HU226247B1 - Newly isolated porcine circoviruses, circovirus vaccines and diagnostic reagents - Google Patents

Newly isolated porcine circoviruses, circovirus vaccines and diagnostic reagents Download PDF

Info

Publication number
HU226247B1
HU226247B1 HU0003756A HUP0003756A HU226247B1 HU 226247 B1 HU226247 B1 HU 226247B1 HU 0003756 A HU0003756 A HU 0003756A HU P0003756 A HUP0003756 A HU P0003756A HU 226247 B1 HU226247 B1 HU 226247B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
circovirus
type
porcine
vaccine
pcv
Prior art date
Application number
HU0003756A
Other languages
English (en)
Inventor
Gordon Allan
Brian Meehan
Edward Clark
John Ellis
Deborah Haines
Lori Hassard
John Harding
Catherine Elisabeth Charreyre
Gilles Emile Chappuis
Francis Mcneilly
Original Assignee
Merial Sas
Univ Belfast
Univ Saskatchewan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27253376&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU226247(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from FR9712382A external-priority patent/FR2769321B1/fr
Priority claimed from FR9800873A external-priority patent/FR2769322B1/fr
Priority claimed from FR9803707A external-priority patent/FR2776294B1/fr
Application filed by Merial Sas, Univ Belfast, Univ Saskatchewan filed Critical Merial Sas
Publication of HUP0003756A2 publication Critical patent/HUP0003756A2/hu
Publication of HUP0003756A3 publication Critical patent/HUP0003756A3/hu
Publication of HU226247B1 publication Critical patent/HU226247B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0321—Propionic acid bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0323—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin using only lactic acid bacteria, e.g. Pediococcus and Leuconostoc species; Bifidobacteria; Microbial starters in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16741—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16743—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/10064—Methods of inactivation or attenuation by serial passage

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány szerinti megoldás alkalmas PCV-fertőzéssel összefüggő rendellenességek megelőzésére és kezelésére.
A leírás terjedelme 32 oldal (ezen belül 18 lap ábra)
HU 226 247 Β1
A találmány tárgyát újonnan izolált, sertésből származó cirkovírus-törzsek (rövidítése PCV, azaz „Porcine CircoVirus”), amelyek a PMWS-szindrómáért („Porcine Multisystemic Wasting Syndrome” azaz sertésben előforduló, multiszlsztémás sorvadási szindróma, melyet „Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome”-nak, azaz elválasztás utáni, multiszisztémás sorvadási szindrómának is neveznek) felelősek, vakcinációs eljárások és vakcinák, valamint ilyen reagensek és vakcinák előállítására szolgáló eljárások képezik.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható PCV-fertőzéssel összefüggő rendellenességek megelőzésére és kezelésére.
PCV-t eredetileg nem citopatogén szennyeződésként detektáltak PK/15 jelű, sertésveséből, származó sejtvonalban. A vírust Circoviridae közé sorolták, csirkéből származó anémiavírussal (rövidítése CAV, azaz „Chicken Anaemia Vírus) és PBFDV-vírussal („Pscittacine Beák and Feather Disease Vírus) együtt. Kis, nem becsomagolt vírus (15-24 nm), amelynek általános jellemzője, hogy genomját 1,76-2,31 kb méretű, cirkuláris, egyszálú DNS formájában tartalmazza. Eleinte azt gondolták, hogy ez a genom körülbelül 30 kDa méretű polipeptidet kódol [Todd és munkatársai Arch. Virol. 117, 129-135 (1991)]. A közelmúltban kimutatták, hogy összetettebb transzkripcióról van szó [Meehan Β. M. és munkatársai, J. Gén. Virol. 78, 221-227 (1997)]. Továbbá ismereteink szerint nincs szignifikáns homológia a nukleotidszekvenciák között, vagy nincs közös antigéndetermináns a három cirkovírus-típusban.
A ΡΚ/15-sejtekből származó PCV-t nem tekintjük patogénnek. Szekvenciáját Β. M. Meehan és munkatársai írták le [J. Gén. Virol. 78, 221-227 (1997)]. Csak igen friss leírásokban néhány szerző állítja, hogy a PCV-törzsek patogének lehetnek, és PMWS-szindrómával asszociáltak [Gupi P. S. Nayar és munkatársai, Can. Vet. J. 38, 385-387 (1997); és Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 499-501 (1997)]. Nayar és munkatársai PCV-DNS-t PCR-technikák alkalmazásával detektáltak PMWS-szindrómában szenvedő sertésekben. Vad típusú PCV-törzset eddig azonban nem izoláltak és tisztítottak.
A PMWS-szindrómát Kanadában, az USA-ban és Franciaországban detektálták és fokozatos tömegvesztés, és például szapora légzés, nehéz légzés és sárgaság megnyilvánulásával jellemezték klinikailag. Patológiai szempontból limfocitikus vagy granulomás infiltrációként, limfadenopátlaként és ritkábban hepatitiszként és limfocitikus vagy granulomás nefritiszként nyilvánul meg [Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 499-501 (1997); La Semaine Vétérinaire No. 26, supplement „La Semaine Vétérinaire”-hoz 54, 857 (1997); Gupi P. S. Nayar és munkatársai, Can. Vet. J. 38, 385-387 (1997)].
öt új PCV-törzset sikerült izolálnunk kanadai, amerikai egyesült államokbeli (Kalifornia) és franciaországi (Brittany) farmokról származó, tüdő vagy ganglionális mintákból, melyeket a továbbiakban a leírásban találmány szerinti cirkovírusoknak nevezünk. Ezeket a vírusokat PMWS-szindrómában szenvedő sertésekben előforduló sérülésekben detektáltuk, de egészséges sertésekben nem.
Továbbá ezen törzsek közül négynek szekvenáltuk a genomját, konkrétan Kanadából és USA-ból, valamint két Franciaországból származó törzs genomját. A törzsek nagyon erős, 96%-ot meghaladó homológiát mutatnak egymással nukleotidszinten, és kisebb mértékű, körülbelül 76%-os homológiát mutatnak a PK/15törzzsel. Az új törzseket így új típusú, sertésből származó cirkovírusok képviselőinek tekinthetjük, melyeket a leírásban II. típusnak hívunk, míg az I. típust a PK/15 képviseli.
