Promotor de Rede Neuronal BDGP, "P", inicio de transcrição previsto "ST", caixa TATA "T") e as sequências que especificam a poliAdenilação ("PA") no produto génico são indicadas. A Figura 10 mostra (A) um mapa que apresenta os cromossomas humanos, as posições dos BLASTP-hits (ver Tabela) são indicadas por setas, (B) mapa de cobertura da legenda: Uma visualização da posição dos BLASTP-hits (barras) e a cobertura total da sequência investigada (Leucolectina humana). Aparentemente a soma das sequências encontradas cobre a sequência inteira de leucolectina, mas os dados claramente não implicam que este seja o gene da leucolectina, C) Tabela que apresenta os BLASTP-hits e a sua posição no genoma humano usando leucolectina humana como a sequência investigada. A Figura 11 mostra os efeitos da leucolectina de salmão no epitélio humano. Cultura de controlo = A; Cultura exposta a leucolectina = B. As setas apontam para células grandes que aparecem na camada basal apenas após exposição à leucolectina. A Figura 12 mostra a expressão proteica de leucolectina em leucócitos. O painel A mostra 2D PAGE a 12% da proteína purificada, ~2yg, de leucócitos de salmão. O painel B mostra 2D PAGE a 15% da proteína purificada, 0,8 yg, de leucócitos humanos Lymphoprep™. As membranas foram tratadas com anticorpos primários policlonais para LL de salmão, antes de serem tratadas com anticorpo de cabra anti-coelho, e visualizadas pelo sistema de deteção ECL-aumentado. A Figura 13 mostra os transcritos de leucolectina de salmão identificados em transferências de Northern. 0 painel A mostra o ARN total de embriões de salmão do Atlântico (370 dd) fracionados em agarose a 1,2% na presença de formaldeido, e sondado com ribo-sonda marcado com DIG antissentido especifico para LL (720 pb). O painel B mostra a análise de transferência de Northern de ARNm (purificado por esferas magnéticas poliT). A hibridação usou ribo-sondas marcadas com DIG geradas a partir da sequência codificante parcial de LL. O painel C mostra a membrana de nitrocelulose (B) sondada com ribo-sonda marcada com DIG de sentido. As setas cinzentas significam transcrito presente; a seta preta aponta para a sua ausência. Foi usado o marcador DIG-ARN I, 0,3-6,9kb (Roche). A Figura 14 mostra um alinhamento Clustal W de LL com proteínas β-hélice relacionadas. A Figura 15 mostra um modelo 3-D de LL. O painel esquerdo mostra duas vistas de uma representação 3D de um modelo 3D de β-hélice de 5 lâminas da leucolectina com base na estrutura da Taquilectina 1 de Tachypleus tridentatus (Biesel et al., 1999, a EMBO J. 18, pp 2313-2322) . O modelo é gerado usando software PyMol v0.99. Os resíduos dos péptidos do epitopo são desenhados em linhas pretas finas no corpo da proteína. Além disso, as posições dos 5 locais de ligação de hidrato de carbono previstas por Biesel et al. (1999) são indicadas como estruturas de hexose esbatidas mas castanhas sólidas. 0 painel direito mostra representações dos domínios previstos de hélice em LL (topo) e em FEL (fundo), comparativamente ao domínio de hélice de consenso. A Figura 16 mostra a amplificação da sequência de ADNc de tamanho total da leucolectina (LL) de peixe-zebra. 0 painel A mostra fragmentos amplificados que foram obtidos usando diversos pares de iniciadores, e clonados por RT-PCR. 0 ARNm usado para a transcrição reversa foi extraído de embriões a 24h pf. Marcador de ADN: escada de 100 pb (New England Biolabs) . O painel B mostra que a 5'RACE PCR resultou em amplificação de dois produtos distintos, respetivamente ~500 pb e -400 pb (gerado após uma segunda ronda de amplificação por PCR usando um iniciador reverso específico do gene e o iniciador interno para a frente GeneRacer) . Os ARNm foram recolhidos das fases de desenvolvimento indicadas. O painel C mostra que a sequência de ADNc de LL de tamanho total de peixe-zebra tem 1240 nt incluindo uma grelha de leitura aberta (ORF) de 765 nt. A ORF compreende cinco exões que são desenhados à escala e mostrados como caixas negras. A região 5'UTR é apresentada como linha contínua. É mostrada a sequência de nucleótidos de 5'UTR. São realçados os locais de início de tradução ATG na posição +1 e potencial segundo início ATG na posição +94. O painel D mostra a expressão de LL truncada em várias fases de desenvolvimento. O painel E mostra que as sequências de salmão e peixe-zebra estão altamente conservadas mesmo na 3'UTR. A Figura 17 proporciona um sumário dos exões, domínios e variabilidade de sequência das leucolectinas de salmão. Os dados de sequência para diferentes leucolectinas são mostrados com relação às posições de resíduos de AA, resíduos de cisteína (C) e domínios TECPR (da base de dados SMART) variáveis. As sequências de leucolectina diferem em apenas sete posições, marcadas em caixas. Cinco desses resíduos variáveis ocorrem dentro dos domínios TECPR, enquanto dois forem encontrados perto da extremidade C-terminal. As variações incompatíveis com a leucolectina-1 ou a leucolectina-2 são apresentadas abaixo como leucolectina-3, onde apenas duas posições são aqui definidas (#2 e #245) . Embora as outras posições não estejam marcadas, os dados indicam que a maioria destas posições são quase idênticas às outras leucolectinas.

Como é o caso com o lectina de ovas (FEL) , as 3 pontes persulfureto em LL são previstas ligar, respetivamente, a primeira e a última cisteína, enquanto a segunda e a penúltima cisteína formam uma segunda ponte, e as duas cisteínas (médias) dentro do exão 3 formam a última ponte persulfureto. Estas cisteínas estão marcadas a cinzento e sublinhadas. A cisteína no propéptido não envolvida em pontes persulfureto está no exão 1. Note-se a falta de ansas de ligação entre os primeiros três domínios, e a falta de variação em duas ansas que ligam os dois últimos domínios TECPR. Três domínios TECPR são codificados por um único exão (2 e 3), enquanto dois domínios abragem dois exões. A forte correlação das extremidades dos exões e domínios é assinalável. Em quatro dos cinco domínios, um resíduo de Trp ocupa o terceiro AA do domínio, enquanto no primeiro domínio TECPR previsto, W é o resíduo inicial. Por último, os asteriscos marcam resíduos em que AA variantes foram encontrados em cada uma ou em ambas a leucolectina-1 ou a leucolectina-2. A Figura 18 mostra a proteína LL no fluido de eclosão dos embriões da truta-arco-íris (Oncorhyncus mykiss) , detetada em transferências de Western. Os padrões de PM são mostrados à esquerda (BioRad 161-0373). As proteínas do fluido de eclosão da truta-arco-íris (pista 1) e da proteína leucolectina de salmão preparada por cromatografia de afinidade (pista 2) sondada com anticorpo antileucolectina. Uma proteína de ~26kDa é encontrada em ambos os casos, correspondendo ao PM da LL. A Figura 19 A, painel esquerdo, mostra a leucolectina de bacalhau entre proteínas encontradas no fluido de eclosão de bacalhau. O fluido de eclosão de bacalhau foi analisado por SDS PAGE a 15%, e as suas proteínas constitutivas visualizadas por coloração de prata. Pista 1: marcador de proteína (Dual color da BioRad 161-0374). Pista 2: proteínas de fluido de eclosão. O painel direito mostra o fluido de eclosão de bacalhau, separado por análise de SDS PAGE a 15%, transferido numa membrana de nitrocelulose, e sondado com diluições adequadas de anticorpo policlonal IgG de coelho anti- leucolectina, purificado por afinidade. Pista 1: Marcador de proteína (Dual color da BioRad 161-0374). Pista 2: alíquota de fluido de eclosão. A localização da leucolectina foi identificada usando anticorpo secundário de cabra anti-coelho marcado com peroxidase de rábano (HRP), intensificada pelo sistema de deteção ECL. Foi detetada uma proteína imunorreativa principal em torno de 2 6kDa. B, mostra a SDS PAGE e a membrana equivalente para proteínas de fluido de eclosão de Oikopleura dioica.

Exemplo 1: Identificação e caracterização da leucolectina

Isolamento da proteína

Durante o curso da análise dos componentes do fluido de eclosão de salmão, foi identificada uma nova proteína presente em embriões.

Um método para preparar zonase parcialmente purificada que pode ser usada como o material inicial para isolamento do polipéptido da invenção é proporcionado em W099/29836 (particularmente o Exemplo 1 do método descrito, mas opcionalmente sem o passo de ureia). A zonase e a leucolectina foram purificadas a partir de fluido de eclosão de salmão. Para melhorar a concentração de proteína do fuido de eclosão, os ovos de salmão foram transferidos para volumes mínimos de áqua antes da eclosão. A eclosão altamente sincronizada pode ser induzida por temperaturas (ambiente) elevadas, ou por desoxigenação (Oppen-Berntsen et al. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417-430), que produz um pequeno volume de preparação altamente concentrada de zonase em bruto e proteínas associadas. A purificação inicial da zonase envolveu filtração de ovos de salmão eclodidos através de gaze. Este filtrado pode ser congelado durante anos sem degradação significativa da zonase, antes de ser descongelado e utilizado para uma purificação proteica adicional. Este facto simplifica extremamente a produção de um material inicial para purificar a zonase de salmão e proteínas associadas, incluindo a leucolectina. O passo seguinte, opcional, envolveu ajustar o filtrado de proteína para 4M de ureia, para dissociar os fragmentos da casca de ovo de salmão, que permitiu a sua remoção juntamente com restos estranhos por centrifugação de baixa velocidade (15.000g; 2 x 15 minutos). Este material não mostrou qualquer sinal de obstrução das colunas, que é característica de materiais em bruto preparados diferentemente do que é descrito acima. Esta preparação de proteína bruta foi adequada para purificação por técnicas cromatográficas convencionais e a zonase pode ser ainda purificada como descrito no Exemplo 7. A leucolectina de fuido de eclosão pode ser isolada juntamente com zonase. A partir de preparações parcialmente purificadas de zonase (como descrito acima), a leucolectina pode ser isolada por cromatografia de exclusão uma vez que a zonase na sua forma nativa é substancialmente maior do que a leucolectina. Para uma primeira separação, são suficientes colunas Superdex 16/60 com as condições descritas na legenda da Figura 1, após o que a zonase pode ser removida por cromatografia de afinidade em colunas de benzamidina-Sepharose.

Para preparações em grande escala, a utilização de ultrafiltração é também adequada porque a zonase na sua forma nativa não penetra significativamente ultrafiltros com exclusão de tamanho de 100 kDa, ao contrário da leucolectina.

Os tampões usados são Tris milimolar (por exemplo, 10 mM) a pH em torno da neutralidade ou levemente alcalino (pH 7,5 - 8,5), contendo 5 mM de NaCl.

Está também prevista a extração em grande escala de leucócitos humanos a partir de produtos que estão fora do prazo em bancos de sangue, por meio de extração em solventes orgânicos (por exemplo, 80% de acetona) porque a leucolectina permanece em solução durante este procedimento que precipita a maioria das outras proteínas. A purificação final por métodos cromatográficos e de filtração é como acima.

Verificou-se também que a proteína isolada é expressa em gâmetas e no zigoto e, além disso, também no embrião inicial (durante a ontogenia do sistema hematopoiético) e, por último, em leucócitos.

Verificu-se que a proteína previamente não identificada co-purifica com a zonase. 0 tamanho desta nova proteína, calculado por cromatografia sob condições nativas, era quase 30 kDa. (Fig. 1).

Expressão de proteína A proteína isolada foi usada para gerar um anticorpo policlonal. As células foram analisadas para a presença da proteína por meio de anticorpo policlonal de coelho anti-LL usando um método de coloração com imunoperoxidase ou imunofluorescência indireta. Os resultados são mostrados na Figura 2.

Por uso do anticorpo, nós verificámos que a nova proteína originou num tipo de célula diferente das células que produzem as coriolisinas (enzimas de eclosão). A morfologia destas células individuais (denominadas lectócitos) é mostrada na Figura e é claramente distinta de células da glândula de eclosão (individuais) que expressam coriolisinas.

