CN102203127B - 白细胞凝集素及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种被描述为凝集素的多肽、其编码核酸序列和针对多肽的抗体以及它们在各种医学应用中的用途,特别是在动物中治疗或预防自体免疫病症、炎性病症或受损皮肤。
Description
本发明涉及多肽即凝集素、其编码核酸序列和针对多肽的抗体,以及它们在各种医学应用中的用途。
细胞免疫防御系统是在微生物和寄生虫的挑战中存活的关键。该系统对于处理癌发生中、病毒感染后和自体免疫疾病中的不正常细胞来说,也是最为相关的。
细胞间识别是这些功能的核心,但是对这些现象的起源本身的了解十分贫乏。在原始有性生物群亿万年的趋异变化后,必须进化出能确保性细胞的物种特异性识别(“受精”)的基因。否则,有性物种的存活率将受到威胁。进化出了几种细胞识别分子。当在寒武纪生物群侵入陆地生境时,这种干燥的生境越来越有利于将有性受精限制于庇坊环境,使物种混杂的机会降低。因此,用于物种特异性配子识别的基因将趋于变得多余,并因此能够在进化中自由获得新的功能。
一种明显的新功能是生物体辨别其自己(自身)细胞与外来(非自身)细胞的能力。已经提出,这种机制为细胞免疫系统的起源提供了一种合理的解释,否则这种现象很难解释。这种由先天免疫提供的辨别能力(Medzhitov & Janeway,1997,Cell,91(3),p295-298)对于多细胞生物体防止其被寄生虫和微生物蚕食来说是必需的。系统辨别“自身”与“非自身”的机能障碍,可能形成了某些自体免疫疾病的基础。
被称为自体免疫的错误定向的免疫应答,由自身抗体或与宿主抗原反应的T淋巴细胞的存在而证实。尽管它通常是无害的并可能是脊椎动物生命的普遍现象,但自体免疫能够引起广范围的被称为自体免疫疾病的人类疾病。自体免疫作为人类疾病的原因这一概念是相对新的,并且直到20世纪50和60年代还未被医学思想的主流所接受。自体免疫疾病被定义为其中发生了从良性自体免疫到病原性自体免疫的发展的疾病。这种发展由遗传影响和环境触发物两者所决定。
自体免疫疾病是对健康的重大威胁。有超过八十种疾病由自体免疫引起。它们对女性特别有威胁;约75%的患者是女性。在高达65岁的所有年龄组中,自体免疫疾病是女性中的十大死因之一。
自体免疫疾病影响身体的许多不同部位,包括皮肤(例如斑秃、大疱性类天疱疮、后天性大疱性表皮松解、落叶性天疱疮、寻常性天疱疮、白癜风,牛皮癣和痤疮)、肾脏(例如IgA肾病)、血液(例如再生障碍性贫血、自体免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜和恶性贫血)、关节(例如强直性脊柱炎)、肌肉(例如多肌炎/皮肌炎)、耳(例如自体免疫性听力丧失和美尼尔综合征)、眼(例如角膜侵蚀性溃疡,赖特综合征和Vogt-小柳-原田病)、心脏(例如自体免疫性心肌炎、Churg-Strauss综合征、巨细胞动脉炎、川崎病、结节性多动脉炎、多发性大动脉炎和韦格纳肉芽肿)、内分泌系统(例如阿狄森氏病、自体免疫性甲状旁腺机能减退、自体免疫性垂体炎、自体免疫性卵巢炎、自体免疫性睾丸炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、1型多腺体自体免疫综合征(PAS-1)、2型多腺体自体免疫综合征(PAS-2)、3型多腺体自体免疫综合征(PAS 3)和1型糖尿病)、胃肠系统(例如自体免疫性肝炎、乳糜泻、炎症性肠病和原发性胆汁性肝硬化)、神经系统(例如慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、格林-巴利综合征、多发性硬化症和重症肌无力),或者可能系统地影响身体(例如抗磷脂综合征、自体免疫性淋巴细胞增生、自体免疫性多内分泌病、白塞氏病、肺出血-肾炎综合征、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征和系统性红斑狼疮)。
自体免疫疾病能够攻击身体的任何部分,因此症状广泛变化,并且诊断和治疗通常是困难的。除非正确诊断和治疗,否则某些自体免疫疾病可能威胁生命。慢性自体免疫病症例如类风湿关节炎使患者变跛,并且也对患者的家庭产生重负。某些类型的眼色素层炎可能导致眼盲。疾病例如硬皮病需要巧妙、终生的治疗。其他自体免疫疾病包括格雷夫斯病和慢性甲状腺炎,如果正确诊断,可以成功地治疗,但是因为它们发病轻微而常常被错过。
炎症是一种正常的过程,在该过程中身体的白细胞和化学物质保护身体抵抗感染和外来物例如细菌和病毒。然而,在某些疾病中,身体的免疫系统在没有外来物抗击时的不恰当地引发炎性响应。因此,炎症在自体免疫疾病中常见,但不是所有炎性病症都是自体免疫性应答。炎性疾病也可以由广泛的各种直接攻击身体的因子引起,例如微生物(病毒和真菌)、细菌毒素、某些药剂(抗生素和抗炎性甾族化合物)以及化学试剂(胆盐、有毒家用化工产品)。与炎症有关的疾病包括关节炎(其是描述关节中炎症的通用术语)、心脏的炎症(心肌炎)、将空气运输到肺的小管的炎症(其可以引起哮喘发作)、肾脏的炎症(肾炎)和大肠的炎症(结肠炎)。
胃肠炎性病症是特别重要的(例如胃部炎性疾病(例如胃溃疡、十二指肠溃疡和胃炎)和肠道炎性疾病(包括克罗恩病、炎症性肠病、热带性和非热带性口炎性腹泻、传染性肠炎、结肠炎、溃疡性结肠炎、假膜性结肠炎、憩室炎以及过敏性和放射性炎性疾病)。
胃肠炎性疾病的特征是炎症,特别是出现浮肿、特征性炎性细胞(即白细胞、组织细胞和巨噬细胞),以及在某些情况下出现表面上皮的坏死和溃疡。已知这些炎性疾病由广泛的各种因子引起,所述因子存在于胃肠道中,已知攻击其表面,产生炎性疾病响应。这些因子包括微生物(病毒和真菌)、细菌毒素、某些药剂(抗生素和抗炎性甾族化合物)以及化学试剂(胆盐、有毒家用化工产品)。事实上,胃酸本身能攻击胃黏膜并产生炎性状态。
目前使用的用于治疗炎症的药物包括非甾族抗炎药(NSAID,例如阿司匹林、布洛芬或萘普生)、皮质类固醇(例如强的松)、抗疟疾药物(例如羟基氯喹)和其他药物例如甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸。某些胃肠疾病、特别是胃病,可以通过抑制引起炎症的胃酸分泌,例如通过中和酸的效应(例如给药解酸剂)或通过给药有效抑制胃酸分泌的药剂,来进行治疗。
受损的皮肤易受感染,并可能难看和/或引起疼痛或不适。某些伤口类型在正常生理条件下对愈合有抗性,例如慢性溃疡。任何修复受损皮肤、特别是修复伤口的药物解决方法都是非常需要的。
对于适合以最小的副作用治疗自体免疫和炎性病症和疾病或皮肤损伤的治疗方法,仍存在需求。
在对可能参与真核生物进化的过程进行了多年研究之后,本发明人鉴定到一种新的蛋白质(在本文中也称为白细胞凝集素(leukolectin)),其不仅存在于配子和合子中,而且也存在于早期胚胎中(在被称为lectocyte的特化细胞中)以及血细胞的个体发生过程中,并且最后存在于白细胞中。
该蛋白最初在鱼中鉴定到并从其中纯化(参见实施例)。该蛋白具有255个氨基酸。这是凝集素的前肽形式,其包含19个氨基酸的N-端肽,这表明它靶向溶酶体以便晚些时候分泌(即进入到卵周空间中)。
利用凝集素的氨基酸序列能够开发表位特异性抗体,取决于所分析的组织,其反过来使得能够鉴定到蛋白的许多(2-8个)上的同种型(图5)。已经从鲑鱼分离到至少两个mRNA(参见实施例11),其包含少量序列差异,在多肽水平上仅产生7个改变(图17)。截短形式的蛋白也已经从鲑鱼白细胞(参见SEQ ID NO:2)和斑马鱼中分离到,在斑马鱼中已经鉴定到分泌形式(如上所述,用sLL表示)和截短形式,所述截短形式从N-端失去前32个氨基酸,用tLL表示(参见实施例9)。
该蛋白与任何已知蛋白几乎没有相似性,显示出与任何已知蛋白的总相似性低于50%。在小结构域中观察到与鲎凝集素(tachylolectin)的一些相似性。
相关蛋白已经在各种动物中鉴定到,包括斑马鱼、鳕鱼、虹鳟鱼、异体住囊虫(Oikopleura dioica),还有鸡和人类。它们的cDNA被鉴定(参见实施例),并被发现是极端保守的。在已经研究过的物种中编码的蛋白显示出低于4%的变化。这表明这些蛋白具有必不可少的功能。
到目前为止还没有报道在任何生物体中有序列相似的基因。使用针对各个外显子或内含子的探针,已经确立只有一个外显子与两种已报道的其他蛋白的一部分具有少量相似性,这两种蛋白与本文描述的分子实体完全不同。
重要的是,这个新基因特异性表达在人类白细胞中,尽管不能在已发表的人类基因组序列中找到该基因。该基因只有非常短的区段可以被检测到,但遍布在多个人类染色体中(参见实施例)。这个谜题的解答到目前为止还未找到。
最后,已发现该分子实体被细胞分泌,其与蛋白的前肽形式同一。天然和重组形式的基因产物两者都已分离到。
令人吃惊地发现,这些蛋白对特别是皮肤的自体免疫和炎性病症以及其他皮肤病症具有显著效应。尽管不希望受到理论的束缚,但据信白细胞凝集素与特异性受体结合,启动人体的正常和固有的愈合过程。从观察到的效应,我们提出白细胞凝集素参与细胞免疫的正常过程。在许多疾病状态下白细胞凝集素似乎丢失,使得将其作为药物导入触发了免疫系统在面对各种激惹:出现外来细胞(微生物、寄生虫)和“自身”的改变细胞时所正常执行的其他防御性应答,这可能将白细胞凝集素与自体免疫疾病的病因相联系,即这样的病症可能由缺乏足够的白细胞凝集素引起。
人类白细胞含有并表达极其保守的白细胞凝集素蛋白。到现在为止,这些蛋白在血细胞中还是未知蛋白。白细胞凝集素看来是鲎凝集素家族蛋白的新成员。
在第一方面,本发明提供了多肽,其包含序列号1-8任一个中显示的氨基酸序列,或与所述序列至少50%同一的序列,或任何所述序列的部分。
“多肽”在本文中是指具有优选超过50、100、150、200或250个残基和/或少于500、400、300、200或100个残基或从中选择的范围的分子。本文中指称的“部分”优选包含它所源自的序列的至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200个或以上的氨基酸。所述部分可以从序列的中间或N-端或C-端部分获得。优选情况下,所述部分从N-末端、例如从多肽的前50、100或150个残基获得。优选情况包括所述多肽的截短,例如除去信号肽或天然存在的变体中不存在的部分。优选的截短发生在N-末端,并且长度为1至50例如1至10、20、30或40,或5至40例如10至35个残基。
优选情况下,所述序列与它所比较的序列至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一。
可以通过例如使用SWISS-PROT蛋白质序列数据库,使用带有可变pamfactor的FASTA pep-cmp,并将间隙生成罚分(gap creation penalty)设置为12.0,间隙延伸罚分(gap extension penalty)设置为4.0,窗口为2个氨基酸,来确定序列同一性。优选情况下所述比较在全长序列上进行,但是可以在较小的比较窗口上进行,例如少于200、100或50个连续的氨基酸。
优选情况下,这种序列同一性相关多肽与所列举的序列号中显示的多肽在功能上等价。这些功能上等价的多肽可以采用下面显示的衍生物的形式。同样,具有序列号中显示序列的多肽可以如下所述进行修饰,而不影响多肽的序列。
此外,本文中描述的“部分”可能是功能等价物。优选情况下,这些部分满足本文中提到的同一性条件(相对于可比较区域来说)。
正如在本文中提到的,为了实现“功能等价”,多肽相对于亲代分子(即其所源自的分子,例如通过氨基酸取代)在执行医疗功能方面可以显示出某些降低的效能,但优选同样有效或更加有效。因此,功能等价物是指有效治疗本文中提到的疾病,即减轻患者的一种或多种症状例如炎症或后文中所述的皮肤外观的多肽。这可以通过以定性或定量方式比较衍生多肽相对于其所源自的多肽的效应,例如通过执行在实施例中提到的体内分析,来测试。当定量结果可用时,衍生物的有效性为亲代多肽的至少30、50、70或90%。可选地,可以执行体外测试,例如通过分析与树突状细胞的结合或对体外细胞培养物的影响。
与天然存在的蛋白相关或从其衍生的功能等价的蛋白,可以通过利用单个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失(只要它们满足上面提到的序列同一性要求即可)以修饰天然氨基酸但不破坏分子的功能,来获得。优选情况下,天然序列具有少于20个取代、添加或缺失,例如少于10、5、4、3、2或1个这样的修饰。这些蛋白由通过一个或多个碱基的适当取代、添加和/或缺失所产生的“功能上等价的核酸分子”编码。
优选的功能等价物是“添加”变体,其中产生了包含与亲代多肽融合的其他蛋白或多肽的氨基和/或羧基端融合蛋白或多肽。
特别优选的功能等价变体是天然生物学变化形式(例如等位基因变体或物种内或可选不同属例如植物、动物或细菌中的地理变化形式),以及使用已知技术制备的衍生物。例如,可以通过化学合成或采取重组体形式,使用已知的定点突变技术包括核酸的缺失、随机诱变或酶切割和/或连接,来生产编码功能等价蛋白的核酸分子。
本发明还提供了编码所述多肽的核苷酸序列。
因此,在优选情况下,本发明提供了在序列号9-15任一个中显示的核苷酸序列,与所述序列至少50%同一的序列,或在6x SSC/50%甲酰胺和室温的非严紧结合条件下、并且在高严紧条件例如2x SSC、65℃下清洗时与所述序列杂交的序列,或与任何上述序列互补的序列,或其部分,其中SSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠,pH 7.2。优选情况下,所述核酸分子编码前文中显示的多肽。
“核酸分子”在本文中是指优选具有150、300、450、600或750个以上的碱基和/或少于1500、1200、900、600或300个碱基或从中选择的范围的分子。上面所指的“部分”优选包含它所源自的序列的至少90、120、150、180、210、240、270、300、450或600个核苷酸碱基。优选情况下,所述部分编码前文中所述的N-端、中段或C-端肽。正如上面涉及多肽时所讨论的,在优选情况下考虑到导致从所列举多肽的N-末端除去残基的截短。在编码核苷酸序列中,相对于本文提出的序列,所述截短的长度优选为1至150、例如1至30、60、90或120,或13至120例如28至105个碱基。
优选情况下,所述序列与它所比较的序列至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一。
可以通过例如使用GCG软件包的FASTA搜索,使用缺省值和可变pamfactor,并将间隙生成罚分(gap creation penalty)设置为12.0,间隙延伸罚分(gap extensionpenalty)设置为4.0,窗口为6个核苷酸,来确定序列同一性。
优选情况下,这些序列同一性相关或杂交核酸分子与所列举的序列号中显示的核酸分子在功能上等价。这些功能等价的核酸分子可以采取下面显示的衍生物的形式,并且如果它们编码的多肽根据上文中描述的测试被认为是功能等价的,则所述衍生物被认为是功能等价的。优选的功能等价物是编码上面提出的优选多肽的等价物,例如编码在不同于本文提到的特定分子的属或种中所发现的多肽的核酸分子。
此外,本文中描述的“部分”可能是功能等价物。优选情况下,这些部分满足本文中提到的同一性(相对于可比较区域来说)或杂交条件。
本发明的核酸分子可以是单链或双链DNA、cDNA或RNA,优选为DNA,并包括如上所述的简并的、基本上同一的和杂交的序列。然而,理想情况下分子是DNA或cDNA。
如上所述的多肽包括通过例如不影响多肽序列的化学修饰、包括去糖基化或糖基化进行修饰的多肽。这样的多肽可以通过不影响功能性的多肽的合成/分离后修饰,例如特定残基的某种糖基化、甲基化等,来制备。
本发明的多肽可以采取肽模拟物的形式,其可以被看作其中多肽的功能特点被保留、但是存在于不同背景例如非肽结构中的衍生物。这样的肽模拟物已被成功开发,并用于其它特定医学应用中。
肽模拟物、特别是非肽类分子,可以通过各种方法来产生,所述方法包括基于构象的药物设计、筛选、集中文库设计和经典药物化学。不仅可以使用非天然氨基酸或其他有机结构单元的寡聚体,而且可以通过本技术领域已知的方法使用糖类、杂环或大环化合物以及包含提供分子静电表面的结构性元件和构象、模拟肽的三维构象的相同性质的任何有机分子。
因此,肽模拟物可以具有与肽骨架非常少的或没有相似性。肽模拟物可以包含全合成的非肽形式(例如基于具有适合取代基的糖骨架),或者可以保留它所基于的肽的一个或多个元件,例如通过衍生一个或多个氨基酸或用可选非肽组分代替一个或多个氨基酸。类似肽的模板包括假肽和环肽。可以将被认为对于肽的功能来说多余的结构元件最小化以便只保留支架功能,或者在适合时将所述结构元件移除。
