ES2302885T3 - Metodo de diagnostico in vitro de la infeccion por circovirus porcino de tipo ii y reactivos de diagnostico. - Google Patents

Metodo de diagnostico in vitro de la infeccion por circovirus porcino de tipo ii y reactivos de diagnostico. Download PDF

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Abstract

Método de diagnóstico de la infección por un circovirus porcino de tipo II, responsable en el cerdo del síndrome de debilitamiento generalizado posterior al destete (PMWS), método en el que se ponen en contacto una muestra de fluido fisiológico o una extracción de tejido de un cerdo y un reactivo de diagnóstico específico del circovirus de tipo II y se revela la posible presencia de antígeno, anticuerpo o ácido nucleico específico del circovirus porcino de tipo II, en esta muestra o extracción.

Description

Método de diagnóstico in vitro de la infección por circovirus porcino de tipo II y reactivos de diagnóstico.
La presente invención se refiere a nuevas cepas de circovirus porcino (PCV de Porcine Circo Virus) responsables del síndrome PMWS (Porcine Multisystemic Wasting Syndrome o Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome, también llamado síndrome de debilitamiento generalizado posterior al destete) a reactivos y a métodos que permiten su detección y a métodos de vacunación y a vacunas, así como a métodos de producción de estos reactivos y vacunas.
El PCV se ha detectado originalmente como contaminante no citopatógeno en líneas celulares de riñón de cerdos PK/15. Este virus se ha clasificado en los Circoviridae con el virus de la anemia del pollo (CAV de Chicken Anemia Virus) y el virus PBFDV (Pscittacine Beak and Feather Disease Virus). Son virus pequeños (de 15 a 24 nm) sin envuelta, cuya característica común es que contienen un genoma en forma de ADN de cadena sencilla circular de 1,76 a 2,31 kb. En un primer momento se pensó que este genoma codificaba un polipéptido de aproximadamente 30 kDa (Todd et al., Arch Virol 1991, 117: 129-135). Sin embargo, trabajos recientes han demostrado una transcripción más compleja (Meehan B. M. et al., 1997, 78: 221-227). Por otro lado, no se conocen homologías significativas de secuencia de nucleótidos ni de determinantes antigénicos comunes entre los tres tipos de circovirus conocidos.
Se considera que el PCV obtenido de las células PK/15 no es patógeno. Su secuencia se conoce del documento B. M. Meehan et al., J Gen Virol 1997 (78) 221-227. Sólo muy recientemente los autores han pensado que las cepas de PCV podrían ser patógenas y estar asociadas al síndrome PMWS (Gupi P. S. Nayar et al., Can Vet J, vol. 38, 1997: 385-387 y Clark E. G., Proc Am Assoc Swine Prac 1997: 499-501). Nayar et al., han detectado ADN de PCV en cerdos que presentan el síndrome PMWS mediante técnicas de PCR. Sin embargo, hasta la fecha no se ha aislado ni purificado ninguna cepa silvestre de PCV.
El síndrome PMWS detectado en Canadá, en los Estados Unidos y en Francia se caracteriza en el plano químico por una pérdida progresiva de peso y por manifestaciones tales como taquipnea, disnea e ictericia. En el plano patológico, el síndrome se traduce en infiltraciones linfocitarias o granulomatosas, linfadenopatías y, más raramente, hepatitis y nefritis linfocitarias o granulomatosas (Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 499-501; La Semaine Vétérinaire Nº 26, suplemento de La Semaine Vétérinaire 1996 (834); La Semaine Vétérinaire 1997 (857): 54; Gupi P. S. Nayar et al., Can Vet J, vol. 38, 1997: 385-387).
La Depositante ha conseguido aislar cinco nuevas cepas de PCV a partir de extracciones pulmonares o ganglionares procedentes de ganaderías situadas en Canadá, en los Estados Unidos (California) y en Francia (Bretaña), en los sucesivo denominadas circovirus de acuerdo con la invención. Estos virus se han descubierto en lesiones de cerdos afectados por el síndrome PMWS, pero no en cerdos sanos.
La Depositante tiene además la secuencia del genoma de cuatro de estas cepas, a saber las cepas procedentes de Canadá y de los Estados Unidos, así como dos cepas francesas. Las cepas presentan una homología muy grande entre sí a nivel de nucleótido, superando el 96% y mucho menor con la cepa PK/15, aproximadamente el 76%. Por lo tanto, las nuevas cepas pueden considerarse representativas de un nuevo tipo de circovirus porcino, denominado en este documento tipo II, estando el tipo I representado por la PK/15.
La presente invención describe el circovirus porcino de grupo II, tal como se ha definido anteriormente, aislado o en forma de preparación purificada.
La invención se refiere a cualquier circovirus porcino que puede aislarse a partir de una muestra fisiológica o de una extracción tisular, particularmente de lesiones, de un cerdo enfermo que presenta el síndrome PMWS, particularmente siguiendo el método descrito en los ejemplos, en particular circovirus de tipo II.
La presente invención describe más particularmente preparaciones purificadas de cinco cepas, que se han depositado en la ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG, Reino Unido) el jueves 2 de octubre de 1997:
-
Nº de acceso V97100219 (llamado en este documento Imp.1008PCV)
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Nº de acceso V97100218 (llamado en este documento Imp.1010PCV)
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Nº de acceso V97100217 (llamado en este documento Imp.999PCV) y, el viernes 16 de enero de 1998:
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Nº de acceso V98011608 (llamado en este documento Imp 1011-48285)
-
Nº de acceso V98011609 (llamado en este documento Imp 1011-48121)
La invención pretende considerar circovirus porcinos aislados de un cerdo enfermo y/o los circovirus que tienen una similitud serológica significativa con las cepas de la invención y/o los circovirus que tienen una hibridación cruzada con las cepas de la invención en condiciones de rigurosidad tales que no haya hibridación con la cepa de PCV PK/15.
Las cepas virales aisladas de una muestra fisiológica o de una extracción tisular, particularmente de una lesión, de un cerdo que presenta el síndrome PMWS pueden propagarse ventajosamente en líneas celulares tales como particularmente líneas celulares de riñón de cerdo, en particular células PK/15 libres de contaminación (en particular por PCV, así como por pestivirus, adenovirus porcino y parvovirus porcino) con vistas a su multiplicación o específicamente para la producción de antígeno, completo (por ejemplo virus) y/o subunidades (por ejemplo, polipéptidos).
De manera muy notable e inesperada, estos aislados se han mostrado muy productivos en cultivo en células PK/15, lo que presenta ventajas innegables para la producción de virus o de antígeno, en particular para la producción de vacuna inactivada.
La presente invención describe las preparaciones de circovirus aislados después de pasos por células, particularmente líneas celulares, por ejemplo células PK/15, cultivadas in vitro y que están infectadas por al menos uno de los circovirus de acuerdo con la invención o por cualquier circovirus porcino que pueda aislarse a partir de una muestra fisiológica o de una extracción tisular, particularmente de lesiones, de un cerdo que presenta el síndrome PMWS. La invención también describe los sobrenadantes o extractos de cultivo, opcionalmente purificados mediante técnicas convencionales y de manera general cualquier preparación antigénica obtenida a partir de cultivos in vitro.
