KR20110095274A - 루코렉틴 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 렉틴으로 기재된 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 핵산 서열, 상기 폴리펩타이드에 대한 항체, 및 이의 다양한 의학적 용도, 특히 자가면역 장애, 염증 장애 또는 손상된 피부를 동물에서 치료 또는 예방하기 위한 용도에 관한 것이다.

Description

루코렉틴 및 이의 용도{LEUKOLECTINS AND USES THEREOF}
본 발명은 폴리펩타이드, 즉 렉틴, 이를 코딩하는 핵산 서열 및 상기 폴리펩타이드에 대한 항체, 및 다양한 의학적 어플리케게이션에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
세포성 면역 방어 시스템은 살아있는 미생물과 기생충의 공격에 대해 중요한 역할을 한다. 또한, 이 시스템은 바이러스 감염 후 암 발생과, 자가면역 질환에서의 비정상적인 세포의 관리와 가장 관련성이 높다.
이러한 기능에는 세포간 인지가 중요하지만, 이러한 현상의 근원은 본질적으로 충분히 파악되지 않았다. 원시 유성 생식 생물상(primordial sexual biota)은 영겁의 다변화 시기를 거치면서, 유전자가 생식 세포의 종-특이적 인지("수정")가 가능하도록 진화되었을 것이다. 그렇지 않다면, 유성 생식 종은 생존성에 위협을 받았을 것이다. 몇 가지 세포 인지 분자들이 진화되었다. 캄브리아기에 생물상이 지구 소생태계에 침입한 것으로 본다면, 이러한 불모의 소생태계에서 유성 수정이라는 제약이 종 교란 가능성이 매우 낮은 보호된 환경에 유리하였을 것이다. 그래서, 종-특이적인 생식체(gamete) 인지를 위한 유전자가 늘어나는 추세가 형성되었을 것이고, 따라서 진화를 통해 새로운 기능성을 자유롭게 습득하게 되었다.
분명한 새로운 기능 한가지는 유기체가 외래(비-자기) 세포로부터 그 자신(자기) 세포를 구별하는 능력일 수 있다. 이러한 기전은, 충분히 해명되지 않은 현상인, 세포성 면역 시스템의 시초에 대한 한가지 이론적인 설명으로 제안되었다. 이러한 선천성 면역에 의한 식별은(Medzhitov & Janeway, 1997, Cell, 91(3), p295-298) 기생충과 미생물이 동족을 잡아먹는 것을 방지하기 위해서는, 다세포 유기체에 필연적이다. "비-자기"로부터 "자기"를 구별하는 시스템의 기능 부전으로, 일부 자가면역 질환의 기초가 형성될 수 있다.
자가면역이라고 하는 잘못 지시된 면역 반응은 숙주 항원에 반응하는 자기항체 또는 T 림프구의 존재로 확인할 수 있다. 이는 통상적으로는 무해하며 척추동물의 생애에 보편적인 현상일 수 있지만, 자가면역은 자가면역 질환이라고 하는 광범위한 인간 질병 범주의 원인이 될 수도 있다. 자가면역이 인간 질환의 원인이라는 이러한 개념은, 상대적으로 새롭지만, 1950년 및 1960년대까지는 의학계의 주류 사상으로 인정받지 못하였다. 자가면역 질환들은 양성 반응의 자가면역에서 병인성 자가면역으로 진행되는 질환으로 정의된다. 이러한 진행은 유전적 영향과 환경적 자극 양자에 의해 결정된다.
자가면역 질환은 건강에 주요한 위협이다. 자가면역으로 인한 질환의 수도 80건 이상이다. 특히 여성에게 위협적이어서, 환자의 약 75%가 여성이다. 자가면역 질환은 65세 이하의 모든 연령층에서 특히 여성의 사망 원인으로 상위 10위를 차지하고 있다.
자가면역 질환은 피부(예, 원형 탈모증, 수포성 유천포창, 후천성 물질 표피 박리증, 낙엽상 천포창, 심상성 천포창, 백반증, 건선 및 여드름), 신장(예, IgA 신장병), 혈액(예, 재생 불량성 빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반증, 악성 빈혈), 관절(예, 강직성 척추염), 근육(예, 다발성 근염/피부 근염), 귀(예, 자가면역성 청력 상실 및 메니에르 증후군), 눈(예, 모렌 궤양, 레이터 증후군 및 보그트-고야나기-하라다 질환), 심장(예, 자가면역성 심근염, 처그-스트라우스 증후군, 자이언트 세포 동맥염, 가와사키 질환, 다발성 결절성 동맥염, 다카야수 동맥염 및 웨게너 육아종증), 내분비계(예, 애디슨 질환, 자가면역성 부갑상선 기능 저하증, 자가면역성 뇌하수체염, 자가면역성 난소염, 자가면역성 고환염, 그레이브 질환, 하시모토 갑상선염, 자가면역성 다선증후군 1형(PAS-1), 자가면역성 다선증후군 2형(PAS-2), 자가면역성 다선증후군 3형(PAS-3) 및 1형 당뇨병), 위장계(예, 자가면역성 간염, 셀리악병(celiac disease), 염증성 장 질환 및 원발성 담도 경화증), 신경계(예, 만성 염증성 수초탈락성 다발성 신경병증, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증) 등의 여러가지 다양한 신체 부위들에서 발병하거나, 또는 신체 전신(예, 항인지질 증후군, 자가면역성 림프증식성 질환, 자가면역성 다발성 내분비장애, 베체트 질환, 굿페스쳐 증후군, 류마티스 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군 및 전신 홍반성 낭창)에서 발병할 수 있다.
자가면역 질환은 신체의 어떤 부위에서도 발생할 수 있으며, 증상은 매우 다양하며 진단과 치료가 대게 어렵다. 일부 자가면역 질환의 경우에는 적절하게 진단되어 치료받지 못하면 생명에 위협이 될 수 있다. 류마티스 관절염과 같은 만성 자가면역 장애는 환자를 불구가 되게 하며, 또한 환자의 가족에게 큰 부담을 지우게 된다. 일부 유형의 포도막염은 실명을 초래할 수도 있다. 경피증과 같은 질환은 평생 동안 전문 치료를 요한다. 또한, 그레이브 질환 및 만성 갑상선염과 같은 자가면역 질환들은 올바르게 진단을 받는다면 성공적으로 치유될 수 있지만, 발병 증상이 경미하여 대게 인지 못하고 지나치게 된다.
염증은 신체의 백혈구 세포와 화합물들이 감염 및 외래 물질, 예컨대 박테리아 및 바이러스로부터 신체를 보호하는 정상적인 과정이다. 그러나, 일부 질환들에서는, 격퇴시킬 외래 물질이 없는 경우에도 신체의 면역계가 염증 반응을 촉발시키기도 한다. 그래서, 자가면역 질환에서 염증은 공통적인 현상이지만, 모든 염증 장애가 자가면역 반응인 것은 아니다. 염증 질환은 또한 미생물(바이러스 및 진균), 세균성 독소, 특정 약제학적 물질(항생제 및 항염증성 스테로이드) 및 화학물질(담즙염, 유해한 하우스홀드 화합물(household chemical)) 등의 신체를 직접 공격하는 매우 다양한 물질들에 의해서도 야기될 수 있다. 염증과 관련있는 질환으로는, 관절염(관절 염증을 의미하는 포괄적인 용어임), 심장의 염증(심근염), 공기를 폐로 전달하는 작은 관의 염증(천식 발작을 유발할 수 있음), 신장의 염증(신장염) 및 대장의 염증(대장염)을 포함한다.
특히 위장 염증 장애(예, 위 염증 질환(예, 위궤양, 십이지장 궤양 및 위염), 및 장 염증 질환(크론 질환, 염증성 장 질환, 열대성 스푸루, 비-열대성 스푸루, 감염성 장염, 대장염, 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 게실염, 알레르기성 염증 질환 및 방사성 염증 질환이 포함됨)에 관심이 있다.
위장 염증 질환은, 염증, 특히 부종, 특징적인 염증 세포(즉, 백혈구, 조직구, 및 대식세포)의 존재가 특징적이며, 일부 사례에서는, 표면 상피의 괴사 및 궤양화가 특징이다. 이러한 염증 질환은 위장관에 존재하여 위장관 표면을 공격함으로써 염증 질환 반응을 발생시키는 것으로 공지된 매우 다양한 물질들에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. 이러한 물질들로는 미생물(바이러스 및 진균), 세균성 독소, 특정 약제학적 물질(항생제 및 항염증성 스테로이드) 및 화학물질(담즙염, 유해한 하우스홀드 화합물(household chemical))을 포함한다. 실제로, 위산 자체가 위 라이닝 부위를 공격하여 염증 상태를 유발할 수 있다.
현재 이용되고 있는 염증 치료용 약제로는, 비스테로이드성 항염증제(NSAID - 아스피린, 이부프로펜 또는 나프록센 등), 코르티코스테로이드(예, 프레드니손), 항-말라리아제(예, 하이드록시클로로퀸) 및 기타 약제, 예컨대 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노마이드, 항-TNF 약제, 사이클로포스파미드 및 마이코페놀레이트가 있다. 일부 위장 질환, 특히 위 질환은 산성의 중화(예, 제산제 투여)에 의해, 또는 위산 분비 저해에 효과적인 약리학적 물질을 투여하는 등의, 염증을 초래하는 위산 분비를 저해함으로써, 치유할 수 있다.
손상된 피부는 감염되기 쉬우며, 눈에 거슬리거나 및/또는 통증이나 불편함을 초래할 수 있다. 어떤 타입의 손상, 예컨대 만성 궤양은 정상적인 생리 조건에서는 잘 치유되지 않는다. 손상된 피부를 회복시키기 위해서, 특히 상처를 회복시키기 위해서는, 모든 약제학적 해법이 특히 바람직하다.
자가면역 및 염증 장애 및 병태 또는 피부 손상을 치료하는데 적합하며, 부작용이 최소화된 치료법이 요구되고 있다.
진핵생물의 진화와 관련 가능성이 있는 프로세스에 대한 다년간의 연구를 통해, 본 발명자들은 생식체(gamete)와 접합체(zygote) 뿐만 아니라 초기 배아(렉토사이트(lectocyte)로 칭하는 분화된 세포)에서, 그리고 혈액 세포의 발생 단계에서, 최종적으로 백혈구에서, 새로운 단백질(본원에서는 루코렉틴이라 칭함)을 동정하게 되었다.
이 단백질은 최초로 어류에서 동정 및 분리되었다(실시예 참조). 이 단백질은 255개의 아미노산을 가진다. 이는 렉틴의 프로펩타이드 형태로서, 나중에 분비(즉, 난황 주위 공간으로의 분비)되기 위해, 리소좀을 타겟으로 하는 것으로 추정되는 19개의 아미노산으로 이루어진 N-말단 펩타이드를 포함하고 있다.
렉틴의 아미노산 서열을 이용하여 에피토프-특이적인 항체를 만들 수 있어, 분석한 조직들에 따라 이 단백질의 여러가지(2-8) 겉보기 이소형(도 5)들을 동정할 수 있었다. 연어에서는 2종 이상의 mRNA가 분리되었는데(실시예 11 참조), 이들은 폴리펩타이드 수준에서 불과 7곳만 달라, 서열 차이가 적었다(도 17). 또한, 연어의 백혈구에서 이 단백질의 절단된 형태들(서열번호 2)이 동정되었으며, 제브라피쉬에서도, N-말단으로부터 시작하여 32개의 아미노산이 없는 분비형(전술한 바와 같이 sLL이라 함) 및 tLL이라 칭하는 절단된 형태(실시예 9 참조)가 동정되었다.
이 단백질은 임의의 공지된 단백질과는 유사성이 매우 낮아, 임의의 공지된 단백질과의 전체 유사성은 50% 미만이다. 소형 도메인에서는 타킬로렉틴(tachylolectins)과의 약간의 유사성이 관찰되었다.
관련 단백질들은, 제브라피쉬, 대구, 레인보우 송어, 오이코플레우라 디오이카(Oikopleura dioica), 닭 및 인간 등의 다양한 동물들에서도 동정되었다. 이의 cDNA를 동정하여(실시예 참조), 보존성이 매우 높다는 것을 확인하였다. 조사한 종들간의, 코딩 단백질의 변이성(variance)은 4% 미만이었다. 이는 이들 단백질들이 필수적인 역할을 수행한다는 것을 의미한다.
지금까지 어떠한 유기체들에서도 비슷한 서열을 가진 유전자는 보고되지 않았다. 각각의 엑손 또는 인트론에 대해 프로브를 이용하여, 하나의 엑손만 보고된 2종의 다른 단백질들의 일부분과 드물게도 유사성이 있다는 것을 확인하였는데, 상기 2종 모두 본원에 기술된 분자 물질과는 전혀 다른 것이다.
중요한 점은, 이러한 신규 유전자는 공개된 인간 게놈 서열에서는 검색할 수 없음에도 불구하고, 인간 백혈구에서 특이적으로 발현된다는 것이다. 이 유전자의 매우 짧은 영역만 검출할 수 있었지만, 이는 인간의 염색체 여러 부위에 분포되어 있었다(실시예 참조). 이러한 수수께끼에 대한 해답은 아직 해결되지 않고 있다.
최종적으로, 단백질의 프로-펩타이드 형태에 부합되는, 분자 물질이 세포에 의해 분비됨을 밝혀냈다. 유전자 산물의 천연 형태와 재조합 형태 둘다 분리되었다.
이러한 단백질들은, 놀랍게도, 특히 피부의 자가면역 장애 및 염증 장애, 및 그외 피부 병태에 대해 현저한 효과를 보임을 확인하였다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 루코렉틴이 진행중인 인체의 정상적이고 선천적인 치유 과정을 지시하는 특정 수용체에 결합하는 것으로 생각된다. 관찰된 결과들로부터, 본 발명자들은, 루코렉틴이 정상적인 세포성 면역 과정에 참여하는 것으로 제안한다. 루코렉틴은 다수의 질병 상태들에서는 결여되어 있어, 이의 약제학적 도입이, 다양한 도전: 외래 세포(미생물, 기생충)의 존재, 및 루코렉틴을 자가면역 질환의 병인으로 엮을 수 있는, 즉 이러한 병태가 루코렉틴이 충분하게 존재하지 않아 야기될 수 있는, 변이된 "자가" 세포의 존재에 직면하였을 때, 면역 시스템의 다른 방어 반응들이 정상적으로 수행되도록 촉발시킬 것으로 보인다.
인간 백혈구는 매우 잘 보존되어 있는 루코렉틴 단백질들을 포함하고 있으며 발현한다. 지금까지, 이들 단백질들은 혈액 세포에서는 미확인된 단백질이었다. 루코렉틴은 타킬로렉틴 단백질 패밀리에 속하는 새로운 구성원인 것으로 보인다.
제1 측면에서, 본 발명은 서열번호 1-8 중 임의의 하나로 기술된 아미노산 서열 또는 상기 서열과 50% 이상 동일한 서열, 또는 상기 서열들 중 임의의 서열의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
"폴리펩타이드"는 본원에서 바람직하게는 50, 100, 150, 200 또는 250개 보다 많거나 및/또는 500, 400, 300, 200 또는 100개 미만이거나, 또는 이로부터 선택되는 범위에 속하는 잔기들을 가진 분자이다. 본원에서, "일부"는 바람직하게는 일부가 유래되어진 서열의 아미노산을 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 또는 그 이상으로 포함한다. 상기 일부는 서열의 중심부, N-말단부 또는 C-말단부로부터 취할 수 있다. 바람직하게는, 상기 일부는 N-말단부로부터, 예컨대 폴리펩타이드의 앞에서부터 50, 100 또는 150개의 잔기로로 취해진다. 바람직한 측면은, 예컨대 신호 펩타이드나 또는 천연적으로 발생되는 변이체에 없는 영역을 제거하기 위한, 상기 폴리펩타이드의 절단체를 포함한다. 바람직한 절단은 N-말단부에서 이루어지며, 길이는 1 내지 50개의 잔기 길이, 예컨대 1 내지 10, 20, 30 또는 40, 또는 5 내지 40, 예컨대 10 내지 35개의 잔기 길이이다.
바람직하게는, 상기 서열은 비교 서열과 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다.
서열 동일성은, 예컨대 FASTA pep-cmp과 다양한 팜팩터(pamfactor)를 이용하여 SWISS-PROT 단백질 서열 데이타은행을 통해 정할 수 있으며, 갭 형성 패널티는 12.0이고, 갭 연장 패널티는 4.0이고, 윈도우(window) 아미노산은 2개로 한다. 바람직하게는, 상기한 비교는 서열의 전체 길이에 대해 이루어지지만, 보다 작은 비교 윈도우에서도, 예컨대 연속적인 아미노산 200개 미만, 100개 미만 또는 50개 미만의 길이에서 이루어질 수도 있다.
바람직하게는, 이러한 서열 동일성(identity)으로 관련있는 폴리펩타이드들은 언급된 서열번호에 기술된 폴리펩타이드와 기능적으로 등가이다. 이러한 기능적으로 등가인 폴리펩타이드는 하기에 기재된 바와 같이 유도체 형태를 취할 수 있다. 마찬가지로, 서열번호로 기술된 서열을 가진 폴리펩타이드는 아래에 기술된 폴리펩타이드의 서열에는 영향을 미치지 않으면서 변형될 수 있다.
아울러, 본원에서 "일부"는 기능적 등가체일 수 있다. 바람직하게는, 이들 일부는 본원에 언급된 동일성(비교가능한 부분에 대한) 조건을 만족시킨다.
본원에서, "기능적 등가"를 충족시키기 위해서는, 폴리펩타이드는 모 분자(즉, 예컨대 아미노산 치환에 의해, 이것이 유래되어진 분자)에 비해 의학적 기능을 수행하는데 일부 효능 감소를 보일 수 있지만, 바람직하게는 효능은 비슷하거나 보다 높다. 따라서, 기능적 등가는 본원에 언급된 질환의 치료에 유효한, 즉, 환자의 한가지 이상의 증상, 예컨대 염증 또는 후술되는 피부의 징후를 경감시키는데 유효한, 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이는, 이것이 유래되어진 폴리펩타이드와, 유도체 폴리펩타이드의 효능을 정성적인 또는 정량적인 방식으로 비교함으로써, 예컨대 실시예에 기술된 생체내 분석을 수행함으로써, 평가할 수 있다. 정량적인 결과가 가능한 경우, 상기 유도체는 모 폴리펩타이드에 대해 적어도 30% 이상, 50% 이상, 70% 이상 또는 90% 이상 유효하다. 다른 구현예로, 시험관내 평가를, 예를 들어 수지상 세포에 대한 결합성 또는 시험관내 세포 배양물에 대한 효과를 분석함으로써, 수행할 수 있다.
천연적으로 생성되는 단백질과 관련 있거나 또는 이로부터 유래되는 기능적으로 등가인 단백질은, 천연 아미노산 서열을 하나 또는 복수의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결손에 의해 변형(단, 이는 전술한 서열 동일성 요건들을 충족함)시켜, 분자의 기능은 파괴하지 않으면서, 수득할 수 있다. 바람직하게는, 상기 천연 서열은 20개 미만의 치환, 부가 또는 결손, 예컨대 이러한 변형을 10개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만 또는 1개 미만으로 가진다. 이러한 단백질은, 하나 이상의 염기를 적절하게 치환, 부가 및/또는 결손시켜 제조되는 "기능적으로 등가인 핵산 분자"에 의해 코딩된다.
바람직한 기능적 등가는, 모 폴리펩타이드에 융합된 부가적인 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는, 아미노 및/또는 카르복시 말단 융합 단백질 또는 폴리펩타이드가 제조되는, "부가" 변이체이다.
특히 바람직한 기능적으로 등가인 변이체는 천연 생물학적 변이체(예, 대립 유전자 변이체 또는 종 또는 여러가지 속, 예컨대 식물, 동물 또는 박테리아 범주내에서의 지리적 변이체) 및 공지 기법으로 이용하여 제조되는 유도체이다. 예컨대, 기능적으로 등가인 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 화학 합성에 의해 제조하거나, 또는 핵산의 결손, 무작위 돌연변이화 또는 효소적 절단 및/또는 효소적 연결 등의 공지된 부위-특이적인 돌연변이화 기법을 이용하여 재조합 형태로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
바람직한 측면에서, 본 발명은 서열번호 9-15 중 임의의 하나에 기술된 뉴클레오티드 서열, 상기 서열과 50% 이상 동일한 서열, 또는 6 x SSC/50% 포름아미드 및 실온의 비-엄격성 결합 조건 및 예컨대 2 x SSC, 65℃의 고엄격 세정 조건에서 상기 서열에 혼성하는 서열, 또는 전술한 서열들 중 임의의 서열에 상보적인 서열, 또는 이의 일부를 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 상기의 SSC는 0.15 M NaCl, 0.015M 소듐 사이트레이트이다.
본원에서 "핵산 분자"는 바람직하게는 150, 300, 450, 600 또는 750개 보다 많은 수의 염기 및/또는 1500, 1200, 900, 600 또는 300개 미만의 염기를 가지는 분자이다. 본원에서 "일부"는 바람직하게는 이것이 유래된 서열의 뉴클레오티드 염기를 적어도 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 450 또는 600개 이상 포함한다. 바람직하게는, 상기 일부는 전술한 바와 같이 N-말단 펩타이드, 중간 부분 펩타이드 또는 C-말단 펩타이드를 코딩한다. 바람직한 측면에서, 폴리펩타이드에 대한 상기 내용에서와 같이, 언급된 폴리펩타이드의 N-말단에서 잔기를 제거하여 제조되는 절단체도 포함된다. 본원에 제공되는 서열에 대한, 뉴클레오티드 코딩 서열에서, 절단체는 그 길이가 1-150, 예컨대 1 - 30, 60, 90 또는 120, 또는 13 - 120, 예, 28 - 105 염기 길이인 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 서열은 비교 서열과 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일하다.
서열 동일성은 GCG 패키지를 이용하여 예컨대 FASTA 검색에 의해, 디폴트 값과 가변적인 팜팩터에서, 캡 생성 패널티 12.0, 갭 연장 패널티 4.0, 윈도우 6개의 뉴클레오티드로 설정하여, 결정할 수 있다.
바람직하게는, 핵산 분자에 대한 이러한 서열 동일성 또는 혼성 핵산 분자는 언급된 서열번호에 기술된 핵산 분자와 기능적으로 등가이다. 이러한 기능적으로 등가인 핵산 분자는 하기에 기술된 유도체 형태를 취할 수 있으며, 이것이 하기에 기술된 테스트에서 기능적 등가인 것으로 간주되는 폴리펩타이드를 코딩하고 있다면, 기능적 등가로 간주된다. 바람직한 기능적 등가는 전술한 바람직한 폴리펩타이드를 코딩하는 것이며, 예로, 본원에 언급된 특정 분자가 아닌 다른 종이나 속에서 발견되는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자이다.
또한, 본원에서, "일부"도 기능적 등가일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 부분은 (비교가능한 영역에 대해) 동일성을 만족시키거나 또는 본원에 언급된 혼성화 조건을 만족시킨다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA, cDNA, 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 DNA이며, 상기에 언급된 바와 같이, 축중(degenerate) 서열, 실질적으로 동일한 서열 및 혼성되는 서열을 포함한다. 그러나, 상기 분자는 이상적으로는 DNA 또는 cDNA이다.
전술한 바와 같이 폴리펩타이드는 예컨대 탈당화 또는 당화에 의해서 등의 화학적 변형에 의해, 폴리펩타이드의 서열에 영향을 주지 않으면서 변형된 것을 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 기능성에는 영향을 미치지 않으면서 폴리펩타이드의 합성/분리 후 변형, 예컨대 특정 잔기의 일정한 당화, 메틸화에 의해 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는, 폴리펩타이드의 기능적 특성은 유지하지만 다른 부분, 예컨대 비-펩타이드 구조에 제시되는, 유도체로 고려될 수 있는, 펩타이드 모방체 형태를 취할 수 있다. 이러한 펩타이드 모방체는 다른 특별한 의학적 이용을 위해 성공적으로 개발되어 이용되고 있다.
펩타이드 모방체, 특히 비-펩타이드 분자는 입체 구조를 기초로 하여, 약물 설계, 탐색, 집중적인 라이브러리(focused library) 설계 및 고전적인 의약품 화학법 등의 다양한 프로세스를 통해 제조할 수 있다. 비천연 아미노산으로 구성된 올리고머 또는 사용되는 그외 유기 빌딩 블록 뿐만 아니라 탄수화물, 헤테로사이클릭 화합물, 마크로사이클릭 화합물 또는 펩타이드의 동일한 3차 구조 특성을 모방하는 분자 정전기 표면을 제공하는 구조 인자와 배위를 포함하는 임의의 유기 분자를, 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 사용할 수 있다.
따라서, 펩타이드 모방체는 펩타이드 벡본과 일부 비슷하거나 또는 전혀 비슷하지 않을 수 있다. 펩타이드 모방체는 전체 합성한 비펩타이드 형태(예, 적절한 치환기를 가진 탄수화물 벡본을 기초로 함)를 포함하거나, 또는 예를 들어 하나 이상의 아미노산을 유도체화하거나 또는 하나 이상의 아미노산을 대안적인 비-펩타이드 요소로 치환함으로써, 기본이 되는 펩타이드의 하나 이상의 인자를 유지할 수 있다. 펩타이드 유사 주형으로는 슈도펩타이드와 사이클릭 펩타이드가 있다. 펩타이드의 기능에 불필요한 것으로 간주되는 구조 인자들은 스캐폴드 기능만을 유지하도록 최소화되거나 또는 적절하게 제거할 수 있다.