A találmány tárgyát tehát a fentebb definiáltak szerint, II. típusú, sertésből származó cirkovírus képezi, izolált vagy tisztított preparátum formájában.
A találmány tárgya bármilyen olyan sertéseredetű cirkovírus, amelyet PMWS-szindrómában szenvedő sertésből származó fiziológiai mintából vagy szövetmintából lehet izolálni, különösen sérülésekből, főleg a példákban leírt eljárást követve, különösen II. típusú cirkovírus.
A találmány tárgya konkrétabban meghatározva öt törzsből tisztított preparátum, amelyeket az ECACCban (European Collection of Cell Cultures, Centre fór Applied Microbiology&Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Egyesült Királyság) deponáltunk 1997. október 2-án, csütörtökön:
nyilvántartási szám: V97100219 (a leírásban Imp. 1008PCV-nek nevezzük), nyilvántartási szám: V97100218 (a leírásban Imp. 1010PCV-nek nevezzük), nyilvántartási szám: V97100217 (a leírásban Imp. 999PCV-nek nevezzük), és amelyeket 1998. január 16-án, pénteken deponáltunk:
nyilvántartási szám: V98011608 (a leírásban Imp. 1011-48285-nek nevezzük), nyilvántartási szám: V98011609 (a leírásban Imp. 1011-48121-nek nevezzük).
A találmány tárgyának tekintjük azokat a sertésből származó cirkovírusokat, amelyeket beteg sertésből izoláltunk, és/vagy azokat a cirkovírusokat, amelyek szignifikáns szerológiai hasonlósággal rendelkeznek a találmány szerinti törzsekkel, és/vagy azokat a cirkovírusokat, amelyek sztringens körülmények között képesek kereszthibridizálni a találmány szerinti törzsekkel, így tehát nincs hibridizáció a PCV-PK/15törzzsel.
PMWS-szindrómában szenvedő sertésből származó fiziológiai mintából vagy szövetmintából, különösen sérülésekből izolált vírustörzsek előnyösen szaporíthatok sejtvonalakon, például elsősorban sertésveséből származó sejtvonalakon, különösen szennyeződéstől mentes ΡΚ/15-sejtekben (főleg PCV, valamint pestivírusok, sertésből származó adenovírusok és sertésből származó parvovírusok esetén) felszaporításuk céljából vagy speciálisan antigén termeltetése céljából, egész antigén (például vírus) és/vagy alegységek (például polipeptidek) formájában.
HU 226 247 Β1
Nagyon szokatlanul és váratlanul, ezek az izolátumok nagyon termelékenynek bizonyultak tenyészetben ΡΚ/15-sejteken, amelyek kétségtelenül előnyösek vírus vagy antigén előállítására, különösen inaktivált vakcina előállítására.
A találmány tárgyát képezik sejtekre passzálás után izolált cirkovírus-preparátumok is, különösen sejtvonalakra, például ΡΚ/15-sejtekre, melyeket in vitro tenyésztünk, miközben megfertőzünk a találmány szerinti legalább egy cirkovírussal, vagy bármilyen olyan sertéseredetű cirkovírussal, amelyet PMWS-szindrómában szenvedő sertésből származó fiziológiai mintából vagy szövetmintából lehet izolálni, különösen sérülésekből. Szintén a találmány tárgyát képezi a tenyészetből előállított extraktum vagy felülúszó, adott esetben standardtechnikákkal tisztítva, és általában bármilyen antigenikus preparátum, melyeket in vitro tenyészetekből állítunk elő.
Szintén a találmány tárgyát képezik az a fentebb definiált immunogén hatóanyagok és legalább egy antigént tartalmazó vakcinák.
Lehetnek legyengített, élő, teljes vírusokra alapuló, immunogén hatóanyagok, vagy ezen hatóanyagokkal előállított vakcinák, amelyben a legyengítést szokásos eljárások szerint végezzük, például sejtekre passzálással, előnyösen sertéseredetű sejtekre passzálással, különösen sejtvonalakra, például ΡΚ/15-sejtekre (például 50-150, különösen 100-as nagyságrendű passzázsokkal). Ezek a vakcinák általában állatorvosi szempontból elfogadható segédanyagot vagy hígítószert tartalmaznak, adott esetben állatorvosi szempontból elfogadható adjuvánst, valamint adott esetben liofilizáláshoz stabilizálószert.
Ezek a vakcinák előnyösen 103—106 TCID50-et tartalmaznak.
Lehetnek a találmány szerinti cirkovírus-antigénre alapuló, immunológiailag aktív hatóanyagok vagy vakcinák, inaktivált állapotban. A vakcinák általában állatorvosi szempontból elfogadható segédanyagot vagy hígítószert tartalmaznak, továbbá adott esetben állatorvosi szempontból elfogadható adjuvánst.
A találmány szerinti cirkovírusokat, az esetleg jelen lévő frakciókkal, szakember által ismert technikákkal inaktiváljuk. Az inaktiválást előnyösen kémiai úton végezzük, például az antigént kémiai ágens, például formaldehid (formaiin), paraformaldehid, β-propiolakton vagy etilén-imin vagy származékaik hatásának tesszük ki. Az inaktiválásra alkalmazott, találmány szerint előnyös módszer kémiai ágens, különösen etilén-imin vagy β-propiolakton alkalmazása.
A találmány szerinti inaktivált vakcinákat előnyösen kiegészíthetjük adjuvánssal, így azokat előnyösen emulzióként biztosítjuk, például „víz az olajban vagy „olaj a vízben” formára hozzuk szakember által jól ismert technikák szerint. Az adjuváns-tulajdonság származhat onnan is, hogy egy szokásos adjuváns-komponenst beépítünk a hatóanyagba.