La invención también describe los principios activos inmunógenos y las vacunas que contienen al menos un antígeno tal como se ha definido anteriormente.
Pueden ser principios activos inmunógenos a base de virus completos vivos atenuados o vacunas preparadas con estos principios activos, realizándose la atenuación de acuerdo con los métodos habituales, por ejemplo mediante el paso por células, preferiblemente mediante paso por células de cerdo, particularmente de una línea, tales como células PK/15 (por ejemplo de 50 a 150, particularmente del orden de 100, pasos). Estas vacunas comprenden en general un vehículo o diluyente aceptable en el plano veterinario, opcionalmente un adyuvante aceptable en el plano veterinario así como opcionalmente un estabilizante de liofilización.
Estas preparaciones antigénicas y vacunas comprenderán preferiblemente de 10^{3} a 10^{8} TCID50.
También pueden ser principios activos inmunógenos o vacunas a base de antígeno de circovirus de acuerdo con la invención, en estado inactivado. Las vacunas comprenden además un vehículo o diluyente aceptable en el plano veterinario con opcionalmente además un adyuvante aceptable en el plano veterinario.
Los circovirus de acuerdo con la invención, con las fracciones que pueden estar presentes, se inactivan de acuerdo con las técnicas conocidas por el especialista en la técnica. La inactivación se realizará preferiblemente por vía química, por ejemplo mediante exposición del antígeno a un agente químico tal como formaldehído (formol), paraformaldehído, \beta-propiolactona o etilenimina o sus derivados. El método de inactivación preferido será en este documento la exposición a un agente químico y en particular a etilenimina o a \beta-propiolactona.
Preferiblemente, las vacunas inactivadas de acuerdo con la invención estarán potenciadas, ventajosamente al estar presentes en forma de emulsiones, por ejemplo de agua en aceite o aceite en agua, de acuerdo con técnicas bien conocidas por el especialista en la técnica. El carácter adyuvante también podrá proceder de la incorporación al principio activo de un compuesto adyuvante habitual.
Entre los adyuvantes que pueden utilizarse, pueden mencionarse como ejemplo el hidróxido de alúmina, saponinas (por ejemplo Quillaja saponina o Quil A; véase el documento Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, editado por Michael F. Powel y Mark J. Newman, Plennum Press, Nueva York y Londres, p. 210), Avridine® (Vaccine Design p. 148), DDA (Bromuro de dimetildioctadecilamonio, Vaccine Design p. 157), Polifosfaceno (Vaccine Design p. 204) o también emulsiones de aceite en agua a base de aceite mineral, de escualano (por ejemplo, emulsión SPT, Vaccine Design p. 147), de escualeno (por ejemplo MF59, Vaccine Design p. 183) o de agua en aceite a base de aceite metabolizable (preferiblemente de acuerdo con el documento WO-A-94 20071) así como las emulsiones descritas en el documento US-A-5 422 109. También pueden seleccionarse asociaciones de adyuvantes, por ejemplo Avridine® o DDA asociado a una emulsión.
Estas vacunas comprenderán preferiblemente de 10^{6} a 10^{8} TCID50.
Los adyuvantes de vacuna viva podrán seleccionarse entre los que se dan para la vacuna inactivada. Se prefieren las emulsiones. A las indicadas para la vacuna inactivada, pueden añadirse las descritas en el documento WO-A-9416681.
Como estabilizante de liofilización, pueden mencionarse como ejemplo el SPGA (Bovamik et al., J. Bacteriology 59, 509,950), hidratos de carbono tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína, derivados de estos compuestos o tampones tales como fosfatos de metales alcalinos.
La Depositante ha obtenido además el genoma de cuatro de los aislados, identificados como SEC ID Nº 1 a 4 y opcionalmente 6.
La presente invención describe por lo tanto un fragmento de ADN que contiene toda o parte de una de estas secuencias. Es evidente que la invención describe automáticamente las secuencias equivalentes, es decir las secuencias que no cambian la funcionalidad ni la especificidad de cepa de la secuencia descrita ni de los polipéptidos codificados por esta secuencia. Por supuesto se incluirán las secuencias que difieran por degeneración del código genético.
La invención describe también las secuencias equivalentes en el sentido en que son capaces de hibridarse a la secuencia anterior en condiciones de rigurosidad elevada y/o tienen una gran homología con las cepas de la invención y pertenecen al grupo II definido anteriormente.
Estas secuencias y sus fragmentos podrán utilizarse ventajosamente para la expresión in vitro o in vivo de polipéptidos con ayuda de vectores apropiados.
En particular, se han identificado marcos abiertos de lectura que forman fragmentos de ADN de acuerdo con la invención, utilizables a tal efecto, en la secuencia genómica de los circovirus de tipo II. La invención describe cualquier polipéptido que contiene al menos uno de estos marcos abiertos de lectura (secuencia de aminoácidos correspondiente). Preferiblemente, la invención describe una proteína formada esencialmente por MAL4, MAL7, MAL10 o MAL13.
Para la expresión de subunidades in vitro, como medio de expresión, se recurrirá preferiblemente a E. coli o al baculovirus (US-A-4 745 051). Se integra la o las secuencias codificantes o sus fragmentos en el genoma del baculovirus (por ejemplo baculovirus Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV) y a continuación se propaga este último en células de insecto por ejemplo Spodoptera frugiperda Sf9 (depósito ATCC CRL 1711). También pueden producirse las subunidades en células eucariotas tales como levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae) o células de mamífero (por ejemplo CHO, BHK).
La invención también describe los polipéptidos que se producirán in vitro mediante estos medios de expresión y después opcionalmente se purificarán de acuerdo con técnicas convencionales. La invención también describe las vacunas de subunidad que comprenden al menos un polipéptido, tal como los obtenidos de este modo, o un fragmento, en un vehículo o diluyente aceptable en el plano veterinario y opcionalmente un adyuvante aceptable en el plano veterinario.
Para la expresión in vivo con vistas a la realización de vacunas vivas recombinantes, se inserta la o las secuencias codificantes o sus fragmentos en un vector de expresión apropiado en condiciones que permitan la expresión del o de los polipéptidos. Como vectores apropiados, pueden utilizarse virus vivos, preferiblemente capaces de multiplicarse en el cerdo, no patógenos para el cerdo (no patógeno de forma natural o artificial), de acuerdo con técnicas bien conocidas por el especialista en la técnica. Podrán utilizarse particularmente herpesvirus de cerdo tales como los virus de la enfermedad de Aujeszky, adenovirus porcino, poxvirus, particularmente virus vaccinia, avipox, canarypox, swinepox. También pueden utilizarse como vectores ADN plasmídicos (WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797, WO-A-95 20660).
La invención describe también por lo tanto los vectores y vacunas vivas recombinantes o plasmídicas (vacunas polinucleotídicas o ADN) realizados de este modo, comprendiendo además las vacunas un vehículo o diluyente aceptable en el plano veterinario.
