ES2658966T3

ES2658966T3 - Leucolectinas y sus usos

Info

Publication number: ES2658966T3
Application number: ES09745090.2T
Authority: ES
Inventors: Bernt Th Walther; Mirushe Miftari
Original assignee: LEUKOLECT AS
Current assignee: LEUKOLECT AS
Priority date: 2008-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2018-03-13
Anticipated expiration: 2029-10-29
Also published as: EP2358745B1; RU2528860C2; JP5539372B2; CA2741823C; RU2011121616A; JP2012506714A; US9260498B2; EP2358745A1; WO2010049688A1; BRPI0920101A2; ZA201103456B; CY1119930T1; AU2009309477A1; PT2358745T; NZ592911A; CL2011000947A1; DK2358745T3; AU2009309477B2; BRPI0920101B1; NO2358745T3

Abstract

Un polipéptido que comprende: (i) una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8; (ii) una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos 95 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8; (iii) una porción de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1, 2 o 5-8, en el que dicha porción comprende al menos 200 aminoácidos; o (iv) una porción de una secuencia de aminoácidos definida en (i) o (ii), en el que dicha porción es idéntica al menos 95 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1, 2 o 5- 8 y comprende al menos 200 aminoácidos.

Description

Leucolectinas y sus usos

La presente invención se refiere a un polipéptido, concretamente una lectina, su secuencia de ácidos nucleicos codificadora y anticuerpos al polipéptido y su uso en diversas aplicaciones médicas.

El sistema de inmunológico de defensa celular es fundamental para sobrevivir a exposiciones a microbios y parásitos. Este sistema también es el más relevante para gestionar células desviadas en la carcinogénesis, después de infecciones virales y en enfermedades autoinmunes.

El reconocimiento intercelular es fundamental para tales funciones, pero el origen de tales fenómenos en sí mismo es escasamente entendido. Después de los eones de diversificación de la biota sexual primordial, los genes deben haber evolucionado para asegurar el reconocimiento específico a especie de las células sexuales (“fertilización”). Si no, se habría amenazado la viabilidad de las especies sexuales. Evolucionaron varias moléculas de reconocimiento celular. Cuando la era Cámbrica vio a la biota invadir los biotopos terrestres, tales biotopos áridos favorecieron cada vez más una restricción de la fertilización sexual a ambientes refugio con menos oportunidad de confusión de especie. Por consiguiente, los genes para el reconocimiento de gameto específico a especie tenderían a llegar a ser redundante y, por tanto, se liberaría para adquirir funcionalidad novedosa en la evolución.

Una nueva función obvia podría se una capacidad de los organismos de distinguir sus (propias) células de células extrañas (no propias). Se propone que este mecanismo proporciona una lógica para el origen del sistema de inmunidad celular, un fenómeno que por otro lado está escasamente explicado. Tal distinción por inmunidad innata (Medzhitov & Janeway, 1997, Cell, 91(3), p295-298) es esencial para los organismos multicelulares para prevenir su canibalización por parásitos y microbios. El malfuncionamiento de los sistemas para distinguir propias” de “no propias”, puede formar la base de algunas enfermedades autoinmunes.

Las respuestas inmunes mal dirigidas que se refieren como autoinmunidad se pueden demostrar por la presencia de autoanticuerpos o linfocitos T reactivos con antígenos del hospedador. Aunque es normalmente inofensivo y probablemente un fenómeno universal de la vida vertebrada, la autoinmunidad puede ser la causa de un amplio espectro de enfermedades humanas, conocidas como enfermedades autoinmunes. Este concepto de autoinmunidad como la causa de enfermedad humana es relativamente nuevo, y no se aceptó en la corriente principal del pensamiento médico hasta la década de 1950 y 1960. Las enfermedades autoinmunes se definen como enfermedades en las que se da la progresión desde la autoinmunidad benigna hasta la autoinmunidad patógena. Esta progresión se determina por ambas influencias genéticas y desencadenantes ambientales.

Las enfermedades autoinmunes son una principal amenaza para la salud. Hay más de ochenta enfermedades causadas por la autoinmunidad. Hay una especial amenaza para las mujeres; aproximadamente el 75 % de los pacientes son mujeres. Las enfermedades autoinmunes son entre las diez causas principales de muerte entre las mujeres en todos los grupos de edad hasta los 65.

Las enfermedades autoinmunes afectan muchas partes diferentes del cuerpo incluyendo la piel (por ejemplo, alopecia areata, penfigoide ampolloso, epidermolysis bullosa acquisita, pénfigo foliáceo, pénfigo vulgar, vitíligo, psoriasis y acné), riñón (por ejemplo, nefropatía de IgA), sangre (por ejemplo, anemia aplásica, anemias hemolíticas autoinmunes, púrpura trombocitopénica idiopática y anemia perniciosa), articulaciones (por ejemplo, espondilitis anquilosante), músculos (por ejemplo, polimiosistis/dermatomiositis), oído (por ejemplo, pérdida de oído autoinmune y síndrome de Meniere), ojo (por ejemplo, úlcera de Mooren, síndrome de Reiter y enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada), corazón (por ejemplo, miocarditis autoinmune, síndrome de Churg-Strauss, arteritis de células gigantes, enfermedad de Kawasaki, poliarteritis nodosa, arteritis de Takayasu y granulomatosis de Wegener), sistema endocrino (por ejemplo, enfermedad de Addison, hipoparatiroidismo autoinmune, hipofisitis autoinmune, ooforitis autoinmune, orquitis autoinmune, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, síndrome autoinmune poliglandular tipo 1 (SPA-1), síndrome autoinmune poliglandular tipo 2 (SPA-2), síndrome autoinmune poliglandular tipo 3 (SPA3), y diabetes mellitus tipo 1), sistema gastereoentérico (por ejemplo, hepatitis autoinmune, enfermedad celiaca, enfermedad de intestino inflamatoria y cirrosis biliar primaria), sistema nervioso (por ejemplo, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Guillan-Barre, esclerosis múltiple y miastenia gravis) o puede afectar al cuerpo de manera sistémica (por ejemplo, síndrome de antifosfolípido, linfoproliferativo autoinmune, poliendocrinopatía autoinmune, enfermedad de Bechet, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren y lupus eritematoso sistémico).

Las enfermedades autoinmunes pueden golpear cualquier parte del cuerpo y, por tanto, los síntomas varían ampliamente y el diagnóstico y el tratamiento son con frecuencia difíciles. Algunas enfermedades autoinmunes pueden ser mortales a menos que se diagnostiquen y traten apropiadamente. Los trastornos autoinmunes crónicos como la artritis reumatoide paralizan al paciente y también crean pesadas cargas para los familiares del paciente. Algunos tipos de uveitis pueden causar ceguera. Las enfermedades tales como escleroderma requieren tratamiento a largo plazo habilidoso. Incluso otras enfermedades autoinmunes, incluyendo la enfermedad de Grave y la tiroiditis

crónica, se pueden tratar con éxito si se diagnostican correctamente, pero frecuentemente no se da con ellas debido a su comienzo sutil.

La inflamación es un proceso normal en el que los glóbulos blancos del cuerpo y los compuestos químicos protegen el cuerpo de infección y sustancias extrañas tales como bacterias y virus. En algunas enfermedades, sin embargo, el sistema inmunológico del cuerpo desencadena inapropiadamente una respuesta inflamatoria cuando no hay sustancias extrañas de las que defenderse. Por tanto, la inflamación es común en enfermedades autoinmunes, pero no todos los trastornos inflamatorios son respuestas autoinmunes. Las enfermedades inflamatorias también pueden estar causadas por una amplia diversidad de agentes que atacan directamente al cuerpo tales como los microorganismos (virus y hongos), toxinas bacterianas, ciertos agentes farmacéuticos (antibióticos y esteroides antiinflamatorios), y agentes químicos (sales biliares, sustancias químicas domésticas tóxicas). Las enfermedades que están asociadas con la inflamación incluyen artritis (que es un término general que describe la inflamación en articulaciones), inflamación del corazón (miocarditis), inflamación de los tubos pequeños que transportan aire a los pulmones (que pueden causar un ataque de asma), inflamación de los riñones (nefritis) e inflamación del intestino grueso (colitis).

Los trastornos inflamatorios gastrointestinales son de particular interés, por ejemplo, enfermedades inflamatorias gástricas (tales como la úlcera gástrica, úlcera duodenal y gastritis), y enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo enfermedad de Crohn, enfermedad del intestino inflamatorio, esprúe tropical y no tropical, enteritis infecciosa, colitis, colitis ulcerosa, colitis pseudomembranosa, diverticulitis, y enfermedades inflamatorias alergénicas y radiológicas).

Las enfermedades inflamatorias gastrointestinales se caracterizan por la inflamación, específicamente por la presencia de edema, células inflamatorias características (es decir, leucocitos, histiocitos, y macrófagos), y, en algunos casos, necrosis y ulceración del epitelio de superficie. Se sabe que estas enfermedades inflamatorias causan una amplia diversidad de agentes presentes en el tracto gastrointestinal que se sabe que atacan a sus superficies, produciendo la respuesta de la enfermedad inflamatoria. Tales agentes incluyen microorganismos (virus y hongos), toxinas bacterianas, ciertos agentes farmacéuticos (antibióticos y esteroides antiinflamatorios), y agentes químicos (sales biliares, sustancias químicas domésticas tóxicas), De hecho, el propio ácido gástrico es capaz de atacar el revestimiento del estómago y producir el estado inflamatorio.

Medicamentos actualmente usados para tratar la inflamación incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE-tales como aspirina, ibuprofeno o naproxeno), corticoesteroides (tales como prednisona), medicamentos antimalaria (tales como hidroxicloroquina) y otros medicamentos tales como metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato. Algunas enfermedades gastrointestinales, específicamente las enfermedades gástricas, se pueden tratar por inhibición de la secreción del ácido gástrico que causa la inflamación, tal como mediante neutralización de los efectos del ácido (por ejemplo, administración de un antiácido),

o mediante la administración de un agente farmacológico eficaz para inhibir la secreción de ácido gástrico.

La piel dañada es vulnerable a la infección y puede ser antiestética y/o causar dolor o malestar. Algunos tipos de heridas son resistentes a la curación bajo condiciones fisiológicas normales, por ejemplo, úlceras crónicas. Es muy deseable alguna solución farmacéutica para reparar la piel dañada, particularmente para reparar heridas.

Queda una necesidad de tratamientos adecuados para tratar los trastornos autoinmunes e inflamatorios y afecciones

o lesiones de la piel con efectos secundarios mínimos.

Después de muchos años de explorar procesos potencialmente implicados en la evolución del eucariota los inventores identificaron una nueva proteína (en el presente documento referida como leucolectina),- no solamente en gametos y en el cigoto, sino también en el embrión temprano (en células especializadas indicadas lectocitos), y durante la ontogenia de células sanguíneas, y finalmente, en leucocitos.

Inicialmente la proteína se identificó en y se purificó de pez (véase los Ejemplos). La proteína tiene 255 aminoácidos. Esta es la forma propéptido de la lectina, que contiene un péptido N-terminal de 19 aminoácidos que sugiere que está dirigido al lisosoma para la posterior secreción (es decir, dentro del espacio de perivitelino).

La secuencia de aminoácidos de la lectina permitió el desarrollo de anticuerpos específicos a epítopo, los cuales de uno en uno posibilitaron la identificación de muchas (2 a 8) isoformas de apariencia de la proteína (Figura 5), dependiendo del tejido analizado. Al menos dos ARNm se han aislado del salmón (véase el Ejemplo 11), los cuales contienen diferencias de secuencia menores que dan como resultado solamente 7 cambios en el nivel de polipéptido (Figura 17). Las formas truncadas de la proteína también se han identificado a partir de los leucocitos de salmón (véase SEQ ID NO: 2) y de pez cebra, en los que se han identificado una forma secretada (como se describió anteriormente, indicada LLs) y una forma truncada que está perdiendo los primeros 32 aminoácidos del terminal N, indicada LLt (véase el Ejemplo 9).

La proteína soporta pequeñas semejanzas a algunas de las proteínas conocidas, mostrando semejanza total de menos del 50 % a cualquier proteína conocida. Alguna semejanza se observó en pequeños dominios a taquilolectinas.

Se han identificado proteínas relacionadas en diversos animales, incluyendo pez cebra, bacalao, trucha asalmonada, Oikopleura dioica y también pollo y seres humanos. Sus ADNc se identificaron (véase los Ejemplos) y se encontró que estaban extremadamente bien conservados. Las proteínas codificadas en las especies que se han examinado muestran menos del 4 % de varianza. Esto señala una función esencial para estas proteínas.

No se han publicado genes con una secuencia similar en ningún organismo hasta la fecha. Usando sondas a exones

o intrones individuales, se ha establecido que hay solamente rara semejanza de un exón con partes de otras dos proteínas publicadas, ambas de las cuales son totalmente distintas a la entidad molecular descrita en el presente documento.

Importantemente, este gen novedoso se expresa específicamente en leucocitos humanos, a pesar del hecho de que este gen no se puede encontrar en secuencias publicadas del genoma humano. Solamente se pueden detectar segmentos muy cortos de este gen pero distribuidos por múltiples cromosomas humanos (véase los Ejemplos). La resolución de este enigma aún no está al alcance.

Finalmente, se ha descubierto que la entidad molecular es secretada por células, lo cual es coherente con la forma propéptido de la proteína. Se han aislado tanto la forma nativa como la recombinante del producto génico.

Sorprendentemente se ha encontrado que estas proteínas han declarado efectos sobre los trastornos autoinmunes e inflamatorios, particularmente de la piel, y otras afecciones de la piel. Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna se cree que la leucolectina se une a receptores específicos que ponen en marcha los procesos de curación normales e inherentes del cuerpo humano. A partir de los efectos observados proponemos que la leucolectina participa en el proceso normal de la inmunidad celular. La leucolectina parece que falta en muchas enfermedades, de manera que su introducción farmacéutica desencadena otras respuestas defensivas del sistema inmunológico para actuar normalmente frente a diversos problemas: la presencia de células extrañas (microbios, parásitos) y de células alteradas de las “propias” que pueden relacionar la leucolectina con la etología de enfermedades autoinmunes, es decir, tales afecciones pueden estar causadas por la ausencia de suficiente leucolectina.

Los leucocitos humanos contienen y expresan proteínas leucolectina extremadamente conservadas. Hasta ahora, estas proteínas eran proteínas desconocidas en las células sanguíneas. La leucolectina parece ser un nuevo miembro de la familia de proteínas de taquilolectina.

En un primer aspecto la invención proporciona un polipéptido que comprende:

(i): una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(ii): una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos 95 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 1 a 8;

(iii) una porción de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 1, 2 o 5-8, en el que dicha porción comprende al menos 200 aminoácidos; o

(iv) una porción de una secuencia de aminoácidos definida en (i) o (ii), en el que dicha porción es idéntica al menos 95 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1, 2 o 58 y comprende al menos 200 aminoácidos.

“Polipéptidos” como se refiere en el presente documento son moléculas con preferiblemente más de 200 o 250 restos y/o menos de 500, 400 o 300 restos o un intervalo seleccionado de los mismos. Como se refiere en el presente documento una “porción” preferiblemente comprende al menos 200 o más aminoácidos de la secuencia de la que deriva. Dicha porción se puede obtener de una porción central o N-terminal o C-terminal de la secuencia.

Preferiblemente dicha porción se obtiene del extremo N-terminal, por ejemplo, de los primeros 50, 100 o 150 restos del polipéptido. Aspectos preferidos incluyen truncamientos de dichos polipéptidos, por ejemplo, para separar un péptido señal o una porción ausente en las variantes de origen natural. Los truncamientos preferidos se dan en el extremo N-terminal y son de 1 a 50, por ejemplo, 1 a 10, 20, 30 o 40, o 5 a 40, por ejemplo, 10 a 35 restos de longitud.

Preferiblemente dicha secuencia es idéntica al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % a la secuencia con la que se compara.

La identidad de secuencia se puede determinar, por ejemplo, usando el banco de datos de secuencia de proteína SWISS-PROT usando FASTA pep-cmp con un factor pam variable, y penalización de creación de hueco (gap) fijada a 12,0 y penalización de extensión de hueco fijada a 4,0, y una ventana de 2 aminoácidos. Preferiblemente dicha comparación se realiza a lo largo de la longitud completa de la secuencia, pero se puede realizar a lo largo de una ventana más pequeña de comparación, por ejemplo, menos de 200, 100 o 50 aminoácidos contiguos.

Preferiblemente tales polipéptidos relacionados con la identidad de secuencia son funcionalmente equivalentes a los polipéptidos que se exponen en los Nº de secuencia enumerados. Tales polipéptidos funcionalmente equivalentes pueden tomar la forma de derivados como se exponen más adelante. Igualmente, los polipéptidos con secuencias como se exponen en los Nº de secuencia se pueden modificar sin afectar la secuencia del polipéptido como se describe más adelante.

Además, las “porciones” como se describe en el presente documento pueden ser equivalentes funcionales. Preferiblemente estas porciones satisfacen las condiciones de identidad (en relación con una región comparable) mencionadas en el presente documento.

Como se refiere en el presente documento, para conseguir “equivalencia funcional” el polipéptido puede mostrar alguna eficacia reducida en la actuación de la función médica en relación con la molécula parental (es decir, la molécula de la que se derivó, por ejemplo, por sustitución de aminoácidos), pero preferiblemente es tan eficaz o es más eficaz. Por tanto, la equivalencia funcional se refiere a un polipéptido que es eficaz para tratar una enfermedad como se refiere en el presente documento, es decir, para reducir uno o más síntomas del paciente, por ejemplo, inflamación o la apariencia de la piel como se describe en lo sucesivo en este documento. Esto se puede ensayar por comparación de los efectos del polipéptido derivado en relación con el polipéptido del que se deriva de una manera cualitativa o cuantitativa, por ejemplo, realizando los análisis in vivo referidos en los Ejemplos. Cuando los resultados cuantitativos son posibles, el derivado es al menos 30, 50, 70 o 90 % tan eficaz como el polipéptido parental. Alternativamente, se puede realizar ensayo in vitro, por ejemplo, por análisis de la unión a células dendríticas o efectos sobre cultivos celulares in vitro.

Proteínas funcionalmente equivalentes que están relacionadas o derivadas de la proteína de origen natural, se pueden obtener modificando la secuencia de aminoácidos nativa por sustitución, adición y/o deleción de aminoácidos sencilla o múltiple (siempre que satisfagan los requerimientos de identidad de secuencia anteriormente mencionados), pero sin destruir la función de la molécula. Preferiblemente la secuencia nativa tiene menos de 20 sustituciones, adiciones o deleciones, por ejemplo, menos de 10, 5, 4, 3, 2, o 1 tales modificaciones. Tales proteínas se codifican por “moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes” que se generan por sustitución, adición y/o deleción apropiada de una o más bases.

Equivalentes funcionales preferidos son variantes de “adición” en las que se generan las proteínas o polipéptidos de fusión de terminal amino y/o carboxi, comprendiendo una proteína o polipéptido adicional fusionados al polipéptido madre.

Variantes funcionalmente equivalentes particularmente preferidas son las variaciones biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de una especie o alternativamente en diferentes géneros, por ejemplo, de plantas, animales o bacterias) y derivados preparados usando técnicas conocidas. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas funcionalmente equivalentes se pueden producir por síntesis química o en forma recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigidas a sitio incluyendo deleción, mutagénesis aleatoria, o escisión enzimática y/o ligación de ácidos nucleicos.

La presente invención también proporciona secuencias de nucleótidos codificadoras de dichos polipéptidos, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico:

(i): una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15;

(ii): una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos 95 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15;

(iii) una porción de una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9-12, 14 o 15, en la que dicha porción comprende al menos 600 bases de nucleótidos;

(iv): una porción de una secuencia de nucleótidos definida en (i) o (ii), en la que dicha porción es idéntica al menos 99 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9-12, 14 o 15 y comprende al menos 600 bases de nucleótidos; o

(v): una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias definidas en (i) a (iv).