Az alkalmazható adjuvánsok között megemlíthetjük például az alumínium-hidroxidot, a szaponinokat [például Quillaja saponin vagy Quil A; lásd „Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” (1995), szerk. Michael F. Powel and Mark J. Newman, Plennum Press, New York and London, 210. old.], Avridine®-t („Vaccine Design” 148. old.), DDA-t (dimetildioktadecil-ammónium-bromid, „Vaccine Design” 157. old.), polifoszfazént („Vaccine Design” 204. old.), vagy más módszer szerint, ásványi olajra alapuló „olaj a vízben” emulziókat (például SPT-emulziót, „Vaccine Design” 147. old.), szkvalént (például MF59, „Vaccine Design 183. old.), vagy metabolizálható olajra alapuló „víz az olajban” emulziókat (előnyösen WO-A-94/20071. sz. nemzetközi közzétételi irat szerint), valamint az 5.422.109. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett emulziókat. Adjuváns-komblnációkat is lehet választani, például Avridine®-t vagy DDA-t egy emulzióval kombinálva.
Ezek a vakcinák előnyösen 106—10® TCID50-et tartalmaznak.
Élő vakcinaadjuvánsokat azok közül lehet választani, amiket megadtunk az Ínaktivált vakcinákra vonatkozóan. Az emulziókat részesítjük előnyben. Az inaktivált vakcinákra leírtakhoz még hozzávehetjük a WO-A-94/16681. sz. nemzetközi közzétételi iratban leírtakat.
Liofilizáláshoz alkalmazott stabilizálószerként megemlíthetjük például SPGA-t [Bovarnik és munkatársai, J. Bacteriology 9, 509, 950], szénhidrátokat, például szorbitot, mannitot, keményítőt, szacharózt, dextránt vagy glükózt, fehérjéket, például albumint vagy kazeint, ezen vegyületek származékait, vagy puffereket, például alkálifém-foszfátokat.
Előállítottuk a négy izolátumból származó genomot, melyeket 1-4., és adott esetben 6. azonosító számú szekvenciaként azonosítottunk.
A találmány tárgya ennélfogva ezen szekvenciák egyikének egészét vagy részét tartalmazó DNS-fragmens. Külön említés nélkül, automatikusan a találmány tárgyát képezik ekvivalens szekvenciák, azaz olyan szekvenciák, amelyek nem változtatják meg a leírt szekvenciák vagy ezen szekvenciák által kódolt polipeptidek funkcióját vagy törzsspecifitását. Természetesen a találmány tárgyát képezik a kodon degeneráltsága következtében eltérő szekvenciák.
Szintén a találmány tárgyát képezik ekvivalens szekvenciák abban az értelemben, hogy nagymértékben sztringens körülmények között képesek hibridizálódni a fenti szekvenciákkal és/vagy nagymértékű homológiával rendelkeznek a találmány szerinti törzsekkel, és a fentebb definiált II. csoporthoz tartoznak.
Ezek a szekvenciák és fragmenseik előnyösen alkalmazhatók polipeptidek in vitro vagy in vivő expresszálására, megfelelő vektorok segítségével.
Konkrétan, a találmány szerinti DNS-fragmenseket kialakító, a fenti célokra alkalmazható nyitott leolvasási fázisokat azonosítottunk II. típusú cirkovírusok genomi szekvenciáján. A találmány tárgyát képezi bármilyen polipeptid, amely ezen nyitott leolvasási fázisoknak megfelelő aminosavszekvenciák közül legalább egyet tartalmaz. A találmány tárgyát képezi előnyösen olyan fehérje, amely lényegében ORF4-ből, ORF7-ből, ORF10-ből vagy ORF13-ből származik.
HU 226 247 Β1
Alegységek in vitro expresszálása céljából, az expresszió eszközeként előnyösen E. colit vagy baculovírust alkalmazunk (4.745.051. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Fragmenseik kódolószekvenciáját (szekvenciáit) baculovírusgenomba integráljuk (például Autographa californica nukleáris polihedrózis vírusba, AcNPV), és ez utóbbit azután rovarsejteken szaporítjuk, például Spodoptera frugiperda Sf9-en (ATCC CRL 1711-ként deponálva). Az alegységeket eukarióta sejtekben is termeltethetjük, például élesztőben (például Saccharomyces cerevisiae) vagy emlőssejtekben (például CHO, BHK).
A találmány tárgyát képezik olyan polipeptidek is, amelyek ezekkel az expressziós eszközökkel in vitro termeltethetők, és azután adott esetben szokásos technikákkal meg vannak tisztítva. A találmány tárgyát képezik alegységvakcinák is, amelyek legalább egy, így előállított polipeptidet vagy fragmenst tartalmaznak, állatorvosi szempontból elfogadható segédanyagban vagy hígítószerben, és adott esetben állatorvosi szempontból elfogadható adjuvánst.
Rekombináns élő vakcinák előállítása céljából, in vivő expresszióra a kódolószekvenciát (szekvenciákat) vagy fragmenseiket megfelelő expressziós vektorba inszertáljuk olyan körülmények között, hogy az lehetővé tegye a polipeptid(ek) expresszióját. Alkalmas vektorként alkalmazhatunk élő vírusokat, előnyösen sertésekben szaporodni képes, sertésekre nem patogén vírusokat (természetes körülmények között nem patogén, vagy ilyenné van alakítva), szakember által jól ismert technikák szerint. Különösen sertésből származó herpeszvírust, például az Aujeszky-féle betegség vírusát, sertéseredetű adenovírust, himlővírust, különösen tehénhimlővírust, madárhimlővírust, kanárihimlő-vírust vagy sertéshimlővlrust alkalmazhatunk. Vektorként plazmid-DNS-eket is alkalmazhatunk (WO-A90/11092, WO-A-93/19813, WO-A-94/21797, WO-A-95/20660 sz. nemzetközi közzétételi irat szerint).
A találmány tárgyát képezik ennélfogva így előállított vektorok és rekombináns élő vakcinák vagy plazmidvakcinák (polinukleotid- vagy DNS-vakcinák) is, amely vakcinák továbbá állatorvosi szempontból elfogadható segédanyagot vagy hígítószert tartalmaznak.