当肽模拟物保留一个或多个肽元件、即一个以上氨基酸时,这些氨基酸可以用非标准氨基酸或其结构类似物代替。也可以将保留在序列中的氨基酸进行衍生或修饰(例如标记、糖基化或甲基化),只要本发明的多肽的功能性质得到保留即可。肽模拟物被称为“可衍生自”某个多肽序列。此时,它意味着肽模拟物参照所确定的多肽序列设计,使得它保留了多肽对于其功能来说必需的结构特征。这可以是多肽的特定侧链或结构的氢键形成潜力。这些特征可以由非肽组分或一个或多个氨基酸残基提供,或者连接多肽的所述氨基酸残基的键可以被修饰,以便改进多肽的某些功能例如稳定性或蛋白酶抗性,同时保留多肽对于其功能来说必需的结构特征。
可以使用的非标准或结构类似氨基酸的实例有D-氨基酸、酰胺电子等排体(例如N-甲基酰胺、tetro-inverse酰胺、硫代酰胺、硫酯、膦酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、氟代乙烯基、(E)-乙烯基、亚甲基氨基、亚甲基硫代或烷烃)、L-N-甲基氨基酸、D-α-甲基氨基酸、D-N-甲基氨基酸。非常规氨基酸的实例列于表1中。
表1
可以使用的非标准氨基酸包括构象限制的类似物,例如Tic(代替F)、Aib(代替A)或哌啶酸(代替Pro)。
上面讨论的多肽和核酸分子也包括被修饰以促进它们在药物应用中的使用(在下面讨论)的衍生物,例如通过添加定向或功能基团以例如提高亲脂性、辅助细胞运输、溶解性和/或稳定性。因此,可以将寡糖、脂肪酸、脂肪醇、氨基酸、肽或多肽与上面提到的多肽或核酸分子偶联。如后文中所述,核酸分子可以存在于病毒载体中。
多肽也包含“药物前体”或“前肽”形式的衍生物,以便添加的组分在给药后可以通过切割移除,例如切割通过酯化添加的取代基,其可以通过酯酶的作用移除。这些药物前体包括天然存在的蛋白的天然前体,其被例如蛋白水解作用切割以产生目标多肽。这些前体在前体形式下可以无活性,但是可以通过蛋白水解切割激活。因此,本发明的核酸分子同样包含编码这些药物前体或前体的分子。如上所述的修饰的多肽或核酸分子可以通过确定它们是否具有相同或类似的医学效应来测试,以确保它们保留了与未修饰分子相当的功能活性。
上面描述的核酸分子可以可操作连接到表达控制序列或重组DNA克隆载体或含有这种重组DNA分子的载体上。这允许本发明的多肽作为基因产物在细胞内表达,所述产物的表达由导入到目标细胞中的基因指导。基因表达由目标细胞中的启动子活性指导,并可以插入到任何形式的线性或环状DNA载体中,用于整合到基因组中或用于独立复制或瞬时转染/表达。适合的转化或转染技术在文献中已充分描述。可选地,裸露的DNA分子可以直接导入细胞中,用于本文描述的应用。
适合的表达载体包括以匹配的阅读框与下面描述的用于执行本发明方法所需的核酸分子相连的适合的控制序列例如翻译(例如起始和终止密码子、核糖体结合位点)和转录控制元件(例如启动子-操纵基因区、终止序列)。适合的载体可以包括质粒和病毒(包括噬菌体和真核病毒两者)。适合的病毒载体包括杆状病毒以及腺病毒、腺相关病毒、疱疹和痘苗/痘病毒。在本技术领域中描述了许多其他病毒载体。优选的载体包括细菌和哺乳动物表达载体pGEX-KG、pEF-neo和pEF-HA。核酸分子可以方便地与编码其他多肽例如谷胱甘肽-S-转移酶的DNA融合,以在表达后产生融合蛋白。
因此,从另一方面看,本发明提供了包含上面定义的核酸分子的载体,优选为表达载体。
本发明的其他方面包括用于制备本发明的重组核酸分子的方法,所述方法包含将编码本发明多肽的核苷酸序列插入载体核酸。
在后文中描述的方法中,可以通过用本发明的核酸分子转染细胞将多肽施加到细胞。正如上面提到的,本发明由此扩展到包含编码上述本发明多肽的序列的核酸分子以及它们在本文所描述的方法中的应用。优选情况下,所述核酸分子包含在载体、例如表达载体中。
本发明的优选包含在载体中的核酸分子,可以通过任何适合的手段导入到细胞中。适合在转化或转染技术在文献中已充分描述。多种技术是已知的,并可用于将这些载体导入原核或真核细胞中进行表达。用于此目的的优选宿主细胞包括昆虫细胞系、真核细胞系或大肠杆菌例如BL21/DE3菌株。本发明还扩展到含有核酸分子、特别是如上定义的载体的被转化或转染的原核或真核宿主细胞。
本发明的另一方面提供了前文中定义的本发明多肽的制备方法,所述方法包含将含有如上定义的核酸分子的宿主细胞,在允许所述多肽表达的条件下培养,并回收由此产生的所述分子。表达的多肽形成了本发明的另一方面。
本发明还扩展到前文中所述的核酸分子编码的多肽。这可以通过如上所述的宿主细胞的表达来生产。
含有本发明的多肽、但是已经通过直接导入所述多肽或通过表达编码核酸物质相对于本源细胞进行了修饰的细胞,形成了本发明的另一方面。优选情况下,所述多肽或核酸分子不内源性出现在所述细胞中,即对所述细胞进行了改变以包含外源多肽或核酸物质。
本发明还扩展到特异性针对前文中定义的多肽的抗体(单克隆或多克隆的)及其抗原结合片段(例如F(ab)2、Fab和Fv片段,即包含抗原结合位点的抗体的“可变”区片段)。
这些抗体可用于后文描述的方法、特别是所描述的治疗性方法中。
本文所述抗体可以在体外用于鉴定本发明多肽的存在或量,并可用于诊断性鉴定本文所述的与所述多肽的异常水平、即相对于正常水平的改变例如所述多肽的水平升高或降低相关的病症或皮肤损伤。
因此,在另一方面,本发明提供了确定样品中本发明多肽或其部分的存在或量的方法,其中将本文所述的抗体与所述样品进行接触,并且抗体结合的程度表明了所述多肽或其片段的存在或量。
被评估的样品可以是任何方便的样品,例如血液或组织样品或非生物学样品。优选情况下,样品源自于本文所述的动物,优选为人类。
本发明还提供了在动物中诊断本文所述的病症或皮肤损伤的方法,所述方法至少包含测定来自所述动物的样品中本文所述多肽的存在或量的步骤,其中所述存在或量对所述病症或皮肤损伤具有诊断性。可以例如使用前文中描述的抗体来检测多肽。样品和动物优选如本文中所描述。量优选为所述多肽与正常水平相比的降低。可以通过将正常对象的标准表格与所调查的患有病症或皮肤损伤的对象进行比较,来获得诊断。
在后文中描述的本发明的组合物和应用中使用的多肽或核酸分子,可以从天然存在的来源获得或衍生,或者可以完全或部分合成地产生。
方便情况下,多肽和核酸分子按照实施例中描述的方案进行分离。这些方法和这些方法的产物形成了本发明的其他方面。
因此,在另一方面中,本发明提供了从孵化液(例如鲑鱼的)分离本文描述的多肽的方法,所述方法至少包含下列步骤:
a)将卵悬浮在最小体积的水中(例如等于卵的体积或更小);
b)诱导所述卵的同步、快速孵化(优选使超过95%的胚胎的孵化在不到2小时内完成);
c)将孵化的卵过滤以获得孵化液;
d)任选向所述孵化液添加固体尿素,以允许卵壳片段解离并将所述流体进行低速离心;
e)执行第一次排阻层析步骤,例如使用Superdex 16/60柱或Biotex100超滤膜;
f)任选地执行第二次排阻层析步骤,例如使用Superdex 16/60柱,以及
g)任选通过亲和层析移除污染的蛋白质,例如zonase,例如在苯甲脒-Sepharose柱上。
本发明进一步扩展到通过上述方法制备的多肽。
当本发明的多肽从白细胞获得时,它以未修饰的形式获得。从鲑鱼孵化液获得的多肽是修饰过的(通过糖基化和/或磷酸化),但是两种形式在本文描述的方法中同等有效。
本文描述的多肽或核酸分子优选基本上不含源自于在分离步骤或它们的合成制备中使用的原材料的任何污染组分。特别优选情况下,将化合物纯化到以w/w(干重)评估时纯度50或60%以上,例如>70、80或90%,优选95或99%以上纯度的程度。这些纯度水平对应于具体的目标分子,但是包括其降解产物。在适合时,可以使用具有较低纯度的富集制备物,例如含有1、2、5或10%以上的目标分子,例如20或30%以上。本发明的多肽可以通过例如层析(例如HPLC、孔径排阻、离子交换、亲和、疏水相互作用、反向)或毛细管电泳进行纯化。
本发明的多肽可以例如通过将较小的合成产生的肽连接来合成地产生,或者更方便地通过编码上文所述多肽的核酸分子的重组表达来产生。
本发明的核酸分子可以例如通过从适合的cDNA文库扩增本文描述的核酸序列来合成地产生。
本文描述的多肽、核酸分子或抗体可以在体外例如在细胞或器官培养物中使用,以在细胞中影响免疫功能。
可选地,多肽、核酸分子或抗体可以在动物的部分或产物、例如器官或收集的血液、细胞或组织上离体使用,特别是当考虑到将它们重新导入它们所源自的身体时。
然而,正如在下面更详细讨论的,多肽、核酸分子和抗体优选用于体内。
本文所述的多肽、核酸分子和抗体可应用于下文中所述的各种病症或疾病的治疗。因此,本发明扩展到包含前文中所述的多肽、核酸分子或抗体以及一种或多种可药用赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
“可药用的”或“生理可接受的”是指成分必须与组合物中的其他成分相容并且对于接受者来说是生理上可接受的。
用于给药的活性成分可以适当地修饰,以用于药物组合物中。例如,可以使用如上所述的衍生物使本发明中使用的化合物稳定,以对抗降解。
也可以例如使用适合的添加剂例如盐类或非电解质、乙酸、SDS、EDTA、柠檬酸或乙酸缓冲液、甘露糖醇、甘氨酸、HSA或聚山梨酸酯,来稳定组合物中的活性成分。
本发明的核酸分子、多肽或抗体可以作为唯一活性成分存在于所述组合物中,或者可以与其他成分、特别是其他活性成分组合,以例如增强疗效或使组合物对消费者更有吸引力。
包含本发明多肽的组合物也可以包含zonase或相关的酶。当在本文中提到时,zonase是含有酶的制备物,其中所述制备物在SDS-PAGE分析上显示出一个分子量约为28kDa的蛋白条带,所述制备物可以通过包含下列步骤的方法获得:
a)将鲑鱼卵悬浮在最小体积的水中;
b)诱导所述鲑鱼卵的同步、快速的孵化;
c)对孵化的鲑鱼卵进行过滤,以获得孵化液;
d)向所述孵化液添加固体尿素,以允许鲑鱼卵壳片段解离并将所述流体进行低速离心;
e)通过对离心上清液进行凝胶过滤进一步纯化所述zonase;以及
f)通过在苯甲脒改性的Superose 6B柱上亲和层析进一步纯化所述zonase,其中所述亲和层析通过进行浓盐洗涤、然后在浓盐溶液中用二噁烷洗脱来进行,以提取结合到层析基质或大分子结构上的zonase;
其中所述zonase具有下列性质:
a)切开chromozym X;
b)被苯甲脒抑制;
c)切开具有精氨酸的肽键;
d)在8M尿素、摩尔浓度的盐、蒸馏水和有机溶剂、优选为二噁烷或丙醇存在下保留活性;以及
e)在溶液中在室温下保留酶活性50天。
Zonase可以按照实施例中的描述制备并添加到组合物中,或者可以作为本发明的多肽从天然来源制备后的“杂质”。在包含本发明的多肽和zonase二者的组合物中,多肽可以它们的总合并重量的1-100%的范围存在,zonase可以占0至99%。优选情况下,以组合后重量计,多肽以50-100%的范围存在,例如>80、90、95、96、97、98或99,zonase以0至50%存在,例如<20、10、5、4、3、2或1%。
在本发明的另一方面,本文所述的组合物用于治疗。
正如上面提到的,本发明的多肽、核酸分子和抗体,在特别是皮肤的各种自体免疫和炎性病症的治疗中,以及例如由于日晒、寒冷、辐射(例如X-射线,例如当用于治疗癌症时)或作为受伤的结果而受损的皮肤的治疗中,显示出治疗性质。
当在本文中提到时,“病症”是指在有症状或无症状生物体中相对于正常生物体的潜在病理失调,其可以由例如感染或获得性或先天性遗传缺陷引起。
正如在实施例中所显示的,已经举例说明了白细胞凝集素治疗各种炎症、自体免疫和其他皮肤病症的用途。对于其他疾病的治疗可以预期类似的效果。例如,慢性胃肠炎可以通过对树突状细胞与有毒药剂的反应失败的过度反应(或在某些情况下可能如此)来解释。因此,预计通过例如口服导入白细胞凝集素将以非常相似的方式治疗慢性GIT炎症,其中发炎的皮肤倾向性地对白细胞凝集素的导入做出响应。
自体免疫疾病可能源自于正常细胞表面抗原的突变形式的特异性体细胞表达。不希望受到理论的束缚,白细胞凝集素可用于保护靶细胞免于攻击。
当在本文中提到时,“炎性病症”是其中在病症发展过程中的某些时间点观察到炎症,或炎症可能是唯一症状或几种症状之一的病症。炎性病症可以是急性或慢性的,并可以如前文或后文中所述。炎性病症包括心血管炎症(例如动脉粥样硬化、中风)、胃肠炎症(包括溃疡例如胃或十二指肠溃疡)、肝的炎性病症、肺部炎症(例如哮喘、通风装置诱导的肺损伤)、肾炎症、眼部炎症(例如眼色素层炎)、胰腺炎症、生殖泌尿炎症、神经炎性病症(例如多发性硬化症、阿茨海默氏病)、过敏(例如过敏性鼻炎/鼻窦炎、皮肤过敏和病症(例如荨麻疹/假膜性喉头炎、血管神经性水肿、特异反应性皮炎、接触性皮炎、牛皮癣)、食物过敏、药物过敏、昆虫过敏、肥大细胞增多症)、骨骼炎症(例如关节炎、骨关节炎、类风湿关节炎、脊椎关节病)、感染(例如细菌或病毒感染;口腔炎性病症(即牙周炎、牙龈炎或口腔炎);黏膜上的疮;以及移植(例如同种异体移植或异种移植排斥或母亲-胎儿耐受)。
本发明治疗的优选炎性病症是炎性皮肤病症例如湿疹、痤疮、酒糟鼻、牛皮癣和接触性皮炎、胃肠炎症和黏膜病症例如溃疡或疮。
本文中提到的“自体免疫病症”是其中良性自体免疫已发展成病原性自体免疫的病症,并可以如前文或后文中所述。自体免疫疾病包括获得性免疫缺陷综合征(AIDS,其是具有自体免疫成分的病毒疾病)、斑秃、关节强硬性脊椎炎、抗磷脂综合征、自体免疫性阿狄森氏病、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性肝炎、自体免疫性内耳病(AIED)、自体免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自体免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、心肌症、乳糜泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳性免疫功能紊乱综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、crest综合征、克罗恩病、德戈斯病、幼年型皮肌炎、盘状红斑狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾脏病症、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(Still′s病)、幼年型类风湿关节炎、美尼尔氏病、混合型结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多内分泌腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣关节炎、雷诺现象、赖特综合征、风湿热、类风湿关节炎、结节病、硬皮病(进行性系统性硬化症(PSS),也称系统性硬化症(SS))、干燥综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、多发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼色素层炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。
本文中指称的“受损皮肤”包括由外部影响例如热、辐射(由各种波长的光例如X-射线或UV)、冷、摩擦、撕裂或例如由意外或手术引起的创伤而受损的皮肤。可选地,受损皮肤可以由感染或疾病或潜在的遗传异常引起。损伤可以表现为皲裂、发红、瘙痒、发炎、角质皮肤、脱皮等。
因此,本发明提供了在动物中治疗或预防自体免疫病症、炎性病症或受损皮肤的方法,其中向所述动物给药上文中所述的多肽、核酸分子、抗体或药物组合物。
此外,本发明提供了本文所述的多肽、核酸分子、抗体或药物组合物的应用,用于制备在动物中治疗或预防自体免疫病症、炎性病症或受损皮肤的药物。
在另一个可选的声明中,本发明提供了本文所述的多肽、核酸分子、抗体或药物组合物,其用于在动物中治疗或预防自体免疫病症、炎性病症或受损皮肤。
在优选情况下,本发明提供了这些方法,应用,多肽、核酸分子、抗体或药物组合物,其用于治疗或预防皮肤的自体免疫病症、皮肤的炎性病症或受损皮肤,其中本文中所述的多肽、核酸分子、抗体或药物或组合物优选局部给药于皮肤。
优选情况下,所述病症是湿疹、痤疮、牛皮癣、胃肠炎症(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎和其他慢性炎症)、牙龈炎和口腔和食管的炎症,所述受损皮肤过敏或红肿、冻裂、晒伤、被热或辐射损伤,或者由创伤引起。
当在本文中使用时,“治疗”是指使所述病症或损伤的一种或多种症状或效应,例如受损皮肤的存在或程度例如伤口的相对尺寸、炎症、发红、瘙痒、疼痛等,相对于在没有进行所述治疗的所述个体的身体的不同部位上或没有进行所述治疗的相应个体中存在的症状或效应来说,减少、减轻、或消除,优选回到正常水平。
“预防”是指绝对防止或减少或减轻所述症状或效应发作的程度或时间(例如延迟)。这可以例如通过基因治疗方法,例如使用anti-RNA或无义序列来实现。
