JPH06225764A - 水チャネル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】腎集合管部に偏在する水チャネルを発現させる
ｍＲＮＡ、またはバソプレシン制御水チャネルを発現さ
せるｍＲＮＡに特異的であり、かつ前記ｍＲＮＡに相補
的であるＷＣＨ−１ｃＤＮＡプローブ。 【効果】腎臓の基本的原理の基礎を達成し、様々な腎臓
障害治療の基礎を得るとともに、高水透過性のタンパク
の人工的な合成が可能になり、更には高水透過性の人工
膜を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は腎臓の集合管部に偏在す
るバソプレシン制御水チャネル（ＷＣＨ−１）を形成す
る遺伝子及びタンパク分子に関するものである。

【０００２】これらを用いて水利尿剤のスクリーニング
方法の確立、ＷＣＨ−１タンパクを組み込んだ高水透過
性人工膜及びリポソームが製造できる。

【０００３】

【従来技術】身体の水分の喪失を防止するには、大部分
の哺乳動物にとって、尿の濃縮が不可欠である。濃縮尿
は、バソプレシンに応答して、腎臓の集合管の内腔から
の水を、水透過性の高い膜を通って上皮経由で回収する
ことによってつくり出される(Orloff,J.& Handler,J.S.
Am.J.Med.42,757-768 (1967).; Knepper,M.A.& Rector,
F.C.Jr.in The Kidney(eds Brenner,B.M.& Rector,F.C.
Jr.)445-482(W.B.Saunders,Philadelphia,(1991).)。こ
のネフロン区画において、バソプレシンは水チャネルの
管腔側膜から、又は管腔側膜へのエンドサイトーシス又
はエキソサイトーシスにより水の透過性を制御している
(Handler,J.S.Am.J.Physiol.255,F375-F382 (1988).; H
arris,H.W.Jr.,Strange,K.& Zeidel,M.L.J.Clin.Inves
t.88,1-8(1991).)。

【０００４】最近になってＣＨＩＰ２８が、腎臓の近位
尿細管及び赤血球膜（以下ＲＢＣと略記する）における
水チャネルであることが示された(Preston,G.M.,Carro
l,T.P.,Guggino,W.B.& Agre,P.Science256,385-387 (19
92).)。しかしＣＨＩＰ２８は集合管において発現して
いない(Denker,B.M.,Smith,B.L.,Kuhajda,F.P.& Agre,
P.J.Biol.Chem.263,15634-15642 (1988).)。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】腎臓の集合管の水チャ
ネルの存在は現在まで立証されていない。この水チャネ
ルの存在が明確に立証され、また単離され、かつ同定さ
れることにより、腎臓の基本的原理の解明の基礎が達成
されるとともに、様々な腎臓障害治療の基礎が得られ
る。

【０００６】本発明はかかる問題点の解明に基づき、腎
臓の集合管の水チャネルを単離したものとして得るこ
と、さらにその複製物、複製の手段を得ることを目的と
する。また本発明の水チャネルを組み込んだ人工膜を提
供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば単
離されたＷＣＨ−１ ｃＤＮＡプローブを入手すること
ができ、ＷＣＨ−１タンパク分子を生産する大腸菌、該
大腸菌により生成されたＷＣＨ−１タンパク分子及び、
該ＷＣＨ−１タンパク分子の製造方法により、上記目的
を達成できる。更に、ＷＣＨ−１タンパクを組み込んだ
脂質膜を得る。

【０００８】具体的手段について以下に述べる。

【０００９】腎集合管部に偏在する水チャネルを発現さ
せるｍＲＮＡに特異的であり、かつ前記ｍＲＮＡに相補
的であるＷＣＨ−１ ｃＤＮＡプローブ。またはバソプ
レシン制御水チャネルを発現させるｍＲＮＡに特異的で
あり、かつ前記ｍＲＮＡに相補的であるＷＣＨ−１ ｃ
ＤＮＡプローブ。

【００１０】哺乳類の腎髄質ｍＲＮＡより作成した一本
鎖ｃＤＮＡについて ５’−（Ｔ／Ｃ）Ｔ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ｔ／Ｃ）
ＣＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＴ
（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＡＣ−３’ 及び ５’−ＡＡ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｃ）（Ｔ／Ａ）
（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）Ｃ（Ｇ／Ｔ）（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）Ｇ
Ｃ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＧ（Ａ／Ｇ）ＴＴ−３’ をディジェネレートプライマーとしてＰＣＲにかけ、前
記ＰＣＲ生成物をプローブとして前記哺乳類の腎ｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングして単離される前記Ｗ
ＣＨ−１ ｃＤＮＡクローン。腎提供者はラットが好ま
しい。

【００１１】配列番号１に示す前記ＷＣＨ−１ ｃＤＮ
Ａの塩基配列。

【００１２】前記ＷＣＨ−１ ｃＤＮＡプローブを鋳型
として得られるＷＣＨ−１ ｍＲＮＡプローブ。

【００１３】腎集合管部に偏在する水チャネルを構成す
るＷＣＨ−１タンパク分子、またはバソプレシン制御水
チャネルを構成するＷＣＨ−１タンパク分子。

【００１４】配列番号１に示す塩基配列によってコード
される前記ＷＣＨ−１タンパク分子をあらわすアミノ酸
配列。

【００１５】発現ベクターに配列番号１に示す塩基配列
であらわされるＷＣＨ−１遺伝子を組み込んだ組み替え
プラスミド。

【００１６】好ましくは前記発現ベクターがｐＳＰＯＲ
Ｔであり、前記ｐＳＰＯＲＴのＮｏｔ−Ｉ及びＳａｌ−
Ｉとの切断部位に前記ＷＣＨ−１遺伝子を挿入した組み
替えプラスミド。

【００１７】ＷＣＨ−１遺伝子による、ラット腎集合管
に偏在する水チャネルを構成するタンパク分子を生産す
る大腸菌。またはＷＣＨ−１遺伝子による、バソプレシ
ン制御水チャネルを構成するタンパク分子を生産する大
腸菌。（この大腸菌は、工業技術院微生物工業研究所に
識別のための表示を「Eschelichia Coli.rWCH-1」とし
て寄託されており、その受託番号は「微工研菌寄第1317
1号（FERM P-13171）」である。）

【００１８】前記大腸菌により生成されたＷＣＨ−１タ
ンパク分子。

【００１９】前記大腸菌を用いてＷＣＨ−１タンパク分
子を採取することを特徴とするＷＣＨ−１タンパク分子
の製造方法。

【００２０】前記大腸菌は、好ましくは、ＷＣＨ−１遺
伝子を発現ベクターｐＳＰＯＲＴに挿入して得られた組
み替えプラスミドを大腸菌ＤＨ１０αに導入し、形質転
換して得られた大腸菌であり、より好ましくは、ｐＳＰ
ＯＲＴのＮｏｔ−Ｉ及びＳａｌ−Ｉとの切断部位にＷＣ
Ｈ−１遺伝子を挿入したプラスミドを含む大腸菌、また
はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（以下ＩＰＴ
Ｇと略記する。）添加により発現誘導可能なベクター
（ｐＳＰＯＲＴ）、宿主（ＤＨ１０α）系を用いた前記
プラスミドを持った大腸菌である。