A találmány szerinti vakcinák (élő legyengített, inaktivált, alegység, rekombináns és plazmidvakcinák) a találmány szerinti, egy vagy több (2 vagy 3) cirkovírusból származó, egy vagy több hatóanyagot (antigént) tartalmazhatnak.
A fentebb leírt egyes vakcinatípusok esetén, a találmány szerinti megoldás lehetőséget biztosít kombinációs vakcinációra is sertéseredetű cirkovírusok ellen, más sertéspatogének elleni vakcinációval együtt, különösen olyanok ellen, amelyek PMSW-szindrómával asszociáltak. A találmány szerinti vakcinák, különösen az inaktivált vakcinák ezért tartalmazhatnak más sertéspatogénnek megfelelő, másik valenciát. Ezen más sertéspatogének közül előnyösen megemlíthetjük a PRRS-t („Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome, azaz sertésben előforduló, szaporodási és légzési szindróma) (szakembernek szóló hivatkozások: WO-A-93/07898, WO-A-94/18311 sz. nemzetközi közzétételi iratokat; FR-A-2 709 966 sz. francia közzétételi iratot; C. Chareyre és munkatársai, „Proceedings of the 15th IPVS Congress”, Birmingham, England, 1998. július 5-9., 139. old., melyeket a kitanítás részének tekintünk) és/vagy a Mycoplasma hyopneumoniat (szakembernek szóló hivatkozások: EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A-571 648 sz. európai közzétételi iratok; „Proceedings of the 15th IPVS Congress”-ben O. Martinon és munkatársai, 157., 284., 285. old. és G. Reynaud és munkatársai, 150. old., melyeket a kitanítás részének tekintünk). Más, jelentős valenciák közül még megemlíthetjük Actinobaclllus pleuropneumoniaet, E. colit, sertésből származó Atrophic rhinitist (sorvadásos ormyálkahártya-gyulladást) és Pseudorabiest (veszettséget, Aujeszky-féle betegséget), sertéskolerát és sertésinfluenzát.
A találmány tárgyát képezi eljárás is immunválasz indukálásra sertésekben a találmány szerinti cirkovírusok ellen. A találmány tárgya különösen sertésekben hatékony, vakcinációs eljárás.
Az eljárásban sertéseknek beadunk a fentebb leírt vakcinából egy vagy több adagot. A fentebb leírt vakcinák közül kombinálni is lehet néhány típust, ugyanabban a vakcinációs eljárásban.
Az eljárásban nemcsak kifejlett sertéseknek adunk be vakcinát, hanem fiatal sertéseknek vagy vemhes nőstényeknek is. Ez utóbbiak vakcinációja pozitív immunitást biztosíthat az újszülötteknek (anyai ellenanyagok).
A találmány szerinti megoldás lehetőséget biztosit a találmány szerinti cirkovírusok jelenlétének diagnosztizálására is sertésekben. Tehát a találmány tárgyát képezik ide vonatkozó diagnosztikai tesztek és eljárások, a lentebb leírt reagenskészletek alkalmazásával.
A különböző cirkovírusok szekvenciáinak ismerete lehetővé teszi közös szekvenciák definiálását, amely lehetővé tesz valamennyi ismert, sertéseredetű cirkovírust felismerni képes reagensek előállítását.
Szakember arra is képes, hogy olyan szekvenciafragmenseket szelektáljon, amelyek a megfelelő PK/15 cirkovírus-szekvenciával kismértékű homológiát mutató régióknak vagy homológiát nem mutató régióknak felelnek meg, specifikus diagnózis elvégzése céljából.
Szekvenciák egymás alá rendezése szakember számára lehetővé tesz igény szerinti reagens szelektálását.
Az első reagensnek megfelelnek a találmány szerinti DNS-szekvenciák és fragmensei, amelyeket elsősorban próbaként vagy láncindító oligonukleotidként alkalmazunk jól ismert hibridizációs vagy PCR-technikákban (polimeráz-láncreakcióban).
A második reagensnek azok a polipeptidek felelnek meg, amelyeket ezen vírusszekvenciák kódolnak, vagy vektor (lásd fentebb) segítségével expresszálódtak, vagy kémiai úton lettek szintetizálva szokásos, peptidszintézisre szolgáló technikák szerint.
A harmadik és negyedik reagenst a megfelelő poliklonális és monoklonális ellenanyagok jelentik, amelye4
HU 226 247 Β1 két a vírus, a polipeptidek vagy fragmenseik alkalmazásával termeltethetünk, extrahálhatunk szokásos technikák szerint, vagy a DNS-szekvenciák kódolhatják azokat.
Ezen második, harmadik és negyedik reagenst olyan diagnosztikai eljárásban alkalmazhatjuk, amely a találmány tárgyát képezi, amelyben egy tesztet hajtunk végre tesztelendő sertésből vett fiziológiai folyadékmintán (vér, plazma, szérum és hasonlók) vagy szövetmintán (idegdúc, máj, tüdő, vese és hasonlók) a találmány szerinti cirkovírusra specifikus antigén jelenlétére úgy, hogy megkíséreljük detektálni magát az antigént, vagy ezen antigénre specifikus ellenanyagokat.
A találmány szerinti antigéneket és ellenanyagokat bármilyen ismert laboratóriumi diagnosztikai technikában alkalmazhatjuk.
Mindazonáltal előnyösen alkalmazhatjuk azokat olyan technikákban, amelyeket közvetlenül állatorvos, az állatok tenyésztője vagy tulajdonosa alkalmaz a tenyésztőhelyen. Szakember számára sok, különféle laboratóriumi és tenyésztőhelyen elvégezhető technika áll rendelkezésre, és ennélfogva tökéletes helyzetben van ahhoz, hogy az antigént és/vagy ellenanyagokat diagnosztikai reagensként való alkalmazásra adaptálja.
A találmány keretei között előnyösen alkalmazható diagnosztikai technikák lehetnek: Western-blottolás, immunfluoreszcencia, ELISA és immunkromatográfia.