“Moléculas de ácido nucleico” como se refieren en el presente documento son moléculas con preferiblemente más de 600 o 750 bases y/o menos de 1.500, 1.200 o 900 bases o un intervalo seleccionado de los mismos. “Porciones” como se refirió anteriormente, preferiblemente comprende al menos 600 bases de nucleótidos de la secuencia de la que se deriva. Preferiblemente dichas porciones codifican péptidos N-terminales, centrales o C-terminales como se describió anteriormente en este documento. Como se discutió anteriormente en relación con los polipéptidos, en un aspecto preferido se contemplan truncamientos dando como resultado la separación de restos del extremo Nterminal de los polipéptidos enumerados. En las secuencias de nucleótidos codificadoras, en relación las secuencias presentadas en el presente documento, dicho truncamiento es preferiblemente de 1 a 150, por ejemplo, 1 a 30, 60, 90 o 120, o 13 a 120, por ejemplo, 28 a 105 bases de longitud.

Preferiblemente dicha secuencia es idéntica al menos 98 o 99 % a la secuencia con la que se compara.

La identidad de secuencia se puede determinar, por ejemplo, por búsqueda con FASTA usando los paquetes GCG, con los valores por defecto y un factor pam variable, y penalización de creación de hueco fijada a 12,0 y penalización de extensión de hueco fijada a 4,0 con una ventana de 6 nucleótidos.

Preferiblemente tales moléculas de ácido nucleico relacionadas con la identidad de secuencia o de hibridación son funcionalmente equivalentes a las moléculas de ácido nucleico que se exponen en los Nº de Secuencia enumerados. Tales moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes pueden tomar la forma de derivados como se exponen más adelante y se consideran funcionalmente equivalentes si codifican polipéptidos que se considerarían equivalentes funcionales según los ensayos anteriormente descritos en el presente documento. Equivalentes funcionales preferidos son los que codifican los polipéptidos preferidos como se presentan anteriormente, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos encontrados en diferentes géneros o especies de las moléculas específicas anteriormente mencionadas.

Además, las “porciones” como se describe en el presente documento pueden ser equivalentes funcionales. Preferiblemente estas porciones satisfacen las condiciones de identidad (en relación con una región comparable) o de hibridación mencionadas en el presente documento.

Moléculas de ácidos nucleicos según la invención pueden ser ADN, ADNc o ARN sencillo o de doble cadena, preferiblemente ADN e incluyen secuencias básicamente idénticas y de hibridación, degeneradas como se describieron anteriormente. Idealmente, sin embargo, las moléculas son ADN o ADNc.

Los polipéptidos como se describieron anteriormente incluyen aquellos que se modifican sin afectar la secuencia del polipéptido, por ejemplo, por modificación química, incluyendo por desglicosilación o glicosilación. Tales polipéptidos se pueden preparar por modificación postsíntesis/aislamiento del polipéptido sin afectar funcionalmente, por ejemplo, cierta glicosilación, metilación, etc. de restos particulares.

Los polipéptidos de la invención también pueden tomar la forma de peptidomiméticos que se pueden considerar derivados en los que los rasgos funcionales del polipéptido se conservan pero se presentan en el contexto de una estructura diferente, por ejemplo, no peptídica. Tales peptidomiméticos se han desarrollado con éxito y se han usado para otras aplicaciones concretamente médicas.

Los peptidomiméticos, concretamente moléculas no peptídicas se pueden generar a través de diversos procesos, incluyendo el diseño de fármaco de base conformacional, cribado (screening), diseño de genoteca enfocado y química medicinal clásica. No solamente se pueden usar oligómeros de aminoácidos no naturales u otros bloques de construcción orgánica, sino también carbohidratos, compuestos heterocíclicos o macrocíclicos o cualquier molécula orgánica que comprende elementos estructurales y la conformación que proporciona una superficie electrostática molecular que imita las mismas propiedades de la conformación en 3 dimensiones del péptido se puede usar por métodos conocidos en la técnica.

Por tanto, los peptidomiméticos pueden soportar poca o ninguna semejanza con una cadena principal de péptido. Los peptidomiméticos pueden comprender una forma no peptídica enteramente sintética (por ejemplo, basándose en una cadena principal de carbohidrato con sustituyentes apropiados) o pueden conservar uno o más elementos del péptido en el que se basan, por ejemplo, sometiendo a derivatización uno o más aminoácidos o reemplazando uno o más aminoácidos con componentes no peptídicos alternativos. Los moldes similares a péptido incluyen pseudopéptidos y péptidos cíclicos. Se pueden minimizar elementos estructurales considerados redundantes para la función del péptido para conservar una función armazón solamente o se pueden separar cuando sea apropiado.

Cuando los peptidomiméticos conservan uno o más elementos peptídicos, es decir, más de un aminoácido, tales aminoácidos se pueden reemplazar con un análogo no estándar o estructural de los mismos. Los aminoácidos conservados en las secuencias también se pueden someter a derivación o modificar (por ejemplo, marcado, glicosilado o metilado) siempre y cuando se conserven las propiedades funcionales de los polipéptidos de la invención. Los peptidomiméticos se refieren como que son “derivables de” una cierta secuencia de polipéptidos. Por esto se quiere decir que los peptidomiméticos se diseñan en referencia a una secuencia de polipéptido definida, de modo que conserva los rasgos estructurales del péptido que son esenciales para su función. Esto puede ser las cadenas laterales particulares del polipéptido, o el enlace de hidrógeno potencial de la estructura. Tales rasgos se pueden proporcionar por componentes no peptídicos o uno o más de los restos de aminoácidos o los enlaces que unen dichos restos de aminoácidos del polipéptido se pueden modificar para mejorar ciertas funciones del polipéptido tal como estabilidad o resistencia a proteasa, mientras que conservan los rasgos estructurales del polipéptido que son esenciales para su función.

Ejemplos de aminoácidos análogos no estándar o estructurales que se pueden usar son aminoácidos D, isoésteres de amida (tales como N-metil amida, amida retro-inversa, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinilo, (E)-vinilo, metilenoamino, metilenotio o alcano), ácidos L-N metilamino, ácidos D-α metilamino, ácidos DN-metilamino. Ejemplos de aminoácidos no convencionales se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1

Aminoácido no convencional Ácido α-aminobutírico: Código Abu Aminoácido no convencional L-N-metilalanina Código Nmala

α-amino-α-metilbutirato Aminociclopropano-carboxilato Ácido aminoisobutírico: Mgabu Cpro Aib L-N-metilarginina L-N-metilasparagina Ácido L-N-metilaspártico L-N-metilcisteína Nmarg Nmasn Nmasp Nmcys

Aminonorbornil-carboxilato ciclohexilalanina: Norb L-N-metilglutamina Ácido L-N-metilglutámico L-N-metilhistidina de Chexa Nmgln Nmglu Nmhis

ciclopentilalanina: Cpen L-N-metilisoleucina Nmile

D-alanina: Dal L-N-metilleucina Nmleu

D-arginina Ácido D-aspártico D-cisteína: Darg Dasp Dcys L-N-metillisina L-N-metilmetionina L-N-metilnorieucina Nmlys Nmmet Nmnle

D-glutamina Ácido D-glutámico D-histidina D-isoluecina: Dgln Dglu Dhis Dile L-N-metilnorvalina L-N-metilornitina L-N-metilfenilalanina L-N-metilprolina Nmnva Nmorn Nmphe Nmpro

D-leucina: Dleu L-N-metilserina Nmser

D-lisina D-metionina D-ornitina: Dlys Dmet Dom L-N-metiltreonina L-N-metiltriptófano L-N-metiltirosina Nmthr Nmtrp Nmtyr

D-fenilalanina D-prolina D-serina D-treonina: Dphe Dpro Dser Dthr L-N-metilvalina L-N-metiletilglicina L-N-metil-t-butilglicina L-norleucina Nmval Nmetg Nmtbug Nle

D-triptófano D-tirosina D-valina D-α-metilalanina: Dtrp Dtyr Dval Dmala L-norvalina α-metil-aminoisobutirato α-metil-γ-aminobutirato α-metilciclohexilalanina Nva Maib Mgabu Mchexa

D-α-metilarginina D-α-metilasparagina D-α-metilaspartato D-α-metilcisteína: Dmarg Dmasn Dmasp Dmcys α-metilciclopentilalanina α-metil-α-naftilalanina α-metilpenilcilamina N-(4-aminobutil)glicina Mcpen Manap Mpen Nglu

D-α-metilglutamina D-α-metilhistidina D-α-metilisoleucina: Dmgln Dmhis Dmile N-(2-aminoetil)glicina N-(3-aminopropil)glicina N-amino-α-metilbutirato Naeg Norn Nmaabu

D-α-metilleucina D-α-metillisina: Dmleu Dmlys α-naftilalanina N-bencilglicina Anap Nphe

D-α-metilmetionina D-α-metilornitina D-α-metilfenilalanina D-α-metilprolina: Dmmet Dmorn Dmphe Dmpro N-(2-carbamiletil)glicina N-(carbamilmetil)glicina N-(2-carboxietil)glicina N-(carboxilmetil)glicina Ngln Nasn Nglu Nasp

D-α-metilserina D-α-metiltreonina D-α-metiltriptófano D-α-metiltirosina: Dmser Dmthr Dmtrp Dmty N-ciclobutilglicina N-cicloheptilglicina N-ciclohexilglicina N-ciclodecilglicina Ncbut Nchep Nchex Ncdec

D-α-metilvalina D-N-metilalanina D-N-metilarginina D-N-metilasparagina: Dmval Dnmala Dnmarg Dnmasn N-ciclododecilglicina N-ciclooctiglicina N-ciclopropilglicina N-cicloundecilglicina Ncdod Ncoct Ncpro Ncund

D-N-metilaspartato D-N-metilcisteína D-N-metilglutamina D-N-metilglutamato: Dnmasp Dnmcys Dnmgln Dnmglu N-(2,2-difeniletil)glicina N-(3,3-difenilpropil)glicina N-(3-guanidinopropil)glicina N-(1-hidroxietil)glicina Nbhm Nbhe Narg Nthr

D-N-metilhistidina D-N-metilisoleucina D-N-metilleucina D-N-metillisina: Dnmhis Dnmile Dnmleu Dnmlys N-(hidroxietil)glicina N-(imidazoliletil)glicina N-(3-indoliletil)glicina N-metil-γ-aminobutirato Nser Nhis Nhtrp Nmgabu

N-metilciclohexilalanina: Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet

D-N-metilomitina N-metilglicina N-metilaminoisobutirato: Dnmorn Nala Nmaib N-metilciclopentilalanina D-N-metilfenilalanina D-N-metilprolina Nmcpen Dnmphe Dnmpro

N-(1-metilpropil)glicina: Nile D-N-metilserina Dnmser

Aminoácido no convencional: Código Aminoácido no convencional Código

N-(2-metilpropil)glicina D-N-metiltriptófano D-N-metiltirosina: Nleu Dnmtrp Dnmtyr D-N-metiltreonina N-(1-metiletil)glicina N-metila-naftilalanina Dnmthr Nval Nmanap

D-N-metilvalina Ácido γ-aminobutírico L-t-butilglicina L-etilglicina: Dnmval Gabu Tbug Etg N-metilpanicillamina N-(p-hidroxifenil)glicina N-(tiometil)glicina penicillamina Nmpen Nhtyr Ncys Peu

L-homofenilalanina L-α-metilarginina L-α-metilaspartato L-α-metilcisteína: Hphe Marg Masp Mcys L-α-metilalanina L-α-metilasparagina L-α-metil-t-butilglicina L-metiletilglicina Mala Masn Mtbug Metg

L-α-metilglutamina L-α-metilhistidina L-α-metilisoleucina L-α-metilleucina: Mgln Mhis Mile Mleu L-α-metilglutamato L-α-metilhomofenilalanina N-(2-metiltiotetil)glicina L-α-metillisina Mglu Mhphe Nmet Mlys

L-α-metilmetionina: Mmet L-α-metilnorleucina Mule

L-α-metilnorvalina: Mnva L-α-metilornitina Mom

L-α-metilfenilalanina L-α-metilserina: Mphe Mser L-α-metilprolina L-α-metiltreonina Mpro Mthr

L-α-metiltriptófano L-α-metilvalina N-(N-(2,2difeniletil)carbamilmetil)glicina 1-carboxi-1-(2,2-difenil-: Mtrp Mval Nnbhm Nmbc L-α-metiltirosina L-N-metilhomofenilalanina N-(N-(3,3difenilpropil)carbamilmetil)glicina L-O-metil serina Mtyr Nmhphe Nnbhe Omser

etilamino)ciclopropano: L-O-metil homoserina Omhser

Aminoácidos: no estándar que se pueden usar incluyen análogos restringidos de manera conformacional, por

ejemplo, tales como Tic (para reemplazar F), Aib (para reemplazar A) o ácido pipecólico (para reemplazar Pro).

Los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico anteriormente discutidos también incluyen derivados que se han modificado, por ejemplo, para facilitar su uso en aplicaciones farmacéuticas (discutido más adelante), por ejemplo, por la adición de grupos dirigidos o funcionales, por ejemplo, para mejorar la lipofilia, ayudar el transporte celular, la solubilidad y/o la estabilidad. Por tanto, oligosacáridos, ácidos grasos, alcoholes grasos, aminoácidos, péptidos o polipéptidos se pueden conjugar con los polipéptidos anteriormente mencionados o las moléculas de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar presentes en un vehículo viral como se describe en lo sucesivo en el presente documento.

Los polipéptidos también incluyen derivados en forma de “profármacos” o “pro-péptidos” de modo que el componente añadido se puede separar por escisión una vez administrado, por ejemplo, por escisión de un sustituyente añadido a través de esterificación que se puede separar por la acción de esterasas. Tales profármacos incluyen precursores nativos de las proteínas de origen natural que se escinden, por ejemplo, por proteólisis para producir el polipéptido de interés. Tales precursores pueden ser inactivos en la forma precursora pero se pueden activar por escisión proteolítica. Así, las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen de manera similar moléculas que codifican tales profármacos o precursores. Polipéptidos modificados o moléculas de ácido nucleico como se describieron anteriormente se pueden ensayar para asegurarse que conservan la actividad funcional en relación con la molécula no modificada determinando si tienen los mismos o similares efectos médicos.

Las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas se pueden unir de forma operativa a una secuencia control de expresión, o a un vehículo de clonación de ADN recombinante o vector que contiene tal molécula de ADN recombinante. Esto deja la expresión intracelular del polipéptido de la invención como un producto génico, la expresión del que es dirigido por el(los) gene(s) introducido(s) en las células de interés. La expresión génica está dirigida a partir de un promotor activo en las células de interés y puede estar insertado en cualquier forma de vector de ADN lineal o circular para la incorporación en el genoma o para la replicación independiente o la transfección/expresión transitoria. Técnicas de transformación o transfección adecuadas están bien descritas en la bibliografía. Alternativamente, la molécula de ADN desnudo se puede introducir directamente en la célula para los usos descritos en el presente documento.

Vectores de expresión apropiados incluyen secuencias control apropiadas tales como, por ejemplo, elementos control de traducción (por ejemplo, codones de inicio y parada, sitios de unión ribosomal) y transcripcionales (por ejemplo, regiones promotor-operador, secuencias de parada de terminación) unidos en el marco de lectura de emparejamiento con las moléculas de ácido nucleico requeridas para la realización del método de la invención como se describe en lo sucesivo en el presente documento. Vectores apropiados pueden incluir plásmidos y virus (incluyendo tanto bacteriófago como virus eucariotas). Vectores virales adecuados incluyen baculovirus y también adenovirus, virus adenoasociados, herpes y virus variolovacunal/de la viruela. Muchos otros vectores virales están

descritos en la técnica. Vectores preferidos incluyen vectores de expresión bacterianos y mamíferos pGEX-KG, pEFneo y pEF-HA. La molécula de ácido nucleico se puede fusionar convenientemente con ADN que codifica un polipéptido adicional, por ejemplo, glutatión-S-transferasa, para producir una proteína de fusión sobre la expresión.

Por tanto, visto desde un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente.

Otros aspectos de la invención incluyen métodos para preparar moléculas de ácido nucleico recombinantes según la invención, que comprenden insertar secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención dentro del ácido nucleico vector.

En métodos como se describen en lo sucesivo en el presente documento, los polipéptidos se pueden administrar a una célula por transfección de una célula con una molécula de ácido nucleico de la invención. Como se mencionó anteriormente, por tanto, la presente invención abarca moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia que codifica los polipéptidos de la invención como se describe en el presente documento y su uso en los métodos descritos en el presente documento. Preferiblemente dichas moléculas de ácido nucleico están contenidas en un vector, por ejemplo, un vector de expresión.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente contenidas en un vector, se pueden introducir en una célula por cualquier medio apropiado. En la bibliografía se describen bien las técnicas de transformación o transfección adecuadas. Se conocen una diversidad de técnicas y se pueden usar para introducir tales vectores en las células procariotas o eucariotas para la expresión. Células hospedadoras preferidas con este propósito incluyen líneas celulares de insecto, líneas celulares eucariotas o E. coli, tal como la cepa BL21/DE3. La invención también abarca células hospedadoras procariotas o eucariotas transformadas o transfectadas que contienen una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector como se definió anteriormente.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método de preparación de un polipéptido de la invención como se definió anteriormente en el presente documento, que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente, bajo condiciones por las que dicho polipéptido se expresa y recuperar dicha molécula producida así. El polipéptido expresado forma un aspecto adicional de la invención.

La invención también abarca un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico como se describió anteriormente en el presente documento. Esto se puede producir por expresión en una célula hospedadora como se describió anteriormente.

Células que contienen polipéptidos de la invención, pero que se han modificado en relación con las células nativas mediante introducción directa de dichos polipéptidos o mediante expresión de material de ácido nucleico codificador forman aspectos adicionales de la invención. Preferiblemente dichos polipéptidos o moléculas de ácido nucleico no aparecen en dichas células de manera endógena, es decir, dicha célula está modificada para contener polipéptidos exógenos o material de ácido nucleico.

La presente invención también abarca anticuerpos (monoclonales o policlonales) y sus fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, fragmentos F(ab)2, Fab y Fv, es decir, fragmentos de la región “variable” del anticuerpo, que comprende el sitio de unión de antígeno) dirigido específicamente a los polipéptidos como se definió anteriormente en el presente documento.

Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden usar in vitro para identificar la presencia o la cantidad del polipéptido de la invención y se pueden usar de manera diagnóstica para identificar trastornos o daño de la piel como se describe en el presente documento asociados con niveles aberrantes de dicho polipéptido, es decir, variación en relación con los niveles normales, por ejemplo, niveles elevados o reducidos de dicho polipéptido.

Por tanto, en el presente documento se describe un método de determinación de la presencia o la cantidad de un polipéptido de la invención o una porción del mismo en una muestra, en el que un anticuerpo como se describe en el presente documento se pone en contacto con dicha muestra y el grado de unión del anticuerpo es indicativo de la presencia o la cantidad de dicho polipéptido o porción del mismo.

La muestra que se valora puede ser cualquier muestra conveniente, por ejemplo, sangre o una muestra de tejido o muestra no biológica. Preferiblemente la muestra se deriva de un animal como se describe en el presente documento, preferiblemente un ser humano.

En el presente documento se describe un método de diagnóstico de un trastorno o daño de la piel como se describe en el presente documento en un animal, que comprende al menos las etapas de determinar la presencia o la cantidad de un polipéptido como se describe en el presente documento en una muestra de dicho animal, en el que dicha presencia o cantidad es diagnóstico de dicho trastorno o daño de la piel. El polipéptido se puede detectar, por ejemplo, usando los anticuerpos anteriormente descritos en el presente documento. La muestra y el animal

preferiblemente es como se describe en el presente documento. La cantidad es preferiblemente una reducción en el nivel de dicho polipéptido en comparación con los niveles normales. El diagnóstico se puede conseguir mediante la comparación con tablas patrones de sujetos normales en comparación con aquellos con el trastorno o el daño de la piel bajo investigación.

Los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico en composiciones y usos de la invención como se describe más adelante en el presente documento se pueden obtener o derivar de fuentes de origen natural o se pueden generar enteramente o parcialmente de manera sintética.

