BRPI0920101B1

BRPI0920101B1 - Vetor, método para preparar um vetor e um polipeptídeo, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, uso

Info

Publication number: BRPI0920101B1
Application number: BRPI0920101-7A
Authority: BR
Inventors: Bernt Th. Walther; Mirushe Miftari
Original assignee: Leukolect As
Priority date: 2008-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2021-11-23
Also published as: KR20110095274A; GB0819883D0; KR101448573B1; CL2011000947A1; US10124034B2; US9260498B2; ZA201103456B; DK2358745T3; EP2358745A1; RU2011121616A; JP5539372B2; PT2358745T; BRPI0920101A2; EP2358745B1; CN102203127B; US20110280882A1; CN102203127A; ES2658966T3; US20160151454A1; NO2358745T3

Abstract

polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, vetor, métodos para preparar uma molécula de ácido nucleico recombinante e um polipeptídeo, célula hospedeira, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, composição farmacêutica, método para tratar ou prevenir um distúrbio, uso de um polipeptideo, molécula de ácido nucleico, anticorpo ou composição farmacêutica, e, produto. a presente invenção diz respeito a um polipeptídeo, descrito como uma lectina, sua sequência de ácido nucleico codificada e anticorpos ao polipeptídeo e seu uso em várias aplicações médicas, particularmente para tratar ou prevenir um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório ou pele danificada em um animal

Description

[0001] A presente invenção diz respeito a um polipeptídeo, isto é uma lectina, sua sequência de ácido nucleico codificada e anticorpos ao polipeptídeo e seu uso em várias aplicações médicas.

[0002] O sistema de defesa imune celular é central para sobreviver aos desafios parasíticos e microbianos. O sistema também é mais relevante para administração das células diferentes em carcinogênese, após infecções virais e nas doenças autoimunes.

[0003] O reconhecimento intercelular é central a tais funções, mas a origem de tal fenômeno é, por si só, pouco entendida. Após eras de diversificação da biota sexual primordial, os genes devem ser envolvidos para garantir o reconhecimento específico pelas espécies das células sexuais ("fertilização"). Se não, a viabilidade das espécies sexuais seriam ameaçadas. Diversas moléculas de reconhecimento celular envolvidas. Quando a biota de saw da era Cambriana invade os biotipos terrestres, tais biotipos áridos favoreceram aumentadamente uma restrição de fertilização sexual a vírions abrigados com menos chance de confusão de espécies. Consequentemente, os genes para o reconhecimento do gameta específico por espécies tende-se a tornar abundante e deste modo será liberada para adquirir nova funcionalidade na evolução.

[0004] Uma nova função óbvia pode ser uma capacidade dos organismos distinguir suas próprias células (próprias) a partir das células estranhas (não próprias). É proposto que este mecanismo forneça uma análise racional para a origem do sistema de imunidade celular, um fenômeno que é de outra maneira pouco explicado. Tal distinção pela imunidade inata (Medzhitov & Janeway, 1997, Cell, 91(3), p295-298) é essencial para os organismos multicelulares a fim de evitar sua canibalização pelos parasitas e micróbios. O mal funcionamento dos sistemas para distinguir “próprio” de “não próprio”, pode formar a base de algumas doenças autoimunes.

[0005] As respostas imunes mal orientadas que são referidas como autoimunidade podem ser demonstradas pela presença de autoanticorpos ou linfócitos T reativos com antígenos hospedeiros. Enquanto é usualmente inofensivo e provavelmente um fenômeno universal da vida vertebrada, a autoimunidade pode ser a causa de um amplo espectro de doença humana, conhecida como doenças autoimunes. O conceito de autoimunidade como o caso da doença humana é relativamente novo e não foi aceito na tendência atual de opinião médica até o 1950s e 1960s. As doenças autoimunes são definidas como doenças em que a progressão de autoimunidade benigna a autoimunidade patogênica ocorre. Esta progressão é determinada tanto pelas influências genéticas quanto causadores ambientais.

[0006] As doenças autoimunes são a ameaça principal a saúde. Existem mais do que oitenta doenças causadas pela autoimunidade. Estas são uma ameaça especial as mulheres; cerca de 75 % dos pacientes são mulheres. As doenças autoimunes estão entre as dez causas principais de morte entre as mulheres em todos os grupos de idade até os 65.

[0007] As doenças autoimunes afetam muitas partes diferentes do corpo incluindo a pele (por exemplo, alopecia areata, pemfigóide bolhosa, epidermólise bolhosa acquisita, penfigo foliáceo, penfigo vulgar, vitiligo, psoríase e acne), rim (por exemplo, nefropatia IgA), sangue (por exemplo, anemia aplástica, anemias hemolíticas autoimunes, púrpura trombocitopênica idiopática e anemia perniciosa), juntas (por exemplo, espondilite ansilosante), músculos (por exemplo, polimiosite/dermatomiosite), ouvido (por exemplo, perda da audição autoimune e síndrome de Meniere), olhos (por exemplo, úlcera de Mooren, síndrome de Reiter e doença de Vogt-Koyanagi-Harada), coração (por exemplo, miocardite autoimune, síndrome de Churg-Strauss, artrite de células gigantes, doença de Kawasaki, poliartrite nodosa, artrite de Takayasu e granulomatose de Wegener), sistema de endocrina (por exemplo, doença de Addison, hipoparatiroidismo autoimune, hipofisite autoimune, ooforite autoimune, orquite autoimune, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, tipo 1 de síndrome autoimune poliglandular (PAS-1), tipo 2 de síndrome autoimune poliglandular (PAS-2), tipo 3 de síndrome autoimune poliglandular (PAS 3) e diabete melito tipo I), sistema gastroentérico (por exemplo, hepatite autoimune, doença celíaca, doença inflamatória do intestino e cirrose biliar primária), sistema nervoso (por exemplo, polineuropatia de desmielinação crônica inflamatória, síndrome de Guillan-Bane, esclerose múltipla e miastenia grave) ou pode afetar o corpo sistemicamente (por exemplo, síndrome de antifosfolipídeo, limfoproliferativa autoimune, poliendocrinopatia autoimune, doença de Bechet, síndrome de Goodpasture, artrite reumatóide, sarcoidose, escleroderma, síndrome de Sjogren e lupus eritematoso sistêmico).

[0008] As doenças autoimunes podem atingir qualquer parte do corpo e deste modo os sintomas podem variar amplamente e o diagnóstico e tratamento são dificuldades frequentes. Algumas das doenças autoimunes podem ser ameaçar a vida a não ser corretamente diagnosticada e tratada. As doenças autoimunes crônicas semelhantes a artrite reumatóide aleijam o paciente e também criam grandes responsabilidades nas famílias dos pacientes. Alguns tipos de uveíte podem causar cegueira. As doenças tal como escleroderma requer tratamento hábil, vitalício. Ainda outras doenças autoimunes, incluindo doença de Graves e tiroidite crônica, podem ser sucessivamente tratadas se corretamente diagnosticada, mas estas são frequentemente encontradas por causa de seu início discreto.

[0009] A inflamação é um processo normal em que as células brancas sanguíneas corporais e químicas protegem o corpo da infecção e das substâncias estranhas tal como bactéria e vírus. Em algumas doenças, entretanto, o sistema imune corporal inapropriadamente causa uma resposta inflamatória quando não existe substância estranha para combater. A inflamação é deste modo comum nas doenças autoimunes, mas não todas as doenças inflamatórias são respostas autoimunes. As Doenças inflamatórias também podem ser causadas por uma variedade de agentes que diretamente atacam o corpo tal como microorganismos (vírus e fungos), toxinas bacterianas, certos agentes farmacêuticos (antibióticos e esteróides anti- inflamatórios) e agentes químicos (sais de bile, químicas domésticas tóxicas). As doenças que são associadas com inflamação incluem artrite (que é um termo geral que descreve a inflamação nas juntas), inflamação do coração (miocardite), inflamação dos tubos menores que transportam o ar aos pulmões (que podem causar um ataque de asma), inflamação dos rins (nefrite) e inflamação do intestino grosso (colite).

[0010] Os distúrbios inflamatórios gastrointestinais são de interesse particular (por exemplo, doenças inflamatórias gástricas (tal como úlcera gástrica, úlcera duodenal e gastrite) e doenças inflamatórias intestinais (incluindo doença de Crohn, doença inflamatória de intestino, psilose tropical e não tropical, enterite infecciosa, colite, colite ulcerativa, colite pseudomembranosa, diverticulite e doenças inflamatórias alergênicas e radiológicas).

[0011] As doenças inflamatórias gastrointestinais são caracterizadas pela inflamação, especificamente pela presença de edema, células inflamatórias características (isto é, leucócitos, histiócitos e macrófagos) e, em alguns casos, necrose e ulceração do epitélio de superfície. Estas doenças inflamatórias são conhecidas serem causadas por uma ampla variedade de agentes presentes no trato gastrointestinal que são conhecidos atacar as superfícies destes, produzindo a resposta da doença inflamatória. Tais agentes incluem microorganismos (vírus e fungos), toxinas bacterianas, certos agentes farmacêuticos (antibióticos e esteróides anti-inflamatórios) e agentes químicos (sais de bile, químicas domésticas tóxicas). Entretanto, o ácido gástrico por si só é capaz de atacar o revestimento do estômago e produzindo o estado inflamatório.

[0012] Geralmente as medicações usadas para o tratamento da inflamação incluem medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs - tal como aspirina, ibuprofeno ou naproxeno), corticosteróides (tal como prednisona), medicações anti-malarial (tal como hidroxicloroquina) e outra medicações tal como metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicações anti-TNF, ciclofosfamida e micofenolato. Algumas doenças gastrointestinais, especificamente doenças gástricas, podem ser tratadas pela inibição da secreção do ácido gástrico que causa a inflamação, tal como pela neutralização os efeitos do ácido (por exemplo, administração antácido), ou pela administração de um agente farmacológico efetivo para inibir a secreção do ácido gástrico.

[0013] A pele danificada é vulnerável a infecção e pode ser disforme e/ou causar dor e desconforto. Alguns tipos de feridas são resistentes a cura sob condições fisiológicas normais, por exemplo, úlceras crônicas. Quaisquer soluções farmacêuticas para reparar a pele danificada, particularmente para reparar as feridas são muito desejáveis.

[0014] Permanece uma necessidade para os tratamentos adequados para o tratamento autoimune e distúrbios inflamatórios e condições ou dano na pele com efeitos colaterais mínimos.

[0015] Após muitos anos de exploração os processos potencialmente envolvidos na evolução da eucariota os inventores identificaram uma nova proteína (neste referido como leucolectina), - não apenas nos gametas e no zigoto, mas também no embrião precoce (nas células especializadas denominadas lectócitos) e durante a ontogênese das células sanguíneas e finalmente, em leucócitos.

[0016] Inicialmente a proteína foi identificada e purificada a partir do peixe (ver os Exemplos). A proteína tem 255 aminoácidos. Este é a forma de propeptídeo de lectina, que contém 19 aminoácidos de peptídeo de terminal N que sugerem que este é alvejado ao lisossomo para a última secreção (isto é no espaço de perivitelina).

[0017] A sequência de aminoácido de lectina permite o desenvolvimento dos anticorpos específicos por epítopo, que tornar-se capaz da identificação de muitas isoformas de aparência (2-8) da proteína (Figura 5), dependendo do tecido analisado. Pelo menos dois mRNAs foram isolados a partir do salmão (ver Exemplo 11), que contém diferenças da sequência menor que resultam em apenas 7 mudanças no nível de polipeptídeo (Figura 17). As formas truncadas da proteína também foram identificadas a partir dos leucócitos de salmão (ver SEQ ID No: 2) e peixe paulistinha, em que uma forma secretado (como descrito acima, denominado sLL) e uma forma truncada que está perdendo os primeiros 32 aminoácidos a partir do terminal N, denominado tLL (ver Exemplo 9) foram identificados.

[0018] A proteína carrega pouca semelhança as quaisquer proteínas conhecidas, que mostra similaridade total de menos do que 50 % em qualquer proteína conhecida. Alguma similaridade foi observada em domínios menores a taquilolectinas.

[0019] As proteínas relacionadas foram identificadas em vários animais, incluindo peixe paulistinha, bacalhau, truta arco-íris, Oikopleura dioica e também galinha e humanos. Seus cDNAs foram identificados (ver os Exemplos) e foram observados serem extremamente bem conservados. As proteínas codificadas nas espécies que foram examinadas mostra menos do que 4 % de diferença. Estes pontos a uma função essencial para estas proteínas.

[0020] Nenhum gene com sequência similar foi relacionado em quaisquer organismos até agora. Usando sondas aos éxons ou íntrons individuais, foram estabelecidos que existem apenas a similaridade rara de um éxon a partes de duas outras proteínas relacionadas, ambos de que são totalmente desiguais a entidade molecular descrita neste.

[0021] Importante, este novo gene é especificamente expressado em leucócitos humanos, apesar do fato que este gene não deve ser observado nas sequências publicadas do genoma humano. Apenas mais segmentos curtos deste gene podem ser detectados mas expandidos em cromossomos humanos múltiplos (ver os Exemplos). A resolução deste enigma ainda não está próxima.

[0022] Finalmente, foi descoberto que a entidade molecular é secretada pelas células, que é consistente com a forma de pro-peptídeo da proteína. Tanto na forma natural quanto recombinante do produto do gene foram isolados.

[0023] Estas proteínas tem surpreendentemente sido observado os efeitos pronunciados nos distúrbios autoimunes e inflamatórios, particularmente da pele ou outras condições da pele. Enquanto não desejar ser ligado pela teoria este é acreditado que a leucolectina liga-se aos receptores específicos que apresentam em moção os processos de cura inerente e normal do corpo humano. A partir dos efeitos observados propomos que a leucolectina participa no processo normal da imunidade celular. A leucolectina parece estar perdida em muitos estados de doença, de modo que sua introdução farmacêutica causa outras respostas defensivas do sistema imune para realizar normalmente na face de vários desafios: a presença de células estranhas (micróbios, parasitas) e de células alteradas “por si só” que podem ligar a leucolectina a etiologia das doenças auto-imunes, isto é, tais condições podem ser causadas pela ausência da leucolectina suficiente.

[0024] Os leucócitos humanos contém e expressam extremamente as proteínas de leucolectina conservadas. Até agora, estas proteínas são proteínas conhecidas nas células sanguíneas. A leucolectina parece ser um novo membro da família de taquilolectina das proteínas.

[0025] Em um primeiro aspecto a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido como apresentado em qualquer uma das sequências Nos. 1-8 ou uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência ou uma porção de qualquer das ditas sequências.

[0026] Os "polipeptídeos" como referidos neste são moléculas com preferivelmente mais do que 50, 100, 150, 200 ou 250 resíduos e/ou menos do que 500, 400, 300, 200 ou 100 resíduos ou uma faixa selecionada destes. Como referidos neste uma "porção" preferivelmente compreende pelo menos 30, 40, 50, 60,.70, 80, 90, 100, 150, 200 ou mais aminoácidos da sequência de que este é derivado. A dita porção pode ser obtida de porções de terminal C ou terminal N ou central da sequência. Preferivelmente a dita porção é obtida da extremidade do terminal N, por exemplo, do primeiro 50, 100 ou 150 resíduos do polipeptídeo. Os aspectos preferidos incluem truncações dos ditos polipeptídeos, por exemplo, para remover um peptídeo sinal ou porção ausente nas variantes de ocorrência natural. As truncações preferidas ocorrem na extremidade do terminal N e são de 1 a 50, por exemplo, 1 a 10, 20, 30 ou 40, ou 5 a 40, por exemplo, 10 a 35 resíduos em comprimento.

[0027] Preferivelmente a dita sequência é pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntica à sequência em que este é comparada.

[0028] A identidade de sequência pode ser determinada, por exemplo, usando o banco de dados da sequência de proteína SWISS-PROT usando FASTA pep-cmp com um pamfator variável e série de penalidade de criação de fenda a 12,0 e série de penalidade de extensão de fenda a 4,0 e uma janela de 2 aminoácidos. Preferivelmente a dita comparação é feita no comprimento total da sequência, mas pode ser feita em uma janela menor de comparação, por exemplo, menos do que 200, 100 ou 50 aminoácidos contínuos.

[0029] Preferivelmente a dita identidade de sequência diz respeito aos polipeptídeos são funcionalmente equivalentes aos polipeptídeos que são apresentados nos Nos de sequência citados. Tais polipeptídeos funcionalmente equivalentes podem tomar forma de derivados como apresentados abaixo. Similarmente, os polipeptídeos com as sequências como apresentados no Nos de sequência. pode ser modificada sem afetar a sequência do polipeptídeo como descrito abaixo.

[0030] Além disso, "porções" como descrito neste pode ser equivalente funcionais. Preferivelmente estas porções satisfazem as condições de identidade (relativa a uma região comparável) mencionadas neste.

[0031]Como referido neste, para atingir "equivalência funcional" o polipeptídeo pode mostrar alguma eficácia reduzida na realização da função médica relativa a molécula precursora (isto é a molécula no qual este é derivada, por exemplo, pela substituição de aminoácido), mas preferivelmente é como eficiente ou mais eficiente. Deste modo, a equivalência funcional diz respeito a um polipeptídeo que é efetivo para tratar a doença como referido neste, isto é para reduzir um ou mais sintomas do paciente, por exemplo, inflamação ou a aparência da pele como descrito anteriormente neste. Este pode ser testado pela comparação dos efeitos do polipeptídeo derivado relativo ao polipeptídeo no qual este é derivado em uma maneira qualitativa ou quantitativa, por exemplo, pela realização da análise in vivo referido nos the Exemplos. Onde os resultados quantitativos são possíveis, o derivado é pelo menos 30, 50, 70 ou 90 % tão efetivo quanto o polipeptídeo precursor. Alternativamente, o teste in vitro pode ser realizado, por exemplo, pela análise da ligação as células dendríticas ou os efeitos nas culturas celulares in vitro.

[0032] As proteínas funcionalmente equivalentes que são relacionadas a ou derivadas da proteína de ocorrência natural, pode ser obtida pela modificação da sequência de aminoácido natural pela substituição de aminoácido simples ou múltiplo, adição e/ou anulação (contanto que este satisfaça os requerimentos da identidade de sequência mencionados acima), mas sem destruir a função das moléculas. Preferivelmente a sequência natural tem menos do que 20 substituições, adições ou anulações, por exemplo, menos do que 10, 5, 4, 3, 2, ou 1 tal modificação. Tais proteínas são codificadas pelas "moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes" que são gerados pela substituição, adição e/ou anulação apropriado de uma ou mais bases.

[0033] Os equivalentes funcionais preferidos são variantes de "adição" em que as proteínas ou polipeptídeos de fusão do terminal carbóxi e/ou amino ou polipeptídeos são gerados, que compreendem uma proteína ou polipeptídeo adicional fundido ao polipeptídeo precursor.

[0034] Particularmente variantes funcionalmente equivalentes preferidos são variações biológicas naturais (por exemplo, variantes alélicas ou variações geográficas dentro de um espécie ou alternativamente no gênero diferente, por exemplo, plantas, animais ou bactéria) e derivados preparados usando técnicas conhecidas. Por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos que codificam proteínas funcionalmente equivalentes podem ser produzidas pela síntese química ou na forma recombinante usando as técnicas conhecidas de mutagênese direcionada ao local incluindo anulação, mutagênese aleatória ou clivagem enzimática e/ou ligação dos ácidos nucleicos.

[0035] A presente invenção também fornece sequências de nucleotídeos que codificam os ditos polipeptídeos.

[0036] Em um aspecto preferido, a presente invenção deste modo fornece uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo como apresentado em qualquer uma das sequências Nos. 9-15, uma sequência que é pelo menos 50 % idêntica à dita sequência ou uma sequência que hibridiza-se à dita sequência sob condições de ligação não estringentes de 6 x SSC/50 % de formamida em temperatura ambiente e lavagem sob condições de estringência alta, por exemplo 2 x SSC, 65°C, em que SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sódio, pH 7,2, ou uma sequência complementar a qualquer uma das sequências já mencionadas ou uma porção da mesma Preferivelmente a dita molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo como apresentado anteriormente.