Análise de sequência A nova proteína foi sujeita a caracterização convencional tal como determinação dos seus péptidos trípticos, seguida por sequenciação de Edman direta parcial. Do puzzle de péptidos, as construções por tentativa e erro de iniciadores degenerados para detetar um ARNm em embriões de peixe para produzir um ADNc, foram primeiro mal sucedidas até o iniciador reverso ter sido estabelecido simplesmente para emparelhar com uma cauda poliA. Deste modo, e com a utilização de múltiplos conjuntos de novos iniciadores à medida que foram identificados, nós fomos capazes de encontrar pelo menos dois ADNc de aproximadamente 1200 nt. Estes provaram ser muito semelhantes em sequência, com apenas um punhado de resíduos de AA variantes. Para ambos faltava alguma da sequência N-terminal.

Usando metodologia N-RACE nós estabelecemos subsequentemente que as sequências acima pertenciam a uma proteína de 2 55 aminoácidos, com um propéptido de 19 AA e com um resíduo de triptofano N-terminal invulgar na proteína processada. Este último resultado explica as grandes dificuldades na obtenção de uma sequência N-terminal por análise direta. Contudo, isto foi eventualmente conseguido para confirmar os virtuais resíduos N-terminais.

Usando a sequência N-terminal da proteína para procurar bases de dados EST, nós identificámos uma sequência de proteína que representa claramente a nova proteína (Fig. 3).

Pesquisando as bases de dados para proteínas com semelhança com a nova proteína, foi identificado apenas um candidato um pouco semelhante (Leren, não publicado). Esta é uma lectina de ovas isolada de carpa (Galliano et al., 2003, Biochem., J., 376, p433-440), com uma semelhança global no máximo de 48% encontrada por um alinhamento manual de sequências. A análise bioinformática sugeriu que a nova proteína era uma lectina relacionada com as tectoninas (Leren, não publicado) . Ao compilar uma lista de todas as proteínas com estrutura de domínio TECPR semelhante, a nossa nova lectina parece representar um novo tipo de lectina (Figs. 4A & B) . A sequência de AA virtual da nova lectina continha cinco domínios TECPR que mostraram alguma semelhança com taquilolectinas em invertebrados inferiores. (Shigenaga et al., 1993, J. Biochem (Tóquio), 114, p307-316) . A forma de propéptido da nova lectina contém um péptido de 19 AA que sugeriu o seu direcionamento aos lisossomas e para posterior potencial secreção (isto é, no espaço perivitelino). A sequência de AA virtual da nova lectina permitiu o desenvolvimento de anticorpos específicos de epitopo que, por sua vez, nos permitiu identificar muitas (2 - 8) isoformas semelhantes da proteína (Fig. 5), dependendo do tecido analisado.

Uma possibilidade é que a lectina encontrada nas células da glândula de eclosão (Fig. 6B) é excretada no espaço perivitelino juntamente com as coriolisinas, e que estas possuem modificações pós-tradução que aumentam o seu tamanho aparente e que baixam o seu pi aparente.

Como o salmão é um peixe tetraploide, e uma vez que os nossos dados indicam mais do que um gene para a leucolectina em salmão, o conjunto de 8 unidades de leucolectina em preparações parcialmente purificadas de zonase pode ser causado por três modificações crescentes de duas proteínas ligeiramente diferentes de leucolectina, para um total de 4 x 2, ou 8 leucolectinas diferentes. As causas da variação precisam de ser verificadas empiricamente. 0 PM estimado da lectina é em torno de 25-30 kDa. O pi estimado para a lectina correspondente de salmão é cerca de pH= 6,5. Os pi observados (Riste, não publicado) foram desde pH 6,5 a 4,9 em lectinas de perivitelino de salmão, e desde pH 6,4 a 6,6 em lectinas leucocíticas de salmão (a lectina foi identificada por técnicas de transferência de Western).

Expressão durante o desenvolvimento embrionário

Usando sondas nucleotídicas para localizar a expressão da nova proteína durante o desenvolvimento embrionário de peixes, nós encontrámos a proteína presente em tipos específicos de células epidérmicas de embriões de peixe. Adicionalmente, nós encontramos a expressão da proteína em ambos os gâmetas, assim como no zigoto. Além disso, foi mostrado que a proteína está ausente na maioria das células dos organismos, mas expressa em algumas células embrionárias, o que sugeriu que a proteína poderia estar associada à mielopoiese (Figs. 5 e 6). Tal perfil de expressão é único. Assim, nós escolhemos o nome "leucolectina" (abreviado LL) para a proteína.

Expressão em diferentes espécies

Um levantamento de sangue de peixe até galinha até humanos revelou que as leucolectinas estão presentes em leucócitos ao longo desta linhagem de vertebrados. A sua presença podia também ser detetada em invertebrados completos usando o nosso anticorpo policlonal. Ter encontrado leucolectinas em leucócitos (humanos) sugeriu imediatamente possíveis funções para as leucolectinas. A leucolectina ocorre em células que realizam funções imunes.

Muito surpreendente foi a extrema invariância da sequência de leucolectinas durante a evolução (Fig. 7). Usando tecnologia convencional de pares de iniciadores, nós podemos detetar ADNc ao longo da linhagem de vertebrados. A análise revelou uma sequência extremamente conservada desde peixe até galinha até humanos, que apontaria para funções essenciais para tais genes. A variância entre a sequência de peixe e humana é em torno de 4% (10 AAs variantes) , ou 96% de semelhança, em que metade das variâncias observadas era substituições conservadoras de AA. Por comparação, a proteína conhecida razoavelmente semelhante é uma lectina de ovas (FEL) da carpa comum (menos de 48% de semelhança). O sumário da estrutura LL variante (Fig. 7) define a nova família LL de proteínas. Nós vemos cerca de 2% de mudanças não-conservadoras em AA de peixe para humanos. Claramente, os genes LL codificam para proteínas que são sujeitas a seleção evolucionária extrema a fim de manter a invariabilidade de sequência. Isto, por sua vez, aponta para importantes, mas até agora desconhecidas, funções que previne a maioria da variação aleatória nos produtos génicos de surgir e manter durante a evolução das espécies.

Preparação de leucolectina recombinante O ADNc de leucolectina de salmão foi clonado a partir de embriões. Os iniciadores de PCR foram concebidos para conter o local de restrição Ncol (para a frente) e ACC65 I (reverso). O vetor pETM-60 foi digerido com NcoI/ACC65l e os produtos de PCR digeridos foram ligados por ligação durante a noite. Após amplificação e sequenciação do plasmídeo, vetores de expressão pETM-60 contêndo a inserção de leucolectina de sequência verificada foram transformados em células competentes BL21 (DE3)p Lys e as colónias foram usadas para inocular 5 mL de LB (= Caldo de Luria) para preparar stocks bacterianos em glicerol.

Cultura bacteriana e purificação de proteína: 0 novo vetor bacteriano ρΕΤΜβΟ-Leucolectina permitiu a expressão de proteínas recombinantes marcadas com His fundidas ao C-terminal de NusA através de uma sequência de reconhecimento de protease TEV. Foram eficientemente purificadas por afinidade de metal e recuperadas na forma solúvel após remoção do parceiro de fusão.

Materiais e métodos:

Iniciadores superiores e inferiores de PCR: NWAlódPET(#23): Ncol

5'-GCA. CCA.TGG. CCA.TGG.GCT.GGG.ACT .GTC.AGG.AGG. TAG.TA CH.AlódPET(#13): ACC65I

5'-CCG.AAG.CTT.GGT.ACC .ATG.TGT. GCA.CAC. CAT.GGT.GAC

Mistura de PCR:

dNTP 4 yL

Iniciador#23/#13 0,5 yL (10 yM)

ADNc 2 yL

Tampão de ADN polimerase 10 yL

ADN polimerase 0,5 yL

dH20 para 50 yL

Reação de PCR: 98 °C 10 seg. 55 °C 15 seg. 72 °C 1 min. 30 ciclos 70 °C 10 min. O produto do PCR e o plasmideo pETM-60 foram digeridos com as enzimas da restrição Ncol e ACC65I; e purificados do gel de agarose a 1% para ligação.

Ligação da inserção de ADN ao vetor pela T4 ADN ligase: A T4 ligase foi usada para unir os grupos 5' fosfato e 3'-hidroxilo de moléculas de ADN de cadeia dupla usando a seguinte mistura:

200 ng de vetor de ADN 500 ng de inserção de ADN tampão de ligase 10X 1 yL de T4 ligase Volume até 10 yL A incubação foi à temperatura ambiente durante a noite, e a inativação térmica da ligase foi conseguida colocando o tubo num banho de água a 65°C durante 10 minutos. A mistura da ligação foi sujeita a eletroporação em células competentes DH5a e as colónias foram usadas para inocular 5 mL de LB. 10 Clones foram escolhidos aleatoriamente para análise. A análise foi feita por digestão de pETM60-Leucolectina com NcoI/ACC65l. A sequência da inserção de leucolectina foi verificada por sequenciação de ρΕΤΜβΟ-Leucolectina com os iniciadores #13 e #23.

Tradução in vitro da leucolectina BL21(DE3)pLysS contém um plasmideo (pLysS com resistência ao cloranfenicol) que codifica a lisozima T7 para reduzir os niveis de fundo da T7 polimerase antes da indução. BL21(DE3)pLysS proporciona um controlo mais apertado da expressão proteica de proteínas tóxicas e é uma estirpe para a expressão proteica de elevado nível e de indução fácil. 0 marcador de fusão usado na expressão e purificação de proteína recombinante foi NusA que tem 495aa de tamanho (54,81kDa) e está localizado no N-terminal e é usado para aumentar a solução de proteínas que são sobreexpressas. A NusA-Leucolectina foi purificada eficientemente por afinidade de metal e recuperada na forma solúvel após remoção do parceiro de fusão.

Materiais para a expressão e purificação de NusA-Leucolectina :

Placa de canamicina Meio 2YTG 0,4 mM de IPTG (concentração final de 0,4 μΜ).

Coluna HisTrap HP (5 mL) A indução foi realizada durante 3 horas a 26°C.

Protocolo de purificação A atividade enzimática inerente do sobrenadante de NusA-Leucolectina antes da purificação: 0,0060/min

Equilíbrio da coluna com 25 mL de tampão B (lxPBS, 30 mM de imidazole, 0,4 M de NaCl)

Aplicação da amostra: 28 mL do sobrenadante foram filtrados e desgaseificados e 25 mL do mesmo foram aplicados à coluna. A coluna foi lavada com 75 mL de tampão B. A eluição foi com 25 mL de tampão C (lxPBS, 0,5 M de imidazole, 0,4 M de NaCl), com uma eluição de um passo. Foram recolhidas amostras de 1 mL.

Resultados:

Mais de 98% da atividade de protease das proteínas recombinantes em bruto foi encontrada na fração de passagem e na lavagem. Apenas 1,6% da atividade de protease foi recuperada nas frações da coluna que incluem aquelas (F6 & F7) com leucolectina recombinante, identificada por análise de SDS-PAGE (ver Figura 8). Estas frações continham 0,3% (níveis de fundo da atividade de protease aplicada à coluna).

Conclusão: A leucolectina recombinante é desprovida de atividade de serina protease e é assim uma verdadeira lectina.

Os vestígios de atividade de serina protease encontrados em algumas preparações de leucolectina de fonte natural (fluido de eclosão) devem representar consequentemente vestígios de zonase. A leucolectina e a zonase coexistem no fuido de eclosão e tendem a co-purificar durante a maioria dos procedimentos cromatográficos, mas podem ser separadas por ultrafiltração final usando filtros Biomax de exclusão de tamanho de 100 kDa.

Análise da proteína recombinante A LL de salmão recombinante produzida como acima e purificada por SDS PAGE foi analisada por técnicas de MS/MS. O espectro de Peptide Mass Fingerprint de LL foi analisado em Mascot em bases de dados de proteína da NCBI e EST para Actinopterygii sem se encontrarem quaisquer resultados significativos (Riste, não publicado). Estes espectros comparam-se bem aos espectros de LL obtidos de unidades de LL embrionárias e leucocíticas eluídas a partir de análise de gel 2D de tais LLs, confirmando ainda a existência de isoformas de LL observadas por métodos de gradiente de pH.