本发明的治疗或预防方法,可以有利地与在病症或皮肤损伤的治疗或预防中有效的一种或多种活性成分的给药相组合。因此,本发明的药物组合物可以附加地含有一种或多种这样的活性成分。
根据本发明的另一方面,我们提供了含有本文定义的一种或多种多肽、核酸分子或抗体以及一种或多种附加活性成分的产品作为复合制剂,以同时、分别或相继使用在人类或动物的治疗中。
本发明的组合物可以按照本技术领域中熟知的技术,使用容易获得的成分,以常规方式与一种或多种生理可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂进行配制。
因此,活性成分,任选地与其他活性物质一起作为复合制剂,可以掺有一种或多种常规载体、稀释剂和/或赋形剂,以生产常规的草药制剂,例如片剂、丸剂、粉剂、锭剂、袋剂、扁囊剂、酏剂、悬液(作为注射或灌注液)、乳液、溶液、糖浆、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、软膏、软质和硬质明胶胶囊、栓剂、无菌注射液、无菌包装粉剂等。可生物降解的聚合物(例如聚酯、聚酸酐、聚乳酸或聚乙醇酸)也可用于固体植入物。可以通过使用冷冻干燥、低冷却或Permazyme使组合物稳定。
适合的赋形剂、载体或稀释剂是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、碳酸钙、乳糖钙、玉米淀粉、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶体纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、糖浆水、水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙烯、乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油或脂肪物质例如硬性油脂,或其适合的混合物。也可以使用用于获得持续释放剂型的试剂,例如羧基聚甲撑、羧甲基纤维素、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯或聚乙酸乙烯酯。
组合物可以附加地包含润滑剂、润湿剂、乳化剂、增粘剂、成粒剂、崩解剂、黏合剂、渗透活性剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、吸附增强剂(例如表面穿透剂或用于鼻部递送,例如胆盐、卵磷脂、表面活性剂、脂肪酸、螯合剂)、褐变剂、有机溶剂、抗氧化剂、稳定剂、润肤剂、硅酮、α-羟基酸、缓和剂、消泡剂、增湿剂、维生素、日用香料、离子或非离子型增稠剂、表面活性剂、填充剂、离子或非离子型增稠剂、多价螯合剂、聚合物、推进剂、碱化或酸化剂、遮光剂、着色剂和脂肪物质等。
可以通过使用本技术领域熟知的技术配制本发明的组合物,以便在给药于身体后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
组合物可以采取允许递送或靶向特定细胞或组织的任何适合的剂型,例如作为乳液或在可以吸附、掺入或结合活性成分的脂质体、非离子表面活性剂泡囊(niosome)、微球、纳粒等中。这可以将产物有效地转变成不溶形式。这些颗粒形式可以克服溶解性(例如降解)和递送两种问题。
这些粒子可以带有适合的提高循环时间的表面分子(例如血清组分、表面活性剂、polyoxamine 908、PEG等)或用于位点特异性定向的组成部分,例如针对特定细胞所携带的受体的配体。用于药物递送和定向的适合技术在本技术领域中是公知的,并描述在WO99/62315中。
优选使用溶液、悬液、凝胶和乳液,例如,活性成分可以装载在水、气体、基于水的液体、油、凝胶、乳液、水包油或油包水乳液、分散体系或其混合物中。
组合物可用于表面(例如皮肤)、口服或肠胃外例如通过注射给药。正如前文中提到的,白细胞凝集素在不同物种中显示出非常少的差异。事实上,已经发现它在健康人群中是不变的,因此这允许以与也在人群中不变的蛋白质胰岛素相似的方式使用白细胞凝集素,例如通过注射到对象中进行给药,而不会引发体液抗体应答。因此,可以使用注射白细胞凝集素的系统性疗法来治疗本文描述的病症,特别是自体免疫病症。
然而,表面组合物和给药是优选的,并包括凝胶、霜剂、软膏、喷剂、洗剂、药膏、小棒、肥皂、粉剂、薄膜、气溶胶、滴剂、泡沫、溶液、乳液、悬液、分散体系例如非离子性囊泡分散体系、乳剂和本技术领域任何其他常规药物形式。
软膏、凝胶和霜剂可以例如使用水性或油性基料并添加适合的增稠剂和/或胶凝剂进行配制。洗剂可以使用水性或油性基料进行配制,并且一般也包含一种或多种乳化剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。粉剂可以在任何适合的粉剂基料的帮助下形成。滴剂和溶液可以使用水性或非水性基料配制,并且还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。气溶胶喷剂常规地从使用适合推进剂的加压包装递送。
可选地,组合物可以提供在适用于口服或肠胃外给药的形式中。因此,可选的药物形式包括普通或包衣片剂、胶囊、悬液和溶液,其包含活性成分,并任选与一种或多种惰性的常规载体和/或稀释剂一起,例如使用玉米淀粉、乳糖、蔗糖、微晶体纤维素、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、酒石酸、水、水/乙醇、水/甘油、水/山梨糖醇、水/聚乙二醇、丙二醇、硬脂醇、羧甲基纤维素或脂肪物质例如硬性油脂,或其适合的混合物。
本发明的组合物中活性成分的浓度取决于所使用的化合物(即多肽、核酸分子或抗体)的性质、给药方式、治疗过程、患者的年龄和体重、医学指征、待治疗的身体或身体区域,并可以根据选择进行改变或调整。然而,一般来说,本文描述的化合物的浓度范围是0.0001、0.0005、0.001或0.01至25%,例如0.0005-15%,例如0.01至10%,例如0.1至5,例如1-5%(用于给药、特别是用于局部给药的最终制剂的w/w)。所述浓度根据化合物本身的量确定,因此应该考虑到组合物的纯度而留有适量的余地。取决于待治疗的动物,有效的单一药剂可以在0.1-100mg/天、优选在2-10mg/天的范围内,作为单一药剂使用。
给药可以通过医药领域已知的任何适合方法进行,包括例如口服、肠胃外(例如肌肉内、皮下、腹膜内或静脉内)、经皮、颊、直肠或局部给药,或通过吸入给药。优选的给药形式是口服给药,或最优选为局部给药。正如将被认识到的,如果活性成分可消化,口服给药具有限制。为了克服这些问题,可以按照前面提到的对成分进行稳定化。
应该认识到,因为用于执行本发明的活性成分采取各种形式,例如核酸分子(其可以在载体中)或多肽,因此组合物的形式和给药途径将有所不同。然而,优选情况下使用液体溶液、霜剂或悬液,特别是例如用于经口递送或局部给药时。
本发明的多肽或核酸分子可用于上面提到的医学指征。在后面的基因治疗方法中,核酸分子优选被提供在如上所述的适用于使用本技术领域已知的用于医学应用的基因治疗方法进行转染/转化的载体中,例如病毒载体如腺病毒。
可以向其施用或给药组合物的动物包括哺乳动物、爬行类、禽类、昆虫和鱼类(例如鲑鱼或鳕鱼)。优选情况下,向其施用本发明组合物的动物是哺乳动物,特别是灵长动物、驯养动物、家畜和实验室动物。因此,优选的动物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猫、狗、猴、猪、牛、山羊、绵羊和马。特别优选情况下,组合物被施用或给药到人类。
仅仅出于说明的目的提供了下面的实施例,其中提到的图如下所述:
图1显示了(A)部分纯化的鲑鱼zonase的凝胶过滤,以产生白细胞凝集素。将Superdex 16/60柱(GE Healthcare)连接到FPLC系统,并以1ml/min的缓冲液流速使用120ml。蛋白从柱上的洗脱通过UV 280运行进行监测(右侧y轴),并收集在1ml的级份中。Zonase活性通过Chromozym X的切割在OD406处测量。Zonase的天然分子量跨过较宽范围,峰值在50kDa附近。凝集素MW=30kDa,以及
(B)通过免疫印迹鉴定鲑鱼(白细胞)凝集素。从上述凝胶过滤获得的所选级份的蛋白免疫印迹分析使用了基于表位的抗(白细胞)凝集素抗体(参见图3)。级份编号显示在免疫印迹上方。分子量标志物(kDa)在左侧标出。凝集素的估算分子量与通过其他方法获得的分子量相符(参见图3)。
图2显示了在大西洋鲑鱼胚胎中凝集素产生细胞(lectocyte)的鉴定,其中图A、B和C表示通过福尔马林固定和石蜡包埋的大西洋鲑鱼胚胎体的横剖面。白细胞凝集素的存在利用兔多克隆抗LL抗体,使用免疫过氧化物酶染色方法(A)或间接免疫荧光(B和C)来确定。与抗凝集素抗体反应的细胞可以分别作为相对于背景的暗点(A)或亮点(B和C)看到。在表皮中,沿着前端-后端胚轴没有空间限制,看到大量具有特定细胞学特征的免疫反应性单细胞。A和B中的箭头指向容易与周围表皮细胞辨别开的相对大的细胞(lectocyte)。它们的核是碱性的,同时细胞质填充有白细胞凝集素,使得细胞在卵黄周空间中像蘑菇一样伸出。图2C显示了他们的颗粒含量。
图3显示了来自人类、鲑鱼、鸡、鳕鱼的白细胞凝集素以及来自构成鲑鱼EST库的UniGene Family Ssa.23163的两个重叠群的两个翻译产物的比对。在两个重叠群中,重叠群1与白细胞凝集素的一级结构最为类似。然而,两个重叠群之间的差异不大,仅为约80%。
图4显示了(A)与人类白细胞凝集素相似的序列的SMART结构域。显示了使用WU-BLAST 2从BLASTP搜索得到的得分最高的序列。序列按照相似性由高至低的顺序列出,a-人类白细胞凝集素,b-鲑鱼胚胎白细胞凝集素,c-鲑鱼白细胞的白细胞凝集素(片段),d-鸡白细胞凝集素(片段),e-鳕鱼白细胞凝集素(片段),f-鲤鱼卵凝集素(Ac#-P68512),g-南美洲泡蟾ranaspumin-6(Ac#:B5DCK6,h-斑马鱼Zgc:173443蛋白(Ac#:A8E4Z1)。注意来自鲑鱼白细胞、鸡白细胞和鳕鱼白细胞的白细胞凝集素的序列只是部分而不是全长序列。这些序列的全长形式将可能类似于在来自人类白细胞(a)和鲑鱼胚胎(b)的白细胞凝集素中发现的整体结构。此外,白细胞凝集素的具有5个连续TECPR结构域的模式,在南美洲泡蟾的序列中仍然保留,但是在斑马鱼的序列中没有,在斑马鱼的序列中只发现了4个TECPR结构域,以及
(B)具有5个TECPR结构域的白细胞凝集素的示意图。TECPR结构域最可能由4个β-链构成,产生2个β-片层。存在3个二硫键:一个在TECPR#4内部,另外两个在连接环中,正如所标出的。在这些凝集素中,糖识别位点一般来说在TECPR结构域之间的区域中发现。与白细胞凝集素最密切相关的凝集素具有已知的糖特异性,主要针对N0乙酰葡萄糖胺。白细胞凝集素的推断的糖识别特异性仍有待建立。
图5显示了白细胞中卵黄周凝集素的存在。在第一维电泳中使用了跨越4-7的pH范围的IPG胶条,而在第二维电泳中使用了12.5%聚丙烯酰胺凝胶。
A:在鲑鱼白细胞中,只发现了两个点与抗凝集素多克隆抗体发生阳性反应。它们的分子量约为26kDa,pI在6.5附近。在其他物种的白细胞制备物中也可以鉴定到白细胞凝集素。
B:在来自鲑鱼的制备物中,我们发现了大量免疫反应性斑点(编号为1-8),分子量在30kDa左右,其跨越pI从4.9至6.5的pH范围。
图6显示了白细胞凝集素在髓样细胞谱系、特别是在斑马鱼的单核细胞-巨噬细胞谱系中的共表达。(A)凝集素和L-网素的基因表达分布。发现斑马鱼表达与我们在鲑鱼中所发现的相同的凝集素。使用了荧光素标记的凝集素mRNA探针以及DIG标记的用于L-网素mRNA的探针,L-网素是单核细胞-巨噬细胞谱系的特异性标志物。双重标记原位杂交显示出在斑马鱼胚胎发生过程中凝集素和L-网素mRNA共表达在同样细胞中。以受精后(pf)的小时计的胚胎年龄显示在左下角。较亮的信号指示L-网素基因的表达;较暗的信号指示凝集素表达。
插图A(侧视图)显示了凝集素和L-网素mRNA共表达在相同细胞中,其在前端和侧方卵黄上形成了分散的轴和傍轴群体。更高的放大倍数(A2)显示出这些细胞的典型的白细胞形态学。A1中的数据证实了这两种基因在前端侧板中胚层中的双侧细胞带中表达(箭头)。插图B显示了在21小时时的同样发现。
插图C(24h pf)证实了L-网素和凝集素基因在后端中间细胞团(上方两个箭头)、腹侧静脉区(下方箭头)中的共表达,其中沿着胚胎体和头部分散有大量细胞。到受精后24小时(C2),大部分细胞共表达这两种基因(参见箭头),但是许多细胞似乎只表达一种或另一种基因。C3中的箭头标出了只表达L-网素mRNA的细胞,以及
(B)凝集素蛋白和L-网素mRNA的细胞共定位。通过免疫组织化学与原位杂交测定法的组合,分析了斑马鱼胚胎(22h pf)的凝集素蛋白(较暗信号)和L-网素mRNA(较亮信号)。原位杂交使用DIG标记的特异性针对L-网素基因的cRNA,并与使用兔抗凝集素多克隆抗体的免疫组织化学相结合。
插图A:胚胎的前视图。箭头指向其特征为凝集素蛋白和L-网素mRNA共同表达的细胞簇。A1:簇的较高放大倍数证实了L-网素基因和凝集素蛋白共表达在相同细胞中(黑色箭头)。注意到几个尺寸小、具有类似于成熟淋巴细胞的圆形形状的细胞,紧挨着具有分裂的核这种成熟嗜中性白细胞的典型形态特点的另一个细胞。插图B、C、D、E显示了遍布在斑马鱼胚胎中的共表达凝集素蛋白和L-网素mRNA(箭头)的分散的细胞群。
图7显示了白细胞凝集素家族。将来自人类、鲑鱼、鸡和鳕鱼的可获得的白细胞凝集素蛋白汇集在一起(weblogo比对)。在一个位置中完全同一的氨基酸残基用大号字母表示,字母尺寸的减小表示同一性程度较低。多个字母表示变异。
图8显示了通过柱层析纯化重组白细胞凝集素后考马斯染色的级份。道分别表示1-上清液,2-流过液,3-冲洗液,4-F1,5-F2,6-F3、F4和F5的混合物,7-F6和8-STD。
图9显示了(A)鉴定和确立鲑鱼白细胞凝集素的基因序列的实验。
插图A显示了在6号滤膜5和2号组中鉴定到的两个阳性双份杂交印记,其分别对应于257和176号板以及克隆L-7和F-7的孔坐标。
插图B证明了在3号滤膜6号组中鉴定到的一个阳性双份杂交印记,其恰好对应于144号板(基于板定位器表单)和克隆A-12的孔坐标,以及
(B)显示了推衍的白细胞凝集素基因的基因组序列(2323bp)。标出了5个外显子的位点,因此也标出了内含子。标出了该基因的转录起始位置(基于BDGP神经网络启动子预测软件(Neural Network Promoter Prediction)的启动子预测,“P”,预测的转录起始“ST”,TATA盒“T”)以及基因产物中序列特定的聚腺苷化(“PA”)。
图10显示了(A)展示人类染色体的图,BLASTP命中物的位置(参见表)由箭头标明,(B)图标覆盖度图:可视化了BLASTP命中物(条)在查询序列(人类白细胞凝集素)中的位置和总覆盖度。显然,发现的序列的总和覆盖了整个白细胞凝集素序列,但数据明显没有暗示这是白细胞凝集素基因,C)显示了使用人类白细胞凝集素作为查询序列在人类基因组中的BLASTP命中物以及它们的位置的表。
图11显示了鲑鱼白细胞凝集素在人类上皮中的效应。对照培养物=A;暴露于白细胞凝集素的培养物=B。箭头指向只有在暴露于白细胞凝集素后才在基底层中出现的大细胞。
图12显示了在白细胞中白细胞凝集素蛋白的表达。插图A显示了从鲑鱼白细胞纯化的~2μg蛋白的12%2D PAGE。插图B显示了从人类白细胞从LymphoprepTM纯化的0.8μg蛋白的15%2D PAGE。将膜用针对鲑鱼LL的多克隆第一抗体处理,然后用山羊抗兔抗体处理,并通过ECL增强的检测系统可视化。
图13显示了在Northern印迹中鉴定到的鲑鱼白细胞凝集素转录本。插图A显示了在甲醛存在下在1.2%琼脂糖中分级、并用特异性针对LL的DIG标记的反义核糖核酸探针(720bp)探测的来自大西洋鲑鱼胚胎(370dd)的总RNA。插图B显示了mRNA(通过磁性polyT珠子纯化)的Northern印迹分析。杂交使用了从LL部分编码序列产生的DIG标记的核糖核酸探针。插图C显示了用DIG标记的正义核糖核酸探针探测硝酸纤维素膜(B)。灰色箭头表示转录本的存在;黑色箭头指示其不存在。使用了0.3-6.9kb的DIG-RNA标志物I(Roche)。
图14显示了LL与相关β-螺旋桨(β-propeller)蛋白的Clustal W比对。
图15显示了LL的三维模型。左图显示了基于来自中国鲎(Tachypleustridentatus)的鲎凝集素1的结构(Biesel等,1999,EMBO J.18,pp 2313-2322)获得的白细胞凝集素的5叶β-螺旋桨三维模型的三维图像的两个视图。模型使用PyMoI v 0.99软件产生。表位肽的残基用细黑线在蛋白体上画出。此外,由Biesel等(1999)预测的5个糖结合位点的位置用浅的实心褐色己糖结构标出。右图显示了在LL(顶部)和FEL(底部)中预测的螺旋桨结构域与共有的螺旋桨结构域相比的图像。