【００２１】ＷＣＨ−１タンパク分子を含有することを
特徴とする脂質膜。

【００２２】ＷＣＨ−１タンパク分子を含有する脂質膜
からなることを特徴とするリポソーム。

【００２３】

【発明の概要】われわれはここで、腎臓の集合管の新し
い水チャネルであるＷＣＨ−１のクローニングについて
報告する。ＷＣＨ−１は、アミノ酸配列において、４２
％まで、ＣＨＩＰ２８と同一である。ＷＣＨ−１トラン
スクリプトは腎臓の集合管のみにおいて検知される。免
疫組織化学的にはＷＣＨ−１は腎臓の集合管部の細胞の
管腔側領域に局在している。アフリカツメガエルの卵母
細胞中のＷＣＨ−１の発現は、卵母細胞膜の浸透圧水透
過性を著しく高くした。興味深いことに、脱水は、ラッ
トの腎臓においてＷＣＨ−１ ｍＲＮＡを著しく誘発さ
せたが、ＣＨＩＰ２８ ｍＲＮＡは誘発しなかった。Ｗ
ＣＨ−１の機能の発現と腎の集合管の管腔側膜のＷＣＨ
−１の局在化はＷＣＨ−１がバソプレシン制御水チャネ
ルであることを示している。

【００２４】＜定義＞本発明でＷＣＨ−１とは腎集合管
に偏在するバソプレシン制御水チャネルをいうものと
し、前記水チャネルを発現させ得る遺伝子をＷＣＨ−１
遺伝子というものとする。

【００２５】

【好適な実施態様】

＜ＷＣＨ−１ｍＲＮＡの単離、塩基配列の決定＞ラット
の腎臓髄質ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡは、ＭＩＰ系列の保存さ
れたアミノ酸配列（Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ｔｈｒ， Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
Ｓｅｒ−Ｐｈｅ）(Wistow,G.J.Pisano,M.M.&Chepelinsk
y,A.B.Trends Biochem. Sci.16,170-171(1991).)に基づ
いて合成された、２つのディジェネレートプライマー(d
egenerate primers)、即ち５′−（Ｔ／Ｃ）Ｔ（Ｔ／Ｃ
／Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ｔ／Ｃ）ＣＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＣ
（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＡＣ−３′
及び５′−ＡＡ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｃ）（Ｔ／
Ａ）（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）Ｃ（Ｇ／Ｔ）（Ｔ／Ｃ／Ａ／
Ｇ）ＧＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＧ（Ａ／Ｇ）ＴＴ−３′
各５μＭによる３０サイクルのＰＣＲ及び逆転写に付し
た。このサイクルは、９４℃においての１分間の変性、
５０℃においての１分間のアニーリング、７２℃におい
ての３分間のエクステンション及びそれに続く７分間の
最終的エクステンションから成るものとした。

【００２６】〜３７０bp ＰＣＲ生成物のバンドをゲル
電気泳動によって単離し、プラスミドベクターＰＣＲ１
０００にサブクローニングした。−２１Ｍ１３及びＭ１
３Ｒけい光プライマーによって、けい光ＤＮＡシーケン
サー３７３Ａ(Applied Biosystems)を用いて、２４個の
クローンの配列を定めた。

【００２７】ヒトＣＨＩＰ２８との５８％のヌクレオチ
ド配列の同一性及び４５％の推定されたアミノ酸配列の
同一性の３６９bpインサートをもって、クローン(ｐＭ
ＷＣ４１)を得た。

【００２８】別の１つのクローン(ｐｒＣＨＩＰ２８)
は、ヒトＣＨＩＰ２８との８８％のヌクレオチド配列の
同一性及び９５％の推定されたアミノ酸配列の同一性の
３６９bpインサートであった。

【００２９】クローンｐＭＷＣ４１は、λｇｔ２２ベク
ター（ＢＲＬ）のＮｏｔ−Ｉ／Ｓａｌ−Ｉ部位に構成さ
れた２×１０⁷組換えラット腎臓ｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングするために使用した。厳密な条件（６
×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアルデヒド、４２℃において
のプローブ結合(hybridization)；２×ＳＳＣ、０．５
％ ＳＤＣ、４２℃においての洗浄）の下に、〜１．４
kbインサートをもって、陽性のクローン（ＷＣＨ−１）
を単離した。

【００３０】ｃＤＮＡインサートをｐＳＰＯＲＴベクタ
ー（ＢＲＬ）のＮＯＴ−Ｉ／Ｓａｌ−Ｉ部位にサブクロ
ーニングし、シークエナーゼ(Sequenase)（ＵＳＢ）を
用いて、サンガー(Sanger)ジデオキシヌクレオチド鎖終
止法によって塩基配列を定め、更にアミノ酸配列を定め
た。

【００３１】図１０にＷＣＨ−１の配列を示す。図１０
は、ＷＣＨ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、並び
に、その推定されたアミノ酸配列とヒトＣＨＩＰ２８(P
reston,G.M.& Agre,P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88,1111
0-11114 (1991).)との整合を示す。保存された残基は、
囲って示し、推定された膜横断領域(Kyte,J.& Doolittl
e,R.F. J.Mol.Biol.157,105-132 (1982).)は下線によっ
て示す。

【００３２】＊は潜在的なＮリンクされたグリコシル化
部位(Kornfeld,R.& Kornfeld,S.Ann.Rev.Biochem.54,63
1-664 (1985).のコンセンサス連鎖を示し、▽はｃＡＭ
Ｐ−依存性プロテインキナーゼによる、◆はプロテイン
キナーゼＣによる、●はカゼインキナーゼIIによる、そ
れぞれのリン酸化部位(Kennelly,P.J.& Krebs,E.G. J.B
iol.Chem.266,15555-15558 (1991).)を示す。ｃＤＮＡ
の終点のポリ（Ａ）⁺トラックは、ＡＡＴＡＡＡ分離及
びポリアデニル化配列の後１４ntにおいて開始される。

【００３３】最初のＡＴＧは、位置−３においてのコザ
ック(Kozak)のコンセンサスＡ(Kozak,M.Nucl.Acid Res.
15,8127-8146(1987).)及び最初の７個のアミノ酸配列が
ヒトＭＩＰと同一であること(Pisano,M.M.& Chepelinsk
y,A.B.Genomics 11,981-990(1991).)に基づいて、開始
コドンとした。

【００３４】最長の読み枠は、ヒトのＣＨＩＰ２８との
４２．７％の配列の同一及びラットのＭＩＰとの５９．
１％の配列の同一(Kent N.A.,Shiels,A.Nucl.Acid Res.
18,4256 (1990).)と共に、２７１個のアミノ酸による蛋
白質をコードする（Ｍｒ２８９２８）。ＭＩＰ系列の各
メンバー(Pao,G.M.et al.Mol.Microbiol.5,33-37 (199
1).)及びＷＣＨ−１の保存される残基と、ＷＣＨ−１の
配列における内部的な配列の繰返し(Wistow,G.J.,Pisan
o,M.M.& Chepelinsky,A.B.Trends Biochem.Sci.16,170-
171 (1991).)は、ＷＣＨ−１がＭＩＰ系列の新しいメン
バーであることを示している。

【００３５】図１は、ＷＣＨ−１の推定されたアミノ酸
配列のヒドロパシープロフィルを示す。平均疎水度指数
は、１２個の残基の窓によって、カイト(Kyte)及びドゥ
ーリトル(Doolittle)のアルゴリズム(Kyte,J.& Doolitt
le,R.F. J.Mol.Biol.157,105-132 (1982).)に従って計
算し、ＣＨＩＰ２８に類似した６個の膜横断領域の存在
が示された。推定された膜スパン領域(membrane-spanni
ng domain)には、Ｉ〜IVの番号を付した。

【００３６】本発明ではラットについて実験を行なった
が、哺乳類であれば他の動物種についても、上記作業に
より該動物種のＷＣＨ−１ｃＤＮＡが得られることは明
白であり、塩基配列及びアミノ酸配列においても、かな
りの部分で同一性を有するであろうことは容易に推測さ
れる。（例えばＣＨＩＰ２８ではヒトとラットの間での
塩基配列の相同性は８８％であった。）