Las vacunas descritas por la invención (vivas atenuadas, inactivadas, de subunidad, vivas recombinantes, plasmídicas) podrán comprender uno o más principios activos (antígenos) de uno o más (2 ó 3) de los circovirus de acuerdo con la invención.
La invención prevé también asociar, para cada uno de los tipos de vacunas descritos anteriormente, la vacunación contra el circovirus porcino con una vacunación contra otros patógenos del cerdo, en particular los que pueden estar asociados al síndrome PMWS. Las vacunas de acuerdo con la invención, particularmente inactivadas, podrán comprender por lo tanto otra valencia correspondiente a otro patógeno del cerdo. Entre estos otros patógenos del cerdo, pueden mencionarse preferiblemente el PRRS (Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome) (el especialista en la técnica podrá remitirse a los documentos WO-A-93/07898, WO-A-94/18311, FR-A-2 709 966; C. Chareyre et al., Proceedings of the 15th IPVS Congress Birmingham, England, 5-9 de julio de 1998, p. 139; incorporados como referencia) y/o Mycoplasma hyopneumoniae (el especialista en la técnica podrá remitirse a los documentos EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A-571 648, O. Martinon et al., p 157, p. 284, p. 285 y G. Reynaud et al., p. 150 del Proceedings of the 15th IPVS Congress anterior. Entre las demás valencias interesantes, también pueden mencionarse Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli y Rhinite atrophique del cerdo, o también enfermedad de Aujeszky, peste porcina clásica (Hog Cholera) y gripe porcina.
La presente invención también describe un método que permite inducir una respuesta inmune en el cerdo frente a circovirus de acuerdo con la invención. La invención describe en particular un método de vacunación eficaz en el cerdo.
Este método prevé la administración al cerdo, en una o más veces, de una vacuna anterior. También es posible combinar varios tipos de vacunas anteriores en un mismo protocolo de vacunación.
Este método no solamente prevé la administración a los cerdos adultos, sino también a los jóvenes o a las hembras en gestación. La vacunación de estas últimas permite otorgar una inmunidad pasiva a los recién nacidos (anticuerpos maternos).
La presente invención también ofrece la posibilidad de diagnosticar la presencia de circovirus de acuerdo con la invención en el cerdo. Por lo tanto, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico y métodos relativos al mismo que emplean los reactivos que se describirán a continuación.
El conocimiento de las secuencias de los diferentes circovirus permite definir las secuencias comunes que permiten producir reactivos adecuados para reconocer el conjunto de los circovirus porcinos conocidos.
El especialista en la técnica también podrá seleccionar los fragmentos de las secuencias correspondientes a las regiones que presentan poca o ninguna homología con la secuencia correspondiente del circovirus PK/15 para poder realizar un diagnóstico específico.
Los alineamientos de secuencias permiten al especialista en la técnica seleccionar un reactivo de acuerdo con sus deseos.
Un primer reactivo consiste en las secuencias de ADN divulgadas en este documento y sus fragmentos; que se utilizarán particularmente como sondas o cebadores en técnicas de hibridación o de PCR ("Polymerase Chain Reaction") bien conocidas.
Un segundo reactivo consiste en polipéptidos codificados por estas secuencias a partir del virus o expresados con ayuda de un vector (véase anteriormente) o sintetizados por vía química de acuerdo con técnicas convencionales de síntesis peptídica.
Un tercer y cuarto reactivos consisten en anticuerpos respectivamente policlonales y monoclonales que podrán producirse de acuerdo con las técnicas habituales a partir de virus, polipéptidos o fragmentos, extraídos o codificados por las secuencias de ADN.
Estos segundo, tercer y cuarto reactivos podrán utilizarse en un método de diagnóstico, objeto de la invención, en el que se busca, en una muestra de fluido fisiológico (sangre, plasma, suero, etc.) o extracción de tejido (ganglios, hígado, pulmones, riñones, etc.) procedente de un cerdo a ensayar, la presencia de un antígeno específico de un circovirus de acuerdo con la invención, buscando detectar el propio antígeno o anticuerpos dirigidos contra este antígeno.
Los antígenos y anticuerpos de acuerdo con la invención podrán utilizarse en todas las técnicas conocidas de diagnóstico de laboratorio.
Sin embargo, se preferirá utilizarlos en técnicas que pueden emplearse directamente sobre el terreno por el veterinario, el ganadero o el propietario del animal. El especialista en la técnica dispone del conjunto de técnicas de laboratorio y sobre el terreno y, por lo tanto, es perfectamente capaz de adaptarlas a la utilización de este antígeno y/o de los anticuerpos como reactivo(s) de diagnóstico.
Las técnicas de diagnóstico que se utilizarán preferiblemente en el marco de la presente invención son Transferencia de Western, inmunofluorescencia, ELISA e inmunocromatografía.
Con respecto a al realización de métodos por inmunocromatografía, el especialista podrá remitirse particularmente al documento Robert F. Zurk et al., Clin. Chem. 31/7, 1144-1150 (1985) así como a las patentes o solicitudes de patente WO-A-88/08 534, WO-A-91/1 2528, EP-A-291 176, EP-A-299 428, EP-A-291 194, EP-A-284 232, US-A-5 120 643, US-A-5 030 558, US-A-5 266 497, US-A-4 740 468, US-A-5 266 497, US-A-4 855 240, US-A-5 451 504, US-A-5 141 850, US-A-5 232 835 y US-A-5 238 652.
De este modo, se busca preferiblemente detectar los anticuerpos específicos en la muestra mediante ensayo indirecto, por competición o por desplazamiento. Para ello, se utiliza el propio antígeno como reactivo de diagnóstico o un fragmento de este antígeno, que conserva el reconocimiento de los anticuerpos. El marcado puede ser ventajosamente un marcado con peroxidasa o un marcado de partículas, preferiblemente con oro coloidal.
También puede buscarse detectar el propio antígeno en la muestra con ayuda de un anticuerpo marcado específico de este antígeno. El marcado es ventajosamente como se ha descrito anteriormente.
Por anticuerpo específico del antígeno utilizable particularmente en competición o desplazamiento o para la detección del propio antígeno, se entiende anticuerpos monoclonales y policlonales específicos del antígeno, fragmentos de estos anticuerpos, preferiblemente fragmentos Fab o F(ab)'_{2}.
Otro aspecto de la invención es la producción de anticuerpos, policlonales o monoclonales, específicos del antígeno de acuerdo con la invención, pudiendo utilizarse estos anticuerpos a continuación particularmente como reactivos de diagnóstico para la detección del antígeno en una muestra de fluido fisiológico o en una extracción de tejido o incluso para la detección de anticuerpos presentes en dicha muestra o extracción. La invención también incluye los fragmentos inmunológicamente funcionales de estos anticuerpos, en particular los fragmentos F(ab) y F(ab)'_{2}.
Los anticuerpos podrán preparase mediante técnicas habituales. Podemos remitirnos particularmente al documento Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, USA o a J.W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Inc., cuyos contenidos se incorporan en este documento como referencia.
Se podrá proceder particularmente, como se conoce en sí misma, a la fusión de células esplénicas de ratón inmunizadas con el antígeno o con al menos uno de sus fragmentos, con células mielomatosas adecuadas.