Convenientemente los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico se aíslan según los protocolos descritos en los Ejemplos.

Por tanto, en el presente documento se describe un método de aislamiento de un polipéptido como se describe en el presente documento a partir de fluido de eclosión (por ejemplo, de salmón) que comprende al menos las etapas de:

a) suspender huevos en un volumen mínimo de agua (por ejemplo, equivalente al volumen de los huevos o menos);

b) inducir sincronizadamente, rápida eclosión de los huevos (preferiblemente de modo que la eclosión es completa en menos de 2 horas para más del 95 % de los embriones);

c) filtrar los huevos eclosionados para obtener el fluido de eclosión

d) añadir opcionalmente urea sólida a dicho fluido de eclosión para permitir la disociación de los fragmentos de la cáscara del huevo y someter dicho fluido a centrifugación de baja velocidad;

e) realizar una primera etapa de cromatografía de exclusión, por ejemplo, usando una columna Superdex 16/60

o un ultra filtro Biotex 100;

f) realizar opcionalmente una segunda etapa de cromatografía de exclusión, por ejemplo, usando una columna Superdex 16/60, y

g) separar opcionalmente proteínas contaminantes, tales como zonasa por cromatografía de afinidad, por ejemplo, sobre una columna de Benzamidina-Sefarosa.

Cuando se obtiene el polipéptido de la invención a partir de leucocitos se obtiene en forma no modificada. Los polipéptidos obtenidos del fluido de eclosión de salmón están modificados (por glicosilación y/o fosforilación), pero ambas formas son igualmente eficaces en los métodos descritos en el presente documento.

Los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico descritos en el presente documento están preferiblemente básicamente libres de cualquier componente contaminante derivado del material o materiales fuentes usados en el procedimiento de aislamiento o en su preparación sintética. Especialmente preferiblemente el compuesto se purifica a un grado de pureza de más de 50 a 60 %, por ejemplo, >70, 80 o 90 %, preferiblemente más de 95 o 99 % de pureza valorado en p/p (peso seco). Tales niveles de pureza corresponden a la molécula específica de interés, pero incluye sus productos de degradación. Cuando sea apropiado, se pueden usar preparaciones enriquecidas que tienen menor pureza, por ejemplo, contienen más de 1, 2, 5 o 10 % de la molécula de interés, por ejemplo, más de 20 o 30 %. Los polipéptidos de la invención se pueden purificar, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, HPLC, de exclusión por tamaño, de intercambio iónico, de afinidad, de interacción hidrófoba, de fase inversa) o electroforesis capilar.

Los polipéptidos de la invención se pueden generar de manera sintética, por ejemplo, por ligación de péptidos sintéticamente generados menores o más convenientemente por expresión recombinante de una molécula de ácido nucleico codificadora de dicho polipéptido como se describió anteriormente en el presente documento.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden generar sintéticamente, por ejemplo, por amplificación de una secuencia de ácido nucleico como se describe en el presente documento por ejemplo a partir de una genoteca de ADNc apropiada.

Los polipéptidos, moléculas de ácido nucleico o anticuerpos como se describen en el presente documento se pueden usar in vitro, por ejemplo, en cultivo celular o de órgano, para afectar las funciones inmunes en las células.

Alternativamente, los polipéptidos, moléculas de ácido nucleico o anticuerpos se pueden usar ex vivo, sobre partes o productos de animal, por ejemplo, órganos o sangre, células o tejidos recogidos, particularmente cuando se contempla que estos se reintroducirán en el cuerpo del que derivan.

Sin embargo, se prefieren los polipéptidos, las moléculas de ácido nucleico y los anticuerpos para su uso in vivo como se discute a más detalle más adelante.

Los polipéptidos, moléculas de ácido nucleico y anticuerpos como se describen en el presente documento tienen aplicaciones para el tratamiento de diversos trastornos o afecciones como se describe en lo sucesivo en el presente documento. Por tanto, la presente invención abarca una composición farmacéutica que comprende un polipéptido, molécula de ácido nucleico o anticuerpo como se describe más adelante en el presente documento y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Por “farmacéuticamente aceptable” o “fisiológicamente aceptable” se quiere decir que el ingrediente debe ser compatible con otros ingredientes en la composición así como fisiológicamente aceptable al recipiente.

El principio activo para la administración se puede modificar apropiadamente para su uso en una composición farmacéutica. Por ejemplo, los compuestos usados según la invención se pueden estabilizar frente a la degradación por el uso de derivados como se describió anteriormente.

El principio activo también se puede estabilizar en las composiciones, por ejemplo, mediante el uso de aditivos apropiados tales como sales o no electrolitos, acetato, SDS, EDTA, tampones de citrato o acetato, manitol, glicina, HSA o polisorbato.

La molécula de ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo de la invención puede estar presentes en dichas composiciones como el único principio activo o se puede combinar con otros ingredientes, particularmente otros principios activos, por ejemplo, para aumentar el efecto terapéutico o para hacer la composición más atractiva al consumidor.

La composición que comprende el polipéptido de la invención también puede comprender zonasa o una enzima relacionada. Como se refiere en el presente documento zonasa es una preparación que contiene una enzima, en la que dicha preparación presenta una banda de proteína en el análisis SDS-PAGE, con un peso molecular de alrededor de 28 kDa, obtenible por un método que comprende las etapas de:

a) suspender huevos de salmón en un volumen mínimo de agua

b) inducir sincronizadamente, rápida eclosión de dichos huevos de salmón

c) filtrar los huevos de salmón eclosionados para obtener el fluido de eclosión;

d) añadir urea sólida a dicho fluido de eclosión para permitir la disociación de los fragmentos de la cáscara de huevo de salmón y someter dicho fluido a centrifugación a baja velocidad;

e) purificar más dicha zonasa sometiendo el sobrenadante de la centrifugación a filtración en gel; y

f) purificar más dicha zonasa por cromatografía de afinidad en una columna Superase 6B® modificada por benzamidina, en la que dicha cromatografía de afinidad se realiza realizando lavados con sal concentrada seguido de elución con dioxana, en solución de sal concentrada, a zonasas extracto unidas a la matriz de cromatografía o a estructuras macromoleculares;

en el que dicha zonasa tiene las siguientes propiedades:

a) escinde chromozym X;

b) es inhibida por benzamidina;

c) escinde los enlaces peptídicos con arginina;

d) se mantiene activa en presencia de urea 8 M, concentraciones molares de sal, agua destilada y disolventes orgánicos, preferiblemente dioxano o propanol; y

e) conserva la actividad enzimática en solución a temperatura ambiente durante 50 días.

La zonasa se puede preparar como se describe en los ejemplos y se añade a la composición o puede representar una “impureza” después de la preparación del polipéptido de la invención a partir de fuentes naturales. En las composiciones que comprenden tanto el polipéptido de la invención como la zonasa, el polipéptido puede estar presente en el intervalo de 1 a 100 % de su peso combinado total y la zonasa puede componer el 0 a 99 %. Preferiblemente el polipéptido está presente en un intervalo de 50 a 100 %, por ejemplo, >80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 y la zonasa está presente a 0 a 50 %, por ejemplo, <20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 % del peso combinado.

En un aspecto adicional la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende:

(a): un polipéptido que comprende:

(ii): una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos 70 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(iii) una porción de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8, en el que dicha porción comprende al menos 100 aminoácidos; o

(iv) una porción de una secuencia de aminoácidos definida en (i) o (ii), en el que dicha porción es idéntica al menos 70 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8 y comprende al menos 100 aminoácidos; o

(b): una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en (a), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende:

(i’) una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 9 a 15; (ii’) una secuencia de nucleótidos que es al menos idéntica al 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 9 a 15; (iii’) una porción de una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 9 a 15, en la que dicha porción comprende al menos 300 bases de nucleótidos; o (iv’) una porción de una secuencia de nucleótidos definida en (i’) o (ii’), en la que dicha porción es idéntica al menos 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9-12, 14 o 15 y comprende al menos 600 bases de nucleótidos; o

(c): un anticuerpo como se definió anteriormente,

y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, para su uso en terapia.

Como se mencionó anteriormente, los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico de la inhibición presentan propiedades terapéuticas en el tratamiento de diversos trastornos autoinmunes e inflamatorios, particularmente de la piel así como tratamiento de piel dañada, por ejemplo, por el sol, frío, irradiación (por ejemplo, rayos X, por ejemplo cuando se usa para tratar cánceres) o como un resultado de una herida.

Como se refiere en el presente documento un “trastorno” se refiere a una perturbación patológica subyacente en un organismo sintomático o asintomático en relación con un organismo normal, el cual puede resultar de, por ejemplo, infección o una imperfección genética adquirida o congénita.

Como se explica en los Ejemplos, se ha ilustrado la utilidad de leucolectina para tratar una diversidad de afecciones de la piel inflamatorias, autoinmunes y otras. Se puede esperar similar eficacia para tratar otras afecciones. Por ejemplo, se puede explicar la inflamación gastrointestinal crónica por una reacción en exceso a (o quizás en algunos ejemplos como) fallo de la reacción por células dendríticas a agentes nocivos. Por lo tanto, la introducción de leucolectina, por ejemplo, oralmente se debería esperar que tratara la inflamación GIT crónica de modo muy similar que la piel inflamada responde de manera favorable a la introducción de leucolectina.

Las enfermedades autoinmunes pueden ser el resultado de la expresión somática específica de versiones mutadas de antígenos superficiales celulares normales. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, las leucolectinas pueden servir para proteger células diana del ataque.

Como se refiere en el presente documento un “trastorno inflamatorio” es un trastorno en el que la inflamación se observa en el mismo momento durante la progresión del trastorno y puede ser el único síntoma o uno de los diversos síntomas. El trastorno inflamatorio puede ser agudo o crónico y puede ser como se describió anteriormente

o en lo sucesivo en el presente documento. Trastornos inflamatorios incluyen inflamación cardiovascular (por ejemplo, ateroesclerosis, apoplejía), inflamación gastrointestinal (incluyendo úlceras tales como úlceras gástricas o duodenales), trastornos inflamatorios hepáticos, inflamación pulmonar (por ejemplo, asma, lesión del pulmón inducida por ventilador), inflamación del riñón, inflamación ocular (por ejemplo, uveitis), inflamación pancreática, inflamación genitourinaria, trastornos neuroinflamatorios (por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer), alergia, (por ejemplo, rinitis /sinusitis alérgica, alergias y trastornos de la piel (por ejemplo, urticaria/colmenas, angioedema, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, psoriasis), alergias alimenticias, alergias a fármacos, alergias a insecto, mastocitosis), inflamación del esqueleto (por ejemplo, artritis, osteoartritis, artritis reumatoide, espondiloartropatías), infección (por ejemplo, infecciones bacterianas o virales; trastornos inflamatorios orales (es decir, perodontis, gingivitis o somatitis); llagas sobre membranas mucosas; y trasplante (por ejemplo, rechazo del aloinjerto o xenoinjerto o tolerancia materno-fetal).

Trastornos inflamatorios para el tratamiento según la presente invención son trastornos de la piel inflamatorios tales como Eczema, Acné, Rosácea, psoriasis y dermatitis de contacto, inflamación gastrointestinal y afecciones de las membranas mucosas tales como úlceras o llagas.

Como se refiere en el presente documento un “trastorno autoinmune” es uno en el que la autoinmunidad benigna ha progresado a autoinmunidad patógena y puede ser como se describió anteriormente o en lo sucesivo en el presente documento. Enfermedades autoinmunes incluyen, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA, que es una enfermedad viral con un componente autoinmune), alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno (EAOI), síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA), púrpura tromobocitopénica autoinmune (PTA), enfermedad de Behcet, cardiomiopatía, celiaquía-dermatitis herpetiforme; síndrome de fatiga crónica y disfunción inmune (SFCDI), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), penfigoide cicatricial, enfermedad aglutinina fría, síndrome de la cresta, enfermedad de Crohn, enfermedad de Dego, dermatomiositis-juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiosistis, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática (enfermedad de Still), artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad de tejido conectivo mixto, esclerosis múltiple, miastenia gravis, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatoniiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriática, fenómenos de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma (esclerosis sistémica progresiva (ESP), también conocida como esclerosis sistémica (ES)), síndrome de Sjogren, síndrome de hombre rígido, lupus eritematosos sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de célula gigante, colitis ulcerativa, uveitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

“Piel dañada” como se refiere en el presente documento incluye piel que se ha dañado por influencias externas tales como calor, irradiación (por luz de diversas longitudes de ondas tales como rayos X o UV), frío, fricción, desgarrón o una herida, por ejemplo, resultante de un accidente o cirugía. Alternativamente la piel dañada pude resultar de una infección, o enfermedad o anormalidad genética subyacente. El daño se puede presentar como grietas, rojeces, picores, inflamación, piel callosa, escamas, etc.

La presente invención proporciona el uso de:

(a): un polipéptido que comprende:

(b): un polipéptido producido por la expresión en una célula hospedadora como se describió anteriormente; o

(c): una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en (a), en el que dicha molécula de ácido nucleico comprende:

(i’) una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15; (ii’) una secuencia de nucleótidos que es al menos idéntica al 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15; (iii’) una porción de una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15, en la que dicha porción comprende al menos 300 bases de nucleótidos; o (iv’) una porción de una secuencia de nucleótidos definidos en (i’) o (ii’), en la que dicha porción es idéntica al menos 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 9-12, 14 o 15 y comprende al menos 600 bases de nucleótidos; o

(d): una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de (a) o (b) o el ácido nucleico de (c) y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables,

en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno autoinmune de la piel, un trastorno inflamatorio de la piel o una membrana mucosa o piel dañada en un animal.

En una declaración alternativa, la invención proporciona:

(a) un polipéptido que comprende:

(b): polipéptido producido por la expresión en una célula hospedadora como se describió anteriormente; o

(c): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en (a), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende:

(d): composición farmacéutica que comprende el polipéptido de (a) o (b) o el ácido nucleico (c) y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables,

para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno autoinmune de la piel, un trastorno inflamatorio de la piel

o una membrana mucosa o piel dañada en un animal.

En un aspecto preferido la invención proporciona tales usos, polipéptidos, moléculas de ácido nucleico, o composiciones farmacéuticas para la administración tópica a la piel.

Preferiblemente dicho trastorno es eczema, acné, psoriasis, inflamación gastrointestinal (tal como en la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y otra inflamación crónica), gingivitis e inflamación de la cavidad oral y esófago y dicha piel dañada está irritada o inflamada, agrietada por frío, quemada por el sol, dañada por calor o irradiación o como el resultado de una herida.

Como se usa en el presente documento, “tratar” se refiere a la reducción, alivio o eliminación, preferiblemente a niveles normales, de uno o más de los síntomas o efectos de dicho trastorno o daño, por ejemplo, presencia o grado de piel dañada, por ejemplo, tamaño relativo de la herida, inflamación, rojez, picor, dolor, etc. en relación con los síntomas o efectos presentes en una parte diferente del cuerpo de dicho individuo no sujeto a dicho tratamiento o en un individuo correspondiente no sujeto a dicho tratamiento.

“Prevenir” se refiere a prevención absoluta, o reducción o alivio del grado o momento (por ejemplo, retraso) del comienzo de ese síntoma o efecto. Esto se puede conseguir, por ejemplo, por métodos de terapia génica, por ejemplo, el uso de secuencias anti-ARN o sin sentido.

Los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico para su uso según la invención se pueden combinar ventajosamente con la administración de uno o más principios activos que son eficaces en el tratamiento o la prevención de los trastornos o daño de la piel. Por tanto, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener además uno o más de tales principios activos.

Según un aspecto adicional más de la invención proporcionamos productos que contienen uno o más polipéptidos, moléculas de ácido nucleico o anticuerpos como se definen en el presente documento y uno o más principios activos adicionales como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en la terapia humana o animal.

Las composiciones de la invención se pueden formular de manera convencional con uno o más vehículos, excipientes y/o diluyentes fisiológicamente aceptables, según las técnicas bien conocidas en la técnica usando ingredientes fácilmente disponibles.

Por tanto, el principio activo se puede incorporar, opcionalmente junto con otras sustancias activas como una preparación combinada, con uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes convencionales, para producir preparaciones galénicas convencionales tales como comprimidos, píldoras, polvos, pastillas para chupar, sobres, obleas, elixires, suspensiones (como fluidos de inyección o infusión), emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), pomadas, cápsulas de gelatina blandas y duras, supositorios, soluciones inyectables estériles, polvos empaquetados estériles y similares. Polímeros biodegradables (tales como poliésteres, polianhídridos, ácido poliláctico, o ácido poliglicólico) también se pueden usar para implantes sólidos. Las composiciones se pueden estabilizar mediante el uso de liofilización, sobreenfriamiento o Permazyme.

Excipientes, vehículos o diluyentes adecuados son lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, carbonato de calcio, lactosa de calcio, almidón de maíz, aglinatos, tragacanto, gelatina,

silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, jarabe de agua, agua, agua/etanol, agua/glicol, agua/polietileno, glicol, propilenglicol, metil celulosa, metilhidroxibenzoatos, propil hidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio, aceite mineral o sustancias grasas tales como grasa sólida o mezclas adecuadas de los mismos. También se puede usar agentes para obtener formulaciones de liberación sostenida, tales como carboxipolimetileno, carboximetil celulosa, acetato ftalato de celulosa, o polivinilacetato.

Las composiciones pueden incluir además agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de incremento de la viscosidad, agentes de granulación, agentes de desintegración, agentes de unión, agentes activos osmóticos, agentes de suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, potenciadores de la absorción (por ejemplo, agentes de penetración superficiales o para la administración nasal, por ejemplo, sales biliares, lecitinas, tensioactivos, ácidos grasos, quelantes), pigmentos, disolvente orgánico, antioxidante, agentes estabilizantes, emolientes, silicona, ácido alfa-hidroxi, emoliente, agente antiespumante, agente humectante, vitamina, fragancia, espesantes iónicos o no iónicos, tensioactivos, relleno, espesante iónico o no iónico, secuestrante, polímero, propulsor, agente alcalinizante o acidificante, opacificante, agentes colorantes y compuestos grasos y similares.

Las composiciones de la invención se pueden formular para proporcionar liberación rápida, sostenida o retrasada del principio activo después de la administración al cuerpo empleando técnicas bien conocidas en la técnica.

La composición puede estar en cualquier forma farmacéutica apropiada para permitir la administración o dirigiendo células particulares o tejidos, por ejemplo, como una emulsión o en liposomas, niosomas, microsferas, nanopartículas o similares con las que el principio activo se pude absorber, adsorber, incorporar o unir. Esto puede convertir eficazmente el producto a una forma insoluble. Estas formas particuladas pueden superar tanto los problemas de estabilidad (por ejemplo, degradación) como de administración.

Estas partículas pueden llevar moléculas superficiales apropiadas para mejorar el tiempo de circulación (por ejemplo, componentes de suero, tensioactivos, polioxamina908, PEG, etc.) o restos para la dirección específica a sitio, tales como ligandos a receptores portados celulares particulares. Técnicas apropiadas para la administración de fármaco y para dirigir son bien conocidas en la técnica y están descritas en el documento WO99/62315.

Se prefiere el uso de soluciones, suspensiones, geles y emulsiones, por ejemplo, el principio activo se puede llevar en agua, un gas, un líquido basado en agua, un aceite, un gel, una emulsión, una emulsión de aceite en agua o agua en aceite, una dispersión o una mezcla de los mismos.

Las composiciones pueden ser para la administración tópica (por ejemplo, a la piel), oral o parenteral, por ejemplo, por inyección. Como se mencionó anteriormente en el presente documento, la leucolectina muestra muy poca variación entre diferentes especies. De hecho, se ha encontrado que es invariante en una población humana sana y, por consiguiente, esto permitiría el uso de leucolectina, por ejemplo, mediante la administración por inyección en sujetos, sin desencadenar una respuesta de anticuerpo humoral, de una manera similar a la proteína insulina que también es invariante en la población humana. Por lo tanto, la terapia sistémica por inyección de leucolectina se puede usar para tratar las condiciones descritas en el presente documento, particularmente trastornos autoinmunes.