[0037] As "moléculas de ácidos nucleicos" como referidos neste são moléculas com preferivelmente mais do que 150, 300, 450, 600 ou 750 bases e/ou menos do que 1500, 1200, 900, 600 ou 300 bases ou uma faixa selecionada destes. As "porções" como referidas acima, preferivelmente compreendem pelo menos 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 450 ou 600 bases de nucleotídeos da sequência no qual este é derivado. Preferivelmente as dita porções que codificam os peptídeos de terminal C, central ou terminal N como descrito anteriormente. Como debatido acima em relação aos polipeptídeos, em um aspecto preferido as truncações resultantes na remoção dos resíduos a partir da extremidade do terminal N dos polipeptídeos relatados é considerado. Nas sequências codificadoras de nucleotídeos, relativo as sequências apresentadas neste, a dita truncação é preferivelmente de 1 a 150, por exemplo, 1 a 30, 60, 90 ou 120, ou 13 a 120, por exemplo, 28 a 105 bases em comprimento.

[0038] Preferivelmente a dita sequência é pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % idêntica à sequência no qual esta é comparada.

[0039] A identidade de sequência pode ser determinada por, por exemplo, FASTA Search usando embalagens GCG, com valores default e um pamfator variável e série de penalidade de criação de fenda a 12,0 e série de penalidade de extensão de fenda a 4,0 com uma janela de 6 nucleotídeos.

[0040] Preferivelmente tal identidade de sequência relaciona ou hibridiza as moléculas de ácidos nucleicos que são funcionalmente equivalentes as to the moléculas de ácidos nucleicos que são apresentadas no No de sequência relacionado. Tais moléculas de ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes podem tomar a forma de derivados como apresentado abaixo e são consideradas funcionalmente equivalentes se estas codificam os polipeptídeos que devem ser equivalentes funcionais considerados de acordo com os testes descritos anteriormente. Os equivalentes funcionais preferidos são aqueles que codificam os polipeptídeos preferidos como apresentados acima, por exemplo, as moléculas de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos observados nos gêneros ou espécies diferentes do que as moléculas específicas mencionadas neste.

[0041] Além disso, as "porções" como descrito neste podem ser equivalentes funcionais. Preferivelmente estas porções satisfazem a identidade (relativa a uma região comparável) ou condições de hibridização mencionadas neste.

[0042] As moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser DNA, cDNA ou RNA filamentados simples ou duplos, preferivelmente DNA e incluem sequências de hibridização substancialmente idênticas e degeneradas como descrito acima. De maneira ideal, entretanto, as moléculas são DNA ou cDNA.

[0043] Os polipeptídeos como descrito acima, incluem aqueles que são modificados sem afetar a sequência do polipeptídeo, por exemplo, pela modificação química, incluindo pela desglicosilação ou glicosilação. Tais polipeptídeos podem ser preparados pela medição de isolamento/pós-síntese do polipeptídeo sem afetar a funcionalidade, por exemplo, certa glicosilação, metilação etc. de resíduos particulares.

[0044] Os polipeptídeos da invenção também podem tomar forma de peptidomiméticos que podem ser considerados derivados em que as características funcionais do polipeptídeo são retidas mas são apresentadas no contexto de uma estrutura diferente, por exemplo, estrutura de não peptídeo. Tais peptidomiméticos foram desenvolvidos bem sucedido e usados para particularmente outras aplicações médicas.

[0045] Os peptidomiméticos, particularmente moléculas não peptídicas podem ser gerados através de vários processos, incluindo projeto de medicamento com base conformacional, triagem, projeto de biblioteca focalizada e química medicinal clássica. Não apenas muitos oligômeros de aminoácidos não naturais ou outros blocos de construção orgânicos serão usados, mas também carboidratos, compostos heterocíclicos ou macrocíclicos ou qualquer molécula orgânica que compreende os elementos estruturais e conformação que fornece uma superfície esletrostática molecular que imita as mesmas propriedades da conformação tri-dimensional do peptídeo e pode ser usado pelos métodos conhecidos na técnica.

[0046] Deste modo os peptidomiméticos podem ter poucas ou nenhuma semelhança a uma estrutura de peptídeo. Os peptidomiméticos podem compreender uma forma de não peptídeo totalmente sintético (por exemplo, com base em uma estrutura de carboidrato com substituintes apropriados) ou podem reter um ou mais elementos de peptídeo em que este é baseado, por exemplo, pela derivação de um ou mais aminoácidos ou substituição de um ou mais aminoácidos com componentes de não peptídeo alternativo. Os modelos semelhantes aos peptídeos incluem pseudopeptídeos e peptídeos cíclicos. Os elementos estruturais considerados redundantes para a função do peptídeo podem ser minimizados para reter uma função de armação apenas ou removida onde apropriado.

[0047] Quando peptidomiméticos retém um ou mais elementos de peptídeo, isto é mais do que um aminoácido, tais aminoácidos podem ser substituídos com um análogo estrutural ou não padrão destes. Os aminoácidos retidos nas sequências também podem ser derivados ou modificados (por exemplo, rotulados, glicosilados ou metilados) contanto que as propriedades funcionais dos polipeptídeos da invenção são retidos. Os peptidomiméticos são referidos como sendo "derivados de" uma certa sequência de polipeptídeo. Para esta é significado que os peptidomiméticos são projetados com a referência a uma sequência de polipeptídeo definido, tal que esta retém as características estruturais do peptídeo que são essenciais para sua função. Estas podem ser as cadeias secundárias particulares do polipeptídeo, ou ligação de hidrogênio potencial da estrutura. Tais características podem ser fornecidas pelos componentes de não peptídeo ou um ou mais dos resíduos de aminoácidos ou as ligações ligam os ditos resíduos de aminoácidos do polipeptídeo podem ser modificadas deste modo para melhorar certas funções do polipeptídeo tal como estabilidade ou resistência de protease, enquanto retém as características estruturais do polipeptídeo que são essenciais para sua função.

[0048] Exemplos de aminoácidos análogos estruturais ou não padrão que podem ser usados são D aminoácidos, amida isósteres (tal como amida N- metil, amida retro-inversa, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinil, (E)-vinil, metilenoamino, metilenotio ou alcano), L-N metilaminoácidos, D-α metilaminoácidos, D-N-metilaminoácidos. Exemplos de aminoácidos não convencionais são listados na Tabela 1.

[0049] Os aminoácidos não padrões que podem ser usados incluem análogos conformacionalmente restritos, por exemplo, tal como Tic (para substituir F), Aib (para substituir A) ou ácido pipecólico (para substituir Pro).

[0050] Os polipeptídeos e as moléculas de ácidos nucleicos debatidos acima incluem derivados que foram modificados, por exemplo, para facilitar seu uso nas aplicações farmacêuticas (debatido acima), por exemplo, pela adição de alvejamento ou grupos funcionais, por exemplo, para melhorar a lipofilicidade, auxiliar no transporte celular, solubilidade e/ou estabilidade. Deste modo os oligossacarídeos, ácidos graxos, alcoóis graxos, aminoácidos, peptídeos ou polipeptídeos podem ser conjugados aos polipeptídeos ou moléculas de ácidos nucleicos anteriormente mencionados. As moléculas de ácidos nucleicos podem estar presentes em um carreador viral como descrito anteriormente.

[0051] Os polipeptídeos também abrangem os derivados na forma de "pró-medicamentos" ou "pró-peptídeos" tal que o componente adicionado pode ser removido pela clivagem uma vez administrada, por exemplo, pela clivagem de um substituinte adicionado através da esterificação que pode ser removida pela ação de esterases. Tais pró-medicamentos incluem precursores naturais das proteínas de ocorrência natural que são clivados por exemplo, pela proteólise para produzir o polipeptídeo de interesse. Tais precursores podem ser inativos na forma precursora mas podem ser ativados pela clivagem proteolítica. As moléculas de ácidos nucleicos da invenção deste modo similarmente abrangem as moléculas que codificam tais pró- medicamentos ou precursores. Os polipeptídeos modificados ou moléculas de ácidos nucleicos como descrito acima podem ser testados para garantir que estes retém a atividade funcional relativo a molécula não modificada pela determinação se estes tem o mesmo ou efeitos médicos similares.

[0052] As moléculas de ácidos nucleicos descritas acima podem ser operavelmente ligadas a uma sequência de controle de expressão, ou umvéiculo ou vetor de clonagem de DNA recombinante contendo uma tal molécula de DNA recombinante. Este permite a expressão intracelular do polipeptídeo da invenção como um produto do gene, a expressão de que é direcionada pelos genes introduzidos nas células de interesse. A expressão do gene é direcionado a partir do promotor ativo nas células de interesse e pode ser inserida em qualquer forma do vetor de DNA linear ou circular para a incorporação no genoma ou para a replicação independente ou expressão/transfecção transiente. As técnicas de transformação ou transfecção adequada são bem descritas na literatura. Alternativamente, a molécula de DNA nua pode ser introduzida diretamente na célula para os usos descritos neste.

[0053] Os vetores de expressão apropriados incluem sequências de controle apropriados tal como, por exemplo, tradução (por exemplo, códons de partida e interrupção, locais de ligação ribossomais) e elementos de controle transcripcional (por exemplo, regiões operadores de promotor, sequências de interrupção de terminação) ligados na estrutura de leitura de comparação com as moléculas de ácidos nucleicos requeridas para o desempenho do método da invenção como descrito anteriormente. Os vetores apropriados podem incluir plasmídeos e vírus (incluindo tanto vírus bacteriófagos quanto eucarióticos). Os vetores virais adequados incluem bacilovírus e também adenovírus, vírus associado ao adeno, herpes e vacina/vírus de varíola. Muitos outros vetores virais são descritos na técnica. Os vetores preferidos incluem vetores de expressão bacterianos e mamíferos pGEX-KG, pEF-neo e pEF-HA. A molécula de ácido nucleico pode convenientemente ser fundida com DNA que codifica um polipeptídeo adicional, por exemplo, glutationa-S-transferase, para produzir uma proteína de fusão na expressão.

[0054] Deste modo observado a partir do aspecto adicional, a presente invenção fornece um vetor, preferivelmente um vetor de expressão, que compreende uma molécula de ácido nucleico como definido acima.

[0055] Outros aspectos da invenção incluem métodos para preparação das moléculas de ácidos nucleicos recombinantes de acordo com a invenção, que compreende inserir as sequências de nucleotídeos que codificam os polipeptídeos da invenção no ácido nucleico do vetor.

[0056] Nos métodos como descrito anteriormente, os polipeptídeos podem ser administrados a uma célula para transfecção de uma célula com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Como mencionado acima, a presente invenção deste modo estende-se as moléculas de ácidos nucleicos que compreendem uma sequência que codificam os polipeptídeos da invenção como descrito neste e seu uso nos métodos descritos neste. Preferivelmente as ditas moléculas de ácidos nucleicos são contidas em um vetor, por exemplo, um vetor de expressão.

[0057] As moléculas de ácidos nucleicos da invenção, preferivelmente contidas em um vetor, podem ser introduzidas em uma célula por quaisquer meios apropriados. As técnicas de transformação ou transfecção adequadas são bem descritas na literatura. Uma variedade de técnicas são conhecidas e podem ser usadas para introduzir tais vetores em células procarióticas ou eucarióticas para a expressão. As células hospedeiras preferidas para este propósito incluem as linhas celulares, linhas celulares eucarióticas ou E. coli, tal como cepa BL21/DE3. A invenção também estende-se as células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas transfectadas ou transformadas contendo uma molécula de ácido nucleico, particularmente um vetor como definido acima.

[0058] Um aspecto adicional da invenção fornece um método para preparar um polipeptídeo da invenção como anteriormente definido, que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico como definido acima, sob condições por meio das quais o dito polipeptídeo é expressado e recuperação da dita molécula produzida desta maneira. O polipeptídeo expressado forma um aspecto adicional da invenção.

[0059] A invenção também estende-se a um polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico como anteriormente descrito. Este pode ser produzido pela expressão de uma célula hospedeira como descrito acima.

[0060] As células contendo polipeptídeos da invenção, mas que foram modificados relativos as células naturais pela introdução direta dos ditos polipeptídeos ou pela expressão do material de ácido nucleico codificado formam os aspectos adicionais da invenção. Preferivelmente os ditos polipeptídeos ou moléculas de ácidos nucleicos não parecem nas ditas células endogenamente, isto é a dita célula é modificada para conter os polipeptídeos exógenos ou material do ácido nucleico.

[0061] A presente invenção também estende-se aos anticorpos (monoclonais ou policlonais) e seus fragmentos de ligação de antígenos (por exemplo, fragmentos F(ab)2, Fab e Fv, isto é fragmentos da região "variável" do anticorpo, que compreende o local de ligação de antígeno) direcionado especificamente aos polipeptídeos como anteriormente definido.

[0062] Tais anticorpos podem ser usados nos métodos descritos anteriormente, em particular os métodos terapêuticos que são descritos.

[0063] Os anticorpos descritos neste podem ser usados in vitro para identificar a presença ou quantidade do polipeptídeo da invenção e pode ser usado diagnosticamente para identificar os distúrbios ou dano à pele como descrito neste associado com níveis aberrantes do dito polipeptídeo, isto é variação relativa aos níveis normais, por exemplo, níveis elevados ou reduzidos do dito polipeptídeo.

[0064] Deste modo, em um aspecto adicional a presente invenção fornece um método de determinação da presença ou quantidade de um polipeptídeo da invenção ou uma porção deste em uma amostra, em que um anticorpo como descrito neste é levado em contato com a dita amostra e a extensão da ligação do anticorpo é indicativo da presença ou quantidade do dito polipeptídeo ou porção deste.

[0065] A amostra que é triada pode ser qualquer amostra conveniente, por exemplo, amostra de sangue ou tecido ou amostra não biológica. Preferivelmente a amostra é derivada de um animal como descrito neste, preferivelmente um humano.

[0066] A presente invenção ainda fornece um método de diagnosticar um distúrbio ou dano à pele como descrito neste em um animal, que compreende pelo menos as etapas de determinação da presença ou quantidade de um polipeptídeo como descrito neste em uma amostra do dito animal, em que a dita presença ou quantidade é diagnosticada ou o dito distúrbio ou dano à pele. O polipeptídeo pode ser detectado por, por exemplo, usando os anticorpos descritos anteriormente. A amostra e o animal são preferivelmente como descritos neste. A quantidade é preferivelmente uma redução no nível do dito polipeptídeo comparado aos níveis normais. O diagnóstico pode ser atingido pela comparação as tabelas padrões de paciente normais comparados aqueles com o distúrbio ou dano à pele sob investigação.

[0067] Os polipeptídeos ou moléculas de ácidos nucleicos usados nas composições e usos da invenção como descrito neste abaixo pode ser obtido ou derivado de fontes de ocorrência natural ou pode ser gerado inteiramente ou parcialmente sintéticos.

[0068] Convenientemente os polipeptídeos e as moléculas de ácidos nucleicos são isolados de acordo com os protocolos descritos nos Exemplos. Tais métodos e os produtos de tais métodos formam os aspectos adicionais da invenção.

[0069] Deste modo em um aspecto adicional a presente invenção fornece um método de isolamento de um polipeptídeo como descrito neste a partir do fluido de incubação (por exemplo, de salmão) que compreende pelo menos as etapas de:a) colocar as ovas em suspensão em um volume mínimo de água (por exemplo, equivalente ao volume de ovas ou menos);b) induzir a incubação rápida, sincronizada das ditas ovas (preferivelmente tal que a incubação é completa dentro de menos do que 2 horas por mais do que 95 % dos embriões);c) filtrar as ovas incubadas para obter o fluido de incubação;d) opcionalmente adicionar uréia sólida ao dito fluido de incubação para permitir a dissociação dos fragmentos de casca de ova e submeter o dito fluido a centrifugação de velocidade baixa;e) realizar a primeira etapa de cromatografia por exclusão, por exemplo, usando uma coluna Superdex 16/60 ou um ultra filtro Biotex 100;f) opcionalmente realizar uma segunda etapa de cromatografia por exclusão, por exemplo, usando uma coluna Superdex 16/60 eg) opcionalmente remover as proteínas de contaminação, tal como zonas e pela cromatografia por afinidade, por exemplo, em uma coluna Benzamidina-Sefarose.

[0070] A invenção ainda estende-se aos polipeptídeos preparados a partir do método descrito acima.

[0071] Quando o polipeptídeo da invenção é obtido de leucócitos é obtido na forma não modificada. Os polipeptídeos obtidos a partir do fluido de incubação de salmão são modificados (pela glicosilação e/ou fosforilação), mas ambas formas são igualmente efetivas nos métodos descritos neste.

[0072] Os polipeptídeos ou moléculas de ácidos nucleicos descritos neste são preferivelmente substancialmente livres de qualquer componente contaminante derivado do material de fonte ou materiais usados no procedimento de isolamento ou em sua preparação sintética. Especialmente, preferivelmente o composto é purificado a um grau de pureza de mais do que 50 ou 60 %, por exemplo, >70, 80 ou 90 %, preferivelmente mais do que 95 ou 99 % de pureza como triado p/p (peso seco). Tais níveis de pureza correspondem a molécula de interesse específica, mas incluem seus produtos de degradação. Onde apropriado, as preparações enriquecida podem ser usadas no qual tem pureza inferior, por exemplo, contém mais do que 1, 2, 5 ou 10 % da molécula de interesse, por exemplo, mais do que 20 ou 30 %. Os polipeptídeos da invenção podem ser purificado por, por exemplo, cromatografia (por exemplo, HPLC, exclusão por tamanho, troca de íon, afinidade, interação hidrofóbica, fase reversa) ou eletroforese capilar.

[0073] Os polipeptídeos da invenção podem ser gerados sinteticamente, por exemplo, pela ligação dos peptídeos sinteticamente gerados menores ou mais convenientemente pela expressão recombinante de uma molécula de ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo como descrito anteriormente.

[0074] As moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem ser sinteticamente geradas, por exemplo, pela amplificação de uma sequência de ácido nucleico como descrito neste tal como a partir da biblioteca de cDNA apropriado.

[0075] Os polipeptídeos, moléculas de ácidos nucleicos ou anticorpos como descrito neste podem ser usados in vitro, por exemplo em uma cultura de órgão ou célula, para afetar as funções imunes nas células.

[0076] Alternativamente os polipeptídeos, moléculas de ácidos nucleicos ou anticorpos podem ser usados ex vivo, em partes do animal ou produtos, por exemplo órgãos ou sangue coletados, células ou tecidos, particularmente quando este é considerado que estes serão introduzidos novamente no corpo no qual estes são derivados.

[0077] Entretanto, os polipeptídeos, moléculas de ácidos nucleicos e anticorpos são preferidos para uso in vivo como debatido em mais detalhes abaixo.

[0078] Os polipeptídeos, moléculas de ácidos nucleicos e anticorpos como descritos neste tem aplicações para o tratamento de vários distúrbios ou condições como descrito anteriormente. A presente invenção deste modo estende-se a uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico ou anticorpo como descrito anteriormente e um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[0079] Para "farmaceuticamente aceitável" ou "fisiologicamente aceitável" é significado que o ingrediente deve ser compatível com outros ingredientes na composição bem como fisiologicamente aceitável ao recipiente.

[0080] O ingrediente ativo para administração pode ser apropriadamente modificado para uso em uma composição farmacêutica. Por exemplo os compostos usados de acordo com a invenção podem ser estabilizados contra a degradação pelo uso dos derivados como descrito acima.

[0081] O ingrediente ativo também pode ser estabilizado nas composições por exemplo pelo uso dos aditivos apropriados tal como sais ou não eletrólitos, acetato, SDS, EDTA, citrato ou tampões de acetato, manitol, glicina, HSA ou polisorbato.

[0082] A molécula de ácido nucleico, polipeptídeo ou anticorpo da invenção pode estar presente nas ditas composições como o único ingrediente ativo ou pode ser combinado com outros ingredientes, particularmente outros ingrediente ativos, por exemplo, para aumentar o efeito terapêutico ou para fazer a composição mais atraente ao consumidor.