펩타이드 모방체가 하나 이상의 펩타이드 인자, 예컨대 2개 이상의 아미노산을 유지하는 경우, 이러한 아미노산은 이의 비-표준 유사체 또는 구조 유사체로 치환할 수 있다. 서열에 유지되는 아미노산들은, 본 발명의 폴리펩타이드의 기능적 특성이 유지되는 경우에 한하여, 유도체화되거나 또는 변형(예, 표지, 당화 또는 메틸화)될 수 있다. 펩타이드 모방체는 특정 폴리펩타이드 서열"로부터 유도체화되는" 것으로 언급된다. 이는, 펩타이드 모방체는 피정된 폴리펩타이드 서열을 참조하여 설계되어, 기능에 필수적인 펩타이드의 구조 특징들을 유지하는 것을 의미한다. 이러한 특징은 폴리펩타이드의 특정 측쇄이거나 또는 구조의 수소 결합 가능성일 수 있다. 이러한 특징들은 비-펩타이드 구성이나 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 제공될 수 있으며, 또는 기능에 필수적인 폴리펩타이드의 구조 특징을 유지하면서도, 안정성 또는 프로테아제 내성과 같은 폴리펩타이드의 특정 기능을 개선하기 위해, 폴리펩타이드의 상기 아미노산 잔기에 결합하는 결합을 변형시킬 수 있다.
사용될 수 있는 비-표준적인 유사체 아미노산 또는 구조 유사체 아미노산의 예로는, D-아미노산, 아미드 동배체(예, N-메틸 아미드, 레트로-인버스 아미드, 티오아미드, 티오에스테르, 포스포네이트, 케토메틸렌, 하이드록시메틸렌, 플루오로비닐, (E)-비닐, 메틸렌아미노, 메틸렌티오 또는 알칸), L-N 메틸아미노산, D-α 메틸아미노산, D-N-메틸아미노산이 있다. 비범용적인 아미노산의 예는 표 1에 나타낸다.
비범용적인 아미노산 코드 비범용적인 아미노산 코드
α-아미노부티르산 Abu L-N-메틸알라닌 Nmala
α-아미노-α-메틸부티레이트 Mgabu L-N-메틸아르기닌 Nmarg
아미노사이클로프로판 카르복실레이트 Cpro L-N-메틸아스파라긴 Nmasn
아미노이소부티르산 Aib L-N-메틸아스파르트산 Nmasp
아미노노르보르닐 카르복실레이트 Norb L-N-메틸사스테인 Nmcys
사이클로헥실알라닌 Chexa L-N-메틸글루타민 Nmgln
사이클로펜틸알라닌 Cpen L-N-메틸글루탐산 Nmglu
D-알라닌 Dal L-N-메틸히스티딘 Nmhis
D-아르기닌 Darg L-N-메틸이소루신 Nmile
D-아스파르트산 Dasp L-N-메틸루신 Nmleu
D-시스테인 Dcys L-N-메틸라이신 Nmlys
D-글루타민 Dgln L-N-메틸메티오닌 Nmmet
D-글루탐산 Dglu L-N-메틸노르루신 Nmnle
D-히스티딘 Dhis L-N-메틸노르발린 Nmnva
D-이소루신 Dile L-N-메틸오르니틴 Nmorn
D-루신 Dleu L-N-메틸페닐알라닌 Nmphe
D-라이신 Dlys L-N-메틸프롤린 Nmpro
D-메티오닌 Dmet L-N-메틸세린 Nmser
D-오르니틴 Dorn L-N-메틸트레오닌 Nmthr
D-페닐알라닌 Dphe L-N-메틸트립토판 Nmtrp
D-프롤린 Dpro L-N-메틸타이로신 Nmtyr
D-세린 Dser L-N-메틸발린 Nmval
D-트레오닌 Dthr L-N-메틸에틸글리신 Nmetg
D-트립토판 Dtrp L-N-메틸-t-부틸글리신 Nmtbug
D-타이로신 Dtyr L-노르루신 Nle
D-발린 Dval L-노르발린 Nva
D-α-메틸알라닌 Dmala α-메틸-아미노부티레이트 Maib
D-α-메틸아르기닌 Dmarg α-메틸-감마-아미노부티레이트 Mgabu
D-α-메틸아스파라긴 Dmasn α-메틸사이클로헥실알라닌 Mchexa
D-α-메틸아스파르테이트 Dmasp α-메틸사이클로펜틸알라닌 Mcpen
D-α-메틸시스테인 Dmcys α-메틸-α-나프틸알라닌 Manap
D-α-메틸글루타민 Dmgln α-메틸페니실아민 Mpen
D-α-메틸히스티딘 Dmhis N-(4-아미노부틸)글리신 Nglu
D-α-메틸이소루신 Dmile N-(2-아미노에틸)글리신 Naeg
D-α-메틸루신 Dmleu N-(3-아미노프로필)글리신 Norn
D-α-메틸라이신 Dmlys N-아미노-α-메틸부티레이트 Nmaabu
D-α-메틸메티오닌 Dmmet α-나프틸알라닌 Anap
D-α-메틸오르니틴 Dmorn N-벤질글리신 Nphe
D-α-메틸페닐알라닌 Dmphe N-(2-카르바밀에틸)글리신 Ngln
D-α-메틸프롤린 Dmpro N-(카르바밀메틸)글리신 Nasn
D-α-메틸세린 Dmser N-(2-카르복시메틸)글리신 Nglu
D-α-메틸트레오닌 Dmthr N-(카르복시메틸)글리신 Nasp
D-α-메틸트립토판 Dmtrp N-사이클로부틸글리신 Ncbut
D-α-메틸타이로신 Dmty N-사이클로헵틸글리신 Nchep
D-α-메틸발린 Dmval N-사이클로헥실글리신N Nchex
D-N-메틸알라닌 Dnmala N-사이클로데실글리신 Ncdec
D-N-메틸아르기닌 Dmargn N-사이클로도데실글리신 Ncdod
D-N-메틸아스파라긴 Dnmasn N-사이클로옥틸글리신 Ncoct
D-N-메틸아스파르테이트 Dnmasp N-사이클로프로필글리신 Ncpro
D-N-메틸시스테인 Dnmcys N-사이클로운데실글리신 Ncund
D-N-메틸글루타민 Dnmgln N-(2,2-디페닐에틸)글리신 Nbhm
D-N-메틸글루타메이트 Dnmglu N-(3,3-디페닐프로필)글리신 Nbhe
D-N-메틸히스티딘 Dnmhis N-(3-구아니디노프로필)글리신 Narg
D-N-메틸이소루신 Dnmile N-(1-하이드록시에틸)글리신 Nthr
D-N-메틸루신 Dnmleu N-(하이드록시에틸)글리신 Nser
D-N-메틸라이신 Dnmlys N-(이미다졸릴에틸)글리신 Nhis
N-메틸사이클로헥실알라닌 Nmchexa N-(3-인돌일리에틸)글리신 Nhtrp
D-N-메틸오르니틴 Dnmorn N-메틸-감마-아미노부티레이트 Nmagebu
N-메틸글리신 Nala D-N-메틸메티오닌 Dnmmet
N-메틸아미노이소부티레이트 Nmaib N-메틸사이클로펜틸알라닌 Nmcpen
N-(1-메틸프로필)글리신 Nile D-N-메틸페닐알라라닌 Dnmphe
N-(2-메틸프로필)글리신 Nlue D-N-메틸프로필 Dnmpro
DF-N-메틸트립토판 Dnmtrp D-N-메틸세린 Dnmser
D-N-메틸타이로신 Dnmtyr D-N-메틸트레오닌 Dnmthr
D-N-메틸발린 Dnmval N-(1-메틸에틸)글리신 Nval
감마-아미노부티르산 Gabu N-메틸라-나프틸알라닌 Nmanap
L-t-부틸글리신 Tbug N-메틸페니실아민 Nmpen
L-에틸글리신 Etg N-(p-하이드록시페닐)글리신 Nhtyr
L-호모페닐알라닌 Hphe N-(티오메틸)글리신 Ncys
L-α-메틸아르기닌 Marg 페니실아민 Pen
L-α-메틸아스파르테이트 Masp L-α메틸알라닌 Mala
L-α-메틸시스테인 Mcys L-α메틸아스파라긴 Masn
L-α-메틸글루타민 Mgln L-α메틸-t-부틸글리신 Mtbug
L-α-메틸히스티딘 Mhis L-α메틸에틸글리신 Metg
L-α-메틸이소루신 Mile L-α메틸글루타메이트 Mglu
L-α-메틸루신 Mleu L-α메틸호모페닐알라닌 Mhphe
L-α-메틸메티오닌 Mmet N-(2-메틸티오에틸)글리신 Nmet
L-α-메틸노르발린 Mnva L-α메틸라이신 Mlys
L-α-메틸페닐알라닌 Mphe L-α메틸노르루신 Mnle
L-α-메틸세린 Mser L-α메틸오르니틴 Morn
L-α-메틸트립토판 Mtrp L-α메틸프롤린 Mpro
L-α-메틸발린 Mval L-α메틸트레오닌 Mthr
N-(N-(2,2-디페닐에틸)카르바밀메틸)글리신 Nnbhm L-α메틸타이로신 Mtyr
1-카르복시-1-(2,2-디페닐-에틸아미노)사이클로프로판 Nmbc L-N-메틸호모페닐알라닌 Nmhphe
N-(N-(3,3-디페닐프로필)카르바밀메틸)글리신 Nnbhe
L-O-메틸 세린 Omser
L-O-메틸 호모세린 Omhser
사용가능한 비-표준 아미노산으로는 입체 구조적으로 한정된 유사체, 예컨대 Tic (F 치환), Aib (A 치환) 또는 피페콜산 (Pro 치환)이 있다.
또한, 전술한 폴리펩타이드 및 핵산 분자는, 예컨대 타겟팅 기 또는 작용기를 추가함으로써 이의 약제학적 활용을 용이하게 하거나, 친지성을 개선시키거나, 세포 수송을 보조하거나, 가용성 및/또는 안전성을 개선시키기 위해, 변형되어진 유도체들을 포함한다. 따라서, 올리고당, 지방산, 지방 알코올, 아미노산, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 전술한 폴리펩타이드 또는 핵산 분자에 접합시킬 수 있다. 핵산 분자는 하기에 기술된 바와 같이 바이러스 담체내에 존재할 수 있다.
또한, 폴리펩타이드는, 추가된 구성이 투여된 후에 절단에 의해, 예컨대 에스테라제 작용에 의해 제거될 수 있는 에스테르화를 통해 추가되어진 치환기를 절단에 의해 제거할 수 있는, "프로드럭" 또는 "프로펩타이드"의 형태의 유도체를 포함한다. 이러한 프로드럭은, 예컨대 단백질 분해에 의해 절단되어 목적한 폴리펩타이드가 되는 천연 단백질의 천연 전구체를 포함한다. 이러한 전구체는 전구체 형태에서는 활성형이 아니지만, 단백질분해에 의한 절단시에는 활성화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자는 마찬가지로 상기한 프로드럭 또는 전구체를 코딩하는 분자를 포함한다. 전술한 바와 같이, 변형된 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 테스트하여, 이들이 동일하거나 비슷한 의학적 효과를 가지고 있는지를 결정함으로써, 비변형된 분자와 비교되는 기능적인 활성을 유지하고 있는지를 확증할 수 있다.
전술한 핵산 분자는 발현 조절 서열, 또는 재조합 DNA 클로닝 벡터 또는 상기한 재조합 DNA 분자를 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이는, 본 발명의 폴리펩타이드가 유전자 산물로서 세포내에서 발현되게 하며, 이의 발현은 목적한 세포에 도입되어진 유전자(들)에 의해 지시된다. 유전자 발현은 목적한 세포에서 활성형인 프로모터로부터 지시되며, 게놈 통합형 또는 독립적인 복제 또는 일시적인 형질감염/발현용의, 선형 또는 원형 DNA 벡터 중 임의 형태에 삽입될 수 있다. 적합한 형질전환 또는 형질감염 기법들은 문헌에 잘 기술되어 있다. 다른 구현예로, 네이키드 DNA 분자를 본원에 언급된 용도를 위해 세포에 직접 도입할 수도 있다.
적합한 발현 벡터는, 후술되는 본 발명의 방법을 실시하는데 요구되는 핵산 분자와 함께, 매칭되는 리딩 프래임으로 연결되는, 적합한 조절 서열, 예컨대 번역(예, 개시 코돈, 정지 코돈, 리보좀 결합부) 및 전사 조절 인자(예, 프로모터-오퍼레이터 영역, 말단 정지 서열)를 포함한다. 적합한 벡터는 플라스미드 및 바이러스(박테리오파지 및 진핵 바이러스 모두 포함)일 수 있다. 적합한 바이러스 벡터로는 베큘로바이러스, 또한 아데노바이러스, 아데조-조합 바이러스, 헤르페스 및 백시니아/폭스 바이러스가 있다. 그외 다수의 바이러스 벡터들이 당해 기술 분야에 알려져 있다. 바람직한 벡터는 박테리아 및 포유류 발현 벡터, pGEX-KG, pEF-neo 및 pEF-HA이다. 핵산 분자는 편리하게 추가적인 폴리펩타이드, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA와 융합되어, 발현시 융합 단백질을 형성할 수 있다.
따라서, 다른 측면에 대한 검토를 통해, 본 발명은 전술한 핵산 분자를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 측면들은 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 벡터 핵산에 삽입하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자의 제조 방법을 포함한다.
하기에 설명되는 방법에 있어서, 폴리펩타이드는 세포에 본 발명의 핵산 분자를 형질감염시킴으로써 세포에 투여할 수 있다. 전술한 바와 같이, 따라서 본 발명은 본원에 기술된 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자, 및 본원에 기술된 방법에서의 이의 용도로 확장된다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 벡터, 예컨대 발현 벡터내에 포함된다.
본 발명의 핵산 분자, 바람직하게는 벡터에 포함되는 핵산 분자는 임의의 적절한 방법에 의해 세포에 도입할 수 있다. 적합한 형질전환 또는 형질감염 기법들은 문헌에 잘 설명되어 있다. 다양한 기법들이 공지되어 있으며, 이를 이용하여 발현을 위한 원핵 또는 진핵 세포에 상기 벡터를 도입할 수 있다. 이러한 목적에 바람직한 숙주 세포는 곤충 세포주, 진행 세포주 또는 E. coli, 예컨대 BL21/DE3 균주가 있다. 또한, 본 발명은 핵산 분자, 특히 전술한 벡터를 포함하는 형질전환 또는 형질감염된 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 확장된다.
본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 폴리펩타이드가 발현되는 조건에서 전술한 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 생산되는 상기 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 상기에서 정의되는 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기에서 언급되는 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드로 확장된다. 이 폴리펩타이드는 전술한 바와 같이 숙주 세포에서 발현시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드를 포함하고 있으며, 상기 폴리펩타이드의 직접 도입에 의해 또는 코딩 핵산 물질의 발현에 의해 천연 세포에 비하여 변형되어진, 세포도 본 발명의 다른 측면을 구성한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드 또는 핵산 분자는 상기 세포에서 내인적으로 형성되지 않으며, 즉, 상기 세포는 외인성 폴리펩타이드 또는 핵산 물질을 포함하도록 변형되어 진다.
또한, 본 발명은 상기에서 정의된 폴리펩타이드에 특이적으로 작용하는 항체(단일클론 또는 다클론) 및 이의 항원-결합 단편(예, F(ab)2, Fab 및 Fv 단편, 즉, 항체의 "가변성" 영역의 단편으로 항원 결합 부위를 포함함)으로 확장된다.
상기한 항체는 하기에 설명되는 방법에, 특히 기술된 치료학적 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명에 기술된 항체는 시험관내에서 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드의 존재 또는 양을 확인할 수 있으며, 진단학적으로 이용하여 상기 폴리펩타이드의 비정상적인 수준, 즉 상기 폴리펩타이드의 정상적인 수준 대비 변동, 예컨대 폴리펩타이드의 수준 증가 또는 감소와 관련있는 본 발명에 기술된 장애 또는 피부 손상을 파악할 수 있다.
이에, 본 발명은 다른 측면으로, 본원에 기술된 항체를 시료에 접촉시키는 단계를 포함하며, 결합된 항체의 수준이 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 일부분의 존재 또는 양을 의미하는 것인, 시료내 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 일부분의 존재 또는 양을 결정하는 방법을 제공한다.
분석되는 시료는 임의의 통상적인 시료, 예컨대 혈액 또는 조직 시료이거나, 또는 비-생물 시료일 수 있다. 바람직하게는, 상기 시료는 본원에 기술된 동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된다.
또한, 본 발명은, 적어도 본원에 기술된 폴리펩타이드의 존재 또는 양을 동물 유래의 시료에서 측정하는 단계를 포함하며, 상기 존재 또는 양이 본 발명에 기술된 장애 또는 피부 손상의 진단에 활용되는, 동물에서 상기 장애 또는 피부 손상을 진단하는 방법을 제공한다. 폴리펩타이드는, 예컨대 상기에서 언급한 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 시료와 동물은 바람직하게는 본원에 기술된 것이다. 상기 양은 바람직하게는 정상 수준 대비 상기 폴리펩타이드의 수준 감소이다. 진단은 정상인 개체의 표준 목록(standard table)을 조사 대상인 장애 또는 피부 손상을 가진 개체와 비교함으로써, 달성할 수 있다.
하기에서 설명되는 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자는, 천연 소스로부터 수득하거나 유래될 수 있으며, 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 제조할 수 있다.
편리하게는, 폴리펩타이드 및 핵산 분자는 실시예에 기술된 프로토콜에 따라 분리한다. 이러한 방법과 이러한 방법을 통해 수득되는 산물은 본 발명의 또다른 측면을 구성한다.
즉, 본 발명은, 다른 측면에서, 적어도 하기 단계들을 포함하는 (예, 연어의) 부화 체액(hatching fluid)으로부터 본 발명의 폴리펩타이드를 분리하는 방법을 제공한다:
a) 알(egg)을 최소 부피(예, 알 부피와 동량 또는 미만)의 물에 현탁하는 단계;
b) 상기 알의 동조화된(synchronized), 신속한 부화를 (바람직하게는, 95% 초과의 수정란에서 2시간 미만 이내에 부화가 완료되게) 유도하는 단계;
c) 상기 부화된 알을 여과하여, 부화 체액을 수득하는 단계;
d) 선택적으로, 상기 부화 체액에 우레아 고체를 첨가하여, 상기 알의 껍질 조각들을 해리시키고, 이를 저속 원심분리하는 단계;
e) 1차 배제 크로마토그래피를, 예컨대 슈퍼덱스 16/60 컬럼 또는 바이오텍스 100 울트라 필터를 이용하여 수행하는 단계;
f) 선택적으로, 2차 배제 크로마토그래피를, 예컨대 슈퍼덱스 16/60 컬럼을 이용하여 수행하는 단계, 및
g) 선택적으로, 오염 단백질, 예컨대 조나제(zonase)를 예컨대 벤즈아미딘-세파로즈 컬럼에서 친화성 크로마토그래피에 의해 제거하는 단계.
또한, 본 발명은 전술한 방법에 의해 제조되는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 백혈구로부터 수득하였을 때는 비변형된 형태로 수득되어 진다. 연어의 부화 체액으로부터 수득되는 폴리펩타이드는 (당화 및/또는 인산화에 의해) 변형된 것이지만, 이들 형태 모두 본원에 기술된 방법에서 동일하게 유효하다.
본 발명에 기술된 폴리펩타이드 또는 핵산 분자에는, 바람직하게는 소스 물질로부터 유래되는 임의의 오염성 성분들, 또는 분리 공정이나 이의 합성 제조에 사용되는 물질이 실질적으로 존재하지 않는다. 특히 바람직하게는, 화합물들은 분석시, w/w(건조 중량)으로 50% 또는 60% 보다 높은 순도로, 예컨대 >70, 80 또는 90%로, 바람직하게는 95% 또는 99% 보다 높은 순도로 정제된다. 이러한 순도는 목적한 특정 분자에 해당 되지만, 이의 분해 산물도 포함된다. 적절한 경우, 순도가 낮은, 예컨대 대상 분자를 >1, >2, >5 또는 >10%로 포함하는, 예컨대 >20% 또는 >30%로 포함하는, 농화된 조제물(enriched preparation)도 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는, 예컨대 크로마토그래피(예, HPLC, 크기-배제, 이온-교환, 친화성, 소수성 상호작용, 역상 크로마토그래피)에 의해 또는 모세관 전기영동에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는, 예컨대 화학 합성한 더 작은 크기의 펩타이드를 연결함으로써 합성에 의해 제조하거나, 또는 보다 편리하게는, 전술한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 재조합 발현시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는, 예컨대 적합한 cDNA 라이브러리로부터 본원에 기술된 핵산 서열을 증폭시킴으로써, 합성에 의해 제조할 수 있다.
본원에 기술된 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 항체를 예컨대 세포 또는 장기 배양에서 시험관내로 사용하여, 세포에서 면역 기능을 수행하게 할 수 있다.
다른 구현예에서, 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 항체는 동물의 일 부분이나 또는 생성물, 예컨대 장기 또는 채집한 혈액 세포 또는 조직 상에, 특히 이것을 유래된 신체로 재도입시키고자 하는 경우에, 생체외에서 사용될 수 있다.
그러나, 폴리펩타이드, 핵산 분자 및 항체는 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 생체내 이용이 바람직하다.
본원에 기술된 폴리펩타이드, 핵산 분자 및 항체는 하기에 기술된 다양한 장애 또는 병태를 치료하기 위한 용도를 가진다. 즉, 본 발명은 전술한 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 항체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는, 약학 조성물에 관한 것이다.
"약제학적으로 허용가능한" 또는 "생리학적으로 허용가능한"은 구성 성분이 조성물 형태에서 다른 성분과 혼화되어야 할 뿐만 아니라 수여체에게 생리학적으로 허용가능하여야 함을 의미한다.
투여용 활성 성분은 약학 조성물에 사용하기 위해 적절하게 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 전술한 바와 같은 유도체를 사용함으로써 분해되지 않게 안정화시킬 수 있다.
또한, 활성 성분은 예를 들어 염 또는 비-전해질, 아세테이트, SDS, EDTA, 사이트레이트 또는 아세테이트 완충액, 만니톨, 글리신, HSA 또는 폴리소르베이트 등의 적당한 첨가제를 사용하여 조성물에서 안정화할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 항체는 상기 조성물에 단일한 활성 성분으로 존재하거나, 또는 치료 효과를 높이거나 또는 상기 조성물에 대한 소비자의 호감을 높이기 위해, 다른 성분, 특히 다른 활성 성분과 조합할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 조나제 또는 관련 효소를 포함할 수 있다. 본원에 언급되는 조나제는 효소를 포함하는 조제물로서, 이 조제물은 SDS-PAGE 분석에서 하나의 단백질 밴드를 나타나며, 이의 분자량은 약 28 kDa이고, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득할 수 있다:
a) 연어 알을 최소량의 물에 현탁하는 단계;
b) 상기 연어 알의 동조화된 신속한 부화를 유도하는 단계;
c) 상기 부화된 알을 여과하여, 부화 체액을 수득하는 단계;
d) 상기 부화 체액에 우레아 고체를 첨가하여, 상기 알의 껍질 조각들을 해리시키고, 이를 저속 원심분리하는 단계;
e) 추가적으로 상기 원심분리 상층액을 겔 여과하여 조나제를 정제하는 단계;
f) 추가적으로, 벤즈아미딘-변형된 세파로즈 6B® 컬럼에서 친화성 크로마토그래피를 수행하여 상기 조나제를 정제하는 단계로서, 상기 친화성 크로마토그래피는 농축 염으로 세정한 다음 농축 염 용액 중의 디옥산으로 용출시켜, 크로마토그래피 매트릭스 또는 마크로분자 구조에 결합된 조나제를 추출함으로써, 수행되며;
상기 조나제는 하기한 특징들을 가진다:
a) 크로모진(chromozym) X 절단;
b) 벤즈아미딘에 의해 저해됨;
c) 아르기닌을 이용한 펩타이드 결합 절단;
d) 8M 우레아, 몰 농도의 염, 증류수 및 유기 용매, 바람직하게는 디옥산 또는 프로판올의 존재 하에 활성 유지; 및
e) 용액 중에 실온에서 50일간 효소학적 활성 유지.
조나제는 실시예에 기술된 바와 같이 준비할 수 있으며, 조성물에 첨가하거나 또는 본 발명의 폴리펩타이드를 천연 소스로부터 준비한 다음 "불순물"로 표시할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드와 조나제 둘다를 포함하는 조성물에서, 상기 폴리펩타이드는 전체 조합한 중량에 1-100%의 범위로 존재할 수 있으며, 조나제는 적어도 0 내지 99%로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는, 조합한 중량에 대해 50-100%의 범위, 예로, >80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%이며, 조나제는 0 - 50%, 예로, < 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1%로 존재한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기술되는 조성물은 치료법에 사용하기 위한 것이다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 분자 및 항체는 다양한 자가면역 장애 및 염증 장애, 특히 피부의 장애의 치료 뿐만 아니라 손상된 피부, 예컨대 태양, 저온, 조사(예, 암 치료에 사용되는 경우와 같은 X-레이)에 의한 피부 손상 또는 부상의 결과로서의 피부 손상의 치료에 치료학적 특성을 나타낸다.
본원에서 언급되는 "장애"는 정상 유기체와 비교하여 증상이 있거나 증상이 없는 유기체에서의 근본적인 병적 교란을 의미하며, 이는 예컨대 감염성 또는 후천적이거나 선천적인 유전자 결함으로 생길 수 있다.