La invención también se refiere a una preparación, preferiblemente pura o parcialmente purificada o incluso en bruto, de anticuerpos monoclonales o policlonales específicos del antígeno, particularmente anticuerpos de ratón o de conejo.
La presente invención también permite determinar epítopos de interés particularmente en base a las secuencias de ADN descritas en este documento, sean estos epítopos de interés para vacunas o epítopos de interés para diagnóstico. A partir de la secuencia de ADN del genoma del circovirus de acuerdo con la invención, el especialista en la técnica puede determinar él mismo, epítopos de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo el programa informático apropiado o PEPSCAN. Los epítopos son regiones inmunodominantes de proteínas y por esta razón son regiones expuestas en la superficie de las proteínas. Por lo tanto, pueden ser reconocidos por los anticuerpos y de este modo pueden emplearse particularmente en el campo del diagnóstico para la preparación de anticuerpos con fines de diagnóstico o para la realización de péptidos correspondientes utilizables como reactivos de diagnóstico.
Como mínimo, un epítopo es un péptido que tiene de 8 a 9 aminoácidos. En general se prefiere un mínimo de 13 a 25 aminoácidos.
Por lo tanto, el especialista en la técnica es capaz, utilizando una o más de estas técnicas así como otras técnicas disponibles, de encontrar epítopos para la realización de péptidos o de anticuerpos con fines de diagnóstico.
La invención también se refiere a un kit de diagnóstico que comprende este antígeno y/o anticuerpos policlonales o monoclonales específicos de este antígeno. Son en particular kits de diagnóstico correspondientes a las técnicas de diagnóstico descritas anteriormente.
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A continuación la invención se describirá con más detalle con ayuda de ejemplos de realización no limitantes, tomados en referencia al dibujo, en el que:
Figura 1: secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1011-48121
Figura 2: secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1011-48285
Figura 3: secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 999
Figura 4: secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1010
Figura 5: alineamiento de las 4 secuencias de acuerdo con las figuras 1 a 4 con la secuencia de la cepa de PCV PK/15
Figura 6: secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 999 tal como se define en el primer depósito en Francia del 3 de octubre de 1997.
Figura 7: alineamientos de la secuencia de la figura 6 con la secuencia de la cepa PK/15
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Lista de las secuencias SEC ID
SEC ID Nº 1 secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1011-48121
SEC ID Nº 2 secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1011-48285
SEC ID Nº 3 secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 999
SEC ID Nº 4 secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1010
SEC ID Nº 5 secuencia de ADN del genoma de la cepa PK/15
SEC ID Nº 6 secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 999 tal como se define en el primer depósito en Francia del 3 de octubre de 1997.
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Ejemplos Ejemplo 1 Cultivo y aislamiento de las cepas de circovirus porcinos
Se han recogido muestras de tejidos en Francia, en Canadá y en los Estados Unidos a partir de pulmones y de ganglios linfáticos de lechones. Estos lechones presentaban signos clínicos típicos del síndrome de debilitamiento generalizado posterior al destete. Para facilitar el aislamiento de los virus, las muestras de tejidos se han congelado a -70ºC inmediatamente después de la autopsia.
Para el aislamiento viral, se han preparado suspensiones que contienen aproximadamente el 15% de muestra de tejido en un medio mínimo que contiene sales de Earl (EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham, UK), penicilina (100 Ul/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml) (medio MEM-SA), mediante trituración de los tejidos con arena estéril por medio de un mortero y una maza estériles. A continuación, esta preparación triturada se recupera en MEM-SA y después se centrifuga a 3000 g durante 30 minutos a +4ºC para recoger el sobrenadante.
Previamente a la siembra de los cultivos celulares, se ha añadido un volumen de 100 \mul de cloroformo a 2 ml de cada sobrenadante y se mezcla de forma continua durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación se transfiere esta mezcla a un tubo de microcentrífuga, se centrifuga a 3000 g durante 10 minutos y después se recoge el sobrenadante. A continuación este sobrenadante se utiliza como inóculo para los experimentos de aislamiento viral.
Todos los estudios de aislamiento viral se han realizado en cultivos de células PK/15, conocidas porque no están contaminadas con circovirus porcino (PCV), pestivirus, adenovirus porcinos y parvovirus porcino (Allan G. et al., Pathogenesis of porcine circovirus experimetal infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995. 44. 49-64).
El aislamiento de los circovirus porcinos se ha realizado de acuerdo con la siguiente técnica:
Se han disociado monocapas de células PK/15 mediante tripsinización (con una mezcla de tripsina-verseno) a partir de cultivos confluyentes y se han suspendido en medio MEM-SA que contiene el 15% de suero fetal bovino no contaminado con pestivirus (= medio MEM-G) a una concentración final de aproximadamente 400.000 células por ml. A continuación se han mezclado fracciones en alícuotas de 10 ml de esta suspensión celular con fracciones en alícuotas de 2 ml de los inóculos descritos anteriormente y las mezclas finales se han dividido en alícuotas en volúmenes de 6 ml en dos tubos Falcon de 25 cm^{2}. Estos cultivos se han incubado a continuación a +37ºC durante 18 horas en atmósfera que contenía el 10% de CO_{2}. Después de la incubación, el medio de cultivo de las monocapas semi-confluyentes se ha tratado con 300 mM de D-glucosamina (Nº de Cat G48175, Sigma Aldrich Company Limited, Poole, UK) (Tischr I. et al., Arch. Virol. 1987 96 39-57) y después se ha continuado la incubación durante un periodo suplementario de 48-72 horas a +37ºC. Después de esta última incubación, uno de los dos Falcon de cada inóculo se ha sometido a 3 ciclos sucesivos de congelación/descogelación. Las células PK/15 del Falcon restante se han tratado con una solución de tripsina-verseno, se han resuspendido en 20 ml de medio MEM-G y después se han sembrado en Falcon de 75 cm^{2} a una concentración 400.000 células/ml. A continuación, los Falcon recién sembrados se han "sobreinfectado" mediante la adición de 5 ml del lisado correspondiente obtenido después de los ciclos de congelación/descongelación.
Ejemplo 2 Preparación de las muestras de cultivo celular para detección de circovirus porcinos por inmunofluorescencia o por hibridación in situ
Se ha extraído un volumen de 5 ml de la suspensión "sobreinfectada" y se ha sembrado en una placa de Petri de 55 mm de diámetro que contiene un portaobjetos de vidrio estéril y desgrasado. Los cultivos en tubos y en portaobjetos de vidrio se han incubado a +37ºC y se han tratado con glucosamina como se ha descrito en el ejemplo 1. Los cultivos en portaobjetos de vidrio se han recogido de 24 a 48 horas después del tratamiento con glucosamina y se han fijado con acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente o con el 10% de formaldehído tamponado durante 4 horas. Después de esta fijación, todos los portaobjetos de vidrio se han almacenado a -70ºC, en gel de sílice, antes de su utilización para los estudios de hibridación in situ y los estudios de marcado inmunocitoquímico.