【００３７】＜ＷＣＨ−１の存在組織の探索＞ノーザン
ブロット分析については、数個の組織から抽出したＲＮ
Ａを、ポリ（Ａ）⁺トラクトについて富化し、１レーン
当り１０μｇを、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル
上において電気泳動させた。臭化エチジウムによる染色
によって、等量及び変性の不在をチェックした。ナイロ
ン膜に移した後、³²Ｐの標識を付したＷＣＨ−１ ｃＤ
ＮＡによって高度の厳密さでブロットを交雑させ、２４
〜１２０時間オートラジオグラフィー写真撮影した。

【００３８】単離したネフロン区画のＲＴ−ＰＣＲを記
述のようにして行った(Moriyama,T.,Murphy,H.R.,Marti
n,B.M.& Garcia-Perez,A. Am.J.Physiol.258,F1470-F14
74 (1990).;Terada,Y.et al.Am.J.Physiol.261,F1080-F
1087 (1991).)。簡単に説明すると、単離されたネフロ
ンの区画の２mmを、ランダムなプライマーによって逆転
写に付した。ＷＣＨ−１（５′−ＴＧＧＧＡＴＣＴＡＴ
ＴＴＣＡＣＣＧＧ−３′、塩基５２２〜５３９、及び
５′−ＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＧＧＧＡＴＣＡＣ−３′、
塩基１２１６〜１２３３）のための特異の１８ntプライ
マーとのＰＣＲ反応（１分間９４℃、１分間６０℃及び
３分間７２℃）４０サイクルのために、合成ｃＤＮＡを
使用した。

【００３９】ＰＣＲ生成物は、２％アガロースにおいて
電気泳動させ、臭化エチジウムにて染色し、写真撮影し
た。サザンブロット分析のためには、ＤＮＡを変性さ
せ、ナイロン膜に移し、³²Ｐの標識を付したＷＣＨ−１
ｃＤＮＡと交雑させた。

【００４０】図２は、ＷＣＨ−１の局在を示すノーザン
ブロット分析の写真である。図２ａは、種々のラットの
組織においてのＷＣＨ−１のノーザンブロット分析であ
り、ラット腎臓ｍＲＮＡを含むレーンのみにおいて検出
されるＷＣＨ−１トランスクリプトを示す。ＷＣＨ−１
トランスクリプトは、１２０時間以内の長いオートラジ
オグラフィーによっても、腎臓ｍＲＮＡ以外のレーンに
は検出されなかった（データは示さない）。

【００４１】図２ｂは、ラット腎臓の皮質及び髄質のス
ライスされた区画においてのＷＣＨ−１のノーザンブロ
ット分析である。主要なトランスクリプト〜１．５kbの
他に、比較的大きな２．８kb及び ４．４kbのトランス
クリプトが検出された。これらは交互のスプライシング
又はポリアデニル化変種を表わしうる。

【００４２】以上のノーザンブロット分析により、ＷＣ
Ｈ−１が排他的に腎臓中に、そして腎臓の髄質中に主
に、腎臓の皮質中に劣勢に表わされていることが明らか
になった。

【００４３】図３は、単離したネフロン区画についての
ＷＣＨ−１ ｍＲＮＡのためのＲＴ−ＰＣＲ生成物のア
ガロースゲル電気泳動である。ＷＣＨ−１の７１２bpバ
ンドが、ＣＣＤ、ＯＭＣＤ及びＩＭＣＤのレーンにおい
て検出された。

【００４４】サザンブロット分析によって、ＰＣＲバン
ドにプローブが特異的に結合されることが、各生成物の
同一性を証明した（データは示さない）。

【００４５】略称は次の通りである。ＰＣＴ；近位尿細
管曲部。ＴＤＬ；ヘンレのループの細い下行脚。ＴＡ
Ｌ；ヘンレのループの細い上行脚。ＭＡＬ；髄質の太い
上行脚。ＣＣＤ；皮質集合管。ＯＭＣＤ；外側髄質集合
管。ＩＭＣＤ；内側髄質集合管。ＲＴ（−）；逆転写酵
素なしの反応。

【００４６】ＷＣＨ−１に特異の７１２bpのＰＣＲ生成
物は、皮質及び外側と内側の髄質集合管区画のみにおい
て検出され、ＷＣＨ−１ｍＲＮＡが集合管部に局在的に
発現していることが示された。

【００４７】次に免疫組織化学的にラット腎におけるWC
H−１の局在性を調べた。NH₂-末端がチロシンで、WCH−
１のCOOH-末端側の１５個のアミノ酸に相当するぺプチ
ド（Val-Glu-Leu-His-Ser-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro-Arg-Gl
y-Ser-Lys-Ala）を合成し、Skowsky,W.R. & Fischer,D.
A.J.Lab.Clin.Med.80,134-144(1972).の記載に従い牛の
サイログロブリン（thyroglobulin）に共役させた（以
下、コンジュゲ−トという）。フレウンドの完全アジュ
バントに混合させたコンジュゲート0.5ｍＬ（ぺプチド
0.2ｍｇ）をニュージーランド ホワイト ラビットに免
疫し、ウサギ抗血清（以下、抗-WCH1/Cという）を得
た。

【００４８】２日間水の摂取が制限されたラットの固定
した腎臓の４μｍ切片をスライド上に置き、非免疫ヤギ
血清でプレインキューベートした後洗浄する。スライド
は500：１に希釈された抗-WCH1/Cと、４℃、一晩インキ
ューベートされ、洗浄後スライドはFITC-ヤギ-抗-ウサ
ギ イムノグロブリンの１:100希釈液と、２５℃、１時
間、インキューベートされた。染色されたスライドを洗
浄し、写真撮影した（図４〜図７）。免疫されたウサギ
の５羽中３羽の抗血清（抗-WCH1/C）による免疫染色は
同様の結果を生じた。

【００４９】上記操作により、ラット腎髄質部分が抗-W
CH1/Cとインキューベートされたものを図４に示す（×1
00倍率）。また、ラット腎髄質部分が前もって相当する
ぺプチド抗原とプレインキューベートされた抗-WCH1/C
と、インキューベートされたものを図５に示す（×100
倍率）。集合管の細胞の管腔側ドメインで観察された染
色（図４）はぺプチド抗原とのプレインキューベーショ
ンによって消失した（図５）ので、抗体の特異性が確認
された。

【００５０】図６はラット腎髄質部分が抗-WCH1/Cとイ
ンキューベートされたものを高倍率（×400倍率）で示
したものであり、図７はラット腎皮質部分が抗-WCH1/C
とインキューベートされたものを示す（×100倍率）。

【００５１】蛍光抗体法による染色は皮質と髄質の集合
管にのみ観察されて、近位尿細管や細い下行脚及び細い
上行脚を含めた他のネフロンセグメントでは観察されな
かった（図４、７）。抗血清と相当するペプチド抗原と
がプレインキューベートされた時に切片が染色されなか
ったので、抗体の特異性が確認された（図５）。近位尿
細管及びヘンレの係蹄の細い下行脚部分に発現している
ＣＨＩＰ２８(Denker,B.M.,Smith,B.L.,Kuhajda,F.P.&
Agre,P.J.Biol.Chem.263,15634-15642(1988).)とは対照
的な免疫学的局在性はWCH−１ mRNAのRT-PCRの局在性と
共に、WCH−１が集合管部に特長的に発現していること
を示している。