Immunkromatográfiás módszerek alkalmazásának tekintetében, szakembernek szóló hivatkozások főleg az alábbiak: Róbert F. Zurk és munkatársai, Clin. Chem. 3117, 1144-1150 (1985), valamint szabadalmi leírások és bejelentések: WO-A-88/08534, WO-A-91/12528 sz. nemzetközi közzétételi iratok, EP-A-291 176, EP-A-299 428, EP-A-291 194, EP-A-284 232 sz. európai közzétételi iratok, 5.120.643, 5.030.558, 5.266.497, 4.740.468,
5.266.497, 4.855.240, 5.451.504, 5.141.850, 5.232.835 és 5.238.652 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások.
Ennek megfelelően, a mintában előnyösen megkísérelünk specifikus ellenanyagokat detektálni közvetett teszt, kompetíció vagy leszorítás alkalmazásával. Ennek elvégzése céljából magát az antigént alkalmazzuk diagnosztikai reagensként, vagy ezen antigén olyan fragmensét, amely megőrizte az ellenanyag általi felismerhetőségét. A jelölést előnyösen peroxidázzal vagy speciális jelölővel, előnyösen kolloidális arannyal végezzük.
Az is kívánatos lehet, hogy magát az antigént detektáljuk a mintában, ezen antigénre specifikus, jelölt ellenanyag segítségével. Az előnyös jelölést a fentebb leírtak szerint végezzük.
Főleg kompetícióban vagy leszorításban vagy magának az antigénnek detektálásában alkalmazott, az antigénre specifikus ellenanyagon az antigénre specifikus monoklonális vagy poliklonális ellenanyagokat, ezen ellenanyagok fragmenseit, előnyösen Fab vagy F(ab)’2 fragmenseket értünk.
A találmány másik vonatkozásában, a találmány tárgyát képezi eljárás a találmány szerinti antigénre specifikus poliklonális vagy monoklonális ellenanyag előállítására, amely lehetővé teszi, hogy azután ezeket az ellenanyagokat főként diagnosztikai reagensként alkalmazzuk fiziológiai folyadékban vagy szövetmintában lévő antigén detektálására, sőt, ilyen mintában vagy fajban lévő ellenanyagok detektálására. A találmány tárgyát képezik ezen ellenanyagok immunológiailag működőképes fragmensei, különösen Fab vagy F(ab)'2 fragmensei.
Ellenanyagokat szokásos technikák alkalmazásával lehet előállítani. Hivatkozásként lásd főleg: „Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), USA, vagy J. W. Goding, „Monoclonal Antibodies: Principles and Practice”, Academic Press Inc., melyek tartalmát a kitanítás részének tekintünk.
önmagában is ismert eljárásban elsősorban olyan fúziót lehet végezni, amelyben az antigénnel vagy legalább egy fragmensével immunizált egerekből származó lépsejteket fuzionálunk alkalmas mielómasejtekkel.
A találmány tárgyát képezi az antigénre specifikus, monoklonális vagy poliklonális ellenanyagok preparátuma is, előnyösen tiszta vagy részlegesen tiszta, sőt akár nyers formában, különösen egérben vagy nyúlban termeltetett ellenanyagok.
A találmány szerinti megoldás lehetővé tesz kérdéses epitópok meghatározását is, főleg a leírás szerinti DNS-szekvenciák alapján, akár vakcina szempontjából jelentős, akár diagnosztikai szempontból jelentős epitópokat. Szakember abban a helyzetben van, hogy a találmány szerinti cirkovírus genomjának DNS-szekvenciájából képes meghatározni epitópokat ismert módszerek szerint, például megfelelő számítógépes program vagy PEPSCAN alkalmazásával. Az epitópok fehérjék immunológiailag domináns régiói, és mint ilyen régiók, a fehérjék felszínén, kitett helyen lévő régiók. Ezért ellenanyagok képesek ezt felismerni, és ezért különösen alkalmasak diagnosztikai területen való felhasználásra, akár ellenanyagok előállítása céljából diagnosztikai célokra, akár megfelelő peptidek előállítására, amelyeket diagnosztikai reagensként lehet alkalmazni.
Egy epitóp legalább 8-9 aminosavból álló peptid. Általában minimum 13-25 aminosav előnyös.
Szakember abban a helyzetben van, hogy ezen technikák közül egyet vagy többet, valamint más, rendelkezésre álló technikákat alkalmazva képes epitópokat találni peptidek vagy ellenanyagok diagnosztikai célokra való alkalmazására.
A találmány tárgyát képezi diagnosztikai reagenskészlet is, amely ezt az antigént és/vagy ezen antigénre specifikus, poliklonális vagy monoklonális ellenanyagokat tartalmaz. Ezek különösen olyan diagnosztikai reagenskészletek, amelyek megfelelnek a fentebb leírt diagnosztikai technikáknak.
A találmány szerinti megoldást részletesebben példaként bemutatott, előnyös megvalósítási módok segítségével ismertetjük, amelyekkel nem kívánjuk korlátozni az igényelt oltalmi kört, és amelyekben az ábrákra hivatkozunk, amelyek:
l.ábra: Az lmp.1011-48121-törzs genomjának DNS-szekvenciája.
HU 226 247 Β1
2. ábra: Az lmp.1011-48285-törzs genomjának
DNS-szekvenciája.
3. ábra: Az lmp.999-törzs genomjának DNS-szekvenciája.
4. ábra: Az lmp.1010-törzs genomjának DNSszekvenciája.
5. ábra: Az 1-4. ábrák szerinti, 4 szekvencia és a
PCV-PK/15-törzs szekvenciájának egymás alá rendezése.
6. ábra: Az lmp.999-törzs genomjának DNS-szekvenciája, ahogyan az első, franciaországi benyújtás alkalmával definiáltuk 1997. október 3-án.
7. ábra: A 6. ábrán lévő szekvencia és a PK/15törzs szekvenciájának egymás alá rendezése.
Szekvencialista
1. azonosító számú szekvencia: az lmp.1011—48121törzs genomjának DNS-szekvenciája.
2. azonosító számú szekvencia: az lmp.1011-48285törzs genomjának DNS-szekvenciája.