图16显示了全长斑马鱼白细胞凝集素(LL)cDNA序列的扩增。插图A显示了使用几个引物对并通过RT-PCR克隆获得的扩增子。用于反转录的mRNA在受精后24小时时从胚胎提取。DNA标志物:100bp序列梯(New England Biolabs)。插图B显示了5′RACE PCR导致扩增到两个不同产物,分别为~500bp和~400bp(在使用基因特异性反向引物和GeneRacer正向嵌套引物的第二轮PCR扩增后产生)。mRNA从标出的发育阶段收集。插图C显示出斑马鱼LL全长cDNA序列为1240nt,包括765nt的开放阅读框(ORF)。该ORF包含5个外显子,其按比例绘制并用黑框显示。5′UTR区用实线标出。显示了5′UTR的核苷酸序列。突出了+1位置的翻译起始位点ATG和+94位的可能的第二个ATG。插图D显示了各种发育阶段时截短的LL的表达。插图E显示了鲑鱼和斑马鱼的序列甚至在3′UTR中也是高度保守的。
图17提供了来自鲑鱼的白细胞凝集素的外显子、结构域和序列差异性的概述。显示了不同白细胞凝集素在可变氨基酸残基的位置、半胱氨酸残基(C)和TECPR结构域(来自SMART数据库)方面的序列数据。白细胞凝集素序列仅仅在7个用框标出的位置有差异。5个这些可变残基出现在TECPR结构域内,两个在靠近C-末端处发现。与白细胞凝集素-1或白细胞凝集素-2不相容的变化在下面用白细胞凝集素-3显示,其中在这里只定义了两个位置(#2和#245)。尽管其他位置没有标出,但数据表明这些位置大多数与其他白细胞凝集素近乎同一。
与鱼卵凝集素(FEL)的情况相同,预计LL中的3个二硫桥分别连接第一个和最后一个半胱氨酸,而第二和倒数第二个半胱氨酸形成第二个桥,3号外显子中的两个(中间的)半胱氨酸形成最后一个二硫桥。这些半胱氨酸用灰色和下划线标出。前肽中不参与二硫桥的一个半胱氨酸位于1号外显子中。注意,在前三个结构域之间缺少互连的环,并且在连接最后两个TECPR结构域的两个环中没有变异。三个TECPR结构域由单一外显子(2和3)编码,而两个结构域跨过两个外显子。外显子末端与结构域之间的清晰的关联性值得注意。在5个结构域的4个中,Trp残基占据结构域的第三个氨基酸,而在预测的第一个TECPR结构域,中,W是起始残基。最后,星号标出了在白细胞凝集素-1或白细胞凝集素-2任一个或两者中发现过变异氨基酸的残基。
图18显示了在虹鳟鱼(Oncorhyncus mykiss)胚胎的孵化液中在Western印迹中检测到的LL蛋白。MW标准品显示在左侧(BioRad 161-0373)。来自虹鳟鱼的孵化液蛋白(第1道)和通过亲和层析制备的鲑鱼白细胞凝集素蛋白(第2道)用抗白细胞凝集素抗体探测。在两种情况下发现了对应于LL的Mw的~26kDa的蛋白。
图19A左图显示了在鳕鱼孵化液中发现的蛋白中的鳕鱼白细胞凝集素。鳕鱼孵化液通过15%SDS PAGE进行分析,其组分蛋白通过银染可视化。第1道:蛋白质标志物(BioRad′s Dual color 161-0374);第2道:孵化液蛋白。右图显示了鳕鱼孵化液,通过15%SDS PAGE分析进行分离,转印到硝酸纤维素膜上,并用亲和纯化的兔多克隆抗白细胞凝集素IgG抗体的适当稀释液进行探测。第1道:蛋白质标志物(BioRad′s Dual color 161-0374);第2道:
孵化液等份试样。白细胞凝集素的位置使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔第二抗体正确指出,通过ECL检测系统进行增强。检测到约26kDa的主要免疫反应性蛋白。B,显示了来自异体住囊虫(Oikopleura dioica)的孵化液蛋白的对等的SDS PAGE和膜。
实施例1:白细胞凝集素的鉴定和性质研究
蛋白分离
在分析鲑鱼孵化液组分的过程中,鉴定到了胚胎中存在的一种新蛋白。
可用作分离本发明多肽的起始原料的部分纯化的zonase的制备方法,提供在WO99/29836中,其在此引为参考(特别是所述方法的实施例1,但是任选不含尿素步骤)。
Zonase和白细胞凝集素两者都从鲑鱼孵化液纯化。为了提高孵化液的蛋白浓度,在孵化前将鲑鱼卵转移到最少体积的水中。可以通过高温(室温)或脱氧(Oppen-Berntsen等,1990,Aquaculture,86,第417-430页)诱导高度同步的孵化,其产生粗zonase和相关蛋白的小体积高浓度制备物。
Zonase的最初纯化包括将孵化的鲑鱼卵通过干酪薄布进行过滤。该滤液在融化并用于进一步蛋白纯化之前可以冷冻多年,而没有明显的zonase降解。这个事实极大地简化了用于纯化鲑鱼zonase和相关蛋白包括白细胞凝集素的起始原料的生产。
下一个任选的步骤包括将蛋白滤液调整到4M尿素,以解离鲑鱼卵壳的片段,这允许通过低速离心(15,000g;2x15min)将它们与外来碎片一起除去。该原料不显示堵塞柱子的迹象,这是所制备的粗原料与以前所描述的不同的特征。该粗蛋白制备物适合于通过常规层析技术进行纯化,并且zonase可以按照实施例7中的描述进一步纯化。
来自孵化液的白细胞凝集素可以与zonase一起分离。从部分纯化的zonase制备物(如上所述),可以通过排阻层析分离白细胞凝集素,因为本源形式的zonase明显大于白细胞凝集素。对于第一次分离来说,Superdex 16/60柱以及在图1说明中描述的条件就已足够,然后可以通过在苯甲脒-Sepharose柱上亲和层析来除去zonase。
对于大规模制备来说,使用超滤也是适合的,因为zonase在其本源形式下与白细胞凝集素不同,不能显著透过孔径排阻为100kDa的超滤膜。
使用的缓冲液是毫摩尔的Tris(例如10mM),pH在中性或微碱性附近(pH 7.5-8.5),含有5mM NaCl。
也设想了利用在有机溶剂(例如80%丙酮)中萃取,从血库中过期的产品中大规模提取人类白细胞,因为在该沉淀大多数其他蛋白的步骤过程中,白细胞凝集素保留在溶液中。最终的通过层析和过滤方法的纯化同上。
还发现分离的蛋白表达在配子和合子中,此外也表达在早期胚胎中(在造血系统个体发育过程中)以及最终表达在白细胞中。
发现该以前未鉴定过的蛋白与zonase共纯化。这种新蛋白的大小,通过在非变性条件下层析来估算,刚好略小于30kDa(图1)。
蛋白表达
分离的蛋白被用于产生多克隆抗体。利用兔多克隆抗LL抗体,使用免疫过氧化物酶染色方法或间接免疫荧光来分析细胞中蛋白的存在。结果显示在图2中。
利用抗体,我们发现该新的蛋白源自于与产生choriolysin(孵化酶类)的细胞不同的细胞类型中。这些个体细胞(被称为lectocyte)的形态显示在图中,并与表达choriolysin的(个体)孵化腺体细胞明显不同。
序列分析
对该新蛋白进行了标准的性质研究例如确定其胰蛋白酶消化肽,然后进行部分直接Edman测序。从复杂的肽中,通过反复试验构建用于在鱼胚胎中检测mRNA以产生cDNA的简并引物最初未能成功,直到将反向引物简单设定为与polyA尾部匹配。通过这种方式,并且当它们被逐渐鉴定时使用多种新的引物组,我们能够发现至少两个约1200NT的cDNA。它们被证明在序列上非常相似,只有少数变异的氨基酸残基。对于二者来说,都丢失了一些N-端序列。
使用N-RACE方法,我们随后确定了上述序列属于255个氨基酸的蛋白,具有19个氨基酸的前肽,并在加工过的蛋白中具有不常见的N-端色氨酸残基。该后一个结果可以解释通过直接分析获得N-端序列的极端困难性。然而,最终成功证实了实际的N-端残基。
使用蛋白的N-端序列搜索EST数据库,我们鉴定了该蛋白序列明显代表新的蛋白(图3)。
在数据库中搜索与该新蛋白相似的蛋白,至鉴定到一个略微相似的候选者(Leren,未发表)。这是从鲤鱼分离的鱼卵凝集素(Galliano等,2003,Biochem.,J.,376,p433-440),通过序列的手动比对发现总相似性不超过48%。
生物信息学分析表明,该新的蛋白是与tectonin相关的凝集素(Leren,未发表)。在汇集具有相似TECPR结构域结构的所有蛋白的名单中,我们的新凝集素似乎代表了凝集素的一个新类型(图4A和B)。新凝集素的实际氨基酸序列包含5个TECPR结构域,其与低等无脊椎动物中的鲞凝集素显示出一定相似性(Shigenaga等,1993,J.Biochem(Tokyo),114,p307-316)。
新凝集素的前肽形式含有19个氨基酸的肽,其表明它靶向溶酶体并用于晚些时间可能的分泌(即进入卵黄周空间)。
新凝集素的实际氨基酸序列允许开发表位特异性抗体,取决于所分析的组织,其反过来允许我们鉴定到蛋白的许多(2-8个)表面上的同种型(图5)。
一种可能性是在孵化腺体细胞中发现的凝集素(图6B)与choriolysin一起分泌到卵黄周空间中,并且它们具有翻译后修饰,增加了它们的表观尺寸并降低其表观pI。
因为鲑鱼是四倍体鱼,并且因为我们的数据表明在鲑鱼中存在一个以上白细胞凝集素的基因,因此在部分纯化的zonase制备物中的8种白细胞凝集素部分的组列,可能来自于两种略微不同的白细胞凝集素蛋白的三种增加的修饰,总共4x2或8种不同的白细胞凝集素。变异的原因需要凭经验验证。
凝集素的估计MW约为25-30kDa。相应的鲑鱼凝集素的估计pI约为pH=6.5。观察到的pI(Riste,未发表)在鲑鱼卵黄周凝集素中是pH 6.5至4.9,在鲑鱼白细胞凝集素中是pH6.4至6.6(该凝集素通过Western印迹技术鉴定)。
胚胎发育过程中的表达
使用核苷酸探针定位新蛋白在鱼胚胎发育过程中的表达,我们发现蛋白存在于鱼胚胎的特定类型的表皮细胞中。此外,我们发现蛋白表达在配子以及合子两种中。此外,在生物体的大多数细胞中显示不存在该蛋白,但是其表达在几种胚胎细胞中,这表明该蛋白可能与骨髓生成有联系(图5和6)。这种表达模式是独一无二的。因此,我们为该蛋白选择了“白细胞凝集素”这个名称(缩写为LL)。
在不同物种中的表达
对来自从鱼到鸡再到人类的血液的调查显示,白细胞凝集素存在于整个该脊椎动物谱系的白细胞中。它的存在也能在全部无脊椎动物中使用我们的多克隆抗体检测到。在(人类)白细胞中发现白细胞凝集素立即建议了白细胞凝集素的可能功能。白细胞凝集素出现在执行免疫功能的细胞中。
最令人吃惊的是白细胞凝集素在进化过程中的极端序列不变性(图7)。使用标准引物对技术,我们能够在整个脊椎动物谱系中检测cDNA。分析显示出从鱼到鸡再到人类的极端保守的序列,其表明了这些基因的必需功能。鱼与人类序列之间的变异约为4%(10个变体氨基酸)或96%的相似性,其中观察到的变异有一半是保守氨基酸取代。作为对比,一种相当类似的已知蛋白是来自鲤鱼的鱼卵凝集素(FEL)(相似性低于48%)。
变体LL结构的概述(图7)定义了该新的LL蛋白家族。我们在从鱼到人类的氨基酸中观察到约2%的非保守变化。显然,LL基因编码的蛋白经历了极端的进化选择,以维持序列不变性。这反过来表明一种重要但还未了解的功能,在物种进化过程中阻止了基因产物中大多数随机变异的产生和保留。
重组白细胞凝集素的制备
从胚胎克隆了鲑鱼白细胞凝集素的cDNA。设计了含有NcoI限制性位点(正向)和ACC65I(反向)的PCR引物。将载体pETM-60用NcoI/ACC65I消化,并通过过夜连接与消化的PCR产物连接。在质粒扩增和测序后,将含有序列已证实的白细胞凝集素插入片段的pETM-60表达载体转化到BL21(DE3)p Lys感受态细胞中,并使用菌落接种5mLLB(=Luria营养肉汤)用于制备细菌甘油储液。
细菌培养和蛋白质纯化:
新的细菌载体pETM60-白细胞凝集素能够表达通过TEV蛋白酶识别序列与NusA的C-端融合的带组氨酸标签的重组蛋白。它们通过金属亲和有效纯化,并在除去融合配偶体后以可溶形式回收。
材料和方法:
PCR上游和下游引物:
NWA15dPET(#23):NcoI
5′-GCA.CCA.TGG.CCA.TGG.GCT.GGG.ACT.GTC.AGG.AGG.TAG.TACH.A15dPET(#13):ACC65I
5′-CCG.AAG.CTT.GGT.ACC.ATG.TGT.GCA.CAC.CAT.GGT.GAC
PCR混合物
PCR反应:
将PCR产物和pETM-60质粒两者用NcoI和ACC65I限制性酶消化‘并从1%琼脂糖凝胶中纯化用于连接。
通过T4 DNA连接酶将插入DNA连接到载体上:
使用下列混合物,利用T4连接酶连接双链DNA分子的5′-磷酸和3′-羟基:
200ng载体DNA
500ng插入DNA
10X连接酶缓冲液
1μl T4连接酶
体积到10μl
温育为室温过夜,连接酶的热失活通过将试管置于65℃水浴中10分钟来进行。
将连接混合物电转化到DH5α感受态细胞中,并使用菌落接种5mlLB。
随机挑取10个克隆进行分析。分析通过用NcoI/ACC65I消化pETM60-白细胞凝集素来进行。
插入的白细胞凝集素的序列通过使用13号和23号引物对pETM60-白细胞凝集素进行测序来证实。
白细胞凝集素的体外翻译
BL21(DE3)pLysS含有编码T7溶菌酶以在诱导前降低T7聚合酶的背景水平的质粒(pLysS具有氯霉素抗性)。BL21(DE3)pLysS提供了毒性蛋白的蛋白表达的更严紧的控制,是用于高水平蛋白表达并容易诱导的菌株。在重组蛋白表达和纯化中使用的融合标签是NusA,其具有495个氨基酸(54.8Kda)的大小,位于N-端处,并被用于增强过量表达的蛋白的溶解。
NusA-白细胞凝集素通过金属亲和有效地纯化,并在除去融合配偶体后以可溶形式回收。
用于NusA-白细胞凝集素的表达和纯化的材料:
卡那霉素平板
2YTG培养基
0.4mM IPTG(终浓度0.4μM)
HisTrap HP(5ml)柱
诱导在26℃下进行3小时。
纯化流程:
NusA-白细胞凝集素上清液在纯化前的固有酶活性:
0.0060/min
用25ml缓冲液B(1xPBS,30mM咪唑,0.4M NaCl)平衡柱子
上样:
将28ml上清液过滤并脱气,并将其25ml施加到柱子。
将柱子用75ml缓冲液B冲洗。使用25ml缓冲液C(1xPBS,0.5M咪唑,0.4M NaCl)利用一步洗脱法进行洗脱。收集1ml样品。
结果:
来自粗重组蛋白的蛋白酶活性,有超过98%发现在流过和清洗液中。只有1.6%的蛋白酶活性在柱级份、包括具有重组白细胞凝集素的级份(F6和F7)中回收,正如通过SDS-PAGE分析所鉴定的(参见图8)。这些级份含有0.3%的施加到柱的蛋白酶活性背景水平。
结论:
重组白细胞凝集素不具有丝氨酸蛋白酶活性,因此是真正的凝集素。
因此,在来自天然来源(孵化液)的某些白细胞凝集素制备物中所发现的痕量丝氨酸蛋白酶活性,必定代表了痕量的zonase。
白细胞凝集素和Zonase共存于孵化液中,并且在大多数层析步骤中倾向于共纯化,但是可以通过使用100kDa排阻孔径的Biomax滤膜的最后的超滤来分离。
重组蛋白分析:
通过MS/MS技术对如上生产并通过SDS PAGE纯化的重组鲑鱼LL进行了分析。在NCBI蛋白和辐鳍亚纲(Actinopterygii)的EST数据库两者中,在Mascot中对LL的肽质量指纹谱进行了分析,没有发现任何明显的命中物(Riste,未发表)。这些谱图与从胚胎和白细胞LL的二维凝胶分析洗脱下来的相应LL组成部分获得的LL谱图相比符合良好,进一步证实了通过pH梯度方法所观察到的LL同种型的存在。
基因组序列
在鲑鱼中,我们通过用670NT探针探测Bac文库,确定了该实体的基因的基因组序列(完整流程也详细描述在实施例10中)。因此,使用根据蛋白质的部分氨基酸序列推导出的信息设计的简并引物,可以获得白细胞凝集素的全长cDNA序列。从370dd(天程度)胚胎(即接近但仍未孵化的胚胎)进行的cDNA的PCR扩增产生了630bp的扩增子,其被凝胶纯化并测序。
使用凝集素基因特异性探针筛选由鲑鱼基因组计划(SGP)合作组制作的BAC文库(18x覆盖度;平均插入片段尺寸188kb)。探针(大小为630bp)通过使用PCR方法掺入地高辛-11-dUTP(Roche)来制备。Bac文库的筛选导致鉴定到7个阳性克隆,其被确定为A-12/144、L16/143、P6/76、B-5/70、O-20/85、L-7/257和F-7/176。阳性响应被实例在插图A和B中。
所选克隆的特异性响应通过PCR扩增来验证,使用了与用于筛选BAC文库的DNA标记探针相同的引物。载体序列内插入片段的大小通过脉冲场电泳来估算。克隆通过鸟枪法商业化测序(MWG-Biotech,德国)。
该工作在(四倍体)鲑鱼的基因组中确定了几个密切相关的白细胞凝集素基因(图9A和9B)。区段序列中的变异似乎表明存在至少两个相似的基因。在结构上,白细胞凝集素表现为具有5个外显子和4个内含子的正常基因,在基因中从转录起始点到聚腺苷化位点约为2300bp,这是相当标准的尺寸。
然而,我们的数据使我们能够确定到目前为止在任何生物体中还未报道具有相似序列的基因。使用针对单个外显子或内含子的探针,我们能够确定只有一个外显子与两个其他已报道蛋白的部分具有很低的相似性,这两种蛋白与我们已发现的分子实体全然不同。