【００５２】皮質集合管の細胞の中には染色されないも
のも少しあり、これらの細胞は、水チャネルが発現しな
いことが知られている(Handler,J.S.Am.J.Physiol.255,
F375-F382(1988).)介在細胞であると考えられる。高倍
率で観察した細胞内の免疫化学的局在性では集合管部の
細胞の管腔側膜が濃く染色していたが、細胞の血管側は
殆ど染色されていなかった（図６）。その結果、WCH−
１は集合管の細胞の管腔側膜に局在していることが立証
された。興味深いことに管腔側膜の強い染色に加えて、
細胞の管腔側膜下領域にも染色が観察された。解像度は
十分ではないけれども、このことは管腔下のエンドソー
ムに余備の水チャネルの存在を示唆している。

【００５３】＜ＷＣＨ−１が水チャネルであることの証
明＞ＷＣＨ−１トランスクリプトを注入した卵母細胞の
水透過性を測定するために、ビデオ顕微鏡を用いて、浸
透勾配によって誘起された溶積の増大を測定した(Zhan
g,R.& Verkman,A.S.Am.J.Physiol.260,C26-C34 (199
1).)。

【００５４】ｐＳＰＯＲＴベクターを線状化した後、Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記ベクター中ＷＣＨ
−１から、キャップ構造のｃＲＮＡを合成した。雌のア
フリカツメガエルの卵から、卵母細胞を得て、Dascal,
N.CRC Crit.Rev.Biochem.22,317-373 (1987).の記述に
従って調整し、水２０ｎｇ又はＷＣＨ−１ＲＮＡ ２０
ｎｇ（１μｇ／μＬ）を注入し、１８℃において培養し
た。２４時間培養した後に卵母細胞を２００ mOsmから
７０ mOsm Barth緩衝液に移し、ビデオ顕微鏡によって
２４℃にて浸透による容積の増大を観察した(Zhang,R.&
Verkman,A.S.Am.J.Physiol.260,C26-C34 (1991).)。卵
母細胞は、オリンパス位相差顕微鏡において透過光によ
って観察し、ARGUS−２００像処理システムに接続したH
amamatsu SITカメラによって撮像した。２０秒間隔で像
を撮像し保存した。

【００５５】卵母細胞の像を、(Zhang,R.& Verkman,A.
S.Am.J.Physiol.260,C26-C34 (1991).)の記述に従って
処理し、卵母細胞の投影面積を、自動加算によって計算
した。容量比（Ｖ／Ｖ₀）を、時間０の面積（Ａ₀）及び
時間ｔの面積（Ａ）から計算した。

【００５６】Ｖ／Ｖ₀＝（Ａ／Ａ₀）^3/2

【００５７】Ｖ／Ｖ₀の時間曲線の最初の勾配（ｄＶ／
Ｖ₀／ｄｔ）、最初の卵母細胞の容積（Ｖ₀＝９×１０^-4
cm³）、最初の卵母細胞の表面積（Ｓ＝０．０４５c
m²）、水のモル容積（Ｖ_w＝１８cm³／モル）から、浸透
による水の透過性(Ｐｆ)を定めた。

【００５８】Ｐｆ＝[Ｖ₀×ｄ(Ｖ／Ｖ₀)／ｄｔ]／[Ｓ×
Ｖ_w×(ｏｓｍ_in−ｏｓｍ_out)]

【００５９】水銀スルヒドリル試薬の効果を検討するた
めに、Ｐｆの測定に先立って、０．３ｍＭ ＨｇＣｌ₂含
有Barth緩衝液中において５分間卵母細胞を培養した。
ＨｇＣｌ₂中の５分間の培養に続いて、５ｍＭ β−メル
カプトエタノール含有Barth緩衝液中において１５分間
培養することによって、還元剤による抑制の回復につい
て検討した。

【００６０】図８は、ＷＣＨ−１ ＲＮＡを注入したア
フリカツメガエル卵母細胞の浸透圧水透過性の増大を示
し、図８ａに、２０ｎｇ ＷＣＨ−１ ＲＮＡ（ＷＣＨ
−１）、水（比較対照）を注入した卵母細胞の時間依存
の容積の増大を示す。 図８ｂは、ＷＣＨ−１ ＲＮＡ又
は水を注入した卵母細胞の顕微鏡写真である。２０秒間
隔で写真撮影したものを左から右及び上から下の順序で
示してある。

【００６１】浸透による水透過度（Ｐｆ）は、水を注入
した卵母細胞の場合、25.1±1.7（平均±ＳＥＭ）×１
０^-4cm／秒、ＷＣＨ−１を注入した卵母細胞において
は、８３．９±１８．２×１０^-4cm／秒であり、ＷＣＨ
−１を注入した卵母細胞中の浸透圧水透過係数（Ｐｆ）
は、水を注入した卵母細胞中のＰｆの３．５倍であっ
た。

【００６２】更に、ＷＣＨ−１ＲＮＡを注入した１１個
の卵母細胞のうち１０個は、低張液中に移した後１０分
以内に破裂したが、水を注入した卵母細胞は、６０分以
上に亘って、１個も破裂しなかった。

【００６３】ＷＣＨ−１を注入した卵母細胞中のＰｆは
８３．９±１８．２×１０^-4cm／秒であったのが、０．
３ｍＭ ＨｇＣｌ₂中において５分間培養した後は、Ｗ
ＣＨ−１水チャネルの活性は部分的に抑制され、Ｐｆは
４４．５±３．６×１０^-4cm／秒まで低下した。 ０．
３ｍＭ ＨｇＣｌ₂中の培養後、５ｍＭ β−メルカプト
エタノール中に１５分間の培養をすることによって、Ｈ
ｇＣｌ₂ による抑制が回復された （Ｐｆ＝６３．１±
２５．８×１０^-4cm／秒)。

【００６４】ＷＣＨ−１ ｃＲＮＡ注入卵母細胞の浸透
圧水透過性の活性化エネルギー（Ｅａ）は１０〜２８℃
で測定されたアレニウスプロットから評価され、Ｅａは
３．６±０．８Ｋｃａｌ／ｍｏｌ（ｎ＝１２）であっ
た。この値はＲＢＣ及び腎臓の近位尿細管及び集合管に
存在する水チャネルについて報告されている活性化エネ
ルギー(Verkman,A.S.Annu.Rev.Physiol.54,97-108 (199
2).)と類似している。

【００６５】チャネルによって媒介される水の透過性の
特徴である、スルヒドリル試薬による抑制（阻止）及び
還元剤による回復を伴う高い浸透圧水透過性の出現(Ver
kman,A.S.Annu.Rev.Physiol.54,97-108 (1992).)及び低
い活性化エネルギーは、ＷＣＨ−１を注入した卵母細胞
中に表わされた蛋白質が水チャネルであることを強く示
している。

【００６６】われわれの観察した、ＷＣＨ−１注入卵母
細胞中のＰｆ値は、ＣＨＩＰ２８を注入した卵母細胞に
おいて報告された値よりも低かった。おそらく、このこ
とはアフリカツメガエルのβ−グロビンのキメラベクタ
ー(Preston,G.M.,Carroll,T.P.,Guggino,W.B.& Agre,P.
Science 256,385-387 (1992).)を使用しない場合には、
ＷＣＨ−１タンパクの翻訳が減少するため、あるいは管
腔下の貯蔵小胞（subapical resorvoir vesicles）から
管腔側膜へ水チャネルを輸送する(Handler,J.S.Am.J.Ph
ysiol.255,F375-F382 (1988).)ために必要であるバソプ
レシン−制御膜輸送系の欠如のために卵母細胞における
ＷＣＨ−１の膜表面への発現が減少するためと考えられ
る。さらにアフリカツメガエルの卵母細胞において、エ
ンドソームの水チャネルタンパクは外来タンパクの非特
異的輸送機構のため、細胞膜表面への発現が少ない可能
性もある。