실시예에 기술된 바와 같이, 다양한 염증, 자가면역 및 그외 피부 병태를 치료에 있어서의 루코렉틴의 유용성이 설명되었다. 비슷한 효능은 다른 병태의 치료에 대해서도 기대할 수 있다. 예컨대, 만성 위장 염증은 수지상 세포가 유해한 물질에 대해 과도한 반응을 나타내거나 (또는 아마도 일부 경우에는) 무반응에 의한 것으로 설명할 수 있다. 이에, 루코렉틴을 예컨대 경구로 도입하면, 염증이 발생한 피부가 루코렉틴의 도입에 유익하게 반응하는 것과 매우 동일한 방식으로 만성 GIT 염증을 치료할 수 있을 것으로 예상할 수 있다.
자가면역 질환은 정상적인 세포-표면 항원의 돌연변이된 버전이 특이적으로 체세포 발현된 원인으로 인한 것일 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것을 아니며, 루코렉틴은 타겟 세포를 공격으로부터 보호하기 위해 사용할 수 있다.
본원에서, "염증 장애"는 장애가 진행되는 동안에 어느 시기에 염증이 관찰되며, 염증이 유일한 증상이거나 또는 여러가지 증상 중 한가지일 수 있는, 장애이다. 염증 장애는 급성이거나 만성일 수 있으며, 상기에 또는 하기에 기술된 바와 같을 수 있다. 염증 장애로는 심혈관 염증(예, 죽상경화증, 발작), 위장 염증(위 궤양 또는 십이지장 궤양 등의 궤양 포함), 간 염증 장애, 폐 염증(예, 천식, 인공 호흡 장치로 인한 폐 손상), 신장 염증, 안 염증(예, 포도막염), 췌장 염증, 비뇨생식기 염증, 신경염증성 장애(예, 다발성 경화증, 알츠하이머 질환), 알레르기(예, 알레르기성 비염/부비강염, 피부 알레르기 및 장애 (예, 두드러기/발진, 혈관 부종, 아토피 피부염, 접촉 피부염, 건선), 식품 알레르기, 약물 알레르기, 곤충 알레르기, 비반 세포증), 골격 염증(예, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 척추관절병증), 감염(예, 박테리아 감염 또는 바이러스 감염; 구강 염증 장애(즉, 잇몸병, 치은염 또는 구내염); 점막 염증; 및 이식(예, 동종 이식 또는 이종 이식 거부 또는 모태 관용(maternal-fetal tolerance))을 포함한다.
본 발명에 따른 치료에 바람직한 염증 장애는 습진, 여드름, 주사코, 건선 및 접촉성 피부염과 같은 염증성 피부 장애, 위장 염증, 및 궤양 또는 종기(sore) 등의 점막 병태이다.
본원에서, "자가면역 장애"는 양성 자가면역이 병적 자가면역으로 진행되는 것으로, 상기 또는 하기에 기술되어 있는 것일 수 있다. 자가면역 질환으로는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS, 이는 자가면역 인자를 가진 바이러스 질환임), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반증(ATP), 베체트 질환, 심근증, 비열대 스프루-포진상 피부염; 만성 피로 면역 기능부전 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초화 다발성 신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한냉 응집소 질환, 크레스트 증후군, 크론 질환, 데고스 질환, 피부근염-청소년, 원판상 낭창, 본태성 혼합 한냉글로불린 혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브 질환, 갈랑 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신경병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 청소년 만성 관절염(스틸 질환), 청소년기 류마티스 관절염, 메니에르 질환, 혼성 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 류마티스 다발성 근육통, 다바렁 근염, 피부근염, 원발성 저감마글로블린 혈증, 원발성 담도 경화증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 레이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 경피증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)이라고 함)), 쇼그렌 증후군, 스티프-만 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야스 동맥염, 관자동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베거너 육아종증을 포함한다.
본원에서 "손상된 피부"는 열, 조사(다양한 파장의 광, 예컨대 X선 또는 UV에 의한 조사), 저온, 마찰, 파열 또는 상해, 예컨대 사건 또는 수술로 인한 상해 등의 외인성 작용에 의해 손상된 피부를 포함한다. 다른 구현예로, 손상된 피부는 감염이나, 또는 질병 또는 기본적인 유전적 이상으로 인한 것일 수 있다. 손상은 갈라짐, 홍반, 가려움, 염증, 딱딱해진 피부(horny skin), 박편 등으로 표시될 수 있다.
이에, 본 발명은, 전술한 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물을 동물에게 투여하는, 동물에서 자가면역 장애, 염증 장애 또는 손상된 피부를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 표현으로, 본 발명은, 동물에서 자가면역 장애, 염증 장애 또는 손상된 피부를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본원의 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
또다른 표현으로, 본 발명은 동물에서 자가면역 장애, 염증 장애 또는 손상된 피부를 치료 또는 예방하기 위한 본원의 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물을 제공한다.
바람직한 측면에서, 본 발명은 전술한 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물을 바람직하게는 피부에 국소 투여하는, 피부의 자가면역 장애, 피부의 염증 장애 또는 손상된 피부를 치료 또는 예방하기 위한, 그러한 방법, 용도, 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 장애는 습진, 여드름, 건선, 위장 염증(예, 크론 질환, 궤양성 대장염 및 그외 만성 염증), 치은염, 구강 염증, 및 식도 염증이며, 상기 손상된 피부는 자극받거나, 염증이 생기거나, 저온에 의해 갈라졌거나, 햇볕에 타거나, 열에 의해 손상되거나, 방사선 피폭에 의해 손상된 것이거나, 또는 상처의 결과이다.
본원에서, "치료"는, 상기한 치료를 받지 않은 개체의 다른 신체 부위 또는 상기한 치료를 받지 않은 대응되는 개체에서 나타나는 증상 또는 효과에 대비되는, 상기 장애 또는 손상의 한가지 이상의 증상 또는 효과, 예컨대 손상된 피부의 존재 또는 정도, 예컨대 상처, 염증, 홍반, 가려움 통증 등의 상대적인 강도 등이, 바람직하게 정상 수준으로 경감, 완화 또는 해소되는 것을 의미한다.
"예방"은 그러한 증상이나 작용의 완전한 예방, 또는 증상이나 작용의 발병 정도 또는 시기(예, 지연)의 축소 또는 완화를 의미한다. 이는, 예컨대 유전자 치료법, 예컨대 항-RNA 또는 넌센스 서열을 이용하여 달성할 수 있다.
본 발명의 치료 또는 예방 방법은 상기한 장애 또는 피부 손상을 치료 또는 예방하는데 유효한 하나 이상의 활성 성분의 투여와 조합하는 것이 유익할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 이러한 활성 성분 하나 이상을 부가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 항체 및 하나 이상의 부가적인 활성 성분을 동시, 개별 또는 순차적으로 인간 또는 동물 치료에 사용하기 위한 조합 조제물로서의 제품을 제공한다.
본 발명의 조성물은 통례적인 방식으로 쉽게 이용가능한 성분을 이용하여 당해 기술 분야에 잘 공지된 기법에 따라 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께 제형화할 수 있다.
이에, 상기 활성 성분은, 선택적으로, 조합 조제물로서 다른 활성 성분과 함께, 하나 이상의 기존 담체, 희석제 및/또는 부형체와 병합하여, 정제, 환제, 산제, 로젠제, 새세제, 카세제, 엘릭시르제, 현탁제(주사 또는 주입용 액체), 에멀젼제, 용액제, 시럽제, 에어로졸제(고체 또는 액체 매질), 연고제, 연질 젤라틴 캡슐제, 경질 젤라틴 캡슐제, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 포장된 산제 등과 같은 기존의 갈레노스식 조제물을 제조할 수 있다. 생분해성 폴리머(예, 폴리에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산) 역시 고체 임플란트로 사용할 수 있다. 조성물은 동결-건조, 과냉각(undercooling) 또는 퍼마자임(Permazyme)을 이용하여 안정화할 수 있다.
적합한 부형제, 담체 또는 희석제들로는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 락토스, 옥수수 전분, 알기네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 마이크로크리스탈린 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물 시럽, 물, 물/에탄올, 물/글리콜, 물/폴리에틸렌, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일, 경질 지방(hard fat)과 같은 지방 물질 또는 이들의 적정 혼합물이 있다. 서방형 제형을 수득하기 위한 물질, 예컨대 카르복시폴리메틸렌, 카르복시메틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 또는 폴리비닐아세테이트도 사용할 수 있다.
조성물은 부가적으로 윤활제, 습윤제, 유화제, 점성 증강제, 과립화제, 붕괴제, 결합제, 삼투 활성제, 현탁화제, 보존제, 감미제, 향제, 흡수 강화제(예, 표면 침투제 또는 코 전달용, 예컨대 담즙염, 렉시틴, 계면활성제, 지방산, 킬레이터제), 갈변제(browning agent), 유기 용매, 항산화제, 안정화제, 연화제, 실리콘, α-하이드록시산, 완화제, 소포제, 보습제, 비타민, 향료, 이온성 또는 비이온성의 증점제, 계면활성제, 충전재, 이온성 또는 비이온성 증점제, 봉쇄제, 폴리머, 추진제, 알칼리화제, 산성화제, 유탁제, 착색제 및 지방 화합물 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 기술 분야에 잘 공지된 기법을 이용함으로써 신체에 투여 후 활성 성분의 신속한 지속 방출 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
조성물은 전달 가능하게 또는 특정 세포나 조직을 표적화하기 위한 모든 적절한 투약 형태, 예컨대 에멀젼 또는 활성 성분이 흡수, 흡착, 병합 또는 결합된 리포솜, 니오솜, 미세구, 또는 나노입자 등의 형태일 수 있다. 이는 산물을 불용성 형태로 효과적으로 변환시킬 수 있다. 이러한 입자 형태는 안정성(예, 분해)과 전달 문제 두 가지 모두 해결할 수 있다.
이러한 입자는 순환 시간을 향상시키기 위해 적절한 표면 분자(예, 혈청 성분, 계면활성제, 폴리옥사님 908, PEG 등)을 가지고 있을 수 있으며, 또는 특정 세포성 수용체에 대한 리간드와 같이 부위 특이적인 표적화를 위한 모이어티를 가지고 있을 수 있다. 적절한 약물 전달 및 표적화 기법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, WO99/62315에 기술되어 있다.
용액, 현탁액, 겔 및 에멀젼을 사용하는 것이 바람직하며, 예컨대 활성 성분은 물, 기체, 수계 액체, 오일, 겔, 에멀젼, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 분산액 또는 이의 혼합물 중에서 전달될 수 있다.
조성물은 국소(예, 피부에), 경구 또는 비경구 투여, 예 주사용일 수 있다. 전술한 바와 같이, 루코렉틴은 여러가지 종들 간에 차이가 매우 적다. 실제, 건강한 인간 집단에서는 차이가 없는 것으로 확인되었는데, 이는 인간 집단에서 또한 차이가 없는 단백질 인슐린과 동일한 방식으로, 체액성 항체 반응을 촉발시키지 않으면서, 루코렉틴을 예컨대 개체에게 주사에 의해 주입함으로써 사용할 수 있을 것이다. 따라서, 루코렉틴의 주입에 의한 전신 요법을 이용하여 본원에 기술된 병태들, 특히 자가면역 장애들을 치료할 수 있다.
그러나, 국소 조성물 및 투여가 바람직하며, 겔, 크림, 연고, 스프레이, 고약, 스틱, 솝, 산제, 필름제, 에어로졸제, 점적제, 포말제, 용액제, 에멀젼, 현탁액, 분산액, 예컨대 비이온성 비지클 분산액, 밀크 및 그외 당해 기술 분야의 다른 통례적인 제약학적 형태를 포함한다.
연고, 젤 및 크림은 예컨대 수성 또는 오일성 베이스를 이용하여 적합한 증점제 및/또는 겔제를 첨가하여 제형화할 수 있다. 로션은 수성 또는 오일성 베이스를 이용하여 제형화하며, 일반적으로 또한 한가지 이상의 유화제, 분산화제, 현탁화제, 증점제 또는 착색제를 포함할 것이다. 산제는 임의의 적합한 분말 베이스를 이용하여 형성할 수 있다. 점적제 및 용액제는 수성 또는 비-수성 베이스를 이용하여 제형화할 수 있으며, 또한 하나 이상의 분산화제, 가용화제 또는 현탁화제를 포함한다. 에어로졸 스프레이는 적합한 추진제를 이용하여 가압 팩으로부터 편리하게 전달할 수 있다.
다른 구현예로, 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있는 형태로 제공될 수 있다. 다른 약제학적 형태로는, 활성 성분과 성택적으로 한가지 이상의 무활성의 통례적인 담체 및/또는 희석제, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 슈크로스, 미세결정 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐피롤리돈, 시트르산, 타르타르산, 물, 물/에탄올, 물/글리세롤, 물/소르비콜, 물/폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 스테아릴 알코올, 카르복시메틸셀룰로스, 또는 경질 지방과 같은 지방 성분 또는 이의 적정 혼합물을 포함하는, 나정(plain tablet) 또는 코딩 정제, 캡슐제, 현탁액제 및 용액제가 있다.
본 발명의 조성물내 활성 성분의 농도는 사용되는 화합물(즉, 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 항체)의 특성, 투여 방식, 치료 경로, 환자의 연령과 체중, 의학적 처방, 치료할 신체 또는 신체 면적에 따라 달라지며, 선택에 따라 변경하거나 조절할 수 있다. 그러나, 일반적으로 본원의 화합물의 농도 범위는, (최종 투여, 예컨대 국소 투여용 조제물에 대한 w/w%인) 0.0001, 0.0005, 0.001 또는 0.01 내지 25%, 예, 0.0005-15%, 예, 0.01 - 10%, 예컨대 0.1 - 5%, 예, 1-5%이다. 상기 농도는 화합물 자체의 양을 참조하여 결정되며, 따라서 적절한 배분은 조성물의 순도를 고려하여 이루어져야 한다. 유효한 1회 투여량은 1회 투약으로 복용하는 치료를 받는 동물에 따라 0.1-100 mg/일, 바람직하게는 2-10 mg/일의 범위일 수 있다.
투여는 예컨대 경구, 비경구(예, 근육내, 피하, 복막내 또는 정맥내), 경피, 볼, 직장 또는 국소 투여 또는 흡입에 의한 투여 등의 의약 분야에 공지된 모든 적합한 방법에 의한 것일 수 있다. 바람직한 투여 형태는 경구로 투여되는 것이거나 또는 가장 바람직하게는 국소이다. 알고 있는 바와 같이, 경구 투여는 활성 성분이 소화되는 물질인 경우에는 제한된다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 성분은 전술한 바와 같이 안정화할 수 있다.
본 발명의 실시를 위한 활성 성분들이 다양한 형태, 예컨대 (벡터내에 있는 형태일 수 있는) 핵산 분자 또는 폴리펩타이드이기 때문에, 조성물의 형태와 전달 경로는 다양할 것으로 생각된다. 바람직하게는, 특히 경구 전달이나 국소 투여를 위해서는 액체 용액제, 크림 또는 현탁제가 사용될 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산 분자 중 어느 것은 전술한 의학적 처방에 사용할 수 있다. 이후의 유전자 치료 방법에서, 핵산 분자는, 바람직하게는, 의학적 적용을 위한 당해 기술 분야에 공지된 유전자 치료 방법을 이용하여, 전술한 바와 같이 형질감염/형질전환에 적합한 벡터, 예컨대 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터내에 제공된다.
조성물을 적용 또는 투여할 수 있는 동물은 포유류, 파충류, 조류, 곤충 및 어류(예, 연어 또는 대구)가 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물이 적용되는 동물은 포유류, 특히 영장류, 사육 동물, 가축 및 실험 동물이다. 따라서, 바람직한 동물로는 마우스, 랫, 토끼, 기니아피그, 고양이, 개, 원숭이, 돼지, 소, 염소, 양 및 말이 있다. 특히, 바람직하게는, 조성물은 인간에게 적용 또는 투여된다.
하기 실시예들은 하기에 나타낸 도면을 참조하여 단지 예시로서 제공된다.
도 1 (A) 루코렉틴을 수득하기 위한 부분 정제된 연어 조나제의 겔 여과. 슈퍼덱스 16/60 컬럼(GE Healthcare)을 FPLC 시스템에 연결하고, 완충액 120 ml을 1 ml/min의 유속으로 사용하였다. 컬럼에서의 단백질 용출은 280 nm (우측 y-축)에서 모니터링하고, 1 ml 씩 분획을 채집하였다. 조나제 활성은 OD406에서 크로모자임 X로 절단하여 측정하였다. 조나제의 천연 분자량은 피트 약 50 kDa의 넓은 범위에 걸쳐 있다. 렉틴 MW = 30 kDa,
(B) 면역블롯팅에 의한 연어(루코) 렉틴의 동정. 상기 겔 여과로 수득한 선택 분획을 에피토프-기반의 항-(루코-)렉틴 항체(도 3 참조)를 이용하여 단백질 면역 분석을 실시함. 분획 번호는 면역블롯 상단에 나타낸다. 분자량 마커(kDa)는 좌측에 나타낸다. 예상되는 렉틴 분자량은 다른 방법에 의해 구한 값과 일치된다(도 3 참조).
도 2는 대서양 연어 배아에서의 렉틴-생산 세포(렉토사이트)를 동정한 것으로, 패널 A, B & C는 포르말린으로 고정하고 파라핀 포매시킨 대서양 연어의 배아의 횡단면을 나타낸다. 루코렉틴의 존재는 면역퍼옥시다제 염색 방법을 이용한 토끼 다클론 항-LL 항체(A) 또는 간접적인 면역플루오레센스(B 및 C)를 이용하여 확인하였다. 항-렉틴-항체에 반응하는 세포는 각각 검(A)거나 또는 백그라운에 비해 밝게 나타난다. 특이적인 세포학적 특징들을 가진 다수의 면역반응성 단일 세포들이 전-후 배아 축을 따라 공간적인 제한 없이 표피에서 보여진다. A & B에서 화살 표시는 주변 상피 세포와 쉽게 구별가능한 상대적으로 큰 세포(렉토사이트)를 나타낸다. 이들의 핵은 기저핵이며, 세포질은 루코렉틴으로 차여 있고, 세포가 난황 주위 공간으로 버섯형으로 돌출되어 있다. 패널 2C는 이의 그래뉼러 내용물을 나타낸다.
도 3은 인간, 연어, 닭, 대구 유래의 루코렉틴과 연어 EST 콜렉션 유니진 패밀리 Ssa.23163에서 작성된 2개의 콘틱(contig)으로부터의 2개의 번역물을 정렬한 것이다. 2개의 콘틱 중에서, 콘틱 1은 대부분 루코렉틴 일차 구조가 비슷한 것이다. 그러나, 2개의 콘틱들 간의 차이는 크지 않았으며, 약 80%에 불과하였다.
도 4는 (A) 인간 루코렉틴과 유사한 서열의 SMART 도메인을 나타낸 것이다. WU-BLAST 2를 이용한 BLASTP 검색에서 최적 서열(highest scoring sequence)을 나타낸다. 서열은 유사성이 가장 높은 것부터 낮은 순으로 나열하였다. a - 인간 루코렉틴, b - 연어 배아 루코렉틴, c - 연어 백혈구 루코렉틴(단편), d - 닭 루코렉틴(단편), e - 대구 루코렉틴(단편), f - 커먼 잉어과 어류(common carp fish)-알 렉틴 (Ac#-P68512), g - 아열대 개구리 라나스푸민-6(ranaspumin-6)(Ac#:B5DCK6), h - 제브라피쉬 Zgc: 173443 단백질 (Ac#: A8E4Z1). 연어 백혈구, 닭 백혈구 및 대구 백혈구 루코렉틴 유래 서열은 단지 일부분이었고 전장 길이 서열은 아니라는 점에 유념하여야 한다. 이들 서열의 전장 길이 버전은 아마도 백혈구 백혈구(a) 및 연어 배아(b) 유래의 루코렉틴에서 발견되는 전체 구조와 비슷할 것이다. 아울러, 5개의 연속적인 TECPR-도메인이 있는 루코렉틴 패턴은 여전히 아열대 개구리 서열에서도 유지되고 있었지만, 제프라피쉬 서열에서는 그렇지 않았으며 4개의 TECPR 도메인만 확인되었다.
(B) 5개의 TECPR-도메인을 가지고 있는 루코렉틴을 나타낸 그래프. TECPR 도메인들은 2개의 β-시트를 형성하는 4개의 β-가닥으로 대부분 구성되어 있을 수 있다. 3개의 이황화 결합이 있으며, 나타낸 바와 같이, 그중 하나는 TECPR #4에 내재되어 있으며, 나머지 2개는 연결 루프에 있다. 일반적으로, 당-인지부는 TECPR-도메인들 사이에 위치한 렉틴들에서 확인된다. 루코렉틴과 가장 비슷한 렉틴은 주로 N-아세틸글루코사민에 대해 공지된 당 특이성을 가지고 있다. 루코렉틴에서 추정되는 당 인지 특이성은 미제로 남아있다.
도 5는 백혈구내 난황주위(perivitelline) 렉틴의 존재를 나타낸 것이다. pH 4-7 범위의 IPG-스트립은 1차 구조로 사용하였고, 12.5% 폴리아크릴아미드 겔을 2차 구조의 전기영동에 사용하였다.
A: 연어 백혈구에서, 2개의 스팟만 항-렉틴 다클론 항체에 대해 양성 반응을 보이는 것으로 확인되었다. 이들의 분자량은 약 26 kDa이며, pI는 약 6.5이다. 루코렉틴은 또한 다른 종들에서는 백혈구-조제물에서도 동정할 수 있다.
B: 연어로부터 준비한 조제물에서, 분자량이 약 30 kDa이고 pI의 pH 범위 4.9-6.5에 걸쳐있는, 면역반응성 스팟들 다수 개가 확인되었다(1-8로 번호를 매김).
도 6은 골수계 라인, 특이적으로 제브라피쉬에서 단핵구-대식세포 라인에서의 루코렉틴의 공동-발현을 나타낸 것이다. (A) 렉틴 및 L-플라스틴 유전자의 발현 프로파일. 제브라피쉬는 연어에서 발견된 것과 동일한 렉틴을 발현하는 것으로 확인되었다. 플루오레세인-표지된 렉틴 mRNA 프로브를, 단핵구-대식세포계 라인의 특이적인 마커인, L-플라스틴 mRNA 프로브에 대한 DIG-표지된 프로브와 함께 사용하였다. 이중-표지된 인 시츄 혼성화를 통해, 제브라피쉬에서 배 형성기에 렉틴과 L-플라스틴 mRNA가 공동-발현되는 것이 확인되었다. 좌측 하단 코너에 수정 후(pf) 경과 시간으로 배아의 시간(age)을 나타낸다. 밝은 신호는 L-플라스틴 유전자의 발현을 의미하며; 어두운 신호는 렉틴-발현을 의미한다.
패널 A (측면도)는 전외측 난황에서 분산 축 및 근축 집단을 형성하는, 동일한 세포에서의 렉틴 및 L-플라스틴 mRNA의 공동-발현을 나타낸 것이다. 고배율(A2)에서 이들 세포는 전형적인 백혈구 형태로 확인된다. A1 데이타에서 전측 플레이트 중배엽(화살표)에서 세포의 양측 띠에서 이들 2가지 유전자의 발현이 확인된다. 패널 B는 21시간대의 동일한 결과를 나타낸 것이다.
패널 C (24h pf)는 후부 중간 세포 덩어리(위쪽 화살표 2개), 배측 혈관부(아래쪽 화살표), 배상체와 배 헤드(embryonic head)에 따라 분산되어 있는 현저한 수의 세포에서의, L-플라스틴 및 렉틴 유전자의 공동-발현을 나타낸 것이다. 24 h pf (C2)에서, 대부분의 세포는 이들 2가지 유전자를 공동-발현(화살표 참조)하지만, 다수의 세포는 하나 또는 다른 유전자만 발현하는 것으로 보인다. C3에서 화살표는 L-플라스틴 mRNA만 발현하는 세포를 나타낸다.
(B) 렉틴 단백질 및 L-플라스틴 mRNA의 세포내 공동-국지화. 제브라피쉬 배아(22 h pf)를 렉틴 단백질(좀더 진한 신호) 및 L-플라스틴 mRNA(좀더 밝은 신호)에 대한 인 시츄 혼성화 분석을 이용한 조합형 면역-조직화학법에 의해 분석하였다. 인 시츄 혼성화에서는 L-플라스틴 유전자에 특이적인 DIG-표지된 cRNA를 토끼 항렉틴 다클론 항체를 이용한 면역조직화학법과 조합하여 사용하였다.
패널 A: 배아의 정면도. 화살 표시는 렉틴 단백질 및 L-플라스틴 mRNA이 공통 발현되는 것으로 나타낸 세포 클러스터를 표시한다. A1: 동일 세포에서 L-플라스틴 유전자와 렉틴 단백질을 공동-발현하는 것으로 보이는 클러스터(검정 화살표)의 교배율 사진. 세포 몇 종은 크기가 작고, 성숙형 림프구와 비슷한 둥근 형태를 가지고 있으며, 그 옆에는 성숙형 호중구성 백혈구의 전형적인 형태적 특성인 분엽 핵을 가진 다른 세포가 존재한다. 패널 B, C, D, E는 제브라피쉬 배아 전체에 분포되어 있는, 렉틴 단백질과 L-플라스틴 mRNA를 공동-발현하는 세포-집단(화살표)을 나타낸 것이다.
도 7은 루코렉틴 패밀리를 나타낸 것이다. 인간, 연어, 닭 및 대구 유래의 이용가능한 루코렉틴 단백질들을 조합하였다(웹로고 정렬). 한 위치에서 AA 잔기가 모두 일치되는 것은 큰 문자로 표시하고, 문자 크기가 작을수록 일치도가 낮음을 의미한다. 복수의 문자는 변이를 나타낸다.