数据库搜索表明,在人类基因组中没能发现对应于LL蛋白、LL的mRNA转录本或白细胞凝集素基因组基因的基因。显然,白细胞凝集素基因或者还没有在任何地方发现,或者其序列还未提交存放,或者在人类中还未检测到LL基因序列。在进一步搜索中,我们使用了列于下面表2中的单个小的结构元件,以便在数据库中定位这些元件。
表2
结果表明,某些已知蛋白与白细胞凝集素的一部分表现出一定程度的相似性,提供了相关的染色体号。没有定位于染色体上的序列被陈述为“某些?”。
首要命中物是人类转凝蛋白,其是平滑肌蛋白22-α(SM22-α)(WS3-10)。转凝蛋白是肌动蛋白结合蛋白,是分化的平滑肌的最早标志物之一。该蛋白的功能尚未确定。http://harvester.embl.de/harvester/P378/P37802.htm。
然而,将转凝蛋白与白细胞凝集素的蛋白序列比对显示出极少的共有序列。此外,在LL结构的部分中发现了与T-细胞受体和未知蛋白的一些小的相似性。重要的是,该新基因特异性表达在人类白细胞中,尽管存在着该基因不能(尚未)在人类基因组已发表的序列中找到这一事实。(在人类血小板的纯化制备物中也能看到一些表达)。在人类基因组中只能检测到该基因的非常短的区段,但是这些区段在人类染色体的尺度上广泛散布(参见图10)。
在染色体上所观察到的分布模式是令人迷惑的。由于人类LL基因直到现在还没有被测序或定位于特定的染色体,这些短的序列可能与LL基因无关。这个谜题的解答还没有获得。
讨论
在人类白细胞中鉴定到一种新的LL凝集素,其与来自鱼和鸡的LL几乎同一。鲑鱼中的LL基因具有标准结构,但是还未在人类中发现。
实施例2:白细胞凝集素的医学应用
材料与方法
使用如实施例1中所述制备的鲑鱼白细胞凝集素蛋白(被称为LL)进行了下列研究。使用的LL的浓度约为1-10毫克/ml。Zonase蛋白酶与LL以1∶100的比例存在于水和椰子油乳液中(其中存在超过30%的椰子油)。白细胞凝集素在zonase存在下稳定。
结果
A.冻裂的皮肤
许多人经历皮肤的季节性开裂,特别是在手上。
在寒冷季节开始时向皮肤施用白细胞凝集素,显著推迟或在许多情况下阻止了冻裂的发生。这种现象已经记录在几十个案例中。关于LL对已确立的冻裂的效应的观察较少,但是已经披露了一些已确立的冻伤的闭合。
B.晒伤的皮肤
裸露皮肤的过度日光暴露可能导致晒伤,并引起灼烧感、发红、瘙痒和暴露过的皮肤的最终脱落。
施用白细胞凝集素导致红色在数分钟内褪去、瘙痒停止以及最终不发生皮肤脱落。这些令人惊异的观察已经在许多个体中重复地观察到。
C.热损伤的皮肤
在皮肤被热直接损伤后,施用鲑鱼白细胞凝集素似乎在相当大程度上阻止这种损伤的正常结果,并且如果在最初损伤后施用一段时间,能够停止这种损伤并加速完全恢复。
D.痤疮
在许多青少年中,通过立即停止瘙痒和发红对痤疮的亚临床病例具有良好反应。在小型实验性研究中,在施用椰子油乳液中的LL后,在约一半的病例中观察到了痤疮本质上的改善。
E.表面牛皮癣
大片患牛皮癣皮肤对施用鲑鱼白细胞凝集素具有良好反应,首先发红几乎立即减退,然后是瘙痒感显著降低。在前几周内角质皮肤的过度聚集缩小,但是在停止施用LL后复发。
F.开放的皮肤伤口
在人类志愿者上进行了观察。我们研究了慢性开放性和渗出性皮肤伤口的病例,所述伤口由髋骨骨折手术后压迫足跟伤口而引起,并且由健康护理人员看护数月到一年没有成功愈合。看到的疮直径为0.5至2cm。
在向下肢(腿)上的慢性开放伤口施用过滤除菌的LL制备物后,我们观察到在2-3天后伤口停止渗液,随后伤口区域快速收缩,使得在2-3周后,伤口消失并被正常皮肤代替。
尽管患者所具有的伤口首先出现在肢体的远端,但我们观察到以上述方式消失的第一个伤口是近端伤口。我们将这解释为更近时候建立的伤口。最后消失的伤口是接近足跟的远端伤口,其是建立时间最长的伤口。最终所有伤口都消失了。
G.体外研究
分化的人类皮肤上皮培养物,在接种到具有微孔以允许营养物质从下方接近上皮组织的塑料生长基质上之后第16天从SkinEthics(Nice,France)获得。这种培养物在37℃下的培养期过程中,在分化后显示出正常的皮肤形态。将这些培养物在体外继续维持两天,以使上部角质层暴露于空气,并使基底层暴露于生长基质。将平行的培养物移至30℃的潮湿大气中,并提供含有Ca、Mg的磷酸盐缓冲盐水介质,在存在或不存在10μg/ml鲑鱼白细胞凝集素的情况下温育6小时。按照标准程序,将培养物在甲醛水溶液中固定并包埋在石蜡中,用苏木精/曙红染色。在表皮中观察到了大的基细胞的快速诱导,具有细胞增殖的迹象(图11)。我们将这些结果解释为与白细胞凝集素对皮肤的治愈效果在原因上相关,其中细胞增殖和细胞分化的组合足以闭合伤口并重建皮肤上皮的完整性。
讨论:
我们在角质细胞的细胞培养物中没有发现LL基因产物的表达。此外,树突状细胞是上皮皮肤中与血液白细胞相关的唯一细胞类型。在某些机械或生物损伤后,由于压迫伤通常发生在正常皮肤中的位置处循环不良,白细胞正常进入上皮皮肤受到干扰。施用白细胞凝集素克服了这种缺陷,并在皮肤中引发正常的愈合机制。
实施例3:白细胞中的白细胞凝集素蛋白表达
鲑鱼血从Bergen大学的Industrilab获得。将鱼全血收集在添加肝素的试管中(Riste,未发表),并按照Miller等(1988,Nucleic Acids Research,16(3)p1215)进行处理。人类血样从挪威的Haukeland大学医院血库获得。
将人类全血收集在5ml含柠檬酸缓冲液的试管中,并按照Miller等(1988,同上)进行处理以制备白细胞。将该制备物通过LymphoprepTM(Axis-Shield PoC,Norway)富集法进一步纯化。按照其流程使用LymphoprepTM以制备人类白细胞级份。将该级份如Miftari和Walther(未发表)中所述用于免疫印迹分析。2D PAGE分析按照MacGillivray和Rickwood(1974,European Journal of Biochemistry,41,pp.181-190)所描述的步骤进行,使用~1μg蛋白。来自这两种物种的LL蛋白通过2D PAGE使用免疫印迹进行可视化,以特异性检测LL蛋白及其同种型。用针对鲑鱼LL的多克隆第一抗体然后用山羊抗兔抗体进行处理,允许通过ECL增强的检测系统可视化LL蛋白。在上样0.5-5μg蛋白的多块凝胶中测试了免疫反应的特异性,获得了相似的结果。
鲑鱼白细胞表现出2种MW~26kDa的LL同种型,其pI类似于在鲑鱼PVF中发现的8种LL同种型的更碱性形式。难以通过在2D PAGE的第二维中从MW标准品外推来估算准确的MW。人类白细胞含有一种主要的LL抗原,分子量~30kDa,从其他观察获得的该分子量接近27kDa。酸性pI对应于在PVF中发现的鲑鱼LL同种型的平均pI(Riste,同上)(参见图12)。
实施例4:在Northern印迹中鉴定到的鲑鱼白细胞凝集素转录本
鲑鱼卵从位于Bolaks as(Fusa,Norway)的饲养鲑鱼种鱼公司(farmed salmonbroodstock)获得,其从1975年起通过表型筛选维持了多代,现在是由挪威Salmo Breed A/S繁殖的鲑鱼种鱼的一部分。
分离总RNA和聚腺苷化RNA
在较晚的孵化前阶段(约370dd),使用Trizol试剂(Life Technologies)按照制造商的说明从鲑鱼胚胎分离总RNA。总RNA在完整性和纯度方面的质量和数量,在用溴乙锭染色的甲醛琼脂糖凝胶上评估。总RNA通过分光光度法定量。RNA的聚腺苷化级份(mRNA)从5-10μg总RNA中使用Dynal珠mRNA纯化试剂盒(Invitrogen)分离。
探针的构建
反义的地高辛(DIG)标记的cRNA探针通过用T3RNA聚合酶转录SP1消化的质粒DNA模板来产生。正义的DIG标记的cRNA探针通过使用T7RNA聚合酶(正义)转录XhoI消化的质粒DNA模板来产生,使用了DIG RNA标记试剂盒(SP6/T7)(Roche Diagnostics)并按照制造商的流程进行。产生的地高辛(DIG)标记的LL反义和正义cRNA探针跨度为~650bp。
Northern印迹分析
将0.5μg纯mRNA和1μg总RNA的等份试样电泳,并转印到带正电荷的硝酸纤维素膜上(Amersham)。将膜在DIG Easy Hyb缓冲液(Roche)中在55℃下预杂交2小时,然后与1μg/ml LL核糖核酸探针在55℃下杂交16小时。清洗以低严紧性在含有0.1%SDS的2x SSC中在室温下进行两次,每次15分钟,并以高严紧性在含有0.1%SDS的0.1x SSC中在65℃下进行两次,每次20分钟。将膜在含有马来酸缓冲液(pH 7.5)和1%阻断试剂(Roche)的阻断溶液中温育,然后在含有1∶10,000稀释的抗DIG-碱性磷酸酶(AP)偶联的抗体(Roche)的阻断溶液中在室温下温育1小时。在用含有150mM NaCl和0.5%Tween 20的100mM马来酸缓冲液(pH7.5)清洗后,将膜在检测缓冲液(0.1M TrisHCl,0.1M NaCl,pH 9.5,室温下)中平衡2分钟。杂交探针靶通过化学发光测定法,使用CSPD(Roche)作为底物并将印迹暴露于X-射线胶片(5-30)5-30分钟进行可视化。使用了DIG标记的RNA分子量标志物(Roche)。
使用反义的DIG标记的LL特异性核糖核酸探针估算成熟LL转录本的大小。总RNA的Northern印迹分析(图13A)显示出大小~1250bp的主要转录本,并且还观察到较弱条带的转录本(~3200bp)。主要条带对应于成熟的(无内含子)和可翻译的LL转录本。使用同样的核糖核酸探针进行的纯化的mRNA的Northern印迹分析显示出~1250bp的单一条带(表明扩增的cDNA接近全长编码序列)(图13B)。当将来自总RNA和mRNA样品的印迹与正义LL特异性核糖核酸探针温育时,没有观察到杂交信号,表明所使用的核糖核酸探针足够特异(图13C)。次要转录本(~3200bp)比鲑鱼的全长LL转录本大。由于用于杂交的特定条件,该实体可能不反映包含LL序列信息的实体。阳性信号仅来自反义探针而不来自正义探针,着重说明了结果的特异性。全长转录本的大小与上面描述的所有LL外显子相称。
实施例5:LL与相关β-螺旋桨蛋白的比对
对鲑鱼LL序列进行了生物信息学分析,与公共序列数据库中储存的信息进行比较。
Clustal W分析(图14)表明,鲑鱼白细胞凝集素的推衍的氨基酸序列与数据库中任何已报道的蛋白不具有显著的序列相似性。然而,BLAST显示出与亲缘关系更远的蛋白的相似性,包括FEL、一种来自鲤鱼(Cyprinus carpio)的鱼卵来源的凝集素(Genebank登记号P68512),其总体相似性仅为48%(E值为2.00E-50)。此外,来自斑马鱼的假设蛋白(HPZ;登记号LOC678590)显示出45%的总体相似性(E值为2.00E-48)。序列比较也证实了白细胞凝集素与来自鲎的TPL-1(以前的凝集素L6)(登记号P82151)、来自多头绒泡菌(Physarumpolycephalum)的tectonin I(登记号O61063)和Tectonin II(O61064)38%、28%和26%同一。(通过SwissProt,这些数字分别为49、35、32和29%同一,并且E值对于FEL来说为1e-51,对于L6来说为1e-40)。我们的数据表明LL与脊椎动物比与无脊椎动物对应物的相似性更高。没有包括的是LL与人类tectonin含β-螺旋桨重复序列的蛋白((KIAAO329_human)的30%的同一性。
多重比对揭示了在FEL的四个生物化学证实的二硫键中(Galliano等,2003,Biochem.J.376,pp.433-440),有三个似乎在白细胞凝集素中保守。第一个桥将两种蛋白的N-末端与C-末端相连。桥连接LL中3和234位(或FEL中的238位)的半胱氨酸。第二和第三个桥连接LL中的Cys 102与Cys 155(FEL中的#157),以及LL和FEL两者中的Cys 132和Cys137。第四个二硫键发现在鲤鱼FEL中,涉及Cys 208(212)和Cys 226(230),其在白细胞凝集素中没有发现。
实施例6:LL(白细胞凝集素)的三维模型
白细胞凝集素蛋白在TECPR结构域构造方面与L6或鲎凝集素1(中国鲞(Tachypleus tridentatus))、一种来自鲞血细胞的与细菌脂多糖结合的凝集素,以及其他无脊椎动物的鲎凝集素相关蛋白共有高度相似性。然而,观察到了在结构域的数量以及β-螺旋桨结构域朝向蛋白C-端的轻微偏移方面的差异。总结从相似性搜索和SMART搜索获得的信息,我们推断白细胞凝集素的总体三维结构表现出5叶β-螺旋桨蛋白结构。在此基础上,我们产生了三维模型(Biesel等,1999,EMBO J.,18,pp.2313-2322),以给出白细胞凝集素蛋白的可能外观的可使用模型。这仅仅是近似,因为来自一个蛋白的残基数被设置成等于另一个蛋白中的残基。在SMART数据库中进行的搜索显示出实际翻译的白细胞凝集素蛋白的显著结构特点,其由5个串联重复序列构成,每个包含35-36个氨基酸,具有32-61%的内部序列同一性(图15,右图)。推衍的白细胞凝集素蛋白的内部重复区段在它们自身之间显示出相似性,大多数长为13个氨基酸。两个短的共有序列XWXXLPGXLKXXXVGPX和GVNKNDXXYXLVG在每个重复序列中高度保守。除了白细胞凝集素N-端区域中的一个20个氨基酸的区段在FEL中没有发现之外,两种蛋白在TECPR结构域的数量和总体结构域构造之间显示出高度相似性,尽管仅共有48%的序列同一性。
实施例7:从鲑鱼孵化液纯化zonase
可以将实施例1中的鲑鱼孵化液进一步纯化以产生纯的zonase制备物。一轮凝胶过滤足以将zonase与滤液中较大的分子组分分离开,纯化倍数为12,收率超过50%。使用的基质可以不同,但是我们通常选择Sephacryl SR-200缓冲液是pH 8.0或pH 8.5的Tris-HCl(0.05M)或Tris-乙酸(0.025M,同样的pH)。在凝胶过滤步骤后获得的zonase占孵化液中zonase组成部分的大部分。
通过在可商购的苯甲脒Sepharose 6B柱上进行亲和层析,将zonase纯化至均一的蛋白产物。使用的具体条件(使用25或125ml体积的柱)仍然是0.05M Tris-HCl缓冲液(pH8或8.5),为了除去柱上非特异性结合的物质,将其调整到1M NaCl。该步骤不移除zonase,因为蛋白与柱保持紧密结合。使用在同样的含有1M NaCl的Tris-HCl缓冲液中10-33%的二噁烷梯度,将zonase从柱上洗脱。在亲和纯化后,zonase制备物在SDS-PAGE分析上显示出一个蛋白条带,分子量约为28kDa。尽管该zonase产物不是测序级纯度,但它被高度纯化。
凝胶过滤纯化加上亲和纯化的zonase,通过一个最后的层析步骤进一步纯化至测序级纯度。该步骤使用了PBE94柱,使用Tris-乙酸缓冲液(10mM,pH 9.0),其中随后的洗脱使用该缓冲液中的盐梯度(最高到1M NaCl)。该步骤本身将zonase的催化活性进一步增加7.6倍,总纯化倍数为714,以起始原料计收率为28%。该纯化步骤保持zonase的蛋白本性完整,作为28kDa的组成部分。
实施例8:LL抗体的生产和纯化
如下制备了多克隆兔抗兔抗鲑鱼LL抗血清:使用来自实施例1的测序级纯化的白细胞凝集素蛋白,按照Harlow和Lane的描述(1988,《实验室手册》(Laboratory Manual),Cold Spring Harbor,NY)在4kg的青紫蓝兔中产生多克隆抗体。在多个皮下位点进行80、40和25mg的测序级白细胞凝集素的三次注射。第一种用Freund′s完全佐剂乳化,后两种在3和6周后用不完全佐剂乳化。在最后的加强剂后8天,收集血液,并在以3,000rpm(Sorvall SS-34转子)离心15分钟后制备血清。
将抗血清的等份试样储存在-80℃下。第一抗体使用HiTrap 1-ml蛋白G柱(Amersham Pharmacia Biotech)以1ml/min的流速亲和纯化。将全部抗血清通过45μm过滤装置过滤,然后施加到1ml蛋白G柱上。柱的平衡使用5-10倍柱体积的结合缓冲液(20mM磷酸钠,pH 7.0)进行,然后使用同样的缓冲液清洗几次,直到通过280nm处的UV吸收检测不到蛋白。使用5ml洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl,pH 2.7)洗脱IgG级份,并分到含有25μl中和缓冲液(1M Tris-HCl,pH 9.0)的管中。浓度使用分光光度法测定。纯度通过在12%的SDS-PAGE中分析纯化的IgG级份,然后进行银染来估算。灵敏度通过使用山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶偶联的第二抗体的Western印记分析来确定。