Sin embargo, se prefieren las composiciones y la administración tópica, e incluyen geles, cremas, pomadas, rociadores, lociones, ungüentos, barras, jabones, polvos, películas, aerosoles, gotas, espumas, soluciones, emulsiones, suspensiones, dispersiones, por ejemplo, dispersiones de vesícula no iónica, leches y cualquier otra forma farmacéutica convencional en la técnica.

Las pomadas, geles y cremas, por ejemplo, se pueden formular con una base acuosa o aceitosa con la adición de agentes espesantes adecuados y/o gelificantes. Las lociones se pueden formular con una base acuosa o aceitosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, dispersantes, de suspensión, espesantes o colorantes. Los polvos se pueden formar con la ayuda de cualquiera base en polvo adecuada. Las gotas y soluciones se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que comprende también uno o más agentes dispersantes, solubilizantes o de suspensión. Los rociadores en aerosol se administran convenientemente a partir de envases presurizados, con el uso de un propulsor adecuado.

Alternativamente, las composiciones se pueden proporcionar en una forma adaptada para la administración oral o parenteral. Por tanto, las formas farmacéuticas alternativas incluyen comprimidos lisos o revestidos, cápsulas, suspensiones y soluciones que contienen el componente activo opcionalmente junto con uno o más vehículos y/o diluyentes convencionales inertes, por ejemplo, con almidón de maíz, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, ácido cítrico, ácido tartárico, agua, agua/etanol, agua/glicerol, agua/sorbitol, agua/polietilenglicol, propilenglicol, alcohol estearílico, carboximetilcelulosa o sustancias grasas tales como grasa sólida o mezclas adecuadas de los mismos.

La concentración del principio activo en las composiciones de la invención depende de la naturaleza del compuesto usado (es decir, el polipéptido, molécula de ácido nucleico o anticuerpo), el modo de administración, el curso del tratamiento, la edad y el peso del paciente, la indicación médica, el cuerpo o el área corporal a tratar y se puede

variar o ajustar según elección. Sin embargo, generalmente, los intervalos de concentración para el compuesto descrito en el presente documento son de 0,0001, 0,0005, 0,001 o 0,01 a 25 %, por ejemplo, 0,0005 a 15 %, por ejemplo, 0,01 a 10 %, tal como 0,1 a 5, por ejemplo, 1 a 5 % (p/p de la preparación final para la administración, particularmente para la administración tópica). Dichas concentraciones se determinan en referencia a la cantidad del propio compuesto y, por tanto, se deberían hacer concesiones apropiadas para tener en cuenta la pureza de la composición. Las dosis únicas eficaces pueden caer en el intervalo de desde 0,1 a 100 mg/día, preferiblemente 2 a 10 mg/día, dependiendo del animal a tratar, tomadas como una sola dosis. La administración puede ser por cualquier método adecuado conocido en las técnicas medicinales, incluyendo, por ejemplo, la administración oral, parenteral (por ejemplo, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa), percutánea, bucal, rectal o tópica

o administración por inhalación. Las formas de administración preferidas se administrarán de forma oral, o lo más preferiblemente de forma tópica. Ya que se apreciará que la administración oral tiene sus limitaciones si el principio activo es digerible. Para superar tales problemas, los ingredientes se pueden estabilizar como se mencionó previamente.

Se apreciará que puesto que el principio activo para la realización de la invención toma una diversidad de formas, por ejemplo, molécula de ácido nucleico (que puede ser un vector) o polipéptido, la forma de la composición y la vía de administración variará. Sin embargo, preferiblemente las soluciones líquidas, cremas o suspensiones se emplearían, particularmente, por ejemplo, por administración oral o administración tópica.

Se pueden usar o bien el polipéptido o las moléculas de ácido nucleico de la invención para las indicaciones médicas anteriormente mencionadas. En los últimos métodos de terapia génica, las moléculas de ácido nucleico se proporcionan preferiblemente en vectores que son adecuados para la transfección/transformación como se describió anteriormente, por ejemplo, vectores virales tales como adenovirus que usan los métodos de terapia génica conocidos en la técnica para aplicaciones médicas.

Los animales a los que se pueden aplicar o administrar las composiciones incluyen mamíferos, reptiles, pájaros, insectos y peces (por ejemplo, salmón o bacalao). Preferiblemente los animales a los que se aplican las composiciones de la invención son mamíferos, particularmente primates, animales domésticos, ganado y animales de laboratorio. Por tanto, los animales preferidos incluyen ratones, ratas, conejos, cobayas, gatos, perros, monos, cerdos, vacas, cabras, ovejas y caballos. Especialmente preferiblemente las composiciones se aplican, o administran, a seres humanos.

Los siguientes Ejemplos se dan solamente a modo de ilustración en los que las Figuras referidas son las siguientes:

La Figura 1 muestra (A) la filtración en gel de zonasa de salmón parcialmente purificada para producir leucolectina. Se conectó una columna Superdex 16/60 (GE Healthcare) a un sistema de FPLC y se usó con un flujo de tampón de 1 ml/min durante 120 ml. Se hizo un seguimiento de la elución de las proteínas desde la columna por UV 280 nm (eje y derecho) y se recogió en fracciones de 1 ml. La actividad de la zonasa se midió por escisión de Chromozym X a DO406. El peso molecular nativo de la zonasa abarca un amplio intervalo con un pico de alrededor de 50 kDa. El PM de lectina = 30 kDa, y (B) identificación de (leuco-)lectina de salmón por inmunotransferencia. Los análisis de inmunotransferencia de proteína de fracciones seleccionadas obtenidas de la anterior filtración en gel usando un anticuerpo anti-(leuco-)lectina basado en epitopo (véase Figura 3). Los números fracción se muestran por encima de las inmunotransferencias. Los marcadores del peso molecular (kDa) están indicados a la izquierda. El peso molecular estimado de la lectina corresponde al obtenido por otros métodos (véase Figura 3).

La Figura 2 muestra la identificación de células productoras de lectina (lectocitos) en embriones de salmón atlántico en la que los paneles A, B y C representan secciones transversales a través del cuerpo de los embriones del salmón atlántico que se han fijado en formalina e incrustado en parafina. La presencia de leucolectina se determinó por medio de un anticuerpo anti-LL policlonal de conejo usando método de tinción con inmunoperoxidasa (A) o inmunofluorescencia indirecta (B y C). Las células que reaccionan al anticuerpo antilectina se pueden ver como oscuras (A), o claras (B y C) en comparación con el fondo, respectivamente. Numerosas células únicas reactivas con rasgos citológicos específicos se ven en la epidermis sin restricciones espaciales a lo largo del eje embrionario anterior-posterior. Las flechas en A y B señalan a células relativamente grandes (lectocitos), fácilmente distinguibles de las células epidérmicas circundantes. Sus núcleos son basales, aunque el citoplasma está lleno con leucolectina de manera que las células sobresalen como setas en el espacio perivitelino. El panel 2C muestra sus contenidos granulares.

La Figura 3 muestra el alineamiento de las Leucolectinas de Ser humano, Salmón, Pollo, Bacalao y dos traducciones de los dos cóntigos que componen la familia de UniGen Ssa.23163, una colección de EST de salmón. De los dos cóntigos, el cóntigo 1 es el que se parece lo máximo a la estructura primaria de las leucolectinas. Sin embargo, la diferencia entre los dos cóntigos no es grande, solamente aproximadamente 80 %.

La Figura 4 muestra (A) dominios SMART de secuencias similares a Leucolectina humana. Se presentan las secuencias de mayor puntuación de una búsqueda BLASTP usando WU-BLAST 2. Las secuencias se enumeran desde la más a la menos similar. a – leucolectina humana, b – leucolectina embrionaria de salmón, c –

leucolectina leucocítica de salmón (fragmento), d – leucolectina de pollo (fragmento), e – leucolectina de bacalao (fragmento), f – lectina de huevo de pez de carpa común (Nº Ac -P68512), g – ranaspumin-6 de rana túngara (Nº Ac: B5DCK6), h – Zgc de pez cebra: proteína 173443 (Nº Ac: A8E4Z1). Indicar que las secuencias de Leucolectina leucocíticas de salmón, leucocíticas de pollo y leucocíticas de bacalao son solamente parciales, y no secuencias de longitud completa. La versión de longitud completa de estas secuencias probablemente se parecerá a la estructura total encontrada en la leucolectina de leucocitos humanos (a) y embriones de salmón (b). Además, el patrón de Leucolectina, con 5 dominios TECPR consecutivos, aún se mantiene para la secuencia de rana túngara, pero no para la secuencia de pez cebra en la que solamente se encuentran 4 dominios TECPR, y

(B) una representación gráfica de leucolectina con 5 dominios TECPR. Los dominios TECPR lo más probablemente se componen de 4 cadenas beta que generan 2 láminas beta. Hay tres enlaces disulfuro: uno es interno en TECPR Nº 4, los otros dos están en bucles de conexión, como se indica. En general los sitios de reconocimiento del azúcar se encuentran en tales lectinas en las áreas entre los dominios TECPR. La lectina más estrechamente relacionada con la Leucolectina tiene una especificidad a azúcar conocida para principalmente la N-acetilglucosamina. La especificidad de reconocimiento de azúcar putativa para la Leucolectina se mantiene estable.

La Figura 5 muestra la presencia de Lectina perivitelina en Leucocitos. Se usó una tira de IPG que abarca el intervalo de pH de 4 a 7 en la primera dimensión, mientras que se utilizó un gel de poliacrilamida al 12,5 % durante la segunda electroforesis de dimensión.

A: en leucocitos de salmón, se encontraron solamente dos puntos que reaccionaban positivamente al anticuerpo policlonal antiLectina. Su peso molecular era alrededor de 26 kDa, con un pI alrededor de 6,5. La leucolectina también se puede identificar en preparaciones de leucocito en otras especies.

B: en una preparación de salmón, encontramos que un número de puntos inmunoreactivos (enumerados del 1 a 8), con un peso molecular alrededor de 30 kDa, que abarcaban un intervalo de pH de pI de 4,9 a 6,5.

La Figura 6 muestra la coexpresión de leucolectina en el linaje mieloide, específicamente en el linaje monocitomacrófago en pez cebra. (A) Perfil de expresión del gen de lectina y L-plastina. Se encontró que el pez cebra expresaba la misma lectina que encontramos en el salmón. Una sonda de ARNm de lectina marcada con fluoresceína se usó junto con una sonda marcada con DIG para la sonda de ARNm de L-plastina, la cual es un marcador específico del linaje de monocito-macrófago. La hibridación in situ marcada doble revela la coexpresión del ARNm de lectina y L-plastina en las mismas células durante la embriogénesis del pez cebra. La edad de los embriones en horas postfertilización (pf) en las esquinas izquierdas inferiores. Las señales más claras indican la expresión del gen de L-plastina; las señales más oscuras indican la expresión de Lectina.

El panel A (vista lateral) muestra la coexpresión de ARNm de lectina y L-plastina en las mismas células, que forman una población axial y paraxial dispersada en la yema anterior y lateral. Mayor aumento (A2) revela morfología de leucocito típica de estas células. El dato en A1 demuestra expresión de estos dos genes en bandas bilaterales de células en el mesodermo de la placa lateral anterior (flechas). El panel B revela los mismos descubrimientos a 21 h.

El panel C (24 h pf) demuestra la coexpresión de los genes de L-plastina y Lectina en la masa celular intermedia posterior (dos flechas superiores), en la región de la vena ventral (flecha inferior), en número significativo de células dispersadas a lo largo del cuerpo y la cabeza embrionaria. Mediante 24 hpf (C2) una mayoría de las células coexpresan estos dos genes (véase las flechas), pero muchas células parecen expresar solamente uno de los otros genes. Las flechas en C3 indican células que expresan solamente ARNm de L-plastina, y

(B) colacalización celular de proteína Lectina y ARNm de L-plastina, embriones de pez cebra (22 hpf) se analizaron por inmuno-histoquímica combinada con ensayo de hibridación in situ para la proteína lectina (señal más oscura) y ARNm de L-plastina (señal más clara). La hibridación in situ usó el ARNc marcado con DIG específico para el gen de L-plastina, combinado con inmunohistoquímica con anticuerpo policlonal antilectina de conejo.

Panel A: la visión frontal del embrión. Las flechas señalan un grupo de células marcadas por la expresión común de proteína Lectina y ARNm de plastina. A1: aumento mayor del conjunto demostrando la coexpresión del gen de L-plastina y la proteína lectina en la misma célula (flechas negras). Notificación de unas pocas células, pequeñas en tamaño con forma redonda que se parecen a los linfocitos maduros próximas a otra célula con un núcleo segmentado, un rasgo morfológico típico de leucocitos neutrófilos maduros. Los paneles B, C, D, E ilustran poblaciones celulares dispersas por todo el embrión de pez cebra que coexpresan ARNm de proteína lectina y L-plastina (flecha).

La Figura 7 muestra la familia de leucolectina. Las proteínas leucolectina disponibles de Ser humano, Salmón, Pollo y Bacalao se parecían (alineamiento weblogo). La correspondencia total de restos AA en una posición

están representadas por las letras mayúsculas, con tamaño descendiente indicando menor grado de correspondencia. Letras múltiples indican variaciones.

La Figura 8 muestra fracciones teñidas con coomassie después de la purificación de leucolectina recombinante por cromatografía de columna. Las líneas son 1–sobrenadante, 2–flujo continuo, 3-lavado, 4–F1, 5–F2, 6–Mezcla de F3, F4 y F5, 7–F6 y 8–STD.

La Figura 9 muestra (A) experimentos para identificar y establecer una secuencia génica para Leucolectina de salmón.

El panel A ilustra dos puntos duplicados positivos identificados en el filtro nº 6, paneles Nº 5 y 2, que corresponden a la placa exacta número 257 y 176, y buenas coordenadas del clon L-7 y F-7, respectivamente. El panel B demuestra un punto duplicado positivo identificado en el filtro nº 3, panel Nº 6, que corresponde a la placa exacta número 144 (basada en la lámina localizadora de placa), y buenas coordenadas del clon A-12, y

(B) muestra la secuencia genómica deducida del gen de leucolectina (2.323 pb). El sitio de los 5 exones está indicado, y como consecuencia, también los intrones. La localización del inicio de Transcripción para este gen (predicción del promotor, basado en la Predicción de Promotor de Red Neural BDGP, “P”, inicio de transcripción previsto “ST”, caja TATA “T”) y las secuencias que especifican la poliadenilación (“PA”) en el producto génico están indicadas.

La Figura 10 muestra (A) un mapa que expone los cromosomas humanos, las posiciones de los aciertos (hits) de BLASTP (véase la tabla) están indicadas por flechas, (B) mapa de cobertura leyenda: A visualización de la posición de los aciertos BLASTP (barras) en, y la cobertura total de la secuencia query (leucolectina humana). Aparentemente la suma de las secuencias encontradas cubre la secuencia de Leucolectina entera, pero los datos claramente no implican que este sea el gen de Leucolectina, C) tabla que expone los aciertos de BLASTP y su posición en el genoma humano usando Leucolectina humana como la secuencia query.

La Figura 11 muestra los efectos de la leucolectina de salmón en epitelio humano. Cultivo control = A; Cultivo expuesto a leucolectina = B. Las flechas señalan a las células grandes que aparecen en la capa basal solamente después de la exposición a leucolectina.

La Figura 12 muestra la expresión de la proteína leucolectina en leucocitos. El panel A muestra 2D PAGE al 12 % de proteína purificada, alrededor de 2 µg, a partir de leucocitos de salmón. El panel B muestra 2D PAGE al 15 % de la proteína purificada, 0,8 µg, a partir de los leucocitos humanos de Lymphoprep™. Las membranas se trataron con anticuerpo primario policlonal a LL de salmón, antes de ser tratada con anticuerpo anti-conejo de cabra, y se visualizaron por el sistema de detección aumentado de ECL.

La Figura 13 muestra los transcritos de leucolectina de salmón identificados en transferencias Northern. El panel A muestra ARN total de embriones de salmón atlántico (370 gd) fraccionados en agarosa al 1,2 % en presencia de formaldehido, y se sondaron con ribosonda marcada con DIG antisentido específica para LL (720 pb). El panel B muestra el análisis de transferencia Northern del ARNm (purificado por perlas magnéticas de poli T). La hibridación usó ribosondas marcadas con DIG generadas a partir de la secuencia codificadora parcial de LL. El panel C muestra que la membrana de nitrocelulosa (B) se sondó con ribosonda marcada con DIG sentido. Las flechas grises significan transcrito presente; la flecha negra señala su ausencia. Se usó el marcador I de ARN con DIG, 0,3 a 6,9 kb (Roche).

La Figura 14 muestra un alineamiento Clustal W de LL con proteínas β-hélice relacionadas.

La Figura 15 muestra un modelo 3-D de LL. El panel izquierdo muestra dos vistas de una representación en 3-D de un modelo en 3-D de β-hélice de 5 aspas de Leucolectina basado en la estructura de Taquilectina 1 de Tachypleus tridentatus (Biesel y col., 1999, EMBO J. 18, pp 2.313-2.322). El modelo se genera usando el programa informático PyMol v 0.99. Los restos de los péptidos epítopo están dibujados en líneas negras finas en el cuerpo de la proteína. También, las posiciones de los 5 sitios de unión a carbohidratos previstos por Biesel y col. (1999) están indicados como estructuras de hexona en marrón borrosas pero sólidas. El panel derecho muestra representaciones de los dominios hélice previstos en LL (parte superior) y en LHP (parte inferior), en comparación con el dominio hélice consenso.

La Figura 16 muestra la amplificación de la longitud completa de la secuencia de ADNc de leucolectina (LL) de pez cebra. El panel A muestra los amplicones que se obtuvieron usando varios pares cebadores, y se clonaron por RT-PCR. El ARNm usado para la transcripción inversa se extrajo de los embriones a 24 hpf. El marcador de ADN: marcador de 100 pb (New England Biolabs). El panel B muestra que 5’RACE PCR dio como resultado la amplificación de dos productos distintos, respectivamente alrededor de 500 pb y alrededor de 400 pb (generados después una segunda ronda de amplificación por PCR usando cebador inverso específico a gen y cebador anidado directo GeneRacer). Los ARNm se recogieron de fases de desarrollo indicadas. El panel C muestra que la secuencia de ADNc de longitud completa de LL de pez cebra es de 1240 nt incluyendo un marco abierto de

lectura (ORF) de 765 nt. El ORF comprende cinco exones que están dibujados a escala y mostrados como recuadros negros. La región 5’UTR está representada como línea continua. Se muestra la secuencia de nucleótidos de 5’UTR. Los sitios de inicio de traducción ATG en la posición +1 y el segundo ATG potencial en la posición +94, están resaltados. El panel D muestra la expresión de la LL truncada en diversas fases de desarrollo. El panel E muestra que las secuencias de salmón y pez cebra se conservan altamente incluso en el 3’UTR.

La Figura 17 proporciona un compendio de la variabilidad de exones, dominios y secuencia de Leucolectinas de salmón. Los datos de secuencia para diferentes leucolectinas se muestran en relación con las posiciones de restos AA variables, restos de cisteína (C) y dominios TECPR (a partir de la base de datos SMART). Las secuencias de leucolectina difieren en solamente siete posiciones, marcadas en recuadros. Cinco de tales restos variables se dan dentro de los dominios TECPR, mientras que dos se encuentran cerca del terminal C-terminal. Las variaciones incompatibles con o bien leucolectina-1 o leucolectina-2 se muestran debajo como leuolectina-3, en la que solamente se definen dos posiciones en el presente documento (Nº2 y Nº 245). Aunque las otras posiciones no están marcadas, los datos indican que la mayoría de estas posiciones son casi idénticas a las otras leucolectinas.