도 8은 컬럼 크로마토그래피로 재조합 루코렉틴을 정제한 후의 코마시-염색한 분획을 나타낸 것이다. 레인에서, 1은 상층액, 2는 통과 분획, 3은 세정 분획, 4는 F1, 5는 F2, 6은 F3, F4 + F5 믹스, 7은 F6이고 8은 STD이다.
도 9는 (A) 연어 루코렉틴의 유전자 서열을 동정 및 확립한 실험을 나타낸 것이다.
패널 A는 필터 nr 6, 패널 #5 및 2에서 동정된 2개의 양성 2배수 스팟을 나타낸 것으로, 정확한 플레이트 번호는 257 및 176이고, 각각 클론 L-7 및 F-7에 해당된다.
패널 B는 필터 nr 3 패널 #6에서 동정된 1개의 양성 2배수 스팟으로, 실제 플레이트 번호는 144(플레이트 로케이터 시트를 기준으로)이고, 클론 A-12이다.
(B)는 루코렉틴 유전자의 유추된 게놈 서열(2323 bp)을 나타낸 것이다. 5개의 엑손 부분이 표시되어 있고, 즉 인트론도 표시되어 있다. 유전자 산물에서, 이 유전자의 전사 개시 위치(BDGP Neural Network Promoter Prediction을 기초로 프로모터 예측, "P", "ST" 예측되는 전사 개시부, "T"는 TATA 박스)와 폴리아데닐화 서열("PA")이 표시되어 있다.
도 10은 (A) BLASTP-히트(hit) 위치를 화살표로 나타낸, 인간 염색체 맵, (B) 범례 커버리지 맵(legend coverage map): BLASTP 히트(바)의 위치 시각화 및 대상 서열(인간 루코렉틴)의 총 커버리지. 대략적으로 발견된 서열 전체는 전체 루코렉틴 서열을 커버하지만, 이것이 루코렉틴 유전자라는 것은 데이타에서 명확하지 않으며; C & D) 대상 서열로 인간 루코렉틴을 이용한, 인간 게놈에서의 BLASTP 히트와 그 위치를 나타낸 표이다.
도 11은 인간 상피에서의 연어 루코렉틴의 효과를 나타낸 것이다. 대조군 배양물 = A; 루코렉틴에 노출시킨 배양물 = B. 화살 표시는 루코렉틴에 노출시킨 후, 기저층에서만 나타나는 큰 세포를 표시한다.
도 12는 백혈구에서의 루코렉틴 단백질의 발현을 보여준다. 패널 A는 연어 백혈구로부터 정제한 단백질 ~2 ㎍의 12% 2D PAGE이다. 패널 B는 Lymphoprep™으로 인간 백혈구로부터 정제한 단백질 0.8 ㎍의 15% 2D PAGE이다. 막에 연어 LL에 대한 일차 다클론 항체를 처리한 다음, 염소 항-토끼 항체를 처리하고, ECL-강화된 검출 시스템으로 시각화하였다.
도 13은 노던 블롯으로 동정한 연어 루코렉틴 전사체를 나타낸 것이다. 패널 A는 포름알데하이드 존재 하에 1.2% 아가로스에서 분리하고 LL에 특이적인 안티센스 DIC-표지된 리보프로브(720 bp)로 탐침한, 대서양 연어 배아(370 dd)의 총 RNA를 나타낸다. 패널 B는 (자기 폴리T-비드로 정제한) mRNA의 노던 블롯 분석 결과이다. LL의 일부 코딩 서열로부터 제조한 DIG-표지된 리보프로브를 이용하여 혼성화하였다. 패널 C는 센스 DIC-표지된 리보프로브를 탐침시킨 니트로셀룰로스 막(B)이다. 회색 화살 표시는 전사체의 존재를 표시하며; 검정 화살표는 이것이 없음을 나타낸다. DIG-mRNA 마커 I, 0.3-6.9kb (Roche)를 사용하였다.
도 14는 LL과 관련된 β-프로펠러 단백질을 Clustal W 정렬한 것이다.
도 15는 LL의 3-D 모델이다. 좌측 패널은 투구게(Tachypleus tridentatus)의 타키렉틴 1의 구조(Biesel et al., 1999, EMBO J. 18, pp 2313-2322)를 기초로 루코렉틴의 5개의 날이 있는 β-플로펠러 3D 모델에 대한 대표적인 3D 2개다. 이 모델은 PyMol v 0.99 소프트웨어를 이용하여 제작하였다. 에피토프 펩타이드 잔기들은 단백질 본체에 가는 검정 선으로 나타내었다. 또한, Biesel 등(1999)에 의해 예측된 5곳의 탄수화물 결합부 위치는 연하게 고르게 칠한 헥소스 구조로 표시하였다. 좌측 패널은 컨센서스 프로펠러 도메인과 비교하여, LL(상단) 및 FEL(하단)에서 예측되는 프로펠러 도메인을 나타낸 것이다.
도 16은 제브라피쉬의 전장 길이의 루코렉틴(LL) cDNA 서열을 증폭시킨 것을 나타낸다. 패널 A는 여러가지 프라이머 쌍을 이용하고 RT-PCR로 클로닝한 앰플리콘들을 나타낸다. 역전사에 사용되는 mRNA는 24 hpf의 배아로부터 추출하였다. DNA 마커: 100 bp 래더 (New England Biolabs). 패널 B는 5'RACE PCR로 각각 ~500 bp 및 ~400 bp(유전자 특이적인 역방향 프로이머 및 GeneRacer 정방향 네스티드 프라이머를 이용한 PCR 증폭으로 제조됨)인 2개의 분리된 산물이 증폭됨을 보여준다. mRNA는 표기한 발생 단계에서 수집하였다. 패널 C는 제브라피쉬 LL의 전장 cDNA 서열이 765 nt의 오픈 리딩 프래임(ORF)을 포함하여 1240 nt임을 나타낸다. ORF는 일정한 비율로 그린 5개의 엑손으로 구성되며 블랙 박스로 나타내었다. 5'UTR 영역은 실선으로 표시되어 있다. 5' UTR 뉴클레오티드 서열도 나타내었다. 번역 개시부인 +1 위치의 ATG와 가능성 있는 +94번 위치의 2번째 ATG를 강조하여 나타내었다. 패널 D는 다양한 발생 단계별 절단형 LL의 발현을 보여준다. 패널 E는 연어 및 제브라피쉬 서열들에서 3'UTR이 고도로 보존적임을 보여준다.
도 17은 연어 유래의 루코렉틴의 엑손, 도메인 및 서열 다양성을 종합하여 나타낸 것이다. 여러가지 루코렉틴에 대한 서열 데이타는 가변성 AA 잔기, 시스테인-잔기(C) 및 TECPR-도메인(SMART 데이타베이스 유래) 위치들에 대해 나타내었다. 루코렉틴 서열은 박스로 표시된 7곳의 위치에서만 상이하다. 이러한 가변적인 잔기 5개는 TECPR-도메인내에 위치하고 있으며, 나머지 2개는 C-말단에 근접한 위치에서 발견된다. 루코렉틴-1 또는 루코렉틴-2 중 어느 한가지로 들어맞지 않는 변이는 루코렉틴-3으로 나타내며, 이것은 단지 2곳의 위치만 표시하였다(#2 및 #245). 다른 위치들은 나타내지 않았지만, 이러한 대부분의 위치들은 다른 루코렉틴과 거의 동일한 것으로 데이타에서 나타났다.
어류 알 렉틴(FEL)의 경우에서와 같이, LL에서의 3개의 이황화-결합은 각각, 첫번째 시스테인과 마지막 시스테인이 연결되고, 2번째 시스테인과 뒤에서 2번째 시스테인이 제2 결합을 형성하고, 엑손 3 내에 위치한 2개의(가운데) 시스테인들이 마지막 이황화 결합을 형성하는 것으로 예측된다. 이들 시스테인들은 회색 및 밑줄로 표시된다. 이황화 결합에 참여하지 않는 프로펩타이드내 하나의 시스테인은 엑손 1에 위치한다. 처음 3개의 도메인들 사이를 상호 연결하는 루프가 없고, 마지막 2개의 TECPR-도메인들을 연결하는 2개의 루프에 변이가 없다는 것에 유념하여야 한다. 3개의 TECPR-도메인들은 단일 엑손(2 및 3)에 의해 코딩되지만, 2개의 도메인들은 2개의 엑손에 걸쳐 있다. 엑손 말단과 도메인 말단의 뚜렷한 상관 관계에 주목할만하다. 5개의 도메인들 중 4개는, Trp 잔기가 도메인의 3번째 AA를 점유하고 있으며, 예상되는 첫번째 TECPR 도메인에서는 W가 첫번째 잔기이다. 마지막으로, *은 루코렉틴-1 또는 루코렉틴-2 중 어느 하나 또는 둘다에서 변이체 AA가 확인되는 잔기를 표시한 것이다.
도 18은 웨스턴 블롯으로 검출된 무지개 송어(Oncorhyncus mykiss) 배아의 부하 체액내 LL 단백질을 나타낸 것이다. MW 표준물질(BioRad 161-0373)은 좌측에 표시하였다. 무지개 송어 유래의 부화 체액 단백질(레인 1) 및 친화성 크로마토그래피에 의해 준비한 연어 루코렉틴 단백질(레인 2)을 항루코렉틴 항체로 탐침하였다. 2가지 경우들에서 ~26kDa의 단백질이 확인되었으며, 이는 LL의 분자량과 일치되었다.
도 19 A, 좌측 패널은 대구 부화 체액에서 발견된 단백질들 중 대구 루코렉틴을 나타낸 것이다. 대구 부화 체액은 15% SDS PAGE로 분석하였고, 이를 구성하고 있는 단백질들은 실버 염색으로 시각화하였다. 레인 1: 단백질 마커 (BioRad's Dual color 161-0374). 레인 2: 부화 체액 단백질. 우측 패널은 15% SDS PAGE 분석으로 분리시키고, 니트로셀룰로스 막 상에 블롯팅한 다음 친화성으로 정제한 토끼 다클론 항-루코렉틴 IgG 항체의 적정 희석물로 탐침한, 대구 부화 체액을 나타낸 것이다. 레인 1: 단백질 마커 (BioRad's Dual color 161-0374). 레인 2: 부화 체액의 분액. 루코렉틴 위치는 서양고추냉이의 퍼옥시다제(HRP)로 표지한 염소 항-토끼 2차 항체를 이용하고 ECL 검출 시스템으로 강화하여, 정확하게 표시하였다. 약 26 kDa의 주요 면역-반응성 단백질이 검출되었다. B는 오이코플레우라 디오이카(Oikopleura dioica) 유래의 부화 체액 단백질에 대한 동일한 SDS PAGE와 막을 나타낸 것이다.
실시예 1: 루코렉틴의 동정 및 특성화
단백질 분리
연어의 부화 체액 성분들을 분석하던 중에, 배아에 존재하는 새로운 단백질이 동정되었다.
본 발명의 폴리펩타이드 분리를 위한 출발 물질로서 사용할 수 있는 부분 정제된 조나제의 제조 방법은 WO99/29836에 기재되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다(특히 실시예 1의 내용으로, 단 선택적으로 우레아 단계는 생략됨).
조나제와 루코렉틴 둘다 연어 부화 체액으로부터 정제하였다. 부화 체액의 단백질 농도를 향상시키기 위해, 연어 알을 부화 전 최소량의 물로 이동시켰다. 고도의 동조성 부화는 승온(실온) 또는 탈산소화(Oppen-Berntsen et al. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417-430)에 의해 유도할 수 있으며, 이로써 조산물 조나제와 관련 단백질들을 고농도의 작은 부피로 수득할 수 있다.
조나제의 처음 정제 과정에는 올이 성긴 무명(cheese cloth)을 통해 부화된 연어 알을 여과하는 과정이 포함된다. 이 여과물은 해동하여 추후 단백질 정제에 사용하기 전까지 조나제를 현저하게 분해시키지 않으면서 수년간 냉동시킬 수 있다. 이러한 사실은 연어 조나제와 루코렉틴 등의 관련 단백질을 정제하기 위한 출발 물질의 제조를 매우 간단하게 한다.
다음은 선택사항 단계로, 단백질 여과물을 4 M 우레아에 순응시켜, 연어의 알 껍질의 조각들을 해리시키는 단계를 수행하며, 이로써 저속 원심분리(15,000g; 2 x 15분)에 의해 관련없는 잔해들을 제거할 수 있다. 이러한 방법은 전술한 바와 다르게 준비한 조산물 물질의 특징으로, 컬럼이 막히는 증상이 없었다. 이 조산물 단백질 조제물은 통례적인 크로마토그래피 기법에 의한 정제에 적합하였으며, 조나제는 실시예 7에 기술된 바와 같이 추가로 정제할 수 있다.
부화 체액 유래의 루코렉틴은 조나제와 함께 분리될 수 있다. 천연 형태의 조나제는 루코렉틴 보다 실질적으로 더 크기 때문에, (전술한 바와 같이) 부분적으로 정제된 조나제 조제물로부터, 루코렉틴은 배제 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다. 1차 분리를 위해서는, 도 1 설명에 기술된 조건의 슈퍼덱스 16-60 컬럼으로도 충분하지만, 그 후 조나제는 벤즈아미딘-세파로스 컬럼에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 제거할 수 있다.
대량 제조를 위해서는, 천연 형태의 조나제는 루코렉틴과는 다르게 100 kDa 크기를 배제시키는 울트라 필터를 잘 통과하지 않기 때문에, 한외여과를 사용하는 것이 적합하다.
완충액을 5 M NaCL을 포함하는 중성 내지는 약간 알카리성(pH 7.5 - 8.5)의 수 mM Tris (예, 10 mM)를 사용한다.
루코렉틴은 대부분의 다른 단백질들이 석출되는 공정에서도 용액으로 남아있기 때문에, 혈액 은행에서 오래된 제품으로부터 유기 용매(예, 80% 아세톤) 중에서 추출하여 인간 백혈구를 대량 추출하는 방법도 고려된다. 크로마토그래피 및 여과 방법에 의한 최종 정제는 상기와 같다.
또한, 분리된 단백질은 생식체와 접합체에서 발현되고, 또한 초기 배아 단계(조혈계의 개체 발생기)와 마지막으로 백혈구에서 발현되는 것으로 확인되었다.
기존에 동정되지 않은 단백질들이 조나제와 함께 정제되는 것으로 확인되었다. 이들 새로운 단백질들은 천연 조건에서의 크로마토그래피에 의해 추정시 크기가 30 kDa을 조금 밑도는 수준이었다(도 1).
단백질 발현
분리된 단백질을 이용하여 다클론 항체를 제조하였다. 세포를, 면역퍼옥시다제 염색 방법 또는 간접 면역형광법을 이용하여 토끼 다클론 항-LL 항체로 단백질의 존재를 분석하였다. 그 결과는 도 2에 나타낸다.
항체를 이용함으로써, 새로운 단백질이 코리오라이신(부화 효소)을 생산하는 세포와는 다른 타입의 세포에서 기원한다는 것을 확인하였다. 이들 각각의 세포(렉토사이트라 칭함)의 형태는 도면에 나타내었으며, 이는 코리오라이신을 발현하는 (개별) 부화선 세포와 명확하게 구분되었다.
서열 분석
새로운 단백질은, 이의 트립신 펩타이드를 결정한 다음 부분 직접 에드만 서열분석을 수행하는 등의 표준적인 특정화에 투입하였다. cDNA를 제조하기 위해, 어류 배아의 mRNA를 검출하기 위한 축퇴 프라이머(degenerate primer)를 펩타이드 퍼즐로부터 시행착오를 거쳐 구축하였지만, 역방향 프라이머가 단순하게 폴리 A-꼬리에 매치되도록 설정될 때까지 처음에는 성공하지 못하였다. 이러한 방식으로, 동정된 여러 개의 새로운 프라이머 세트를 사용함으로써 약 1200 nt의 2가지 이상의 cDNA를 찾을 수 있었다. 이 서열들은 매우 유사한 것으로 확인되었으며, 단지 몇가지 변이 AA 잔기들이 존재하였다. 둘다, N-말단 서열 일부가 생략되어 있었다.
다음으로, N-RACE 방법을 이용하여, 상기 서열들이 255개의 아미노산으로 이루어진 단백질에 속하며, 프로세싱된 단백질에 19개의 AA 프로펩타이드와 예외적인 N-말단 트립토판 잔기가 존재한다는 것을 확인하였다. 이러한 후자 특징은 직접 분석으로는 N-말단 서열을 알기 매우 어렵다는 것을 설명해준다. 그러나, 이는 최종적으로 실제 N-말단 잔기들을 확인함으로써 달성할 수 있었다.
단백질의 N-말단 서열을 이용한 EST 데이타베이스 검색을 이용하여, 단백질 서열이 명확하게 새로운 단백질임을 확인하였다(도 3).
이 새로운 단백질과 유사성을 지닌 단백질에 대한 데이타베이스 검색을 통해 다소 유사한 후보를 유일하게 하나를 동정하였다(Leren, 미공개). 이것은 잉어과 어류로부터 분리된 어류 알 렉틴(Galliano et al., 2003, Biochem., J., 376, p433-440)으로, 서열의 매뉴얼 정렬에서 전체 유사성은 기껏해야 48%이었다.
바이오인포메틱 분석을 통해, 새로운 단백질은 텍토닌에 가까운 렉틴(Leren, 미공개)인 것으로 제시되었다. 비슷한 TECPR-도메인 구조를 가진 모든 단백질 리스트를 종합하면, 새로운 렉틴은 새로운 타입의 렉틴인 것으로 보인다(도 4A & B). 새로운 렉틴의 실제 AA-서열에는 저등 무척추동물에서 타킬로렉틴과 일부 유사성을 나타내는 5개의 TECPR-도메인이 포함되어 있었다(Shigenaga et al., 1993, J. Biochem (Tokyo), 114, p307-316).
새로운 렉틴의 프로펩타이드 형태에는, 이를 리소좀으로 표적화하고 이후 (즉, 난황주위 공간으로의) 분비 가능성을 시시하는, 19 AA 펩타이드가 포함되어 있다.
새로운 렉틴의 실제 AA-서열로 에피토프-특이적인 항체 개발이 가능하였고, 분석 조직에 따라 단백질의 이소형(도 5)으로 보이는 다수의 단백질(2-8)을 동정할 수 있었다.
부화선 세포에서 발견된 렉틴(도 6B)이 코리오라이신과 함께 난황주위 공간으로 분비되며, 이들은 이의 겉보기 크기를 증가시키고 이의 겉보기 pI를 낮추는 번역후 변형을 가지고 있을 가능성이 있다.
연어는 4배체 어류이고, 본 발명자의 데이타에 따르면 연어의 루코렉틴 유전자가 2개 이상인 것으로 보이기 때문에, 부분 정제한 조나제 조제물에서의 8개의 루코렉틴 모이어티 어레이는, 총 4 x 2의 경우, 약간 다른 2개의 루코렉틴 단백질에 대한 3가지 이상의 변형으로 인한 것이거나, 또는 상이한 8개의 루코렉틴으로 인한 것일 수 있다. 차이의 이유는 실험적으로 검증하여야 한다.
렉틴의 추정 MW는 약 25-30 kDa이다. 대응되는 연어 렉틴의 추정 pI는 약 pH= 6.5이다. 연어 난황주위 렉틴의 pI(Riste, 미공개)는 pH 6.5 - 4.9이고, 연어 백혈구 렉틴의 경우에는 pH 6.4 - 6.6 이다(웨스턴 블롯팅 기법에 의해 렉틴을 동정하였음).
배아 발생기 동안의 발현
어류의 배아 발생기에서의 새로운 단백질의 발현 위치를 알아내기 위한 뉴클레오티드 프로브를 이용하여, 어류 배아의 상피 세포의 특정 타입에 존재하는 단백질을 검출하였다. 또한, 생식체 및 접합체 모두에서 이 단백질이 발현됨을 확인하였다. 더불어, 이 단백질은 유기체의 대부분 세포에는 없지만 이 단백질이 골수혈구 형성과 관련있을 수 있다고 제안되는 소수의 배아 세포에서는 발현되는 것으로 확인되었다(도 5 및 6). 이러한 발현 패턴은 독특한 현상이다. 따라서, 본 발명자들은 이 단백질을 "루코렉틴"(LL로 약칭함)이라는 이름으로 선택하였다.
여러가지 종들에서의 발현
어류에서 닭 인간에 이르는 혈액 조사를 통해, 루코렉틴이 이러한 전체 척추동물 계통의 백혈구에 존재한다는 것을 확인하였다. 또한, 이의 존재는 다클론 항체를 이용하여 전체 무척추동물에서도 검출할 수 있었다. (인간) 백혈구에서의 루코렉틴의 발견은 직접적으로 루코렉틴에 대해 가능성있는 기능을 시사하였다. 루코렉틴은 면역 기능을 수행하는 세포에 존재한다.
가장 놀라운 점은 진화에서 루코렉틴 서열이 매우 불변성이라는 점이다(도 7). 표준적인 프라이머-쌍 기법을 이용하여, 척추동물 계통에 대해서 cDNA를 검출할 수 있었다. 분석을 통해 어류에서 닭 그리고 인간에까지 극도로 보존된 서열인 것으로 확인되었는데, 이는 이들 유전자가 중요한 기능을 수행한다는 것을 의미한다. 어류 서열과 인간 서열 간의 차이는 약 4 % (10개의 AA 변이)이거나 유사성은 96 %이었으며, 관찰되는 차이의 절반은 보존적인 AA 치환이었다. 비교에서, 공지된 단백질 1종인 잉어(common carp) 유래의 어류 알 렉틴이 매우 유사한 것으로 확인되었다(유사성 48% 미만).
다양한 LL 구조를 종합하여(도 7) 새로운 LL 패밀리 단백질이 확인되었다. 본 발명자들은 어류와 인간에서 약 2%의 AA 비-보존적인 변화를 확인하였다. 명확한 점은, LL-유전자가 서열 불변성을 유지하기 위해 고도의 진화 선별을 겪은 단백질을 코딩한다는 점이다. 이는 바로 종이 진화되는 동안 발생되고 확립되는 대부분의 랜덤 변이가 이 유전자 산물에서는 저지되는, 중요하지만 아직 미확인된 기능을 수행함을 의미한다.
재조합 루코렉틴의 제조
연어의 루코렉틴의 cDNA를 배아에서 클로닝하였다. NcoI 제한효소 부위(정방향) 및 ACC65 I(역방향)을 포함하도록 PCR 프라이머를 설계하였다. 벡터 pETM-60을 NcoI/ACC65I으로 자르고, 절단한 PCR 산물과 밤새 라이게이션으로 연결하였다. 플라스미드를 증폭시켜 서열분석한 후, 서열로 검증된 루코렉틴 인서트가 포함된 pETM-60 발현 벡터를 BL21 (DE3)p Lys 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, 박테리아 글리세롤 스톡 제조를 위해 콜로니를 5 mL의 LB (= Luria Broth)에 접종하였다.
박테리아 배양 및 단백질 정제: 새로운 박테리아 벡터 pETM60-루코렉틴은 TEV 프로테아제 인지 서열을 통해 NusA의 C-말단과 His-테깅된 재조합 단백질이 접합된 접합체를 발현할 수 있다. 이는 금속 친화성으로 효과적으로 정제한 다음 융합 파트너를 제거한 후 가용성 형태로 회수하였다.
재료 및 방법:
PCR 상위 및 하위 프라이머:
NWA15dPET(#23): NcoI
5'-GCA.CCA.TGG.CCA.TGG.GCT.GGG.ACT.GTC.AGG.AGG.TAG.TA
CH.A15dPET(#13): ACC65I
5'-CCG.AAG.CTT.GGT.ACC.ATG.TGT.GCA.CAC.CAT.GGT.GAC
PCR 믹스:
dNTP 4 ㎕
프라이머 #23/#13 0.5 ㎕ (10 μM)
cDNA 2 ㎕
DNA 중합효소 완충액 10 ㎕
DNA 중합효소 0.5 ㎕
dH2O 총 50 ㎕이 되도록 첨가
PCR 반응:
98 ℃ 10초.
55 ℃ 15초.
72 ℃ 1분.
30회 사이클
70 ℃ 10분.
PCR 산물과 pETM-60 프라이머를 NcoI 및 ACC65I 제한효소로 자르고, 라이게이션을 위해 1% 아가로스 겔에서 정제하였다.
T4 DNA 라이게이즈에 의한 인서트 DNA 와 벡터의 연결:
T4 라이게이즈와 하기 믹스를 이용하여 이중가닥 DNA 분자의 5' 포스페이트와 3'-하이드록시기를 연결하였다:
200 ng 벡터 DNA
500 ng 삽입체 DNA
10X 라이게이즈 완충액
1 ㎕ T4 라이게이즈
총 부피 10 ㎕
실온에서 밤새 인큐베이션하고, 시험관을 65℃ 수조에 10분간 두어 라이게이즈를 열에 의해 불활성화하였다.
라이게이션 믹스를 DH5α 컴피턴트 세포에 전기천공으로 도입하고, 콜로니를 LB 5 ml에 접종하였다.
분석을 위해 클론 10개를 무작위로 선정하였다. 분석은 pETM60-루코렉틴을 NcoI/ACC65I으로 절단하여 행하였다.
인서트 루코렉틴의 서열은 pETM60-루코렉틴을 프라이머 #13 및 #23으로 서열분석하여 검증하였다.
루코렉틴의 시험관내 번역
BL21(DE3)pLysS에는 T7 리소자임을 코딩하는 플라스미드(클로람페니콜 내성을 갖춘 pLysS)이 포함되어 있어, 유도 전에 T7 중합효소의 백그라운드 수준을 낮춘다. BL21(DE3)pLysS는 독성 단백질들의 단백질 발현을 엄격하게 통제하며, 단백질의 고도 발현 및 용이한 유도에 적합한 균주이다.