[0083] A composição que compreende o polipeptídeo da invenção também pode compreender zonase ou uma enzima relacionada. Como referido neste zonase é uma preparação contendo uma enzima, em que a dita preparação exibe um grupo de proteína em análise SDS-PAGE, com um peso molecular de cerca de 28kDa, obtido por um método que compreende as etapas de:a) ) colocar em suspensão as ovas de salmão em um volume mínimo de água;b) ) induzir a incubação rápida, sincronizada das ditas ovas de salmão;c) filtrar as ovas de salmão incubadas para obter o fluido de incubação;d) adicionar uréia sólida ao dito fluido de incubação para permitir a dissociação dos fragmentos de casca de ova de salmão e submeter o dito fluido a centrifugação de velocidade baixa;e) ainda purificar a dita zonase para submeter o sobrenadante de centrifugação à filtração em gel; ef) ainda purificar a dita zonase pela cromatografia por afinidade em uma coluna Superose 6B® modificada por Benzamidina, em que a dia cromatografia por afinidade é realizada pela realização dos sais concentrados lavados seguidos pela eluição com dioxano, na solução salina concentrada, para extrair zonases ligado à matriz de cromatografia ou as estruturas macromoleculares;em que a dita zonase tem as seguintes propriedades:a) cliva a cromozima X;b) é inibida pela benzamidina;c) cliva as ligações de peptídeo com arginina;d) permanece ativa na presença de uréia 8M, concentrações molares de sal, água destilada e solventes orgânicos, preferivelmente dioxano ou propanol; ee) retém a atividade enzimática na solução em temperatura ambiente por 50 dias.

[0084] A zonase pode ser preparada como descrito nos exemplos e adicionada a uma composição ou pode representar uma "impureza" após a preparação do polipeptídeo da invenção a partir das fontes naturais. Nas composições que compreendem tanto o polipeptídeo da invenção quanto zonase, o polipeptídeo pode estar presente na faixa de 1 a 100 % de seu peso combinado total e zonase pode fabricar de 0 a 99 %. Preferivelmente o polipeptídeo está presente na faixa de 50 a 100 %, por exemplo, >80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 e zonase está presente a 0 a 50 %, por exemplo, < 20, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 % do peso combinado.

[0085] Em um aspecto adicional da invenção, as composições como descrito neste são para o uso na terapia.

[0086] Como mencionado acima, os polipeptídeos, moléculas de ácidos nucleicos e anticorpos da invenção exibem as propriedades terapêuticas no tratamento de vários distúrbios autoimunes e inflamatórios, particularmente da pele bem como o tratamento da pele danificada, por exemplo, pelo sol, frio, irradiação (por exemplo, raio X, tal como quando usado para tratar câncer) ou como um resultado de uma ferida.

[0087] Como referido neste um "distúrbio" refere-se a uma perturbação patológica subjacente em um organismo sintomático ou assintomático relativo ao organismo normal, que pode resultar, por exemplo, a partir da infecção ou uma imperfeição genética congênita ou adquirida.

[0088] Como apresentado nos Exemplos, a utilidade da leucolectina para tratamento de uma variedade de condições inflamatórias, autoimunes e outras condições da pele foi ilustrada. A eficácia similar pode ser esperada para tratamento de outras condições. Por exemplo, inflamação gastrointestinal crônica pode ser explicada por uma reação excessiva à falha de reação (ou talvez em alguns exemplos como) pelas células dendríticas aos agentes nocivos. A introdução de leucolectina, por exemplo, oralmente, portanto deve ser esperado tratar a inflamação GIT crônica em muitos a mesma maneira que a pele inflamada responde favoravelmente a introdução de leucolectina.

[0089] As doenças autoimunes podem diminuir a partir da expressão somática específica das versões mutadas dos antígenos de superfície celular. Sem desejar ser ligado a esta teoria, as leucolectinas podem servir para proteger as células alvos a partir do ataque.

[0090] Como referido neste um "distúrbio inflamatório" é um distúrbio em que a inflamação é observada em algum ponto durante a progressão do distúrbio e pode ser o único sintoma ou um dos diversos sintomas. O distúrbio inflamatório pode ser agudo ou crônico e pode ser como descrito anteriormente ou mencionado acima. Os distúrbios inflamatórios incluem inflamação cardiovascular (por exemplo, ateroesclerose, acidente vascular cerebral), inflamação gastrointestinal (incluindo úlceras tal como úlceras gástricas ou duodenais), distúrbios inflamatórios hepáticos, inflamação pulmonar (por exemplo, asma, dano no pulmão induzido por ventilador), inflamação do rim, inflamação ocular (por exemplo, uveíte), inflamação pancreática, inflamação genitourinária, distúrbios neuroinflamatórios (por exemplo, esclerose múltipla, doença de Alzheimer), alergia (por exemplo, rinite/sinusite alérgica, alergias de pele e distúrbios (por exemplo, urticárias, angioedema, dermatite atópica, dermatite por contato, psoríase), alergias por alimento, alergias à medicamento, alergias à inseto, mastocitose), inflamação esqueletal (por exemplo, artrite, osteoartrite, artrite reumatóide, espondiloartropatia), infecção (por exemplo, infecções bacterianas ou virais; distúrbios inflamatórios orais (isto é perodonte, gengivite ou somatite); feridas nas membranas mucosais e transplante (por exemplo, rejeição de aloenxerto ou xenoenxerto ou tolerância maternal-fetal).

[0091]Os distúrbios inflamatórios preferidos para o tratamento de acordo com a presente invenção são distúrbios inflamatórios da pele tal como Eczema, Acne, Rosacea, psoríase e dermatite por contato, inflamação gastrointestinal e condições das membranas mucosais tal como úlceras ou feridas.

[0092] Como referidos neste um "distúrbio autoimune" é um no qual a imunidade benigna tem progredido a autoimunidade patogênica e pode ser como descrito anteriormente ou mencionado acima. As doenças autoimunes incluem, síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS, que é uma doença viral com um componente autoimune), alopecia areata, espondilite ancilosante, síndrome de antifosfolipídeo, doença de Addison autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença do ouvido interno autoimune (AIED), síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS), púrpura trombocitopênica autoimune (ATP), doença de Behcet, cardiomiopatia, psilose celíaca-dermatite hepetiforme; síndrome de disfunção imue de fadiga crônica (CFIDS), polinueropatia de desmielinação inflamatória crônica (CIPD), penfigóide cicatricial, doença de aglutinina fria, síndrome de crista, doença de Crohn, doença de Degos, dermatomiosite juvenil, lupus discóide, crioglobulinemia misturada essencial, fibromialgia- fibromiosite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, tiroidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopenia idiopática (ITP), IgA nefropatia, diabete melito dependente de insulina, artrite crônica juvenil (doença de Still), artrite reumatóide juvenil, doença de Meniere, doença do tecido conectivo misturado, esclerose múltipla, miastenia grave, anemia perniciosa, poliartrite nodosa, policondrite, síndrome poliglandular, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, febre reumática, artrite reumatóide, sarcoidose, escleroderma (esclerose sistêmica progressiva (PSS), também conhecida como esclerose sistêmica (SS)), síndrome de Sjogren, síndrome do homem rígido, lupus eritematoso sistêmico, artrite Takayasu, artrite temporal/artrite de célula gigante, colite ulcerativa, uveíte, vitiligo e granulomatose de Wegener.

[0093] A "pele danificada" como referido neste inclui pele que foi danificada pelas influências externas tal como calor, irradiação (pela luz de várias microondas tal como raio X ou UV), frio, fricção, ruptura ou um ferimento, por exemplo, resultando a partir de um acidente ou cirurgia. Alternativamente a pele danificada pode resultar a partir da infecção, ou doença ou anomalia genética subjacente. O dano pode ser exibido como rachaduras, vermelhidão, coceira, inflamação, pele calosa, escamas, etc.

[0094] A invenção deste modo fornece um método para tratar ou prevenir um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório ou pele danificada em um animal, em que um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, anticorpo ou composição farmacêutica como descrito anteriormente é administrada ao dito animal.

[0095] Alternativamente estado, a presente invenção fornece o uso de um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, anticorpo ou composição farmacêutica como descrito neste na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório ou pele danificada em um animal.

[0096] Ainda em uma afirmação alternativa, a invenção fornece um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, anticorpo ou composição farmacêutica como descrito neste para tratar ou prevenir um distúrbio autoimune, um distúrbio inflamatório ou pele danificada em um animal.

[0097] Em um aspecto preferido a invenção fornece tais métodos, usos, polipeptídeos, moléculas de ácidos nucleicos, anticorpos ou composições farmacêuticas para tratar ou prevenir um distúrbio autoimune da pele, um distúrbio inflamatório da pele ou pele danificada em que um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, anticorpo ou farmacêutico ou composição como descrito anteriormente é preferivelmente topicamente administrado à pele.

[0098] Preferivelmente o dito distúrbio é eczema, acne, psoríase, inflamação gastrointestinal (tal como na doença de Crohn, colite ulcerosa e outra inflamação crônica), gengivite e inflamação da cavidade oral e esôfago e dita pele danificada é irritada ou inflamada, rachada por frio, queimada pelo sol, calor ou irradiação danificada ou como o resultado de um ferimento.

[0099]Como usado neste, "tratamento" refere-se a redução, alívio ou eliminação, preferivelmente aos níveis normais, de um ou mais dos sintomas ou efeitos do dito distúrbio ou dano por exemplo, presença ou extensão da pele danificada, por exemplo, tamanho relativo do ferimento, inflamação, vermelhidão, coceira, dor etc. relativo aos sintomas ou efeitos presentes em uma parte diferente do corpo do dito indivíduo não paciente ao dito tratamento ou em um indivíduo correspondente não paciente ao dito tratamento.

[00100] A "prevenção" refere-se a prevenção absoluta, ou redução ou alívio da extensão ou período (por exemplo, retardo) do início do sintoma ou efeito. Este pode ser atingido, por exemplo, pelos métodos de terapia do gene, por exemplo, uso de sequências anti-RNA ou não sentido.

[00101] O método de tratamento ou prevenção de acordo com a invenção pode ser vantajosamente combinado com a administração de um ou mais ingredientes ativos que são efetivos no tratamento ou prevenção dos distúrbios ou dano à pele. Deste modo, a composição farmacêutica da invenção pode adicionalmente conter um ou mais de tais ingrediente ativos.

[00102] De acordo já com um aspecto adicional da invenção fornecemos os produtos contendo um ou mais polipeptídeos, moléculas de ácidos nucleicos ou anticorpos como definido neste e um ou mais ingredientes ativos adicionais como uma preparação combinada para uso simultâneo, separado, sequencial na terapia animal ou humano.

[00103] As composições da invenção podem ser formuladas na maneira convencional com um ou mais carreadores, excipientes e/ou diluentes fisiologicamente aceitáveis, de acordo com as técnicas bem conhecidas na técnica usando ingredientes prontamente disponíveis.

[00104] Deste modo, o ingrediente ativo pode ser incorporado,opcionalmente junto com outras substâncias ativas como uma preparação combinada, com um ou mais carreadores, diluentes e/ou excipientes convencionais, para produzir preparações galênicas convencionais tal como tabletes, pílulas, pós, losangos, sachês, cápsulas, elixir, suspensões (como injeção ou fluidos de infusão), emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um sólido ou em um meio líquido), unguentos, cápsulas de gelatina macias e duras, supositórios, soluções injetáveis estéreis, pós embalados estéreis e outros. Polímeros biodegradáveis (tal como poliésteres, polianidro, ácido poliláctico, ou ácido poliglicólico) também podem ser usados para os implantes sólidos. As composições podem ser estabelecidas pelo uso de secagem por congelamento, subcongelamento ou Permazyme.

[00105] Os excipientes, carreadores ou diluentes adequados são lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma de acácia, fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, lactose de cálcio, amido de milho, aglinatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, xarope de água, água, água/etanol, água/glicol, água/polietileno, glicol, propileno glicol, metil celulose, metilidroxibenzoatos, propil hidroxibenzoatos, talco, estearato de magnésio, óleo mineral ou substâncias graxas tal como misturas adequadas ou gordura dura destes. Agentes para obtenção das formulações de liberação sustentada, tal como carboxipolimetileno, carboximetil celulose, ftalato de acetato de celulose, ou polivinilacetato também podem ser usados.

[00106] As composições podem adicionalmente incluir agentes de lubrificação, agentes de umectação, agentes de emulsificação, agentes que aumentam a viscosidade, agentes de granulação, agentes desintegrantes, agentes de ligação, agentes ativos osmóticos, agentes de suspensão, agentes de preservação, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, intensificadores de absorção (por exemplo, agentes de penetração de superfície ou para liberação nasal, por exemplo, sais de bile, lecitinas, tensoativos, ácidos graxos, quelantes), agentes de bronzeamento, solvente orgânico, antioxidante, agentes de estabilização, emolientes, silicone, ácido alfa-hidróxi, demulcentes, agentes anti-espumantes, agentes umectantes, vitamina, fragrância, espessantes iônicos ou não iônicos, tensoativos, enchedores, espessante iônico ou não iônico, sequestrantes, polímero, propelente, agente de acidificação ou alcalinização, opacificador, agentes de coloração e compostos graxos e outros.

[00107] As composições da invenção podem ser formuladas deste modo para fornecer liberação rápida, sustentada ou atrasada do ingrediente ativo após a administração ao corpo pela utilização de técnicas bem conhecidas na técnica.

[00108] A composição pode ser em qualquer forma de dosagem apropriada para permitir a liberação ou para as células de alvejamento particulares ou tecidos, por exemplo, como uma emulsão ou nos lipossomos, niossomos, microesferas, nanopartículas ou outros com o qual o ingrediente ativo pode ser absorvido, incorporado ou ligado. Este pode efetivamente converter o produto a uma forma insolúvel. Esta forma particulada pode superar tanto a estabilidade (por exemplo, degradação) e quanto os problemas.

[00109] Estas partículas podem realizar as moléculas de superfície apropriadas para melhorar o período de circulação (por exemplo, componentes de soro, tensoativos, polioxamina908, PEG etc.) ou porções para alvejamento específico por local, tal como ligantes aos receptores que conduzem as células particulares. As técnicas apropriadas para a liberação de medicamento e para o alvejamento são bem conhecidos na técnica e são descritos em W099/62315.

[00110] O uso das soluções, suspensões, géis e emulsões são preferidos, por exemplo, o ingrediente ativo pode ser realizado em água, um gás, um líquido com base em água, um óleo, um gel, uma emulsão, um emulsão água em óleo ou emulsão óleo em água, uma dispersão ou uma mistura destes.

[00111] As composições podem ser para a administração tópica (por exemplo, a pele), oral ou parenteral, por exemplo, por injeção. Como mencionadas anteriormente, a leucolectina mostra poucas variações entre as espécies diferentes. De fato, foi observado ser invariável em uma população humana saudável e este deve consequentemente permitir o uso de leucolectina, por exemplo, pela administração por injeção nos pacientes, sem disparar uma resposta de anticorpo humoral, em uma maneira similar a uma proteína de insulina que é também invariável na população humana. Portanto, a terapia sistêmica por injeção de leucolectina pode ser usada para tratar as condições descritas neste, particularmente distúrbios autoimunes.

[00112] As composições e administração tópicas são entretanto preferidas e incluem géis, cremes, unguentos, pulverizadores, loções, pomadas, bastões, sabão, pós, películas, aerossóis, gotas, espumas, soluções, emulsões, suspensões, dispersões por exemplo, dispersões de vesícula não iônica, leites e quaisquer outras formas farmacêuticas convencionais na técnica.

[00113] Unguentos, géis e cremes podem ser por exemplo, formulados com uma base oleosa ou aquosa com a adição dos agentes formadores de gel/espessantes adequados. As loções podem ser formuladas com uma base oleosa ou aquosa e em geral também conterá dum ou mais agentes de emulsificação, dispersão, suspensão, espessantes ou corantes. Os pós podem ser formados com a ajuda de qualquer base em pó adequada. As gotas e soluções podem ser formuladas com uma base aquosa e não aquosa também que compreendem um ou mais agentes de dispersão, solubilização ou suspensão. Os pulverizadores aerossóis são convenientemente liberados a partir das embalagens pressurizadas, com o uso de um propelente adequado.

[00114] Alternativamente, as composições podem ser fornecidas em uma forma adaptada para a administração oral ou parenteral. As formas farmacêuticas alternativas deste modo incluem tabletes simples ou revestidos, cápsulas, suspensões e soluções contendo o componente ativo opcionalmente junto com um ou mais carreadores e/ou diluentes convencionais inertes, por exemplo, com amido de milho, lactose, sacarose, celulose microcristalina, estearato de magnésio, polivinilpirrolidona, ácido cítrico, ácido tartárico, água, água/etanol, água/glicerol, água/sorbitol, água/polietileno glicol, propileno glicol, álcool estearílico, carboximetilcelulose ou substâncias graxas tal como gordura dura ou misturas adequadas destes.

[00115] A concentração do ingrediente ativo nas composições da invenção, depende da natureza do composto usado (isto é o polipeptídeo, molécula de ácido nucleico ou anticorpo), o modo de administração, o curso do tratamento, a idade e peso do paciente, a indicação médica, o corpo ou área do corpo a ser tratada e pode ser variada ou ajustada de acordo com as escolhas. Geralmente entretanto, as faixas de concentração para o composto descrito neste é 0,0001, 0,0005, 0,001 ou 0,01 a 25 %, por exemplo, 0,0005 a 15 %, por exemplo, 0,01 a 10 %, tal como 0,1 a 5, por exemplo, 1 a 5 % (p/p da preparação final para administração, particularmente para a administração tópica. As ditas concentrações são determinadas por referência a uma quantidade do composto por si só e deste modo auxílio apropriado deve ser feito levando em conta a pureza da composição. As dosagens simples efetivas podem sustentar na faixa de 0,1 a 100 mg/dia, preferivelmente 2 a 10 mg/dia, dependendo do animal a ser tratado, recebendo como uma dosagem simples.

[00116] A administração pode ser por qualquer método adequado conhecido nas técnicas médicas, incluindo por exemplo administração oral, parenteral (por exemplo, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa) percutânea, bucal, retal ou tópica ou administração por inalação. As formas de administração preferidas serão administradas oralmente, ou mais preferivelmente topicamente. Como será apreciado a administração oral tem suas limitações se o ingrediente ativo for digerido. Para superar tais problemas, os ingredientes podem ser estabelecidos como mencionados previamente.

[00117] Será apreciado visto que o ingrediente ativo para o desempenho da invenção leva a uma variedade de formas, por exemplo, molécula de ácido nucleico (que pode estar em um vetor) ou polipeptídeo, a forma de uma composição e via de liberação variará. Preferivelmente entretanto as soluções líquidas, cremes ou suspensões devem ser utilizados, particularmente por exemplo, para a liberação oral ou administração tópica.

[00118] O polipeptídeo ou as moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem ser usados para as indicações médicas mencionadas acima. Nos últimos métodos de terapia do gene, as moléculas de ácidos nucleicos são preferivelmente fornecidos nos vetores que são adequados para a transfecção/transformação como descrito acima, por exemplo, vetores virais tal como adenovírus usando métodos de terapia do gene conhecidos na técnica para aplicações médicas.

[00119] Os animais no qual as composições podem ser aplicadas ou administradas incluem mamíferos, répteis, pássaros, insetos e peixes (por exemplo, salmão ou bacalhau). Preferivelmente os animais no qual as composições da invenção são aplicadas são os mamíferos, particularmente primatas, animais domésticos, gado e animais de laboratório. Deste modo animais preferidos incluem camundongos, ratos, coelhos, porquinho-da-índia, gatos, cães, macacos, porcos, vacas, cabras, ovelhas e cavalos. Especialmente preferivelmente as composições são aplicadas, ou administradas aos humanos.