3. azonosító számú szekvencia: az lmp.999-törzs genomjának DNS-szekvenciája.
4. azonosító számú szekvencia: az lmp.1010-törzs genomjának DNS-szekvenciája.
5. azonosító számú szekvencia: a PK/15-törzs genomjának DNS-szekvenciája.
6. azonosító számú szekvencia: az lmp.999-törzs genomjának DNS-szekvenciája, ahogyan az első, franciaországi benyújtás alkalmával definiáltuk 1997. október 3-án.
1. példa
Sertésből származó cirkovírus-törzsek tenyésztése és izolálása
A szövetmintákat Franciaországban, Kanadában és az USA-ban gyűjtötték fiatal sertések tüdejéből és nyirokcsomóiból. Ezek a sertések elválasztás utáni, multiszisztémás sorvadási szindróma tipikus klinikai jeleit mutatták. A vírusok izolálásának elősegítése céljából a szövetmintákat lefagyasztottuk -70 °C-ra közvetlenül a boncolás után.
Vírusizoláláshoz körülbelül 15% szövetmintát tartalmazó szuszpenziókat készítettünk Earle-féle sókat (EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham, UK), penicillint (100 lU/ml) és sztreptomicint (100 pg/ml) tartalmazó minimáltápközegben (MEM-SA-tápközeg), és a szöveteket megőröltük steril homokkal, steril mozsarat és törőt alkalmazva. Ezt az őrleménypreparátumot azután felvettük MEM-SA-ban, és azután centrifugáltuk 3000 g-n, 30 percig, 4 °C-on a felülúszó kinyerése céljából.
A sejttenyészetek beoltása előtt 100 μί térfogatú kloroformot adtunk az egyes 2 ml térfogatú felülúszókhoz, és folyamatosan kevertettük azokat szobahőmérsékleten 10 percig. A keveréket azután átvittük mikrocentrifugacsövekbe, 3000 g-n centrifugáltuk 10 percig, és azután a felülúszót elkülönítettük. Azután ezt a felülúszót használtuk oltásra a vírusizolálási kísérletekhez.
Valamennyi vírusizolálási kísérletet olyan PK/15sejttenyészeteken végeztünk, amelyekről tudtuk, hogy nem tartalmaznak szennyeződésként sertésből származó cirkovírust (PCV), pestivírusokat, sertésből származó adenovírusokat és sertésből származó parvovírusokat [Allan G. és munkatársai, Vet. Microbiol. 44, 49-64 (1995)].
Sertéseredetű cirkovírusok izolálását az alábbi technika szerint hajtottuk végre:
Egyrétegű ΡΚ/15-sejteket tripszinnel disszociáltuk (tripszin-verzén keverékkel) konfluens tenyészetekből, és felvettük 15% magzati borjúszérumot tartalmazó MEMSA-tápközegben, amely nem volt szennyezett pestivírussal (=MEM-G-tápközeg), körülbelül 400 000 sejt/ml végkoncentrációban. Azután ezen sejtszuszpenzióból 10 ml aliquotfrakciókat összekevertünk a fentebb leírt oltóanyagokból származó 2 ml-es aliquotfrakciókkal, és a végső keverékeket 6 ml térfogatú aliquotokban szétosztottuk két, 25 cm1 2-es Falcon-csövekbe. Ezeket a tenyészeteket azután 37 °C-on, 18 óra hosszáig inkubáltuk 10% széndioxidot tartalmazó atmoszférában.
A beoltás után szemikonfluens, egyrétegű sejtek tenyésztési tápközegét 300 mM D-glükóz-aminnal (Kát. sz. G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, UK) kezeltük [Tischr I. és munkatársai, Arch. Virol. 96, 39-57 (1987)], azután az inkubálást további 48-72 óra hosszáig folytattuk 37 °C-on. Ezen utolsó inkubálást követően, az egyes oltóanyagokat tartalmazó, két Falconcső közül az egyiket 3 egymás utáni fagyasztási/felolvasztási ciklusnak vetettük alá. A maradék Falcon-csőben lévő ΡΚ/15-sejteket tripszin-verzén-oldattal kezeltük, 20 ml MEM-G-tápközegben felszuszpendáltuk, és azután ráoltottuk 75 cm2-es Falconra, 400 000 sejt/ml-es koncentrációban. A frissen oltott edényeket azután felülfertőztük 5 ml, a fagyasztási/felolvasztási ciklusokból után kapott, megfelelő lizátum hozzáadásával.
2. példa
Sejttenyészet előállítása sertésből származó cirkovírusok detektálására immunfluoreszcenciával vagy in situ hibridizációval
Felülfertőzött, 5 ml térfogatú szuszpenziót elkülönítettünk, és 55 mm átmérőjű Petri-csészébe oltottuk, amely steril és zsírmentes, üveg fedőlemezt tartalmazott. A tenyésztőedényekben és az üveg fedőlemezeken lévő tenyészeteket 37 °C-on Inkubáltuk, és glükóz-aminnal kezeltük az 1. példában leírtak szerint. Az üveg fedőlemezeken lévő tenyészeteket a glükóz-aminos kezelés után 24-48 órával elkülönítettük és fixáltuk acetonnal, 10 percig, szobahőmérsékleten, vagy 10% puffért tartalmazó formaldehiddel, 4 óra hosszáig. A fixálást követően valamennyi üveg fedőlemezt -70 °C-on, szilikagélen tároltunk in situ hibridizációs kísérletekben vagy immundtokémiai jelölési kísérletekben való felhasználás előtt.
3. példa
PCV-szekvenciák detektálására szolgáló technikák in situ hibridizációval
In situ hibridizációt beteg sertésekből gyűjtött és formaldehiddel fixált szöveteken, és olyan sejttenyé6
HU 226 247 Β1 szet-preparátumokon is végeztük, melyeket a vírusizoláláshoz oltottunk (lásd a 2. példát) és üveg fedőlemezeken fixáltunk.