Como es el caso con la lectina de huevo de pez (LHP), se prevé que los 3 puentes disulfuros en LL conectan, respectivamente, las primeras y las últimas cisteínas, mientras que las cisteínas segunda y penúltima forman un segundo puente, y las dos (mitad) cisteínas dentro del exón 3 forman el último puente disulfuro. Estas cisteínas están marcadas en gris y subrayadas. La cisteína en el propéptido no implicada en los puentes disulfuros está en el exón 1. Indicar la falta de bucles de interconexión entre los tres dominios, y la falta de variación en dos bucles que interconectan los dos últimos dominios TECPR. Tres dominios TECPR están codificados por un solo exón (2 y 3), mientras que dos dominios abarcan dos exones. La correlación aguda de los extremos de exones y dominios es notable. En cuatro de los cinco dominios, un resto Trp ocupa el tercer AA del dominio, mientras que en el primer dominio de TECPR previsto, W es el resto inicial. Por último, los asteriscos marcan los restos en los que AA variantes se han encontrado en una o ambas leucolectina-1 o leucolectina-2.

La Figura 18 muestra la proteína LL en el fluido de eclosión de embriones de trucha asalmonada (Oncorhyncus mykiss), detectada en las transferencias Western. Los patrones de PM se muestran a la izquierda (BioRad 1610373). Las proteínas del fluido de eclosión de trucha asalmonada (Línea 1) y la proteína leucolectina de salmón preparada por cromatografía de afinidad (Línea 2) sondada con anticuerpo antileucolectina. Se encuentra una proteína de alrededor de 26 kDa en ambos casos, correspondiente al PM de LL.

La Figura 19 A, panel izquierdo, muestra la leucolectina de bacalao entre las proteínas encontradas en fluido de eclosión de bacalao. El fluido de eclosión de bacalao se analizó por SDS PAGE al 15 %, y sus proteínas constituyentes visualizadas por tinción con plata. La Línea 1: marcador de proteína (BioRad’s Dual color 1610374). La Línea 2: proteínas de fluido de eclosión. El panel derecho muestra fluido de eclosión, separado por el análisis de SDS PAGE al 15 %, sometida a transferencia sobre una membrana de nitrocelulosa, y sondada con diluciones apropiadas de anticuerpo IgG antileucolectina policlonal de conejo purificado por afinidad. La Línea 1: marcador de proteína (BioRad’s Dual color 161-0374). Línea 2:

Alícuota de fluido de eclosión. La localización de la leucolectina se señaló con precisión usando anticuerpo secundario anti-conejo de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (HPR), aumentado por el sistema de detección de ECL. Se detectó una proteína inmunoreactiva principal de alrededor de 26 kDa. B muestra la SDS PAGE equivalente y la membrana para las proteínas de fluido de eclosión de Oikopleura dioica.

Ejemplo 1: Identificación y caracterización de leucolectina

Aislamiento de proteína

Durante el trascurso del análisis de los componentes del fluido de eclosión del salmón se identificó una nueva proteína presente en los embriones.

Un método para preparar zonasa parcialmente purificada que se puede usar como material de partida para aislar el polipéptido de la invención se proporciona en el documento WO99/29836 (particularmente el Ejemplo 1 del método descrito, pero opcionalmente sin la etapa de urea).

Se purificaron tanto zonasa como leucolectina a partir del fluido de eclosión de salmón. Para mejorar la concentración de proteína del fluido de eclosión, se transfirieron huevos de salmón a volúmenes mínimos de agua antes de la eclosión. Se puede inducir eclosión altamente simultánea por temperaturas elevadas (ambiente), o por desoxigenación (Oppen-Berntsen y col. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417-430), que produce un volumen pequeño de preparación altamente concentrada de zonasa en bruto y proteínas asociadas.

La purificación inicial de zonasa implicó filtración de huevos de salmón eclosionados a través de estameña. Este filtrado se puede congelar durante años sin degradación significante de la zonasa, antes de ser descongelado y empleado para purificación de proteína adicional. Este hecho simplifica mucho la producción de un material de partida para la purificación de la zonasa de salmón y proteínas asociadas, incluyendo leucolectina.

A continuación, la etapa opcional implicada que ajusta el filtrado de proteína a urea 4 M, para disociar los fragmentos de la cáscara de huevo de salmón, que permitió su separación junto con restos extraños por centrifugación a baja velocidad (15.000 g; 2x15 min). Este material no mostró señal de atasque de columnas, que es característico de materiales en bruto preparados de manera diferente de la que se describió anteriormente. Esta preparación de proteína en bruto era adecuada para la purificación por técnicas cromatográficas convencionales y además la zonasa se puede purificar como se describe en el Ejemplo 7.

La leucolectina del fluido de eclosión se puede aislar junto con la zonasa. A partir de las preparaciones de zonasa parcialmente purificada (como se describió anteriormente), la leucolectina se puede aislar por cromatografía de exclusión ya que la zonasa en su forma nativa es sustancialmente mayor que la leucolectina. Para una primera separación, columnas de Superdex 16/60 con las condiciones descritas en la leyenda de la figura 1 son suficientes, después de lo cual la zonasa se puede separar por cromatografía de afinidad en columnas de Benzamidina-Sefarosa.

Para preparaciones a gran escala el uso de la ultrafiltración es también adecuada ya que la zonasa en su forma nativa no penetra significativamente los ultra filtros con exclusión por tamaño de 100 kDa a diferencia de la leucolectina.

Los tampones usados son Tris milimolar (por ejemplo, 10 mM) a pH alrededor de la neutralidad o ligeramente alcalino (pH 7,5 a 8,5), conteniendo NaCl 5 mM.

También se concibe la extracción a gran escala de leucocitos humanos de productos que están caducados en bancos de sangre, mediante el uso de la extracción en disolventes orgánicos (por ejemplo, acetona al 80 %) debido a que la leucolectina se mantiene en solución durante este procedimiento que precipita la mayoría de las otras proteínas. La purificación final por métodos cromatográficos y de filtración son como anteriormente.

También se encuentra que la proteína aislada se expresa en gametos y en el cigoto y, además, también en el embrión temprano (durante la ontogenia del sistema hematopoyético), y finalmente, en leucocitos.

Se encontró que la proteína no identificada previamente se copurifica con zonasa. El tamaño de esta nueva proteína, estimado por cromatografía bajo condiciones nativas, era casi de 30 kDa. (Figura 1).

Expresión de proteína

La proteína aislada se usó para generar un anticuerpo policlonal. Se analizó la presencia de la proteína en células por medio de un anticuerpo anti-LL policlonal de conejo usando un método de tinción por inmunoperoxidasa o inmunofluorescencia indirecta. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Mediante el uso del anticuerpo, encontramos que la nueva proteína originada en un tipo celular diferente de las células que producen coriolisinas (enzimas de eclosión). La morfología de estas células individuales (denominadas lectocito) se muestra en la Figura y es claramente distinta de células de glándula de eclosión (individuales) que expresan coriolisinas.

Análisis de secuencia

La nueva proteína se sometió a caracterización estándar tal como la determinación de sus péptidos trípticos, seguido de secuenciación Edman directa parcial. A partir del rompecabezas de péptidos, las construcciones de ensayo y error de los cebadores degenerados para detectar un ARNm en embriones de pez para producir un ADNc, eran a la primera fallidos hasta que el cebador inverso se colocaba simplemente para emparejar una cola de poliA. De esta manera, y con el uso de nuevos conjuntos de cebador múltiples ya que llegan a ser identificados, somos capaces de encontrar al menos dos ADNc de aproximadamente 1.200 NT. Estos probaron ser muy similares en secuencia, con solamente un puñado de restos AA variantes. Para ambos, alguna de la secuencia N-terminal estaba ausente.

Usando metodología N-RACE establecimos posteriormente que las secuencias anteriores pertenecían a una proteína de 255 aminoácidos, con un polipéptido de 19 AA y con un resto de triptófano N-terminal inusual en la proteína procesada. Este último resultado explicaría las grandes dificultades en obtener una secuencia N-terminal por análisis directo. Sin embargo, esto se consiguió finalmente para confirmar los restos N-terminales virtuales.

Usando la secuencia N-terminal de la proteína para investigar bases de datos de EST, identificamos una secuencia de proteína que claramente representaba la nueva proteína (Fig. 3).

La investigación de las bases de datos para proteínas con similitud a la nueva proteína identificó solamente un candidato en cierto modo similar (Leren, no publicado). Esto es una lectina de huevo de pez aislada de carpa (Galliano y col., 2003, Biochem., J., 376, p 433-440), con una similitud total de como mucho 48 % encontrada por un alineamiento manual de secuencias.

El análisis bioinformático sugirió que la nueva proteína era una lectina relacionada con las tectoninas (Leren, no publicado). En la recopilación de una lista de todas las proteínas con estructura de dominio TECPR similar, nuestra nueva lectina parece representar un nuevo tipo de lectina (Figuras 4A y B). La secuencia AA virtual de la nueva lectina contenía cinco dominios TECPR que mostraron alguna similitud con taquilolectinas en invertebrados inferiores (Shigenaga y col., 1993, J. Biochem (Tokyo), 114, p 307-316).

La forma de propéptido de la nueva lectina contiene un péptido de 19 AA que sugirió su objetivo a lisosomas y para posterior secreción potencial (es decir, en el espacio perivitelino).

La secuencia de AA virtual de la nueva lectina permitió el desarrollo de anticuerpos específicos a epítopo, que de uno en uno nos permitieron identificar muchas (2 a 8) isoformas de apariencia de la proteína (Fig. 5), dependiendo del tejido analizado.

Una posibilidad es que la lectina encontrada en las células de glándula de exclusión (Fig. 6B) se secrete en el espacio perivitelino junto con las coriolisinas, y que estas posean modificaciones postraducción que incrementan su tamaño aparente y que reducen su pI aparente.

Ya que el salmón es un pez tetraploide, y ya que nuestros datos indican más de un gen para Leucolectina en salmón, la serie de 8 restos de Leucolectina en preparaciones de zonasa parcialmente purificadas puede ser el resultado de tres modificaciones crecientes de dos proteínas Leucolectina ligeramente diferentes, para un total de 4x2, o 8 leucolectinas diferentes. Las causas de variación necesitan ser verificadas empíricamente.

El PM estimado de la lectina es alrededor de 25 a 30 kDa. El pI estimado para la correspondiente lectina de salmón es aproximadamente pH=6,5. Los pI observados (Riste, no publicado) eran de pH 6,5 a 4,9 en lectinas de perivitelino de salmón, y desde pH 6,4 a 6,6 en lectinas leucocíticas de salmón (la lectina se identificó por técnicas de transferencia Western).

Expresión durante el desarrollo embrionario

Usando sondas de nucleótido para localizar la expresión de la nueva proteína durante el desarrollo embrionario de pez, encontramos que la proteína presente en tipos específicos de células epidérmicas de embriones de pez. Además, encontramos la expresión de la proteína en tanto los gametos así como en el cigoto. Además, se mostró que la proteína está ausente en la mayoría de las células de los organismos, pero se expresa en unas pocas células embrionarias lo cual sugiere que la proteína se podría relacionar con mielopoyesis (Figuras 5 y 6). Tal patrón de expresión es único. Por tanto, elegimos la misma “leucolectina” (LL abreviada) para la proteína.

Expresión en diferentes especies

Una investigación de sangre de pez a pollo a seres humanos reveló que las leucolectinas están presentes en leucocitos a través de este linaje de vertebrados. Su presencia también se podría detectar en todos los invertebrados usando nuestro anticuerpo policlonal. El encontrar leucolectinas en leucocitos (humanos) sugirió inmediatamente posibles funciones para las leucolectinas. La leucolectina se da en células que llevan a cabo funciones inmunes.

Lo más sorprendente era la invariancia de secuencia extrema durante la evolución (Figura 7). Usando tecnología de par de cebador estándar podríamos detectar ADN por todo el linaje de vertebrados. El análisis reveló una secuencia extremadamente conservada de pez a pollo a seres humanos, lo cual señalaría funciones esenciales para tales genes. La varianza entre la secuencia de pez y ser humano es alrededor de 4 % (10 AA variantes), o 96 % de similitud, donde la mitad de las varianzas observadas eran sustituciones AA conservativas. En comparación, la proteína conocida bastante similar es una lectina de huevo de pez (LHP) de la carpa común (menos de 48 % de similitud).

El compendio de la estructura de LL variante (Figura 7) define la nueva familia LL de proteínas. Vemos aproximadamente 2 % de cambios no conservativos en AA desde pez a seres humanos. Claramente, el código de genes de LL para proteínas que se someten a extrema selección evolutiva para mantener la invariabilidad de secuencia. Esto de uno en uno señala funciones importantes pero todavía desconocidas que previenen la mayoría de la variación aleatoria en los productos génicos del surgimiento y el arraigo durante la evolución de especies.

Preparación de leucolectina recombinante

Se clonó ADNc de leucolectina de salmón de embriones. Los cebadores de PCR se diseñaron para contener el sitio de restricción Ncol (directo) y ACC65 I (inverso). El vector pETM-60 se digirió con NcoI/ACC65I y los productos PCR digeridos se ligaron por ligación durante la noche. Después de la amplificación de plásmido y la secuenciación, los vectores de expresión de pETM-60 que contenían el inserto de Leucolectina verificado por secuencia se transformaron en células competentes BL21 (DE3)p Lys y las colonias usadas para inocular 5 ml de LB (= Caldo Luria) para preparar reservas de glicerol bacterianas.

Cultivo bacteriano y purificación de proteína: El nuevo vector bacteriano pETM60-Leucolectina posibilitó la expresión de proteínas recombinantes etiquetadas con His fusionadas al terminal C de NusA a través de una secuencia de reconocimiento de proteasa TEV. Se purificaron eficazmente por afinidad de metal y se recuperaron en forma soluble después de la separación del patrón de fusión.

Materiales y métodos:

Cebadores superiores e inferiores de PCR:

NWA15dPET(Nº23): NcoI

5’-GCA.CCA.TGG.CCA.TGG.GCT.GGG.ACT.GTC.AGG.AGG.TAG.TA

CH.A15dPET(Nº13): ACC65I

5’-CCG.AAG.CTT.GGT.ACC.ATG.TGT.GCA.CAC.CAT.GGT.GAC

Mezcla de PCR:

dNTP Cebador Nº 23/Nº 13 ADNc ADN polimerasa buf.: 4 µl 0,5 µl (10 µl) 2 µl 10 µl

ADN polimerasa dH2O: 0,5 µl hasta 50 µl

Reacción de PCR:

98 ºC: 10 s

55 ºC: 15 s

72 ºC: 1 min

30 ciclos

70 ºC: 10 min

Tanto el producto de PCR como el plásmido pETM-60 se digirieron con Ncol y enzimas de restricción ACC65I; y se purificaron del gel de agarosa al 1 % para la ligación.

Ligación de ADN inserto al vector por ADN ligasa T4: La ligasa T4 se usó para unir el 5’ fosfato y los grupos de 3’-hidroxilo de moléculas de ADN de doble cadena usando la siguiente mezcla:

200 ng de ADN vector 500 ng de ADN inserto 10X tampón ligasa 1 µl T4 ligasa Volumen hasta 10 µl

La incubación era a temperatura ambiente durante la noche, y la inactivación por calor de la ligasa se consiguió

colocando el tubo en baño de agua a 65 ºC durante 10 minutos. La mezcla de ligación se sometió a electroporación en células competentes DH5α, y las colonias usadas para inocular 5 ml de LB.

Se escogieron aleatoriamente 10 clones para el análisis. El análisis se hizo por digestión de pETM60-Leucolectina con NcoI/ACC65I.

Se verificó la secuencia de Leucolectina inserto por secuenciación de pETM60-Leucolectina con los cebadores Nº 13 y Nº 23.

Traducción in vitro de Leucolectina

BL21(DE3)pLysS contiene un plásmido (pLysS con resistencia a cloranfenicol) que codifica T7 lisozima para reducir niveles de base de T7 polimerasa antes de la inducción. BL21(DE3)pLysS proporciona control más ajustado de la expresión proteica de proteínas tóxicas y es una cepa para la expresión proteica de alto nivel y fácil inducción.

La etiqueta de fusión usada en la expresión proteica recombinante y la purificación era NusA que tiene un tamaño de 495 aa (54,81 kDa) y está localizada en el terminal N y se usa para aumentar la solución de proteínas que se sobreexpresan.

NusA-Leucolectina se purificó eficazmente por afinidad de metal y se recuperaron en forma soluble después de la separación del patrón de fusión.

Materiales para la expresión y purificación de NusA-Leucolectina:

Placa de kanamicina Medio 2YTG IPTG 0,4 mM (concentración final de 0,4 µM. Columna His Trap (5 ml) La inducción se realizó durante 3 horas a 26 ºC.

Protocolo de purificación

La actividad enzimática inherente del sobrenadante de NusA-Leucolectina antes de la purificación: 0,0060/min Calibración de la columna con 25 ml de tampón B (1xPBS, imidazol 30 mM, NaCl 0,4 M)

Aplicación de muestra:

Se filtraron 28 ml del sobrenadante y se desgasificaron, y 25 ml del mismo se aplicó a la columna.

La columna se lavó con 75 ml de tampón B. La elución fue con 25 ml de tampón C (1xPBS, imidazol 0,5 M, NaCl 0,4 M), con una elución de una etapa. Se recogieron muestras de 1 ml.

Resultados:

Más del 98 % de la actividad de la proteasa de las proteínas recombinantes en bruto se encontraron en el flujo continuo y el lavado. Solamente el 1,6 % de la actividad de la proteasa se recuperó en fracciones de columna incluyendo aquellas (F6 y F7) con la Leucolectina recombinante, identificadas por análisis SDS-PAGE (véase la Figura 8). Estas fracciones contenían 0,3 % (niveles de base de la actividad de la proteasa aplicada a la columna).

Conclusión:

La Leucolectina recombinante está desprovista de actividad de serina proteasa y, por tanto, es una lectina verdadera.

Por lo tanto, las trazas de actividad de la serina proteasa encontrada en algunas preparaciones de leucolectina de origen natural (fluido de eclosión), deben representar trazas de zonasa.

La leucolectina y la zonasa coexisten en el fluido de eclosión, y tienden a copurificarse durante la mayoría de los procedimientos cromatográficos, pero se pueden separar por ultrafiltración final usando filtros Biomax de tamaño de exclusión de 100 kDa.

Análisis de proteína recombinante

La LL recombinante de salmón producida como anteriormente y purificada por SDS PAGE se analizó por técnicas MS/MS. El espectro de la Huella peptídica de LL se analizó en Mascot tanto en las bases de datos de proteína NCBI como de EST para Actinopterygii sin encontrar ningún acierto significante (Riste, no publicado). Estos espectros bien comparados con los espectros de LL obtenidos de restos de LL embrionarios y leucocíticos eluidos del análisis en gel 2-D de tales LL, confirmando además la existencia de isoformas de LL observadas por métodos por gradiente de pH.

Secuencia genómica

En el salmón hemos establecido la secuencia genómica de los genes para su entidad mediante sondeo de genotecas Bac con una sonda de 670 nt (también se describe un protocolo completo en detalle en el Ejemplo 10).

5 Por tanto, una secuencia de ADNc de longitud completa para Leucolectina estaba disponible a partir del uso de cebadores degenerados basados en la información derivada de secuencias AA de proteína parciales. Las amplificaciones por PCR de ADNc de embriones de 370 gd (grados día) (es decir, embriones cerca de, pero no aún en, la eclosión) generaron el amplicón de 630 pb, el cual se purificó en gel y se secuenció.

10 Las sondas específicas a gen se usaron para cribar una genoteca BAC (18x cobertura; tamaño de inserto promedio, 188 kb), la cual se puso a disposición por el consorcio del ”Salmon Genome Project” (SGP). Las sondas (tamaño 630 pb) se prepararon incorporando digoxigenina-11-dUTP (Roche) usando el método de PCR. El cribado de la genoteca Bac dio como resultado la identificación de 7 clones positivos caracterizados como A-12/144, L16 /143, P6/76, B-5/70, O-20/85, L-7/257, F-7/176. Las respuestas positivas se ilustraron en los Paneles A y B.

15 Las respuestas específicas de los clones seleccionados se confirmaron por amplificación por PCR usando los mismos cebadores que para la sonda marcada de ADN usada para el cribado de la genoteca Bac. El tamaño del inserto dentro de la secuencia vector se estimó por electroforesis en campo pulsado. Los clones se secuenciaron comercialmente (MWG-Biotech, Alemania) mediante el método de secuenciación aleatoria.