Ejemplo 3 Técnicas de detección de secuencias de PCV por hibridación in situ
La hibridación in situ se ha realizado en tejidos extraídos de cerdos enfermos y fijados con formaldehído y también en preparaciones de cultivos de células inoculadas para el aislamiento viral (véase el ejemplo 2) y fijadas en portaobjetos de vidrio.
Se han utilizado sondas genómicas completas correspondientes al circovirus porcino PK/15 (PCV) y al virus de la anemia infecciosa del pollo (chicken anemia virus = CAV). El plásmido pPCV1, que contiene la forma de replicación del genoma de PCV clonada en forma de un único inserto de 1,7 kilopares de bases (kpb) (Meehan B. et al., Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses. J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227) se ha utilizado como fuente de ADN viral específico para PCV. Un plásmido análogo, pCAA1, que contiene la forma de replicación de 2,3 kpb del circovirus aviar CAV se ha utilizado como control negativo. Las reservas de glicerol respectivas de estos dos plásmidos se han utilizado para la producción y la purificación de los plásmidos de acuerdo con la técnica de lisis alcalina (Sambrook J. et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989) para que a continuación sirvan de matrices para la preparación de las sondas. Las sondas de circovirus representativas de los genomas completos de PCV y de CAV se han producido a partir de los plásmidos purificados descritos anteriormente (1 \mug para cada sonda) y de cebadores hexanucleotídicos al azar utilizando un kit comercial de marcado no radiactivo ("DIG DNA labelling kit", Boehringer Mannheim, Lewes, UK) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
Las sondas marcadas con digoxigenina se han suspendido en un volumen de 50-100 \mul de agua estéril antes de su utilización para la hibridación in situ.
Las muestras de tejidos de cerdos enfermos, incluidas en parafina y fijadas con formaldehído, así como las preparaciones de cultivos de células infectadas, fijadas con formaldehído, se han preparado para la detección de los ácidos nucleicos de PCV de acuerdo con la siguiente técnica:
Se han recortado secciones de 5 \mum de grosor a partir de bloques de tejido incluidos en parafina, se han desparafinado y después se han rehidratado en soluciones sucesivas de alcohol a concentración decreciente. Las secciones de tejidos y los cultivos de células fijadas con formaldehído se han incubado respectivamente durante 15 minutos y 5 minutos a +37ºC en una solución de proteinasa K al 0,5% en tampón Tris-HCl 0,05 M, EDTA 5 mM (pH 7,6). Los portaobjetos se han colocado a continuación en una solución de glicina al 1% en agua destilada esterilizada en un autoclave, durante 30 segundos, se lavan dos veces con un tampón PBS (phosphate buffer saline) 0,01 m (pH 7,2) y finalmente se lavan durante 5 minutos en agua destilada estéril. Finalmente se secan al aire libre y se ponen en contacto con las sondas.
Cada preparación de tejido/sonda se ha recubierto con un cubreobjetos apropiado y desengrasado y después se coloca en un horno a +90ºC durante 10 minutos, a continuación se pone en contacto con un bloque de hielo durante 1 minuto y finalmente se incuba durante 18 horas a +37ºC. A continuación, las preparaciones se sumergen brevemente en un tampón de sal de sodio-citrato (SSC) 2x (pH 7,0) para eliminar los cubreobjetos protectores y después se lavan dos veces durante 5 minutos en tampón SSC 2x y finalmente se lavan 2 veces durante 5 minutos en tampón PBS.
Después de estos lavados, las preparaciones se han sumergido en una solución de ácido maleico 0,1 M, NaCl 0,15 M (pH 7,5) (tampón maleico) durante 10 minutos y después se incuban en una solución del 1% de reactivo de bloqueo (Nº de Cat. 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex UK) en tampón maleico durante 20 minutos a +37ºC.
Las preparaciones se han incubado a continuación con una solución a 1/250 de un anticuerpo monoclonal anti-digoxigenina (Boehringer Mannheim), diluido en tampón de bloqueo, durante 1 hora a +37ºC, se lavan en PBS y finalmente se incuban con un anticuerpo biotinilado anti-inmunoglobulina de ratón durante 30 minutos a +37ºC. Las preparaciones se han lavado en PBS y la actividad peroxidasa endógena se ha bloqueado mediante un tratamiento con una solución de peróxido de hidrógeno al 0,5% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las preparaciones se lavan una vez más en PBS y se tratan con un sustrato 3-amino-9-dietilcarbazol (AEC) (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK) preparado extemporáneamente.
Después de un último lavado con agua corriente, las preparaciones se han contra-teñido con hematoxilina "se azulean" en agua corriente y se montan en portaobjetos de microscopio con un líquido de montaje (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK). Los controles del experimento incluían la utilización de una sonda negativa no pertinente (CAV) y de una sonda positiva (PCV) en muestras procedentes de cerdos enfermos y de cerdos no enfermos.
Ejemplo 4 Técnica de detección del PCV por inmunofluorescencia
La selección inicial de todas las preparaciones de cultivo celular fijadas con acetona se ha realizado mediante una técnica de inmunoflourescencia indirecta (IFI) utilizando una dilución al 1/100 de una reserva de sueros de cerdos adultos. Esta reserva de sueros comprende sueros de 25 cerdas adultas de Irlanda del Norte y se sabe que contiene anticuerpos contra una gran variedad de virus porcinos, incluyendo PCV: parvovirus porcino, adenovirus porcino y virus PRRS. La técnica IFI se ha realizado mediante el contacto del suero (diluido en PBS) con los cultivos celulares durante una hora a +37ºC, seguido de dos lavados en PBS. A continuación, los cultivos de células se tiñen con una dilución a 1/80 en PBS de un anticuerpo de conejo anti-inmunoglobulina de cerdo conjugado con isotiocianato de fluoresceína durante una hora y después se lavan en PBS y se montan en tampón glicerol previamente a la observación al microscopio con luz ultravioleta.
Ejemplo 5 Resultados de la hibridación in situ en tejidos de cerdos enfermos
La hibridación in situ, que utiliza una sonda genómica de PCV, realizada en tejidos extraídos de lechones franceses, canadienses y californianos que presentan lesiones de debilitamiento generalizado y fijadas con formaldehído, ha revelado la presencia de ácidos nucleicos de PCV asociados a las lesiones, en varias de las lesiones estudiadas. No se ha observado ninguna señal cuando la sonda genómica de PCV se ha utilizado en tejidos extraídos de cerdos no enfermos o cuando se ha utilizado la sonda de CAV en tejidos de cerdos enfermos. La presencia de ácido nucleico de PCV se ha identificado en el citoplasma y el núcleo de numerosas células mononucleares que infiltran las lesiones en los pulmones de los lechones californianos. La presencia de ácido nucleico de PCV también se ha descubierto en pneumocitos, células epiteliales bronquiales y bronquiolares y en células endoteliales de pequeñas arteriolas, vénulas y vasos linfáticos.