Sequência genómica

Em salmão nós estabelecemos a sequência genómica de genes para esta entidade por sondagem de bibliotecas Bac com uma sonda de 670 nt (um protocolo completo é também descrito em detalhe no Exemplo 10). Assim, uma sequência de ADNc tamanho total para a leucolectina estava disponível para utilização de iniciadores degenerados concebidos com base em informação derivada de sequências de AA de proteína parciais. As amplificações de PCR de ADNc de embriões de 370 dd (graus dia) (isto é, embriões perto da eclosão, mas ainda não eclodidos) geraram o fragmento de amplificação de 630 pb, que foi purificado a partir do gel e sequenciado.

Foram usadas sondas específicas para o gene de lectina para rastrear uma biblioteca BAC (cobertura 18x; tamanho médio de inserção, 188 kb), que foi disponibilizada pelo consórcio do Projeto do Genoma de Salmão (SGP) . As sondas (tamanho 630 pb) foram preparadas por incorporação de digoxigenina-ll-dUTP (Roche) usando o método de PCR. O rastreio da biblioteca BAC resultou na identificação de 7 clones positivos caracterizados como A-12/144, L16/143, P6/76, B-5/70, 0-20/85, L-7/257, F-7/176. Respostas positivas são exemplificadas nos painéis A&B.

As respostas específicas dos clones selecionados foram confirmadas por amplificação por PCR usando os mesmos iniciadores que para a sonda de ADN marcada usada para rastreio da biblioteca BAC. O tamanho da inserção dentro da sequência do vetor foi estimado por eletroforese de campo pulsado. Os clones foram sequenciados comercialmente (MWG-Biotech, Alemanha) pelo método de ligação aleatória.

Este trabalho estabeleceu diversos genes estreitamente relacionados para leucolectinas no genoma do salmão (tetraploide) (Figs. 9A e B) . Uma variância nas sequências segmentares parecia sugerir a existência de pelo menos dois genes semelhantes. Estruturalmente, as leucolectinas aparecem como genes normais com 5 exões e 4 intrões, num gene com cerca de 2300 pb do inicio da transcrição ao local de poliadenilação, um tamanho razoavelmente convencional. Não obstante, os nossos dados permitiram-nos determinar que até agora nenhum gene com uma sequência semelhante tenha sido reportado em quaisquer organismos. Usando sondas para exões ou intrões individuais, nós pudemos estabelecer apenas a semelhança rara de um exão com partes de outras duas proteínas reportadas, as quais são ambas totalmente diferentes da entidade molecular que nós descobrimos.

Pesquisas de bases de dados indicam que não pode ser encontrado qualquer gene que corresponda à proteína LL, ao transcrito de ARNm de LL ou ao gene genómico para a leucolectina em cromossomas humanos. Aparentemente, o gene da leucolectina não foi ainda encontrado ou a sua sequência ainda não foi depositada, ou a sequência do gene de LL ainda não foi detetada em humanos. Em pesquisas adicionais, nós usamos elementos estruturais pequenos individuais listados na Tabela 2 abaixo, a fim de localizar tais elementos nas bases de dados. TABELA 2

Os resultados indicam que algumas proteínas conhecidas apresentaram algum grau de semelhança com partes da leucolectina - os números dos cromossomas relevantes são proporcionados. As sequências não localizadas em cromossomas são indicadas como "algum ?". 0 resultado positivo primário foi a transgelina humana, que é uma proteína de músculo liso alfa-22 (SM22-alfa) (WS3-10) . A transgelina é uma proteína de ligação a actina e é um dos marcadores mais precoces de músculo liso diferenciado. A função desta proteína não foi ainda determinada. http://harvester.embl.de/harvester/P378/ P37802.htm

Contudo, o alinhamento de sequências proteicas de trangelina e leucolectina mostrou sequências de consenso mínimas. Caso contrário, foi encontrada alguma pequena semelhança em partes da estrutura de LL no que diz respeito a um recetor de célula T e com uma proteína desconhecida. Importante, este novo gene é expresso especificamente em leucócitos humanos, apesar do facto de que este gene não poder ser (ainda) encontrado em sequências publicadas do genoma humano. (Alguma expressão é também observada em preparações purificadas de trombócitos humanos.) Apenas segmentos muito curtos deste gene podem ser detetados no genoma humano, mas estes segmentos estão amplamente espalhados ao longo de uma multitude de cromossomas humanos (ver Figura 10). O padrão observado de distribuição em cromossomas é desconcertante. Tais sequências curtas não podem ser relacionadas com o gene de LL, se o gene de LL humano não foi até agora ele próprio sequenciado ou localizado num cromossoma específico. A resolução deste mistério não está ainda disponível.

Discussão

Uma nova lectina LL foi identificada em leucócitos humanos que é quase idêntica à LL de peixe e galinha. O gene da LL em salmão tem estrutura convencional, mas não foi ainda encontrada em humanos.

Exemplo 2: Aplicações médicas da leucolectina

Materials e métodos

Os seguintes estudos foram realizados usando a proteína leucolectina de salmão (referida como LL) , preparada como descrito no Exemplo 1. A concentração de LL usada foi cerca de 1-10 microgramas/mL. A protease zonase estava presente com LL numa razão de 1:100 numa emulsão de água e óleo de coco (em que está presente mais de 30% de óleo de coco). A leucolectina é estável na presença de zonase.

Resultados

A. PELE GRETADA PELO FRIO

Muitas pessoas sofrem de gretas sazonais da pele, particularmente nas mãos. A aplicação de leucolectina à pele durante o início da estação fria adiou dramaticamente, ou em muitos casos preveniu, o início de gretas de frio. Este fenómeno foi registado em dúzia de casos. As observações sobre efeitos de LL em gretas de frio estabelecidas são em menor número, mas foi revelado algum fechamento de feridas de frio estabelecidas.

B. PELE DANIFICADA POR QUEIMADURA DO SOL A exposição solar excessiva de pele nua pode causar queimaduras, e resultar em sensações de calor, vermelhidão, comichão e eventual escamação da pele exposta. A aplicação de leucolectina resultou no desvanecimento da vermelhidão em minutos, na cessação da comichão e na não-ocorrência eventual de escamação da pele. Estas observações surpreendentes foram repetidamente observadas em muitos indivíduos.

C. PELE DANIFICADA PELO CALOR

Após lesão direta pelo calor à pele, a aplicação de leucolectina de salmão parece ter prevenido em grande medida as consequências normais de tal dano, e parar a lesão se aplicada algum tempo após a lesão original e apressar a recuperação total.

D. ACNE

Casos sub-clínicos de acne responderam em muitos jovens numa cessação imediata de comichão e vermelhidão. Foi observada, por si só, melhoria da acne num pequeno estudo piloto em cerca de metade dos casos, após aplicação de LL na emulsão de óleo de coco.

E. PSORÍASE TÓPICA

Grandes áreas de pele psoriática responderam à aplicação da leucolectina de salmão com primeiro um recuo quase imediato da vermelhidão, seguido pela sensação drasticamente reduzida de comichão. A congregação excessiva de pele calosa retraiu durante as primeiras semanas, mas ocorreu novamente após cessação da aplicação de LL.

F. FERIDAS DE PELE ABERTA

Foram feitas observações em voluntários humanos. Nós estudámos casos de feridas da pele aberta e com corrimento crónicas que tinham resultado de feridas do calcanhar por compressão após cirurgia de anca partida e que tinham sido atendidas sem sucesso por pessoal de saúde durante meses e até um ano. Foram observados ferimentos de meio até dois cm de diâmetro.

Após aplicação de preparações de LL esterilizadas por filtração às feridas cronicamente abertas nas extremidades inferiores (pernas), nós observámos que o liquido parou de correr das feridas após 2-3 dias, seguido pelo encolhimento rápido da área ferida, de modo que após 2-3 semanas as feridas tinham desaparecido e tinham sido substituídas por pele normal.

Dada a natureza dos doentes com feridas que aparecem primeiro no extremo remoto das extremidades, nós observámos que as primeiras feridas a desaparecer no modo acima eram feridas proximais. Nós interpretámos isto como as feridas mais recentemente estabelecidas. As últimas feridas a desaparecer eram as feridas distais perto do calcanhar, que são as feridas estabelecidas há mais tempo. Eventualmente todas as feridas desapareceram.

G. ESTUDOS IN VITRO

As culturas de epitélio de pele humana diferenciada foram obtidas à SkinEthics (Nice, França) no dia 16 após inoculação sobre substratos de crescimento de plástico com microporos que permitem o acesso dos nutrientes ao tecido epitelial a partir de baixo. Tais culturas apresentam morfologia de pele normal após diferenciação durante o período de cultivo a 37°C. Estas culturas foram mantidas durante mais dois dias in vitro de modo que o estrato córneo superior fosse exposto ao ar, e o estrato basal ao substrato de crescimento. Culturas paralelas foram movidas para atmosfera húmida de 30°C e expostas a um meio de soro fisiológico tamponado com fosfato contendo Mg Ca durante 6 horas, com ou sem presença de 10 yg/mL de leucolectina de salmão. As culturas foram fixadas em formalina e incluídas em parafina de acordo com procedimentos convencionais, e coradas com hematoxilina/eosina. Foi observada rápida indução de células basais grandes na epiderme, com sinais de proliferação celular (Fig. 11). Nós interpretámos tais resultados como sendo causalmente relacionados com os efeitos de cicatrização da leucolectina sobre a pele, em que uma combinação de proliferação celular e de diferenciação celular é suficiente para fechar a ferida e para restabelecer a integridade epitelial da pele.

Discussão: Nós não encontrámos expressão de produtos génicos de LL em culturas celulares de queratinócitos. Além disso, as células dendriticas são as únicas células na pele epitelial relacionadas com os leucócitos do sangue. 0 acesso normal dos leucócitos à pele epitelial é perturbado após algum insulto mecânico ou biológico devido à pobre circulação, que é onde as feridas de compressão ocorrem frequentemente na pele normal. A administração de leucolectina supera esta deficiência e despoleta mecanismos normais de cicatrização na pele.

Exemplo 3: Expressão proteica de leucolectina em leucócito 0 sangue de salmão foi obtido da Industrilab, Univ. de Bergen. 0 sangue total de peixe foi recolhido em tubos heparinizados (Riste, não publicado) e processado de acordo com Miller et al. (1988, Nuclei Acids Research, 16(3) pl215) . As amostras de sangue humano foram obtidas do banco de sangue no hospital da universidade de Haukeland, Noruega. 0 sangue humano total foi recolhido em tubos tamponados com 5 mL de citrato e processado de acordo com

Miller et al. (1988, supra) para preparar leucócitos. Esta preparação foi ainda purificada pelo enriquecimento de Lymphoprep™ (Axis-Shield PoC, Noruega). Lymphoprep™ foi usado de acordo com o seu protocolo para preparar uma fração de leucócitos humanos. Esta fração foi usada para análise de imunotransferência, como descrito em Miftari e Walther (não publicado) . A análise por 2D PAGE seguiu os procedimentos descritos por MacGillivray e Rickwood (1974, European Journal of Biochemistry, 41, pp. 181-190), com ~1 yg de proteína. As proteínas LL destas duas espécies foram visualizadas por 2D PAGE usando imunotransferências para a deteção específica de proteínas LL e das suas isoformas. Os tratamentos com anticorpo primário policlonal para LL de salmão, seguido por anticorpo de cabra anti-coelho, permitem visualizar proteínas LL pelo sistema de deteção ECL-aumentado. A especificidade da imunorreação foi testada em múltiplos géis aplicando 0,5-5 yg de proteína, com resultados semelhantes.

Os leucócitos de salmão apresentam 2 isoformas de LL de PM ~26 kDa, com pi semelhante às formas mais básicas das 8 formas isoelétricas de LL encontradas em PVF de salmão. É difícil estimar os PM exatos por extrapolação dos padrões de PM na segunda dimensão da 2D PAGE. Os leucócitos humanos contêm um principal antigénio LL de peso molecular ~30 kDa, que de outras observações é próximo de 27 kDa. O pi acídico corresponde ao pi médio das isoformas de LL de salmão encontradas em PVF (Riste, supra) (ver Figura 12).