20 Este trabajo estableció diversos genes estrechamente relacionados para leucolectinas en el genoma del salmón (tetraploide) (Figuras 9A y B). Una varianza en las secuencias segmentarias parecería sugerir la existencia de al menos dos genes similares. Estructuralmente, las leucolectinas aparecen como genes normales con 5 exones y 4 intrones, en un gen aproximadamente de 2.300 pb desde el inicio de la transcripción al sitio de poliadenilación, un

25 tamaño bastante estándar.

Sin embargo, nuestros datos nos posibilitan determinar que no se han publicado genes con una secuencia similar en ningún organismo hasta la fecha. Usando sondas a exones o intrones individuales, podríamos establecer solamente la similitud rara de un exón a partes de otras dos proteínas publicadas, las cuales ambas son totalmente distintas de

30 la entidad molecular que hemos descubierto.

Las investigaciones de las bases de datos indican que no se pueden encontrar gen que corresponda a la proteína LL, el trascrito de ARNm de LL, o al gen genómico para la Leucolectina en cromosomas humanos. Aparentemente, el gen de Leucolectina todavía no se encuentra en ningún sitio, o su secuencia no está aún depositada, o la

35 secuencia del gen LL todavía no se ha detectado en seres humanos. En investigaciones adicionales usamos elementos estructurales pequeños individuales enumerados en la Tabla 2 de a continuación, para localizar tales elementos en las bases de datos.

Tabla 2

Exón/intrón LL: Longitud (NT) Aciertos

Desde Ts-Inicio a exón I: 51 Ninguno

Exón I: 55 Crom.11, 7, 1, 18, 17, 10

Exón I + Intrón I: 55 + 89 Crom.11, 14, 18, 13

Exón II: 234 Región de protocadherina, enz. tiamina trifos.

Exón II + Intrón II: 234 + 163 ninguno

Exón III: 218 Proteína de músculo liso, Receptor de linfocito T, etc.

Exón III + Intrón III: 218 +133 Región V de la cadena beta del receptor de linfocito T

Exón IV: 116 Ninguno; Crom. 20 y 21

Exón IV + intrón IV: 116 + 682 Cromosoma 8 (x2)

Exón V: 142 Ninguno; alguno?

Exón V + intrón V: 142 + 404 Cromosomas 5 y 4

Ts-inicio a extremo poliA: 2283 Ninguno; alguno?

ADNc: 765 Ninguno

Proteína LL: 255 AA Ninguno

Intrón I: 89 Crom. 3, 4, 18, 14

Intrón II: 163 Crom. 14, X, 4

Intrón III: 133 Crom. 21, 2, 7, 4, 15, 13, 18, 12, 8, 1,

Intrón IV: 682 Crom. 18 (x2)

Intrón V: 404 Ninguno; alguno?

Los resultados indican que algunas proteínas conocidas presentaron algún grado de similitud a partes de la Leucolectina – se proporcionan los números del cromosoma relevante. Las secuencias no localizadas en cromosomas se indican como “alguno?”.

5 El acierto primario era Transgelina humana, que es una proteína 22-alfa del músculo liso (SM22-alfa) (WS3-10). La transgelina es una proteína de unión a actina, y es uno de los marcadores más tempranos del músculo liso diferenciado. La función de esta proteína todavía no se ha determinado. http://harvester.embl.de/harvester/P378/P37802.htm

10 Sin embargo, alinear las secuencias de proteína de Transgelina y Leucolectina mostró secuencias consenso mínimas. De otra manera, se encontró alguna pequeña similitud en partes de la estructura de LL con respecto a un receptor de linfocito T y con una proteína desconocida. Importantemente, este nuevo gen se expresa específicamente en leucocitos humanos, a pesar del hecho de que este gen no se puede (aún) encontrar en secuencias publicadas del genoma humano. (Alguna expresión también se ve en preparaciones purificadas de

15 trombocitos humanos.) Solamente se pueden detectar segmentos muy cortos de este gen en el genoma humano, pero estos segmentos se distribuyen mucho por una multitud de cromosomas humanos (véase la Figura 10).

El patrón observado de distribución en los cromosomas es desconcertante. Tales secuencias cortas no se pueden relacionar con el gen LL, si el propio gen LL humano hasta ahora no se ha secuenciado o localizado en un 20 cromosoma específico. La resolución de este enigma aún no está al alcance.

Discusión

Se ha identificado una nueva lectina LL en leucocito humano que es casi idéntica a la LL de pez y pollo. El gen LL en 25 salmón es de estructura estándar pero aún no se ha encontrado en seres humanos.

Ejemplo 2: Aplicaciones médicas de leucolectina

Materiales y métodos

30 Los siguientes estudios se llevaron a cabo usando la proteína de leucolectina de salmón (referida como LL), preparada como se describe en el Ejemplo 1. La concentración de LL usada era de aproximadamente 1 a 10 microgramos/ml. La zonasa-proteasa estaba presente con LL en una relación de 1:100 en una emulsión de agua y aceite de coco (en la cual está presente más de 30 % de aceite de coco). La leucolectina es estable en presencia de

35 zonasa.

Resultados

A. PIEL AGRIETADA POR EL FRÍO

40 Mucha gente experimenta agrietamiento estacional de la piel, particularmente de las manos.

La aplicación de leucolectina a la piel durante el comienzo de la estación fría aplazó drásticamente, o en muchos ejemplos previno, el comienzo de las grietas por el frío. Este fenómeno se ha registrado en una docena de casos. 45 Las observaciones sobre los efectos sobre grietas por el frío establecidas de LL son menores, pero se han revelado algo cercanas de las heridas por frío establecidas.

B. PIEL DAÑADA POR QUEMADURA SOLAR

50 Excesiva exposición solar a piel desnuda puede causar quemaduras solares, y dar como resultado sensaciones de calor, rojeces, picores y descamamiento final de la piel expuesta.

La aplicación de leucolectina dio como resultado el descoloramiento de la rojez en minutos, el cese del picor y no el suceso final de descamamiento de la piel. Estas estupendas observaciones se han observado repetidamente en 55 muchos individuos.

C. PIEL DAÑADA POR EL CALOR

Después del daño directo por calor a la piel, la aplicación de leucolectina de salmón parecía prevenir las 60 consecuencias normales de tal daño a un grado considerable, y detener el daño si se aplicaba algún tiempo después del daño original y acelerar la recuperación completa.

D. ACNÉ

Los casos subclínicos de acné han respondido en muchos menores por un cese inmediato del picor y de la rojez. El mejoramiento de los acnés per se se han visto en un pequeño estudio piloto en aproximadamente la mitad de los casos tras la aplicación de LL en la emulsión de aceite de coco.

E. PSORIASIS TÓPICA

Parches grandes de piel psoriática han respondido a la aplicación de leucolectina de salmón con primero, un casi intermediario que reduce la rojez, seguido de sensación drásticamente reducida de picor. La congregación en exceso de la piel caliente se retrajo durante las primeras pocas semanas, pero volvieron a ocurrir tras el cese de la aplicación de LL:

F. HERIDAS ABIERTAS DE LA PIEL

Se hicieron observaciones sobre voluntarios humanos. Estudiamos casos de heridas de la piel abiertas crónicas y que supuraban que habían resultado de la comprensión de las heridas del talón después de cirugía de cadera rota, y que se habían atendido sin éxito por el personal sanitario durante meses y hasta un año. Las llagas vistas eran de medio a dos cm de diámetro.

Tras la aplicación de las preparaciones de LL esterilizadas por filtro a heridas crónicamente abiertas en las extremidades inferiores (piernas), observamos que el líquido paró de supurar de las heridas después de 2 a 3 días, seguido de rápida reducción del área de la herida, de manera que después de 2 a 3 semanas, las heridas estaban desapareciendo y estaban siendo reemplazadas por piel normal.

Dada la naturaleza de los pacientes con heridas que aparecen primero en el extremo de las extremidades, observamos que las primeras heridas a desaparecer de la manera anterior eran las heridas proximales. Esto lo interpretamos como las heridas más recientemente establecidas. Las últimas heridas a desaparecer eran las heridas distales cerca del talón, que son las heridas establecidas durante más tiempo. Finalmente, todas las heridas desaparecieron.

G. ESTUDIOS IN VITRO

Se obtuvieron cultivos de epitelio de piel humana diferenciada de SkinEthics (Niza, Francia) el día 16 después de la siembra sobre los sustratos de crecimiento de plástico con microporos que permitían el acceso de nutrientes al tejido epitelial desde abajo. Tales cultivos presentan morfología de piel normal después de la diferenciación durante el periodo de cultivo a 37 ºC. Estos cultivos se mantuvieron durante dos días más in vitro de modo que el stratum corneum superior estaba expuesto al aire, y el stratum basalis al sustrato de crecimiento. Cultivos paralelos se movieron a atmósfera húmeda a 30 ºC y se presentaron con una solución salina tamponada con fosfato que contiene Ca, Mg medio durante 6 horas con o sin la presencia de 10 µg/ml de leucolectina de salmón. Los cultivos se fijaron en formalina y se incrustaron en parafina según los procedimientos estándar, y se tiñeron con hematoxilina/eosina. Se observó en la epidermis inducción rápida de grandes células basales, con señas de proliferación celular (Figura 11). Interpretamos que tales resultados están relacionados causalmente con los efectos de curación de la leucolectina sobre la piel, en los cuales una combinación de proliferación celular y diferenciación celular es suficiente para cerrar la herida y reestablecer la integridad epitelial de la piel.

Discusión:

No hemos encontrado expresión de productos génicos de LL en cultivos celulares de queratinocitos. También, las células dendríticas son las únicas células en la piel epitelial en relación con los leucocitos sanguíneos. El acceso normal de leucocitos a la piel epitelial se ve afectado después de alguna agresión mecánica o biológica debido a la escasa circulación, que es cuando con frecuencia se dan las heridas de comprensión en la piel normal. La administración de leucolectina ignora esta deficiencia y desencadena mecanismos normales de curación en la piel.

Ejemplo 3: Expresión de proteína leucolectina en leucocitos

Se obtuvo sangre de salmón de Industrilab, Univ. de Bergen. Se recogió sangre completa de pez en tubos con heparina (Riste, no publicado), y se procesó según Miller y col. (1988, Nucleic Acids Research, 16(3) p1215). Se obtuvieron muestras de sangre humana del Banco de Sangre en el “Haukeland University Hospital”, Noruega.

Se recogió sangre humana completa en tubos con tampón de citrato de 5 ml, y se procesaron según Miller y col. (1988, supra) para preparar leucocitos. Esta preparación se purificó más mediante el enriquecimiento con Lymphoprep™ (Axis-Shield PoC, Noruega). Lymphoprep™ se usó según su protocolo para preparar una fracción de leucocito humano. Esta fracción se usó por análisis de inmunotransferencia, como se describe en Miftari y Walther (no publicado). El análisis por 2D PAGE seguido de los procedimientos descritos por MacGillivray y Rickwood (1974, European Journal of Biochemistry, 41, pp. 181-190), con alrededor de 1 µg de proteína. Las proteínas LL de estas

dos especies se visualizaron por 2D PAGE usando inmunotransferencias para la detección específica de proteínas LL y sus isoformas. Los tratamientos con el anticuerpo primario policlonal a LL de salmón seguido por anticuerpo anti-conejo de cabra, seguido por visualización de proteínas LL por el sistema de detección aumentada por ECL. La especificidad de la reacción inmune se ensayó en geles múltiples aplicando desde 0,5 a 5 µg de proteína, con resultados similares.

Los leucocitos de salmón presentan 2 isoformas de LL de PM alrededor de 26 kDa, con pI similar a las formas más básicas de las 8 formas isoeléctricas de LL encontradas en el PVF de salmón. Es difícil estimar PM exactos por extrapolación de patrones de PM en la segunda dimensión de 2D PAGE. Los leucocitos humanos contienen un antígeno LL principal de peso molecular de alrededor de 30 kDa, de los cuales otras observaciones están cerca de 27 kDa. El pI ácido corresponde al pI promedio de las isoformas LL de salmón encontradas en PVF (Riste, supra) (véase la Figura 12).

Ejemplo 4: Transcritos de leucolectina de salmón identificados en transferencias Northern

Se obtuvieron huevos de salmón de una reserva de sangre de salmón de piscifactoría en Bolaks as (Fusa, Noruega), mantenida durante múltiples generaciones desde 1975 por seleccionó fenotípica, y ahora parte de la reserva de salmón propagada por Salmo Breed A/S, Noruega.

Aislamiento de ARN total y ARN poliadenilado

El ARN total se aisló de embrión de salmón en fases de pre-eclosión, tardías (alrededor de 370 gd) usando el reactivo Trizol (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad del ARN total en términos de la integridad y la pureza se valoró sobre un gel de agarosa de formaldehido teñido con bromuro de etidio. El ARN total se cuantificó espectrofotométricamente. La fracción poliadenilada de ARN (ARNm) se aisló de 5 a 10 µg del ARN total usando el kit de purificación de ARNm de perlas Dynal (Invitrogen).

Construcción de sondas

Se generó sonda de ARNc marcada con Digoxigenina (DIG) antisentido por transcripción de moldes de ADN plásmido digerido por SP1 con ARN polimerasa T3. La sonda de ARNc marcada con DIG sentido se generó por transcripción de molde de ADN plásmido digerido por Xhol con ARN polimerasa T7 (sentido) usando el kit de marcación de ARN con DIG (SP6/T7) (Roche Diagnostics) según los protocolos de fabricación. Las sondas de ARNc antisentido y sentido de LL marcadas con digoxigenina (DIG) generadas abarcaban alrededor de 650 pb.

Análisis de transferencia Northern

Alícuotas de 0,5 µg de ARNm puro y 1 µg de ARN total se sometieron a electroforesis y transferencia sobre membrana de nitrocelulosa positivamente cargada (Amersham). Las membranas se prehibridaron en el tampón DIG Easy Hyb (Roche) a 55 ºC durante 2 h y, a continuación, se hibridaron a 55 ºC durante 16 h, con 1 µg/ml de ribosonda de LL. El lavado se realizó dos veces a baja severidad en 2x SSC con SDS al 0,1 % a TA durante 15 min cada uno, y dos veces a alta severidad en 0,1x SSC con SDS al 0,1 % a 65 ºC durante 20 min cada uno. Las membranas se incubaron en una solución bloqueante que contenía el tampón de ácido maleico (pH 7,5) y reactivo bloqueante al 1 % (Roche) y posteriormente en la solución bloqueante con anticuerpo conjugado anti-DIG-fosfatasa alcalina (AP) (Roche) diluido 1:10.000 a TA durante 1 h. Después de lavar con tampón de ácido maleico 100 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,5 %, la membrana se calibró 2 min en el tampón de detección (TrisHCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 9,5 a TA). Las dianas sonda híbridas se visualizaron por ensayo quimioluminescente usando CSPD (Roche) como sustrato, y la exposición de las transferencias a película de rayos X (Kodak) durante 5 a 30 min. Se usó el marcador (Roche) de peso molecular de ARN marcado con DIG.

Se usó ribosonda específica a LL marcada con DIG antisentido para estimar el tamaño de transcritos de LL maduros. El análisis de transferencia Northern del ARN total (Figura 13A) reveló un mayor transcrito con el tamaño de alrededor de 1.250 pb, y también se observó un transcrito de banda más débil (alrededor de 3.200 pb). La banda dominante corresponde a un transcrito del trascrito de LL maduro (intrón-less) y traducible. El análisis de transferencia Northern del ARNm purificado usando la misma ribosonda reveló una única banda de alrededor de

1.250 pb (indicando que el ADNc amplificado estaba cerca de una secuencia codificadora de longitud completa (Figura 13B). Cuando las transferencias de las muestras de ARN total y ARNm se incubaron con una ribosonda específica a LL sentido se observó ausencia de una señal de hibridación indicando que la ribosonda que se usó era suficientemente específica (Figura 13C). El transcrito menor (alrededor de 3.200 pb) es mayor que el transcrito de LL de longitud completa para el salmón. Dada las condiciones específicas para la hibridación, esta entidad probablemente refleja una entidad que contiene información de secuencia de LL. Las señales positivas de solamente sondas antisentido y no de sondas sentido, enfatizan la especificidad de los resultados. El tamaño del transcrito de longitud completa aloja todos los exones de LL anteriormente descritos.

Ejemplo 5: Alineamiento de LL con proteínas β-hélice relacionadas

Se llevaron a cabo análisis bioinformáticos sobre secuencias de LL de salmón en comparación con la información depositada en bancos de secuencia públicas.

El análisis Clustal W (Figura 14) indicó que la secuencia de aminoácidos deducida de la leucolectina de salmón no compartía similitud de secuencia significante con ninguna de las proteínas publicadas en el banco de datos. Sin embargo, BLAST revela similitudes a proteínas más distantemente relacionadas, incluyendo LHP, una lectina derivada de huevo de pez de Cyprinus carpio (Nº Acc. Gene bank P68512) con similitud total de solamente 48 % (valores E de 2,00 E-50). Además, una proteína hipotética de pez cebra (HPZ; Nº Acc. LOC678590) presentaba una similitud total de 45 % (valores E de 2,00 E-48). Las comparaciones de secuencia también demostraron que la leucolectina era idéntica al 38 %, 28 % y 26 % a TPL-1 (previamente Lectina L6) de cangrejo herradura (Nº Acc. P82151), tectonina I de Physarum polycephalum) (Nº Acc. 061063) y Tectonina II (061064). (Por SwissProt, estos números eran, 49, -, 35, y 29 % de identidades, respectivamente, y el valor E para LHP 1 e-51 y para L6, 1 e-40). Nuestros datos sugieren una mayor similitud de LL al vertebrado que a los homólogos invertebrados. No incluido, es una identidad al 30 % de LL con proteína que contiene repeticiones de β-hélice de tectonina humana (KIAAO329_humana).

Los alineamientos múltiples revelaron que de los cuatro enlaces disulfuro bioquímicamente confirmados en LHP (Galliano y col., 2003, Biochem. J. 376, pp. 433-440), tres parecen estar conservados en leucolectina. El primer puente conecta el extremo N-terminal al extremo C-terminal de ambas proteínas. El puente conecta las cisteínas en las posiciones 3 y 234 en LL (o 238 en LHP)). El segundo y el tercer puente conecta Cys 102 a Cys 155 en LL (Nº 157 en LHP), y Cys 132 y Cys 137 en tanto LL como LHP. El cuarto enlace disulfuro encontrado en LHP de carpa, que implica Cys 208 (212) y Cys 226 (230) se encuentra en leucolectina.

Ejemplo 6: Modelo 3-D de LL (Leucolectina)

La proteína de leucolectina comparte un alto grado de similitud en términos de arquitectura de dominio TECPR con L6 o taquilectina 1 (Tachypleus tridentaus), una lectina de unión a lipopolisacárido bacteriano de hemocitos de cangrejo herradura, y otras proteínas relacionadas con taquilectina de invertebrados. Aun así, se observaron diferencias en términos del número de dominios, junto con un ligero desplazamiento de los dominios de β-hélice hacia el C-terminal de la proteína. Resumiendo la información de las búsquedas de similitud y las búsquedas SMART, inferimos que la estructura 3-D total de la leucolectina presenta una estructura de proteína β-hélice de 5 aspas. Sobre esta base recurrimos al modelo 3D (Biesel y col., 1999, EMBO J., 18, pp. 2.313-2.322) para dar un modelo de trabajo de cómo se puede observar la proteína de leucolectina. Esto es solamente una aproximación, ya que los números de resto de una proteína se establecen iguales a los restos en la otra. Las búsquedas en la base de datos SMART indican un rasgo estructural prominente de la proteína leucolectina virtualmente traducida, que consiste en cinco repeticiones en tándem, conteniendo cada una 35 a 36 AA con identidades de secuencia interna al 32 a 61 % (Figura 15, panel derecho). Los tramos repetidos internos de la proteína de leucolectina deducida mostraron similitud entre ellos, siendo mayormente 13 AA de longitud. Dos secuencias consenso cortas, XWXXLPGXLKXXXVGPX y GVNKNDXXYXLVG, se conservan altamente en cada repetición. Aparte de un tramo de 20 restos en la región N-terminal de leucolectina, que no se encontró en la LHP, ambas proteínas muestran un alto grado de similitud entre el número y la arquitectura de dominio total de los dominios TECPR, mientras que comparte solamente 48 % de identidad de secuencia.