[00120] Os seguintes Exemplos são dados por meio da ilustração apenas no qual as figuras referidas são como seguem:

[00121] Figura 1 mostra (A) filtração em gel de zonase de salmão parcialmente purificado para produzir leucolectina. Uma coluna Superdex 16/60 (GE Healthcare) foi conectada a um sistema FPLC e usado com um fluxo de tampão de 1 ml/min por 120 ml. A eluição de proteínas a partir da coluna foi monitorado por UV 280 nm (eixo y direito) e coletado em 1 ml de frações. A atividade de zonase foi medida pela clivagem de Chromozym X a OD406. O peso molecular natural de zonase mede uma ampla faixa com um pico de cerca de 50 kDa. Lectina MW = 30 kDa e (B) identificação de (leuco- ) lectina de salmão pela imunoblotting. As análises de imunoblot de proteína das frações selecionadas obtidas da filtração em gel acima usando um epítopo com base no anticorpo de anti-(leuco-) lectina (ver Fig. 3). Os números da fração são mostrados acima no imunoblots. Os marcadores de peso molecular (kDa) são indicados na esquerda. O peso molecular estimado de lectina corresponde a um obtido pelos outros métodos (ver Fig.3).

[00122] Figura 2 mostra a identificação de células que produzem lectina (lectócitos) em embriões de salmão do atlântico no qual os painéis A, B & C representam as seções transversas através do corpo dos embriões do salmão do atlântico que foram fixos por formalina e embutidos em parafina. A presença de leucolectina foi determinado por meio de um anticorpo anti-LL policlonal de coelho usando método de tingimento de imunoperoxidase (A) ou imunofluorescência indireta (B a C). As células que reagem ao anticorpo anti-lectina podem ser vistas no escuro (A), ou luz (B e C) relativo ao fundamento respectivamente. As numerosas células imunorreativas com características citológicas específicas são vistas na epiderme sem nenhuma restrição espacial junto com o eixo embriônico anterior-posterior. As setas no ponto A&B relativamente as amplas células (lectócitos), facilmente distinguem a partir da sobrevivências das células epidermais. Seus núcleos são basais, enquanto o citoplasma é enchido com leucolectina de modo que as células projetam-se semelhantes aos cogumelos no espaço perivitelino. O painel 2C mostra seus conteúdos granulares.

[00123] Figura 3 mostra alinhamento de Leucolectinas de Humano, Salmão, galinha, Bacalhau e duas traduções a partir de dois contigs que constituem a Família UniGene Ssa.23163, uma coleção de salmão EST. Dos dois contigs, o contig 1 é um que assemelha-se a estrutura primária das leucolectinas a mais. Entretanto, a diferença entre os dois contigs não é amplo, apenas cerca de 80 %.

[00124] Figura 4 mostra os domínios (A) SMART das sequências similares a Leucolectina humana. As sequências de contagem maiores a partir de uma busca BLASTP usando WU-BLAST 2 são apresentadas. As sequências são listadas a partir de mais ao menos um similar.

[00125] a - leucolectina humana, b - leucolectina embriônica de salmão, c - leucolectina leucocítica de salmão (fragmento), d - leucolectina de galinha (fragmento), e - leucolectina de bacalhau (fragmento), f - lectina de ova de peixe de carpa comum (Ac#-P68512), g - ranaspumin-6 de rã tungara (Ac#:B5DCK6), h - peixe paulistinha Zgc: proteína 173443 (Ac#: A8E4Z1). Nota-se que as sequências leucocítica de salmão, leucocítico de galinha e Leucolectinas leucocítica de bacalhau são apenas parciais e não sequências de comprimento total. A versão de comprimento total destas sequências provavelmente assemelhará a estrutura total observada na leucolectina a partir dos leucócitos humanos (a) e embriões de salmão (b) ainda, a origem de Leucolectina, com 5 domínios TECPR consecutivos, ainda mantém para a sequência de rã Tungara, mas não para a sequência do Peixe paulistinha em que apenas 4 domínios TECPR são observados e

[00126] (B) uma representação gráfica de leucolectina com 5 domíniosTECPR. Os domínios TECPR são mais parecidos compostos de 4 beta- filamentos gerando 2 beta-chapas. Existem ligações de bissulfeto THREE: uma é interna em TECPR # 4, a outras duas estão em conexão de arcos, como indicado. Em geral os locais de reconhecimento de açúcar são observados em tais lectinas nas áreas entre os domínios TECPR. A lectina mais próxima relacionada a Leucolectina tem uma especificidade de açúcar conhecida para principalmente N-Acetilglucosamina. A especificidade de reconhecimento de açúcar putativo para Leucolectina permanece ser estabelecido.

[00127] Figura 5 mostra a presença de lectina perivitelina em Leucócitos. Uma varredura de faixa IPG da faixa de pH de 4-7 foi usado na primeira dimensão, enquanto um gel de poliacrilamida a 12,5 % foi utilizado durante a segunda dimensão de eletroforese.

[00128] Nos leucócitos de salmão, apenas duas etapas foram observadas reagir positivamente ao anticorpo policlonal anti-Lectina. Seu peso molecular foi de cerca de 26 kDa, com um pI cerca de 6,5. Leucolectina também pode ser identificada nas preparações de leucócito em outras espécies.

[00129] Em uma preparação a partir do salmão, observamos um número de marcas imunorreativas (enumeradas 1-8), com um peso molecular de cerca de 30 kDa, que mediu uma faixa de pH de pI de 4,9 a 6,5.

[00130] Figura 6 mostra a co-expressão de leucolectina na linhagem mielóide, especificamente na linhagem de monócito-macrófago no peixe paulistinha. O perfil de expressão do gene de (A) Lectina e L-plastina. Peixe paulistinha foi observado expressar a mesma lectina como observamos no salmão. Uma sonda de mRNA de lectina rotulado por fluorescência foi usado junto com uma sonda rotulada por DIG para a sonda L-Plastina mRNA, que é um marcador específico da linhagem de monócito-macrófago. Hibridização in situ rotulada dupla revela a co-expressão de lectina e L-plastina mRNA na mesma célula durante a embriogênese de peixe paulistinha. A idade dos embriões em horas pós-fertilização (pf) no ângulo esquerdo inferior. Os sinais mais luminosos indicam a expressão do gene de L-plastina; os sinais mais escuros indicam a expressão de Lectina.

[00131] O painel A (aspecto lateral) mostra co-expressão de Lectina e L- plastina mRNA nas mesmas células, que formam uma população paraxial e axial dispersada na gema de ova anterior e lateral. A ampliação mais alta (A2) revela morfologia de leucócito típico destas células. Os dados em A1 demonstram a expressão destes dois genes nos grupos bilaterais das células no mesoderma da placa lateral anterior (setas). O painel B revela as mesmas descobertas a 21 h.

[00132] O painel C (24h pf) demonstra a co-expressão dos genes de L- plastina e lectina na massa celular intermediária posterior (duas setas superiores), na região da veia ventral (seta inferior), no número significante de células dispersadas junto com o corpo embriônico e cabeça. Por 24 h pf (C2) a maioria das células co-expressam estes dois genes (ver setas), mas muitas células parecem expressar apenas um ou outros genes. As setas em células C3 indicam a expressão apenas da L-plastina mRNA e

[00133] (B) co-localização celular da proteína de lectina e L-plastinamRNA. Os embriões de Peixe paulistinha (22 h pf) foram analisados pela imuno-histoquímica combinada com ensaio de hibridização in situ para a proteína de lectina (sinal mais escuro) e L-plastina mRNA (sinal mais claro). A hibridização in situ usada por cRNA rotulado por DIG-específico pelo gene de L-plastina, combinado com imunohistoquímica com anticorpo policlonal anti-lectina de coelho.

[00134] Painel A: vista frontal do embrião. O ponto das setas a um grupo de células marcadas pela expressão comum da proteína de Lectina e L- plastina mRNA. A1: ampliação maior do grupo que demonstra a co-expressão do gene de L-plastina e proteína de lectina na mesma célula (setas pretas). Observar poucas células, menores em tamanho com forma circular semelhante aos linfócitos maduros próximos a outra célula com um núcleo segmentado, uma característica morfológica típica de leucócitos neutrofílicos maduros. Os Painéis B, C, D, E ilustram as populações de células dispersadas através do embrião de peixe paulistinha que co-expressam a proteína de lectina e L-plastina mRNA (seta).

[00135] Figura 7 mostra a família de leucolectina. As proteínas de Leucolectina disponíveis de Humano, salmão, galinha e Bacalhau foram reunidos (alinhamento logo da web). A correspondência total dos resíduos AA em uma posição são representados pelos letras grandes, com diminuição do tamanho indicando o grau menor da correspondência. As letras múltiplas indicam variações.

[00136] Figura 8 mostra frações tingidas por coomassie após a purificação da leucolectina recombinante por cromatografia em coluna. As linhas são 1 - sobrenadantes, 2 - através do fluxo, 3 - lavagem, 4 - F1, 5 - F2, 6- mistura de F3, F4 e F5, 7- F6 e 8 - STD.

[00137] Figura 9 mostra (A) experimentos para identificar e estabelecer uma sequência do gene para a Leucolectina de salmão.

[00138] O painel A ilustra duas marcas duplicadas positivas identificadas no filtro n° 6, painéis # 5 e 2, que correspondem precisar o número da placa 257 e 176 e bem coordenadas do clone L-7 e F-7, respectivamente.

[00139] Painel B demonstra uma marca duplicada positiva identificada no filtro n° 3, painel # 6, que corresponde para precisar o número da placa 144 (com base na chapa localizadora de placa) e bem coordenada do clone A- 12 e

[00140] (B) mostra a sequência genômica deduzida do gene deleucolectina (2323 bp). O site de 5 éxons são indicados e como uma consequência, também os íntrons. A localização do início de transcrição para este gene (predição promotora, com base na predição promotora BDGP Neural Network, "P", início de transcrição predita "ST", TATA box "T") e as sequências que especificam a poliadenilação ("PA") no produto do gene são indicados.

[00141] Figura 10 mostra (A) um mapa que apresenta os cromossomos humanos, as posições de BLASTP-hits (ver tabela) são indicados pelas setas, (B) mapa de cobertura da legenda:

[00142] Uma visualização da posição dos acertos BLASTP (barras) na cobertura total da sequência em questão (Leucolectina humana). Aparentemente a soma das sequência observadas cobrem a sequência de Leucolectina inteira, mas o dados claramente não envolvem que este é o gene de leucolectina, C) tabela apresenta os acertos BLASTP e sua posição no genoma humano usando Leucolectina humana como a sequência em questão.

[00143] Figura 11 mostra os efeitos da leucolectina de salmão no epitélio humano. Cultura de controle = A; cultura exposta a Leucolectina = B. O ponto das setas as amplas células parecem na camada basal apenas após a exposição a leucolectina.

[00144] Figura 12 mostra a expressão de proteína de leucolectina em leucócitos. Painel A mostra 12 % de 2D PAGE da proteína purificada, ~2 μg, a partir dos leucócitos de salmão. Painel B mostra 15 % de 2D PAGE da proteína purificada, 0,8 μg, a partir dos leucócitos humanos de membranas LymphoprepTM foram tratados com anticorpo primário policlonal ao salmão LL, antes de ser tratado com anticorpo anti-coelho de cabra e visualizado pelo sistema de detecção intensificado por ECL.

[00145] Figura 13 mostra transcritos de leucolectina de salmão identificados em Northern blots. Painel A mostra RNA total de embriões de salmão do atlântico (370 dd) fracionado em 1,2 % de agarose na presença de formaldeído e sondados com específico por ribosonda rotulado por DIG anti- sentido por LL (720 bp). Painel B mostra análise Northern blot de mRNA (purificado pelos poliT-pérolas magnéticas). A hibridização usada ribosondas rotuladas por DIG geradas da sequência codificadora parcial LL. Painel C mostra a membrana nitrocelulose (B) que foi sondada com ribosonda rotulada por DIG sentido. As setas cinza significam o transcrito presente; os pontos da seta preta a sua ausência. Marcador DIG-RNA I, 0,3-6,9kb (Roche) foi usado.

[00146] Figura 14 mostra uma alinhamento de LL Clustal W com proteínas β-propelentes relacionadas.

[00147] Figura 15 mostra um modelo 3-D de LL. O painel esquerdo mostra duas visões de uma representação 3D de um modelo 3D β-propelente de 5 lâminas de Leucolectina com base na estrutura de Taquilectina 1 de Tachypleus tridentatus (Biesel et al., 1999, EMBO J. 18, pp 2313-2322). O modelo é gerado usando software PyMol v 0.99. os resíduos dos peptídeos epítopos são tirados nas linhas pretas finas em um corpo de proteína.

[00148] Também, as posições de 5 locais de ligação de carboidrato preditos por Biesel et al. (1999) são indicados como fracos mas estruturas de hexose bronzeada sólida. O painel direito mostra representações dos domínios propelentes preditos em LL (parte superior) e em FEL (parte funda), comparado ao domínio propelente consenso.

[00149] Figura 16 mostra a amplificação da sequência de cDNA de leucolectina de peixe paulistinha de comprimento total (LL). O painel A mostra amplicons que foram obtidos usando diversos pares de iniciadores e clonados por RT-PCR. mRNA usado para a transcrição reversa foi extraído de embriões a 24 hpf. Marcador DNA: 100 bp ladder (New England Biolabs). Painel B mostra que 5'RACE PCR resultou na amplificação de dois produtos distintos, respectivamente -500 bp e -400 bp (gerados após um segundo ciclo de amplificação PCR usando iniciador reversp específico por gene e GeneRacer avançado neste iniciador). mRNAs foram coletados a partir dos estágios de desenvolvimento indicados. O Painel C mostra que o peixe paulistinha LL da sequência de cDNA de comprimento total é 1240 nt incluindo uma estrutura de leitura aberta (ORF) de 765 nt. O ORF compreende cinco éxons que são tirados para escalar e mostrar como caixas pretas. A região 5'UTR é apresentada como linha sólida. A sequência de nucleotídeo 5'UTR é mostrada. Os locais de início da tradução ATG na posição +1 e segundo ATG potencial na posição +94, são pontos mais luminosos. Painel D mostra a expressão do LL truncado em vários estágios de desenvolvimento. Painel E mostra que as sequências de salmão e peixe paulistinha são conservadas mais altas ainda na extremidade 3'UTR.

[00150] Figura 17 fornece um resumo dos éxons, domínios e variabilidade da sequência de Leucolectinas a partir do salmão. Os dados da sequência para as leucolectinas diferentes são mostrados em relação as posições de resíduos AA variáveis, resíduos de cisteína (C) e domínios TECPR (a partir dos bancos de dados SMART). As sequência de Leucolectina diferem apenas de sete posições, marcados em caixas. Cinco tais resíduos variáveis ocorrem dentro dos domínios TECPR, enquanto dois são observados próximos a extremidade final do terminal C. As variações incompatíveis com leucolectina-1 ou leucolectina-2 são mostrados sob como leucolectina-3, em que apenas duas posições são definidos neste (# 2 e # 245). Enquanto outras posições não são marcadas, os dados indicam que mais uma destas posições são proximamente idênticas a outras leucolectinas.

[00151] Como é o caso com a lectina de ova de peixe (FEL), as 3 pontes de bissulfeto em LL são preditos para conectar, respectivamente, o primeiro e o último de cisteínas, enquanto o segundo e a última cisteínas forma uma segunda ponte e duas (média) cisteínas dentro do éxon 3 formam a última ponte de bissulfeto. Estas cisteínas estão marcadas em cinza e sublinhadas. Uma cisteína no propeptídeo não envolvido nas pontes de bissulfeto está em éxon 1. Nota-se a perda dos arcos de interconexão entre os primeiro três domínios e a perda da variação em dois arcos que interconectam ao último dos dois domínios TECPR. Três domínios TECPR são codificados por um éxon simples (2 e 3), enquanto dois domínios medem dois éxons. A forma de correlação das extremidades finais de éxons e domínios é notável. Em quatro de cinco domínios, um resíduo Trp ocupa três AA do domínio, enquanto no primeiro domínio TECPR predito, W é o resíduo inicial. Finalmente, os asteriscos marcam os resíduos em que a variante AAs foram observados em ou tanto leucolectina-1 quanto leucolectina-2.

[00152] Figura 18 mostra proteína LL no fluido de incubação dos embriões da Truta arco-íris (Oncorhyncus mykiss), detectados em Western blots. MW padrões são mostrados na esquerda (BioRad 161-0373). As proteínas de fluido de incubação de Truta arco-íris (Linha 1) e proteína de leucolectina de salmão preparada pela cromatografia por afinidade (linha 2) sondada com anticorpo de antileucolectina. Uma proteína de ~26kDa é observado em ambos casos, correspondente ao Mw de LL.

[00153] Figura 19 A, painel esquerdo, mostra leucolectina de Bacalhau entre proteínas observadas no fluido de incubação de bacalhau. O fluido de incubação de bacalhau foi analisado por 15 % de SDS PAGE e suas proteínas constituintes visualizadas pelo tingimento de prata. Linha 1: marcador de proteína (cor BioRad's Dual 161-0374). Linha 2: proteínas de fluido de incubação. O painel direito mostra fluido de incubação de bacalhau, separada por 15 % de análise SDS PAGE, bloted em uma membrana de nitrocelulose e sondada com diluições apropriadas de IgG anticorpo anti-leucolectina policlonal de coelho purificado por afinidade. Linha 1: marcador de proteína (cor BioRad's Dual 161-0374). Linha 2:

[00154] A alíquota do fluido de incubação. Localização de Leucolectina foi localizada usando anticorpo secundário anti-coelho rotulado por peroxidase de rábano silvestre (HRP), intensificado pelo sistema de detecção ECL. Uma proteína imunorreativa de cerca de 26kDa foi detectada. B, mostra o equivalente SDS PAGE e membrana para as proteínas de fluido de incubação de Oikopleura dioica.

Exemplo 1: Identificação e Caracterização de LeucolectinaIsolamento de Proteína

[00155] Durante o curso da análise de componentes de fluido de incubação de salmão, uma nova proteína presente nos embriões foi identificada.

[00156] Um método para preparar zonases parcialmente purificadas que podem ser usadas como o material de partida para o isolamento do polipeptídeo da invenção é fornecido no WO99/29836 que é incorporado deste modo por referência (particularmente Exemplo 1 do método descrito, mas opcionalmente sem a etapa de uréia).

[00157] Tanto a zonase quanto a leucolectina oram purificadas a partir do fluido de incubação de salmão. Para melhorar a concentração de proteína de fluido de incubação, as ovas de salmão foram transferidas a volumes mínimos de água antes da incubação. Incubação altamente síncrona pode ser induzida por temperaturas elevadas (ambiente) ou por desoxigenação (Oppen-Bemtsen et al. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417-430), que produz um volume pequeno de preparação altamente concentrada de zonase bruta e proteínas associadas.

[00158] A purificação inicial de zonase envolveu a filtração de ovas de salmão incubadas através de gaze. O filtrado pode ser congelado por anos sem degradação de zonase significante, antes de ser descongelada e utilizada para a purificação de proteína adicional. Este fato simplifica grandemente a produção de um material de partida para a purificação de zonase de salmão e proteínas associadas, incluindo leucolectina.

[00159] A seguir, a etapa opcional envolveu o ajuste de filtrado de proteína a 4 M de uréia, para dissociar os fragmentos da casca da ova de salmão, que permitiu sua remoção junto com os escombros estranhos pela centrifugação em baixa velocidade 15.000 g; 2 x 15 minutos). Este material não apresentou sinal de coluna de coágulo, que é característico de materiais brutos preparados de maneira diferente da que é descrita acima. Esta preparação de proteína bruta foi adequada para a purificação por técnicas cromatográficas convencionais e a zonase ainda pode ser purificada como descrito no Exemplo 7.

[00160] A leucolectina do líquido de incubação pode ser isolada junto com a zonase. A partir de preparações de zonase parcialmente purificadas (como descrito acima), a leucolectina pode ser isolada pela cromatografia de exclusão como zonase em sua forma natural é substancialmente maior do que Leucolectina. Para uma primeira separação, as colunas Superdex 16/60 com as condições descritas na Legenda da Figura 1 são suficientes, após o que a zonase pode ser removida pela cromatografia por afinidade em colunas de Benzamidina-Sepharose.

[00161] Para preparações em grande escala, o uso de ultrafiltração também é adequada como zonase em sua forma natural não penetra significantemente nos ultra filtros com a exclusão de tamanho de 100 kDa diferente da leucolectina.