En los cerdos enfermos franceses, la presencia de ácido nucleico de PCV se ha detectado en el citoplasma de numerosos linfocitos foliculares y en las células mononucleares intrasinusoidales de los ganglios linfáticos. El ácido nucleico de PCV también se ha detectado en los sincitios ocasionales. En función de estos resultados de detección, se han seleccionado muestras de pulmones de cerdos californianos, de ganglios linfáticos mesentéricos de cerdos franceses y de órganos de cerdos canadienses para fines de aislamiento de las nuevas cepas de circovirus porcino.
Ejemplo 6 Resultados del cultivo celular de las nuevas cepas de circovirus porcino y detección mediante inmunofluorescencia
No se ha observado ningún efecto citopático (ECP) en los cultivos de células inoculadas con las muestras extraídas de lechones franceses (cepa Imp.1008), californianos (cepa Imp.999) y canadienses (cepa Imp.1010) que muestran signos clínicos del síndrome de debilitamiento generalizado. Sin embargo, el inmuno-marcado de las preparaciones procedentes de los cultivos de células inoculadas, después de la fijación con acetona y con una reserva de sueros policlonales de cerdos, ha revelado una fluorescencia nuclear en numerosas células en los cultivos inoculados a partir de pulmones de lechones californianos (cepa Imp.999), a partir de ganglios linfáticos mediastínicos de lechones franceses (cepa Imp.1008) y a partir de órganos de lechones canadienses (cepa Imp.1010).
Ejemplo 7 Extracción del ADN genómico de los circovirus porcinos
Las formas de replicación de las nuevas cepas de circovirus porcino (PCV) se han preparado a partir de células PK/15 infectadas (véase el ejemplo 1) (10 tubos Falcon de 75 cm^{2}) recogidas después de 72-76 horas de incubación y tratadas con glucosamina, como se describe para la clonación de la forma de replicación de CAV (Todd. D. et al., Dot blot hybridization assay for chicken anemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991. 29. 933-939). El ADN de doble cadena de estas formas de replicación se ha extraído de acuerdo con una modificación de la técnica de Hirt (Hirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures. J. Mol. Biol. 1967. 36. 365-369), como se describe por Molitor (Molitor T.W. et al., Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates. Virology. 1984. 137. 241-254).
Ejemplo 8 Mapa de restricción de la forma de replicación del genoma de la cepa Imp.999 de circovirus porcino
El ADN (1-5 \mug) extraído de acuerdo con la técnica de Hirt se ha tratado con nucleasa S1 (Amersham) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor y después este ADN se ha digerido con diferentes enzimas de restricción (Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, UK) y los productos de la digestión se han separado mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% en presencia de bromuro de etidio como se describe por Todd et al., (Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990. 71. 819-823).
El ADN extraído de los cultivos de la cepa Imp.999 posee un sitio único EcoRI, 2 sitios SacI y no posee sitio PstI. Este perfil de restricción es por lo tanto diferente del perfil de restricción presentado por la cepa de PCV PK/15 (Meehan B. et al., Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses. 1997. 78. 221-227) que por el contrario posee un sitio PstI y no posee sitio EcoRI.
Ejemplo 9 Clonación del genoma de la cepa Imp.999 de circovirus porcino
El fragmento de restricción de aproximadamente 1,8 kpb generado mediante digestión de la forma de replicación de cadena doble de la cepa de PCV Imp.999 con la enzima de restricción EcoRI se ha aislado después de electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (véase el ejemplo 3) utilizando un kit comercial Qiagen (QIAEXII Gel Extraction Kit, Nº de Cat 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK). Este fragmento de restricción EcoRI-EcoRI se ha ligado a continuación con el vector pGEM-7 (Promega, Medical Supply Company, Dublín, Irlanda), previamente digerido con las mismas enzimas de restricción y desfosforilado, siguiendo las técnicas convencionales de clonación (Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Los plásmidos obtenidos se han transformado en una cepa hospedadora de Escherichia coli JM109 (Stratagene, La Jolla, USA) de acuerdo con técnicas convencionales. El fragmento de restricción EcoRI-EcoRI de la cepa de PCV Imp.999 también se ha clonado en el sitio EcoRI del vector pBlueScript SK+ (Stratagene Inc., La Jolla, USA). Entre los clones obtenidos para cada cepa hospedadora, se han seleccionado al menos 2 clones que contienen los fragmentos del tamaño esperado. A continuación, los clones obtenidos se han cultivado y los plásmidos que contienen el genoma completo de la cepa Imp.999 se han purificado en volumen pequeño (2 ml) o en volumen grande (250 ml) de acuerdo con las técnicas convencionales de preparación y de purificación de los plásmidos.
Ejemplo 10 Secuenciación del ADN genómico (forma de replicación de cadena doble) de la cepa de PCV Imp.999
La secuencia de nucleótidos de 2 clones EcoRI Imp.999 (clones pGEM-7/2 y pGEM-7/8) se ha determinado de acuerdo con la técnica de los didesoxinucleótidos de Sanger utilizando el kit de secuenciación "AmpliTaq DNA polymerase FS" (Nº de Cat 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK) y un aparato de secuenciación automática Applied BioSystems ABI373A de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Las reacciones de secuenciación iniciales se han realizado con los cebadores universales M13 "forward" (directo) y "reverse" (inverso). Las reacciones de secuenciación siguientes se han generado de acuerdo con la técnica de "paseo con cebadores" (primer walking). Los oligonucleotidos necesarios para estas posteriores secuenciaciones han sido sintetizados por Life Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, UK).
Las secuencias generadas se han reunido y analizado por medio del programa MacDNASIS versión 3.2. (Nº de Cat 22020101, Appligene, Durham, UK). Los diferentes marcos abiertos de lectura se han analizado por medio del algoritmo BLAST disponible en el servidor del ``National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
La secuencia completa (fragmento EcoRI-EcoRI) obtenida inicialmente a partir del clon pGEM-7/8 (SEC ID Nº 6) se presenta en la figura Nº 6. La secuencia comienza arbitrariamente después de la G del sitio EcoRI y presenta varias incertidumbres en el plano de los nucleótidos.
A continuación la secuenciación se ha optimizado y la SEC ID Nº 3 (Figura 3) da la secuencia total de esta cepa, que se ha hecho comenzar arbitrariamente en el inicio del sitio EcoRI, o sea G como primer nucleótido.
Se procede de manera similar para la obtención de la secuencia de los otros tres aislados de acuerdo con la invención (véase SEC ID Nº 1, 2 y 4 y figuras 1, 2 y 4).
El tamaño del genoma de estas cuatro cepas es:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Imp 1011-48121 \+  \hskip3cm  \+ 1767
nucleótidos\cr  Imp 1011-48285 \+ \+ 1767
nucleótidos\cr  Imp 999 \+ \+ 1768 nucleótidos\cr  Imp 1010 \+ \+
1768
nucleótidos\cr}
Ejemplo 11 Análisis de la secuencia de la cepa de PCV Imp. 999
Cuando la secuencia generada a partir de la cepa Imp.999 se ha utilizado para una búsqueda de homología frente a secuencias contenidas en el banco de datos GenBank, la única homología significativa que se ha detectado es una homología de aproximadamente el 76% (a nivel de ácido nucleico) con la secuencia de la cepa PK/15 (Números de acceso Y09921 y U49186) (véase la figura Nº 5).