此外,通过在斑马鱼丙酮干粉中温育,将多克隆抗体预吸附。荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的猪抗兔F(ab′)2来自于Dako(F-0054)。Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG从Molecular Probe,Eugene,US获得(Invitrogen,目录号A-21244),生物素标记的多克隆猪抗兔免疫球蛋白来自Dako(目录号E0353)。第一和第二抗体的最适浓度通过事先的稀释实验确定。多克隆抗体使用在实施例1中描述的蛋白表达分析中。
实施例9:来自斑马鱼的LL的鉴定和性质研究
在4、6、12、24、48hpf和5dph时使用Trizol步骤(Life Technologies)按照制造商的说明从斑马鱼胚胎分离总RNA。总RNA的完整性和纯度在甲醛琼脂糖凝胶上使用溴乙锭染色进行评估。只使用28S与18S rRNA的比例为2-2.4∶1并且没有可检测到的DNA污染的样品。RNA通过分光光度法进行定量。聚腺苷化mRNA从5-10μg RNA中使用Dynal试剂盒(Invitrogen)分离。
反转录使用200U/μl TermoScript(Invitrogen)进行。将mRNA(0.5μg)加热到72℃5分钟,冷却,离心,并添加到20μl反应混合物中,所述反应混合物在2.0mM cDNA合成缓冲液(Invitrogen)中含有100ng/μl寡聚dT、10μM DDT和0.8U/μl RNAse抑制剂。温育在50℃进行1小时。将产物通过苯酚/氯仿/异戊醇抽提、通过MicroSpin S-200HR柱并用乙醇沉淀进行纯化。基因特异性LL引物从鲑鱼LL序列设计(表3)。PCR混合物(20μl)含2μl cDNA模板、0.4μM引物(LLF1、LLF2、LLR1、LLR2和LLR3)、1x PCR缓冲液、0.5U Taq DNA聚合酶(Takara)和0.2mM dNTP。PCR扩增使用32个循环,每个循环94℃45s/58℃45s/72℃90s,最后在72℃延伸7分钟。反应混合物通过1.8%琼脂糖-TBE凝胶,使用在1x TBE缓冲液(pH 8.3)中的0.5μg/ml溴乙锭进行分析,使用DNA标志物100bp序列梯(New England Biolabs)。
表3:用于斑马鱼LL扩增的引物
通过标准流程,将PCR片段连接到pGEM T-Easy载体系统1(Promega,Madison,WI)中。
电转化使用40μL大肠杆菌DH5α和1μL连接在pGEM T-Easy载体中的PCR片段。加入SOC培养基(1ml),然后将细菌在37℃温育1小时。将重组细菌(200μL)铺于标准的LB/氨苄青霉素、X-gal、IPTG琼脂平板上,并在37℃下温育过夜进行蓝/白筛选。挑取10个白色克隆,并在含有100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB培养基中过夜培养进行生长。使用质粒小量纯化试剂盒(Qiagen,Chatsworth,CA)进行质粒纯化。使用标准流程扩增质粒并测序(DNA SequenceLab,Bergen)。
LL的5′-和3′-RACE PCR使用GeneRacer core试剂盒(Invitrogen目录号45-0168)按照说明书进行。使用2μg总RNA,使用Superscript III(Invitrogen)在RT中合成第一链cDNA。第一轮5′-和3′-RACE PCR扩增使用5′-或3′-GeneRacer引物和反向或正向基因特异性引物LLR2和LLF3(表3)进行。嵌套5′-或3′-RACE PCR扩增使用嵌套5′-或3′-RACEPCRGeneRacer引物和嵌套反向或正向基因特异性引物LLR4和LLF4。对于5′-和3′-RACE PCR来说,第一步5个循环,94℃30秒和72℃1分钟;接下来5个循环94℃30秒和70℃1分钟;第三步30个循环,94℃30秒、68℃45秒和72℃1分钟;最后的延伸步骤72℃7分钟。嵌套5-或3′-RACE PCR分三个步骤:第一步5个循环,94℃30秒,72℃2分钟;第二步5个循环,94℃30秒,70℃2分钟;第三步25个循环,94℃30秒、65℃30秒和68℃1分钟;最后的延伸步骤72℃10分钟。用于嵌套PCR的模板使用以1∶25在蒸馏水中稀释的第一轮RACE PCR的PCR产物。
用于RACE PCR的引物列于表3中。使用PCR纯化试剂盒(Promega,Madison,WI,US)纯化单一PCR产物,并将其连接到PCR II Topo载体(Invitrogen)中,用于转化JM109高效感受态大肠杆菌(Invitrogen)。重组细菌在Lucia Bertani琼脂平板上通过蓝/白筛选进行鉴定。含有插入片段的质粒使用Promega纯化试剂盒进行纯化,并使用M13引物测序。LL mRNA序列使用Blastx和Blastp搜索程序进行分析。
通过组合三组引物(参见表3),扩增产生了大小如从鲑鱼LL所预测的扩增子(图16A)。没有斑马鱼mRNA的白色空白是阴性的。对最大的产物(720bp)进行测序,证明了LL存在于斑马鱼中。使用位于鲑鱼外显子两侧不同位置的特异性寡核苷酸作为引物扩增不同大小的PCR产物(图16A),进一步证实了斑马鱼与鲑鱼LL之间的高同源性。作为扩增反应的阳性对照,我们使用了β-肌动蛋白。
5′-RACE PCR阐明了斑马鱼LL的5′-非翻译区(5′-UTR)的序列。我们使用了从受精后4小时(hpf)直到受精后5天(dph)的mRNA。第一轮RACE PCR扩增产生非常弱的产物。将来自所有阶段的这些扩增产物用于第二轮RACE PCR,使用高退火温度(65℃)以便提高反应的特异性,使用1∶20稀释的第一轮RACE PCR反应液。从所有阶段、甚至是4hpf产生了同样的两个产物(520和420bp)(图16B)。从这些发育阶段,获得了来自20个以上克隆的LL序列信息。所有克隆都含有在鲑鱼LL中检测到的29nt的上游区(图16C)。也通过多次分析对3′-末端进行了测序,并显示出其具有与在鲑鱼白细胞凝集素中发现的结构非常相似(几乎同一)的结构。根据全长cDNA序列推衍的斑马鱼LL蛋白保存在NCBI Gene Bank(登记号FJ 643620)。编码序列由1,213nt构成,具有765个核苷酸的开放阅读框。推衍的斑马鱼LL的氨基酸序列显示出255个氨基酸的蛋白,翻译起始密码子位于+1核苷酸位置(或30-32核苷酸位置;图16C)。LL cDNA也在nt+94处具有可能的起始密码子(图16C)。在20个斑马鱼LL克隆的4个中,转录本含有从+1位点上游的29个核苷酸,但是缺少接下来的93个核苷酸(核苷酸序列正确阅读到-1,其后跟着+94位处的核苷酸;图16C)。因此,数据表明可以翻译出两种不同的LL蛋白(图16C)。
斑马鱼与鲑鱼LL之间明显存在强烈同源性。斑马鱼LL与两种鲑鱼LL相比是混杂结构。在已确立的7个LL分类标准判据中,4个标准判据将斑马鱼LL置于LL-1类别,而两个标准判据将其置于LL-2类别中(图16E)。第七个标准判据对于斑马鱼LL是独特的(图16E,加框区域)。此外,在外显子3中失去一个Cys,并在序列“nmnTPYClts”中被Arg代替,其在斑马鱼中读成“nmnDTPRlts”。结果,斑马鱼LL具有5个半胱氨酸,而鲑鱼具有6个半胱氨酸,预计它们都位于二硫桥中。
对于各个外显子来说,外显子1是同一的,而斑马鱼外显子2具有三个在鲑鱼中未发现的独特氨基酸(Gly-Arg代替57和58位的Ser-Gln,以及Val代替78位的Ile)。外显子3具有4个改变的残基(或2个?)。在外显子4和5中,除了3个分类位点之外没有差别。因此,忽略分类位点,在斑马鱼LL(总共255个氨基酸)中存在5(或7)个独特的氨基酸。斑马鱼LL与鲑鱼LL相比高度保守,差别只有几个百分点。
斑马鱼LL(图16D、E)与鲑鱼LL非常类似。斑马鱼LL缺少在鲑鱼LL中发现的六个Cys中的一个,因此可能只含有两个二硫桥:一个连接N-和C-端,加上外显子4中的内部桥。对比鲑鱼和大斑马鱼LL(图16E),在鲑鱼中观察到的固定结构变异得到斑马鱼LL结构的支持。观察到了一个原子团的变化(131号残基),但是在鲑鱼LL中发生变异的地方观察到的主要是保守取代。在PVF中,LL可能具有免疫保护功能。LL结构中受限的变异可能与这些功能有关。截短的白细胞凝集素(tLL)缺少分泌肽,表明tLL(图16D)没有分泌,tLL可能是4叶β-螺旋桨蛋白。不同的LL蛋白在理论上可能执行不同的细胞功能。tLL的功能可以在lectocyte之外的细胞中起作用。
实施例10:来自鲑鱼的LL基因的分离和性质研究
BAC文库的筛选
为了获得白细胞凝集素基因的基因组结构,我们筛选了由鲑鱼基因组计划(Salmon Genome Project)(Oslo,Norway)制作的可以获得的公共鲑鱼基因组BAC文库(18x覆盖度,平均插入片段大小约为188kb)。使用从雄性大西洋鲑鱼(Salmo Salar)的挪威水产养殖株构建的高度冗余的细菌人工染色体(BAC)文库来筛选LL阳性克隆。文库由总数为305,557个克隆构成。文库的平均插入片段大小为188kbp,代表了18倍的基因组覆盖度。产生了CHORI-214高密度滤膜Seg.1(滤膜组-007193)用于杂交筛选,所述滤膜各含18,432个双份点样的克隆。
为了筛选文库,使用正向引物LL/F5′-TACGGACACAGGTCGAATCCCCTACTACC-3′和反向引物LL/R5′-ACAGAGAAGAGGCTAATGTGTGCAC-3′,通过PCR方法掺入地高辛-11-dUTP(Roche),制备了620bp的LL特异性cDNA探针。将DIG标记的cDNA探针在95℃温育10分钟,并立即置于冰中5分钟,然后加入到杂交缓冲液中(5x SSC,50%甲酰胺,0.02%SDS,2%阻断剂(Roche),DEPC处理过的水)。
杂交在杂交管中于55℃执行过夜。杂交后的清洗步骤以低严紧性在含有0.1%SDS的2x SSC中在室温下进行两次,每次15分钟,并以高严紧性在含有0.1%SDS的0.1x SSC中于65℃进行两次,每次20分钟。将滤膜在含有马来酸缓冲液(pH 7.5)和1%阻断剂(Roche)的阻断溶液中温育,然后在含有1∶10,000稀释的抗Dig-碱性磷酸酶(AP)偶联的抗体(Roche)的阻断溶液中在室温下温育。在用含有150mM NaCl和0.5%Tween 20的0.1M马来酸缓冲液(pH 7.5)清洗后,将膜在检测缓冲液(0.1M TrisHCl,0.1M NaCl,pH 9.5,室温下)中平衡2分钟。阳性的双份杂交斑通过化学发光测定法,使用CSPD(Roche)作为底物进行可视化。阳性信号的鉴定通过将滤膜暴露于X-射线胶片(Kodak)来获得。曝光时间从3至15分钟不等。将两个所选阳性克隆L-7/257和A-12/144铺于制备好的琼脂平板上,并在37℃温育过夜。挑取三个克隆,在含有20μg/ml氯霉素的5ml LB培养基中,于37℃振摇培养生长过夜。质粒DNA的纯化在第二天使用超纯DNA纯化试剂盒(Qiagen)进行。将BAC DNA用Not I消化,并通过脉冲场电泳(PFGE)进行分析(Osoegawa等,1998,Genomics,52,pp.1-8)。使用低范围PFG标志物(New England Biolabs)和λ-Hind III片段(Takara)作为DNA大小的标志物。
阳性克隆的PCR验证
使用纯化的BAC DNA作为模板并使用基因特异性引物进行PCR反应。PCR反应在95℃温育3分钟,然后进行35个循环的95℃30s、54℃退火30s和72℃延伸30s,最后在72℃温育10分钟。在热循环后,将2μl每种PCR反应液在1.5%琼脂糖凝胶上进行分析。
白细胞凝集素BAC克隆的鸟枪法测序
两个克隆由德国柏林的MRW测序。载体插入片段被测序到估计冗余度为2.4倍。从读取数据中清除载体和宿主的元件。从约180个读取数据中,使用生物信息学从两个BAC克隆分别建立了总共33和22个重叠群。通过mRNA序列和氨基酸序列对重叠群进行检查。通过程序搜索和人工目测检测进行分析,鉴定了外显子和内含子两者。从交叠的重叠群鉴定到完整LL基因。
基因组结构
上述筛选的结果鉴定到7个特异性克隆,按照BAC文库的名称命名为A-12/144、L-16/143、P-6/76、B-5/70、O-20/85、L-7/257和F-7/176。基因组BAC克隆的平均插入片段大小,根据从所有选择的BAC克隆纯化的DNA并随后将其用Not I限制性酶消化来估算。含有载体的DNA消化产物通过脉冲场凝胶电泳进行分离,并通过溴乙锭染色进行可视化。所有BAC克隆只产生两条带,显示出载体(pTARBAC2.1)大小为~13kbp(13,397bp;Osoegawa等,1998,同上)。这表明所有克隆的插入片段大小为~25kbp。使用从BAC克隆纯化的DNA作为模板并使用LL基因特异性引物,通过扩增再一次验证了7个所选BAC克隆中的6个的序列。从所有这些克隆的PCR扩增产生了~600bp的产物。它们的身份通过直接测序进一步证实。
两个BAC克隆的鸟枪法测序
对所有序列数据使用序列组装程序BioEdit和Dna Baser。分析显示,当针对mRNA序列和蛋白质序列两者进行筛选时,两个所分离的25kbp BAC克隆都含有完整的白细胞凝集素mRNA序列(在消除载体序列元件后)。来自一个BAC克隆的数据产生了总共80个读取数据,其被组装在33个重叠群中。其中,至少6个重叠群含有LL序列,这允许重建整个LL基因。除了LL序列之外,在这些重叠群中经常以高度确定性鉴定到其他组分,包括反转录酶、离子性肽酶和可转座元件。
LL基因组基因结构的特征
在第一次分析中,只有一个克隆(L7/247)允许鉴定到完整LL基因,而另一个克隆(A12/144)显示出大部分基因组结构(图16)。来自基因组克隆L7/247的数据显示了白细胞凝集素的基因组组织,其中基因由5个外显子构成,被4个内含子中断,从TATA盒开始跨度为~2.3kbp。基因组LL序列显示出TATA开始于从ATG起始密码子-81的位置(TATAAAA),指出mRNA具有81个核苷酸的5′UTR(不能翻译的元件)。终止密码子在基因组序列中位于从ATG起约1850nt的位置。6个核苷酸长的聚腺苷化信号AATAAA始于从ATG起约2,250的位置。3′UTR是从终止密码子TAG后开始约400个核苷酸长的序列。按照传统的定义,加上由81个核苷酸构成的5′UTR,LL基因的大小据估算为至少~2.3kbp,其中内含子序列为外显子序列的两倍。为了验证白细胞凝集素基因的外显子-内含子边界,从已确定的基因组内含子序列设计PCR引物,并将其用于从鲑鱼胚胎DNA扩增每个外显子。这5个外显子序列通过扩增子的直接序列分析得出,并且都对应于已确定的基因组序列。
编码外显子的尺寸看起来相当明确,在55bp(外显子1)到234bp(外显子2)之间不等。值得注意的是,两个内含子相对小,使得准确长度可以通过人工读取数据得出。相反,内含子3约为250nt,而内含子4跨度约为700bp。内含子4的准确长度不能从可用数据确定。合并的外显子序列数据证实了预测的翻译产物,即255个氨基酸的蛋白。
此外,数据支持两种已描述的白细胞凝集素变体之一的具有5个外显子和4个内含子的基因组LL基因结构。分泌型LL蛋白的N-端氨基酸残基已经通过纯化LL的直接Edman降解确定是色氨酸。该色氨酸残基占据255个氨基酸的前体蛋白中从N-端甲硫氨酸起的20号位置,前面是18号(His)和19号(Ala)氨基酸。预测在Ala与Trp之间是用于产生分泌型LL蛋白的加工蛋白酶的切割位点。通过直接Edman降解,该分泌型LL的序列被确定是WDCQEVVNIK NLMQI DAGLG Q-V,并且也被多个真实的蛋白序列所证实。外显子不都是同框的,但是可能允许跳过某些外显子而不破坏所有阅读框。基因组序列分析指出了外显子/内含子边界的序列。例外的是内含子4,其中在内含子序列两侧可能存在非标准核苷酸。在内含子1、2和3中,我们发现了在许多脊椎动物内含子的开始和结束处两侧共有的GT//AG特征。(Shapiro和Senepathy,1987,Nucleic Acids Research,15,pp.7155-7174)。
外显子1(19个氨基酸)长为55nt,序列为MATA-AVLLV-LCLLT-ISH(A),并终止于分泌型白细胞凝集素的N-端色氨酸前的19号Ala残基的第一个G密码子处。加粗斜体的大写R表示该位置中的变体氨基酸可能与白细胞凝集素-3基因相关(参见图17)。基因组基因序列继续使用核苷酸GT开始内含子1。内含子1结束于核苷酸AG,随后是外显子II,其含有19号Ala密码子的最后两个碱基(-CA),其后是白细胞凝集素N-端的20号Trp的TGG密码子。内含子1长为89nt。