[00162] Os tampões usados são Tris milimolar (por exemplo, 10 mM) em pH em torno da neutralidade ou levemente alcalino (pH 7,5 a 8,5), contendo 5 mM de NaCl.

[00163] A extração em grande escala de leucócitos humanos de produtos que estão fora de data nos bancos sanguíneos também é considerada, pelo uso da extração em solventes orgânicos (por exemplo, 80 % de acetona) porque a leucolectina permanece na solução durante este procedimento que precipita a maioria de outras proteínas. A purificação final pelos métodos cromatográficos e de filtração são como acima.

[00164] A proteína isolada também foi observada ser expressada em gametas e no zigoto e, além disso, também no embrião precoce (durante a ontogenia do sistema hemopoiético) e, finalmente, em leucócitos.

[00165] A proteína previamente indefinida foi observada co-purificar com zonase. O tamanho desta nova proteína, estimada por cromatografia sob condições naturais, foi modesta de 30 kDa. (Fig. 1).

Expressão de proteína

[00166] A proteína isolada foi usada para a geração de um anticorpo monoclonal. As células foram analisadas quanto à presença da proteína por meio de um anticorpo anti-LL policlonal de coelho usando-se um método de tingimento de imunoperoxidase ou imunofluorescência indireta. Os resultados são mostrados na figura 2.

[00167] Usando-se o anticorpo, observamos que a nova proteína originada em um tipo celular diferente das células que produzem coriolisinas (enzimas de incubação). A morfologia destas células individuais (denominadas lectócito) é mostrada na Figura e é claramente distinta de células de glândula de incubação (individuais) que expressam coriolisinas.

Análise de Sequência

[00168] Esta nova proteína foi submetida à caracterização padrão, tal como determinação de seus peptídeos trípticos, seguido pelo sequenciamento de Edman direto. A partir do quebra-cabeças de peptídeo, ensaio e construções de erro de iniciadores degenerados ou detecção de um mRNA em embriões de peixe para a produção de cDNA, em que no primeiro mal resultado até o iniciador reversos ser ajustado simplesmente para comparar um cauda de polyA. Desta maneira e com o uso de novas séries de iniciador múltiplo quando estes tornam-se identificados, fomos capazes de identificar pelo menos dois cDNAs de aproximadamente 1200 NT. Estes mostraram-se ser muito similares em sequência, com apenas alguns de resíduos de variante AA. Para ambos, alguma sequência de terminal N foi perdida.

[00169] Usando-se a metodologia de N-RACE, estabelecemos subsequentemente que as sequências acima estabeleceram que as sequências acima pertenceram a uma proteína de 255 aminoácidos, com um polipeptídeo de 19 AA e com um resíduo de triptofano de terminal N não usual na proteína processada. Este último resultado deve explicar as dificuldades maiores na obtenção de uma sequência de terminal N pela análise direta. entretanto, isto foi eventualmente atingido para confirmar os resíduos de terminal N virtual.

[00170] Usando-se a sequência de terminal N da proteína para a pesquisa dos bancos de dados EST, identificamos uma sequência de proteína que claramente representa a proteína nova (Fig. 3).

[00171] A pesquisa dos bancos de dados para a proteína com semelhança a novas proteínas identificadas apenas um candidato algumas vezes similares (Leren, não publicado). Isto é uma lectina de ova de peixe isolada e carpa (Galliano et al., 2003, Biochem., J., 376, p433-440), com uma similaridade total de mais do que 48 % observado por um alinhamento manual das sequências.

[00172] As análises de bioinformática sugeriram que a nova proteína foi uma lectina relacionada com as tectoninas (Leren, não publicado). Na compilação de uma lista de todas as proteínas com estrutura de domínio de TECPR similar, nossa nova lectina parece representar um novo tipo de lectina (Figs. 4A & B). A sequência AA virtual da nova lectina continha cinco domínios TECPR que apresentaram alguma similaridade com taquilolectinas em invertebrados inferiores (Shigenaga et al., 1993, J. Biochem (Tóquio), 114, p307-316).

[00173] A forma de propeptídeo da nova lectina contém um peptídeo de 19 AA que sugeriu seu alvejamento às lisossomas e para a secreção potencial posterior (isto é, no espaço perivitelino).

[00174] A sequência AA virtual da nova lectina permitiu o desenvolvimento de anticorpos específicos de epítopo, que, por sua vez, nos permitiram identificar muitas (2 a 8) isoformas parecidas da proteína (Fig. 5), dependendo do tecido analisado.

[00175] Uma possibilidade é que a pectina encontrada nas células de glândula de incubação (Fig. 6B) é secretada no espaço perivitelino junto com as coriolisinas e que estas possuem modificações de pós-trandução que aumentam seu tamanho aparente e que diminuem seu pI aparente.

[00176] Como o salmão é um peixe tetraplóide e como nossos dados indicam mais do que um gene para Leucolectina em salmão, a série de 8 porções de Leucolectina em preparações de zonase parcialmente purificadas pode ser proveniente de três modificações crescentes de duas proteínas de Leucolectina levemente diferentes, para um total de 4 x 2 ou 8 leucolectinas diferentes. As causas de variação necessitam ser empiricamente verificadas.

[00177] O MW estimado da lectina está em torno de 25 a 30 kDa. O pI estimado para a lectina de salmão correspondente está em torno do pH = 6,5. Os pIs observados (Riste, não publicado) foram do pH 6,5 a 4,9 em lectinas perivitelinas de salmão e do pH 6,4 a 6,6 em lectinas leucocíticas de salmão (a lectina foi identificada por técnicas de Western blotting).Expressão durante o desenvolvimento embriônico

[00178] Usando-se as sondas de nucleotídeo para localizar a expressão da nova proteína durante o desenvolvimento embriônico do peixe, observamos a proteína presente em tipos específicos de células epidérmicas em embriões de peixe. adicionalmente, observamos a expressão da proteína em ambos os gametas bem como no zigoto. Além disso, a proteína foi mostrada estar ausente na maioria das células dos organismos, mas expressado em algumas células embriônicas que sugerem que a proteína pode ser presa à mielopoiese (Figs. 5 e 6). Um tal padrão de expressão é único. Desta maneira, escolhemos o nome "leucolectina" (abreviado LL) para a proteína.Expressão em espécies diferentes

[00179] Uma visão geral do sangue do peixe para galinha para humanos revelou que as leucolectinas estão presentes em leucócitos por toda esta linhagem de vertebrados. Sua presença também pode ser detectada em todos os vertebrados que usam nosso anticorpo policlonal. A descoberta de leucolectinas em leucócitos (humano) sugere imediatamente as funções possíveis para leucolectinas. A Leucolectina ocorre em células que carregam as funções imunes.

[00180] Mais surpreendente foi a inconstância de sequência extrema de leucolectinas durante a evolução (Fig. 7). Usando-se a tecnologia de par de iniciador padrão pudemos detectar cDNAs por toda a linhagem de vertebrados. A análise revelou uma sequência extremamente conservada de peixe para galinha para seres humanos, que deve apontar para funções essenciais para tais genes. A variância entre sequência de peixe e de humano está em torno de 4 % (10 AAs variantes) ou 96 % de similaridade, em que metade das variâncias observadas foram substituições AA conservativas. Por comparação, a uma proteína conhecida satisfatoriamente similar é uma lectina de ova de peixe (FEL) da carpa comum (menos do que 48 % de similaridade).

[00181] O sumário da estrutura LL variante (Fig. 7) define a nova família LL de proteínas. Vemos em torno de 2 % de mudanças não conservativas em AA de peixe para humanos. Claramente, o código dos genes LL para proteínas que são submetidas à seleção evolucionária extrema a fim de manter a invariabilidade de sequência. Isto, por sua vez aponta para funções importantes, mas ainda desconhecidas que evitam a maioria da variação aleatória nos produtos genéticos de originar e manter durante a evolução das espécies.

Preparação de leucolectina recombinante

[00182] O cDNA de Leucolectina de salmão foi clonado a partir de embriões. Os iniciadores de PCR foram projetados para conter o local de restrição NcoI (avançado) e ACC65 I (reverso). O vetor pETM-60 foi digerido com NcoI/ACC65I e os produtos de PCR digeridos foram ligados pela ligação durante a noite. Após a amplificação e sequenciamento de plasmídeo, os vetores de expressão pETM-60 contendo a inserção de Leucolectina verificada por sequência foram transformados em células competentes BL21 (DE3)p Lys e as colônias usadas para inocular 5 mL de LB (= Caldo Luria) para a preparação de estoques de glicerol bacterianos.

[00183] Cultura bacteriana e purificação de proteína: O novo vetorbacteriano pETM60-Leucolectina permitiu a expressão de proteínas recombinantes rotuladas por His fundidas ao terminal C de NusA através de uma sequência de reconhecimento de TEV protease. Estes foram eficientemente purificados pela afinidade metálica e forma insolúvel recuperada após a remoção do parceiro de fusão.Materiais e métodos:Iniciadores superiores e inferiores de PCR: NWA15dPET(#23): NcoI5'-GCA.CCA.TGG.CCA.TGG.GCT.GGG.ACT.GTC.AGG.AGG.TAG.TACH.A15dPET(#13): ACC65I5'-CCG.AAG.CTT.GGT.ACC.ATG.TGT.GCA.CAC.CAT.GGT.GAC

[00184] Tanto o produto de PCR quanto o plasmídeo pETM-60 foram digeridos com enzimas de restrição NcoI e ACC65I e purificados a partir e 1 % de gel de agarose para a ligação.

Ligação de DNA de inserção ao vetor por T4 DNA ligase:

[00185] A T4 ligase foi usada para unir os grupos 5' fosfato e o 3'- hidroxila de moléculas de DNA de filamento duplo usando-se a seguinte mistura:200 ng de DNA de vetor500 ng de DNA de inserção10X tampão de ligase1 μl de T4 LigaseVolume a 10 μl

[00186] A incubação foi em temperatura ambiente durante a noite, e a inativação por calor da ligase foi atingida colocando-se o tubo em banho de água a 65°C por 10 minutos.

[00187] A mistura de ligação foi submetida à eletroporação em células competentes DH5a e as colônias usadas para inocular 5 ml de LB.

[00188] 10 clones foram aleatoriamente coletados para análise. A análisefoi realizada pela digestão de pETM60-Leucolectina com NcoUACC65I.

[00189] A sequência de Leucolectina de inserção foi verificada pelo sequenciamento de pETM60-Leucolectina com os iniciadores #13 e #23. Tradução in vitro de leucolectina

[00190] BL21(DE3)pLysS contém um plasmídeo (pLysS com resistência a cloranfenicol) que codifica a lisozima T7 para reduzir os níveis básicos de T7 polimerase antes da indução. BL21(DE3)pLysS fornece controle mais estrito de expressão de proteína de proteínas tóxicas e é uma cepa para a expressão de proteína de nível alto e indução fácil.

[00191] A etiqueta de fusão usada na expressão e purificação de proteína recombinante foi NusA que tem um tamanho de 495 aa (54,8 kDa) e está localizado no terminal N e é usado para intensificar a solução de proteína que são superexpressado.

[00192] A NusA-Leucolectina foi eficientemente purificada pela afinidade metálica e recuperada na forma solúvel após a remoção do parceiro de fusão.Materiais para a expressão e purificação de NusA- Leucolectina:Placa de canamicinaMeio 2YTG0,4 mM de IPTG (concentração final 0,4 μM.Coluna HisTrap HP (5 ml)A indução foi realizada por 3 horas a 26°C.

Protocolo de purificação:

[00193] Atividade de enzima inerente do sobrenadante NusA- leucolectina antes da purificação: 0,0060/minutos

[00194] Equilíbrio da coluna com 25 ml de tampão B (1 x PBS, 30 mM de imidazol, 0,4 M de NaCl)

[00195] Amplificação da amostra:28 ml do sobrenadante foram filtrados e desgaseificados e 25 ml deste aplicado à coluna.

[00196] A coluna foi lavada com 75 ml de tampão B. A eluição ocorreu com 25 ml de tampão C (1 x PBS, 0,5 M de imidazol, 0,4 M de NaCl), com uma etapa de uma eluição. 1 ml de amostras foi coletado.

Resultados:

[00197] Mais de 98 % da atividade de protease das proteínas recombinantes brutas foi observado no através do fluxo e lavagem. Apenas 1,6 % da atividade de protease foi recuperado nas frações da coluna incluindo os (F6 & F7) com a leucolectina recombinante, identificado pela análise de SDS-PAGE (ver Figura 8). Estas frações continham 0,3 % (níveis básicos de atividade de protease aplicados à coluna).

Conclusão:

[00198] A leucolectina recombinante é desprovida de atividade de serina protease e é, desta maneira, uma lectina verdadeira.

[00199] Os traços de atividade de serina encontradas em algumas preparações de leucolectina de fonte natural (fluido de incubação) deve, portanto, representar traços de zonase.

[00200] A Leucolectina e a Zonase co-existem no fluido de incubação e tendem a copurificar durante os procedimentos mais cromatográficos, mas podem ser separadas pela ultrafiltração final usando-se os filtros biomax de tamanho de exclusão de 100 kDa.

Análise de proteína recombinante

[00201] O LL de salmão recombinante produzido como acima e purificado por SDS PAGE foi analisado pelas técnicas de MS/MS. O espectro de impressão Digital de Massa de Peptídeo de LL foi analisado em Mascot tanto na proteína NCBI quanto nos bancos de dados EST para Actinopterygii sem a descoberta de quaisquer acertos significantes (Riste, não publicado). Estes espectros bem comparados com os espectros LL obtidos das porções de LL embriônicas e leucocíticas eluídas a partir da análise de gel 2D de tais LLs, ainda confirmando a existência de isoformas de LL observadas pelos métodos de gradiente de pH.

Sequência genômica

[00202] No salmão estabelecemos a sequência genômica de genes para a sua entidade de sondar as bibliotecas Bac com uma sonda de 670 NT (um protocolo total também é descrito em detalhes no Exemplo 10). Desta maneira, uma sequência de cDNA de comprimento total para Leucolectina foi disponível a partir do uso de iniciadores degenerados projetados com base na informação derivada das sequências AA de proteína parcial. As amplificações de PCR de cDNA a partir de embriões de 370 dd (graus dia) (isto é, embriões próximo a, mas não em incubação) gerou o amplicon de 630 bp, que foi purificado em gel e sequenciado.

[00203] As sondas específicas do gene de lectina foram usadas para triar uma biblioteca BAC (cobertura 18x; tamanho de inserção médio, 188 kb), que foi tornado disponível pelo consórcio Salmon Genome Project (SGP). As sondas (tamanho de 630 bp) foram preparadas pela incorporação de digoxigenina-11-dUTP (Roche) usando-se o método de PCR. A triagem da biblioteca Bac resultou na identificação de 7 clones positivos caracterizados como A-12/144, L16 /143, P6/76, B-5/70, 0-20/85, L-7/257, F-7/176. As respostas positivas são exemplificadas nos Painéis A&B.

[00204] As respostas específicas dos clones selecionados foram conformadas pela amplificação de PCR usando-se os mesmos iniciadores assim como para a sonda rotulada com DNA usada para a triagem da biblioteca BAC. O tamanho da inserção dentro da sequência do foi estimado pela eletroforese de campo de pulso. Os clones foram sequenciados comercialmente (MWG-Biotech, Alemanha) pelo método aleatório.

[00205] Este trabalho estabeleceu diversos genes intimamente relacionados para leucolectinas no genoma do salmão (tetraplóide) (Figs. 9A e B). Uma variação nas sequências de segmento pareceram sugerir a existência de pelo menos dois genes similares. Estruturalmente, as leucolectinas aparecem como genes normais com 5 éxons e 4 íntrons, em um gene de cerca de 2300 bp do início da transcrição ao local de poliadenilação, um tamanho satisfatoriamente padrão.

[00206] Entretanto, nossos dados nos permitiram determinar que nenhum genoma com uma sequência similar foi relatado em quaisquer organismos até hoje. Usando-se sondas para éxons e íntrons individuais, pudemos estabelecer a apenas a similaridade rara de um éxon com as partes de duas outras proteínas relatadas, que ambas são totalmente diferentes da entidade molecular que descobrimos.

[00207] As pesquisas dos anos de dados indicam que nenhum gene pode ser observado correspondendo à proteína LL, a transcrição de mRNA de LL ou ao gene genômico para leucolectina em cromossomos humanos. Aparentemente, o gene de Leucolectina ainda não é observado em qualquer lugar ou sua sequência ainda não é depositada ou a sequência de gene LL ainda não foi detectada em humanos. Em pesquisas adicionais usamos elementos estruturais pequenos individuais listados na Tabela 2 abaixo, a fim de localizar tais elementos nos dados

[00208] Os resultados indicam que algumas proteínas conhecidas apresentaram algum grau de similaridade com as partes de Leucolectina - os números de cromossomo relevantes são fornecidos. As sequências não localizadas para os cromossomos são estabelecidas como "algum ?".

[00209] O acerto primário foi Transgelina humana, que é uma proteína do músculo liso 22-alfa (SM22-alfa) (WS3-10). A Transgelina é uma proteína de ligação de actina e é um dos marcadores mais novos de músculo liso diferenciado. A função desta proteína ainda não foi determinada. http://harvester.embl.de/harvester/P378/P37802.htm

[00210] Entretanto, o alinhamento de sequências de proteína de Trangelina e Leucolectina apresentaram sequências de consenso mínimas. De outra maneira, alguma similaridade pequena em partes da estrutura LL foi observada com respeito ao receptor de célula T e com uma proteína desconhecida. Importantemente, este novo gene é especificamente expressado em leucócitos humanos, a despeito do fato que este gene não pode ser (ainda) encontrado em sequências publicadas do genoma humano. (alguma expressão também é vista em preparações purificadas de trombócitos humanos). Apenas segmentos muito curtos deste gene podem ser detectados no genoma humano, mas estes segmentos são amplamente disseminados em uma multitude de cromossomos humanos (ver Figura 10).

[00211] O padrão de distribuição observado nos cromossomos é instável. Tais sequências curtas não podem ser relacionadas com o gene LL, se i gene LL humano por si só até agora não foi sequenciado ou localizado em um cromossomo específico. A resolução deste enigma ainda não está próximo. Debate

[00212] Uma nova LL-lectina foi identificada em leucócito humano que é quase idêntico ao LL de peixe ou galinha. O gene LL em salmão é de estrutura padrão mas ainda não é encontrado em seres humanos.Exemplo 2: Aplicações médicas de leucolectinaMateriais e Métodos

[00213] O seguintes estudos foram realizados usando-se a proteína de leucolectina de salmão (referida como LL), preparada como descrito no Exemplo 1. A concentração de LL usada foi de cerca de 1 a 10 microgramas/ml. A Zonase-protease esteve presente com LL em uma razão de 1:100 em uma emulsão de água e óleo de coco (em que mais de 30 % de óleo de coco está presente). A Leucolectina é estável na presença de zonase.

ResultadosA. PELE RACHADA PELO FRIO

[00214] Muitas pessoas experimentam a rachadura sasonal da pele, particularmente nas mãos.

[00215] A aplicação de leucolectina à pele durante o início da estação de frio adia dramaticamente ou, em muitos casos evitou, o início de rachaduras por frio. Este fenômeno foi registrado em uma dúzia de casos. As observações nos efeitos em quebras por fio estabelecidas de LL são menores, mas algo próximo de ferimentos por frio estabelecidos foi revelado.

B. PELE DANIFICADA POR QUEIMADURA SOLAR

[00216] A exposição solar excessiva à pele nua pode causar queimaduras solares e resultar em sensações de calor, vermelhidão, coceira e escamação eventual da pele exposta.

[00217] A aplicação de leucolectina resultou no desaparecimento gradual da vermelhidão em minutos, na cessação da coceira e na não ocorrência eventual de escamação da pele. Estas observações surpreeendentes foram repetidamente observadas em muitos indivíduos.

C. PELE DANIFICADA POR CALOR

[00218] Após o dano direto da pele por calor, a aplicação de leucolectina de salmão pareceu prevenir as consequências normais de tal dano a uma extensão considerável e para impedir o dano se aplicado algum tempo após o dano original e para acelerar a recuperação total.