Al nivel de los aminoácidos, la búsqueda de homología de la traducción de las secuencias en las 6 fases con los bancos de datos (algoritmos BLAST X en el servidor NCBI) ha permitido descubrir una homología del 94% con el marco abierto de lectura correspondiente a la replicasa teórica del virus BBTV similar al circovirus de plantas (número de identificación GenBank 1841515) codificado por la secuencia GenBank U49186.
Ninguna otra secuencia contenida en los bancos de datos muestra homología significativa con la secuencia generada a partir de la cepa de PCV Imp.999.
El análisis de las secuencias obtenidas a partir de la cepa Imp.999 cultivada a partir de lesiones extraídas de lechones californianos que presentan signos clínicos del síndrome de debilitamiento generalizado, muestra claramente que este aislado viral es una nueva cepa de circovirus porcino.
Ejemplo 12 Análisis comparativo de las secuencias
El alineamiento de las secuencias de nucleótidos de las 4 nuevas cepas de PCV se ha realizado con la secuencia de la cepa de PCV PK/15 (figura 5). Se ha realizado una matriz de homología teniendo en cuenta las cuatro cepas nuevas y la cepa anterior PK/15. Los resultados son los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
1: Imp 1011-48121
2: Imp 1011-48285
3: Imp 999
4: Imp 1010
5: PK/15
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
La homología entre las dos cepas francesas Imp 1011-48121 e Imp 1011-48285 es superior al 99% (0,9977).
La homología entre las dos cepas norteamericanas Imp 999 e Imp 1010 también es superior al 99% (0,9949). La homología entre cepas francesas y cepas norteamericanas es algo superior al 96%.
La homología de todas estas cepas con PK/15 cae hasta un valor comprendido entre el 75 y el 76%.
De esto se deduce que las cepas de acuerdo con la invención son representativas de un nuevo tipo de circovirus porcino, distinto del tipo representado por la cepa PK/15. Este nuevo tipo, aislado de cerdos que presentan el síndrome PMWS, se denomina circovirus porcino de tipo II, representando la PK/15 el tipo 1. Las cepas que pertenecen a este tipo II presentan una notable homogeneidad de secuencia de nucleótidos, incluso cuando se han aislado de regiones geográficas muy alejadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13 Análisis de las proteínas codificadas por el genoma de las nuevas cepas de PCV
La secuencia de nucleótidos del aislado Imp. 1010 se ha considerado representativa de las otras cepas de circovirus asociadas al síndrome de debilitamiento generalizado. Esta secuencia se ha analizado con más detalle con ayuda del algoritmo BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410) y de una combinación de programas del conjunto de programas MacVector 6.0 (Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK). Ha sido posible detectar 4 marcos abiertos de lectura (o MAL) de un tamaño superior a 20 aminoácidos en esta secuencia (genoma circular). Estos 13 MAL son los siguientes:
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las posiciones de inicio y de fin de cada MAL se refieren a la secuencia presentada en la figura Nº 4 (SEC ID Nº 4), del genoma de la cepa 1010. Los límites de los MAL 1 a 13 son idénticos para la cepa 999. También lo son para las cepas 1011-48121 y 1011-48285, salvo para los MAL 3 y 13:
\vskip1.000000\baselineskip
MAL3 1432-1539, sentido, 108 nt, 35 aa
MAL13 314-1377, antisentido, 705 nt, 234 aa. 
\vskip1.000000\baselineskip
De los 13 MAL, 4 presentan una homología significativa con MAL análogos situados en el genoma del virus clonado PCV PK-15. Se ha analizado cada uno de los marcos abiertos de lectura presentes en el genoma de todos los aislados de circovirus asociados al síndrome de debilitamiento generalizado. Estos 4 MAL son los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
Las posiciones de inicio y de fin de cada MAL se refieren a la secuencia presentada en la figura Nº 4 (SEC ID Nº 4). El tamaño del MAL (en nucleótidos = nt) incluye el codón de terminación.
La comparación entre la organización genómica de los aislados PCV Imp. 1010 y PCV PK-15 ha permitido la identificación de 4 MAL conservados en el genoma de los dos virus. La tabla a continuación presenta los grados de homología observados:
4
La mayor identidad de secuencia se ha observado entre el MAL4 Imp. 1010 y el MAL1 PK-15 (86% de homología). Siendo esto esperado en la medida en que esta proteína está implicada probablemente en la replicación del ADN viral y es esencial para la replicación viral (Meehan et al., J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227; Mankertz et al., J. Gen. Virol. 1998. 381-384).
La identidad de secuencia entre el MAL13 Imp. 1010 y el MAL2 PK-15 es menor (66,4% de homología), pero cada uno de estos dos MAL presenta una región básica N-terminal muy conservada, que es idéntica a la región N-terminal de la proteína estructural mayor del circovirus aviar CAV (Meehan et al., Arch. Virol. 1992. 124. 301-319). Se observan mayores diferencias entre MAL7 Imp. 1010 y MAL3 PK-15 y entre MAL10 Imp. 1010 y MAL4 PK-15. En cada caso, existe una deleción de la región C-terminal de los MAL7 y MAL10 del aislado Imp. 1010 cuando se les compara con los MAL3 y MAL4 de PCV PK-15. La mayor homología de secuencia se observa a nivel de las regiones N-terminales de MAL7/MAL3 (61,5% de homología a nivel de la envuelta) y de MAL10/MAL4 (83% de homología a nivel de la envuelta).
Parece que la organización genómica del circovirus porcino es bastante compleja como resultado de la extrema compacidad de su genoma. La proteína estructural mayor es probablemente el resultado de un corte y empalme entre varios marcos de lectura situados en la misma hebra del genoma del circovirus porcino. Por lo tanto, puede considerarse que cualquier marco abierto de lectura (MAL1 a MAL13) tal como se ha descrito en la tabla anterior, puede representar toda o parte de un proteína antigénica codificada por el circovirus porcino de tipo II y es por lo tanto potencialmente un antígeno utilizable para el diagnóstico específico y/o para la vacunación. La invención se refiere por lo tanto a cualquier proteína que comprende al menos uno de estos MAL. Preferiblemente, la invención se refiere a una proteína formada esencialmente por los MAL4, MAL7, MAL10 o MAL13.
Ejemplo 14 Carácter infeccioso del genoma de PCV clonado a partir de las nuevas cepas
El plásmido pGEM-7/8 que contiene el genoma completo (forma de replicación) del aislado Imp.999 se ha transfectado en células PK/15 de acuerdo con la técnica descrita por Meehan B. et al., (Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome fragments. Arch. Virol. 1992. 124. 301-319). El análisis por inmunofluorescencia (véase el ejemplo 4) realizado en el primer paso después de la transfección en células PK/15 no contaminadas ha demostrado que el plásmido del clon pGEM7/8 era capaz de inducir la producción de virus PCV infecciosos. La disponibilidad de un clon que contiene un material genético de PCV infeccioso permite cualquier manipulación útil sobre el genoma viral para producir virus PCV modificados (atenuados en el cerdo o defectivos) utilizables para la producción de vacunas atenuadas o recombinantes o para la producción de antígenos para kits de diagnóstico.