外显子2(234nt)含有77个氨基酸(234-2nt/3=77AA+1nt)。这里,基因组序列翻译成(ala)-WDCQEVVNIK-NLMQIDAGLG-QVVAT DTSQI-PYYLV G*DKWI-RL*PGS LKHIT-VGPAGIWGVN-KDYAI YKYVA-GNWVQ AA(G)(=77个氨基酸+1nt),其后跟着核苷酸GT(在内含子2中)。星号表示在LL蛋白或多个LLcDNA序列中发现可选氨基酸的残基(参见图17)。G*似乎在白细胞凝集素-1中变化,而L*似乎在白细胞凝集素-2中变化。内含子2长度为186nt,以核苷酸AG结束。
外显子3(72个氨基酸)在2个核苷酸GC后开始(=Gly,78号残基),并持续另外216nt(总共218nt)或72个氨基酸。外显子3的氨基酸序列读为:(G)LL*KQL DAGG -QF VGANMN*D TPCLTSSAT-VGYKG PGSPL-PWTGL PGAVK-YYSCG P*FGCW-AVNKN DDIYL-MS,其中150号残基是S。三个粗体强调的大写字母表示用于辨别白细胞凝集素-1和白细胞凝集素-2的变体氨基酸。具有星号的字母仍然表示在该位置处具有微变化(N*存在于白细胞凝集素-2中;P*表示在白细胞凝集素-1和白细胞凝集素-2二者中的微变化)(参见图17)。随后是内含子3,始于核苷酸GT,并延续另外~250nt。
外显子4(39个氨基酸)始于151号氨基酸残基,序列=LNQDCQNGW-SHIE*G KLSMI-EVATD GSVFG-VNSA*GSVYT,其中T是189号残基。同样,用粗体强调的残基用于区分白细胞凝集素-1与白细胞凝集素-2,而星号表示该位置处的微变化(位置E*可以在任一种白细胞凝集素中看到,位置A*只在白细胞凝集素-2中看到)。内含子4可能不以定义内含子的标准核苷酸序列开始和终止。因此关于内含子4的数据多少有些初步,因此内含子4的长度是估算值(~700nt)。
外显子5(47个氨基酸)始于R的密码子(=190号残基),并延续到C-端组氨酸(236号残基),其后跟着终止密码子TAG和3′UTR。序列读为:RDGIT-ASKPE-GTGWS-NIPMG*-MLMGHVTYDL-GRLWV-VKS-TMVCT-H,其中星号表示在白细胞凝集素-1中该位置中的微变化。粗体字母表示白细胞凝集素-1与白细胞凝集素-2之间的差异。粗体和斜体字母表示存在白细胞凝集素-3的可能性。这些数据概述在图17中。
实施例11:白细胞凝集素-1基因组序列与白细胞凝集素mRNA序列的比较
使用来自鲑鱼的cDNA的十几个独立的克隆和测序实验,比对的序列显示出只在7个位置处存在明显的可选替的不同氨基酸残基。整体序列变异的稀少以及对这些变异的定型限制,是非常显著的。
来自L-7/247的基因组序列对应于被分类为白细胞凝集素-1的白细胞凝集素克隆。另一个测序的cDNA被称为白细胞凝集素-2,在标出的7个位置处不同。除了这些位置之外,有迹象表明存在一些其他的氨基酸变异。这可能表明了两种分类的cDNA的额外的微观非均质性,但是数据可能表明存在第三类LL cDNA,因为例如在226号位置中,我们在某些克隆中发现了酪氨酸残基,其在任何白细胞凝集素-1或白细胞凝集素-2的cDNA中从未发现过(图17)。
观察到的变异的概述显示在图17中。两种类型的白细胞凝集素的特征在于,成熟白细胞凝集素的推衍的氨基酸序列在7个位置(88、91、101、147、158、229、230号)处分别为(E、I、Y、Y、K、A、V)对(N、V、F、F、N、G、G)。这7个位置明确地将它们分类成两类白细胞凝集素,其此外可以在用星号显示的定型位置处表现出微变化。正如图17中的数据所指示的,某些mRNA序列在LL信号肽的2号位置处显示出独特的Gly,其在白细胞凝集素1和2中没有看到,因此其表明可能存在白细胞凝集素-3。此外,我们已经在成熟白细胞凝集素中226号位置处观察到Tyr,而在白细胞凝集素1和2中只看到Ser。我们的结论是L7/247中的基因组序列对应于通过鲑鱼LL cDNA的多重测序发现的白细胞凝集素-1的序列。LL BAC克隆的进一步测序将显示出其他主要的白细胞凝集素-2类别,以及可能的怀疑存在的白细胞凝集素-3,正如由上述残基判据所确定的。
实施例12:在其他物种中检测白细胞凝集素蛋白
调查了虹鳟鱼(Oncorhyncus mykiss)、鳕鱼和异体住囊虫(Oikopleura dioica)的孵化液中白细胞凝集素蛋白的存在。通过亲和层析制备来自孵化液的蛋白,并通过15%SDS-PAGE进行分析。将凝胶银染以显示各种蛋白的存在,或转印并用鲑鱼白细胞凝集素抗体探测。在每种情况下都检测到~26kDa的单一蛋白,其对应于白细胞凝集素的分子量(参见图18(虹鳟鱼)、19A(鳕鱼)和19B(异体住囊虫)。
序列:
1:(来自鲑鱼胚胎的白细胞凝集素多肽):
MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPY
YLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ
LDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCG
PFGCWAVNKNDDIYLMS LNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNS
AGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSAVTM
VCTH
2:(来自鲑鱼白细胞的白细胞凝集素多肽):
SIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGL
PKQLDAGGEQFIVGANMDDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYY
SCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNNGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFG
VNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMCMLMGHVTYDLGRLWVVSKSAV
TMVCTH
3:(来自鳕鱼白细胞的白细胞凝集素多肽):
LVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQL
DAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGP
FGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVNSA
GSVYTRD
4:(来自鸡白细胞的白细胞凝集素多肽):
IPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYATYKYVAGNWVQAAGLL
KQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYS
CGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGV
NSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVV
5:(来自人类白细胞的白细胞凝集素多肽):
MRATAAVLLVLCLLTISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTGRIPY
YLVGDKWIRLPGSLKHVTVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLK
QLDAGGEQFIVGANMNDTPYRLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSC
GPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVN
SAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSGGTM
VCTH
6:(来自斑马鱼的白细胞凝集素多肽):
MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPY
YLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ
LDAGGNQFIVGANMNDTPYRLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSC
GPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVN
SAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVTKSGGTMVCTH
7:(来自鲑鱼的白细胞凝集素2多肽):
MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPY
YLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ
LDAGGNQFVVGANMDDTPFCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSC
GHFGCWAVNKNDDIFLMSLNQDCQNNGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVN
SAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSGGTM
VCTH
8:(来自鲑鱼的白细胞凝集素3多肽):
MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPY
YLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQ
LDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCG
PFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNS
AGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVYKSAVTM
VCTH
9:(来自人类血液的白细胞凝集素cDNA序列)
ATGAGAGCCACTGCAGCCGTCCTATTGGTCCTCTGTCTCCTGACCATCAG
TCATGCATGGGACTGTCAGGAGGTAGTAAACATCAAGAATCTGATGCAG
ATCGATGCAGGACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAGGTCGAATCC
CCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAG
CATGTCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATG
CAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCCTTCTG
AAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGA
ACGATACTCCATACCGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGG
TCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTAC
TACAGCTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATA
TCTACTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCA
CATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCT
TTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGC
CAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTC
ATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTC
TGGCGGCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCGAAGGC
CGTTCGGGATCTGTCTAAAGTTCACTTGCGAACTCATTGATCTCTCTTTCT
GGAAAAGCCTTTAGTTCATTAGTTCATAAAAATCCTTCATTTTAAAACCT
ATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATTATCTTATTGCCATTTAAA
AAAATATCAATGAAGATGTTATATTTTCTTGACCACTCCTTGATTAACAC
TTCAATAGATCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAGTGTAGTGTAAACTAGGG
CATGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTTTGCTGTGCTTCAGAGGT
CATCAATAGGATTGGATGGAATCCTTGTCATTGTTTATTATCTCATTATAT
AAACATTTCCTGCAAAAATAAAGCATTCATTTTGAAACTATTGTAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAN
10:(来自鲑鱼的白细胞凝集素的基因序列,来自成熟鲑鱼的基因组DNA文库):
TGTGCAGGGCTATAAAAAGCGCAAAGTCTTCCAATGGGACAATTGAAGTC
TGGTGTACAACCAAACGTATACTGTAGATCTACATAGACATCATGAGAG
CCACTGCAGCCGTCCTATTGGTCCTCTGTCTCCTGACCATCAGTCATGGT
AAGTTACCATCATCTGAAACATGCTTGATCAACTTGGAGTTGAAGTTTTT
CTTGGTATACTCTACTCATATGTCTTTGTCTCCATAGCATGGGACTGTCA
GGAGGTAGTAAACATCAAGAATCTGATGCAGATCGATGCAGGACTGGGG
CAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTACCTGGTAGGTG
ATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGTAGGACCA
GCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAGTATGTGG
CCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGTAAGTGGAGAGCATTACTCAATAT
TTATCCAGAGGACACCTGCTTATTAGCTTTCCTGATACCATCAGGCTGTT
GAAAAAAACGATTGATGTTTTAAATTGTAACTTGTAGGTAATTTGGCAGT
ACTCCTTGTTTGCTTGTCTGTCTGTCTTTGTGGTCTTGGCCTTCTGAAACA
GTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGAT
ACTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAG
GCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAG
CTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTA
CTTAATGAGTGTAAGATCTGGGAAAGAGTGGGAGAGCTGGAGTAGAGTA
GTAGAGGATGGAGAGTGTCAGTTATTTTAAAACTGTTTCATATTATAACT
GTTGAAATTGTCCTAAAACCCTGATTGTATCATTTTGTTTCCAGCTGAAT
CAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCA
TGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGT
AGTGTTTATACCCAGGTAAGGTTGCTACTGAACTATGTGTATGGTCCACC
ACCCCCCCCCCCCCAACAGTATTAACTTGAAAATGACTTGTAATAATAAC
TTAGAATAATAATGGTATACCCTTTAATTATAACTCTGATCCTTACAGTA
CATGCTATGTGAATCTCCTTACACAAAAACTAAATATTGTAGGTACATAA
ATAAAATCAGTTAAATATAATCAGATCTAAACTTATAGGACTTATTAAGA
AATGTGTAGACAGTGTATGATAAAATATGTAAAAGTTGGATGTCCTGTA
AAGCTACAGTTTGGGATAAAAAACAACAACTTCCCAGACACCCCACCAC
TTGTTCTGGTAAACAGCTGAGGAATGTAGTTAGAGAAATGTAACCACTCT
CACATTCATACATGGAGCTACGGATGCAAAGACACAACAATTTTTTTATT
AAAAAAAAAAAAATGTTTATATTTTCTTTTAAAGCTAAACATTGTTTGTT
TACAATAACATTGTTTACAAACAATTGAGTAAAAGCTTACATTTTGGCTT
CTAATGTGGTTGAATAAAGCTCAAGATGCAGAAGTTATATTCTTCAAAA
ATCTATGGCTATATTTAATTATTAAAGTCCAAAAATGGATGTACTTAAAA
AAAATGGATAAGCTTTAAAACATGAACCCCAACCCTTTCTTCAACACAG
AGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATAT
CCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTT
GGGTCGTCTCCAAGTCTGGCGGCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTT
CTCTGTAGCTGAAGGCCGTTCGGGATCTGTCTAAAGTTCACTTGCGAACT
CATTGATCTCTCTTTCTGGAAAAGCCTTTAGTTCATTAGTTCATAAAAAT
CCTTCATTTTAAAACCTATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATTA
TCTTATTGCCATTTAAAAAAATATCAATGAAGATGTTATATTTTCTTGAC
CACTCCTTGATTAACACTTCAATAGATCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAG
TGTAGTGTAAACTAGGGCACGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTT
TGCTGTGCTTCAGAGGTCATCAATAGGATTTGACGGAATCCTTGTCATTG
TTTATTATCTCATTATATAATCATTTCCTGCAAAAATAAA
11:(来自200-450日龄的鲑鱼胚胎的白细胞凝集素cDNA序列,只显示外显子):
ATGAGAGCCA CTGCAGCCGT CCTATTGGTC CTCTGTCTCC
TGACCATCAG TCATGCATGG GACTGTCAGG AGGTAGTAAA
CATCAAGAAT CTGATGCAGA TCGATGCAGG ACTGGGGCAA
GTGGTTGCTA CGGACACAAG TCAAATCCCC TACTACCTGG
TAGGTGATAA ATGGATCCGT CTGCCTGGTT CCCTGAAGCA
TATCACTGTA GGACCAGCAG GGATCTGGGG TGTCAACAAG
GACTATGCAA TCTACAAGTA TGTGGCCGGT AACTGGGTTC
AAGCTGCAGG CCTTCTGAAA CAGTTGGATG CTGGAGGTGA
ACAGTTTATT GTGGGGGCTA ACATGAACGA TACTCCATAC
TGTCTGACAA GTAGTGCCAC AGTTGGCTAC AAGGGTCCAG
GCTCACCCCT TCCATGGACA GGATTGCCAG GAGCTGTGAA
GTACTACAGC TGCGGACCCT TTGGGTGCTG GGCAGTCAAC
AAGAATGATG ATATCTACTT AATGAGTCTG AATCAAGACT
GCCAAAACAA GGGGTGGAGT CACATTGAAG GCAAGCTTTC
CATGATTGAG GTGGCAACTG ATGGTAGTGT CTTTGGGGTC
AACTCTGCGG GTAGTGTTTA TACCAGAGAC GGCATCACAG
CCAGTAAACC AGAGGGCACC GGATGGAGCA ATATCCCAAT
GGGCATGCTC ATGGGCCACG TGACCTACGA CCTGGGCCGT
CTTTGGGTCG TCTCCAAGTC TGGCGGCACC ATGGTGTGCA CACAT
12:(来自鲑鱼白细胞的白细胞凝集素基因序列):
ACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTACCTG
GTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGT
AGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAG
TATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCGTTCCGAAACAGTTGG
ATGCTGGAGGTAACCAGTTTGTTGTGGGGGCTAACATGGACGATACTCC
ATTTTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAGGCTCAC
CCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGCTGCGG
ACACTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATTTTCTTAATGA
GTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAACGGGTGGAGTCACATTGATGGCAA
GCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACT
CTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGA
GGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTG
ACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTCTGGCGGCACCAT
GGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGT
13:(来自鳕鱼的白细胞凝集素基因序列)
CAATCCCCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCC
CTGAAGCATATCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGG
ACTATGCAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGG
CCTTCTGAAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTA
ACATGAACGATACTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTA
CAAGGGTCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTG
AAGTACTACAGCTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATG
ATGATATCTACTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTG
GAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGT
AGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGAC
14:(来自鸡的白细胞凝集素基因序列):
CAGGACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTA
CCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCA
CTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTA
CAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCCTTCTGAAACAG
TTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGATA
CTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAGG
CTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGC
TGCGGACGCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTACT
TAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGA
AGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGG
TCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGCCGTAAA
CCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCC
ACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCT
15:(来自斑马鱼的白细胞凝集素部分基因组序列):
NNAAAANNTAAAATANNGTAGGTACANNNNAAATCAGTTAAATATAATC
AGATNTAAANTTNTAGGACTATTAAGAAATGTGTAGACAGCGTACGATAA
AATATGTAAAAGTTGGATGTCCTGTAAAGCTACAGTTTGGGATAAAAAAC
AACAACTTNCCAGACACCCCACCACTTGTTNTGGTAAACAGNTGAGGAAT
GTAGTTAGAGAAATGTAACCANTCTCACATTCATACATGGAGTTACGGAT
GCAAAGACACAACAATTTTTTGTTTACATTNTTTTTAACATGTTTTTTAAA
GCAATACACATTGTTTGTTTACAATAACATTGTTTACAAACAATTGAGTAA
AAGCTTACATTTTGGCTTCTGTGTGGTTGAAATAAAGCTCAAGAGGCAGA
AGTTATATTCTTCAAAAATCAATGGCTATATTTAATTATTAAAGTTCCAAA
AAGGATGTACTTAATAAATGGATAAGCTTTAAAACATGAACCCCAACCC
TTTCTTCAACACAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGG
ATGGAGCAATATCCCAATGTGTATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACC
TGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTCTGCCGTCACCATGGTGTGCACAC
ATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGTTCGGGATCCGTCCAAAGTTCC
CTGGCGAACTCATTGATCTCTCTTTCTGGAAAGCCTTTAGTTCATAAAAA
TCCTTCATTTTAAAACCTATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATGA
TCTTATTGACATTTAAAAAAAATATCATTGAAGATTTTATATTTTCTTGAC
AACTCCTAGATTAACACTTCAATAGACCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAGT
GTAGTGTAAACTAGGGCACGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTTT
GCTGTGCTTCAAAGGTCATCAATAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGT
CGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTNGGATGCATAAG
Claims (20)
1.一种多肽,所述多肽由序列号1,7和8任一个中显示的氨基酸序列组成。
2.一种核酸分子,所述核酸分子由序列号11显示的核苷酸序列或与序列号11互补的序列组成。
3.一种载体,其包含权利要求2中限定的核酸分子。
4.权利要求3的载体,其中所述载体是表达载体。
5.一种用于制备权利要求3的载体的方法,所述方法包含将权利要求2中限定的核酸分子插入到载体核酸中。
6.一种用于制备权利要求1中的多肽的方法,所述方法包含将含有权利要求2中限定的核酸分子的宿主细胞在使所述多肽表达的条件下培养,并回收由此产生的所述多肽。
7.一种多肽,所述多肽从权利要求6的方法获得。
8.一种宿主细胞,所述宿主细胞含有权利要求1的多肽或权利要求2的核酸分子。
9.一种抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段与权利要求1的多肽特异性结合。
10.一种药物组合物,所述药物组合物包含权利要求1中限定的多肽、权利要求2中限定的核酸分子或权利要求9中限定的抗体,以及一种或多种可药用赋形剂和/或稀释剂。
11.以下物质在制备用于治疗或预防动物的皮肤自体免疫病症、皮肤或黏膜炎性病症或受损皮肤的药物中的应用:
(i)权利要求1限定的多肽;(ii)权利要求2限定的核酸分子;或者
(iii)一种药物组合物,所述药物组合物包含(i)的多肽,或(ii)的核酸分子,以及一种或多种可药用赋形剂和/或稀释剂。
12.权利要求11的应用,其中所述多肽,核酸分子或组合物用于向皮肤或黏膜表面给药。
13.权利要求11的应用,其中待治疗或预防的所述皮肤自体免疫病症、皮肤或黏膜炎性病症选自溃疡、湿疹、痤疮、牛皮癣、胃肠炎症、牙龈炎、口腔和食管的炎症。
14.权利要求13的应用,其中所述胃肠炎症选自克罗恩病、溃疡性结肠炎和其他慢性炎症。
15.权利要求11的应用,其中所述受损皮肤过敏或红肿、冻裂、晒伤、被辐射、热损伤或者是创伤。
16.权利要求11的应用,其中所述动物是哺乳动物。
17.权利要求16的应用,其中所述哺乳动物为人类。
18.一种产品,所述产品包含以下的一种或多种:
(i)权利要求1限定的多肽;或
(ii)权利要求2限定的核酸分子;以及
一种或多种其他活性成分作为复合制剂,用于同时、分别或相继使用在动物的治疗中。
19.权利要求18的产品,其中所述动物是哺乳动物。
20.权利要求19的产品,其中所述哺乳动物为人类。
Applications Claiming Priority (3)
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Publications (2)
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