D. ACNE

[00219] Casos sub-clínicos de acne replicaram em muitos adolescentes por uma cessação imediata de coceira e de vermelhidão. A melhora das acnes per se foi vista em um estudo piloto pequeno de cerca de metade dos casos na aplicação de LL na emulsão de óleo de coco.

E. PSORÍASE TÓPICA

[00220] Pedaços grandes de pele psoriática têm respondido à aplicação de leucolectina de salmão com primeiro, uma quantidade imediata retrocedendo da vermelhidão, seguido pela sensação de coceira drasticamente reduzida. A congregação em excesso de pele calosa retraiu nas primeiras algumas semanas, mas recorreu na cessação da aplicação de LL.

F. FERIMENTOS ABERTOS NA PELE

[00221] As observações foram feitas em voluntários humanos. Estudamos casos de ferimentos abertos e gotejantes crônicos que resultaram de ferimentos curados compressão após a cirurgia de quadril quebrado e que foram observados de maneira mal sucedida por pessoal da saúde por meses e até um ano. As feridas tinhas de meio até dois cm de diâmetro.

[00222] Na aplicação de preparações LL esterilizadas por filtro a ferimentos cronicamente abertos nas extremidades inferiores (pernas), observamos que o gotejamento de líquido dos ferimentos parou após 2 a 3 dias, seguido pelo encolhimento rápido da área do ferimento, os de modo que após 2 a 3 semanas, os ferimentos foram desaparecendo e sendo substituídos por pele normal.

[00223] Dada a natureza dos pacientes com ferimentos aparecendo primeiro longe das extremidades, observamos que os primeiros ferimentos a desaparecerem da maneira acima foram os ferimentos proximais. Interpretamos isto como os ferimentos mais recentemente estabelecidos. Os últimos ferimentos a desaparecerem oram os ferimentos distais próximos ao calcanhar, que são os ferimentos estabelecidos mais. Eventualmente, todos os ferimentos desapareceram.

G. ESTUDOS IN VITRO

[00224] As culturas de epitélio de pele humana diferenciadas foram obtidas da SkinEthics (Nice, France) no dia 16 após a semeadura nos substratos de desenvolvimento de plástico com microporos permitindo o acesso a nutrientes para o tecido epitelial de baixo. Tais culturas apresentam morfologia de pele normal após a diferenciação durante o período de cultura a 37°C. Estas culturas foram mantidas por mais dois dias in vitro de modo que o stratum corneum superior foi exposto ao ar e o stratum basalis ao substrato de desenvolvimento. As culturas paralelas foram movidas em atmosfera úmida a 30°C e apresentadas com um meio de Ca, solução salina tamponada por fosfato contendo Mg por 6 horas com ou sem a presença de 10 μg/ml de leucolectina de salmão. As culturas foram fixadas em formalina e embutidas em parafina de acordo com os procedimentos padrão e tingidas com hematoxilina/eosina. A indução rápida de células basais grandes foi observada na epiderme, com sinais de proliferação celular (Fig. 11). Interopretamos tais resultados sendo casualmente relacionados com os efeitos de cura da leucolectina na pele, em que uma combinação de proliferação celular e diferenciação celular é suficiente para fechar o ferimento e para reestabelecer a integridade epitelial da pele.

Debate:

[00225] Não observamos a expressão de produtos genéticos de Llnas culturas de célula de queratinócitos. Também, as células dendríticas são as únicas células na pele epitelial relacionada com os leucócitos sanguíneos. O acesso normal dos leucócitos à pele epitelial é interferida com algum insulto mecânico ou biológico devido à circulação deficiente, que é em que os ferimentos por compressão frequentemente ocorrem na pele normal. A administração de leucolectina supera esta deficiência e dispara os mecanismos normais de cura na pele.

Exemplo 3: Expressão de proteína de Leucolectina em leucócitos

[00226] O sangue de salmão foi obtido da Industrilab, Univ. of Bergen. O sangue de peixe total foi coletado em tubos heparinizados (Riste, não publicado) e processado de acordo com Miller et al. (1988, Nucleic Acids Research, 16(3) p1215). As amostras de sangue humano foram obtidas da Blood Bank em Haukeland University Hospital, Noruega.

[00227] O sangue humano total foi coletado em tubos tamponados por citrato de 5 ml e processados de acordo com Miller et al. (1988, supra) para a preparação dos leucócitos. Esta preparação ainda foi purificada pelo enriquecimento LymphoprepTM (Axis-Shield PoC, Noruega). O LymphoprepTM foi usado de acordo com este protocolo para a preparação da fração de leucócito humano. Esta fração foi usada para a análise immunoblot, como descrito em Miftari and Walther (não publicado). A análise por 2D PAGE seguiu os procedimentos descritos por MacGillivray and Rickwood (1974, European Journal of Biochemistry, 41, pp. 181-190), com ~l μg de proteína. As proteínas LL destas duas espécies foram visualizadas por 2D PAGE usando-se immunoblots para a detecção específica de proteínas LL e suas isoformas. Os tratamentos com o anticorpo primário policlonal ao LL de salmão seguido pelo anticorpo anti-coelho de cabra, permitiu a visualização de proteínas LL pelo sistema de detecção intensificado por ECL. A especificidade da imunorreação foi testada em aplicação de géis múltiplos de 0,5 a 5 μg de proteína com resultados similares.

[00228] Os leucócitos de salmão apresentam 2 isoformas de LLde MW ~26 kDa, com pI similar às formas mais básicas das 8 formas isoelétricas de LL encontradas em PVF de salmão. É difícil estimar os MWs exatos pela extrapolação de padrões de MW na segunda dimensão de 2D PAGE. Os leucócitos humanos contém um antígeno LL principal de peso molecular de ~30 kDa, que a partir de outras observações está próximo de 27 kDa. O pI ácido corresponde ao pI médio de isoformas de LL de salmão encontrados em PVF (Riste, supra) (ver Figura 12).

Exemplo 4: Transcrições de Leucolectina de salmão identificadas em Northern blots

[00229] As ovas de salmão foram obtidas a partir de um estoque de ninhada de salmão ventilada em Bolaks como (Fusa, Noruega), mantido por gerações múltiplas desde 1975 pela seleção fenotípica e agora parte do estoque de salmão propagado pela Salmo Breed A/S, Noruega.Isolamento de RNA total e de RNA poliadenilado

[00230] O RNA total foi isolado do embrião de salmão nos últimos estágios de pré-incubação (em torno de 370 dd) usando-se o reagente de Trizol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade e a quantidade de RNA total em termos de integridade foi estimado em um gel de formaldeído agarose tingido com brometo de etídio. O RNA total foi quantificado espectrofotometricamente. A fração poliadenilada de RNA (mRNA) foi isolada de 5 a 10 μg de RNA total usando-se o kit de purificação de RNA com pérolas Dynal (Invitrogen).

Construção de sondas

[00231] A sonda de cRNA rotulada por Digoxigenina anti-sentido (DIG) foi gerada pela transcrição de padrões de plasmídeo digeridos por SP 1 com T3 RNA polimerase. A sonda de cRNA rotulada por DIG sentido foi gerada pela transcrição de padrão de DNA de plasmídeo digerido por XhoI com T7 RNA polimerase (sentido) usando-se o DIG RNA Labelling Kit (SP6/T7) (Roche Diagnostics) de acordo com os protocolos do fabricante. As sondas de cRNA anti-sentido e sentido de LL rotulado por digoxigenina (DIG) gerou ~650 bp estendido.

Análise Northern Blotting

[00232] As alíquotas de 0,5 μg de mRNA puro e 1 μg de RNA total foram submetidos à eletroforese e manchados na membrana de nictrocelulose positivamente carregada (Amersham). As membranas foram pré-hibridizadas em tampão DIG Easy Hyb (Roche) a 55°C por 2 h e então hibridizado a 55°C por 16 h, com 1 μg/ml de ribossonda LL. A lavagem foi realizada duas vezes em baixa estringência em 2x SSC com 0,1 % de SDS em temperatura ambiente por 15 minutos cada e duas vezes em estringência alta em 0,1 x SSC com 0,1 % de SDS a 65°C por 20 minutos cada. As membranas foram incubadas em uma solução de bloqueio contendo o tampão de ácido nucleico (pH 7,5) e 1 % de reagente de bloqueio (Roche) e subsequentemente na solução de bloqueio com anticorpo conjugado com fosfatase anti-DIG- alcalina (AP) (Roche) diluído 1:10.000 em temperatura ambiente por 1 hora. Após a lavagem com 100 mM de tampão de ácido nucleico (pH 7,5) contendo 150 mM de NaCl e 0,5 % de Tween 20, a membrana foi equilibrada 2 minutos em tampão de detecção (0,1 M de TrisHCl, 0,1 M de NaCl, pH 9,5 em temperatura ambiente). Os alvos de sonda híbrida foram visualizados por ensaio quimioluminescente usando-se CSPD (Roche) como um substrato e exposição das manchas à película de raio X (Kodak) por 5 a 30 minutos. O marcador de peso molecular de RNA rotulado por DIG (Roche) foi usado.

[00233] A ribossonda específica de LL rotulada por DIG foi usada para estimar o tamanho de transcrições maduras. A análise de Northern blot de RNA total (Figura 13A) revelou uma transcrição principal com o tamanho ~1250 bp e também uma transcrição de faixa mais fraca (~3200 bp) foi observada. A faixa dominante corresponde a uma transcrição da transcrição de LL madura (sem íntron) e traduzível. A análise de Northern blot de mRNA purificado usando-se a mesma ribossonda revelou uma faixa única de ~1250 bp (indicando que o cDNA amplificado esteve próximo de uma sequência codificadora de comprimento total (Figura 13B). Quando as manchas de amostras de RNA e mRNA totais foram incubadas com uma ribossonda específica de LL, a ausência de um sinal de hibridização foi observado indicando que a ribossonda que foi usada foi suficientemente específica (Figura 13C). A transcrição menor (~3200 bp) é maior do que a transcrição LL de comprimento total para o salmão. Dadas as condições específicas para a hibridização, esta entidade provavelmente não reflete uma entidade contendo a informação da sequência LL. Os sinais positivos apenas de sondas anti-sentido e não a partir de sondas sentido, ressaltam a especificidade dos resultados. O tamanho da transcrição de comprimento total acomoda todos os éxons LL descritos acima:

Exemplo 5: Alinhamento de LL com proteínas β-propelentes relacionadas

[00234] As análises de bioinformática foram realizadas nas sequências LL de salmão em comparação com a informação depositada em bancos de sequência públicos.

[00235] A análise Clustal W (Figura 14) indicou que a sequência de aminoácido deduzida de leucolectina de salmão não divide similaridade de sequência significante com quaisquer proteínas relatadas nos bancos de dados. Entretanto, o BLAST revela similaridades a proteínas mais distantemente relacionadas, incluindo FEL, uma lectina derivada de ova de peixe de Cyprinus carpio (Banco de Gene Acess. Nos. P68512) com similaridade total de apenas 48 % (valores E de 2.00 E-50). Além disso, uma proteína hipotética de peixe paulistinha (HPZ;. Nos de Acesso LOC678590) apresentou uma similaridade total de 45 % (valores E de 2,00 E-48). As comparações de sequência também demonstraram que a leucolectina foi 38 %, 28 % e 26 % idêntica a TPL-1 (previamente Lectin L6) de caranguejo ferradura (Acc. NosP82151), tectonina I de Physarum polycephalum) (Acc. Nos 061063) e Tectonina II (061064). (By SwissProt, estes números foram 49, -, 35, 32 e 29 % de identidades respectivamente e valor E para FEL 1 e-51 e para L6, 1 e-40). Nossos dados sugerem uma similaridade mais alta de LL às contrapartes de vertebrado do que as de invertebrado. Não está incluída uma identidade de 30 % de LL com a tectonina humana (proteína contendo repetição de β-propelente (KIAA0329 humano).

[00236] Os alinhamentos múltiplos revelaram que das quatro ligações de bissulfeto bioquimicamente confirmadas em FEL (Galliano et al., 2003, Biochem. J. 376, pp. 433-440), três parecem ser conservadas em leucolectina. A primeira ponte conecta a extremidade do terminal N à extremidade do terminal C de ambas as proteínas. A ponte conecta cisteínas nas posições 3 e 234 em LL (ou 238 em FEL)). A segunda e a terceira pontes conectam Cys 102 a Cys 155 em LL (#157 em FEL) e Cys 132 e Cys 137 tanto em LL quanto em FEL. A quarta ligação de vissulfeto encontrada em FEL de carpa, que envolve Cys 208 (212) e Cys 226 (230) não é encontrada em leucolectina.

Exemplo 6: Modelo 3D de LL (Leucolectina)

[00237] A proteína de leucolectina divide um alto grau de similaridade em termos de arquitetura do comínio TECPR com L6 ou taquilectina 1 (Tachypleus tridentaus), uma lectina de ligação de lipopolissacarídeo bacteriano de hemócitos de caranguejo ferradura e outras proteínas relacionadas com a taquilectina de invertebrado. entretanto, diferenças em termo dos números de domínios, junto com uma mudança leve dos domínios de β-propelente em torno do terminal C da proteína, foram observados. O resumo da informação resumindo a informação de pesquisas de similaridade e das pesquisas SMART, inferimos que a estrutura 3-D total da leucolectina apresenta uma estrutura de proteína de β propelente de 5 lâminas. Nesta base, invocamos o modelo 3D (Biesel et al., 1999, EMBO J., 18, pp. 2313-2322) para dar um modelo de trabalho de como a proteína de leucolectina pode parecer. Esta é apenas uma aproximação, como números de resíduos de uma proteína são fixados iguais aos resíduos no outro. Pesquisas nos bancos de dados SMART indicam uma característica estrutural proeminente da proteína de leucolectina virtualmente traduzida que consiste de cinco repetições tandem, cada uma contendo de 35 a 36 AAs com 32 a 61 % de identidades de sequência internas (Figura 15, painel direto). As tensões de repetição internas da proteína de leucolectina deduzida apresentou similaridade entre elas, sendo, na maioria, de 13 AAs de comprimento. Duas sequências de consenso curtas, XWXXLPGXLKXXXVGPX e GVNKNDXXYXLVG, são altamente conservados em cada repetição. À parte de um estiramento de 20 resíduos na região de terminal N de leucolectina, que não é observado no FEL, ambas as proteínas apresentam um alto grau de similaridade entre o número e a arquitetura de domínio total de domínios TECPR, enquanto divide apenas 48 % de identidade de sequência.

Exemplo 7: Purificação de zonase de fluido de incubação de salmão

[00238] O fluido de incubação de salmão no Exemplo 1 ainda pode ser purificado para a produção de preparação de zonase pura. Uma série de filtração em gel foi suficiente para a separação de zonase dos componentes moleculares maiores no filtrado com uma purificação de 12 vezes com um rendimento melhor do que 50 %. A matriz utilizada pode variar, mas Sephacryl SR-200® foi nossa escolha usual. O tampão foi Tris-HC1 pH 8,0 ou pH 8,5 (0,05 M) ou Tris-Acetato (0,025 M, mesmos pHs). A zonase obtida após os procedimentos de filtração em levaram em conta as porções de zonase predominantes no fluido de incubação.

[00239] A zonase foi purificada a um produto de proteína homogêneo pela cromatografia por afinidade nas colunas de Benzamidina Sepharose 6B® comercialmente adequadas. As condições específicas utilizadas (com volumes de coluna de 25 ou 125 ml) foi novamente um tampão de 0,05 M de Tris-HCl (pH 8 ou 8,5), que, para remover o material não especificamente ligado nas colunas, foi ajustado a 1 M NaCl. A Zonase não foi removida por esta etapa, assim como a proteína permaneceu estritamente ligada à coluna. A eluição de zonase da coluna foi atingida usando-se um gradiente de 10 a 33 % de gradiente de dioxano em 1 M de NaCl no mesmo tampão de Tris-HCl. Após a purificação por afinidade, a preparação de zonase apresentou uma faixa de proteína na análise de SDS-PAGE, com um peso molecular em torno de 28 kDa. Enquanto este produto de zonase que não foi de pureza de grau de sequência foi altamente purificado.

[00240] A zonase purificada por afinidade mais, purificado por filtração em gel ainda foi purificada à pureza de grau de sequência por um procedimento cromatográfico final. Este procedimento utilizou uma coluna PBE94®, com um tampão de Tris-Acetato (10 mM, pH 9,0), em que a eluição subsequente foi com um gradiente de sal (até 1 M de sal de NaCl) neste tampão. Esta etapa, por si só, aumentou a atividade catalítica da por um adicional de 7,6 vezes, para um total - purificação de 714 vezes e com um rendimento de 28 % do material de partida. Esta etapa de purificação deixou a identidade de proteína da zonase intacta como uma porção de 28 kDa.

Exemplo 8: Produção e Purificação de anticorpos LL

[00241] O anti-soro de LL anti-salmão anti-coelho de coelho policlonal foi preparado como segue: A proteína de leucolectina purificada de grau de sequência do Exemplo 1 foi usado para dar origem ao anticorpo policlonal em coelho Chinchilla de 4 kg, como descrito por Harlow and Lane (1988, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Três injeções de 80, 40 e 25 mg de leucolectina de grau de sequência foram colocados em locais subcutâneos múltiplos. O primeiro foi emulsificado com o adjuvante completo de Freund, os dois últimos com o adjuvante incompleto após 3 e 6 semanas. Oito dias após o intensificador final, o sangue foi coletado e o soro preparado após a centrifugação a 3.000 rpm (rotor Sorvail SS-34) por 15 minutos.

[00242] As alíquotas do anti-soro foram armazenadas a -80°C. Os anticorpos primários foram purificados por afinidade usando-se colunas de proteína G de 1 ml HiTrap (Amersham Pharmacia Biotech) com taxa de fluxo de 1 ml/minuto. O anti-soro total foi filtrado através da unidade de filtro de 45 μm antes de ser aplicado a colunas de Proteína G de um ml. O equilíbrio da coluna foi realizado usando-se volumes de 5 a 10 colunas de tampão de ligação (20 mM de fosfato de Na, pH 7,0) seguido por diversas lavagens com o mesmo tampão até nenhuma proteína ser detectada pela absorbância de UV em 280 nm. A fração de IgG foi eluída com 5 ml de tampão de eluição (0,1 M de glicina HCl, pH 2,7) e dividido em 10 tubos contendo 25 μl de tampão de neutralização (1 M TrisHCl, pH 9,0). A concentração foi determinada espectrofotometricamente. A pureza foi estimada pela análise das alíquotas de frações de IgG purificadas em 12 % de SDS-PAGE com tingimento de prata subsequente. A sensibilidade foi determinada pela análise Western blot usando-se IgG anti-coelho de cabra, anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre.

[00243] Adicionalmente, os anticorpos policlonais foram pré-absorvidos em pó de acetona de peixe paulistinha. F(ab')2 anti-coelho de suíno rotulado por isotiocianato de Fluoresceína (FITC) foi da Dako (F-0054). IgG anticoelho de cabra rotulado por Alexa Fluor 647foi obtido da Molecular Probe, Eugene, US (Invitrogen, catálogo n° A-21244) e imunoglobulinas anti-coelho de suíno policlonal biotinilado foi da Dako (catálogo n° E0353). As concentrações ótimas dos anticorpos primários e secundários foram determinados por experimentos de diluição anteriores. Os anticorpos policlonais foram usados na análise da expressão de proteína descrita no Exemplo 1.

Exemplo 9: Identificação e caracterização de LL de peixe paulistinha

[00244] O RNA total foi isolado de embrião de peixe paulistinha em 4, 6, 12, 24, 48 hpf e 5 dph usando-se procedimento de Trizol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade e a pureza de RNA total foi estimada em um gel de formaldeído agarose tingido com brometo de etídio. Apenas amostras com uma razão de 28S a 18S de rRNA de 2 a 2,4:1 e nenhuma contaminação de DNA detectável, foram usadas. O RNA foi quantificado espectrofotometricamente. O mRNA poliadenilado foi isolado de 5 a 10 μg de RNA usando-se kits Dynal (Invitrogen).