【００６７】水除去の効果を検討するために、水の摂取
制限の０．２及び５日後のラットの全腎臓からのＲＮＡ
５０μｇを用いた。ＲＮＡは、アガロース−ホルムア
ルデヒドゲル電気泳動により、大きさに従って分画し
た。臭化エチジウムによる染色と、³²Ｐ標識β−アクチ
ンとの交雑とによって、等量及び変性の不在をチェック
した。ナイロン膜に移した後、ＷＣＨ−１発現のための
ＷＣＨ−１ ｃＤＮＡ及び³²Ｐ標識ＣＨＩＰ２８表現の
ためのｐｒＣＨＩＰ２８のインサートと、高度の厳密さ
で交雑し、オートラジオグラフィー写真撮像した。

【００６８】図９は、長期間の脱水後のラットの腎臓中
におけるＷＣＨ−１及びＣＨＩＰ２８ ｍＲＮＡの量の
変化を示すノーザンブロット分析である。

【００６９】長期間の脱水の後にラットの腎臓中にＣＨ
ＩＰ２８ ｍＲＮＡでなくＷＣＨ−１ ｍＲＮＡが際立っ
て誘発されたことは、長期の抗利尿において集合管の水
チャネルのタンパク質の増大が水透過の増大に寄与しう
ることを示している。

【００７０】バソプレシンの抗利尿作用は、管腔側膜に
水チャネルを挿入することによる集合管の透水性の急激
な増大(Ganote,C.E.et al.J.Cell Biol.36,355-367(196
8).;Kuwahara,M.,Berry,C.A.& Verkman,A.S.Biophys.J.
54,595-602(1988).;Verkman,A.S.Annu.Rev.Physiol.54,
97-108(1992).)と、対向流増幅系及び皮質−髄質間の浸
透圧勾配の増大による尿濃縮力の増大(Knepper,M.A.& R
ector,F.C.Jr.in The Kidney (eds Brenner,B.M.& Rect
or,F.C.Jr.)445-482(W.B.Saunders,Philadelphia,199
1).;Kirk,K.L.& Schafer,J.A.in The Kidney:Physiolog
h and Pathophysiology (eds Seldin,D.W.& Giebisch,
G.)1693-1725(Raven Press,New York,1992).)を含む。

【００７１】われわれの結果は、バソプレシンが、集合
管中の水チャネルの合成を増大させることによっても、
最大水透過性を増大させうる可能性を示した。

【００７２】バソプレシンは集合管の管腔側膜の浸透圧
水透過性を、水チャネルを含有しない他の膜の浸透圧透
過性と同程度より(Verkman,A.S.Annu.Rev.Physiol.54,9
7-108 (1992).;Kuwahara,M.,Berry,C.A.& Verkman,A.S.
Biophys.J.54,595-602 (1988).)大いなる増加へと導く
ので、管腔側膜にある水チャネルの全て、あるいは少な
くとも大多数はバソプレシンに制御されていると推測さ
れる。集合管の細胞の管腔側ドメインでの選択的なＷＣ
Ｈ−１の存在および卵母細胞における水チャネルの機能
発現は、ＷＣＨ−１が集合管の管腔側及びエンドソーム
の膜のバソプレシン制御水チャネルであることを強く示
唆している。

【００７３】本発明により管腔側膜の水チャネルが分子
学的に同定されたので、集合管の細胞でのバソプレシン
制御水透過性の機序の細胞レベルでの研究が直接できる
ようになるであろう。

【００７４】＜ＷＣＨ−１タンパク質の複製手段＞環状
プラスミドｐＳＰＯＲＴを制限酵素Ｎｏｔ−Ｉ及びＳａ
ｌ−Ｉで切って、切断された部位にＷＣＨ−１ ｃＤＮ
Ａを挿入する。ＷＣＨ−１遺伝子を組み込んだプラスミ
ドは大腸菌１０ＤＨα株に導入して形質転換させる。

【００７５】上記組み替えＤＮＡ法による宿主の形質転
換は、公知の方法(Cohen,S.N.et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.,USA.,69,2110(1972).)もしくは、それに準ずる方法
により行なうことができる。

【００７６】このようにして、得られた形質転換体（組
換え体）を公知の培地、例えば L−Broth （アンピシリ
ン含有）培地で培養する。培養に際して、菌体増殖後の
一定時期にプロモーターをより効率よく働かせるため
に、ＩＰＴＧを添加する。添加後の培養は通常３７℃で
３〜４時間行なう。培養後、公知の方法で菌体を集め、
緩衝液に懸濁し、菌体を破砕し、カラムクロマトグラフ
ィー等の公知の方法によりＷＣＨ−１タンパクを精製す
る。

【００７７】＜産業上の利用例＞本発明でＷＣＨ−１の
単離、同定、複製が可能になったことにより、産業上次
のような利用価値が得られる。

【００７８】ＷＣＨ−１タンパクを発現させた物質を利
用した水利尿剤のスクリーニング法が確立できる。例え
ば以下に示す水利尿剤のスクリーニング法が挙げられ
る。

【００７９】１）ＷＣＨ−１のアミノ酸配列から、いく
つかの活性中心と思われるペプタイドを人工合成し、該
ペプタイドと特異的に結合する物質をスクリーニングす
る。

【００８０】２）ＷＣＨ−１組み替えプラスミドを有す
る本発明の大腸菌からＷＣＨ−１タンパクを大量に製造
させ、該タンパクに特異的に結合する物質をスクリーニ
ングする。

【００８１】３）ＷＣＨ−１ ｃＤＮＡから人工的に作
成したｍＲＮＡをアフリカツメガエルの卵へ注入し、卵
膜上にＷＣＨ−１タンパクを発現させる。外液の浸透圧
が低下すると卵は膨張するので、低張液に卵を培養し膨
張をモニターし、膨張が抑制される物質をスクリーニン
グする。

【００８２】４）ＷＣＨ−１タンパクの細胞外ドメイン
に対する抗体を作成し、該抗体がＷＣＨ−１タンパクと
結合するのを阻害する物質をスクリーニングする。

【００８３】５）ＷＣＨ−１ ｃＤＮＡを組み込んだベ
クターを適当な培養細胞（例えばＣＯＳ−７細胞）に移
植する。移植された細胞は水透過性がよくなるので、外
液の浸透圧を低下させると、水が細胞内に流入し、膨張
して破裂する。そこでこの破裂を抑制する物質をスクリ
ーニングする。

【００８４】ＷＣＨ−１タンパクを組み込んだ人工膜(B
ear,C.E.,et al.Cell,68,809-818(1992).)は、高水透過
性を示し利用価値が多く、例えば以下に示す利用法があ
る。

【００８５】１）限外瀘過膜として純水製造に用いる。

【００８６】２）塩の濃縮

【００８７】３）浸透圧センサー

【００８８】４）水利尿剤のスクリーニング

【００８９】特にＷＣＨ−１タンパクを脂質膜の一種で
あるリポソームに組み込んだものは利用価値が幅広く、
例えば以下に示す利用法がある。

【００９０】１）人工血球

【００９１】 ２）薬物を内部に包含させた上記リポソーム 血液中での薬物の放出が緩やかなので持続性徐方性製剤
に適する。

【００９２】３）水利尿剤抵抗性の患者、及び著しい浮
腫の患者への治療薬 高浸透圧物質を包含させたリポソームを経口摂取させる
と、リポソーム中へ体内の水分が取り込まれ、最終的に
便として排出される。即ち、便への水排出が増加するこ
ととなる。