Ejemplo 7: Purificación de la zonasa de fluido de eclosión de salmón

El fluido de eclosión de salmón en el Ejemplo 1 además se puede purificar para producir una preparación de zonasa pura. Una ronda de filtración por gel era suficiente para separar la zonasa de los componentes moleculares mayores en el filtrado con una purificación 12 veces con mejor que un rendimiento al 50 %. La matriz utilizada puede variar, pero Sephacryl SR-200® fue nuestra elección habitual. El tampón era Tris-HCl pH 8,0 o pH 8,5 (0,05 M) o Tris-Acetato (0,025 M, mismos pH). La zonasa obtenida después de los procedimientos de filtración por gel representa los restos de zonasa predominantes en el fluido de eclosión.

La zonasa se purificó a un producto proteico homogéneo por cromatografía de afinidad sobre columnas Benzamidina-Sefarosa 6B® comercialmente disponibles. Las condicione específica utilizada (con columnas de volúmenes 25 o 125 ml) era de nuevo un tampón de Tris-HCl 0,05 M (pH 8 o 8,5), la cual para separar el material no específicamente unido sobre las columnas, se ajustó a NaCl 1 M. La zonasa no se separó mediante esta etapa, ya que la proteína se mantenía ligeramente unida a la columna. La elución de la zonasa de la columna se consiguió usando un gradiente de dioxano 10 a 33 % en NaCl 1 M en el mismo tampón Tris-HCl. Después de la purificación por afinidad, la preparación de la zonasa presentó una banda de proteína en el análisis SDS-PAGE, con un peso molecular de alrededor de 28 kDa, Aunque, este producto de zonasa no era de pureza grado de secuencia era altamente purificada.

La zonasa purificada por filtración por gel más purificada por afinidad se purificó más hasta pureza de grado de secuencia por un procedimiento cromatográfico final. Este procedimiento empleó una columna PBE94®, con un

tampón de Tris-Acetato (10 mM, pH 9,0), donde la posterior elución fue con un gradiente de sal (hasta sal de NaCl 1 M) en este tampón. La propia etapa incrementó la actividad catalítica de la zonasa mediante unas 7,6 veces más, para una purificación total de 714 veces, y con un rendimiento de 28 % a partir del material de partida. Esta etapa de purificación dejó la identidad de proteína de la zonasa intacta como un resto de 28 kDa.

Ejemplo 8: Producción y purificación de anticuerpos LL

Se preparó antisuero anti-LL de salmón anti-conejo de conejo policlonal como sigue: La proteína de leucolectina purificada de grado de secuencia del Ejemplo 1 se usó para causar anticuerpo policlonal en conejo de Chinchilla de 4 kg, como se describe por Harlow y Lane (1988, “Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, NY). Tres inyecciones de 80, 40 y 25 mg de leucolectina de grado de secuencia se colocaron en múltiples sitios subcutáneos. La primera se emulsionó con adyuvante completo de Freund, las dos últimas con adyuvante incompleto después de 3 y 6 semanas. Ochos días después de la dosis de refuerzo final, se recogió sangre y el suero se preparó después de centrifugación a 3.000 rpm (Sorvall SS-34 rotor) durante 15 min.

Alícuotas del antisuero se almacenaron a -80 ºC. Los anticuerpos primarios se purificaron por afinidad usando columnas de Proteína G de 1 ml HiTrap (Amersham Pharmacia Biotech) con caudal de 1 ml/min. Se filtró el antisuero completo a través de la unidad de filtro de 45 µm antes de aplicarse a columnas de Proteína G de 1 ml. La calibración de la columna se llevó a cabo usando 5 a 10 volúmenes de columna de tampón de unión (fosfato de Na 20 mM, pH 7,0) seguido de varios lavados con el mismo tampón hasta que no se detectó proteína mediante la absorbancia de UV a 280 nm. La fracción de IgG se eluyó con 5 ml de tampón de elución (glicinaHCl 0,1 M, pH 2,7) y se dividió en 10 tubos que contenían 25 µl de tampón de neutralización (TrisHCl 1 M, pH 9,0). La concentración se determinó de manera espectrofotométrica. La pureza se estimó analizando las alícuotas de las fracciones de IgG purificadas en SDS PAGE al 12 % con posterior tinción de plata. La sensibilidad se determinó por análisis de transferencia Western usando anti-IgG de conejo de cabra, anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante.

Además, los anticuerpos policlonales se adsorbieron previamente por incubación en polvo de acetona de pez cebra. El anti-F(ab’)2 de conejo de marrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) era de Dako (F-0054). El anti-IgG de conejo de cabra marcado con Alexa Fluor 647 se obtuvo de la Sonda Molecular, Eugene, US (Invitrogen, nº de catálogo. A-21244) y las anti-inmunoglobulinas de conejo de marrano policlonales biotiniladas eran de Dako (nº de catálogo E0353). Las concentraciones óptimas de los anticuerpos primarios y secundarios se determinaron mediante los anteriores experimentos de dilución. Los anticuerpos policlonales se usaron en el análisis de expresión de proteína descritos en el Ejemplo 1.

Ejemplo 9: Identificación y caracterización de LL de pez cebra

El ARN total se aisló del embrión del pez cebra a 4, 6, 12, 24, 48 hpf y 5 dpe usando el procedimiento Trizol (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. La integridad y la pureza del ARN total se valoró sobre un gel de agarosa formaldehido teñido con bromuro de etidio. Se usaron solamente muestras con una relación de ARNr 28S a 18S de 2-2,4:1, y contaminación de ADN no detectable. El ARN se cuantificó de manera espectrofotométrica. El ARNm poliadenilado se aisló de 5 a 10 µg de ARN usando kits de Dynal (Invitrogen).

La transcripción inversa se realizó usando 200 U/µl TermoScript (Invitrogen). Se calentó ARNm (0,5 µg) a 72 ºC durante 5 min, se enfrió, aglomeró y se añadió a una mezcla de reacción de 20 µl que contenía 100 ng/µl de oligo dT, DDT 10 µM y 0,8 U/µl de inhibidor de la ARNasa en tampón de síntesis de ADNc 2,0 mM (Invitrogen). La incubación era a 50 ºC durante 1 h. Los productos se purificaron por extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, se pasó a través de la columna MicroSpin S-200HR, y se precipitó por etanol. Los cebadores de LL específicos a gen se diseñaron a partir de las secuencias de LL de salmón (Tabla 3). La mezcla de PCR (20 µl) contenía 2 µl de molde de ADNc, 0,4 µM de cebadores (LLF1, LLF2, LLR1, LLR2, y LLR3), 1x tampón de PCR, 0,5 U de ADN polimerasa Taq (Takara), y 0,2 mM de dNTP. La amplificación por PCR usó 32 ciclos de 94 °C durante 45 s / 58 °C durante 45 s / 72 °C durante 90 s y la extensión final a 72 ºC durante 7 min. La mezcla de reacción se analizó por gel de agarosa-TBE al 1,8 % con 0,5 µg/ml de bromuro de etidio en 1x tampón TBE (pH 8,3) con marcador de 100 pb de marcador de ADN (New England Biolabs).

El fragmento de PCR se ligó en un sistema 1 de vector pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) mediante protocolos estándar.

La electroporación usó 40 µl de E. coli DH5α, y 1 µl de fragmento de PCR ligado en el vector pGEM T-Easy. El medio SOC (1 ml) se añadió antes de que se incubaran las bacterias a 37 ºC durante 1 h. Las bacterias recombinantes (200 µl) se sembraron en placa sobre placas de agar con LB/ampicilina, X-gal, IPTG estándar y se incubaron a 37 ºC durante la noche para cribado azul/blanco. Diez clones blancos se escogieron y se cultivaron en un cultivo durante la noche de 5 ml en medio LB con 100 µg/ml de ampicilina. La purificación del plásmido usó el kit de minipurificación de plásmido (Qiagen, Chatsworth, CA). Los plásmidos se amplificaron y se secuenciaron usando protocolos estándar (DNA Sequence Lab, Bergen).

Las 5’- y 3’-RACE PCR de LL se realizaron usando el kit GeneRacer core (Invitrogen Nº cat. 45-0168) según las instrucciones. Se usó 2 µg del ARN total para sintetizar el ADNc de la primera cadena en TA usando Superscript III (Invitrogen). Se realizó la primera ronda de amplificación por 5’- y 3’-RACE PCR aplicando cebador 5’-o 3’-GeneRacer y cebador específico a gen inverso o directo LLR2 y LLF3 (Tabla 3). La amplificación 5’- o 3’-RACE PCR anidada empleó cebador de 5’- o 3’-RACE PCR GeneRacer anidado y cebador específico a gen inverso o directo anidado LLR4 y LLF4. Para 5’- y 3’-RACE PCR, la primera etapa cinco ciclos, 94 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min; la próxima cinco ciclos a 94 °C durante 30 s y 70 °C durante 1 min; la tercera etapa 30 ciclos con 94 °C durante 30 s, y 68 °C durante 45 s y 72 °C durante 1 min; etapa de extensión final 72 °C durante 7 min. 5-o 3’-RACE PCR anidada en tres etapas: primera etapa 5 ciclos a 94 °C durante 30 s, 72 °C durante 2 min; la próxima etapa 5 ciclos 94 °C, 30 s, 70 °C 2 min; 3 etapa 25 ciclos 94 °C durante 30 s, 65 °C durante 30 s y 68 °C durante 1 min; etapa de extensión final 72 °C durante 10 min. Los moldes para la PCR anidada usó el producto de PCR de la primera ronda de RACE PCR diluido 1:25 en agua destilada.

Los cebadores para RACE PCR se enumeraron en la Tabla 3. Los productos de PCR sencillos se purificaron usando el kit de purificación de PCR (Promega, Madison, WI, US), y se ligaron al vector PCR II Topo (Invitrogen) para la transformación de la E. coli competente de alta eficacia JM109 (Invitrogen). Las bacterias recombinantes se identificaron por cribado azul/blanco sobre placas de agar de Luria Bertani. Los plásmidos que contenían los insertos se purificaron usando el kit de purificación Promega y se secuenciaron con cebadores M13. La secuencia de ARNm de LL se analizó usando los programas de búsqueda Blastx y Blastp.

Al combinar tres conjuntos de cebadores (véase la Tabla 3), la amplificación dio amplicones de tamaños (Figura 16A) previstos de LL de salmón. El blanco de agua sin ARNm de pez cebra era negativo. El producto más largo (720 pb) se secuenció, siempre que LL esté presente en el pez cebra. La amplificación de productos de PCR de diferentes tamaños (Figura 16A) cebado por oligonucleótidos específicos que flanquean los exones de salmón en diferentes posiciones, documentaron además alta homología entre los LL de pez cebra y salmón. Como control positivo para las reacciones de amplificación, se usó β-actina.

5’-RACE PCR aclaró la secuencia de la región 5’ no traducida (5’-UTR) de LL de pez cebra. Usamos ARNm (Figura 16B) de 4 horas postfertilización (hpf) hasta 5 días posteclosión (dpe). La primera ronda de amplificación por RACE PCR produjo productos muy débiles. Tales productos amplificados a partir de todas las fases se usaron para la segunda ronda de RACE PCR usando alta temperatura de emparejamiento (65 ºC) para incrementar la especificidad de la reacción, usando una dilución 1:20 de la primera reacción de RACE PCR. Los mismos dos productos (520 y 420 pb) se generaron a partir de todas las fases (Figura 16B), incluso desde 4 hpf. A partir de estas fases de desarrollo, se obtuvo la información de secuencia de LL de más de 20 clones. Todos los clones contenían la región en dirección 5’ de 29 nt (Figura 16C) detectada en LL de salmón. El extremo 3’ también se secuenció por análisis múltiple y se reveló una estructura muy similar (casi idéntica) a la estructura encontrada en la leucolectina de salmón. Basándose en la secuencia de ADNc de longitud completa, la proteína LL de pez cebra deducida se depositó en el NCBI Gene Bank (Nº Acc. FJ 643620). La secuencia codificadora consiste en 1.213 nt con un marco de lectura abierto de 765 nucleótidos. La secuencia de aminoácidos deducida para la LL de pez cebra sugiere una proteína de 255 AA, dado un codón de inicio de traducción en la posición de nt +1 (o nt 30-32; (Figura 16C). El ADNc de LL también tiene un codón de inicio potencial a nt +94 (Figura 16C). En 4 de 20 clones de pez cebra, el transcrito contenía los 29 nt en dirección 5’ a partir del sitio +1, pero carecía de los siguientes 93 nt (la secuencia de nt leída correctamente hasta -1 seguido del nt en +94: Figura 16C). Por tanto, los datos sugieren que dos proteínas LL diferentes se pueden traducir (Figura 16C).

La fuerte homología entre las proteínas LL de pez cebra y salmón era aparente. La LL del pez cebra es una estructura híbrida comparada con las dos LL de salmón. De siete criterios de clasificación de LL establecidos, 4 criterios colocaron la LL de pez cebra en la categoría LL-1, mientras que 2 criterios la colocaron en la categoría LL-2 (Figura 16E). El séptimo criterio es único para la LL de pez cebra (Figura 16E, área recuadrada). Además, una Cys falta en el exón 3 y está reemplazada por Arg en la secuencia "nmnTPYClts", la cual en el pez cebra lee "nmnDTPRlts". En consecuencia, la LL de pez cebra tiene 5 cisteínas, mientras que el salmón tiene 6 cisteínas, todas previstas en puentes disulfuros.

Con respecto a los diversos exones, el exón 1 es idéntico, mientras que el exón 2 del pez cebra tiene tres AA únicos no encontrados en el salmón (Gly-Arg en lugar de Ser-Gln en las posiciones nº 57 y 58, y Val en lugar de Ile en la

posición nº 78). El exón 3 tiene 4 restos alterados (o 2?). En los exones 4 y 5 no hay diferencias aparte de los 3 sitios de clasificación. Por tanto, hay 5 (o 7) AA únicos en LL de pez cebra (255 AA totales), ignorando los sitios de clasificación. La LL de pez cebra está altamente conservada en comparación con la LL de salmón, difiriendo solamente pocos puntos de porcentaje.

La LL de pez cebra (Figura 16D, E) es muy similar a la LL de salmón. La LL de pez cebra carece de una de las seis Cys vistas en la LL de salmón y, por tanto, puede contener solamente dos puentes disulfuro: uno que conecta los Ny C-terminales, más un puente interno en el exón 4. Comparando la LL de salmón y de pez cebra grande (Figura 16E), las variaciones estructurales estereotípicas vistas en salmón se refuerzan por la estructura de LL de pez cebra. Se observa una diferencia radical (resto nº 131), pero en su mayoría sustituyentes conservadas se ven cuando se dan variaciones en LL de salmón. En PVF, LL puede tener funciones inmunoprotectoras. Las variaciones restringidas en la estructura de LL pueden relacionarse con tales funciones. La leucolectina truncada (LLt) carece del péptido secretor, sugiriendo que LLt (Figura 16D) no está secretada, y LLt puede ser una proteína β-hélice de 4 aspas. Diferentes proteínas LL pueden en teoría realizar diferentes funciones celulares. La función de LLt puede funcionar en células distintas de lectocitos.

Ejemplo 10: Aislamiento y caracterización del gen de LL de salmón

Cribado de genoteca BAC

Para obtener la estructura genómica del gen de leucolectina, cribamos una genoteca BAC genómica de salmón público (18x cobertura, tamaño de inserto promedio aproximadamente 188 kb) puesta a disposición por el ”Salmon Genome Project” (Oslo, Noruega). La genoteca del cromosoma artificial bacteriano (BAC) altamente redundante construida a partir de una cepa de acuacultivo noruego del salmón atlántico macho (Salmo Salar) se cribó para clones positivos de LL. La genoteca consiste en un número total de 305.557 clones. El tamaño de inserto promedio de la genoteca es de 188 kpb, representando cobertura de genoma 18 veces. Filtros Seg. 1 de alta densidad CHORI-214 (conjunto de filtro 007193), consistiendo cada uno en 18.432 clones reconocidos en duplicados, se han producido para el cribado por hibridación.

Para cribar la genoteca, se preparó una sonda de ADNc específica a LL de 620 pb incorporando digoxigenina-11dUTP (Roche) por método PCR, usando cebadores directos LL/F 5’-TACGGACACAGGTCGAATCCCCTACTACC-3’ y cebador inverso LL/R 5’-ACAGAGAAGAGGCTAATGTGTGCAC-3’. La sonda de ADNc marcada con DIG se incubó a 95 ºC durante 10 min y se colocó inmediatamente en hielo durante 5 min antes de la adición al tampón de hibridación (5x SSC, formamida al 50 %, SDS al 0,02 %, agente bloqueante (Roche), agua tratada con DEPC).

La hibridación se llevó a cabo en tubos de hibridación a 55 ºC durante la noche. La etapa de lavado posthibridación se realizó dos veces a baja severidad en 2x SSC con SDS al 0,1% a TA durante 15 min cada uno, y dos veces a alta severidad en 0,1x SSC con SDS al 0,1% a 65 °C durante 20 min cada uno. Los filtros se incubaron en una solución bloqueante que contenía tampón de ácido maleico (pH 7,5) y reactivo bloqueante al 1 % (Roche), y posteriormente en solución bloqueante con anticuerpo conjugado anti-Dig-fosfatasa alcalina (AP) (Roche) diluido 1:10.000 durante 1 h a TA. Después de lavar con tampón de ácido maleico 0,1 M (pH 7,5) que contenía NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,5 %, la membrana se calibró durante 2 min en tampón de detección (TrisHCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 9,5 a TA). Los puntos duplicados positivos se visualizaron por ensayo qumioluminiscente usando CSPD (Roche) como sustrato. La identificación de señales positivas se consiguió exponiendo los filtros a película de rayos X (Kodak). El tiempo de exposición varió de 3 a 15 min. Dos clones positivos elegidos L-7/257 y A-12/144 se cultivaron en placa sobre placas de agar preparadas y se incubaron a 37 ºC durante la noche. Se escogieron tres clones, se cultivaron durante la noche en un cultivo con agitación de 5 ml en medio LB a 37 ºC con 20 µg/ml de cloranfenicol. La purificación de ADN plásmido se realizó el próximo día usando el kit de purificación de ADN ultrapuro (Qiagen). El ADN de BAC se digirió con Not I y se analizó por electroforesis en campo pulsado (PFGE) (Osoegawa y col., 1998, Genomics, 52, pp. 1-8). El Marcador de PFG de bajo rango (New England Biolabs) y el fragmento λ-Hind III (Takara) se usaron como marcadores de tamaño de ADN.

Verificación de PCR de clones positivos

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando ADN de BAC purificado como un molde y cebadores específicos de gen. Las reacciones de PCR se incubaron a 95 ºC durante 3 min, seguido de 35 ciclos a 95 ºC durante 30 s, emparejamiento a 54 ºC durante 30 s y extensión a 72 ºC durante 30 s con una incubación final a 72 ºC durante 10 min. Después de la termociclación, 2 µl de cada reacción de PCR se analizó sobre un gel de agarosa al 1,5 %.

Secuenciación aleatoria de clones BAC de leucolectina

Se secuenciaron dos clones por MRW, Berlín, Alemania. Los insertos vectores se secuenciaron a una redundancia estimada de 2,4 veces. Las lecturas se limpiaron de vector y elementos del hospedador. A partir de alrededor 180 lecturas, se establecieron un total de 33 y 22 cóntigos respectivamente de los dos clones de BAC usando bioinformática. Los cóntigos se examinaron tanto por secuencias de ARNm como por secuencias de aminoácidos. El

análisis identificó exones e intrones, tanto por las búsquedas del programa y por inspecciones manuales. El gen LL entero se identificó a partir de cóntigos solapados.