ΡΚ/15-cirkovírusoknak (PCV) és fertőző csirkeanémia-vírusnak (CAV) megfelelő, teljes genomi próbákat alkalmaztunk. A pPCV1-plazmidot [Meehan B. és munkatársai, J. Gén. Virol. 78, 221-227 (1997)] alkalmaztuk specifikus virális DNS-forrásként PCV-re, amely plazmid a PCV-genom replikatív formáját tartalmazta, egyetlen, 1,7 kilobázispár (kbp) méretű inszert formájában klónozva. Madáreredetű cirkovírus (CAV) replikatív formáját tartalmazó, 2,3 kbp méretű, analóg pCAA1plazmldot alkalmaztunk negatív kontrollként. A két plazmid megfelelő glicerines törzsoldatait alkalmaztuk a plazmidok előállítására és tisztítására, alkalikus lízistechnika szerint [Sarabrook, J. és munkatársai, „Molecular cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)] úgy, hogy azokat azután templátként alkalmaztuk a próbák előállítására. A PCV és a CAV teljes genomját képviselő cirkovírus-próbákat a fentebb leírt, tisztított plazmidokból (1 pg az egyes próbákra) és random láncindító hexanukleotidokból állítottuk elő, kereskedelemben elérhető, nem radioaktív jelölő reagenskészlet („DIG DNA labelling kit”, Boehringer Mannheim, Lewes, UK) alkalmazásával, a gyártó által ajánlott eljárás szerint.
A digoxigenin-jelölt próbákat az in situ hibridizációban való alkalmazás előtt felvettük 50-100 pl steril vízben.
Beteg sertésekből származó, paraffinba zárt és formaldehiddel fixált mintákat, valamint fertőzött sejttenyészetekbői származó, formaldehiddel fixált preparátumokat az alábbi technika alkalmazásával készítettünk elő PCV-nukleinsavak detektálására:
Paraffinba zárt, szövetblokkokból levágtunk 5 pm vastagságú szeleteket, paraffinmentesítettük, és azután rehidratáltuk egymás után olyan alkoholos oldatokban, amelyek csökkenő koncentrációban tartalmaztak alkoholt. Formaldehiddel fixált szövetmetszeteket és sejttenyészeteket 15 percig vagy 5 percig, sorrendben, inkubáltunk 37 °C-on, 5 mM EDTA-t tartalmazó, 0,05 M Tris-HCI-pufferben (pH=7,6) oldott, 0,5%-os proteináz-K-oldatban. A tárgylemezeket azután autoklávozott, desztillált vízben oldott, 1%-os glicerinoldatba helyeztük 30 percre, kétszer mostuk 0,01 M PBS-pufferrel (foszfátpufferolt nátrium-klorid-oldat) (pH=7,2), és végül 5 percig mostuk steril, desztillált vízben. Végül levegőn megszárítottuk azokat, és érintkeztettük a próbákkal.
Az egyes szövet-/próbapreparátumokat tiszta, zsírmentes, üveg fedőlemezzel letakartuk, és azután fűthető termosztátba helyeztük 90 °C-on, 10 percre, és azután jéggel érintkeztettük 1 percre, és végül 18 óra hosszáig inkubáltuk 37 °C-on. A preparátumokat azután rövid időre 2xnátrium-citrát-só-pufferbe (SSC) (pH=7,0) merítettük, a védő, üveg fedőlemezek eltávolítása céljából, és azután kétszer mostuk 5 percig 2*SSC-pufferben, és végül kétszer, 5 percig mostuk PBS-pufferrel.
Ezen mosások után a preparátumokat belemerítettük 0,1 M maleinsavat és 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó oldatba (pH=7,5) (maleinpuffer) 10 percre, és azután blokkolóreagens (Kát. sz. 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK) malelnpufferben oldott 1%-os oldatában inkubáltuk 20 percig, 37 °C-on.
A preparátumokat azután antidigoxigenin monoklonális ellenanyag (Boehringer Mannheim) 1/250 oldatával inkubáltuk 1 óra hosszáig, 37 °C-on, melyet blokkolópufferben hígítottunk, majd PBS-ben mostuk és végül biotinilált, antiegér immunoglobulin ellenanyaggal inkubáltuk 30 percig, 37 °C-on. A preparátumokat PBS-ben mostuk, és az endogén peroxidázaktivltást úgy blokkoltuk, hogy PBS-ben oldott, 0,5%-os hidrogén-peroxiddal kezeltük 20 percig, szobahőmérsékleten. A preparátumokat újra mostuk PBS-el, és 3-amino-9-dietil-karbazol-szubsztráttal (AEC) (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK) kezeltük, melyet közvetlenül felhasználás előtt készítettünk el.
Az utolsó mosást csapvízzel végeztük, a preparátumokat hematoxylinnel utánszíneztük, „kékítettük csapvíz alatt, és mikroszkópiás üveg fedőlemezre vittük montírozó folyadék (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK) alkalmazásával. Kísérleti kontrollként nem ide vonatkozó negatív próbát (CAV), és pozitív próbát (PCV) alkalmaztunk beteg sertésekből és nem beteg sertésekből származó mintákhoz.
4. példa
PCV detektálási technikája immunfluoreszcenciával te acetonnal fixált, valamennyi sejttenyészet-preparátum első szkrínelését közvetett immunfluoreszcenciát alkalmazó technikával (IIF) végeztük, kifejlett sertésekből származó, 1/100 arányban hígított, egyesített szérum felhasználásával. Ez az egyesített szérum 25 kifejlett kocából származott Észak-frországból, és sokféle sertéseredetű vírus ellen tartalmazott ellenanyagokat, többek között PCV-re és például: sertésből származó parvovírusra, sertésből származó adenovírusra és PRRS-vírusra. Az IIF-technikát úgy hajtottuk végre, hogy a szérumot (PBS-el hígítva) érintkeztettük 1 óra hosszáig, 37 °C-on a sejttenyészetekkel, azt követően kétszer mostuk PBS-ben. A sejttenyészeteket azután 1 óra hosszáig festettük 1/80 arányban PBS-el hígított, nyúlban termeltetett, fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált, antisertés immunoglobulin ellenanyaggal, azután PBS-el mostuk, és glicerines pufferben vettük fel, azután mikroszkópban, UV fény alatt vizsgáltuk.