【００９３】４）水吸着剤 高浸透圧物質を包含させた上記小胞は水の吸収力が大き
い。従って、紙等の間に多量の該小胞を入れておけば水
吸着能が著しく上昇するので、おしめ、生理用ナプキン
等に使用できる。

【００９４】ＷＣＨ−１タンパクを組み込んだリポソー
ムは公知の方法で製造でき、比較的一般的なのは凍結融
解法(M.Kasahara,P.C.Hinkle,J.Biol.Chem.,252,7384(1
977).)、オクチルグルコシドによる希釈法(M.J.Newman,
T.H.Wilson,J.Biol.Chem.,255,10583(1980).)及び透析
法(Y.Kagawa,A.Kandrach,E.Racker,J.Biol.Chem.,248,6
76(1973).)である。

【００９５】リポソームの大きさ、性状（単層または多
重層）は脂質の種類によって適宜選択する。

【００９６】例えばＷＣＨ−１タンパクと脂質（リン脂
質との混合が好ましい。）と界面活性剤（例えばデオキ
シコール酸塩）を加えて、超音波によりよく攪拌混合す
る。次に透析またはゲル瀘過により界面活性剤を除け
ば、ＷＣＨ−１タンパクが組み込まれたリポソームがで
きる。

【００９７】凍結融解法によるリポソームの調製例を以
下に示す。

【００９８】

【調製例】１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５），５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、アセトン処理したアゾレク
チン（ダイズ粗脂質）２２．５ｍｇに１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．５ｍＬを加え、窒素ガス
を吹き込んだ後水浴型の超音波発振装置で約２０分、ほ
ぼ透明になるまで超音波処理する。

【００９９】このリポソーム１６７μＬ、精製ＷＣＨ−
１タンパク質２０μｇ、及び１０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）を加え０．５ｍＬとする。窒素ガスを
吹き込んだ後−７０℃に冷やしたアセトン中で凍結す
る。室温で融解した後、水浴型の超音波発振装置を用い
て超音波処理を１５秒行なう。５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂−１
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）及び水で希
釈し、８ｍｇ脂質／ｍＬ−２ｍＭ ＭｇＣｌ₂−１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液として、ＷＣＨ−１タンパク質を組
み込んだリポソームを得る。

【０１００】また、本発明によりＷＣＨ−１ｃＤＮＡの
複製が可能となり、かつ人工的にＷＣＨ−１ｍＲＮＡを
合成することができるようになったので、公知の技術
(M.Mishina,et al.Nature(London),307,604(1984).)を
利用して生体膜上にＷＣＨ−１タンパク質を発現させる
ことができる。

【０１０１】例えば上述の例示にあるようにＷＣＨ−１
ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドを細胞培養に移植し、
あるいはＷＣＨ−１ｍＲＮＡを卵母細胞に注入して、細
胞膜上にＷＣＨ−１タンパク質を発現させることができ
る。

【０１０２】

【発明の効果】本発明により次のような効果が期待でき
る。

【０１０３】腎臓の集合管の水チャネルの存在が明確
に立証され、また単離され、かつ同定されたので、腎臓
の基本的原理の解明の基礎が達成される。

【０１０４】更に腎臓の基本的原理が解明されるの
で、腎臓障害診断に新たな指針が得られる。

【０１０５】また腎臓の基本的原理が解明されるの
で、腎臓障害治療または治療のための材料に新たな指針
が得られる。

【０１０６】ＷＣＨ−１ｃＤＮＡあるいはｍＲＮＡを
細胞内に導入することにより、生体膜にＷＣＨ−１水チ
ャネルを発現させることができる。

【０１０７】本発明の遺伝子操作大腸菌により高水透
過性のＷＣＨ−１タンパクが容易に大量に入手できる。

【０１０８】水利尿剤のスクリーニング法が確立され
る。

【０１０９】ＷＣＨ−１タンパク質を組み込んだ高水
透過性の人工膜が得られる。

【０１１０】ＷＣＨ−１タンパク質を組み込んだ高水
透過性のリポソームが得られる。

【０１１１】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1408 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物：Sprague-Dawley rat 単離クローン名：WCHー1 組織の種類：腎臓 直接の起源 クローン名：pMWC41 配列 AGAGAGAAGA GAAAGAGAGA GGGAGGGAGG AAGAGCCACC CCCGTGGCCC AGACCCCTGG 60 CCAGCGCGCA GAAGTCGGAG CAGC ATG TGG GAA CTC AGA TCC ATA GCC TTC 111 Met Trp Glu Leu Arg Ser Ile Ala Phe 1 5 TCC CGA GCA GTG CTG GCT GAG TTC TTG GCC ACG CTC CTT TTT GTC TTC 159 Ser Arg Ala Val Leu Ala Glu Phe Leu Ala Thr Leu Leu Phe Val Phe 10 15 20 25 TTT GGC CTT GGC TCA GCC CTC CAG TGG GCC AGC TCC CCA CCC TCT GTG 207 Phe Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gln Trp Ala Ser Ser Pro Pro Ser Val 30 35 40 CTC CAG ATC GCC GTG GCC TTT GGT CTG GGC ATC GGC ATC CTG GTT CAG 255 Leu Gln Ile Ala Val Ala Phe Gly Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Gln 45 50 55 GCT CTG GGC CAT GTC AGC GGG GCA CAC ATC AAC CCC GCC GTG ACT GTG 303 Ala Leu Gly His Val Ser Gly Ala His Ile Asn Pro Ala Val Thr Val 60 65 70 GCA TGC CTG GTG GGT TGC CAT GTC TCC TTC CTT CGA GCT GCC TTC TAT 351 Ala Cys Leu Val Gly Cys His Val Ser Phe Leu Arg Ala Ala Phe Tyr 75 80 85 GTG GCT GCC CAG CTG CTG GGC GCC GTG GCT GGG GCT GCC ATC CTC CAT 399 Val Ala Ala Gln Leu Leu Gly Ala Val Ala Gly Ala Ala Ile Leu His 90 95 100 105 GAG ATT ACT CCA GTA GAA ATC CGT GGG GAC CTG GCT GTC AAT GCT CTC 447 Glu Ile Thr Pro Val Glu Ile Arg Gly Asp Leu Ala Val Asn Ala Leu 110 115 120 CAC AAC AAC GCC ACA GCT GGC CAG GCT GTG ACT GTA GAG CTC TTC CTG 495 His Asn Asn Ala Thr Ala Gly Gln Ala Val Thr Val Glu Leu Phe Leu 125 130 135 ACC ATG CAG CTG GTG CTG TGC ATC TTT GCC TCC ACC GAC GAG CGC CGC 543 Thr Met Gln Leu Val Leu Cys Ile Phe Ala Ser Thr Asp Glu Arg Arg 140 145 150 GGT GAC AAC CTG GGT AGC CCT GCC CTC TCC ATT GGT TTC TCT GTT ACC 591 Gly Asp Asn Leu Gly Ser Pro Ala Leu Ser Ile Gly Phe Ser Val Thr 155 160 165 CTG GGC CAC CTC CTT GGG ATC TAT TTC ACC GGT TGC TCC ATG AAT CCA 639 Leu Gly His Leu Leu Gly Ile Tyr Phe Thr Gly Cys Ser Met Asn Pro 170 175 180 185 GCC CGC TCC CTG GCT CCA GCA GTT GTC ACT GGC AAG TTT GAT GAT CAC 687 Ala Arg Ser Leu Ala Pro Ala Val Val Thr Gly Lys Phe Asp Asp His 190 195 200 TGG GTC TTC TGG ATC GGA CCC CTG GTG GGC GCC ATC ATC GGC TCC CTC 735 Trp Val Phe Trp Ile Gly Pro Leu Val Gly Ala Ile Ile Gly Ser Leu 205 210 215 CTC TAC AAC TAC CTG CTG TTC CCC TCG GCA AAG AGC CTG CAG GAG CGC 783 Leu Tyr Asn Tyr Leu Leu Phe Pro Ser Ala Lys Ser Leu Gln Glu Arg 220 225 230 TTG GCA GTG CTC AAG GGC CTG GAG CCC GAC ACC GAC TGG GAG GAA CGT 831 Leu Ala Val Leu Lys Gly Leu Glu Pro Asp Thr Asp Trp Glu Glu Arg 235 240 245 GAA GTG CGG CGG CGG CAG TCG GTG GAG CTC CAC TCT CCT CAG AGC CTG 879 Glu Val Arg Arg Arg Gln Ser Val Glu Leu His Ser Pro Gln Ser Leu 250 255 260 265 CCT CGC GGC AGC AAG GCC TGAGCTCCCC TGCAGCGCAC CGCAGCTCAG 927 Pro Arg Gly Ser Lys Ala 270 271 CCGACCGACG GCTCGCCCCC TCCTTCCCCC TGACCCGTCG TCGGTTCCCA GTGCAGAGTA 987 GCTGCTCCAG CGAGTGCAGT GAGCCTCAAG AAGGGGCTCG CCGGGAGCTG ACAGTACCTC 1047 CGCCCGGAAG CCTTGAGCTA CCCTCGAGCT CGCCCCTTGC AGGAACCAGA CACTTGGGGA 1107 CCGAGGCGTG GGGAGGGAAG GCAGGCCGGC GAGAGACGGA GAGCTCTGGA GAGCCCGCTC 1167 TGGTGCCTGG GGAGAAGTGC ATAGACTCCT TCTGGGGGAC TGTGCTTAGT GCATCTCATT 1227 TTATTAGGTT GTAAAAGTGC TCGTCTCCGC GTATTTCTTT TCCTCACGAA CAGAGTTTGC 1287 ATGATCCTGA GCGTGATCCC GAGTGCCTGT GGTGATACAG AGCCGGGGAC TGTCATTCCC 1347 GCTTTGGCCT TCTTCTCCTG TACCTGCAAT AAATCCACTA TCTCTGAAAA AAAAAAAAAA 1407 A 1408