Estructura genómica

Los resultados del anterior cribado identificaron 7 clones específicos denominados A-12/144, L-16/143, P-6/76, B5/70, O-20/85, L-7/257 y F-7/176 según la nomenclatura de la genoteca BAC. El tamaño del inserto medio de los clones BAC genómicos se estimó a partir de ADN purificado de todos los clones BAC seleccionados, el cual se digirió posteriormente con la enzima de restricción Not I. Los productos de digestión de ADN que contenían vector se separaron por electroforesis en gel en campo pulsado y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Todos los clones de BAC produjeron solamente dos bandas, mostrando que el tamaño del vector (pTARBAC2.1) era de alrededor de 13 kpb (13,397 pb; Osoegawa y col., 1998, supra). Esto sugiere que el tamaño de inserto de todos los clones era de alrededor de 25 kpb. Las secuencias de seis de los 7 clones de BA seleccionados se verificaron una vez más por amplificación usando como ADN molde purificado de un clon BAC, junto con cebadores específicos al gen de LL. La amplificación de PCR dio un producto de alrededor 600 pb a partir de todos estos clones. Su identidad se confirmó además mediante secuenciación directa.

Secuenciación aleatoria de dos clones de BAC

Los programas de reunión de secuencia BioEdit y Dna Baser se usaron sobre todos los datos de secuencia. Los análisis revelaron que ambos clones de BAC de 25 kpb aislados contenían la secuencia de ARNm de leucolectina completa (después de la eliminación de elementos de secuencia vector), cuando se cribó frente a tanto secuencias de ARNm como secuencias de proteína. Los datos de uno de los clones de BAC produjeron un total de 80 lecturas, que se reunieron en 33 cóntigos. De estos, al menos 6 cóntigos contenían secuencias de LL, que permitieron la reconstrucción del gen de LL entero. Además de las secuencias de LL, otros componentes se identificaron frecuentemente en estos cóntigos con un alto grado de certeza, e incluían transcriptasa inversa, peptidasa iónica y elementos transponible.

Rasgos de la estructura del gen genómico de LL

En el primer análisis solamente uno de los clones (L7/247) permitió la identificación de un gen de LL entero, mientras que el otro clon (A12/144) reveló la mayoría de la estructura genómica (véase la Figura 6). Los datos del clon genómico L7/247 sugirió una organización genómica de leucolectina en la que el gen está compuesto de 5 exones interrumpidos por 4 intrones, y tramos de -2,3 kpb comenzando desde la caja TATA. Las secuencias de LL genómicas revelaron una caja TATA que comenzaba en la posición -81 (TATAAAA) desde el codón de inicio ATG, indicando un 5’UTR de 81 nt (elemento no traducible) del ARNm. El codón de parada TAG se localiza en aproximadamente 1.850 nt desde ATG en la secuencia genómica. Una señal de poliadenilación de 6 nt de longitud AATAAA comienza alrededor de la posición 2.250 desde ATG. El 3’UTR es una secuencia de aproximadamente 400 nt de longitud que comienza después del codón de parada TAG. Con un 5’UTR que consiste en 81 nt, el tamaño del gen de LL se estima a al menos alrededor 2,3 kpb por definiciones convencionales, con intrones que suponen dos veces más secuencia que los exones. Para verificar las fronteras de exón-intrón del gen de leucolectina, se diseñaron cebadores de PCR a partir de las secuencias de intrón genómico establecidas y se usaron para amplificar cada exón desde el ADN embrionario de salmón. Estas 5 secuencias de exón se derivaron por análisis de secuencia directa de amplicones, y todas correspondían a las secuencias genómicas establecidas.

Los tamaños de los exones codificadores parecían ser bastante ambiguos, y variaban entre 55 pb (Exón 1) y 234 pb (Exón 2). Notablemente, dos intrones eran relativamente pequeños de modo que una longitud exacta se podría derivar de la lectura manual de los datos. Por el contrario, el intrón 3 es de alrededor 250 nt, mientras que el intrón 4 abarca alrededor de 700 pb. La longitud exacta del intrón 4 no se podría definir de los datos disponibles. Los datos de secuencia de exón compuestos confirman el producto previsto de traducción, concretamente una proteína de 255 AA.

Además, los datos soportan una estructura de gen de LL genómica con 5 exones y 4 intrones para una de las dos variantes descritas de leucolectina. Se ha establecido que el resto AA N-terminal de la proteína LL secretada es triptófano por degradación de Edman directa de LL purificada. Este resto Trp ocupa la posición nº 20 a partir de la metionina N-terminal en la proteína precursora de 255 AA, y se predice por los aminoácidos nº 18 (His) y nº 19 (Ala). Se predice un sitio de escisión entre Ala y Trp para una proteasa de procesamiento, para generar la proteína LL secretada. Por degradación de Edman directa, la secuencia de esta LL secretada se ha establecido como WDCQE VVNIK NLMQI DAGLG Q-V, y también se verificó por secuencias de proteína virtual múltiples. Los exones no están todos en la estructura, pero permiten potencialmente que algún exón se salte sin alteración de todos los marcos de lecturas. El análisis de la secuencia genómica indicó las secuencias de las fronteras exón/intrón. La excepción es el intrón 4 en el que posiblemente los nt no estándar flanquean las secuencias intrón. En los intrones 1, 2 y 3, encontramos el rasgo GT//AG común que flanquea el comienzo y el final de muchos intrones de vertebrados (Shapiro y Senepathy, 1987, Nucleic Acids Research, 15, pp. 7.155-7.174).

El exón 1 (19 AA) es de 55 nt de longitud, con la secuencia MRATA -AVLLV -LCLLT-ISH(A) y finaliza en el primer G del condón para Ala resto nº 19 que precede al triptófano N-terminal de la leucolectina secretada. La R mayúscula en cursiva y negrita significa un AA variante en esta posición posiblemente unido a un gen de Leucolectina 3 (véase la Figura 17). La secuencia de gen genómico continua con los nucleótidos GT para empezar el intrón 1. El intrón 1 termina con los nucleótidos AG seguidos por el exón II, que contiene las dos últimas bases (-CA) del codón Ala nº 19 seguido del codón TGG para el Trp nº 20, el N-terminal de leucolectina. El intrón 1 es de 89 nt de longitud.

El exón 2 (234 nt) contiene 77 AA (234-2 nt/3=77 AA +1 nt). Aquí, la secuencia genómica traduce (ala) -WDCQEVVNIK -NLMQI DAGLG -QWAT DTSQI -PYYLV G* DKWI - RL* PGS LKHIT - VGPAG IWGVN -KDYAI YKYVA - GNWVQ AA (G) (= 77 AAs + 1 nt) antes de continuar con los nucleótidos GT (en el intrón 2). El asterisco indica un resto en el que AA alternativos se encuentran o bien en la proteína LL o en las secuencias múltiples de ADNc de LL (véase la Figura 17). G* parece variar en la Leucolectina-1, mientras que L* parece variar en la leucolectina-2. El intrón 2 es 186 nt de longitud, terminando en los nucleótidos AG.

El exón 3 (72 AA) empieza después de 2 nucleótidos con GC (=Gly, resto nº 78) y continua durante otros 216 nt (para un total de 218 nt) o 72 AA. Las lecturas de la secuencia de aminoácidos de Exón 3: (G)LL* KQL DAGGE -QFIVG ANMN* D TPYCLTSSAT -VGYKG PGSPL- PWTGL PGAVK - YYSCG P* FGCW - AVNKN DDIYL - MS, en la que el resto nº 150 es S. Tres letras mayúsculas, en negrita y subrayadas, significan AA variantes que sirven para distinguir entre la leucolectina-1 y la leucolectina-2. Las letras con asterisco de nuevo significan restos con microvariación (N* en leucolectina-2; P* significa microvariación en tanto leucolectina-1 como leucolectina-2) en tal posición (véase la Figura 17). El intrón 3 sigue, comenzando con los nucleótidos GT, y continua durante otros alrededor de 250 nt.

El exón 4 (39 AA) comienza en el AA resto nº 151= LNQDC QNKGW -SHIE* G KLSMI -EVATD GSVFG - VNSA* GSVYT, en el que T es el resto nº 189. De nuevo el resto subrayado en negrita sirve para distinguir leucolectina-1 de leucolectina-2, mientras que un asterisco significa microvariación en esta posición (véase en cualquier leucolectina en la posición E*, y solamente en leucolectina 2 para la posición A*). El intrón 4 posiblemente no puede comenzar y parar con secuencias de nt estándar para la definición del intrón. Los datos sobre el intrón 4 son, por tanto, de alguna manera preliminares y, por consiguiente, la longitud del intrón 4 es un estimado (alrededor de 700 nt).

El exón 5 (47 AA) comienza con el codón para R (= resto nº 190) y continúa hasta una histidina C-terminal (resto nº 236), que es seguida por un codón de parada TAG, y el 3’UTR. Las lecturas de secuencia: RDGIT-ASKPE-GTGWS-NIPMG*-MLMGHVTYDL-GRLWV-VSKSAV-TMVCT-H, en la que un asterisco indica microvariación en esta posición en leucolectina-1. Las letras en negrita significan diferencias entre leucolectina-1 y leucolectina-2. Las letras en negrita y cursiva significan la posibilidad de existencia de leucolectina-3. Estos datos se resumen en la Figura 17.

Ejemplo 11: Comparación de la secuencia genómica de leucolectina-1 con secuencias de ARNm de leucolectina

Con más de una docena de experimentos de clonación y secuenciación separados de ADNc de salmón, las secuencias de alineamiento revelaron que solamente en 7 posiciones son claras alternativas de diferentes restos de aminoácidos alojados. La escasez de variación de secuencia total, y la limitación estereotípica a tales variaciones, es notable.

La secuencia genómica de L-7/247 corresponde a clones de leucolectina clasificados como leucolectina-1. Los otros ADNc secuenciados denominados leucolectina-2, difieren en las siete posiciones indicadas. Además de estas posiciones, hay indicaciones de algunas variaciones adicionales en AA. Esto puede sugerir microheterogeneidad adicional de los dos ADN clasificados, pero los datos pueden sugerir la existencia de una tercera categoría de ADNc de LL, puesto que por ejemplo en la posición nº 226, no encontramos un resto de tirosina en algunos clones que nuca se observaron en ningún ADNc de leucolectina-1 o leucolectina-2 (Figura 17).

Un compendio de las variaciones observadas se muestra en la Figura 17. Los dos tipos de leucolectinas se caracterizan por respectivamente (E, I, Y, Y, K, A, V) frente a (N, V, F, F, N, G, G) en las siete posiciones (nº 88, 91, 101, 147, 158, 229, 230) de la secuencia AA deducida para la leucolectina madura. Estas 7 posiciones clasifican ambiguamente estas dos leucolectinas, que además pueden presentar microvariaciones en las posiciones estereotípicas mostradas por asteriscos en la Figura 17. Como indican los datos en la Figura 17, algunas secuencias de ARNm señalan una Gly única en la posición nº 2 del péptido señal de LL que no se ve en leucolectinas 1 y 2, y que, por lo tanto, sugiere una posible leucolectina-3. Además, hemos observado un Tyr en la posición nº 226 en la leucolectina madura cuando solamente Ser se ve en las leucolectinas 1 y 2. Concluimos que la secuencia genómica en L7/247 corresponde a secuencias de leucolectina-1 encontradas por secuenciación múltiple de ADNc de LL de salmón. Secuenciación adicional de clones de BAC de LL deberían revelar la otra categoría de leucolectina-2 principal, y tal vez también la supuesta existencia de leucolectina-3, como se definió por los anteriores criterios.

Ejemplo 12: Detección de proteínas de Leucolectina en otras especies

Se investigó la presencia de proteínas leucolectina en el fluido de eclosión de trucha asalmonada (Oncorhyncus mykiss), Bacalao y Oikopleura dioica. La proteína del fluido de eclosión se preparó por cromatografía de afinidad

analizada por SDS-PAGE al 15 %. El gel o bien se tiñó con plata para mostrar la presencia de una diversidad de proteínas, o se sometió a transferencia y a sonda con un anticuerpo de leucolectina de salmón. En cada caso se detectó una proteína única de alrededor de 26 kDa, correspondiente al peso molecular de leucolectina (véase las Figuras 18 (trucha asalmonada), 19A (bacalao) y 19B (Oikopleura dioica)).

Secuencias:

1: (polipéptido de leucolectina de embrión de salmón):

2: (polipéptido de leucolectina de leucocitos de salmón):

15 TMVCTH

3: (polipéptido de leucolectina de leucocitos de bacalao):

4: (polipéptido de leucolectina de leucocitos de pollo):

5: (polipéptido de leucolectina de leucocitos humanos):

6: (polipéptido de leucolectina de pez cebra):

7: (polipéptido de leucolectina-2 de salmón):

8: (polipéptido de leucolectina-3 de salmón):

9: (secuencia de ADNc de leucolectina de sangre humana):

10: (secuencia de gen de leucolectina de salmón, de una genoteca de ADN genómico de salmón maduro):

11: (secuencia de ADNc de leucolectina de embriones de salmón 200 a 450 días de vida – solamente exones):

12: (secuencia de gen de leucolectina de leucocitos de salmón):

13: (secuencia de gen de leucolectina de bacalao):

14: (secuencia de gen de leucolectina de pollo):

15: (secuencia genómica parcial de leucolectina de pez cebra):

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende:

5 (i) una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(ii) una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos 95 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(iii) una porción de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1, 2 o 5-8, en el que dicha porción comprende al menos 200 aminoácidos; o

10 (iv) una porción de una secuencia de aminoácidos definida en (i) o (ii), en el que dicha porción es idéntica al menos 95 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1, 2 o 58 y comprende al menos 200 aminoácidos.
2. Una molécula de ácido nucleico que comprende: 15

(i)

una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15;

(ii)

una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos 95 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15;

(iii) una porción de una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9-12, 20 14 o 15, en el que dicha porción comprende al menos 600 bases de nucleótidos;

(iv) una porción de una secuencia de nucleótidos definida en (i) o (ii), en el que dicha porción es idéntica al menos 99 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9-12, 14 o 15 y comprende al menos 600 bases de nucleótidos; o

(v) una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias definidas en (i) a (iv). 25
3.

Un vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 2.
4.

Un método de preparación de una molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 3, que

30 comprende insertar una molécula de ácido nucleico como se definió en la reivindicación 2 en el ácido nucleico vector.
5. Un método de preparación de un polipéptido según la reivindicación 1, que comprende cultivar una célula

hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 2, bajo condiciones 35 por las que se expresa dicho polipéptido y recuperar dicha molécula así producida.
6. Un polipéptido obtenido del método de la reivindicación 5.
7. Una célula hospedadora que contiene un polipéptido según la reivindicación 1 o una molécula de ácido nucleico 40 según la reivindicación 2.
8. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos 95 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias nº 1 a 8.
9. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) un polipéptido que comprende:

50 (i) una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(ii) una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos 95 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 1 a 8;

(iii) una porción de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 1, 2 o 5-8, en el que dicha porción comprende al menos 200 aminoácidos; o

55 (iv) una porción de una secuencia de aminoácidos definida en (i) o (ii), en el que dicha porción es idéntica al menos 95 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1, 2 o 5-8 y comprende al menos 200 aminoácidos; o

(b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en (a), en la que dicha molécula 60 de ácido nucleico comprende:

(i’) una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 9 a 15; (ii’) una secuencia de nucleótidos que es al menos idéntica al 98 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15;

(iii’) una porción de una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 912, 14 o 15, en la que dicha porción comprende al menos 600 bases de nucleótidos; o (iv’) una porción de una secuencia de nucleótidos definida en (i’) o (ii’), en la que dicha porción es idéntica al menos 99 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9-12, 14 o 15 y comprende al menos 600 bases de nucleótidos;

y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
10.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se define en la reivindicación 8 y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
11.

Una composición farmacéutica que comprende:

(a)

un polipéptido que comprende:

(i)

una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(ii)

una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos 70 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(iii) una porción de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8, en el que dicha porción comprende al menos 100 aminoácidos; o

(iv) una porción de una secuencia de aminoácidos definida en (i) o (ii), en el que dicha porción es idéntica al menos 70 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8 y comprende al menos 100 aminoácidos; o

(b)

una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en (a), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende:

(i’) una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15; (ii’) una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15; (iii’) una porción de una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15, en la que dicha porción comprende al menos 300 bases de nucleótidos; o (iv’) una porción de una secuencia de nucleótidos definida en (i’) o (ii’), en la que dicha porción es idéntica al menos 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9-12, 14 o 15 y comprende al menos 600 bases de nucleótidos; o

(c)

un anticuerpo como se definió en la reivindicación 8,

y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, para su uso en terapia.
12. El uso de:

(a)

un polipéptido que comprende:

(i)

una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(ii)

una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos 70 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(iii) una porción de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8, en el que dicha porción comprende al menos 100 aminoácidos; o

(iv) una porción de una secuencia de aminoácidos definida en (i) o (ii), en el que dicha porción es idéntica al menos 70 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8 y comprende al menos 100 aminoácidos; o

(b)

un polipéptido como se describe en la reivindicación 6; o

(c)

una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en (a), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende:

(i’) una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15; (ii’) una secuencia de nucleótidos que es al menos idéntica al 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 9 a 15; (iii’) una porción de una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15, en la que dicha porción comprende al menos 300 bases de nucleótidos; o (iv’) una porción de una secuencia de nucleótidos definida en (i’) o (ii’), en la que dicha porción es idéntica al menos 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9-12, 14 o 15 y comprende al menos 600 bases de nucleótidos; o

(d) una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de (a) o (b) o el ácido nucleico de (c) y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables,

en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno autoinmune de la piel, un trastorno 5 inflamatorio de la piel o una membrana mucosa o piel dañada en un animal.
13. Un:

(a) polipéptido que comprende: 10

(i)

una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(ii)

una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos 70 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8;

(iii) una porción de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 15 a 8, en el que dicha porción comprende al menos 100 aminoácidos; o

(iv) una porción de una secuencia de aminoácidos definida en (i) o (ii), en el que dicha porción es idéntica al menos 70 % a una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 1 a 8 y comprende al menos 100 aminoácidos; o

20 (b) polipéptido como se describe en la reivindicación 6; o

(c) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en (a), en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende:

(i’) una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15;

25 (ii’) una secuencia de nucleótidos que es al menos idéntica al 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las secuencias Nº 9 a 15; (iii’) una porción de una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9 a 15, en la que dicha porción comprende al menos 300 bases de nucleótidos; o (iv’) una porción de una secuencia de nucleótidos definida en (i’) o (ii’), en la que dicha porción es idéntica al

30 menos 80 % a una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de las Secuencias Nº 9-12, 14 o 15 y comprende al menos 600 bases de nucleótidos; o

(d) composición farmacéutica que comprende el polipéptido de (a) o (b) o el ácido nucleico de (c) y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables,

35 para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno autoinmune de la piel, un trastorno inflamatorio de la piel

o una membrana mucosa o piel dañada en un animal.
14. El uso o el polipéptido, molécula de ácido nucleico, o composición farmacéutica para su uso según la

40 reivindicación 12 o 13, en el que dicho polipéptido, molécula de ácido nucleico, o composición farmacéutica es para la administración tópica a la piel o una membrana mucosa.
15. El uso o el polipéptido, molécula de ácido nucleico, o composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 en el que dichos trastornos a tratar o prevenir son llagas, úlceras, eczema,

45 acné, psoriasis, inflamación gastrointestinal (preferiblemente enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y otra inflamación crónica), gingivitis, inflamación de la cavidad oral y esófago o piel dañada, en el que preferiblemente dicha piel dañada está irritada o inflamada, agrietada por frío, quemada por el sol, irradiada, dañada por calor o es una herida.

50 16. Un producto que contiene uno o más polipéptidos, moléculas de ácido nucleico o anticuerpos como se define en uno o más reivindicaciones precedentes y uno o más principios activos adicionales como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia humana o animal.
17. El uso o el polipéptido, molécula de ácido nucleico, composición farmacéutica o para su uso según una 55 cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 en el que dicho animal es un mamífero, preferiblemente un ser humano.

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