Exemplo 4: Transcritos de leucolectina de salmão identificados em transferências de Northern

Os ovos de salmão foram obtidos de viveiros de reprodutores de salmão em Bolaks (Fusa, Noruega), como mantidos durante múltiplas gerações desde 1975 por seleção fenotipica, e agora parte do stock de salmão propagado pela Salmo Breed A/S, Noruega.

Isolamento de ARN total e ARN poliadenilado 0 ARN total foi isolado de embrião de salmão em fases tardias pré-eclosão (em torno de 370 dd) usando reagente Trizol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade e a quantidade de ARN total em termos de integridade e pureza foram avaliadas num gel de agarose com formaldeido corado com brometo de etidio. O ARN total foi determinado espectrofotometricamente. A fração poliadenilada de ARN (ARNm) foi isolada de 5-10 yg de ARN total usando o kit de purificação de ARNm com esferas Dynal (Invitrogen).

Construção de sondas A sonda de ARNc marcada com digoxigenina (DIG) antissentido foi gerada por transcrição de moldes de ADN plasmidico, digerido com SPl, com T3 ARN polimerase. A sonda de ARNc marcada com DIG de sentido foi gerada por transcrição de molde de ADN plasmidico, digerido com Xhol, com T7 ARN polimerase (de sentido) usando o kit de marcação DIG ARN (SP6/T7) (Roche Diagnostics) de acordo com os protocolos do fabricante. As sondas de ARNc antissentido e de sentido de LL marcadas com digoxigenina (DIG) geradas cobriram ~650 pb.

Análise de transferência de Northern

Alíquotas de 0,5 yg de ARNm puro e 1 yg de ARN total foram sujeitas a eletroforese e foram transferidas para membranas de nitrocelulose carregadas positivamente (Amersham). As membranas foram pré-hibridadas em tampão DIG Easy Hyb (Roche) a 55°C durante 2h, e depois hibridadas a 55 °C durante 16 h, com 1 yg/mL de ribo-sonda de LL. A lavagem foi realizada duas vezes a baixa restringência em 2x SSC com 0,1% de SDS à RT durante 15 minutos cada uma, e duas vezes a alta restringência em 0,lx SSC com 0,1% de SDS a 65°C durante 20 minutos cada uma. As membranas foram incubadas numa solução de bloqueamento contendo tampão de ácido maleico (pH 7,5) e reagente de bloqueamento a 1% (Roche) e subsequentemente na solução de bloqueamento com anticorpo anti-DIG-conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Roche) diluído 1:10.000 à RT durante lh. Após lavagem com tampão de ácido maleico a 100 mM (pH 7,5) contendo 150 mM de NaCl e 0,5% de Tween 20, a membrana foi equilibrada 2 minutos em tampão de deteção (0,1 M de Tris-HCl, 0,1 M de NaCl, pH 9,5 à RT) . Os alvos da sonda híbrida foram visualizados por ensaio quimioluminescente usando CSPD (Roche) como um substrato, e exposição das transferências a filme de raio X (Kodak) durante 5-30 minutos. Foi usado marcador de peso molecular de ARN marcado com DIG (Roche). A ribo-sonda especifica de LL marcada com DIG antissentido foi usada para estimar o tamanho de transcritos de LL maduros. A análise de transferência de Northern de ARN total (Figura 13A) revelou um transcrito principal com o tamanho de ~1250 pb e foi também observado um transcrito de banda mais fraca (~3200 pb) . A banda dominante corresponde a um transcrito do transcrito de LL traduzivel (sem intrão) maduro. A análise de transferência de Northern do ARNm purificado usando a mesma ribo-sonda revelou uma única banda de ~1250 pb (indicando que o ADNc amplificado era próximo a uma sequência codificante de tamanho total (Figura 13B) . Quando as transferências de amostras de ARN total e ARNm foram incubadas com uma ribo-sonda especifica de LL de sentido, foi observada ausência de um sinal de hibridação indicando que a ribo-sonda que foi usada era suficientemente especifica (Figura 13C) . O transcrito pouco significativo (~3200 pb) é maior do que o transcrito LL de tamanho total para salmão. Dadas as condições especificas para a hibridação, esta entidade reflete provavelmente uma entidade contendo informação de sequência de LL. Os sinais positivos de apenas sondas antissentido e não de sondas de sentido, subestima a especificidade dos resultados. O tamanho do transcrito de tamanho total acomoda todos os exões de LL descritos acima.

Exemplo 5: Alinhamento de LL com proteínas β-hélice relacionadas

Análises de bioinformática foram realizadas em sequências de LL de salmão comparativamente a informação depositada em bancos de sequências públicos. A análise Clustal W (Figura 14) indicou que a sequência de aminoácidos deduzida da leucolectina de salmão não partilhou semelhança de sequência significativa com nenhuma proteína reportada no banco de dados. Contudo, BLAST revela semelhanças com proteínas mais distantemente relacionadas, incluindo FEL, uma lectina derivado de ovas de Cyprinus carpio (Genebank Acc. N° P68512) com semelhança qlobal de apenas 48% (valores de E de 2,00 E-50) . Além disso, uma proteína hipotética de peixe-zebra (HPZ; Acc. N° LOC678590) apresentou uma semelhança global de 45% (valores de E de 2,00 E-48) . As comparações de sequência também demonstraram que a leucolectina era 38%, 28% e 26% idêntica a TPL-1 (previamente lectina L6) de caranguejo-ferradura (Acc. N° P82151), tectonina I de Physarum policephalum) (Acc. N° 061063) e Tectonina II (061064). (Por SwissProt, estes números eram 49, -, 35, 32 e 29% de identidade, respetivamente, e valor E para FEL 1 e-51 e para L6, 1 e-40). Os nossos dados sugerem uma semelhança mais alta de LL para vertebrados do que para os correspondentes invertebrados. Não está incluída uma identidade de 30% de LL com a proteína contendo repetição de β-hélice de tectonina humana (KIAA0329_humana).

Alinhamentos múltiplos revelaram que das quatro liqações persulfureto confirmadas bioquimicamente em FEL (Galliano et al., 2003, Biochem. J. 376, pp. 433-440), três parecem estar conservados na leucolectina. A primeira ponte liqa a extremidade N-terminal à extremidade C-terminal de ambas as proteínas. A ponte liqa cisteínas nas posições 3 e 234 em LL (ou 238 em FEL) ) . A sequnda e terceira pontes liqam Cys 102 a Cys 155 em LL (#157 em FEL) , e Cys 132 e Cys 137 em LL e FEL. A quarta liqação persulfureto encontrada na FEL de carpa, envolvendo Cys 208 (212) e Cys 226 (230) não é encontrada em leucolectina.

Exemplo 6: Modelo 3D de LL (Leucolectina) A proteína leucolectina partilha um alto nível de semelhança em termos de arquitetura do domínio TECPR com L6 ou taquilectina 1 (Tachypleus tridentatus), uma lectina bacteriana de ligação a lipopolissacárido de hemócitos de caranguejo-ferradura, e outras proteínas relacionadas com taquilectina de invertebrado. Não obstante, foram observadas diferenças em termos do número de domínios, juntamente com um ligeiro deslocamento dos domínios β-hélice para o C-terminal da proteína. Resumindo a informação das pesquisas de semelhança e das pesquisas SMART, nós inferimos que a estrutura 3-D global da leucolectina apresenta uma estrutura proteica de β-hélice com 5 lâminas. Nesta base, nós invocamos o modelo 3D (Biesel et al., 1999, EMBO J., 18, pp. 2313-2322) para proporcionar um modelo de trabalho de como a proteína leucolectina pode parecer. Este é apenas uma aproximação, na medida em que os números de resíduos de uma proteína são estabelecidos como iguais aos resíduos na outra. Pesquisas na base de dados SMART indicam uma característica estrutural proeminente da proteína leucolectina virtualmente traduzida, que consiste em cinco repetições em tandem, cada uma contendo 35-36 AAs com 32-61% de identidades de sequência interna (Figura 15, painel direito). Trechos de repetição internos da proteína leucolectina deduzida mostraram semelhança entre si, sendo na maioria de 13 AAs de comprimento. Duas curtas sequências de consenso, XWXXLPGXLKXXXVGPX e GVNKNDXXYXLVG, são altamente conservadas em cada repetição. Para além do trecho de 20 resíduos na região N-terminal da leucolectina, que não é encontrado em FEL, ambas as proteínas apresentam um alto nível de semelhança entre o número e a arquitetura de domínio global dos domínios TECPR, enquanto partilham apenas 48% de identidade de sequência.

Exemplo 7: Purificação da zonase a partir de fluido de eclosão de salmão O fluido de eclosão de salmão no Exemplo 1 pode ser ainda purificado para produzir uma preparação de zonase pura. Uma ronda de filtração em gel foi suficiente para separar a zonase de componentes moleculares maiores no filtrado com uma purificação de 12 vezes com mais do que 50% de rendimento. A matriz utilizada pode variar, mas

Sephacryl SR-200® foi a nossa escolha habitual. 0 tampão foi Tris-HCl pH 8,0 ou pH 8,5 (0,05 M) ou Tris-acetato (0,025 M, mesmos pHs). A zonase obtida após procedimentos de filtração em gel foi responsável pelas unidades de zonase predominantes no fluido de eclosão. A zonase foi purificada a partir de um produto proteico homogéneo por cromatografia de afinidade em colunas de Benzamidina-Sepharose 6B® disponíveis comercialmente. As condições específicas utilizadas (com colunas de volumes de 25 ou 125 mL) foram novamente um tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 8 ou 8,5), que para remover material não especificamente ligado nas colunas, foi ajustado para 1 M de NaCl. A zonase não foi removida por este passo, uma vez que a proteína permaneceu fortemente ligada à coluna. A eluição da zonase da coluna foi conseguida usando um gradiente de dioxano de 10-33% em NaCl 1 M no mesmo tampão Tris-HCl. Após a purificação de afinidade, a preparação da zonase apresentou uma banda de proteína na análise de SDS-PAGE com um peso molecular em torno de 28 kDa. Embora este produto da zonase não fosse de pureza de qualidade de sequência, ele estava altamente purificado. A zonase purificada por filtração gel e ainda purificada por afinidade foi adicionalmente purificada até pureza de qualidade de sequência por um procedimento cromatográfico final. Este procedimento empregou uma coluna PBE94®, com um tampão de Tris-acetato (10 mM, pH 9,0), em que a eluição subsequente foi com um gradiente de sal (até 1 M de sal de NaCl) neste tampão. Este passo por si aumentou a atividade catalítica da zonase por mais 7,6 vezes, para uma purificação total de 714 vezes, e com um rendimento de 28% a partir do material inicial. Este passo de purificação deixou a identidade da proteína zonase intacta como uma unidade de 2 8 kDa.

Exemplo 8: Produção e purificação de anticorpos

para LL

Antissoro policlonal de coelho anti-LL de salmão anti-coelho foi preparado como se segue: A proteína leucolectina purificada em qualidade de sequência do Exemplo 1 foi usada para produzir anticorpo policlonal em chinchila de 4 kg, como descrito por Harlow e Lane (1988, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) . Três injeções de 80, 40 e 25 mg de leucolectina de qualidade de sequência foram colocadas em múltiplos locais subcutâneos. A primeira foi emulsionada com adjuvante completo de Freund, as últimas duas com adjuvante incompleto após 3 e 6 semanas. Oito dias após o reforço final, o sangue foi recolhido e o soro foi preparado após centrifugação a 3.000 rpm (rotor SS-34 Sorvall) durante 15 minutos.

Alíquotas do antissoro foram armazenadas a -80°C. Os anticorpos primários foram purificados por afinidade usando colunas de proteína G de 1 mL HiTrap (Amersham Pharmacia Biotech) com caudal de 1 mL/min. O antissoro completo foi filtrado através de unidade de filtração de 45ym antes de ser aplicado em colunas de proteína G de 1 mL. 0 equilíbrio da coluna foi realizado usando 5-10 volumes de coluna de tampão de ligação (20 mM de fosfato de Na, pH 7,0), seguido por diversas lavagens com o mesmo tampão até nenhuma proteína ser detetada por absorvência de UV a 280 nm. A fração de IgG eluiu com 5 mL de tampão de eluição (0,1 M de glicina-HCl, pH 2,7) e foi dividida em 10 tubos contendo 25 yL de tampão de neutralização (1 M de Tris-HCl, pH 9,0) . A concentração foi determinada espectrofotometricamente. A pureza foi estimada por análise de alíquotas de frações de IgG purificadas em 12% de SDS-PAGE com subsequente coloração de prata. A sensibilidade foi determinada por análise de transferência de Western usando anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho, conjugado com peroxidase de rábano.