재조합 단백질 발현 및 정제에 사용한 융합 테그는, 495aa (54.8 kDa) 크기의 N-말단에 위치한 NusA로서, 이를 이용하여 과다 발현되는 단백질의 용해를 증가시켰다.
NusA-루코렉틴은 금속 친화성에 의해 효과적으로 정제하고, 융합 파트너를 제거한 후 가용성 형태로 회수하였다.
NusA - 루코렉틴의 발현 및 정제를 위한 재료:
카나마이신 플레이트
2YTG 배지
0.4mM IPTG (최종 농도 0.4 μM)
HisTrap HP (5 ml) 컬럼
유도는 26℃에서 3시간 동안 수행하였다.
정제 프로토콜:
정제하기 전의 NusA-루코렉틴 상층액의 고유 효소 활성: 0.0060/min
25 ml 완충액 B (1xPBS, 30 mM 이미다졸, 0.4 M NaCl)로 컬럼 평형화
샘플 적용:
상층액 28 ml을 여과하고, 탈기한 다음, 25 ml을 컬럼에 주입하였다.
컬럼을 75 ml의 완충액 B로 헹구었다. 25 ml의 완충액 C (1xPBS, 0.5 M 이미다졸, 0.4 M NaCl)를 이용하여 한단계 용출로 용출시켰다. 샘플 1 ml씩 수집하였다.
결과:
통과 분획과 세정 분획에서 조산물 재조합 단백질의 프로테아제 활성 98% 이상이 확인되었다. SDS-PAGE 분석(도 8)에 의해 확인된, 재조합 루코렉틴이 포함된 분획(F6 & F7)을 비롯한 컬럼 분획들에서는 프로테아제 활성 1.6%만 회수되었다. 이들 분획에는 0.3% (컬럼에 적용된 프로테아제 활성의 백그라운드 수준)이 포함되어 있었다.
결론:
재조합 루코렉틴은 세린 프로테아제 활성이 없으며, 따라서 진성 렉틴이다.
따라서, 천연 소스(부화 체액) 유래의 일부 루코렉틴 조제물에서 확인되는 세린 프로테아제 활성 흔적은 조나제 흔적으로 보아야 한다.
루코렉틴과 조나제는 부화 체액에 함께 존재하며, 대부분의 크로마토그래피 공정에서 함께 정제되는 경향이 있지만, 100 kDa를 제한크기로 하는 바이오맥스 필터를 이용한 마지막 한외 여과로 분리할 수 있다.
재조합 단백질 분석
상기에서 제조하고 SDS PAGE로 정제한 재조합 연어 LL를 MS/MS 기법으로 분석하였다. LL의 펩타이드 질량 핑거프린트 스펙트럼을 조기아강(Actinopterygii)에 대해 NCBI 단백질 및 EST 데이타베이스 2곳에서 Mascot로 분석하였지만, 어떠한 유의한 히트도 발견되지 않았다(Riste, 미공개). 이러한 스펙트럼을 LL의 2D-겔 분석으로 용출시킨 배아 및 백혈구 LL 모이어티들로부터 수득한 LL 스펙트럼과 잘 비교하고, 추가적으로 pH-농도구배 방법에 의해 관찰되는 LL의 이소형의 존재를 검증하였다.
게놈 서열
본 발명자들은, 연어에서, 670 NT 프로브로 Bac-라이브러리를 탐침함으로써 이러한 실체의 유전자의 게놈 서열을 확립하였다(전체 프로토콜은 또한 실시예 10에서 상세하게 설명됨). 따라서, 일부 단백질 AA 서열로부터 파생된 정보를 기초로 설계된 축퇴성 프라이머를 이용함으로써, 루코렉틴에 대한 전장 cDNA 서열을 이용할 수 있었다. 370 dd(day degree) 배아(즉, 부화기에 근접하지만 아직 부화기는 아닌 배아)의 cDNA를 PCR 증폭하여, 630 kb의 앰플리콘을 제조하였고, 이를 겔 정제하고 서열분석하였다.
렉틴 유전자-특이적인 프로브를 이용하여, 연어 게놈 프로젝트(SGP) 기구에 의해 이용할 수 있게 된 BAC 라이브러리(18x 커버리지; 평균 삽입체 크기, 188 kb)를 스크리닝하였다. 프로브(크기 630 bp)는 PCR 방법을 이용하여 디그옥시게닌-11-dUTP(Roche)를 병합시킴으로써 제조하였다. Bac 라이브러리 스크리닝을 통해 7개의 양성 클론들이 동정되었으며, 이들은 각각 A-12/144, L16 /143, P6/76, B-5/70, O-20/85, L-7/257, F-7/176로 하였다. 양성 반응은 패널 A & B에 예시해 두었다.
선택한 클론의 특이적인 반응은 BAC-라이브러리 스크리닝에 사용된 DNA-표지된 프로브와 동일한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하여 검증하였다. 벡터 서열내 삽입체의 크기는 펄스형 필드의 전기천공에 의해 예측하였다. 클론들은 숏건 방법에 의해 의뢰(MWG-Biotech, Germany)하여 서열분석하였다.
이러한 작업으로, (4배체) 연어의 게놈에서 루코렉틴과 밀접하게 관련있는 유전자 몇가지를 확인하였다(도 9A 및 B). 단편 서열들에서의 차이는 2가지 이상의 유사한 유전자들이 존재한다는 것을 시사하는 것으로 볼 수 있었다. 구조적으로 루코렉틴은 5개의 엑손과 4개의 인트론을 가진 정상적인 유전자로 보이며, 유전자에서 전사 개시부에서 폴리아데닐화 부위까지는 2300 bp로 매우 표준적인 크기이다.
그러나, 본 발명자들의 데이타를 통해, 지금까지 유사한 서열을 가진 유전자가 어떤 유기체에서도 보고된 적이 없다고 결정내릴 수 있었다. 본 발명자들은, 각각의 엑손 또는 인트론에 대한 프로브들을 이용하여, 하나의 엑손이 다른 보고된 2종의 단백질의 일부분과 드물게 유사성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었지만, 상기 2종의 단백질 모두 본 발명자들이 발견한 분자 실체와는 전체적으로 상이하였다.
데이타베이스 검색에서, LL 단백질, LL의 mRNA 전사체 또는 인간 염색체에서의 루코렉틴 게놈 유전자에 해당되는 유전자는 찾을 수 없는 것으로 나타났다. 명백하게, 루코렉틴 유전자는 어디에서도 아직 발견되지 않았거나, 또는 그 서열이 아직 등재되지 않았거나, 또는 LL 유전자 서열은 인간에서 아직 검출되지 않은 것이다. 추가적인 검색으로, 본 발명자들은 데이타베이스에서 소형 구조 인자의 위치를 보기 위해, 하기 표 2에 열거된 각각의 소형 구조 인자를 이용하였다.
LL 엑손/ 인트론 길이( NT ) 히트
Ts -Start에서 엑손 I까지 51 없음
엑손 I 55 염색체 11,7,1,18,17,10
엑손 I + 인트론 I 55 + 89 염색체 11,14,18, 13
엑손 II 234 프로토카드헤린 영역, 티아민 트리포스페이트 효소.
엑손 II + 인트론 II 234 + 163 없음
엑손 III 218 평활근 단백질, T 세포 수용체 등
엑손 III + 인트론 III 218 + 133 T 세포 수용체 β 체인 V 영역
엑손 IV 116 없음; 염색체 20 & 21
엑손 IV + 인트론 IV 116 + 682 염색체 8 (x2)
엑손 V 142 없음; 어떤 ?
엑손 V + 인트론 V 142 + 404 염색체 5 & 4
Ts -Start에서 폴리A 말단까지 2283 없음; 어떤 ?
cDNA 765 없음
LL 단백질 255 AA 없음
인트론 I 89 염색체 3,4,18,14
인트론 II 163 염색체 14, X, 4
인트론 III 133 염색체 21,2,7,4,15, 13,18,12,8,1,
인트론 IV 682 염색체 18 (x2)
인트론 V 404 없음; 어떤 ?
그 결과, 일부 공지된 단백질들이 루코렉틴의 일부분과 어느 정도의 유사성이 있는 것으로 보이며, 해당되는 염색체 번호를 기재하였다. 염색체에 위치하지 않는 서열은 "어떤 ?"으로 표기하였다.
주요한 히트는 인간 트랜스겔린인데, 이것은 평활근 단백질 22-α (SM22-alpha) (WS3-10)이다. 트랜스겔린은 액틴-결합성 단백질이며, 분화된 평활근의 가장 초기에 나타나는 마커 중 하나이다. 이 단백질의 기능은 아직 파악되지 않았다. http://harvester.embl.de/harvester/P378/P37802.htm
그러나, 트랜스젤린과 루코렉틴의 단백질 서열을 정렬하면 컨세서스 서열은 최소로 나타났다. 그 밖에, LL 구조의 일부분과의 약간의 낮은 유사성이 T-세포 수용체와 공지되지 않은 단백질에 대해서 확인되었다. 중요한 점은, 이 신규 유전자는 공개된 인간 게놈 서열에서는 (아직까지) 발견할 수 없음에도 불구하고, 인간 백혈구에서 특이적으로 발현된다는 것이다. (또한, 일부 발현은 인간 혈소판의 정제된 조제물에서도 보여짐). 인간 게놈에서는, 이 유전자의 매우 짧은 단편만 검출할 수 있으며, 이들 단편은 다수의 인간 염색체 상에 널리 퍼져있다(도 10).
염색체 상에서의 분포 패턴의 관찰은 성공하지 못하였다. 인간 LL-유전자 자체는 지금까지 서열분석되지 않았거나 또는 특정 염색체에 위치되어 있지 않다면, 이러한 짧은 서열들은 LL-유전자와 관련없을 수도 있다. 이러한 수수께끼는 아직 해결되지 않았다.
고찰
어류 및 닭 유래의 LL과 거의 동일한 새로운 LL-렉틴을 인간 백혈구에서 동정하였다. 연어의 LL 유전자가 표준 구조의 LL이지만, 인간에서는 아직 발견되지 않았다.
실시예 2 : 루코렉틴의 의학적 용도
재료 및 방법
실시예 1에 기술된 바와 같이 준비한, 연어의 루코렉틴 단백질(LL이라 함)을 이용하여 하기 실험들을 수행하였다. 사용한 LL-농도는 ca. 1-10 ㎍/ml이었다. 조나제-프로테아제는 LL과 수 및 코코넛 오일 에멀젼내에 1:100의 비율로 존재하였다(코코넛 오일은 30% 이상으로 존재함). 루코렉틴은 조나제 존재 조건에서 안정적이다.
결과
A. 저온의 의한 피부 갈라짐
많은 사람들이 피부 특히 손에서 피부의 계절성 피부 갈라짐을 경험한다.
저온 계절(cold season)에 피부에 루코렉틴을 적용하면 저온에 의한 피부 갈라짐의 발생율이 급격하게 지연되거나, 또는 많은 경우들에서는 방지된다. 이러한 현상은 12건 보고되었다. LL가 확립된 저온-갈라짐에 대해 효과를 나타낸 사례는 소수였지만, 확립된 저온 상처는 일부 봉합되었다.
B. 일광 화상 - 손상된 피부
맨 피부에 태양을 과도하게 노출시키면 일광 화상이 발생될 수 있으며, 그 결과 열감, 붉음증, 가려움이 생길 수 있으며, 궁극적으로 노출된 피부가 벗겨질 수 있다.
루코렉틴을 적용하면 수분내에 붉은 부분이 사라지고, 가려운 증상이 중단되고, 궁극적으로 피부 박리는 생기지 않게 된다. 이러한 놀라운 결과는 다수의 개체들에서 반복적으로 나타났다.
C. 열 - 손상된 피부
피부에 직접 열을 가하여 손상시킨 후, 연어의 루코렉틴을 적용하면, 현저한 수준으로 상기한 손상의 정상적인 결과가 예방되고, 처음 손상 후 어느 정도 시간 후에 적용한 경우에는 손상이 정지되고 충분하게 회복되는 것으로 나타났다.
D. 여드름
여드름에 대한 준임상적인 사례는 다수 청소년들에서 즉각적인 가려움 및 붉음증의 중단이었다. 여드름 자체의 개선은 코코넛 오일 에멀젼 중의 LL 적용시 소규모 파일롯 실험에서 사례의 약 절반에서 나타났다.
E. 국소 건선
넓은 건선 피부 영역에 연어 루코렉틴을 적용하면 처음에는 거의 즉각적으로 붉음증이 엷어지고, 다음으로 가려움증이 급격하게 감소되는 반응이 나타났다. 과도한 각질 피부(horny skin)들이 처음 수 주간 완화되었지만, LL 적용을 중단하면 재발하였다.
F. 개방형 피부 상해
인간 지원자를 대상으로 관찰하였다. 골절된 고관절 수술 후 발 뒤꿈치 압박 상해로 인해 발생하였고 보건 의료인에게 진료받았지만 수개월에서 최대 1년간 완치되지 않고 있는, 만성적인 개방형의 삼출성 피부 상해 사례를 조사하였다. 관찰되는 상처는 직경 0.5 내지 2 cm이었다.
필터-멸균한 LL 조제물을 하지(다리)의 만성적인 개방형 상처에 적용시, 2-3일 후 상처에서 삼출액 분비가 중단되었고, 상처 부위가 신속하게 수축되어, 2-3주 후 상처가 사라지고 정상 피부로 대체되었다.
처음에 하지 맨 말단에 상처가 생기는 환자의 특성을 감안하면, 상기 방식으로 없어지는 1차 상처는 기부(proximal) 상처인 것으로 관찰되었다. 이는 보다 최근에 확립된 상처로 판단되었다. 없어지는 마지막 상처들은 발뒤꿈치에 가까이 있는 원위 상처들이었으며, 이는 가장 오랜기강동안에 확립된 상처였다. 궁극적으로 모든 상처들이 사라졌다.
G. 시험관내 연구
분화된 인간 피부 상피 배양물들을 영양분들이 아래쪽에서부터 상피 조직까지 접근가능한 미세기공의 플라스틱 배양 기질 상에 접종하고, 16일 후 SkinEthics (Nice, France)로부터 수득하였다. 이러한 배양물은 37℃에서의 배양 기간 동안 분화되어 정상적인 피부 형태를 나타낸다. 이러한 배양물은, 상부 각질층이 공기에 노출되고 기저층이 배양 배지에 노출되도록 2일간 시험관내에서 유지시켰다. 비교 배양물은 30℃의 습한 대기에서 취하여, 배지 Ca, Mg-함유성 인산 완충화된 염수에서 연어 루코렉틴 10 mg/ml 존재 또는 부재하에 두었다. 배양물을 표준 기법에 따라 포르말린으로 고정하고, 파라핀으로 포매한 다음, 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다. 거대한 기저 세포의 신속한 유도가 상피에서 관찰되었고, 세포 증식 신호가 있었다(도 11). 이러한 결과는, 세포 증식과 세포 분화의 조합이 상처 폐쇄와 피부 상피 보전성을 재확립하는데 충분한, 피부 상의 루코렉틴의 치유 효과와 인과적으로 관련있는 것으로 해석되었다.
고찰:
케라티노사이트 세포 배양물에서의 LL-유전자 산물의 발현은 확인되지 않았다. 또한, 수지상 세포는 상피 피부에서 혈액 백혈구와 관련있는 유일한 세포이다. 상피 세포에 대한 백혈구의 정상적인 접근은, 정상 피부에서 흔히 압박 상처가 생기는 순환 불량으로 인해, 일부 기계적 또는 생물학적 상해를 입은 후에는 방해받게 된다. 루코렉틴의 투여는 이러한 결함을 무효화시키고, 피부에서 정상적인 치유 메카니즘을 촉발시킨다.
실시예 3: 백혈구에서의 루코렉틴 단백질의 발현
연어 혈액을 버건 산업대학으로부터 입수하였다. 전체 어류 혈액을 헤파린 처리한 시험관(Riste, unpublished)에 채혈하고, Miller et al. (1988, Nucleic Acids Research, 16(3) p1215)에 따라 처리하였다. 인간 혈액 샘플은 노르웨이 하우캘란드 대학 병원의 혈액 은행으로부터 입수하였다.
전체 인간 혈액을 5 ml 사이트레이트-완충액 시험관에 채혈하고, Miller et al. (상기 1988)에 따라 처리하여, 백혈구를 준비하였다. 이 조제물을 Lymphoprep™ (Axis-Shield PoC, Norway) 농화로 추가로 정제하였다. Lymphoprep™을 프로토콜에 따라 사용하여, 인간 백혈구 분획을 준비하였다. 이 분획을 Miftari 및 Walther(비공개)에 따라 면역블롯 분석에 사용하였다. MacGillivray 및 Rickwood (1974, European Journal of Biochemistry, 41, pp. 181-190)에 기술된 방법에 따라, ~1 ㎍ 단백질로 2D PAGE 분석하였다. 이들 2 종으로부터 수득한 LL 단백질을 LL 단백질 및 이의 이소형을 특이적으로 검출하기 위한 민역블롯을 이용하여 2D PAGE로 시각화하였다. 연어 LL에 다클론 1차 항체를 처리한 다음, 염소 항-토끼 항체를 처리한 후, ECL-강화된 검출 시스템으로 LL-단백질을 시각화하였다. 면역반응의 특이성은 단백질 0.5-5 ㎍을 사용하는 복수의 겔에서 테스트하였고, 비슷한 결과를 수득하였다.
연어 백혈구는 MW ~26 kDa의 2가지 LL-이소형을 보였으며, pI는 연어 PVF에서 발견되는 8가지의 LL 등전성 형태들 중 보다 염기성인 형태들과 비슷하였다. 2D PAGE의 2차 구조에서 MW 표준물질로 추론하여 실제 MW를 추정하기 어렵다. 인간 백혈구에는 분자량 ~30 kDa의 하나의 주류 LL-항원이 포함되어 있으며, 이는 다른 관찰에서는 27 kDa에 가까웠다. 산성 pI는 PVF(상기 Riste)에서 발견된 연어 LL-이소형들의 평균 pI와 일치되었다(도 12).
실시예 4: 노던 블롯으로 동정한 연어 루코렉틴 전사체
연어 알을, 표현형 선별에 의해 1975년 이래 복수 시대로 유지시킨, (노르웨이 푸사) 보락스의 연어 친어 농장으로부터 입수하였고, 연어 스톡의 현재의 일부분을 노르웨이의 연어 Breed A/S에서 증폭시켰다.
총 RNA 및 폴리아데닐화된 RNA 의 분리
총 RNA를 후기, 전-부화 단계(약 370 dd)에서 연어 배아로부터 트리졸 시약(Life Technologies)을 제조사의 지침서에 따라 이용하여 분리하였다. 완결성 및 순도 측면에서의 총 RNA의 품질과 양을 포름알데하이드 아가로스 겔에서 에티듐 브로마이드로 염색하여 평가하였다. 총 RNA를 분광광도측정으로 정량하였다. RNA의 폴리아데닐화된 분획(mRNA)은 Dynal 비드 mRNA 정제 키트(Invitrogen)를 이용하여 총 RNA 5-10 ㎍으로부터 분리하였다.
프로브 구축
안티센스 디곡시게닌(DIG)으로 표지된 cRNA 프로브를 SP1 절단한 플라스미드 DNA 주형을 T3 RNA 중합효소로 전사하여 제조하였다. DIG RNA 표지 키트(SP6/T7) (Roche Diagnostics)를 제조사의 프로토콜에 따라 이용하여, XhoI로 절단한 플라스미드 DNA 주형을 T7 RNA 중합효소로 전사하여, 센스 DIG-표지된 cRNA 프로브를 제작하였다. 제작된 디곡시게닌(DIG)-표지된 LL 안티센스 및 센스 cRNA 프로브는 ~650 bp였다.
노던 블롯팅 분석
순수한 mRNA 0.5 ㎍ 및 총 RNA 1 ㎍ 분액을 전기영동하고, 양으로 하전된 니트로셀룰로스 막(Amersham)에 블롯팅하였다. 막을 DIG Easy Hyb 완충액(Roche) 중에서 2시간 동안 55℃에서 사전-혼성화한 다음, 1 ㎍/ml LL 리보프로브로 55℃에서 16시간 혼성화하였다. 2x SSC + 0.1% SDS의 저엄격 조건에서 RT에서 각각 15분간 2번 세정하는 단계를 수행하였고, 0.1x SSC + 0.1 % SDS의 고엄격 조건에서 65℃에서 각각 20분간 2번 세정하는 단계를 수행하였다. 막을 말레산 완충액(pH7.5) 및 1% 블록킹 시약(Roche)을 포함하는 블록킹 용액에서 인큐베이션한 다음, 1:10,000로 희석된 항-DIG-알카리 포스파타제(AP) 접합된 항체(Roche)가 포함된 블록킹 용액에서 RT에서 1시간 인큐베이션하였다. 150 mM NaCl 및 0.5 % Tween 20을 포함하는 100 mM 말레산 완충액(pH 7.5)으로 세정한 후, 막을 검출 완충액(0.1 M TrisHCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5, RT)에서 2분간 평형화하였다. 하이브리드 프로브 타겟은 기질로서 CSPD(Roche)를 이용한 화학발광 분석 및 X-레이 필름(Kodak)에 블롯을 5-30분간 노출시켜, 가시화하였다. DIG-표지된 RNA 분자량(Roche)을 사용하였다.
안티센스 DIG 표지된 LL 특이적인 리보프로브를 이용하여 성숙형 LL 전사체의 크기를 추정하였다. 총 RNA의 노던 블롯 분석(도 13A)으로, ~1250 bp 크기의 주요 전사체가 확인되었고, 또한 약한 밴드 전사체(~3200 bp)도 관찰되었다. 주류 밴드는 성숙형(인트론-없음) 전사체와 번역가능한 LL 전사체에 해당되었다. 동일한 리보프로브를 이용한 정제된 mRNA의 노던 블롯 분석에서는 ~1250 bp의 단일 밴드가 나타났다(이는 증폭된 cDNA가 전장 코딩 서열에 가깝다는 것을 의미함)(도 13B). 총 RNA 및 mRNA 샘플에 대한 블롯을 센스 LL 특이적인 리보프로브와 인큐베이션하였을 때, 혼성 신호는 관찰되지 않았는데, 이는, 사용된 리보프로브가 층분하게 특이적이지 않다는 것을 의미한다(도 13C). 소수인 전사체(~3200 bp)는 연어에서의 전장 LL-전사체 보다 더 컸다. 특이적인 혼성화 조건을 감안하면, 이 물질은 아마도 LL-서열 정보를 포함하고 있는 물질을 내포하는 것일 것이다. 안티센스-프로브에 대해서만 양성 신호가 나타나고 센스 프로브에서는 그렇치 않았다는 것은 결과의 특이성을 반영하는 것이다. 전장 전사체의 크기는 전술한 모든 LL-엑손과 일치되었다.
실시예 5: LL 및 관련 β-프로펠러 단백질의 정렬
바이오인포메틱스 분석을 공개 서열 은행에 수탁된 정보와 비교하여 연어 LL 서열에 대해 수행하였다.
Clustal W 분석(도 14)에서, 연어 루코렉틴의 유추된 아미노산 서열은 데이타은행에 기록된 모든 단백질들과 유의한 서열 유사성을 공유하지 않는 것으로 나타났다. 그러나, BLAST에서 시프리누스 카르피오(Cyprinus carpio)의 어류 알 유래 렉틴인 FEL(Gene bank Acc. Nr. P68512) 등의 보다 관련성이 먼 단백질과 유사성을 나타내었지만, 총 유사성은 48%에 불과하였다(E 값: 2.00 E-50). 또한, 제브라피쉬 유래의 가정 단백질의 총 유사성은 45% (E 값: 2.00 E-48)이다. 또한, 서열 비교에서, 렉틴이 말굽형 크랩의 TPL-1 (기존에는 렉틴 L6)(Acc. Nr.P82151), 피사룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum)의 텍토닌 I(Acc. Nr. O61063) 및 텍토닌 II (O61064)과 38%, 28% 및 26% 동일한 것으로 나타났다. (SwissProt에 의하면, 이 수치는 각각 49, -, 35, 32 및 29% 동일성이며, E-수치는 FEL 1는 e-51이고 L6은 1 e-40임). 이러한 데이타는, 무척추동물 보다는 척추 동물에 대해 보다 높은 LL 유사성을 가진다는 것을 시사한다. 제외시켰지만, LL과 인간 텍토닌 β-프로펠러 리피트-함유 단백질(KIAAO329_인간)의 동일성 30%이다.
다중 정렬을 통해, FEL(Galliano et al., 2003, Biochem. J. 376, pp. 433-440)에서, 4가지 생화학적으로 확증된 이황화 결합들 중, 3가지는 루코렉틴에 보존되어 있는 것으로 확인되었다. 첫번째 결합은 양 단백질의 N-말단과 C-말단을 연결한다. 이 결합은 LL에서 3번과 234번(또는 FEL의 238번) 위치의 시스테인들을 연결한다. 2번째와 3번째 결합은, LL에서 Cys 102와 Cys 155(FEL의 경우 #157)을, LL과 FEL 둘다에서는 Cys 132와 Cys 137을 연결하고 있다. Cys 208 (212)와 Cys 226 (230)가 참여하는, 잉어과 어류 FEL에서 확인되는, 4번째 이황화 결합은, 루코렉틴에서는 발견되지 않았다.