【図面の簡単な説明】

【図１】ＷＣＨ−１の推定されたアミノ酸配列のヒドロ
パシープロフィルを示すチャート図である。

【図２】（ａ）は種々のラットの組織においてのＷＣＨ
−１のノーザンブロット分析を示す写真である。（ｂ）
はラット腎臓の皮質及び髄質のスライスされた区画にお
いてのＷＣＨ−１のノーザンブロット分析を示す写真で
ある。 kidney medulla；腎髄質、 kidney corte
x；腎皮質。cerebrum；大脳、 c
erebellum；小脳、atrium；心房、
ventricle；心室、aorta；大動脈、
lung；肺、stomach；胃、
intestine；腸、liver；肝、
spleen；脾臓、pancreas；すい臓
kidney；腎 adrenal gland；副腎、 testis；精
巣、ovary；卵巣、 bladde
r；膀胱。

【図３】分離したネフロン区画についてのＷＣＨ−１
ｍＲＮＡのためのＲＴ−ＰＣＲ生成物のアガロースゲル
電気泳動を示す写真である。英語表記、略称は次の通り
である。 ＰＣＴ；近位尿細管曲部。 ＴＤＬ；ヘンレ
のループの細い下行脚。ＴＡＬ；ヘンレのループの細い
上行脚。ＭＡＬ；髄質の太い上行脚。ＣＣＤ；皮質集合
管。 ＯＭＣＤ；外側髄質集合管。ＩＭ
ＣＤ；内側髄質集合管。 ＲＴ（−）；逆転写
酵素なしの反応。

【図４】抗−ＷＣＨ１／Ｃを用いた蛍光抗体法によるラ
ット腎髄質部分の染色組織を示す顕微鏡写真（×１００
倍率）。

【図５】あらかじめ相当するペプチド抗原とプレインキ
ューベーションした抗−ＷＣＨ１／Ｃを用いた蛍光抗体
法による染色組織を示す顕微鏡写真（×１００倍率）。

【図６】抗−ＷＣＨ１／Ｃを用いた蛍光抗体法によるラ
ット腎臓質部分の染色組織を示す顕微鏡写真（×４００
倍率）。

【図７】抗−ＷＣＨ１／Ｃを用いた蛍光抗体法によるラ
ット腎皮質部分の染色組織を示す顕微鏡写真（×１００
倍率）。

【図８】（ａ）は２０ｎｇ ＷＣＨ−１ ＲＮＡ（ＷＣ
Ｈ−１）、水（比較対照）を注入した卵母細胞の時間依
存の容積の増大を示すグラフである。（ｂ）はＷＣＨ−
１ ＲＮＡ又は水を注入した卵母細胞の顕微鏡写真であ
る。

【図９】長期間の脱水後のラットの腎臓中におけるＷＣ
Ｈ−１及びＣＨＩＰ２８ ｍＲＮＡの量の変化を示すノ
ーザンブロット分析を示す写真である。

【図１０】ＷＣＨ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、
並びに、その推定されたアミノ酸配列とヒトＣＨＩＰ２
８との整合を示す配列図である。アミノ酸の略号は次の
通りである。 Ａ；アラニン（Ａｌａ）、 Ｃ；システイン
（Ｃｙｓ）、Ｄ；アスパラギン酸（Ａｓｐ）、 Ｅ；
グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｆ；フェニルアラニン（Ｐｈ
ｅ）、 Ｇ；グリシン（Ｇｌｙ）、Ｈ；ヒスチジン（Ｈ
ｉｓ）、 Ｉ；イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｋ；リ
ジン（Ｌｙｓ）、 Ｌ；ロイシン（Ｌｅ
ｕ）、Ｍ；メチオニン（Ｍｅｔ）、 Ｎ；アスパ
ラギン（Ａｓｎ）、Ｐ；プロリン（Ｐｒｏ）、
Ｑ；グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｒ；アルギニン（Ａｒ
ｇ）、 Ｓ；セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ；トレオニン
（Ｔｈｒ）、 Ｖ；バリン（Ｖａｌ）、Ｗ；トリ
プトファン（Ｔｒｐ）、 Ｙ；チロシン（Ｔｙｒ）。