[00245] A transcrição reversa foi realizada usando-se 200 U/μl de TermoScript (Invitrogen). O mRNA (0,5 μg) foi aquecido a 72°C por 5 minutos, esfriado, granulado e adicionado a uma mistura de reação de 20 μl de mistura de reação contendo 100 ng/μl de oligo dT, 10 μM de DDT e 0,8 U/μl de inibidor de RNAse em 2,0 mM de tampão de síntese de cDNA (Invitrogen). A incubação foi a 50°C por 1 h.Os produtos foram purificados por extração de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, passados através da coluna MicroSpin S-200HR e precipitado em etanol. Os iniciadores de LL específicos de gene foram projetados a partir de sequências de LL de salmão (Tabela 3). A mistura de PCR (20 μl) continha 2 μl de padrão de cDNA, 0,4 μM de iniciadores (LLF1, LLF2, LLR1, LLR2 e LLR3), 1 x tampão de PCR, 0,5 U de Taq DNA polimerase (Takara) e 0,2 mM de dNTPs. A amplificação de PCR usou 32 ciclos de 94°C por 45 s / 58°C por 45 s / 72°C por 90 s e extensão final em 72°C por 7 min. A mistura de reação foi analisada por 1,8 % de gel de agarose-TBE com 0,5 μg/ml de brometo de etídio em 1 x tampão de TBE (pH 8,3) com marcador de DNA 100 bp ladder (New England Biolabs).Tabela 3: Iniciadores usados para a amplificação de LL de peixe paulistinha

[00246] O fragmento de PCR foi ligado em um pGEM T-Easy Vectorsystem 1 (Promega, Madison, WI) por protocolos padrão.

[00247] A eletroporação usou 40 μL de E. coli DH5a e 1 μl de fragmento de PCR ligado no vetor pGEM T-Easy. O meio SOC (1 ml) foi adicionado antes das bactérias serem incubadas a 37°C por 1 hora. As bactérias recombinantes (200 μL) foram colocadas em placas de ágar com LB/ampicilina, X-gal, IPTG padrão e incubado a 37°C durante a noite para a triagem azul/branco. Dez clones brancos foram coletados e desenvolvidos em uma cultura de 5 ml durante a noite em meio LB com 100 μg/mL de ampicilina. A purificação de plastídeo usou o kit Plasmid Minipurification (Qiagen, Chatsworth, CA). Os plasmídeos foram amplificados e sequenciados usando-se os protocolos padrão (DNA Sequence Lab, Bergen).

[00248] 5'- e 3'-RACE PCRs de LL foram realizados usando-se o kit de núcleo GeneRacer (Invitrogen cat. #45-0168) de acordo com as instruções. 2 μg de RNA total foi usado para sintetizar o cDNA de primeiro filamento em RT usando-se Superscript III (Invitrogen). A primeira série de amplificação de 5'- e 3'-RACE PCR foi realizada aplicando-se o iniciador 5'- ou 3'-GeneRacer e iniciador específico de reverso ou avançado LLR2 & LLF3 (Tabela 3). A amplificação de 5'- ou 3'-RACE PCR aninhado utilizou o iniciador 5'- ou 3'-RACE PCR aninhado GeneRacer e iniciador específico de gene reverso ou avançado aninhado LLR4 & LLF4. Para 5'- e 3'-RACE PCR, o primeiro ciclo de cinco etapas, 94°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto; cinco ciclos seguintes a 94°C por 30 segundos e 70°C por 1 minuto; terceira etapa 30 ciclos com 94°C por 30 segundos e 68°C por 45 segundos e 72°C por 1 minuto; etapa de extensão final 72°C por 7 minutos. 5- ou 3'-RACE PCR aninhado em três etapas: primeiros ciclos da etapa 5 a 94°C por 30 segundos, 72°C por 2 minutos; seguintes ciclos de 5 etapas 94°C, 30 segundos, 70°C 2 minutos; 3 ciclos de 25 etapas 94°C por 30 segundos, 65°C por 30 segundos e 68°C por 1 minuto; etapa de extensão final 72°C por 10 minutos. Os padrões para PCR aninhado usou o produto de PCR a partir da primeira série de RACE PCR diluído 1:25 em água destilada.

[00249] Os iniciadores para RACE PCR são listados na Tabela 3. Os produtos de PCR simples foram purificados usando-se o kit de purificação de PCR (Promega, Madison, WI, US) e ligado em vetor de PCR II Topo (Invitrogen) para a transformação de E. Coli competente de eficiência alta JM109 (Invitrogen). As bactérias recombinantes foram identificadas pela triagem azul/branco em placas de ágar Lucia Bertani. Os plasmídeos contendo as inserções foram purificadas usando-se o kit de purificação Promega sequenciado com iniciadores M13. A sequência de LL mRNA foi analisada suando-se os programas de pesquisa Blastx e Blastp.

[00250] Pela combinação de três séries de iniciadores (ver Tabela 3), a amplificação deu amplicons de tamanhos (Figura 16A) predito a partir do salmão LL. O branco de água sem mRNA de peixe paulistinha foi negativo. O produto maior (720 bp) foi sequenciado, mostrando que o LL está presente em peixe paulistinha. A amplificação de produtos de PCR de tamanho diferente (Figure 16A) iniciado por oligonucleotídeos específicos flanqueiam os éxons de salmão em posições diferentes, a homologia alta ainda documentada entre os LLs de peixe paulistinha e salmão. Como um controle positivo para as reações de amplificação, usamos f3-actina.

[00251] O 5'-RACE PCR esclareceu a sequência da região 5'-não traduzida (5'-UTR) de LL de peixe paulistinha. Usamos mRNA (Figura 16B) de 4 horas pós fertilização (hpf) até 5 dias pós-incubação (dph). A primeira série de amplificação de RACE PCR produziu produtos muito fracos. Tais produtos amplificados de todos os estágios foram usados para a segunda série de RACE PCR usando-se a temperatura de recozimento alta (65°C) a fim de aumentar a especificidade da reação, usando-se diluições de 1:20 da primeira reação de RACE PCR. Os mesmos dois produtos (520 e 420 bp) foram gerados a partir de todos os estágios (Figura 16B), ainda de 4 hpf. A partir destes estágios de desenvolvimento, a informação de sequência de LL de mais do que 20 clones foi obtida. Todos os clones continham região a montante de 29 nts (Figura 16C) foram detectadas no LL de salmão. A extremidade 3' também foi sequenciada pela análise múltipla e revelou uma estrutura muito similar (quase idêntica) à estrutura encontrada em leucolectina de salmão. Com base na sequência de cDNA de comprimento total, a proteína LL de peixe paulistinha deduzida foi depositada no NCBI Gene Bank (N° d Acesso FJ 643620). A sequência codificadora consiste de 1.213 nts com uma estrutura de leitura aberta de 765 nucleotídeos. A sequência de aminoácido deduzida para LL de peixe paulistinha LL sugere uma proteína de 255 AAs, dando um códon de início de tradução na posição nt +1 (ou nts 30 a 32; (Figure 16C). cDNA de LL também tem um códon de início potencial em nt +94 (Figura 16C). Em 4 de 20 clones de LL de peixe paulistinha, a transcrição continha os 29 nts a montante do local +1, mas perdeu os 93 nts seguintes (a sequência nt leu corretamente até -1 seguido pelo nt em +94: Fig. 16C). Desta maneira, os dados sugeriram que duas proteínas LL diferentes podem ser traduzidas (Figura 16C).

[00252] Homologia forte entre as proteínas LL de peixe paulistinha e salmão foram evidentes. O LL de peixe paulistinha é uma estrutura híbrida em comparação com os dois LLs de salmão. De sete critérios de classificação de LL estabelecidos, 4 critérios colocaram o LL de peixe paulistinha na categoria LL-1, enquanto 2 critérios o colocaram na categoria LL-2 (Figura 16E). O sétimo critério é único para o LL de peixe paulistinha (Figura 16E, área em caixa). Além disso, um Cys é perdido no éxon 3 e substituído por Arg na sequência "nmnTPYClts", que, no peixe paulistinha lê "mmnDTPRlts". Em consequência, o peixe paulistinha LL tem 5 cisteínas, em que o salmão tem 6 cisteínas, todas preditas em pontes de bissulfeto.

[00253] Com respeito a vários éxons, o éxon 1 é idêntico, enquanto o éxon 2 de peixe paulistinha tem três AAs únicos encontrados no salmão (Gly- Arg em vez de Ser-Gln em posições # 57 & 58 e Val em vez de Ile na posição # 78). O éxon 3 tem 4 resíduos alterados (ou 2?). Nos éxons 4 & 5 não existem diferenças à parte dos 3 locais de classificação dos 3 locais de classificação. Desta maneira, existem 5 (ou 7) AAs únicos em LL peixe paulistinha LL (255 AAs total), ignorando os locais de classificação. O LL de peixe paulistinha é altamente conservado em comparação com o LL de salmão, diferindo apenas por alguns pontos percentuais.

[00254] O LL de peixe paulistinha (Figura 16D,E) é intimamente similar ao LL de salmão. O LL de peixe paulistinha perde um de seis Cys vistos no LL de salmão e, desta maneira, pode conter apenas duas pontes de bissulfeto: um conectando os terminais N e C, mais uma ponte interna no éxon 4. Comparando-se o LL de salmão com peixe paulistinha grande (Figura 16E), as variações estruturais estereotípicas vistas no salmão são reforçadas pela estrutura de LL de peixe paulistinha. Uma diferença radical é observada (resíduo # 131), mas a maioria das substituições conservadas são vistas em que variações no LL do salmão ocorrem. Em PVF, o LL pode ter funções imunoprotetoras. As variações restritas na estrutura de LL podem dizer respeito a tais funções. A leucolectina truncada (tLL) perde o peptídeo secretor, sugerindo que o tLL (Figura 16D) não é secretado e o tLL pode ser uma proteína de β-propelente de 4 lâminas. As proteínas LL diferentes podem, em teoria, realizar funções celulares diferentes. A função de tLL pode funcionar em outras células que não lectócitos.

Exemplo 10: Isolamento e caracterização do gene LL de salmãoTriagem da biblioteca BAC

[00255] Para obter a estrutura genômica do gene de leucolectina, triamos uma biblioteca BAC genômica de salmão (cobertura 18 x, tamanho de inserção média de cerca de 188 kb) disponibilizadas pelo Salmon Genome Project (Oslo, Noruega). A biblioteca de cromossomo artificial bacteriano altamente redundante (BAC) construída a partir de uma cepa de aquacultura Noruega de salmão do atlântico macho (Salmo Salar) foi triado quanto aos clones de LL positivos. A biblioteca consiste de um número total de 305.557 clones. O tamanho de inserção médio da biblioteca é de 188 kbp, representando uma cobertura de genoma de 18 vezes. Filtros de densidade alta CHORI-214 Seg. 1 (ajuste de filtro-007193), cada um consistindo de 18.432 clones marcados em duplicata, foram produzidos para a triagem de hibridização.

[00256] Para triar a biblioteca, uma sonda de cDNA específica de LL de 620 bp foi preparada pela incorporação de digoxigenina-11-dUTP (Roche) pelo método de PCR, usando-se os iniciadores diretos LL/F 5'- TACGGACACAGGTCGAATCCCCTACTACC-3' e iniciador reverso LL/R 5'-ACAGAGAAGAGGCTAATGTGTGCAC-3'. A sonda de cDNA rotulada por DIG foi a incubação a 95°C por 10 minutos e imediatamente colocado no gelo por 5 minutos antes da adição do tampão de hibridização (5 x SSC, 50 % de formamida, 0,02 % de SDS, 2 % de agente de bloqueio (Roche), água tratada com DEPC).

[00257] A hibridização foi realizada em tubos de hibridização a 55°C durante a noite. A etapa de lavagem pós-hibridização foi realizada duas vezes em baixa estringência em 2 x SSC com 0,1 % de SDS em temperatura ambiente por 15 minutos cada e duas vezes em estringência alta em 0,1 x SSC com 0,1 % de SDS a 65°C por 20 minutos cada. Os filtros foram incubados em uma solução de bloqueio contendo tampão de ácido maleico (pH 7,5) e reagente de bloqueio a 1 % (Roche) e subsequentemente na solução de bloqueio com anticorpo conjugado com fosfatase alcalina anti-Dig (AP) (Roche) diluído 1:10.000 por uma hora 1 h em temperatura ambiente. Após a lavagem com 0.1 M de tampão de ácido maleico (pH 7,5) contendo 150 mM de NaCl e 0,5 % de Tween 20, a membrana foi equilibrada por 2 minutos em tampão de detecção (0,1 M de TrisHCl, 0,1 M de NaCl, pH 9,5 em temperatura ambiente). Os pontos duplicados positivos foram analisados por ensaio quimiluminescente usando-se CSPD (Roche) como um substrato. A identificação de sinais positivos foi atingida pela exposição dos filtros à película de raio X (Kodak). O período de exposição variou de 3 a 15 minutos. Dois clones positivos eleitos L-7/257 e A-12/144 foram colocados em placas de ágar preparadas e incubadas a 37°C durante a noite. Três clones foram coletados, desenvolvidos durante a noite em uma cultura de agitação de 5 ml em meio LB a 37°C com 20 μg/ml de cloranfenicol. A purificação de DNA de plasmídeo foi realizada no dia seguinte usando-se o kit de purificação de DNA ultrapuro (Qiagen). O BAC DNA foi digerido com Not I e analisado por eletroforese de campo de pulso (PFGE) (Osoegawa et al., 1998, Genomics, 52, pp. 1-8). Low Range PFG Marker (New England Biolabs) e fragmento y- Hind III (Takara) foram usados como marcadores de tamanho de DNA.

Verificação de PCR de clones positivos

[00258] As reações de PCR foram realizadas usando-se BAC DNA purificado como um padrão e os iniciadores específicos de gene. As reações de PCR foram incubadas a 95°C por 3 minutos, seguido por 35 ciclos a 95°C por 30 s, recozimento a 54°C por 30 s e extensão a 72°C por 30 s com uma incubação final a 72°C por 10 min. Após o termociclo, 2 μl de cada reação de PCR foram analisados em um gel de agarose a 1,5 %. Sequenciamento aleatório de clones BAC de leucolectina

[00259] Dois clones foram sequenciados por MRW, Berlin, Alemanha. As inserções de vetor foram sequenciadas a uma redundância estimada de 2,4 vezes. As leituras foram isentas de vetor e de elementos hospedeiros. A partir de cerca de 180 leituras, um total de respectivamente 33 e 22 contigs foram estabelecidos a partir de dois clones BAC usando-se bioinformática. Os contigs foram examinados tanto por sequências de mRNA quanto por sequências de aminoácido. A análise identificou éxons e íntrons, tanto por pesquisas de programa quanto por inspeções manuais. O gene LL inteiro foi identificado a partir de contigs de sobreposição.

Estrutura genômica

[00260] Os resultados da triagem acima identificaram 7 clones específicos denominados A-12/144, L-16/143, P-6/76, B-5/70, 0-20/85, L- 7/257 e F-7/176 de acordo com a nomenclatura da biblioteca BAC. O tamanho de inserção médio dos clones BAC genômicos foi estimado a partir do DNA purificado a partir do clones BAC selecionados, que, subsequentemente foram digeridos com a enzima de restrição Not I. Os produtos de digestão de DNA contendo o vetor foram separados pela eletroforese em gel de campo de pulso e visualizado pelo tingimento com brometo de etídio. Todos os clones BAC produziram apenas umas faixas, mostrando que o tamanho do vetor (pTARBAC2.1) foi de ~13 kbp (13.397 bp; Osoegawa et al., 1998, supra). Isto sugere que o tamanho da inserção de todos os clones foi de ~25 kbp. As sequências de seis dos 7 clones BAC selecionados foram verificados uma vez mais pela amplificação usando-se como o padrão DNA purificado a partir de um clone BAC, junto com os iniciadores específicos de gene de LL. A amplificação de PCR deu um produto de ~600 bp de todos estes clones. Sua identidade ainda foi confirmada pelo sequenciamento direto.

Sequenciamento aleatório dos dois clones BAC

[00261] Os programas de montagem de sequência BioEdit e Dna Baser foram usados em todos os dados de sequência. A análise revelou que ambos os clones BAC de 25 kbp continham a sequência de mRNA de leucolectina completa (após a eliminação dos elementos de sequência de vetor), quando triados tanto contra as sequências de mRNA quanto sequências de proteína. Os dados de um dos clones BAC produziram um total de 80 leituras, que são montados em 33 contigs. Destes, pelo menos 6 contigs continham sequências LL, que permitiram a reconstrução do gene LL inteiro. Além das sequências LL, outros componentes foram frequentemente identificados nestes contigs com um alto grau de certeza e incluíram a transcriptase reversa, peptidase iônica e elementos transponíveis.

Características da estrutura de gene genômico de LL

[00262] Na primeira análise um dos clones (L7/247) permitiu a identificação de um gene LL inteiro, enquanto o outro clone (A12/144) revelou a maioria da estrutura genômica (ver Figura 16). Os dados do clone genômico L7/247 sugeriram uma organização genômica de leucolectina em que o gene é composto de 5 éxons interrompidos por 4 íntrons e extensões ~2,3 kbp começando do TATA-box. As sequências LL genômicas revelaram um início de TATA box na posição -81 (TATAAAA) do códon de partida ATG, indicando um 81 nt 5'UTR (elemento não traduzível) do mRNA. O códon de interrupção TAG está localizado aproximadamente 1850 nt do ATG na sequência genômica. Um sinal de poliadenilação longo de 6 nt AATAAA começa em torno da posição 2.250 do ATG. A 3 'UTR é uma sequência de cerca de 400 nt de comprimento começando após o códon de interrupção TAG. Com um 5'UTR consistindo de 81 nts, o tamanho de gene LL é estimado a pelo menos ~2,3 kbp pelas definições convencionais, com íntrons responde duas vezes tanto para sequência quanto para éxons. A fim de verificar as fronteiras éxon-íntron do gene de leucolectina, os iniciadores de PCR foram projetados a partir das sequências de íntron genômicas estabelecidas e usados para amplificar cada éxon de DNA embriônico de salmão. Estas sequências de 5 éxons foram derivadas pela análise de sequência direta de amplicons e todos corresponderam às sequências genômicas estabelecidas.

[00263] Os tamanhos dos éxons codificadores pareceram ser muito claros e variaram entre 55 bp (Éxon 1) e 234 bp (Éxon 2). Notavelmente, dois íntrons foram relativamente pequenos de modo que um comprimento exato pôde ser derivado da leitura manual dos dados. em contraste, o íntron 3 está em torno de 250 nt, enquanto o íntron 4 estende-se em torno de 700 bp. O comprimento exato do íntron 4 não pode ser definido a partir dos dados disponíveis. Os dados da sequência de éxon do compósito confirmam o produto predito de tradução, isto é uma proteína de 255 AA.

[00264] Além disso, os dados suportam uma estrutura de gene LL genômica com 5 éxons e 4 íntrons para uma das duas variantes de leucolectina descritas. O resíduo AA do terminal N de proteína LL secretada foi estabelecido ser triptofano pela degradação de Edman direta de LL purificado. Este resíduo Trp ocupa a posição # 20 da metionina de terminal N na proteína precursora de 255 AA e é precedida por aminoácidos # 18 (His) e # 19 (Ala). Um local de clivagem é predito entre Ala e Trp para uma protease de processamento, para a geração da proteína LL secretada. Pela degradação de Edman direta, a sequência deste LL secretado foi estabelecida como WDCQE VVNIK NLMQI DAGLG Q-V, e também verificado por sequências de proteína virtual múltiplas. Os éxons não estão todos na estrutura, mas potencialmente permitem que algum éxon pule sem interromper todas as estruturas de leitura. A análise da sequência genômica indicou as sequências das fronteiras de éxon/íntron. A exceção é o íntron 4 em que possivelmente os nts não padrão flanqueiam as sequências de íntron. Nos íntrons 1, 2 e 3, observamos a característica GT//AG comum que flanqueia o início e o fim de muitos íntrons de vertebrados (Shapiro and Senepathy, 1987, Nucleic Acids Research, 15, pp. 7155-7174).