실시예 6: LL ( 루코렉틴 )의 3D-모델
루코렉틴 단백질은, L6 또는 타킬렉틴 1(타키플레우스 트리덴타우스), 즉 말굽형 크랩 헤모사이트 유래의 박테리아 다당류-결합 렉틴 및 그외 무척추 타킬렉틴-관련 단백질과, TECPR 도메인 구조 측면에서 높은 수준의 유사성을 공유하고 있다. 그러나, 단백질의 C-말단 방향으로 β-프로펠러 도메인이 약간 이동되어 있다는 점과 도메인 수 측면에서 차이가 관찰되었다. 유사성 검색과 SMART 검색 정보를 종합하여, 루코렉틴의 전반적인 3-D 구조가 5부위 돌출형의 β-프로펠러 단백질 구조인 것으로 추론되었다. 이를 기초로, 루코렉틴 단백질을 볼 수 있는 작동 모델을 제공하기 위한 3D 모델을 제작하였다(Biesel et al., 1999, EMBO J., 18, pp. 2313-2322). 하나의 단백질의 잔기 번호들을 다른 것의 잔기와 동일하게 설정한 바와 같이, 이는 단순한 어림치이다. SMART 데이타베이스 검색에서, 실질적으로 번역되는 루코렉틴 단백질의 주된 구조적 특징이 확인되었는데, 이는 각각 35-36개의 AA로 구성된 5개의 탠덤 반복부와 32-61%의 내부 서열이다(도 15, 우측 패널). 유추된 루코렉틴 단백질의 내부 반복부 가닥들은 대부분 13AA 길이로 서로 간에 유사성을 보였다. 짧은 컨센서스 서열들 X W XX LP GXLKXXXVGPX 및 GVNKNDXXYXLVG은 각 반복부에서 고도로 보존되어 있었다. FEL에서 발견되지 않은, 루코렉틴의 N-말단 영역내 20개의 잔기로 구성된 가닥 외에도, 이들 단백질 모두 TECPR 도메인의 수와 전체 도메인 구조 에서는 높은 수준의 유사성을 나타내었지만, 서열 동일성은 48%에 불과하였다.
실시예 7: 연어 부화 체액으로부터 조나제의 정제
실시예 1의 연어 부화 체액을 추가로 정제하여, 순수한 조나제 조제물을 수득할 수 있었다. 여과물에서 큰 분자 구성성분로부터 조나제를 분리하여 50% 이상의 수율로 12배 정제하는데, 1라운드의 겔 여과로도 충분하였다. 이용한 매트릭스를 바꿀 수 있으며, 세파크릴 SR-200®을 통상 선택하였다. 완충액은 Tris-HCl pH 8.0 또는 pH 8.5 (0.05 M)이거나 또는 트리스-아세테이트 (0.025 M, 동일한 pH)였다. 겔 여과 공정 후 수득되는 조나제는 부화 체액에서 우세한 조나제 모이어티였다.
상업적으로 이용가능한 벤즈아미딘 세파로즈 6B®-컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 조나제를 정제하여 동종(homogeneous) 단백질을 수득하였다. 이용된 특이적인 조건(25 또는 125 ml 부피 컬럼), 0.05 M Tris-HCl 완충액(pH 8 또는 8.5)을 다시 사용하고, 컬럼 상에서 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하기 위해 1 M NaCl로 적응시켰다. 단백질이 컬럼에 견고하게 결합되어 유지되기 때문에 이 단계로 조나제는 제거되지 않았다. 컬럼에서의 조나제의 용출은, 동일한 Tris-HCl 완충액 중의 1 M NaCl 중의 10-33% 디옥산-농도 구배를 이용하여 달성하였다. 친화성 정제 후, 조나제 조제물은 SDS-PAGE 분석에서 하나의 단백질 밴드를 나타내었고, 이의 분자량은 약 28 kDa이었다. 한편, 이 조나제 산물은 고도로 정제된 서열분석-등급의 순도는 아니었다.
겔 여과-정제 + 친화성-정제한 조나제를 최종적인 한가지 크로마토그래피 공정에 의해 서열분석-등급 순도로 추가적으로 정제하였다. 이 공정에서는 PBE94® 컬럼을 사용하였고, 완충액은 트리스-아세테이트(10 mM, pH 9.0)를 사용하였으며, 이후의 용출은 이 완충액 중의 염 농도 구배(최대 1 M의 NaCl 염)로 용출시켰다. 이 단계 자체로 조나제의 촉매 활성을 추가로 7.6배, 전체 정제에서는 714배로 증가되었으며, 출발 물질로부터의 수율은 28%였다. 이러한 정제 단계로 무손상 조나제는 28 kDa 모이어티 단백질 물질로 동정되었다.
실시예 8: LL 및 항체의 제조 및 정제
다클론 토끼 항-토끼 항-연어 LL 항혈청을 다음과 같이 제조하였다: 실시예 1의 서열분석 등급으로 정제된 루코렉틴 단백질을 이용하여 Harlow and Lane (1988, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)에 기술된 바와 같이, 4 kg 친틸라 토끼에서 다클론 항체를 제조하였다. 서열분석-등급의 루코렉틴 80, 40 및 25 mg의 3번의 주사를 여러 피하 부위에 실시하였다. 1차는 프레운드 완전 보강체를 이용하여 에멀젼화하고, 마지막은 3 및 6주 후에 불완전 보강체로 에멀젼화하였다. 마지막 부스터하고 8일 후, 채혈하여 15분간 3,000 rpm으로 원심분리(Sorvall SS-34 rotor)하여 혈청을 제조하였다.
항혈청 분액들을 -80℃에 보관하였다. 1차 항체는 HiTrap 1-ml 단백질 G 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)에서 유속 1 ml/분으로 이용하여 친화성 정제하였다. 전체 항혈청을 45 ㎛ 필터 유닛으로 여과한 다음, 1 ml 단백질 G 컬럼에 적용하였다. 컬럼 평형화는 결합 완충액(20 mM Na 포스페이트, pH 7.0) 5-10 컬럼 부피를 이용하여 수행한 다음, UV 280 nm에서 단백질이 검출되지 않을 때까지 동일한 완충액으로 여러번 헹구었다. IgG 분획은 5 ml의 용출 완충액(0.1 M 글리신 HCl, pH 2.7)으로 용출시키고, 25 ㎕의 중화 완충액(1 M TrisHCl, pH 9.0)이 든 시험관 10개에 나누어 담았다. 농도는 분광광도측정으로 측정하였다. 순도는, 12% SDS-PAGE에서 정제된 IgG 분획들의 분액을 분석하고, 실버 염색하여 추정하였다. 감도는 항-토끼 IgG, 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 2차 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다.
부가적으로, 다클론 항체를 제브라피쉬 아세톤 분말에서 인큐베이션하여, 사전흡착시켰다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 돼지 항-토끼 F(ab')2는 Dako (F-0054)에서 입수하였다. Alexa Fluor 647-표지된 염소 항-토끼 IgG는 미국 유겐 Molecular Probe(Invitrogen, catalog nr.A-21244)에서 입수하였고, 바이오틴화된 다클론 돼지 항-토끼 면역글로불린은 Dako (카다로그 번호 E0353)에서 입수하였다.
1차 및 2차 항체의 최적 농도를 종래의 희석 실험으로 정하였다. 다클론 항체를 실시예 1에 기술된 단백질 발현 분석에 사용하였다.
실시예 9: 제브라피쉬에서 LL 동정 및 특정화
4, 6, 12, 24, 48 hpf 및 5 dph의 제브라피쉬 배아로부터 트리졸 공정(Life Technologies)을 제조사의 설명서에 따라 사용하여, 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA의 온전성 및 순도를 포름알데하이드 아가로스 겔에서 에티듐 브로마이드로 염색하여 분석하였다. 28S rRNA : 18S rRNA 비율이 2 - 2.4 : 1이고 검출가능한 DNA 오염이 없는 샘플들만 사용하였다. RNA를 분광광도측정으로 정량하였다. 폴리아데닐화한 mRNA를 Dynal 키트(Invitrogen)를 이용하여 5-10 ㎍의 RNA로부터 분리하였다.
200 U/㎕ TermoScript (Invitrogen)를 이용하여 역전사를 수행하였다. mRNA (0.5 ㎍)을 5분간 72℃로 열처리하고, 냉각시키고, 펠렛화하여, 2.0 mM cDNA 합성 완충액(Invitrogen) 중의 100 ng/㎕ 올리고 dT, 10 μM DDT 및 0.8 U/㎕ RNAse 저해제가 포함된 반응 혼합물 20 ㎕에 첨가하였다. 50℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출, 마이크로스핀 S-200HR 컬럼 통과시키고, 에탄올-석출시켜, 산물을 정제하였다. 유전자-특이적인 LL 프라이머들을 연어 LL 서열(표 3)로부터 설계하였다. PCR 믹스(20 ㎕)에는, cDNA 주형 2 ㎕, 0.4 μM 프라이머(LLF1, LLF2, LLR1, LLR2 및 LLR3), 1x PCR 완충액, 0.5 U Taq DNA 중합효소(Takara) 및 0.2 mM dNTP이 포함된다. PCR 증폭은, 94℃에서 45초 / 58℃에서 45초 / 72℃에서 90초로 이루어진 32회 사이클과, 72℃에서 7분의 최종 연장을 사용하였다. 반응 혼합물은 1.8% 아가로스-TBE 겔과 TBE 완충액(pH 8.3) 중의 0.5 ㎍/ml 에티듐 브로마이드로 분석하였고, 100 bp 래더 DNA 마커(New England Biolabs)를 사용하였다.
제브라피쉬 LL 증폭에 사용한 프라이머
RT - PCR
프라이머 서열 위치(nt) 예상되는 크기 (bp)
LLF1 5'-ATGCAGATCGATGCAGGACTGGG-3'
 94-116 F1/R1 = ~720
LLF2 5'-TGGTTCCCTGAAGCATGTCACTGT-3' 186-209 F1/R2 = ~454
F1/R3 = ~340
LLR1 5'-GAAAGAGAGATCAATGAGTTCGCA-3'
 840-817 F2/R1 = ~655
LLR2 5'-CAAAGACACTACCATCAGTTGCCAC-3'
 595-571 F2/R2 = ~410
LLR3 5'-GTCCGCAGCTGTAGTACTTCACAG-3' 457-434 F2/R3 = ~300
5' RACE - PCR
프라이머 서열 프라이머 서열
GeneRacer 5' 프라이머 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' GeneRacer 3' 프라이머 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'
GeneRacer 5' 네스티드 프라이머 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3' GeneRacer 3' 네스티드 프라이머 5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'
LLR2 5'-CAAAGACACTACCATCAGTTGCCAC-3' LLF2 5'-TGGTTCCCTGAAGCATGTCACTGT-3'
LLR4 5'-AGCCTGGACCCTTGTAGCCAACTGT-3' LLF4 5'-GTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCT-3'
PCR 단편을 표준 프로토콜에 따라 pGEM T-Easy 벡터 시스템 1(Promega, Madison, WI)에 연결하였다.
전기충격에, 40 ㎕의 E. coli DH5α와 pGEM T-Easy 벡터내 연결된 PCR 단편 1 ㎕을 사용하였다. SOC 배지(1 ml)을 첨가하여, 박테리아는 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 재조합 박테리아(200 ㎕)를 표준 LB/암피실린, X-gal, IPTG 아가 플레이트에 접종하고, 블루/화이트 스크리닝을 위해 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 백색 클론 10개를 취하여, 100 ㎍/mL 암피실린이 첨가된 LB 배지에서 5 ml 밤새 배양물로 배양하였다. 플라스미드 정제에 플라스미드 정제 키트(Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하였다. 플라스미드를 증폭시키고, 표준 프로토콜(DNA Sequence Lab, Bergen)을 이용하여 서열분석하였다.
LL의 5'- 및 3'-RACE PCR을, GeneRacer 코어 키트(Invitrogen cat. #45-0168)를 지침서에 사용하여 수행하였다. 총 RNA 2 ㎍을 사용하여, Superscript III (Invitrogen)로 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. 5'- 또는 3'-GeneRacer 프라이머와, 역방향 또는 정방향 유전자 특이적인 프라이머 LLR2 & LLF3(표 3)을 이용하여, 5'- 및 3'-RACE PCR 증폭 1라운드를 수행하였다. 네스티드 5'- 또는 3'-RACE PCR GeneRacer 프라이머 및 네스티드 역방향 또는 정방향 유전자 특이적인 프라이머 LLR4 & LLF4를 사용하여, 네스티드 5'- 또는 3'-RACE PCR 증폭을 실시하였다. 5'- 및 3'-RACE PCR을 위해, 일차 단계로, 5회 주기: 94℃에서 30초 및 72℃에서 1분; 다음 단계로 5회 주기: 94℃에서 30초 및 70℃에서 1분; 3차 단계로 30회 주기: 94℃에서 30초, 68℃에서 45초 및 72℃에서 1분; 최종 연장 단계: 72℃에서 7분. 3단계의 네스티드 5'- 또는 3'-RACE PCR: 1차 단계, 5회 주기, 94℃에서 30초, 72℃에서 2분; 다음 단계, 5회 주기, 94℃에서 30초, 70℃에서 2분; 3단계, 25회 주기 94℃에서 30초, 65℃에서 30도 및 68℃에서 1분; 최종 연장 단계 72℃에서 10분. 증류수에 1:25로 희석한 RACE PCR 유래의 PCR 산물을 네스티스 PCR용 주형으로 사용하였다.
RACE PCR용 프라이머를 표 3에 열거하였다. 단일 PCR 산물을 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하고, JM109 고-효율적인 컴피턴트 E. coli (Invitrogen)의 형질전환을 위해 PCR II Topo 벡터(Invitrogen)에 연결하였다. 재조합 박테리아는 루시아 버타니 아가 플레이트에서 블루/화이트 스크리닝에 의해 식별하였다. 삽입체가 포함된 플라스미드는 프로메가 정제 키트를 이용하여 정제하고, M13 프라이머로 서열분석하였다. LL mRNA 서열을 Blastx 및 Blastp 검색 프로그램을 이용하여 분석하였다.
3세트의 프라이머(표 3 참조)를 조합하여, 연어 LL로 예측되는 크기의 앰플리콘(도 16A)을 증폭하였다. 제브라피쉬 mRNA가 첨가되지 않은 수 블랭크는 음석이었다. 가장 큰 산물(720 bp)을 서열 분석하여, LL이 제브라피쉬에 존재하는지를 입증하였다. 여러가지 위치에 연어 엑손들이 측면으로 위치한 특이적인 올리고뉴클레오티드로 여러가지 크기의 PCR 산물들(도 16A)을 증폭시켰으며, 제브라피쉬 LL과 연어 LL 간에 높은 상동성이 확인되었다. 증폭 반응에 대한 양성 대조군으로, β-액틴을 사용하였다.
5'-RACE PCR로 제브라피쉬 LL의 5'-비번역(5'UTR) 영역의 서열을 명확하게 확인하였다. 수정 후(hpf) 4시간에서 부화 후 5일(dph)까지 mRNA를 사용하였다. 1라운드의 RACE PCR 증폭을 실시하여 매우 약한 생성물을 수득하였다. 모든 단계에서 입수한 이러한 증폭 생성물을, 반응 특이성을 높이기 위해 높은 어닐링 온도(65℃)에서, 1차 RACE PCR 반응의 1:20 희석물로, 2라운드 RACE PCR에 사용하였다. 모든 단계들(도 16B)과 심지어 4 hpf에서 동일한 2개의 생성물(520 및 420 bp)이 제조되었다. 이러한 발생 단계들로부터, 20개 보다 많은 수의 클론들로부터 LL-서열 정보를 입수하였다. 모든 클론들에, 연어 LL에서 확인된 29nt 상류 영역이 포함되어 있는 것으로 확인되었다(도 16C). 또한, 다중 분석을 통해 3'-말단도 서열분석하였고, 연어 루코렉틴에서 확인된 구조와 매우 비슷한(거의 동일한) 구조를 확인하였다. 전장 cDNA 서열을 기초로, 유추한 제브라피쉬 LL-단백질은 NCBI Gene Bank (Acc.nr. FJ 643620)에 수탁하였다. 코딩 서열은, 765개의 뉴클레오티드로 구성된 오픈 리딩 프래임을 포함하여, 1,213 nt로 구성되어 있다. 유추된 제브라피쉬 LL 아미노산 서열에 따르면, 단백질은 255 AA로 이루어져 있는데, 이는 nt 위치 +1(또는 nt 30 - 32; (도 16C))을 번역 개시 코돈으로 감안한 것이다. 또한, LL cDNA는 nt +94에 잠재적인 개시 코돈을 가지고 있다(도 16C). 20개의 제브라피쉬 LL 클론들에서, 전사체에는 +1 위치에서부터 상류로 29개의 nt가 포함되어 있지만, 그 다음 93개의 nt는 포함되어 있지 않았다(nt-서열은 정확하게는 -1에서 +94까지 판독됨: 도 16C). 따라서, 데이타는, 2가지 상이한 LL-단백질들이 번역될 수 있음을 시사한다(도 16C).
제브라피쉬와 연어는 LL 단백질 간에 높은 상동성이 확인되었다. 제브라피쉬 LL은 2종의 연어 LL과 비교하면 하이브리드 구조를 가진다. 확립된 7가지의 LL-분류 기준들 중에서, 4개의 기준에 의해 제브라피쉬 LL은 카테고리 LL-1으로 분류되지만, 2개의 기준으로는 카테고리 LL-2로 분류된다(도 16E). 7가지의 기준은 제브라피쉬 LL에서만 유일하다(도 16E, 박스친 부분). 또한, 엑손 3에는 Cys 하나가 생략되어 있고, 서열 "nmnTPYClts"에 Arg으로 치환되어 있어, 제브라피쉬에서는 "nmnDTPRlts"로 읽힌다. 결론적으로, 제브라피쉬 LL에는 시스테인이 5개 있지만, 연어는 모두 이황화 결합할 것으로 예측되는 6개의 시스테인을 포함하고 있다.
다양한 엑손들과 관련하여, 엑손 1은 동일하지만, 제브라피쉬 엑손 2에는 연어에서는 발견되지 않은 독특한 3개의 AA를 가지고 있다(# 57 & 58 위치에 Ser-Gln 대신 Gly-Arg, # 78 위치에 Ile 대신 Val). 엑손 3에는 4개(또는 2?)의 변형된 잔기가 있다. 엑손 4 및 5에는, 3곳의 분류 사이트 외에는 차이가 없다. 즉, 분류 사이트 이외에, 제브라피쉬 LL(총 255개의 AA)에는 독특한 AA가 5(또는 7)개 있다. 제브라피쉬 LL은 연어 LL에 비해 고도로 보존적이어서, 약간의 % 수준으로만 차이가 있다.
제브라피쉬 LL (도 16D, E)이 연어 LL와 가장 비슷하다. 제브라피쉬 LL에는 연어 LL에서 확인된 6개의 Cys 중 하나가 없어, 2개의 이황화 결합만을 포함할 수 있는데: 하나는 N-말단과 C-말단을 연결하고 있으며, 또한 엑손 4에서 내부 결합을 형성하고 있다. 연어 LL과 큰 제브라피쉬 LL을 비교하면(도 16E), 연어에서 확인되는 전형적인 구조적 변형은 제브라피쉬 LL 구조에 의해 강화된다. 한가지 기본적인 차이가 관찰되지만(# 131 잔기), 연어 LL에서 변이가 나타난 위치는 대부분 보존적인 치환이다. PVF에서, LL은 면역보호 기능을 수행할 수 있다. LL 구조에서의 제한된 변형은 이러한 기능과 관련있을 수 있다. 절단형(truncated) 루코렉틴(tLL)에는 분비 펩타이드가 생략되어 있어, tLL (도 16D)은 분비되지 않는 것으로 생각되며, tLL은 4부위-돌출형의 β-프로펠러 단백질일 수 있다. 다른 LL-단백질들은 이론상 다른 세포 기능을 수행할 수 있다. tLL의 기능은 렉토사이트가 아닌 다른 세포에서 기능할 수 있다.
실시예 10: 연어에서의 LL 유전자의 분리 및 특정화
BAC 라이브러리의 스크리닝
루코렉틴 유전자의 게놈 구조를 입수하기 위해, 연어 게놈 프로젝트(Oslo, Norway)를 통해 이용가능해진 공공의 연어 게놈 BAC 라이브러리(18x 커버리지, 평균 삽입체의 크기는 약 188 kb)를 스크리닝하였다. 대서양 수컷 연어의 노르웨이 양식 균주로부터 구축된 중복도가 높은(highly redundant) 박테리아 인공 염색체(BAC) 라이브러리로부터, LL 양성 클론을 스크리닝하였다. 라이브러리는 총 305,557개의 클론으로 구성되어 있다. 라이브러리의 평균 삽입체 크기는 188 kbp로, 18x 게놈 커버리지를 갖는다. 2세트로 스팟팅되어 있으며, 각각 18,432개의 클론으로 구성된, CHORI-214 고밀도 필터 Seg. 1 (필터 세트-007193)을 혼성화 스크리닝을 위해 제작하였다.
라이브러리를 스크리닝하기 위해, 정방향 프라이머 LL/F 5'-TACGGACACAGGTCGAATCCCCTACTACC-3'와 역방향 프라이머 LL/R 5'-ACAGAGAAGAGGCTAATGTGTGCAC-3'를 이용한 PCR 방법에 의해 디옥시게닌-11-dUTP (Roche)를 혼입함으로써, 620 bp LL-특이 cDNA 프로브를 제조하였다. DIG-표지된 cDNA 프로브는 95℃에서 10분간 인큐베인션한 다음, 즉시 얼음 위에 5분간 둔 다음, 혼성화 완충액(5x SSC, 50% 포름아미드, 0.02% SDS, 2% 차단제 (Roche), DEPC-처리한 물)을 첨가하였다.
혼성화는 혼성화 시험관에서 55℃ 조건에서 밤새 수행하였다. 혼성화 후 세정 단계는 2x SSC + 0.1% SDS, RT의 저엄격 조건에서 각각 15분씩 2번, 그리고, 0.1x SSC + 0.1% SDS, 65℃의 고엄격 조건에서 각각 20분씩 2번 수행하였다. 필터를 말레산 완충액 (pH 7.5)과 1% 차단제(Roche)가 포함된 차단 용액에서 인큐베이션한 다음, 항-Dig-알카리 포스파타제(AP)가 접합된 항체(Roche)가 1:10,000으로 희석된 차단 용액에서 1시간 동안 RT로 인큐베이션하였다. 150 mM NaCl 및 0.5 % Tween 20이 포함된 0.1M 말레산 완충액(pH 7.5)으로 막을 세정한 다음, 검출 완충액(0.1 M TrisHCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5, RT)에서 2분간 평형화하였다. 양성 신호를 나타내는 2세트의 동일한 스팟들을 기질로 CSPD (Roche)를 이용한 화학발광 분석으로 가시화하였다. 양성 신호는 이 필터를 X- 레인 필름(Kodak)에 노출시켜 동정하였다. 노출 시간은 3 내지 15분으로 다양하였다. 선별한 양성 클론 2종, L-7/257 및 A-12/144를 준비한 아가 플레이트에 도말하여, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 클론 3개를 취하여, LB 배지가 든 5 ml 교반 배양기에서, 20 ㎍/ml 클로람페니콜을 첨가하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 울트라퓨어 DNA 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 그 후, BAC DNA를 Not I으로 자르고, PFGE(Pulse Field electrophoresis)(Osoegawa et al ., 1998, Genomics, 52, pp. 1-8)로 분석하였다. 저범위 PFG 마커(New England Biolabs)와 λ-Hind III 단편(Takara)을 DNA 크기 마커로 사용하였다.
양성 클론의 PCR 검증
주형으로 정제된 BAC DNA를 사용하고, 유전자 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응물은, 95℃에서 3분간 둔 다음, 35 사이클: 95℃, 30초 -> 어닐링, 54℃에서 30초 -> 연장, 72℃에서 30초 후, 72℃에서 10분간 마지막으로 인큐베이션하였다. 온도 손환을 거친 후, 각 PCR 반응물 2 ㎕를 1.5% 아가로스 겔에서 분석하였다.
루코렉틴 BAC 클론의 샷건 서열분석
독일 베를린에 위치한 MRW에서 클론 2개의 서열을 분석하였다. 벡터 삽입체는 예측 중복도 2.4x로 서열분석되었다. 판독시, 벡터와 숙주의 인자들은 배제하였다. 약 180번의 판독으로, 2개의 BAC 클론으로부터 바이오인포메틱스를 이용하여 각각 33 및 22개의 콘틱(contig)을 확보하였다. 이들 콘틱은 mRNA 서열과 아미노산 서열 둘다를 평가하였다. 프로그램 검색 및 매뉴얼 검사 두가지 방법에 의한 분석으로 엑손과 인트론들을 동정하였다. 전체 LL 유전자는 중첩되는 콘틱들로부터 동정하였다.
게놈 구조
상기 스크리닝의 결과로, BAC 라이브러리 명명법에 따라 A-12/144, L-16/143, P-6/76, B-5/70, O-20/85, L-7/257 및 F-7/176으로 명명된 7개의 특이 클론들을 동정하였다. 게놈 BAC 클론의 평균 삽입체 크기는, 선별한 모든 BAC 클론으로부터 DNA를 정제한 다음 Not I 제한 효소로 절단하여, 예측하였다. 벡터가 포함된 DNA 절단 산물은 펄스 필드 겔 전기영동에 의해 분리시킨 다음, 에티듐 브로마이드 염색으로 가시화하였다. BAC 클론 모두 2개의 밴드만 나타내었는데, 벡터(pTARBAC2.1) 크기는 ~13 kbp (13,397 bp; Osoegawa et al ., 1998, supra)이었다. 모든 클론의 삽입체 크기는 ~25 kbp인 것으로 제안되었다. 7가지의 선별된 BAC 클론들 중 6개의 서열을 BAC 클론으로부터 정제한 주형 DNA를 LL 유전자 특이 프라이머로 증폭시켜, 한번 더 검증하였다. PCR 증폭으로 이들 클론들 모두에서 ~600 bp의 산물이 수득되었다. 이의 정체는 직접적인 서열분석에 의해 추가로 확인하였다.