【手続補正書】

【提出日】平成５年７月１９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】（ａ）は種々のラットの組織においてのＷＣＨ
−１のノーザンブロット分析を示す写真である。（ｂ）
はラット腎臓の皮質及び髄質のスライスされた区画にお
いてのＷＣＨ−１のノーザンブロット分折を示す写真で
ある。ここで、ノーザンブロットとはＲＮＡ断片を電気
泳動で分離し、特殊な紙（ここではナイロン膜）に移し
た後、放射性の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ（ここでは^３２
Ｐの標識を付したＷＣＨ−１ ｃＤＮＡ）をプローブと
してハイブリッド形成を行ない位置決定する方法のこと
であり、電気泳動法の一種である。 英語表記の説明 ｋｉｄｎｅｙ ｍｅｄｕｌｌａ；腎髄質、 ｋｉｄ
ｎｅｙ ｃｏｒｔｅｘ；腎皮質。ｃｅｒｅｂｒｕｍ；大
脳、 ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ；小
脳、ａｔｒｉｕｍ；心房、 ｖ
ｅｎｔｒｉｃｌｅ；心室、ａｏｒｔａ；大動脈、
ｌｕｎｇ；肺、ｓｔｏｍａｃｈ；
胃、 ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ；
腸、ｌｉｖｅｒ；肝、 ｓ
ｐｌｅｅｎ；脾臓、ｐａｎｃｒｅａｓ；すい臓
ｋｉｄｎｅｙ；腎 ａｄｒｅｎａｌ ｇｌａｎｄ；副腎、 ｔｅｓ
ｔｉｓ；精巣、ｏｖａｒｙ；卵巣、
ｂｌａｄｄｅｒ；膀胱。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】ラット腎髄質部分の細胞組織形態を表わしたも
のであり、抗−ＷＣＨ１／Ｃを用いた蛍光抗体法による
染色を示す顕微鏡写真（×１００倍率）である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】ラット腎髄質部分の細胞組織形態を表わしたも
のであり、あらかじめ相当するペプチド抗原とプレイン
キューベーションした抗−ＷＣＨ１／Ｃを用いた蛍光抗
体法による染色を示す顕微鏡写真（×１００倍率）であ
る。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】ラット腎髄質部分の細胞組織形態を表わしたも
のであり、抗−ＷＣＨ１／Ｃを用いた蛍光抗体法による
染色を示す顕微鏡写真（×４００倍率）である。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】ラット腎皮質部分の細胞組織形態を表わしたも
のであり、抗−ＷＣＨ１／Ｃを用いた蛍光抗体法による
染色を示す顕微鏡写真（×１００倍率）である。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図８】（ａ）は２０ｎｇ ＷＣＨ−１ ＲＮＡ（ＷＣ
Ｈ−１）、水（比較対照）を注入した卵母細胞の時間依
存の容積の増大を示すグラフである。（ｂ）はＷＣＨ−
１ ＲＮＡ又は水を注入した卵母細胞の形態を表わす顕
微鏡写真である。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正内容】

【図９】長期間の脱水後のラットの腎臓中におけるＷＣ
Ｈ−１及びＣＨＩＰ２８ ｍＲＮＡの量の変化を示すノ
ーザンブロット分折を示す写真である。ここで、ノーザ
ンブロットとは前述したようにＲＮＡ断片の電気泳動法
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】腎集合管部に偏在する水チャネルを発現さ
   せるｍＲＮＡに特異的であり、かつ前記ｍＲＮＡに相補
   的であるＷＣＨ−１ ｃＤＮＡプローブ。
2. 【請求項２】バソプレシン制御水チャネルを発現させる
   ｍＲＮＡに特異的であり、かつ前記ｍＲＮＡに相補的で
   あるＷＣＨ−１ ｃＤＮＡプローブ。
3. 【請求項３】配列番号１に示す塩基配列であらわされる
   請求項１記載のＷＣＨ−１ ｃＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】請求項１又は２記載のＷＣＨ−１ ｃＤＮ
   Ａプローブを鋳型として得られることを特徴とするＷＣ
   Ｈ−１ ｍＲＮＡプローブ。
5. 【請求項５】ａ）哺乳類の腎髄質ｍＲＮＡより作成した
   一本鎖ｃＤＮＡについて ５’−（Ｔ／Ｃ）Ｔ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ｔ／Ｃ）
   ＣＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＴ
   （Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＡＣ−３’ 及び ５’−ＡＡ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｃ）（Ｔ／Ａ）
   （Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）Ｃ（Ｇ／Ｔ）（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）Ｇ
   Ｃ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＧ（Ａ／Ｇ）ＴＴ−３’ をディジェネレートプライマーとしてＰＣＲにかける、 ｂ）前記ＰＣＲ生成物をプローブとして前記哺乳類の腎
   ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得られる、 ことを特徴とする請求項１又は２に記載のＷＣＨ−１
   ｃＤＮＡ。
6. 【請求項６】請求項５における哺乳類がラットであるこ
   とを特徴とする請求項５に記載のＷＣＨ−１ ｃＤＮ
   Ａ。
7. 【請求項７】腎集合管部に偏在する水チャネルを構成す
   るＷＣＨ−１タンパク分子。
8. 【請求項８】バソプレシン制御水チャネルを構成するＷ
   ＣＨ−１タンパク分子。
9. 【請求項９】配列番号１の塩基配列によってコードされ
   る請求項７又は８記載のＷＣＨ−１タンパク分子のアミ
   ノ酸配列。
10. 【請求項１０】発現ベクターに配列番号１に示す塩基配
    列であらわされるＷＣＨ−１遺伝子を組み込んだことを
    特徴とする組み替えプラスミド。
11. 【請求項１１】前記発現ベクターがｐＳＰＯＲＴであ
    り、前記ｐＳＰＯＲＴのＮｏｔ−Ｉ及びＳａｌ−Ｉとの
    切断部位に前記ＷＣＨ−１遺伝子を挿入したことを特徴
    とする請求項１０記載の組み替えプラスミド。
12. 【請求項１２】請求項６に記載のＷＣＨ−１ ｃＤＮＡ
    による、 腎集合管部に偏在する水チャネルを構成するタンパク分
    子を生産する大腸菌。
13. 【請求項１３】請求項６に記載のＷＣＨ−１ ｃＤＮＡ
    による、 バソプレシン制御水チャネルを構成するタンパク分子を
    生産する大腸菌。
14. 【請求項１４】配列番号１に示す塩基配列であらわされ
    るＷＣＨ−１遺伝子による、 腎集合管部に偏在する水チャネルを構成するタンパク分
    子を生産する大腸菌。
15. 【請求項１５】配列番号１に示す塩基配列であらわされ
    るＷＣＨ−１遺伝子による、 バソプレシン制御水チャネルを構成するタンパク分子を
    生産する大腸菌。
16. 【請求項１６】前記ＷＣＨ−１遺伝子を発現ベクターｐ
    ＳＰＯＲＴに挿入して得られた組み替えプラスミドを大
    腸菌ＤＨ１０αに導入し、形質転換して得られた請求項
    １２〜１５の一に記載の大腸菌。
17. 【請求項１７】ｐＳＰＯＲＴのＮｏｔ−Ｉ及びＳａｌ−
    Ｉとの切断部位に前記ＷＣＨ−１遺伝子を挿入したプラ
    スミドを含む請求項１６記載の大腸菌。
18. 【請求項１８】イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド
    添加により発現誘導可能なベクター（ｐＳＰＯＲＴ）、
    宿主（ＤＨ１０α）系を用いた請求項１７記載のプラス
    ミドを持った大腸菌。
19. 【請求項１９】請求項１２〜１８の一に記載の大腸菌に
    より生成されたＷＣＨ−１タンパク分子。
20. 【請求項２０】請求項１２〜１８の一に記載の大腸菌を
    用いてＷＣＨ−１タンパク分子を採取することを特徴と
    するＷＣＨ−１タンパク分子の製造方法。
21. 【請求項２１】腎集合管部に偏在する水チャネルを構成
    するＷＣＨ−１タンパク分子を含有することを特徴とす
    る脂質膜。
22. 【請求項２２】バソプレシン制御水チャネルを構成する
    ＷＣＨ−１タンパク分子を含有することを特徴とする脂
    質膜。
23. 【請求項２３】腎集合管部に偏在する水チャネルを構成
    するＷＣＨ−１タンパク分子を含有する脂質膜からなる
    ことを特徴とするリポソーム。
24. 【請求項２４】バソプレシン制御水チャネルを構成する
    ＷＣＨ−１タンパク分子を含有する脂質膜からなること
    を特徴とするリポソーム。