Adicionalmente, os anticorpos policlonais foram pré-adsorvidos por incubação em pó de acetona de peixe-zebra. O F(ab')2 de porco anti-coelho marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi da Dako (F-0054). A IgG de cabra anti-coelho marcada com Alexa Fluor 647 foi obtida da Molecular Probe, Eugene, E.U.A. (Invitrogen, n° de catálogo A-21244) e imunoglobulinas policlonais de porco anti-coelho biotiniladas foram da Dako (N° de catálogo E0353). As concentrações ótimas dos anticorpos primários e secundários foram determinadas por experiências prévias de diluição. Os anticorpos policlonais foram usados na análise de expressão proteica descrita no Exemplo 1.

Exemplo 9: Identificação e caracterização de LL de peixe-zebra 0 ARN total foi isolado de embrião de peixe-zebra a 4, 6, 12, 24, 48 hpf e 5 dph usando o procedimento de

Trizol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade e a pureza do ARN total foram avaliadas num gel de agarose com formaldeido corado com brometo de etidio. Foram usadas apenas amostras com uma relação de ARNr 28S para 18S de 2-2,4:1, e nenhuma contaminação detetável de ADN. 0 ARN foi determinado espectrofotometricamente. 0 ARNm poliadenilado foi isolado de 5-10yg de ARN usando kits Dynal (Invitrogen). A transcrição reversa foi realizada usando

200 U/yL de TermoScript (Invitrogen). O ARNm (0,5 yg) foi aquecido a 72 °C durante 5 min, arrefecido, sedimentado e adicionado a uma mistura de reação de 20 yL contendo 100 ng/yL de oligo dT, 10 yM de DDT e 0,8 U/yL de inibidores de RNAse em 2,0 mM de tampão de síntese de ADNc (Invitrogen) . A incubação foi a 50°C durante 1 h. Os produtos foram purificados por extração com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, passados através de coluna MicroSpin S-200HR, e precipitados com etanol. Os iniciadores de LL específicos do gene foram concebidos a partir de sequências de LL de salmão (Tabela 3). A mistura do PCR (20 yL) continha 2 yL de molde de ADNc, 0,4 yM de iniciadores (LLFl, LLF2, LLRl, LLR2 e LLR3), tampão de PCR lx, 0,5 U de Taq ADN polimerases (Takara) , e 0,2 mM de dNTPs. A amplificação de PCR usou 32 ciclos de 94°C durante 45 s/58°C durante 45 s/72°C durante 90 s e extensão final a 72°C durante 7 minutos. A mistura de reação foi analisada por gel de agarose-TBE de 1,8% com 0,5 yg/mL de brometo de etidio em tampão TBE lx (pH 8,3) com marcador de ADN de escada de 100 pb (New England Biolabs). _Tabela 3: Iniciadores usados para a amplificação de LL de peixe-zebra__

RT-PCR

Iniciador Sequência Posição (nt) Tamanho esperado (pb)_ LLFi 5'-ATGCAGATCGATGCAGGACTGGG-3' 94-116 Fl/Rl = -72 0 LLF2 5'-TGGTTCCCTGAAGCATGTCACTGT-3' 186-209 F1/R2 = -454 F1/R3 = -340 LLRi 5'-GAAAGAGAGATCAATGAGTTCGCA-3’ 840-817 F2/Rl = -655 LLR2 5'-CAAAGACACTACCATCAGTTGCCAC-3' 5 95-571 F2/R2 = —410 LLR3 5-GTCCGC AGCTGT AGTACTTCACAG-3' 457-434 F2/R3 = —30 0

5' RACE-PCR

Iniciador Sequência Iniciador Sequência

Iniciador 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' Iniciador 5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-

GeneRacer 5' Gene Racer 3. 3'

Iniciador 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3' Iniciador 5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'

5' RACE-PCR

Iniciador Sequência

GeneRacer 5'

Interno LLR2 5'-CAAAGACACTACCATCAGTTGCCAC-3' LLR4 5'-AGCCTGGACCCTTGTAGCCAACTGT-3'

Iniciador Sequência

GeneRacer 3'

Interno llf2 5'-TGGTTCCCTGAAGCATGTCACTGT-3' 5’- LLF4 GTGAGGTGGC AACTGATGGT AGTGTCT- 3' 0 fragmento de PCR foi ligado num sistema de vetor 1 pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) por protocolos padrão. A eletroporação usou 40 yL de E. coli DH5a, e 1 yL de fragmento de PCR ligado no vetor pGEM T-Easy. Meio SOC (1 mL) foi adicionado antes das bactérias serem incubadas a 37 °C durante 1 h. As bactérias recombinantes (200 yL) foram plaqueadas em placas de agar convencionais de LB/ampicilina, X-gal, IPTG e incubadas a 37°C durante a noite para seleção azul/branco. Dez clones brancos foram escolhidos e cultivados numa cultura de 5 mL durante a noite em meio LB com 100 yg/mL de ampicilina. A purificação de plasmideo usou o kit de minipurificação de plasmideo (Qiagen, Chatsworth, CA). Os plasmideos foram amplificados e sequenciados usando protocolos convencionais (DNA Sequence Lab, Bergen). PCRs 5'- e 3'-RACE de LL foram realizadas usando o kit central GeneRacer (Invitrogen cat. #45-0168) de acordo com instruções. 2 yg de ARN total foram usados para sintetizar a primeira cadeia de ADNc à RT usando Superscript III (Invitrogen). A primeira ronda de amplificação de PCR 5'- e 3'-RACE foi realizada aplicando o iniciador 5'- ou 3'-GeneRacer e o iniciador especifico de gene LLR2 & LLF3 reverso ou para a frente (Tabela 3) . A amplificação de PCR 5'- ou 3'-RACE interna utiliza iniciadores de PCR GeneRacer 5' - ou 3'-RACE interna e iniciador interno especifico de gene LLR4 & LLF4 reverso ou para a frente. Para PCR 5'- e 3'-RACE, primeiro passo cinco ciclos, 94°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto; em seguida cinco ciclos a 94°C durante 30 segundos e 70°C durante 1 minuto; terceiro passo 30 ciclos com 94°C durante 30 segundos, e 68°C durante 45 segundos e 72°C durante 1 minuto; passo final de extensão a 72°C durante 7 minutos. PCR 5'- ou 3'-RACE interna em três passos: primeiro passo 5 ciclos em 94°C durante 30 segundos, 72°C durante 2 minutos; passo seguinte 5 ciclos a 94°C, 30 segundos, 70°C 2 minutos; 3 passo 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos e 68°C durante 1 minuto; passo final de extensão 72 °C durante 10 minutos. Os moldes para a PCR interna usaram o produto de PCR da primeira ronda de PCR RACE diluídos 1:25 em água destilada.

Os iniciadores para a PCR RACE estão listados na Tabela 3. Produtos de PCR únicos foram purificados usando o kit de purificação de PCR (Promega, Madison, WI, E.U.A.), e ligados no vetor PCR II Topo (Invitrogen) para transformação de E. coli competente de elevada eficiência JM109 (Invitrogen). As bactérias recombinantes foram identificadas por seleção azul/branca em placas de ágar Lucia Bertani. Os plasmídeos contendo as inserções foram purificados usando o kit de purificação Promega e sequenciados com iniciadores M13. A sequência de ARNm de LL foi analisada usando programas de pesquisa Blastx e Blastp.

Ao combinar três conjuntos de iniciadores (ver Tabela 3), a amplificação produziu fragmentos amplificados de tamanhos (Figura 16A) previstos de LL de salmão. 0 branco de água sem ARNm de peixe-zebra foi negativo. 0 produto maior (720 pb) foi sequenciado, mostrando que LL está presente em peixe-zebra. A amplificação de produtos de PCR de diferentes tamanhos (Figura 16A) iniciados por oligonucleótidos específicos que flanqueiam os exões de salmão em posições diferentes, documentam adicionalmente a alta homologia entre LLs de peixe-zebra e salmão. Como um controlo positivo para as reações de amplificação, nós usamos β-actina. A PCR 5'-RACE clarificou a sequência da região 5'-não traduzida (5'-UTR) de LL de peixe-zebra. Nós usamos ARNm (Figura 16B) de 4 horas pós-fecundação (hpf) até 5 dias pós-eclosão (dph). A primeira ronda de amplificação de PCR RACE produziu produtos muito fracos. Tais produtos amplificados de todas as fases foram usados para uma segunda ronda de PCR RACE usando alta temperatura de emparelhamento (65°C) a fim de aumentar a especificidade da reação, utilizando diluições 1:20 da primeira reação de PCR RACE. Os mesmos dois produtos (520 e 420 pb) foram gerados a partir de todas as fases (Figura 16B), mesmo de 4 hpf. Destas fases de desenvolvimento, foi obtida informação de sequência de LL de mais de 20 clones. Todos os clones continham a região a montante de 29 nts (Figura 16C) detetada em LL de salmão. A extremidade 3' também foi sequenciada por análise múltipla e revelou uma estrutura muito semelhante (quase idêntica) à estrutura encontrada em leucolectina de salmão. Com base na sequência de ADNc de tamanho total, a proteína LL deduzida de peixe-zebra foi depositada no NCBI Genebank (Acc. n° FJ 643620). A sequência codificante consiste em 1.213 nts com uma grelha de leitura aberta de 765 nucleótidos. A sequência de aminoácidos deduzida para LL de peixe-zebra sugere uma proteína de 255 AAs, dado um codão de iniciação de tradução na posição +1 (ou nts 30 - 32; (Figura 16C) . O ADNc de LL também tem um potencial codão de iniciação em nt +94 (Figura 16C) . Em 4 de 20 clones de LL de peixe-zebra, o transcrito continha 29 nts a montante do local +1, mas carecia dos 93 nts seguintes (a sequência de nt lê corretamente acima até -1 seguida pelo nt em +94: Fig. 16C). Assim, os dados sugerem que duas proteínas LL diferentes possam ser traduzidas (Figura 16C). A forte homologia entre proteínas LL de peixe-zebra e salmão era aparente. A LL de peixe-zebra é uma estrutura híbrida comparada às duas LLs de salmão. De sete critérios de classificação de LL estabelecidos, 4 critérios colocaram a LL de peixe-zebra na categoria LL-1, enquanto 2 critérios colocaram na categoria LL-2 (Figura 16E). O sétimo critério é único para LL de peixe-zebra (Figura 16E, área na caixa) . Além disso, uma Cys falta no exão 3 e é substituído por Arg na sequência "nmnTPYClts", que em peixe-zebra se lê "nmnDTPRlts". Como consequência, a LL de peixe-zebra tem 5 cisteínas, onde o salmão tem 6 cisteínas, todas previstas em pontes persulfureto. A respeito dos vários exões, o exão 1 é idêntico, enquanto o exão 2 de peixe-zebra tem três AAs únicos não encontrados em salmão (Gly-Arg em vez de Ser-Gln nas posições #57 & 58, e Vai em vez de Ile na posição #78) . 0 Exão 3 tem 4 resíduos modificados (ou 2?). Nos exões 4 & 5 não há nenhuma diferença independentemente dos 3 locais de classificação. Assim, existem 5 (ou 7) AAs únicos na LL de peixe-zebra (255 AAs no total), ignorando os locais de classificação. A LL de peixe-zebra é altamente conservada comparada à LL de salmão, diferindo apenas por poucos pontos percentuais. A LL de peixe-zebra (Figura 16D,E) é muito semelhante à LL de salmão. A LL de peixe-zebra carece de uma das seis Cys vistas na LL de salmão, e pode assim conter apenas duas pontes persulfureto: uma que liga o N-terminal e o C-terminal, mais uma ponte interna no exão 4. Comparando a LL de salmão e a grande de peixe-zebra (Figura 16E), as variações estruturais estereotípicos observadas em salmão são reforçadas pela estrutura de LL de peixe-zebra. É observada uma diferença radical (resíduo #131), mas são observadas na maioria substituições conservadas onde ocorrem variações na LL de salmão. Em PVF, a LL pode ter funções imunoprotetoras. As variações restringidas na estrutura de LL podem-se relacionar com tais funções. A leucolectina truncada (tLL) carece do péptido secretor, sugerindo que a tLL (Figura 16D) não é segregada, e tLL pode ser uma proteína β-hélice com 4 lâminas. Diferentes proteínas LL podem em teoria realizar diferentes funções celulares. A função da tLL pode funcionar em células diferentes dos lectócitos.