2종의 BAC 클론의 샷건 서열분석
서열 조합 프로그램인 BioEdit 및 Dna Baser를 모든 세포 데이타에 사용하였다. 분석을 통해, 분리된 25 kbp BAC 클론 2가지 모두, mRNA 서열과 단백질 서열 2가지에 대해 스크리닝하였을 때, (벡터 서열 인자를 배제한 후) 완전한 루코렉틴 mRNA 서열을 포함하고 있는 것으로 확인되었다. BAC 클론들 중 하나의 클론의 데이타는 총 80 리드(read)를 나타내었고, 이는 33개의 콘틱으로 조립되어 있었다. 이들 중, 6개 이상의 콘틱에는 LL-서열들이 포함되어 있어, 전체 LL 유전자의 재구성이 가능하였다. LL 서열 외에도, 이들 콘틱에서는 다른 구성 성분들도 고도로 필연적으로 자주 동정되었는데, 역전사효소, 이온성 펩티아제 및 이동성 인자들이 포함된다.
LL 게놈 유전자 구조의 특징
1차 분석에서, 클론들 중 오직 하나(L7/247)에서는 전체 LL-유전자의 동정이 가능하였으며, 다른 클론(A12/144)에서는 대부분의 게놈 구조가 확인되었다(도 16). 게놈 클론 L7/247의 데이타로부터, 유전자가 4개의 인트론이 사이에 위치한 5개의 엑손으로 구성되어 있으며, TATA-박스에서 시작하여 ~2.3kbp에 이른다는, 루코렉틴의 게놈 구조가 제안되었다. 게놈 LL 서열에서, TATA 박스가 ATG 개시 코돈으로부터 -81번 위치(TATAAAA)에서 시작되는 것으로 확인되었는데, 이는 mRNA의 81 nt 5'UTR(비번역 인자)이다. 정지 코돈 TAG는 게놈 서열에서 ATG로부터 약 1850 nt에 위치하고 있다. 6 nt 길이의 폴리아데닐화 신호 AATAAA는 ATG로부터 약 2,250 위치에서 시작한다. 3' UTR은 정지 코돈 TAG 다음에서 시작되는 약 400 nt 길이의 서열이다. 81 nt로 구성되는 5' UTR을 포함하여, LL-유전자의 크기는 통례적인 정의에 따라 적어도 ~2.3kbp인 것으로 추정되며, 인트론은 엑손 보다 서열이 2배 더 긴 것으로 보인다. 엑손-인트론의 경계를 루코렉틴 유전자에서 검증하기 위해, 확립된 게놈 인트론 서열로부터 PCR 프라이머를 설계하고, 이를 사용하여 연어 배야 DNA로부터 각 엑손을 증폭시켰다. 이들 5개의 엑손 서열들은 앰플리콘의 직접 서열분석에 의해 유래된 것이며, 모두 확립된 게놈 서열에 부합되었다.
코딩 엑손의 크기는 꽤 명확한 것으로 나타났으며, 55 bp (엑손 1) 내지 234 bp (엑손 2)으로 다양하였다. 특히, 2개의 인트론이 상대적으로 작아, 실제 길이는 데이타의 매뉴얼 판독으로부터 유추할 수 있었다. 반면, 인트론 3은 약 250 nt이지만, 인트론 4는 약 700 bp이었다. 인트론 4의 실제 길이는 이용가능한 데이타에서는 알 수 없었다. 컴포지트 엑손 서열 데이타로, 예상되는 번역 산물, 즉 255 AA 단백질을 확인하였다.
또한, 데이타를 통해, 기술된 루코렉틴 변이체 2가지 중 하나에서, 엑손 5개와 인트론 4개로 이루어진 게놈 LL 유전자 구조가 뒷받침되었다. 분비된 LL 단백질의 N-말단 AA 잔기는 정제된 LL의 에드만 직접 분해에 의해 트립토판인 것으로 확증되었다. 이 Trp-잔기는 255 AA 전구체 단백질에서 N-말단 메티오닌으로부터 #20 위치에 있으며, 그 앞에 아미노산 # 18 (His)과 # 19 (Ala)이 위치한다. 프로세싱 프로테아제에 대한 절단부는 Ala과 Trp 사이인 것으로 예측되며, 이로써 분비형 LL 단백질이 제조된다. 직접적인 에드만 분해를 통해, 이 분비형 LL의 서열을 WDCQE VVNIK NLMQI DAGLG Q-V로서 확정하였으며, 또한 다중 가상 단백질 서열에 의해 검증하였다. 엑손은 모두 인-프래임은 아니지만, 잠재적으로 모든 리딩 프래임을 파괴하지 않으면서 일부 엑손을 생략(skipping)할 수 있다. 게놈 서열 분석에서, 엑손/인트론 경계부의 서열이 확인되었다. 그러나, 인트론 서열 측면에 비표준 nt가 위치되어 있을 수 있는 인트론 4는 예외였다. 인트론 1, 2 및 3에서, 다수의 척추동물 인트론의 개시부와 종결부 옆에 존재하는 공통적인 GT//AT 특징이 확인되었다(Shapiro and Senepathy, 1987, Nucleic Acids Research, 15, pp. 7155-7174).
엑손 1 (19 AAs)은 55 nt 길이이며, 서열은 M R ATA - AVLLV - LCLLT- ISH(A)이고, 분비형 루코렉틴의 N-말단 트립토판 앞에 있는 Ala # 19 잔기 코돈 중 첫번째 G에서 끝난다. 진한 이탤릭체로 나타낸 대문자 R은 루코렉틴-3 유전자에 어쩌면 연결된 그 위치에서의 변이체 AA를 의미한다(도 17). 게놈 유전자 서열은 뉴클레오티드 GT에서 인트론 1 개시부까지 이어진다. 인트론 1은 엑손 II가 다음으로 오는 뉴클레오티드 AG에서 끝나며, 엑손 II에는 #19 Ala 코돈의 뒤부분 2개의 염기(-CA)와, 그 다음으로, 루코렉틴의 N-말단인 #20 Trp의 TGG 코돈이 포함된다. 인트론 1은 89 nt 길이이다.
엑손 2(234 nt)는 77 AA (234 - 2 nt / 3 = 77 AA + 1 nt)를 포함한다. 여기에서, 게놈 서열은 (ala) - WDCQEVVNIK - NLMQI DAGLG - QVVAT DTSQI - PYYLV G* DKWI - RL* PGS LKHIT - VGPAG IWGVN -KDYAI YKYVA - GNWVQ AA (G) (= 77 AAs + 1 nt)을 번역하며, 다음으로 뉴클레오티드 GT(인트론 2내)가 이어진다. *은 LL 단백질이나 또는 LL cDNA의 복수의 서열들 중 어느 하나에서 대체가능한 AA가 확인된 잔기를 표시한다(도 17). G*은 루코렉틴-1에서 바뀌는 것으로 보이며, L*은 루코렉틴-2에서 바뀌는 것으로 보인다. 인트론 2의 길이는 186 nt이고, 뉴클레오티드 AG에서 끝난다.
엑손 3 (72 AA)은 GC(= Gly, 잔기 # 78)인 뉴클레오티드 2개 다음부터 시작하여, 다른 216 nt(총 218 nt) 또는 72 AA까지 이어진다. 엑손 3의 아미노산 서열은 (G)LL* KQL DAGGE - QFIVG ANMN* D TPYCLTSSAT - VGYKG PGSPL - PWTGL PGAVK - YYSCG P* FGCW - AVNKN DDIYL - MS이며, 이때 잔기 #150은 S이다. 진한 글씨와 밑줄 친 3개의 대문자는, 루코렉틴-1과 루코렉틴-2를 구분하게 하는 변이체 AA이다. * 표시된 문자는 즉 그 위치에 작은-변이가 있는 잔기를 의미한다(루코렉틴-2에서 N*; P*은 루코렉틴-1과 루코렉틴-2 둘다에서의 작은-변이를 의미함)(도 17). 뉴클레오티드 GT에서 시작되어, 다음번 ~250 nt로 이어지는 인트론 3이 다음 차례로 위치한다.
엑손 4 (39 AA)는 AA 잔기 #151에서 시작되는 LNQDC QNKGW - SHIE* G KLSMI - EVATD GSVFG - VNSA* GSVYT이며, T는 # 189 잔기이다. 즉, 진한 글씨의 밑줄 친 잔기는 루코렉틴-1과 루코렉틴-2를 구별할 수 있게 하는 것이며, *은 이 위치에 작은-변이가 있음을 의미한다(루코렉틴 2가지에서 위치 E*에서 확인되며, 루코렉틴-2는 위치 A*에서만 나타남). 인트론 4는 아마 인트론-한정에서의 표준적인 nt-서열로 시작 및 끝나지 않을 수 있다. 인트론 4에 대한 데이타는 따라서 일부 임시이며, 그래서 인트론 4의 길이는 추정치 (~700 nt)이다.
엑손 5 (47 AA)는 R 코돈(= 잔기 # 190)에서 시작하며, C-말단 히스티딘(#236 잔기)까지 이어지는데, 다음으로 정지 코돈 TAG와 3' UTR이 온다. 서열은 RDGIT-ASKPE-GTGWS-NIPMG*-MLMGHVTYDL-GRLWV-V S KSAV-TMVCT-H로 번역되며, *은 루코렉틴-1에서 이 위치에서의 작은-변이를 의미한다. 진한 문자는 루코렉틴-1과 루코렉틴-2 간의 차이를 나타낸다. 진한 이탤릭체 문자는 루코렉틴-3의 존재 가능성을 나타낸다. 이러한 데이타를 도 17에 종합하여 나타내었다.
실시예 11: 루코렉틴 -1 게놈 서열과 루코렉틴 mRNA 서열의 비교
연어 cDNA에 대한 12회 이상의 각각의 클로닝 및 서열분석 실험과 더불어, 서열 정렬을 통해, 7곳의 위치만, 점유된 여러가지 아미노산 잔기들에 대한 확실한 선택부(alternative)인 것으로, 확인되었다. 전체 서열의 변이가 거의 없고, 이러한 변이가 전형적으로 한정되어 있다는 점이 주목할만한 부분이었다.
L-7/247의 게놈 서열은 루코렉틴-1으로 분류된 루코렉틴 클론에 부합되었다. 루코렉틴-2로 명명된 서열분석된 다른 cDNA는, 지적한 7곳의 위치가 상이하였다. 이러한 위치 외에도, AA에 일부 다른 변이도 나타났다. 이는 분류된 2가지 cDNA에 대한 추가적인 미소-이종성(micro-heterogeneity)을 시사하는 것일 수 있지만, 예컨대 #226 위치에서 어떠한 루코렉틴-1 또는 루코렉틴-2 cDNA에서도 관찰되지 않았던 타이로신 잔기가 일부 클론들에서 확인되었기 때문에, 상기한 데이타는 제3의 카테고리의 LL cDNA가 존재할 수도 있음을 시사하는 것일 수 있다(도 17).
관찰된 변이를 종합하여 도 17에 나타내었다. 2가지 타입의 루코렉틴은, 성숙형 루코렉틴에 대한 유추된 AA 서열에서, 7곳의 위치가 각각 (E, I, Y, Y, K, A, V) 대 (N, V, F, F, N, G, G)으로 특징적이었다. 이들 7곳의 위치는 이들을 2가지 루코렉틴으로 명확하게 분류해주며, 또한 도 17에 *로 표시한 전형적인 위치에서도 미소-변이가 나타날 수 있다. 도 17의 데이타가 나타내는 바와 같이, 일부 mRNA 서열에서는 루코렉틴-1 & 2에서는 보이지 않는 LL 신호 펩타이드의 #2 위치에 위치한 고유한 Gly가 확인되는데, 이에 루코렉틴-3일 가능성을 시사한다. 또한, 루코렉틴-1 &2에서는 오직 Ser만 보이는, 성숙형 루코렉틴내 #226 위치에서는 Tyr이 관찰되었다. L7/247의 게놈 서열은 연어 유래 LL cDNA의 다중 서열분석에 의해 찾은 루코렉틴-1 서열에 부합되는 것으로 결론지어 졌다. 또한, LL BAC 클론의 서열분석으로, 다른 주류 루코렉틴-2 카테고리가 확인되며, 어쩌면 상기 잔기-기준에 따른 정의에 의해 루코렉틴-3의 존재 가능성도 의심될 것이다.
실시예 12: 다른 종들에서의 루코렉틴 단백질의 검출
레인보우 송어(Oncorhyncus mykiss), 대구 및 오이코플레우라 디오이카(Oikopleura dioica)의 부화 체액에서, 루코렉틴 단백질의 존재를 조사하였다. 부화 체액 유래의 단백질을 친화성 크로마토그래피로 분석하여 준비하고, 15% SDS-PAGE로 분석하였다. 겔은 실버 염색하여 다양한 단백질의 존재를 확인하거나, 또는 블롯팅하여 연어 루코렉틴 항체로 탐침하였다. 각각의 경우에서, 단일 단백질 ~26kDa이 검출되었는데, 이는 루코렉틴의 분자량과 일치되었다(도 18 (레인보우 송어), 19A (대구) 및 19B (오이코플레오라 디오이카)).
서열:
1: (연어 배아 유래의 루코렉틴 폴리펩타이드):
MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSAVTMVCTH
2: (연어 백혈구 유래 루코렉틴 폴리펩타이드):
SIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLPKQLDAGGEQFIVGANMDDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNNGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMCMLMGHVTYDLGRLWVVSKSAVTMVCTH
3: (대구 백혈구 유래 루코렉틴 폴리펩타이드):
LVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRD
4: (닭 백혈구 유래 루코렉틴 폴리펩타이드):
IPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVV
5: (인간 백혈구 유래 루코렉틴 폴리펩타이드):
MRATAAVLLVLCLLTISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTGRIPYYLVGDKWIRLPGSLKHVTVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYRLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSGGTMVCTH
6: (제브라피쉬 유래 루코렉틴 폴리펩타이드):
MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGNQFIVGANMNDTPYRLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVTKSGGTMVCTH
7: (연어 유래 루코렉틴-2 폴리펩타이드):
MRTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGNQFVVGANMDDTPFCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGHFGCWAVNKNDDIFLMSLNQDCQNNGWSHIDGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVSKSGGTMVCTH
8: (연어 유래 루코렉틴-3 폴리펩타이드):
MGTTAAFLLVLCLLAISHAWDCQEVVNIKNLMQIDAGLGQVVATDTSQIPYYLVGDKWIRLPGSLKHITVGPAGIWGVNKDYAIYKYVAGNWVQAAGLLKQLDAGGEQFIVGANMNDTPYCLTSSATVGYKGPGSPLPWTGLPGAVKYYSCGPFGCWAVNKNDDIYLMSLNQDCQNKGWSHIEGKLSMIEVATDGSVFGVNSAGSVYTRDGITASKPEGTGWSNIPMGMLMGHVTYDLGRLWVVYKSAVTMVCTH
9: (인간 혈액 유래 루코렉틴 cDNA 서열):
ATGAGAGCCACTGCAGCCGTCCTATTGGTCCTCTGTCTCCTGACCATCAGTCATGCATGGGACTGTCAGGAGGTAGTAAACATCAAGAATCTGATGCAGATCGATGCAGGACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAGGTCGAATCCCCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATGTCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCCTTCTGAAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGATACTCCATACCGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGCTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTACTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTCTGGCGGCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGTTCGGGATCTGTCTAAAGTTCACTTGCGAACTCATTGATCTCTCTTTCTGGAAAAGCCTTTAGTTCATTAGTTCATAAAAATCCTTCATTTTAAAACCTATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATTATCTTATTGCCATTTAAAAAAATATCAATGAAGATGTTATATTTTCTTGACCACTCCTTGATTAACACTTCAATAGATCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAGTGTAGTGTAAACTAGGGCATGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTTTGCTGTGCTTCAGAGGTCATCAATAGGATTGGATGGAATCCTTGTCATTGTTTATTATCTCATTATATAAACATTTCCTGCAAAAATAAAGCATTCATTTTGAAACTATTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAN
10: (성숙형 연어의 게놈 DNA 라이브러리 유래의, 연어의 루코렉틴 유전자 서열):
TGTGCAGGGCTATAAAAGCGCAAAGTCTTCCAATGGGACAATTGAAGTCTGGTGTACAACCAAACGTATACTGTAGATCTACATAGACATCATGAGAGCCACTGCAGCCGTCCTATTGGTCCTCTGTCTCCTGACCATCAGTCATGGTAAGTTACCATCATCTGAAACATGCTTGATCAACTTGGAGTTGAAGTTTTTCTTGGTATACTCTACTCATATGTCTTTGTCTCCATAGCATGGGACTGTCAGGAGGTAGTAAACATCAAGAATCTGATGCAGATCGATGCAGGACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGTAAGTGGAGAGCATTACTCAATATTTATCCAGAGGACACCTGCTTATTAGCTTTCCTGATACCATCAGGCTGTTGAAAAAAACGATTGATGTTTTAAATTGTAACTTGTAGGTAATTTGGCAGTACTCCTTGTTTGCTTGTCTGTCTGTCTTTGTGGTCTTGGCCTTCTGAAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGATACTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGCTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTA
CTTAATGAGTGTAAGATCTGGGAAAGAGTGGGAGAGCTGGAGTAGAGTAGTAGAGGATGGAGAGTGTCAGTTATTTTAAAACTGTTTCATATTATAACTGTTGAAATTGTCCTAAAACCCTGATTGTATCATTTTGTTTCCAGCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCCAGGTAAGGTTGCTACTGAACTATGTGTATGGTCCACCACCCCCCCCCCCCCAACAGTATTAACTTGAAAATGACTTGTAATAATAACTTAGAATAATAATGGTATACCCTTTAATTATAACTCTGATCCTTACAGTACATGCTATGTGAATCTCCTTACACAAAAACTAAATATTGTAGGTACATAAATAAAATCAGTTAAATATAATCAGATCTAAACTTATAGGACTTATTAAGAAATGTGTAGACAGTGTATGATAAAATATGTAAAAGTTGGATGTCCTGTAAAGCTACAGTTTGGGATAAAAAACAACAACTTCCCAGACACCCCACCACTTGTTCTGGTAAACAGCTGAGGAATGTAGTTAGAGAAATGTAACCACTCTCACATTCATACATGGAGCTACGGATGCAAAGACACAACAATTTTTTTATTAAAAAAAAAAAAATGTTTATATTTTCTTTTAAAGCTAAACATTGTTTGTTTACAATAACATTGTTTACAAACAATTGAGTAAAAGCTTACATTTTGGCTTCTAATGTGGTTGAATAAAGCTCAAGATGCAGAAGTTATATTCTTCAAAAATCTATGGCTATATTTAATTATTAAAGTCCAAAAATGGATGTACTTAAAAAAAATGGATAAGCTTTAAAACATGAACCCCAACCCTTTCTTCAACACAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTCTGGCGGCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGTTCGGGATCTGTCTAAAGTTCACTTGCGAACTCATTGATCTCTCTTTCTGGAAAAGCCTTTAGTTCATTAGTTCATAAAAATCCTTCATTTTAAAACCTATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATTATCTTATTGCCATTTAAAAAAATATCAATGAAGATGTTATATTTTCTTGACCACTCCTTGATTAACACTTCAATAGATCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAGTGTAGTGTAAACTAGGGCACGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTTTGCTGTGCTTCAGAGGTCATCAATAGGATTTGACGGAATCCTTGTCATTGTTTATTATCTCATTATATAATCATTTCCTGCAAAAATAAA
11: (200-450 일령의 연어 배아 유래의 루코렉틴 cDNA 서열 - 엑손만 있음):
ATGAGAGCCA CTGCAGCCGT CCTATTGGTC CTCTGTCTCC TGACCATCAG TCATGCATGG GACTGTCAGG AGGTAGTAAA CATCAAGAAT CTGATGCAGA TCGATGCAGG ACTGGGGCAA GTGGTTGCTA CGGACACAAG TCAAATCCCC TACTACCTGG TAGGTGATAA ATGGATCCGT CTGCCTGGTT CCCTGAAGCA TATCACTGTA GGACCAGCAG GGATCTGGGG TGTCAACAAG GACTATGCAA TCTACAAGTA TGTGGCCGGT AACTGGGTTC AAGCTGCAGG CCTTCTGAAA CAGTTGGATG CTGGAGGTGA ACAGTTTATT GTGGGGGCTA ACATGAACGA TACTCCATAC TGTCTGACAA GTAGTGCCAC AGTTGGCTAC AAGGGTCCAG GCTCACCCCT TCCATGGACA GGATTGCCAG GAGCTGTGAA GTACTACAGC TGCGGACCCT TTGGGTGCTG GGCAGTCAAC AAGAATGATG ATATCTACTT AATGAGTCTG AATCAAGACT GCCAAAACAA GGGGTGGAGT CACATTGAAG GCAAGCTTTC CATGATTGAG GTGGCAACTG ATGGTAGTGT CTTTGGGGTC AACTCTGCGG GTAGTGTTTA TACCAGAGAC GGCATCACAG CCAGTAAACC AGAGGGCACC GGATGGAGCA ATATCCCAAT GGGCATGCTC ATGGGCCACG TGACCTACGA CCTGGGCCGT CTTTGGGTCG TCTCCAAGTC TGGCGGCACC ATGGTGTGCA CACAT
12: (연어 백혈구 유래의 루코렉틴 유전자 서열):
ACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCGTTCCGAAACAGTTGGATGCTGGAGGTAACCAGTTTGTTGTGGGGGCTAACATGGACGATACTCCATTTTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGCTGCGGACACTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATTTTCTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAACGGGTGGAGTCACATTGATGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTCTGGCGGCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGT
13: (대구 유래의 루코렉틴 유전자 서열):
CAATCCCCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCCTTCTGAAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGATACTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGCTGCGGACCCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTACTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGAC
14: (닭 유래의 루코렉틴 유전자 서열):
CAGGACTGGGGCAAGTGGTTGCTACGGACACAAGTCAAATCCCCTACTACCTGGTAGGTGATAAATGGATCCGTCTGCCTGGTTCCCTGAAGCATATCACTGTAGGACCAGCAGGGATCTGGGGTGTCAACAAGGACTATGCAATCTACAAGTATGTGGCCGGTAACTGGGTTCAAGCTGCAGGCCTTCTGAAACAGTTGGATGCTGGAGGTGAACAGTTTATTGTGGGGGCTAACATGAACGATACTCCATACTGTCTGACAAGTAGTGCCACAGTTGGCTACAAGGGTCCAGGCTCACCCCTTCCATGGACAGGATTGCCAGGAGCTGTGAAGTACTACAGCTGCGGACGCTTTGGGTGCTGGGCAGTCAACAAGAATGATGATATCTACTTAATGAGTCTGAATCAAGACTGCCAAAACAAGGGGTGGAGTCACATTGAAGGCAAGCTTTCCATGATTGAGGTGGCAACTGATGGTAGTGTCTTTGGGGTCAACTCTGCGGGTAGTGTTTATACCAGAGACGGCATCACAGCCGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGGGCATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCT
15: (제브라피쉬 유래의 루코렉틴 게놈 서열 일부):
NNAAAANNTAAAATANNGTAGGTACANNNNAAATCAGTTAAATATAATCAGATNTAAANTTNTAGGACTATTAAGAAATGTGTAGACAGCGTACGATAAAATATGTAAAAGTTGGATGTCCTGTAAAGCTACAGTTTGGGATAAAAAACAACAACTTNCCAGACACCCCACCACTTGTTNTGGTAAACAGNTGAGGAATGTAGTTAGAGAAATGTAACCANTCTCACATTCATACATGGAGTTACGGATGCAAAGACACAACAATTTTTTGTTTACATTNTTTTTAACATGTTTTTTAAAGCAATACACATTGTTTGTTTACAATAACATTGTTTACAAACAATTGAGTAAAAGCTTACATTTTGGCTTCTGTGTGGTTGAAATAAAGCTCAAGAGGCAGAAGTTATATTCTTCAAAAATCAATGGCTATATTTAATTATTAAAGTTCCAAAAAGGATGTACTTAATAAAATGGATAAGCTTTAAAACATGAACCCCAACCCTTTCTTCAACACAGAGACGGCATCACAGCCAGTAAACCAGAGGGCACCGGATGGAGCAATATCCCAATGTGTATGCTCATGGGCCACGTGACCTACGACCTGGGCCGTCTTTGGGTCGTCTCCAAGTCTGCCGTCACCATGGTGTGCACACATTAGCCTCTTCTCTGTAGCTGAAGGCCGTTCGGGATCCGTCCAAAGTTCCCTGGCGAACTCATTGATCTCTCTTTCTGGAAAAGCCTTTAGTTCATAAAAATCCTTCATTTTAAAACCTATTGCTCTACCTATTATTTTCAGTTCTTCAATGATCTTATTGACATTTAAAAAAAATATCATTGAAGATTTTATATTTTCTTGACAACTCCTAGATTAACACTTCAATAGACCTTTGCCATGGAGGCTATTTAAGTGTAGTGTAAACTAGGGCACGGTCATGTTGCTCACAATCCACATGGGTTTTGCTGTGCTTCAAAGGTCATCAATAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTNGGATGCATAAG
SEQUENCE LISTING <110> Walther, Bernt Th Miftari, Mirushe H <120> Product and uses <130> 42.20.98089/01 <150> GB0819883.0 <151> 2008-10-29 <160> 38 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 255 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 1 Met Arg Thr Thr Ala Ala Phe Leu Leu Val Leu Cys Leu Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ser His Ala Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met 20 25 30 Gln Ile Asp Ala Gly Leu Gly Gln Val Val Ala Thr Asp Thr Ser Gln 35 40 45 Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser 50 55 60 Leu Lys His Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val Gly 100 105 110 Ala Asn Met Asn Asp Thr Pro Tyr Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val 115 120 125 Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly 130 135 140 Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn 145 150 155 160 Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn 165 170 175 Lys Gly Trp Ser His Ile Glu Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val Ala 180 185 190 Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr 195 200 205 Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser Asn 210 215 220 Ile Pro Met Gly Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly Arg 225 230 235 240 Leu Trp Val Val Ser Lys Ser Ala Val Thr Met Val Cys Thr His 245 250 255 <210> 2 <211> 208 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 2 Ser Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys His Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn 20 25 30 Lys Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala 35 40 45 Ala Gly Leu Pro Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val 50 55 60 Gly Ala Asn Met Asp Asp Thr Pro Tyr Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr 65 70 75 80 Val Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro 85 90 95 Gly Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val 100 105 110 Asn Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln 115 120 125 Asn Asn Gly Trp Ser His Ile Glu Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val 130 135 140 Ala Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr 145 150 155 160 Thr Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser 165 170 175 Asn Ile Pro Met Cys Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly 180 185 190 Arg Leu Trp Val Val Ser Lys Ser Ala Val Thr Met Val Cys Thr His 195 200 205 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Gadus morhua <400> 3 Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser Leu Lys His Ile 1 5 10 15 Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys Asp Tyr Ala Ile 20 25 30 Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala Gly Leu Leu Lys 35 40 45 Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val Gly Ala Asn Met Asn 50 55 60 Asp Thr Pro Tyr Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val Gly Tyr Lys Gly 65 70 75 80 Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly Ala Val Lys Tyr 85 90 95 Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn Lys Asn Asp Asp 100 105 110 Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn Lys Gly Trp Ser 115 120 125 His Ile Asp Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val Ala Thr Asp Gly Ser 130 135 140 Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr Arg Asp 145 150 155 <210> 4 <211> 196 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 4 Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys His Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys 20 25 30 Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala 35 40 45 Gly Leu Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val Gly 50 55 60 Ala Asn Met Asn Asp Thr Pro Tyr Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly 85 90 95 Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn 100 105 110 Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn 115 120 125 Lys Gly Trp Ser His Ile Asp Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val Ala 130 135 140 Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr 145 150 155 160 Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser Asn 165 170 175 Ile Pro Met Gly Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly Arg 180 185 190 Leu Trp Val Val 195 <210> 5 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Arg Ala Thr Ala Ala Val Leu Leu Val Leu Cys Leu Leu Thr Ile 1 5 10 15 Ser His Ala Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met 20 25 30 Gln Ile Asp Ala Gly Leu Gly Gln Val Val Ala Thr Asp Thr Gly Arg 35 40 45 Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser 50 55 60 Leu Lys His Val Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val Gly 100 105 110 Ala Asn Met Asn Asp Thr Pro Tyr Arg Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val 115 120 125 Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly 130 135 140 Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn 145 150 155 160 Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn 165 170 175 Lys Gly Trp Ser His Ile Glu Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val Ala 180 185 190 Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr 195 200 205 Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser Asn 210 215 220 Ile Pro Met Gly Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly Arg 225 230 235 240 Leu Trp Val Val Ser Lys Ser Gly Gly Thr Met Val Cys Thr His 245 250 255 <210> 6 <211> 255 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 6 Met Gly Thr Thr Ala Ala Phe Leu Leu Val Leu Cys Leu Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ser His Ala Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met 20 25 30 Gln Ile Asp Ala Gly Leu Gly Gln Val Val Ala Thr Asp Thr Ser Gln 35 40 45 Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser 50 55 60 Leu Lys His Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Asn Gln Phe Ile Val Gly 100 105 110 Ala Asn Met Asn Asp Thr Pro Tyr Arg Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val 115 120 125 Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly 130 135 140 Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn 145 150 155 160 Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn 165 170 175 Lys Gly Trp Ser His Ile Glu Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val Ala 180 185 190 Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr 195 200 205 Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser Asn 210 215 220 Ile Pro Met Gly Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly Arg 225 230 235 240 Leu Trp Val Val Thr Lys Ser Gly Gly Thr Met Val Cys Thr His 245 250 255 <210> 7 <211> 255 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 7 Met Arg Thr Thr Ala Ala Phe Leu Leu Val Leu Cys Leu Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ser His Ala Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met 20 25 30 Gln Ile Asp Ala Gly Leu Gly Gln Val Val 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Thr His 245 250 255 <210> 8 <211> 255 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 8 Met Gly Thr Thr Ala Ala Phe Leu Leu Val Leu Cys Leu Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ser His Ala Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met 20 25 30 Gln Ile Asp Ala Gly Leu Gly Gln Val Val Ala Thr Asp Thr Ser Gln 35 40 45 Ile Pro Tyr Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser 50 55 60 Leu Lys His Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Ala Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val Gly 100 105 110 Ala Asn Met Asn Asp Thr Pro Tyr Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val 115 120 125 Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly 130 135 140 Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn 145 150 155 160 Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn 165 170 175 Lys Gly Trp Ser His Ile Glu Gly Lys Leu Ser Met Ile Glu Val Ala 180 185 190 Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr 195 200 205 Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser Asn 210 215 220 Ile Pro Met Gly Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly Arg 225 230 235 240 Leu Trp Val Val Tyr Lys Ser Ala Val Thr Met Val Cys Thr His 245 250 255 <210> 9 <211> 1214 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1214)..(1214) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 atgagagcca ctgcagccgt cctattggtc ctctgtctcc tgaccatcag tcatgcatgg 60 gactgtcagg aggtagtaaa catcaagaat ctgatgcaga tcgatgcagg actggggcaa 120 gtggttgcta cggacacagg tcgaatcccc tactacctgg taggtgataa atggatccgt 180 ctgcctggtt ccctgaagca tgtcactgta ggaccagcag ggatctgggg tgtcaacaag 240 gactatgcaa tctacaagta tgtggccggt aactgggttc aagctgcagg ccttctgaaa 300 cagttggatg ctggaggtga acagtttatt gtgggggcta acatgaacga tactccatac 360 cgtctgacaa gtagtgccac agttggctac aagggtccag gctcacccct tccatggaca 420 ggattgccag gagctgtgaa gtactacagc tgcggaccct ttgggtgctg ggcagtcaac 480 aagaatgatg atatctactt aatgagtctg aatcaagact gccaaaacaa ggggtggagt 540 cacattgaag gcaagctttc catgattgag gtggcaactg atggtagtgt ctttggggtc 600 aactctgcgg gtagtgttta taccagagac ggcatcacag ccagtaaacc agagggcacc 660 ggatggagca atatcccaat gggcatgctc atgggccacg tgacctacga cctgggccgt 720 ctttgggtcg tctccaagtc tggcggcacc atggtgtgca cacattagcc tcttctctgt 780 agctgaaggc cgttcgggat ctgtctaaag ttcacttgcg aactcattga tctctctttc 840 tggaaaagcc tttagttcat tagttcataa aaatccttca ttttaaaacc tattgctcta 900 cctattattt tcagttcttc aattatctta ttgccattta aaaaaatatc aatgaagatg 960 ttatattttc ttgaccactc cttgattaac acttcaatag atctttgcca tggaggctat 1020 ttaagtgtag tgtaaactag ggcatggtca tgttgctcac aatccacatg ggttttgctg 1080 tgcttcagag gtcatcaata ggattggatg gaatccttgt cattgtttat tatctcatta 1140 tataaacatt tcctgcaaaa ataaagcatt cattttgaaa ctattgtaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaan 1214 <210> 10 <211> 2323 <212> DNA <213> Salmo salar <400> 10 tgtgcagggc tataaaagcg caaagtcttc caatgggaca attgaagtct ggtgtacaac 60 caaacgtata ctgtagatct acatagacat catgagagcc actgcagccg tcctattggt 120 cctctgtctc ctgaccatca gtcatggtaa gttaccatca tctgaaacat gcttgatcaa 180 cttggagttg aagtttttct tggtatactc tactcatatg tctttgtctc catagcatgg 240 gactgtcagg aggtagtaaa catcaagaat ctgatgcaga tcgatgcagg actggggcaa 300 gtggttgcta cggacacaag tcaaatcccc tactacctgg taggtgataa atggatccgt 360 ctgcctggtt ccctgaagca tatcactgta ggaccagcag ggatctgggg tgtcaacaag 420 gactatgcaa tctacaagta tgtggccggt aactgggttc aagctgcagg taagtggaga 480 gcattactca atatttatcc agaggacacc tgcttattag ctttcctgat accatcaggc 540 tgttgaaaaa aacgattgat gttttaaatt gtaacttgta ggtaatttgg cagtactcct 600 tgtttgcttg tctgtctgtc tttgtggtct tggccttctg aaacagttgg atgctggagg 660 tgaacagttt attgtggggg ctaacatgaa cgatactcca tactgtctga caagtagtgc 720 cacagttggc tacaagggtc caggctcacc ccttccatgg acaggattgc caggagctgt 780 gaagtactac agctgcggac cctttgggtg ctgggcagtc aacaagaatg atgatatcta 840 cttaatgagt gtaagatctg ggaaagagtg ggagagctgg agtagagtag tagaggatgg 900 agagtgtcag ttattttaaa actgtttcat attataactg ttgaaattgt cctaaaaccc 960 tgattgtatc attttgtttc cagctgaatc aagactgcca aaacaagggg tggagtcaca 1020 ttgaaggcaa gctttccatg attgaggtgg caactgatgg tagtgtcttt ggggtcaact 1080 ctgcgggtag tgtttatacc caggtaaggt tgctactgaa ctatgtgtat ggtccaccac 1140 cccccccccc ccaacagtat taacttgaaa atgacttgta ataataactt agaataataa 1200 tggtataccc tttaattata actctgatcc ttacagtaca tgctatgtga atctccttac 1260 acaaaaacta aatattgtag gtacataaat aaaatcagtt aaatataatc agatctaaac 1320 ttataggact tattaagaaa tgtgtagaca gtgtatgata aaatatgtaa aagttggatg 1380 tcctgtaaag ctacagtttg ggataaaaaa caacaacttc ccagacaccc caccacttgt 1440 tctggtaaac agctgaggaa tgtagttaga gaaatgtaac cactctcaca ttcatacatg 1500 gagctacgga tgcaaagaca caacaatttt tttattaaaa aaaaaaaaat gtttatattt 1560 tcttttaaag ctaaacattg tttgtttaca ataacattgt ttacaaacaa ttgagtaaaa 1620 gcttacattt tggcttctaa tgtggttgaa taaagctcaa gatgcagaag ttatattctt 1680 caaaaatcta tggctatatt taattattaa agtccaaaaa tggatgtact taaaaaaaat 1740 ggataagctt taaaacatga accccaaccc tttcttcaac acagagacgg catcacagcc 1800 agtaaaccag agggcaccgg atggagcaat atcccaatgg gcatgctcat gggccacgtg 1860 acctacgacc tgggccgtct ttgggtcgtc tccaagtctg gcggcaccat ggtgtgcaca 1920 cattagcctc ttctctgtag ctgaaggccg ttcgggatct gtctaaagtt cacttgcgaa 1980 ctcattgatc tctctttctg gaaaagcctt tagttcatta gttcataaaa atccttcatt 2040 ttaaaaccta ttgctctacc tattattttc agttcttcaa ttatcttatt gccatttaaa 2100 aaaatatcaa tgaagatgtt atattttctt gaccactcct tgattaacac ttcaatagat 2160 ctttgccatg gaggctattt aagtgtagtg taaactaggg cacggtcatg ttgctcacaa 2220 tccacatggg ttttgctgtg cttcagaggt catcaatagg atttgacgga atccttgtca 2280 ttgtttatta tctcattata taatcatttc ctgcaaaaat aaa 2323 <210> 11 <211> 765 <212> DNA <213> Salmo salar <400> 11 atgagagcca ctgcagccgt cctattggtc ctctgtctcc tgaccatcag tcatgcatgg 60 gactgtcagg aggtagtaaa catcaagaat ctgatgcaga tcgatgcagg actggggcaa 120 gtggttgcta cggacacaag tcaaatcccc tactacctgg taggtgataa atggatccgt 180 ctgcctggtt ccctgaagca tatcactgta ggaccagcag ggatctgggg tgtcaacaag 240 gactatgcaa tctacaagta tgtggccggt aactgggttc aagctgcagg ccttctgaaa 300 cagttggatg ctggaggtga acagtttatt gtgggggcta acatgaacga tactccatac 360 tgtctgacaa gtagtgccac agttggctac aagggtccag gctcacccct tccatggaca 420 ggattgccag gagctgtgaa gtactacagc tgcggaccct ttgggtgctg ggcagtcaac 480 aagaatgatg atatctactt aatgagtctg aatcaagact gccaaaacaa ggggtggagt 540 cacattgaag gcaagctttc catgattgag gtggcaactg atggtagtgt ctttggggtc 600 aactctgcgg gtagtgttta taccagagac ggcatcacag ccagtaaacc agagggcacc 660 ggatggagca atatcccaat gggcatgctc atgggccacg tgacctacga cctgggccgt 720 ctttgggtcg tctccaagtc tggcggcacc atggtgtgca cacat 765 <210> 12 <211> 683 <212> DNA <213> Salmo salar <400> 12 actggggcaa gtggttgcta cggacacaag tcaaatcccc tactacctgg taggtgataa 60 atggatccgt ctgcctggtt ccctgaagca tatcactgta ggaccagcag ggatctgggg 120 tgtcaacaag gactatgcaa tctacaagta tgtggccggt aactgggttc aagctgcagg 180 cgttccgaaa cagttggatg ctggaggtaa ccagtttgtt gtgggggcta acatggacga 240 tactccattt tgtctgacaa gtagtgccac agttggctac aagggtccag gctcacccct 300 tccatggaca ggattgccag gagctgtgaa gtactacagc tgcggacact ttgggtgctg 360 ggcagtcaac aagaatgatg atattttctt aatgagtctg aatcaagact gccaaaacaa 420 cgggtggagt cacattgatg gcaagctttc catgattgag gtggcaactg atggtagtgt 480 ctttggggtc aactctgcgg gtagtgttta taccagagac ggcatcacag ccagtaaacc 540 agagggcacc ggatggagca atatcccaat gggcatgctc atgggccacg tgacctacga 600 cctgggccgt ctttgggtcg tctccaagtc tggcggcacc atggtgtgca cacattagcc 660 tcttctctgt agctgaaggc cgt 683 <210> 13 <211> 488 <212> DNA <213> Gadus morhua <400> 13 caatccccta ctacctggta ggtgataaat ggatccgtct gcctggttcc ctgaagcata 60 tcactgtagg accagcaggg atctggggtg tcaacaagga ctatgcaatc tacaagtatg 120 tggccggtaa ctgggttcaa gctgcaggcc ttctgaaaca gttggatgct ggaggtgaac 180 agtttattgt gggggctaac atgaacgata ctccatactg tctgacaagt agtgccacag 240 ttggctacaa gggtccaggc tcaccccttc catggacagg attgccagga gctgtgaagt 300 actacagctg cggacccttt gggtgctggg cagtcaacaa gaatgatgat atctacttaa 360 tgagtctgaa tcaagactgc caaaacaagg ggtggagtca cattgaaggc aagctttcca 420 tgattgaggt ggcaactgat ggtagtgtct ttggggtcaa ctctgcgggt agtgtttata 480 ccagagac 488 <210> 14 <211> 626 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 14 caggactggg gcaagtggtt gctacggaca caagtcaaat cccctactac ctggtaggtg 60 ataaatggat ccgtctgcct ggttccctga agcatatcac tgtaggacca gcagggatct 120 ggggtgtcaa caaggactat gcaatctaca agtatgtggc cggtaactgg gttcaagctg 180 caggccttct gaaacagttg gatgctggag gtgaacagtt tattgtgggg gctaacatga 240 acgatactcc atactgtctg acaagtagtg ccacagttgg ctacaagggt ccaggctcac 300 cccttccatg gacaggattg ccaggagctg tgaagtacta cagctgcgga cgctttgggt 360 gctgggcagt caacaagaat gatgatatct acttaatgag tctgaatcaa gactgccaaa 420 acaaggggtg gagtcacatt gaaggcaagc tttccatgat tgaggtggca actgatggta 480 gtgtctttgg ggtcaactct gcgggtagtg tttataccag agacggcatc acagccgtaa 540 accagagggc accggatgga gcaatatccc aatgggcatg ctcatgggcc acgtgaccta 600 cgacctgggc cgtctttggg tcgtct 626 <210> 15 <211> 1089 <212> DNA <213> Danio rerio <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (62)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (158)..(158) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (180)..(180) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (191)..(191) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (221)..(221) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (280)..(280) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1038)..(1038) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1078)..(1078) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 nnaaaannta aaatanngta ggtacannnn aaatcagtta aatataatca gatntaaant 60 tntaggacta ttaagaaatg tgtagacagc gtacgataaa atatgtaaaa gttggatgtc 120 ctgtaaagct acagtttggg ataaaaaaca acaacttncc agacacccca ccacttgttn 180 tggtaaacag ntgaggaatg tagttagaga aatgtaacca ntctcacatt catacatgga 240 gttacggatg caaagacaca acaatttttt gtttacattn tttttaacat gttttttaaa 300 gcaatacaca ttgtttgttt acaataacat tgtttacaaa caattgagta aaagcttaca 360 ttttggcttc tgtgtggttg aaataaagct caagaggcag aagttatatt cttcaaaaat 420 caatggctat atttaattat taaagttcca aaaaggatgt acttaataaa atggataagc 480 tttaaaacat gaaccccaac cctttcttca acacagagac ggcatcacag ccagtaaacc 540 agagggcacc ggatggagca atatcccaat gtgtatgctc atgggccacg tgacctacga 600 cctgggccgt ctttgggtcg tctccaagtc tgccgtcacc atggtgtgca cacattagcc 660 tcttctctgt agctgaaggc cgttcgggat ccgtccaaag ttccctggcg aactcattga 720 tctctctttc tggaaaagcc tttagttcat aaaaatcctt cattttaaaa cctattgctc 780 tacctattat tttcagttct tcaatgatct tattgacatt taaaaaaaat atcattgaag 840 attttatatt ttcttgacaa ctcctagatt aacacttcaa tagacctttg ccatggaggc 900 tatttaagtg tagtgtaaac tagggcacgg tcatgttgct cacaatccac atgggttttg 960 ctgtgcttca aaggtcatca ataaatcact agtgcggccg cctgcaggtc gaccatatgg 1020 gagagctccc aacgcgtngg atgcataagc gaccatatgg gagagctccc aacgcgtngg 1080 atgcataag 1089 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> NWA15dPET(#23): NcoI <400> 16 gcaccatggc catgggctgg gactgtcagg aggtagta 38 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CH.A15dPET(#13): ACC65I <400> 17 ccgaagcttg gtaccatgtg tgcacaccat ggtgac 36 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Leukolectin consensus 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 18 Xaa Trp Xaa Xaa Leu Pro Gly Xaa Leu Lys Xaa Xaa Xaa Val Gly Pro 1 5 10 15 Xaa <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Leukolectin consensus 2 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 19 Gly Val Asn Lys Asn Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Leu Val Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Zebrafish LLF1 <400> 20 atgcagatcg atgcaggact ggg 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Zebrafish LLF2 <400> 21 tggttccctg aagcatgtca ctgt 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Zebrafish LLR1 <400> 22 gaaagagaga tcaatgagtt cgca 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Zebrafish LLR2 <400> 23 caaagacact accatcagtt gccac 25 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Zebrafish LLR3 <400> 24 gtccgcagct gtagtacttc acag 24 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GeneRacer 5' primer <400> 25 cgactggagc acgaggacac tga 23 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GeneRacer 5' Nested primer <400> 26 ggacactgac atggactgaa ggagta 26 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Zebrafish LLR4 <400> 27 agcctggacc cttgtagcca actgt 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GeneRacer 3' primer <400> 28 gctgtcaacg atacgctacg taacg 25 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GeneRacer 3' Nested primer <400> 29 cgctacgtaa cggcatgaca gtg 23 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Zebrafish LLF4 <400> 30 gtgaggtggc aactgatggt agtgtct 27 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Salmon LL/F <400> 31 tacggacaca ggtcgaatcc cctactacc 29 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Salmon LL/R <400> 32 acagagaaga ggctaatgtg tgcac 25 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 33 Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met Gln Ile Asp 1 5 10 15 Ala Gly Leu Gly Gln Val 20 <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 34 Met Arg Ala Thr Ala Val Leu Leu Val Leu Cys Leu Leu Thr Ile Ser 1 5 10 15 His Ala <210> 35 <211> 78 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 35 Trp Asp Cys Gln Glu Val Val Asn Ile Lys Asn Leu Met Gln Ile Asp 1 5 10 15 Ala Gly Leu Gly Gln Val Val Ala Thr Asp Thr Ser Gln Ile Pro Tyr 20 25 30 Tyr Leu Val Gly Asp Lys Trp Ile Arg Leu Pro Gly Ser Leu Lys His 35 40 45 Ile Thr Val Gly Pro Ala Gly Ile Trp Gly Val Asn Lys Asp Tyr Ala 50 55 60 Ile Tyr Lys Tyr Val Ala Gly Asn Trp Val Gln Ala Ala Gly 65 70 75 <210> 36 <211> 73 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 36 Gly Leu Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Gly Glu Gln Phe Ile Val Gly 1 5 10 15 Ala Asn Met Asn Asp Thr Pro Tyr Cys Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val 20 25 30 Gly Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Pro Leu Pro Trp Thr Gly Leu Pro Gly 35 40 45 Ala Val Lys Tyr Tyr Ser Cys Gly Pro Phe Gly Cys Trp Ala Val Asn 50 55 60 Lys Asn Asp Asp Ile Tyr Leu Met Ser 65 70 <210> 37 <211> 39 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 37 Leu Asn Gln Asp Cys Gln Asn Lys Gly Trp Ser His Ile Glu Gly Lys 1 5 10 15 Leu Ser Met Ile Glu Val Ala Thr Asp Gly Ser Val Phe Gly Val Asn 20 25 30 Ser Ala Gly Ser Val Tyr Thr 35 <210> 38 <211> 47 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 38 Arg Asp Gly Ile Thr Ala Ser Lys Pro Glu Gly Thr Gly Trp Ser Asn 1 5 10 15 Ile Pro Met Gly Met Leu Met Gly His Val Thr Tyr Asp Leu Gly Arg 20 25 30 Leu Trp Val Val Ser Lys Ser Ala Val Thr Met Val Cys Thr His 35 40 45

Claims (18)

  1. 서열번호 1-8 중 임의의 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 50% 이상 동일한 서열, 또는 상기 서열들 중 임의 서열의 일부를 포함하는, 폴리펩타이드.
  2. 서열번호 9-15 중 임의의 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열과 50% 이상 동일한 서열, 또는 6 x SSC(SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 소듐 사이트레이트) / 50% 포름아미드 및 실온의 비-엄격성 결합 조건과 예컨대 2 x SSC, 65℃의 고엄격 세정 조건에서 상기 서열과 혼성화되는 서열, 또는 상기 서열들 중 임의의 서열에 상보적인 서열, 또는 그것의 일부를 포함하는 핵산 분자.
  3. 제2항의 핵산 분자를 포함하는, 바람직하게는 발현 벡터인, 벡터.
  4. 제2항의 핵산 분자를 벡터의 핵산 서열에 삽입하는 단계를 포함하는, 제3항에 따른 재조합 핵산 분자의 제조 방법.
  5. 제2항의 핵산 분자를 포함하고 있는 숙주 세포를 상기 폴리펩타이드가 발현되는 조건에서 배양하는 단계 및 이로써 생산되는 상기 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항의 폴리펩타이드의 제조 방법.
  6. 제5항의 방법으로 수득되는 폴리펩타이드.
  7. 제1항의 폴리펩타이드 또는 제2항의 핵산 분자를 포함하고 있는 숙주 세포.
  8. 제1항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항의 폴리펩타이드, 제2항의 핵산 분자 또는 제8항의 항체, 및 1종 이상의 제약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는, 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 치료법에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 선행 청구항들 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 장애, 염증 장애 또는 손상된 피부를 치료 또는 예방하는 방법.
  12. 동물에서 자가면역 장애, 염증 장애 또는 손상된 피부를 치료 또는 예방하기 위한 약제 제조에 있어서의, 선행 청구항들 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물의 용도.
  13. 동물에서 자가면역 장애, 염증 장애 또는 손상된 피부를 치료 또는 예방하기 위한, 선행 청구항들 중 어느 한항에 따른 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 치료 또는 예방할 장애는 피부의 자가면역 장애, 피부의 염증 장애 또는 손상된 피부이며,
    상기 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물은 피부에 바람직하게는 국소 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법, 용도, 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 치료 또는 예방할 장애는 종기(sore), 궤양, 습진, 여드름, 건선, 위장 염증(바람직하게는 크론 질환, 궤양성 대장염 및 그외 만성 염증), 치은염, 구강 염증 및 식도 염증, 또는 손상된 피부인 것을 특징으로 하는, 방법, 용도, 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 손상된 피부는 자극받거나 염증이 생기거나, 저온에 의해 갈라졌거나, 햇볕에 타거나, 방사선 피폭되거나, 열에 의해 손상된 것이거나, 또는 상처인 것을 특징으로 하는, 방법, 용도, 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체 또는 약학 조성물.
  17. 인간 또는 동물 치료법에 동시, 개별 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합된 조제물로서, 선행 청구항들 중 하나 이상의 청구항에 기재된 하나 이상의 폴리펩타이드, 핵산 분자 또는 항체, 및 하나 이상의 부가적인 활성 성분을 포함하는 제품.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한항에 있어서, 상기 동물은 포유류, 바람직하게는 인간인 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 폴리펩타이드, 핵산 분자, 항체, 약학 조성물 또는 제품.
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