Ejemplo 15 Producción de los antígenos de PCV mediante cultivo in vitro
El cultivo de las células PK/15 no contaminadas y la multiplicación viral se realizan de acuerdo con las mismas modalidades que en el ejemplo 1. Las células infectadas se recogen después de una tripsinización después de 4 días de incubación a 37ºC y se numeran. El siguiente paso se inocula con 400.000 células infectadas por ml.
Ejemplo 16 Inactivación de los antígenos virales
Al final del cultivo viral, las células infectadas se recogen y se lisan mediante ultrasonidos (Branson Sonifier) o con ayuda de un triturador coloidal del tipo rotor-estator (Ultra Turrax, IKA). A continuación, la suspensión se centrifuga a 3700 g durante 30 minutos. La suspensión viral se inactiva con el 0,1% de etilenimina durante 18 horas a +37ºC o con el 0,5% de beta-propiolactona durante 24 horas a +28ºC. Si el título del virus antes de la inactivación es insuficiente, la suspensión viral se concentra mediante ultrafiltración utilizando una membrana con un umbral de corte de 300 kDa (Millipore PTMK300). La suspensión viral inactivada se conserva a +5ºC.
Ejemplo 17 Preparación de la vacuna en forma de emulsión a base de aceite mineral
La vacuna se prepara de acuerdo con la siguiente fórmula:
-
suspensión de circovirus porcino inactivado: 250 ml
-
Montanide® ISA 70 (SEPPIC): 750 ml
La fase acuosa y la fase oleosa se esterilizan por separado mediante filtración. La emulsión se prepara mediante mezcla y homogeneización de los ingredientes con ayuda de un emulsor con turbina Silverson.
Una dosis de vacuna contiene aproximadamente 10^{7,5} DICT50. El volumen de una dosis de vacuna es de 0,5 ml para administración por vía intradérmica y de 2 ml para administración por vía intramuscular.
Ejemplo 18 Preparación de la vacuna en forma de emulsión a base de aceite metabolizable
La vacuna se prepara de acuerdo con la siguiente fórmula:
-
suspensión de circovirus porcino inactivado: 200 ml
-
Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 ml
-
Radia 7204 (Oleofina): 740 ml
La fase acuosa y la fase oleosa se esterilizan por separado mediante filtración. La emulsión se prepara mediante mezcla y homogeneización de los ingredientes con ayuda de un emulsor con turbina Silverson.
Una dosis de vacuna contiene aproximadamente 10^{7,5} DICT50. El volumen de una dosis de vacuna es 2 ml para administración por vía intramuscular.
Ejemplo 19 Resultados de inmunofluorescencia indirecta frente a cepas de virus PCV de EEUU y francesa y del contaminante PK/15 con un suero hiperinmune (PCV-T), un panel de anticuerpos monoclonales F99, preparados a partir de PK/15 y un suero hiperinmune preparado a partir de la cepa canadiense (PCV-C)
5
<110> MERIAL
\hskip1.05cmUniversidad de Sskatchewan
\hskip1.05cmUniversidad de Belfast
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos circovirus porcinos, vacunas y reactivos de diagnóstico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Circovirus porcinos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/FR98/02107
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 10-01-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 9800873
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 22-01-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 9803707
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 20-03-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 9712382
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 03-10-1997
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1767
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Circovirus porcino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1767
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Circovirus porcino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1768
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Circovirus porcino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1768
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Circovirus porcino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1759
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Circovirus porcino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Circovirus porcino
\vskip1.000000\baselineskip
12

Claims (21)

1. Método de diagnóstico de la infección por un circovirus porcino de tipo II, responsable en el cerdo del síndrome de debilitamiento generalizado posterior al destete (PMWS), método en el que se ponen en contacto una muestra de fluido fisiológico o una extracción de tejido de un cerdo y un reactivo de diagnóstico específico del circovirus de tipo II y se revela la posible presencia de antígeno, anticuerpo o ácido nucleico específico del circovirus porcino de tipo II, en esta muestra o extracción.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo de diagnóstico comprende al menos una secuencia de ADN que forma una sonda o un cebador específico del circovirus porcino de tipo II.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo de diagnóstico comprende la secuencia SEC ID Nº 6.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo de diagnóstico comprende al menos un fragmento de la secuencia SEC ID Nº 6, permitiendo este fragmento la formación de una sonda o un cebador específico del circovirus porcino de tipo II.
5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el método se basa en una técnica de hibridación o de Reacción en Cadena de la Polimerasa.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo comprende un antígeno específico del circovirus porcino de tipo II.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el reactivo comprende un epítopo o un polipéptido específico del circovirus porcino de tipo II, codificado por un fragmento de la secuencia SEC ID Nº 6.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el antígeno, epítopo o polipéptido permite detectar anticuerpos en la muestra o extracción, siendo estos anticuerpos específicos del circovirus porcino de tipo
II.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo comprende un anticuerpo específico de un antígeno del circovirus porcino de tipo II.
10. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza un reactivo que comprende un anticuerpo específico del circovirus porcino de tipo II y un reactivo que comprende un antígeno específico del circovirus porcino de tipo II.
11. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque se aplica un método de tipo Transferencia de Western, inmunofluorescencia, ELISA o inmunocromatografía.
12. Método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque se aplica un método de ensayo indirecto, de competición o de desplazamiento.
13. Preparación aislada de anticuerpos específicos del circovirus porcino de tipo II, responsable en el cerdo del síndrome de debilitamiento generalizado posterior al destete (PMWS), que puede obtenerse a partir de un circovirus porcino de tipo II o de un fragmento antigénico de un circovirus porcino de tipo II o a partir de un polipéptido codificado por un fragmento de la secuencia SEC ID Nº 6.
14. Preparación de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque el circovirus porcino de tipo II se selecciona entre los depositados en la ECACC con las referencias V97100217, V97100218 y V97100219.
15. Preparación de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, caracterizada porque los anticuerpos son anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales.
16. Preparación de acuerdo con la reivindicación 13, 14 ó 15, caracterizada porque los anticuerpos comprenden anticuerpos marcados.
17. Preparación de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizada porque los anticuerpos se marcan con peroxidasa o con un marcado de partículas, por ejemplo oro coloidal.
18. Preparación antigénica aislada, que comprende un antígeno específico del circovirus porcino de tipo II, responsable en el cerdo del síndrome de debilitamiento generalizado posterior al destete (PMWS), siendo este antígeno reconocido por anticuerpos específicos del circovirus porcino de tipo II y permitiendo diagnosticar la infección por un circovirus porcino de tipo II.
\newpage
19. Kit para el diagnóstico de la infección por un circovirus porcino de tipo II responsable en el cerdo del síndrome de debilitamiento generalizado posterior al destete (PMWS), que comprende al menos un anticuerpo y/o antígeno
tal(es) como se ha(n) definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18.
20. Kit de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende los medios para realizar un método de diagnóstico de tipo Transferencia de Western, inmunofluorescencia, ELISA o inmunocromatografía.
21. Kit de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende los medios para realizar un método de ensayo indirecto, de competición o de desplazamiento.
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