Exemplo 10: Isolamento e caracterização do gene de LL de salmão

Rastreio da biblioteca BAC

Para se obter a estrutura genómica do gene da leucolectina, nós rastreamos uma biblioteca BAC genómica de salmão pública (cobertura 18x, tamanho médio de inserção de cerca de 188 kb) disponibilizada pelo Projeto do Genoma de Salmão (Oslo, Noruega). Uma biblioteca do cromossoma artificial bacteriano (BAC) altamente redundante construída a partir de uma estirpe de aquacultura Norueguesa de salmão do Atlântico macho (Salmo Salar) foi rastreada para clones positivos de LL. A biblioteca consiste num número total de 305.557 clones. 0 tamanho médio de inserção da biblioteca é 188 kpb, representando uma cobertura de genoma de 18 vezes. Filtros de alta densidade CHORI-214 Seg. 1 (conjunto de filtro-007193), cada um consistindo em 18.432 clones aplicados em duplicado, foram produzidos para rastreio de hibridação.

Para rastrear a biblioteca, uma sonda de ADNc específica de LL de 620 pb foi preparada incorporando digoxigenina-ll-dUTP (Roche) pelo método de PCR, usando o iniciador para a frente LL/F 5'- TACGGACACAGGTCGAATCCCCTACTACC-3 e o iniciador reverso LL/R 5'-ACAGAGAAGAGGCTAATGTGTGCAC-3. A sonda de ADNc marcada com DIG foi incubada a 95°C durante 10 minutos e colocada imediatamente em gelo durante 5 minutos antes da adição ao tampão de hibridação (5x SSC, 50% de formamida, 0,02% de SDS, 2% de agente de bloqueamento (Roche), água tratada com DEPC). A hibridação foi realizada em tubos de hibridação a 55°C durante a noite. O passo de lavagem pós-hibridação foi realizado duas vezes a baixa restringência em 2x SSC com 0,1% de SDS à RT durante 15 minutos cada uma, e duas vezes a alta restringência em 0,lx SSC com 0,1% de SDS a 65°C durante 20 minutos cada uma. Os filtros foram incubados numa solução de bloqueamento contendo tampão de ácido maleico (pH 7,5) e 1% de reagente de bloqueamento (Roche), e subsequentemente em solução de bloqueamento com anticorpo anti-DIG-conjugado com fosfatase alcalina (AP) (Roche) diluído 1:10.000 durante 1 h à RT. Após lavagem com tampão de ácido maleico 0,1M (pH 7,5) contendo 150 mM de NaCl e 0,5% de Tween 20, a membrana foi equilibrada durante 2 minutos em tampão de deteção (0,1 M de Tris-HCl, 0,1 M de NaCl, pH 9,5 à RT) . As manchas duplicadas positivas foram visualizadas por ensaio quimioluminescente usando CSPD (Roche) como substrato. A identificação de sinais positivos foi conseguida expondo os filtros a filme de raio X (Kodak) . O tempo de exposição variou de 3 a 15 minutos. Dois clones positivos eleitos L-7/257 e A-12/144 foram plaqueados em placas de ágar preparadas e incubados a 37°C durante a noite. Três clones foram escolhidos, cultivados durante a noite numa cultura de 5 mL com agitação em meio LB a 37°C com 20 yg/mL de cloranfenicol. A purificação do ADN plasmidico foi realizada no dia seguinte usando o kit de purificação de ADN ultrapure (Qiagen) . O ADN de BAC foi digerido com Notl e analisado por eletroforese de campo pulsado (PFGE) (Osoegawa et al., 1998, Genomics, 52, pp. 1-8) . O marcador PFG de baixa gama (New England Biolabs) e o fragmento λ-Hind III (Takara) foram usados como marcadores de tamanho de ADN.

Verificação por PCR de clones positivos

As reações de PCR foram realizadas usando ADN de BAC purificado como um molde e iniciadores específicos do gene. As reações de PCR foram incubadas a 95°C durante 3 minutos, seguidas por 35 ciclos a 95°C durante 30 s, emparelhamento a 54°C durante 30 s, e extensão a 72°C durante 30 s com uma incubação final a 72 °C durante 10 minutos. Após termociclagem, 2 yL de cada reação de PCR foram analisados num gel de agarose de 1,5%.

Sequenciação de ligação aleatória de clones BAC da de leucolectina

Dois clones foram sequenciados por MRW, Berlim, Alemanha. As inserções de vetor foram sequenciadas a uma redundância estimada de 2,4 vezes. As leituras foram limpas de elementos de vetor e de hospedeiro. Das cerca de 180 leituras, um total de respetivamente 33 e 22 contigs foram estabelecidos a partir dos dois clones de BAC usando bioinformática. Os contigs foram examinados por sequências de ARNm e por sequências de aminoácidos. A análise identificou exões e intrões, por pesquisas de programa e por inspeçãos manuais. 0 gene de LL inteiro foi identificado a partir de contigs sobreponíveis.

Estrutura genómica

Os resultados do rastreio acima identificaram 7 clones específicos denominados A-12/144, L-16/143, P-6/76, B-5/70, 0-20/85, L-7/257 e F-7/176 de acordo com a nomenclatura da biblioteca BAC. 0 tamanho médio da inserção dos clones BAC genómicos foi estimado a partir de ADN purificado de todos os clones BAC selecionados, que foi subsequentemente digerido com a enzima de restrição Notl. Os produtos de digestão de ADN contendo vetor foram separados por eletroforese em gel de campo pulsado e visualizados por coloração de brometo de etídio. Todos os clones BAC produziram apenas duas bandas, mostrando que o tamanho do vetor (pTARBAC2.1) era ~13 kpb (13.397 pb; Osoegawa et al., 1998, supra). Isto sugere que o tamanho da inserção de todos os clones fosse ~25 kpb. As sequências de seis dos 7 clones BAC selecionados foram verificadas uma vez mais por amplificação usando como molde ADN purificado de um clone BAC, juntamente com iniciadores específicos do gene de LL. A amplificação de PCR produziu um produto de ~600 pb de todos estes clones. A sua identidade foi confirmada por sequenciação direta.

Sequenciação de ligação aleatória de dois clones

BAC

Os programas de montagem de sequências BioEdit e Dna Baser foram usados em todos os dados de sequência. A análise revelou que ambos os clones BAC isolados de 25 kpb continham a sequência completa de ARNm de leucolectina (após eliminação de elementos de sequência do vetor), quando rastreados contra sequências de ARNm e sequências de proteína. Os dados de um dos clones BAC produziram um total de 80 leituras, que foram montadas em 33 contigs. Destes, pelo menos 6 contigs continham sequências de LL, que permitiram a reconstrução do gene inteiro de LL. Para além de sequências de LL, outros componentes foram frequentemente identificados nestes contigs com um alto grau de certeza, e incluía transcriptase reversa, peptidase iónica e elementos de transposão.

Características da estrutura genómica do gene de LL

Na primeira análise apenas um dos clones (L7/247) permitiu a identificação de um gene inteiro de LL, enquanto o outro clone (A12/144) revelou a maioria da estrutura genómica (ver Figura 16). Os dados do clone genómico L7/247 sugeriram uma organização genómica da leucolectina em que o gene é composto de 5 exões interrompidos por 4 intrões, e abarca ~2,3 kpb começando a partir da caixa TATA. As sequências genómicas de LL revelaram uma caixa TATA que começa na posição -81 (TATAAAA) do codão de iniciação ATG, indicando uma 5' UTR (elemento não traduzivel) de 81 nt do ARNm. 0 codão de terminação TAG está localizado a cerca de 1850 nt de ATG na sequência genómica. Um sinal de poliadenilação longo de 6 nt AATAAA começa em torno da posição 2.250 desde o ATG. A 3'UTR é uma sequência de cerca de 400 nt que começa tardiamente após o codão de terminação TAG. Com uma 5'UTR consistindo de 81 nts, o tamanho do gene de LL é estimado ser pelo menos ~2,3 kpb por definições convencionais, com os intrões as justificarem o dobro da sequência dos exões. A fim de verificar os limites exão-intrão do gene da leucolectina, foram concebidos iniciadores de PCR a partir de sequências de intrão genómicas estabelecidas, e usados para amplificar cada exão a partir de ADN embrionário de salmão. Estas 5 sequências de exão foram derivadas por análise de sequência direta de fragmentos amplificados, e todos corresponderam às sequências genómicas estabelecidas.

Os tamanhos dos exões codificantes pareceram ser bastante inequívocos, e variaram entre 55 pb (Exão 1) e 234 pb (Exão 2) . Notavelmente, dois intrões eram relativamente pequenos de modo que um comprimento exato pode ser derivado da leitura manual de dados. Pelo contrário, o intrão 3 é cerca de 250 nt, enquanto o intrão 4 abarca cerca de 700 pb. O comprimento exato do intrão 4 não pode ser definido a partir dos dados disponíveis. Os dados de sequência de exão compostos confirmam o produto previsto de tradução, a saber uma proteína de 255 AA.

Além disso, os dados suportam uma estrutura genómica do gene de LL com 5 exões e 4 intrões para uma das duas variantes descritas da leucolectina. 0 resíduo de AA N-terminal da proteína LL excretada foi estabelecido como sendo triptofano por degradação direta de Edman de LL purificada. Este resíduo de Trp ocupa a posição #20 desde a metionina N-terminal na proteína precursora de 255 AA, e é precedido pelos aminoácidos #18 (His) e #19 (Ala). Um local de clivagem para uma protease de processamento é previsto entre Ala e Trp, para gerar a proteína LL excretada. Por degradação direta de Edman, a sequência desta LL excretada foi estabelecida como WDCQE VVNIK NLMQI DAGLG Q-V, e também verificada por múltiplas sequências de proteína virtuais. Os Exões não estão todos em-grelha, mas permitem potencialmente alguma omissão de exão sem interromper todas as grelhas de leitura. A análise de sequência genómica indicou as sequências dos limites exão/intrão. A exceção é o intrão 4 em que possivelmente nts não convencionais flanqueiam as sequências do intrão. Nos intrões 1, 2 e 3, nós encontramos a característica comum GT//AG a flanquear o início e o final de muitos intrões de vertebrados (Shapiro e Senepathy, 1987, Nucleic Acids Research, 15, pp. 7155-7174) . O Exão 1 (19 AAs) tem 55 nt de comprimento, com a sequência MBATA - AVLLV - LCLLT-ISH (A) e pára no primeiro G do codão para o resíduo Ala #19 que precede o triptofano N-terminal da leucolectina excretada. O R grande em itálico e negrito significa um AA variante nesta posição possivelmente associado a um gene de leucolectina-3 (ver Figura 17) . A sequência genómica do gene continua com os nucleótidos GT para começar o intrão 1. 0 intrão 1 termina com os nucleótidos AG seguidos pelo exão II, que contém as últimas duas bases (-CA) do codão Ala #19, seguido pelo codão TGG para #20 Trp, o N-terminal da leucolectina. O Intrão 1 tem 89 nt de comprimento. O Exão 2 (234 nts) contém 77 AA (234 - 2 nts / 3 = 77 AA + 1 nt). Aqui, a sequência genómica traduz-se (ala) - WDCQEVVNIK - NLMQI DAGLG - QWAT DTSQI - PYYLV G* DKWI -RL* PGS LKHIT - VGPAG IWGVN -KDYAI YKYVA - GNWVQ AA (G) (= 77 AAs + 1 nt) antes de continuar com os nucleótidos GT (no intrão 2) . O asterisco refere-se a um resíduo em que AAs alternativos foram encontrados na proteína de LL ou em múltiplas sequências de ADNc de LL (ver Figura 17) . G* parece variar na leucolectina-1, enquanto L* parecer variar na leucolectina-2. O Intrão 2 tem 186 nts de comprimento, terminando nos nucleótidos AG. O Exão 3 (72 AAs) começa após 2 nucleótidos com GC (= Gly, resíduo #78) e continua por mais 216 nts (para um total de 218 nts) ou 72 AAs. A sequência de aminoácidos do Exão 3 le-se: (G)LL* KQL DAGGE - QFIVG ANMN* D TPYCLTSSAT - VGYKG PGSPL- PWTGL PGAVK - YYSCG P* FGCW -AVNKN DDIYL - MS, em que o resíduo #150 é S. Três letras grandes, em negrito e sublinhadas, significam AAs variantes que servem para distinguir entre a leucolectina-1 e a leucolectina-2. As letras com asterisco significam novamente resíduos com micro-variação (N* em leucolectina-2; P* significa micro-variação na leucolectina-1 e leucolectina-2) em tal posição (ver Figura 17). 0 Intrão 3 segue-se, começando com os nucleótidos GT, e continua durante mais ~250 nts. 0 Exão 4 (39 AAs) começa no resíduo #151= LNQDC QNKGW - SHIE* G KLSMI - EVATD GSVFG - VNSA* GSVYT, em que T é o resíduo #189. Novamente o resíduo sublinhado em negrito serve para distinguir a leucolectina-1 da leucolectina-2, enquanto um asterisco significa micro-variação nesta posição (visto nas duas leucolectinas na posição E*, e apenas na leucolectina-2 para a posição A*) . 0 Intrão 4 pode possivelmente não começar e parar com sequências nt convencionais para a definição de intrão. Os dados sobre o intrão 4 são assim um tanto preliminares, e assim o comprimento do intrão 4 é uma estimativa (~700 nts). 0 Exão 5 (47 AAs) começa com o codão para R ( = resíduo #190) e continua até uma histidina C-terminal (resíduo #236), que é seguida por um codão de terminação TAG, e 3'UTR. A sequência le-se: RDGIT-ASKPE-GTGWS-NIPMG*-MLMGHVTYDL-GRLWV-VSKSAV-TMVCT-H, em que um asterisco indica micro-variação nesta posição na leucolectina-1. As letras em negrito significam diferenças entre a leucolectina-1 e a leucolectina-2. As letras em negrito e itálico significam a possibilidade da existência de leucolectina-3. Estes dados são resumidos na Figura 17.