[00265] O Éxon 1 (19 AAs) é de 55 nt de comprimento, com a sequência M R ATA - AVLLV - LCLLT - ISH(A) e interrupções no primeiro G do códon para o resíduo Ala #19 que precede o triptofano do terminal N da leucolectina secretada. O R grande em negrito itálico significa uma variante AA nesta posição possivelmente preso a um gene de Leucolectina-3 (ver Figura 17). A sequência de gene genômica continua com os nucleotídeos GT para o íntron 1 de partida. As extremidades de Íntron 1 com os nucleotídeos AG seguido por éxon II, que contém as duas últimas bases (-CA) do códon #19 Ala seguido pelo códon TGG para # 20 Trp, o terminal N de leucolectina. O íntron 1 é de 89 nt de comprimento.

[00266] O éxon 2 (234 nts) contém 77 AA (234 - 2 nts / 3 = 77 AA + 1 nt). aqui, a sequência genômica traduz (ala) - WDCQEVVNIK - NLMQI DAGLG - QVVAT DTSQI - PYYLV G* DKWI - RL* PGS LKHIT - VGPAG IWGVN -KDYAI YKYVA - GNWVQ AA (G) (= 77 AAs + 1 nt ) antes de continuar com os nucleotídeos GT (no íntron 2). O asterisco indica um resíduo em que AAs alternativos são observados na proteína LL ou em sequências múltiplas de cDNA de LL (ver Figure 17). G* parece variar em Leucolectina-1, enquanto L* parece variar em leucolectina-2. O íntron 2 é de 186 nts de comprimento, terminando nos nucleotídeos AG.

[00267] O Éxon 3 (72 AAs) começa após 2 nucleotídeos com GC (= Gly, resíduo # 78) e continua por outros 216 nts (para um total de 218 nts) ou 72 AAs. A sequência de aminoácido de Éxon 3 lê: (G)LL* KQL DAGGE - QFIVG ANMN* D TPYCLTSSAT - VGYKG PGSPL = PWTGL PGAVK - YYSCG P* FGCW - AVNKN DDIYL - MS, em que o resíduo #150 é S. Três letras grandes em negrito e sublinhadas, significam a variante AAs que serve para distinguir entre a leucolectina-1 e leucolectina-2. As letras com asterisco novamente significa resíduos com micro-variação (N* em leucolectina-2; P* significa micro-variação tanto em leucolectina-1 quanto em leucolectina-2) em uma tal posição (ver a Figura 17). O íntron 3 segue, começando com os nucleotídeos GT e continua por outros ~250 nts.

[00268] O éxon 4 (39 AAs) começa no resíduo AA #151 = LNQDC QNKGW - SHIE* G KLSMI - EVATD GSVFG - VNSA* GSVYT, em que T é o resíduo # 189. Novamente, o resíduo sublinhado em negrito serve para distinguir leucolectina-1 da leucolectina-2, enquanto um asterisco significa micro-variação nesta posição (ver em cada na posição E* e apenas na leucolectina-2 para a posição A*). O Íntron 4 pode, possivelmente, não começar e finalizar com sequências nt padrão para a definição de íntron. Os dados no íntron 4 são, desta maneira, algumas vezes preliminares e, em consequência o comprimento do íntron 4 é uma estimativa (~700 nts).

[00269] O éxon 5 (47 AAs) começa com o códon para R (= resíduo # 190) e continua até uma histidina de terminal C (resíduo # 236), que é seguido por um códon de interrupção TAG e o 3'UTR. A sequência lê: RDGIT- ASKPE-GTGWS-NIPMG*-MLMGHVTYDLGRLWV-VSKSAV-TMVCT- H, em que um asterisco indica uma microvariação neste ponto na leucolectina-1. As letras em negrito significam diferenças entre a leucolectina-1 e a leucolectina-2. As letras em negrito e em itálico significa a possibilidade da existência de leucolectina-3. Estes dados são resumidos na Figura 17.Exemplo 11: Comparação de sequência genômica de leucolectina-1 para as sequências de mRNA de leucolectina

[00270] Com mais do que uma dúzia de experimentos de clonagem e de sequenciamento separados de cDNA de salmon, as sequências alinhadas revelaram que apenas nas posições 7 estão alternativas claras de resíduos de aminoácido diferentes acomodados. A falta de variação de sequência total e a eliminação estereotípica a tais variações é notável.

[00271] A sequência genômica de L-7/247 corresponde aos clones de leucolectina classificados como leucolectina-1. Os outros cDNAs sequenciados denominados leucolectina-2, diferem nas sete posições indicadas. Além destas posições, existem indicações de algumas outras variações em AA. Isto pode sugerir a micro-heterogeneidade adicional dos dois cDNAs classificados, mas os dados pode sugerir a existência de uma terceira categoria de cDNA de LL, visto que, por exemplo, na posição #226, observamos um resíduo de tirosina em alguns clones que nunca foram observados em qualquer cDNA de leucolectina-1 ou leucolectina-2 (Figura 17).

[00272] Um sumário de variações observadas é mostrado na Figure 17. Os dois tipos de leucolectinas são caracterizados por, respectivamente (E, I, Y, Y, K, A, V) versus (N, V, F, F, N, G, G) nas sete posições (# 88, 91, 101, 147, 158, 229, 230) da sequência AA deduzida da leucolectina madura. Estas 7 posições classificam claramente estas duas leucolectinas, que além disso podem apresentar microvariações nas posições estereotípicas mostradas por asteriscos na Figura 17. Como os dados na Figura 17 indicam, algumas sequências de mRNA apontam a um único Gly na posição #2 do peptídeo de sinal LL que não é visto em leucolectinas-1&2 e que portanto sugere uma leucolectina-3 possível. Além disso, observamos um Tyr na posição # 226 na leucolectina madura em que apenas Ser é visto em leucolectinas-1&2. Concluímos que a sequência genômica em L7/247 corresponde às sequências de leucolectina-1 observadas pelo sequenciamento múltiplo de cDNA de salmão. O sequenciamento adicional de clones de LL BAC devem revelar a outra categoria de leucolectina-2 principal e talvez, também, a existência suspeita de leucolectina-3, como definido pelo critério de resíduo acima.Exemplo 12: Detecção de proteínas de Leucolectina em outras espécies

[00273] O fluido de incubação de truta arco-íris (Oncorhyncus mykiss), bacalhau e Oikopleura dioica foi investigado quanto à presença de proteínas de leucolectina. A proteína do fluido de incubação foi preparado pela cromatografia de afinidade analisada por 15 % de SDSPAGE. O gel foi tingido de prata para mostrar a presença de uma variedade de proteínas ou manchado ou sondado com um anticorpo de leucolectina de salmão. Em cada caso, uma proteína simples ~26 kDa foi detectado, correspondente ao peso molecular de leucolectina (ver as Figuras 18 (truta arco-íris), 19A (bacalhau) e 19B (Oikopleura dioica)).Sequências:1: (polipeptídeo de leucolectina de embrião de salmão)MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEWNIKNLMQIDAGLGQWATDTSQIPY IYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ LDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCG PFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNS AGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWWSKSAVTM VCTH2: (polipeptídeo de leucolectina de leucócitos de salmão)SIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGL PKQLDAGGEQFIVGANMDDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYY SCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNNGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFG VNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMCMLMGHVTYDLGRLWWSKSAV 3: (polipeptídeo de leucolectina de leucócitos de bacalhau)LVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQL DAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGP FGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVNSA GSVYTRD4: (polipeptídeo de leucolectina de leucócitos de frango)IPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLL KQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYS CGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGV NSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWW5: (polipeptídeo de leucolectina de leucócitos humanos)MRATAAVLLVLCLLTISHAWDCQEWNIKNLMQIDAGLGQWATDTGRIPY YLVGDKWIRLPGSLKHVTVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLK QLDAGGEQFIVGANMNDTPYRLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSC GPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVN SAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWWSKSGGTMVCTH6: (polipeptídeo de leucolectina de peixe paulistinha)MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEWNIKNLMQIDAGLGQWATDTSQIPY YLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ LDAGGNQFIVGANMNDTPYRLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSC GPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVN SAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWWTKSGGTM VCTH7: (polipeptídeo de leucolectina-2 de salmão)MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEWNIKNLMQIDAGLGQWATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ LDAGGNQFWGANMDDTPFCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSC GHFGCWAVNKNDDIFLMSLNQDCQNNGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVN SAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWWSKSGGTM VCTH 8: (polipeptídeo de leucolectina-3 de salmão)MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEWNIKNLMQIDAGLGQWATDTSQIPY YLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ LDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCG PFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNS . AGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWWYKSAVTM VCTH9: (cDNA de leucolectina de sangue humano)ATGAGAGCCACTGCAGCCGTCCTATTGGTCCTCTGTCTCCTGACCATCAG TCATGCATGGGACTGTCAGGAGGTAGTAAACATCAAGAATCTGATGCAG ATCGATGCAGGACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAGGTCGAATCC CCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAG CATGTCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATG CAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCCTTCTG AAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGA ACGATACTCCATACCGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGG TCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTAC TACAGCTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATA TCTACTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCA CATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCT TTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGC CAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTC ATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTC TGGCGGCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGTTCGGGATCTGTCTAAAGTTCACTTGCGAACTCATTGATCTÇTCTTTCT GGAAAAGCCTTTAGTTCATTAGTTCATAAAAATCCTTCATTTTAAAACCT ATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATTATCTTATTGCCATTTAAA AAAATATCAATGAAGATGTTATATTTTCTTGACCACTCCTTGATTAACAC TTCAATAGATCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAGTGTAGTGTAAACTAGGG CATGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTTTGCTGTGCTTCAGAGGT CATCAATAGGATTGGATGGAATCCTTGTCATTGTTTATTATCTCATTATAT AAACATTTCCTGCAAAAATAAAGCATTCATTTTGAAACTATTGTAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAN 10: (sequência genética de leucolectina de salmão, de uma biblioteca de DNA genômico de salmão maduro)TGTGCAGGGCTATAAAAGCGCAAAGTCTTCCAATGGGACAATTGAAGTC TGGTGTACAACCAAACGTATACTGTAGATCTACATAGACATCATGAGAG CCACTGCAGCCGTCCTATTGGTCCTCTGTCTCCTGACCATCAGTCATGGT AAGTTACCATCATCTGAAACATGCTTGATCAACTTGGAGTTGAAGTTTTT CTTGGTATACTCTACTCATATGTCTTTGTCTCCATAGCATGGGACTGTCA GGAGGTAGTAAACATCAAGAATCTGATGCAGATCGATGCAGGACTGGGG CAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTACCTGGTAGGTG ATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGTAGGACCA GCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAGTATGTGG CCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGTAAGTGGAGAGCATTACTCAATAT TTATCCAGAGGACACCTGCTTATTAGCTTTCCTGATACCATCAGGCTGTT GAAAAAAACGATTGATGTTTTAAATTGTAACTTGTAGGTAATTTGGCAGT ACTCCTTGTTTGCTTGTCTGTCTGTCTTTGTGGTCTTGGCCTTCTGAAACA GTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGAT ACTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAG GCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAG CTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTA CTTAATGAGTGTAAGATCTGGGAAAGAGTGGGAGAGCTGGAGTAGAGTA GTAGAGGATGGAGAGTGTCAGTTATTTTAAAACTGTTTCATATTATAACT GTTGAAATTGTCCTAAAACCCTGATTGTATCATTTTGTTTCCAGCTGAAT CAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCA TGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGT AGTGTTTATACCCAGGTAAGGTTGCTACTGAACTATGTGTATGGTCCACC ACCCCCCCCCCCCCAACAGTATTAACTTGAAAATGACTTGTAATAATAAC TTAGAATAATAATGGTATACCCTTTAATTATAACTCTGATCCTTACAGTA CATGCTATGTGAATCTCCTTACACAAAAACTAAATATTGTAGGTACATAA ATAAAATCAGTTAAATATAATCAGATCTAAACTTATAGGACTTATTAAGA AATGTGTAGACAGTGTATGATAAAATATGTAAAAGTTGGATGTCCTGTA AAGCTACAGTTTGGGATAAAAAACAACAACTTCCCAGACACCCCACCAC TTGTTCTGGTAAACAGCTGAGGAATGTAGTTAGAGAAATGTAACCACTCT CACATTCATACATGGAGCTACGGATGCAAAGACACAACAATTTTTTTATT AAAAAAAAAAAAATGTTTATATTTTCTTTTAAAGCTAAACATTGTTTGTT TACAATAACATTGTTTACAAACAATTGAGTAAAAGCTTACATTTTGGCTT CTAATGTGGTTGAATAAAGCTCAAGATGCAGAAGTTATATTCTTCAAAA ATCTATGGCTATATTTAATTATTAAAGTCCAAAAATGGATGTACTTAAAA AAAATGGATAAGCTTTAAAACATGAACCCCAACCCTTTCTTCAACACAG AGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATAT CCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTT GGGTCGTCTCCAAGTCTGGCGGCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTT CTCTGTAGCTGAAGGCCGTTCGGGATCTGTCTAAAGTTCACTTGCGAACT CATTGATCTCTCTTTCTGGAAAAGCCTTTAGTTCATTAGTTCATAAAAAT CCTTCATTTTAAAACCTATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATTA TCTTATTGCCATTTAAAAAAATATCAATGAAGATGTTATATTTTCTTGAC CACTCCTTGATTAACACTTCAATAGATCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAG TGTAGTGTAAACTAGGGCACGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTT TGCTGTGCTTCAGAGGTCATCAATAGGATTTGACGGAATCCTTGTCATTG TTTATTATCTCATTATATAATCATTTCCTGCAAAAATAAA 11: (sequência de cDNA de leucolectina de embriões de salmão de 200 a 450 dias de idade - éxons apenas)ATGAGAGCCA CTGCAGCCGT CCTATTGGTC CTCTGTCTCCTGACCATCAG TCATGCATGG GACTGTCAGG AGGTAGTAAACATCAAGAAT CTGATGCAGA TCGATGCAGG ACTGGGGCAAGTGGTTGCTA CGGACACAAG TCAAATCCCC TACTACCTGGTAGGTGATAA ATGGATCCGT CTGCCTGGTT CCCTGAAGCA TATCACTGTA GGACCAGCAG GGATCTGGGG TGTCAACAAG GACTATGCAA TCTACAAGTA TGTGGCCGGT AACTGGGTTC AAGCTGCAGG CCTTCTGAAA CAGTTGGATG CTGGAGGTGA ACAGTTTATT GTGGGGGCTA ACATGAACGA TACTCCATAC TGTCTGACAA GTAGTGCCAC AGTTGGCTAC AAGGGTCCAG GCTCACCCCT TCCATGGACA GGATTGCCAG GAGCTGTGAA GTACTACAGC TGCGGACCCT TTGGGTGCTG GGCAGTCAAC AAGAATGATG ATATCTACTT AATGAGTCTG AATCAAGACT GCCAAAACAA GGGGTGGAGT CACATTGAAG GCAAGCTTTC CATGATTGAG GTGGCAACTG ATGGTAGTGT CTTTGGGGTC AACTCTGCGG GTAGTGTTTA TACCAGAGAC GGCATCACAG CCAGTAAACC AGAGGGCACC GGATGGAGCA ATATCCCAAT GGGCATGCTC ATGGGCCACG TGACCTACGA CCTGGGCCGT CTTTGGGTCG TCTCCAAGTC TGGCGGCACC ATGGTGTGCA CACAT12: (sequência genética de leucolectina de leucócitos de salmão)ACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTACCTG GTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGT AGGACCAGGAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAG TATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCGTTCCGAAACAGTTGG ATGCTGGAGGTAACCAGTTTGTTGTGGGGGCTAACATGGACGATACTCC ATTTTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAGGCTCAC CCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGCTGCGG ACACTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATTTTCTTAATGA GTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAACGGGTGGAGTCACATTGATGGCAA GCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACT CTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGA GGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTG ACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTCTGGCGGCACCAT GGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGT13: (sequência de gene de leucolectina de bacalhau)CAATCCCCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCC CTGAAGCATATCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGG ACTATGCAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGG CCTTCTGAAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTA ACATGAACGATACTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTA CAAGGGTCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTG AAGTACTACAGCTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATG ATGATATCTACTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTG GAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGT AGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGAC .14: (sequência de gene de leucolectina de galinha)CAGGACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTA CCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCA CTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTA CAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCCTTCTGAAACAG TTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGATA CTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACÁGTTGGCTACAAGGGTCCAGG CTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGC TGCGGACGCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTACT TAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGA AGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGG TCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGCCGTAAA CCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCC ACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCT15: (sequência genômica parcial de leucolectina de peixe paulistinha).NNAAAANNTAAAATANNGTAGGTACANNNNAAATCAGTTAAATATAATC AGATNTAAANTTNTAGGACTATTAAGAAATGTGTAGACAGCGTACGATAA AATATGTAAAAGTTGGATGTCCTGTAAAGCTACAGTTTGGGATAAAAAAC AACAACTTNCCAGACACCCCACCACTTGTTNTGGTAAACAGNTGAGGAAT GTAGTTAGAGAAATGTAACCANTCTCACATTCATACATGGAGTTACGGAT GCAAAGACACAACAATTTTTTGTTTACATTNTTTTTAACATGTTTΠTAAA GCAATACACATTGTTTGTTTACAATAACATTGTTTACAAACAATTGAGTAA AAGCTTACATTTTGGCTTCTGTGTGGTTGAAATAAAGCTCAAGAGGCAGA AGTTATATTCTTCAAAAATCAATGGCTATATTTAATTATTAAAGTTCCAAA AAGGATGTACTTAATAAAATGGATAAGCTTTAAAACATGAACCCCAACCC TTTCTTCAACACAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGG ATGGAGCAATATCCCAATGTGTATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACC TGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTCTGCCGTCACCATGGTGTGCACAC ATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGTTCGGGATCCGTCCAAAGTTCC CTGGCGAACTCATTGATCTCTCTTTCTGGAAAAGCCTTTAGTTCATAAAAA TCCTTCATTTTAAAACCTATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATGA TCTTATTGACATTTAAAAAAAATATCATTGAAGATTTTATATTTTCTTGACAACTCCTAGATTAACACTTCAATAGACCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAGT GTAGTGTAAACTAGGGCACGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTTT GCTGTGCTTCAAAGGTCATCAATAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGT CGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTNGGATGCATAAG

Claims

1. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo como definida em qualquer uma das Sequências Nos 9 a 15.

2. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de preferivelmente ser um vetor de expressão.

3. Método para preparar um vetor como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende inserir uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido em qualquer uma das Sequências Nos. 9-15 no ácido nucleico do vetor.

4. Método para preparar um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das Sequências Nos. 2-6, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido em qualquer uma das Sequências Nos. 9 ou 11-15, sob condições por meio das quais o dito polipeptídeo é expressado e recuperação da dita molécula produzida desta maneira.

5. Célula hospedeira procariótica, caracterizada pelo fato de que contém um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das Sequências Nos. 1-8 ou uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido em qualquer uma das Sequências Nos. 9-15.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo compreendendo:(a) uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das Sequências Nos. 1-8;(b) uma quantidade eficaz de um agente estabilizante adicionado, em que o referido agente estabilizante estabiliza o polipeptídeo de (a) contra a degradação; e(c) um ou mais excipientes e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

7. Uso de (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido em qualquer uma das Sequências Nos. 1-8 ou de (b) uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo de (a) e um ou mais excipientes e / ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir um distúrbio autoimune da pele, um distúrbio inflamatório da pele ou uma membrana de mucosa ou pele danificada em um animal.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo ou composição é administrado topicamente à pele.

9. Uso de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que os ditos distúrbios a serem tratados ou evitados são feridas, úlceras, eczema, acne, psoríase, inflamação gastrointestinal, gengivite, inflamação da cavidade oral e esôfago ou pele danificada.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a inflamação gastrointestinal é doença de Crohn ou colite ulcerativa.

11. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dita pele danificada está irritada ou inflamada, rachada por frio, queimada de sol, irradiada, danificada por calor ou é um ferimento.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 11, caracterizado pelo fato de que o dito animal é um mamífero.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 12, caracterizado pelo fato de que o animal é um ser humano.