Exemplo 11: Comparação da sequência genómica de leucolectina-1 com as sequências de ARNm da leucolectina

Com mais de uma dúzia de experiências de clonagem e sequenciação separadas do ADNc de salmão, as sequências alinhadas revelaram que apenas em 7 posições existem alternativas claras de diferentes resíduos de aminoácidos acomodados. A escassez de variação de sequência global, e a limitação estereotípica a tais variantes, é assinalável. A sequência genómica de L-7/247 corresponde a clones de leucolectina classificados como leucolectina-1. Os outros ADNc sequenciados denominados leucolectina-2, diferem nas sete posições indicadas. Para além destas posições, existem indicações de mais algumas variações em AA. Isto pode sugerir micro-heterogeneidade adicional dos dois ADNc classificados, mas os dados podem sugerir a existência de uma terceira categoria de ADNc de LL, uma vez que, por exemplo, na posição #226, nós encontramos um resíduo de tirosina em alguns clones que nunca foi observado em qualquer ADNc de leucolectina-1 ou leucolectina-2 (Figura 17).

Um sumário de variações observadas é mostrado na Figura 17. Os dois tipos de leucolectinas são caracterizados por respetivamente (E, I, Y, Y, K, A, V) versus (N, V, F, F, N, G, G) nas sete posições (#88, 91, 101, 147, 158, 229, 230) da sequência de AA deduzida para a leucolectina madura. Estas 7 posições classificam inequivocamente estas duas leucolectinas, que além disso podem apresentar micro-variações em posições estereotípicas mostradas por asteriscos na Figura 17. Como os dados na Figura 17 indicam, algumas sequências de ARNm apontam para uma Gly única na posição #2 do péptido de sinal de LL que não é vista nas leucolectinas-l&2, e que sugere assim uma possível leucolectina-3. Além disso, nós observámos uma Tyr na posição #226 na leucolectina madura em que apenas Ser é vista em leucolectinas-l&2. Nós concluímos que a sequência genómica em L7/247 corresponde a sequências de leucolectina-1 encontradas por sequenciação múltipla de ADNc de LL de salmão. Sequenciação adicional de clones BAC de LL deve revelar a outra principal categoria de leucolectina-2, e talvez também a existência suspeita de leucolectina-3, como definida pelos critérios de resíduos acima.

Exemplo 12: Deteção de proteínas de leucolectina noutras espécies 0 fluido de eclosão da truta-arco-íris (Oncorhyncus mykiss) , bacalhau e Oikopleura dioica foi investigado para a presença de proteínas de leucolectina. A proteína de fuido de eclosão foi preparada por cromatografia de afinidade, analisada por SDS-PAGE a 15%. 0 gel foi corado com prata para mostrar a presença de uma variedade de proteínas, ou transferido e sondado com um anticorpo de leucolectina de salmão. Em cada caso foi detetada uma única proteína de ~26 kDa, correspondendo ao peso molecular da leucolectina (ver Figuras 18 (truta-arco-íris) , 19A (bacalhau) e 19B (Oikopleura dioica)).

Sequências:

1: (polipéptido de leucolectina de embrião de salmão): MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEWNIKNLMQIDAGLGQWATDTSQIPY ylVgdkwirlpgslkhitvgpagiwgvnkdyaiykyvagnwvqaagllkq LDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCG PFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNS AGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWWSKSAVTM VCTH 2: (polipéptido de leucolectina de leucócitos de salmão):

SIPYYLV GDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKD Y AIYKYVAGNWV QAAGL

PKQLDAGGEQFIVGANMDDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYY

SCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNNGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFG

VNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMCMLMGHVTYDLGRLWWSKSAV

TMVCTH

3: (polipéptido de leucolectina de leucócitos de bacalhau): LVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQL

DAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGP

FGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVNSA

GSVYTRD 4: (polipéptido de leucolectina de leucócitos de galinha):

IPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLL

KQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYS

CGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGV

NSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWW

5: (polipéptido de leucolectina de leucócitos humanos): MRATAAVLLVLCLLTISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQWATDTGRIPY

YLVGDKWIRLPGSLKHVTVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLK

QLDAGGEQFIVGANMNDTPYRLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSC

GPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVN

SAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSGGTM

VCTH 6: (polipéptido de leucolectina de peixe-zebra):

MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQWATDTSQIPY

YLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ

LDAGGNQFIVGANMNDTPYRLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSC

GPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVN

SAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWWTKSGGTM

VCTH 7: (polipéptido de leucolectina-2 de salmão):

MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEWNEKNLMQIDAGLGQWATDTSQIPY

YLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ

LDAGGNQFWGANMDDTPFCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSC

GHFGCWAVNKNDDIFLMSLNQDCQNNGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVN

SAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWWSKSGGTM

VCTH

8: (polipéptido de leucolectina-3 de salmão): MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEWNIKNLMQIDAGLGQWATDTSQIPY

YLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ

LDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCG

PFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNS

AGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWWYKSAVTM

VCTH 9: (sequência de ADNc de leucolectina de sangue humano):

ATGAGAGCCACTGCAGCCGTCCTATTGGTCCTCTGTCTCCTGACCATCAG

TCATGCATGGGACTGTCAGGAGGTAGTAAACATCAAGAATCTGATGCAG

ATCGATGCAGGACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAGGTCGAATCC

CCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAG

CATGTCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATG

CAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCCTTCTG

AAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGA

ACGATACTCCATACCGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGG

TCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTAC

TACAGCTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATA

TCTACTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCA

CATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCT

TTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGC

CAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTC

ATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTC

TGGCGGCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGC

CGTTCGGGATCTGTCTAAAGTTCAeTTGCGAACTCATTGATCTÇTCTTTCT

GGAAAAGCCTTTAGTTCATTAGTTCATAAAAATCCTTCATTTTAAAACeT

ATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATTATCTTATTGCCATTTAAA

AAAATATCAATGAAGATGTTATATTTTCTTGACCACTCCTTGATTAACAC

TTCAATAGATCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAGTGTAGTGTAAACTAGGG

CATGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTTTGCTGTGCTTCAGAGGT

CATCAATAGGATTGGATGGAATCCTTGTCATTGTTTATTATCTCATTATAT

AAACATTTCCTGCAAAAATAAAGCATTCATTTTGAAACTATTGTAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAN 10: (sequência do gene de leucolectina de salmão, de uraa biblioteca de ADN genómico de salmão maduro):

TGTGCAGGGCTATAAAAGCGCAAAGTCTTCCAATGGGACAATTGAAGTC

TGGTGTAC AACCAAACGTATACTGTAGATCTACAT AG ACATCATGAGAG

CCACTGCAGCCGTCCTAÍTGGTCCTCTGTCTCCTGACCATCAGTCATGGT

AAGTTACCATCATCTGAAACATGCTTGATCAACTTGGAGTTGAAGTrrTT

CTTGGTATACTCTACTCATATGTCTTTGTCTCCATAGCATGGGACTGTCA

GGAGGTAGTAAACATCAAGAATCTGATGCAGATCGATGCAGGACTGGGG

CAAOTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAÀTCCCCTACTACCTGGTAGGTG

ATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGTAGGACCA

GCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAGTATGTGG

CCGGT AACTGGGTTCAAGCTGCAGGTAAGTGGAGAGCATT ACTCAATAT

TTATCCAGAGGACACCTGCTTATTAGCTTTCCTGATACCATCAGGCTGTT

GAAAAAAACGATTGATGTTTTAAArrGTAAClTGTAGGTAATTTGGCAGT

ACTCCTTGTTTGCTTGTCTGTCTGTCTTTGTGGTCTTGGCCTTCTGAAACA

GTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGAT

ACTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAG

GCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAG

CTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTA CTTAATGAGTGT AAGATCTGGG AAAGAGTGGGAGAGCTGGAGT AGAGTA

GT AGAGGATGGAGAGTGTCAGTT ATTTT AAA ACT GTTT C ΑΤΑΤΓ AT A ACT

GTTGAAATl'GTCCTAAAACCCTGATTGTATCATTTTGTTTCCAGCTGAAT

CAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCA

TGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGT

AGTGTTTATACCCAGCTAAGGTTGCTACTGAACTATGTGTATGGTCCACC acccccccccccccaacagtattaacttgaaaatgacttgtaataataac

TTAGAATAATAATGGTATACCCTTTAATTATAACTCTGATCCTTACAGTA

CATGCTATGTGAATCTCCTrACACAAAAACTAAATATTGTAGGTACATAA

ATAAAATCAGTTAAATATAATCAGATCTAAACTTATAGGACTTATTAAGA

AATGTGTAGACAGTGTATGATAAAATATGTAAAAGTTGGATGTCCTGTA

AAGCTACAGTTTGGGATAAAAAACAACAACTTCCCAGACACCCCACCAC

TTGTTCTGGTAAACAGCTGAGGAATGTAGTTAGAGAAATGTAACCACTCT

CACATTCATACATGGAGCrACGGATGCAAAGACACAACAATTTTTTTATT

AAAAAAAAAAAAATGTTTATATTTTCTTTTAAAGCT AAACATTGTTTGTT

TACAATAACATTGTTl'ACAAACAATTGAGTAAAAGCTTACATrTTGGCTT

CTAATGTGGTTGAATAAAGCTCAAGATGCAGAAGTTATATTCTTCAAAA

ATCTATGGCTAT ATTT AATTATTAAAGTCCAAAAATGGATGTACTTAAAA

AAAATGGATAAGCTTTAAAACATGAACCCCAACCCTTTCTTCAACACAG

AGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATAT

GCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTT

GGGTCGTCTCCAAGTCTGGCGGCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTT

CTCTGTAGCTGAAGGCCGTTCGGGATCTGTCTAAAGTTCACTTGCGAACT

CATTGATCTCTCTTTCTGGAAAAGCCTTTAGTTCATTAGTrCATAAAAAT

CCTTCATTTTAAAACCT ATTGCTCTACCT ATTATTTTCAGTTCTTCAATTA

TCITATTGCCATTTAAAAAAATATCAATGAAGATGTTATATTTTCTTGAC

CACTCCTTGATTAACACTTCAATAGATCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAG

TGTAGTGT AAACTAGGGC ACGGTC ATGTT GCTCACAATCCAC AT GGGTTT

TGGTGTGCTTCAGAGGTCATCAATAGGATTTGACGGAATCCTTGTCATTG

TTTATTATCTCATTATATAATCATTTCCTGCAAAAATAAA 11: (sequência de ADNc de leucolectina de embriões de salmão com 200-450 dias de idade - apenas exões):

AT GAG AGCCA CTGCAGCCGT CCTATTGGTC CTCTGTCTCC

TGACCATCAG TCATGCATGG GACTGTCAGG AGGTAGTAAA

CATCAAGAAT CTGATGCAGA TCGATGCAGG ACTGGGGCAA

GTGGTTGCTA CGGACACAAG TCAAATCCCC TACTACCTGG

TAGGTGATAA ATGGATCCGT CTGCCTGGTT CCCTGAAGCA

TATCACTGTA GGACCAGCAG GGATCTGGGG TGTCAACAAG

GACTATGCAA TCTACAAGTA TGTGGCCGGT AACTGGGTTC

AAGCTGCAGG CCTTCTGAAA CAGTTGGATG CTGGAGGTGA

AC AGTTT ATT GTGGGGGCTA ACATGAACGA TACTCCATAC

TGTCTGACAA GTAGTGCCAC AGTTGGCTAC AAGGGTCCAG

GCTCACCCCT TCCATGGACA GGATTGCCAG GAGCTGTGAA

GTACTACAGC TGCGGACCCT TTGGGTGCTG GGCAGTCAAC

AAGAATGATG ATATCTACTT AATGAGTCTG AATCAAGACT i

GCCAAAACAA GGGGTGGAGT CACATTGAAG GCAAGCTTTC CATGATTGAG GTGGCAACTG ATGGTAGTGT CTTTGGGGTC AACTCTGCGG GTAGTGTTTA TACCAGAGAC GGCATCACAG CCAGTAAACC AGAGGGCACC GGATGGAGCA ATATCCCAAT GGGCATGCTC ATGGGCCACG TGACCTACGA CCTGGGCCGT CTTTGGGTCG TCTCCAAGTC TGGCGGCACC ATGGTGTGCA CACAT 12: (sequência do gene de leucolectina de leucócitos de salmão):

ACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTACCTG

GTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGT

AGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAG

TATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCGTTCCGAAACAGTTGG

ATGCTGGAGGTAACCAGTTTGTTGTGGGGGCTAACATGGACGATACTCC

ATTTTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAGGCTCAC

CCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGCTGCGG

ACACTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATTTTCTTAATGA

GTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAACGGGTGGAGTCACATTGATGGCAA

GCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACT

CTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGA

GGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTG

ACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTCTGGCGGCACCAT

GGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGT

13: (sequência do gene de leucolectina de bacalhau): CAATCCCCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCC

CTGAAGCATATCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGG

ACT ATGC AATCT AC AAGT ATGTGGCCGGT AACT GGGTTC AAGCTGCAGG

CCTTCTGAAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTA

ACATGAACGATACTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTA

CAAGGGTCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTG

AAGTACTACAGCTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATG

ATGATATCTACTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTG

GAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGT AGTGTCTTTGGGGTC AACTCTGCGGGT AGTGTTT AT ACC AGAGAC .

14: (sequência do gene de leucolectina de galinha): CAGGACTGGGGCAAGTGGTFGCTACGGACÁCAAGTCAAATCCCCTACTA

CCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCA

CTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTA

CAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTrCAAGCTGCAGGCCTTCTGAAACAG

TTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGATA

CTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACÀGTTGGCTACAAGGGTCCAGG

CTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGC

TGCGGACGCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTACT

TAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGA

AGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGG

TCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGCCGTAAA

CCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCC

ACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCT 15: (sequência genómica parcial de leucolectina de peixe- zebra): NNAAAANNTAAÀATANNGTAGGTACANNNNAAATCAGTTAAATATAATC AG ATNT AAANTTNTAGGACTATTAAGAA ATGTGTAG AC AGCGTACGATAA . AATATGTAAAAGTTGGATGTCCTGTAAAGCTACAGTTTGGGATAAAAAAC AACAACTTNCCAGACACCCCACCACTTGTTNTGGTAAACAGNTGAGGAAT GTAGTTAGAGAAATGTAACCANTCTCACATTCATACATGGAGTTACGGAT GCAAAGACACAACAATTITTTGTlTACATTOTTTTTAACATGTTrnTAAA GCAATACACATTGTTTGTTTACAATAACATTGTTTACAAACAATTGAGTAA AAGCTTACATrTTGGCTTCTGTGTGGTTGAAATAAAGCTCAAGAGGCAGA AGTTATArrCTTCAAAAATCAATGGCTATATTTAATTATTAAAGTTCCAAA AAGGATGTACTTAATAAAATGGATAAGCTTTAAAACATGAACCCCAACCC TTTCTTCAACACAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGG ATGGAGCAATATCCCAATGTGTATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACC TGGGCCGTCmGGGTCGTCTCCAAGTCTGCCGTCACCATGGTGTGCACAC ATT AGCCTCTTCTCTGT AGCTGAAGGCCGTTCGGGATCCGTCCAAAGTTCC CTGGCGAACTCATTGATCTCTCTrrCTGGAAAAGCCTTTAGTTCATAAAAA TCCTTCATTTTAAAACCTATTGCTCTACCTATTATrTTCAGTTCTrCAATGA tcttattgacatttaaaaaaaatatcattgaagattttatattttcttgac

AACTCCTAGATTAACACTTCAATAGACCTTIGCCATGGAGGCTAITTAAGT gtagtgtaaactagggcacggtcatgttgctcacaatccacatgggtttt

GCTGTGCrrCAAAGGTCATCAATAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCÂGGT

CGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTNGGATGCATAAG

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipéptido compreendendo: (i) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (iii) uma porção de uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1, 2 ou 5-8, em que a referida porção compreende pelo menos 200 aminoácidos; ou (iv) uma porção de uma sequência de aminoácidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1, 2 ou 5-8 e compreende pelo menos 200 aminoácidos.
2. Molécula de ácido nucleico compreendendo: (i) uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (ii) uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 98% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (iii) uma porção de uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15, em que a referida porção compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas; (iv) uma porção de uma sequência de nucleótidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15 e compreende pelo menos 600 bases nucleotídicas; ou (v) uma sequência complementar a qualquer das sequências definidas em (i)-(iv).
3. Vetor, preferencialmente um vetor de expressão, compreendendo uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 2.
4. Método de preparação de uma molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 3, compreendendo introduzir uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 2 no ácido nucleico do vetor.
5. Método de preparação de um polipéptido como reivindicado na reivindicação 1, que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 2, sob condições em que o referido polipéptido é expresso e recuperar a referida molécula assim produzida.
6. Polipéptido obtido a partir do método da reivindicação 5.
7. Célula hospedeira contendo um polipéptido como reivindicado na reivindicação 1 ou uma molécula de ácido nucleico como reivindicada na reivindicação 2.
8. Anticorpo ou um seu fragmento de ligação a antigénio que se liga especificamente a um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8.
9. Composição farmacêutica compreendendo: (a) um polipéptido compreendendo: (i) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (iii) uma porção de uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1, 2 ou 5-8, em que a referida porção compreende pelo menos 200 aminoácidos; ou (iv) uma porção de uma sequência de aminoácidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1, 2 ou 5-8 e compreende pelo menos 200 aminoácidos; ou (b) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido como definido em (a) , em que a referida molécula de ácido nucleico compreende: (i' ) uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (ii' ) uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 98% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (iii') uma porção de uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15, em que a referida porção compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas; ou (iv') uma porção de uma sequência de nucleótidos definida em (i') ou (ii'), em que a referida porção é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15 e compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas, e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
10. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo como definido na reivindicação 8 e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
11. Composição farmacêutica compreendendo: (a) um polipéptido compreendendo: (i) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (iii) uma porção de uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8, em que a referida porção compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (iv) uma porção de uma sequência de aminoácidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8 e compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (b) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido como definido em (a) , em que a referida molécula de ácido nucleico compreende: (i' ) uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (ii' ) uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (iii') uma porção de uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15, em que a referida porção compreende pelo menos 300 bases nucleotidicas; ou (iv' ) uma porção de uma sequência de nucleótidos definida em (i') ou (ii') , em que a referida porção é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15 e compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas; ou (c) um anticorpo como definido na reivindicação 8, e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, para utilização em terapia.
12. Utilização de: (a) um polipéptido compreendendo: (i) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (iii) uma porção de uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8, em que a referida porção compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (iv) uma porção de uma sequência de aminoácidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8 e compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (b) um polipéptido como descrito na reivindicação 6; ou (c) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido como definido em (a) , em que a referida molécula de ácido nucleico compreende: (i' ) uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (ii') uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (iii') uma porção de uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15, em que a referida porção compreende pelo menos 300 bases nucleotídicas; ou (iv' ) uma porção de uma sequência de nucleótidos definida em (i') ou (ii' ) , em que a referida porção é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15 e compreende pelo menos 600 bases nucleotídicas; ou (d) uma composição farmacêutica compreendendo o polipéptido de (a) ou (b) ou o ácido nucleico de (c) e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir um distúrbio autoimune da pele, um distúrbio inflamatório da pele ou de uma membrana mucosa ou uma pele danificada num animal. 13. A: (a) polipéptido compreendendo: (i) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8; (iii) uma porção de uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8, em que a referida porção compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (iv) uma porção de uma sequência de aminoácidos definida em (i) ou (ii) , em que a referida porção é pelo menos 7 0% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 1-8 e compreende pelo menos 100 aminoácidos; ou (b) polipéptido como descrito na reivindicação 6; ou (c) molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido como definido em (a), em que a referida molécula de ácido nucleico compreende: (i' ) uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (ii' ) uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15; (iii') uma porção de uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-15, em que a referida porção compreende pelo menos 300 bases nucleotidicas; ou (iv' ) uma porção de uma sequência de nucleótidos definida em (i') ou (ii'), em que a referida porção é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleótidos como apresentada em qualquer uma das sequências N° 9-12, 14 ou 15 e compreende pelo menos 600 bases nucleotidicas; ou (d) composição farmacêutica compreendendo o polipéptido de (a) ou (b) ou o ácido nucleico de (c) e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, para utilização no tratamento ou prevenção de um distúrbio autoimune da pele, um distúrbio inflamatório da pele ou de uma membrana mucosa ou uma pele danificada num animal.
14. Utilização ou o polipéptido, a molécula de ácido nucleico ou a composição farmacêutica para utilização como reivindicada na reivindicação 12 ou 13, em que o referido polipéptido, molécula de ácido nucleico ou composição farmacêutica é para administração tópica à pele ou a uma membrana mucosa.
15. Utilização ou o polipéptido, a molécula de ácido nucleico ou a composição farmacêutica para utilização como reivindicado em qualquer das reivindicações 12 a 14, em que os referidos distúrbios a serem tratados ou prevenidos são irritações, úlceras, eczema, acne, psoríase, inflamação gastrointestinal (preferencialmente a doença de Crohn, colite ulcerosa e outra inflamação crónica), gengivite, inflamação da cavidade oral e esófago ou pele danificada, em que preferencialmente a referida pele danificada está irritada ou inflamada, gretada pelo frio, queimada, irradiada, danificada pelo calor ou é uma ferida.
16. Produto contendo um ou mais polipéptidos, moléculas de ácido nucleico ou anticorpos como definidos em uma ou mais reivindicações anteriores e um ou mais ingredientes ativos adicionais, como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial em terapia humana ou animal.
17. Utilização ou o polipéptido, a molécula de ácido nucleico, a composição farmacêutica ou para utilização como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 12 a 16, em que o referido animal é um mamífero, preferencialmente um humano.