5. példa
In situ hibridizáció eredményei beteg sertésekből származó szövetekben
Multiszisztémás sorvadást sérülésekkel rendelkező, franciaországi, kanadai és kaliforniai fiatal sertésekből gyűjtött és formaldehiddel fixált szövetekből előállított PCV genomi próbát alkalmazó, in situ hibridizációban kimutattuk a sérülésekkel asszociált PCV-nukleinsavak jelenlétét, számos vizsgált sérülésben. Nem figyeltünk meg jelet akkor, ha PCV genomi próbát nem
HU 226 247 Β1 beteg sertésekből gyűjtött szövetekre alkalmaztunk, vagy ha CAV-próbát alkalmaztunk beteg sertésekből származó szöveteken. PCV-nukleinsavat azonosítottunk a citoplazmában, és számos mononukleáris sejt magjában, melyek beszűrődtek kaliforniai fiatal sertések tüdejében lévő sérülésekbe. PCV-nukleinsavat kimutattunk a pneumocitákban, a bronchiális és bronchioláris epitél sejtekben, és az arteriolák, a hajszálerek és nyirokerek endotél sejtjeiben is.
Franciaországi, beteg sertésekben a PCV-nukleinsav jelenlétét számos follikuláris limfocita citoplazmájában, és a nyirokcsomók intrasinusoid mononukleáris sejtjeiben detektáltuk. PCV-nukleinsavat alkalmi syncytiumokban is detektáltunk. Ezen detektálási eredmények alapján, kaliforniai sertésekből származó tüdőmintákat, francia sertésekből származó, bélfodorhoz tartozó nyirokcsomómintákat, és kanadai sertésekből származó szerveket szelektáltunk ki az új, sertéseredetű cirkovírus-törzsek izolálására.
6. példa
Az új, sertéseredetű cirkovírus-törzsek sejttenyésztésének és immun fluoreszcens detektálásának eredményei Nem figyeltünk meg citopatikus hatást (CPE) multiszisztémás sorvadásos szindróma klinikai jeleit mutató francia fiatal sertésekből (lmp.1008-törzs), kaliforniai fiatal sertésekből (lmp.999-törzs) és kanadai fiatal sertésekből (lmp.1010-törzs) gyűjtött mintákkal oltott sejttenyészetekben. Az oltott sejttenyészetekből előállított preparátumok immunjelölésével (acetonnal való fixálás után) és sertésből származó, egyesített poliklonális szérummal viszont kimutattunk nukleáris fluoreszcenciát kaliforniai fiatal sertésekből származó tüdő (lmp.999törzs), francia fiatal sertésekből származó mediastinalis nyirokcsomó (lmp.1008-törzs) és kanadai fiatal sertésekből származó szervek (lmp.1010-törzs) felhasználásával oltott tenyészetekben lévő számos sejtben.
7. példa
Sertésből származó cirkovlrusok genomi. DNSének extrakciója
A sertéseredetű cirkovlrusok (PCV) új törzseinek replikatív formáját fertőzött ΡΚ/15-sejttenyészetek (10 Falcon-cső, 75 cm2) alkalmazásával állítottuk elő (lásd 1. példát), melyeket 72-76 órás inkubálás után elkülönítettünk és glükóz-aminnal kezeltük, CAV replikatív formájának klónozására leírtak szerint [Todd, D. és munkatársai, J. Clin. Microbiol. 29, 933-939 (1991)]. Ezen replikatív formák duplaszálú DNS-ét Hírt által leírt [Hírt B„ J. Mól. Bioi. 36, 365-369 (1967)], Molitor [Molitor, T. W. és munkatársai, Virology 137, 241-254 (1984)] által módosított technika szerint extraháltuk.
8. példa
Sertéseredetű cirkovírus lmp.999-törzséből származó genom replikatív formájának restrikciós térképe
Hirt-féle technika szerint extrahált totál DNS-t (1-5 pg) S1-nukleázzal kezeltük (Amersham), a gyártó által ajánlott eljárás szerint, és azután ezt a DNS-t különböző restrikciós enzimekkel (Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, UK) emésztettük, és az emésztés termékeit elektroforézissel választottuk el 1,5%-os agarózgélben, etídium-bromid jelenlétében, Todd és munkatársai által leírtak szerint [J. Gén. Virol. 71, 819-823 (1990)]. Az lmp.999-törzs tenyészeteiből extrahált DNS egyedi EcoRI-hasítóhellyel, 2 Sacl-hasítóhellyel rendelkezik, és nem rendelkezik Pstl-hasítóhellyel. Ez a restrikciós mintázat ezért eltér a PCV-PK/15-törzsre kimutatott restrikciós mintázattól [Meehan, B. és munkatársai, J. Gén. Virol. 78, 221-227 (1997)], amely ezzel ellentétben rendelkezik Pstl-hasítóhellyel és nem rendelkezik EcoRI-hasítóhellyel.
9. példa
Sertéseredetű cirkovírus lmp.999-törzséből származó genom klónozása A PCV-lmp.999-törzs dupla szálú, replikatív formájának EcoRI-jelű restrikciós enzimes emésztésével előállított, körülbelül 1,8 kbp méretű restrikciós fragmenst izoláltunk 1,5%-os agarózgélben (lásd 3. példát), kereskedelemben elérhető Qiagen-reagenskészlet alkalmazásával (QIAEXII Gél Extraction Kit, kát. sz. 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK). Azután ezt az EcoRI-EcoRI restrikciós fragmenst előzőleg ugyanezen restrikciós enzimekkel emésztett és defoszforilált pGEM-7-vektorral (Promega, Medical Supply Company, Dublin, Ireland) ligáltuk, standard klónozótechnikák szerint [Sambrook, J. és munkatársai, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)]. Az így kapott plazmidokat Escherichia coli JM109 gazdatörzsbe (Stratagene, La Jolla, USA) transzformáltuk standardtechnikák szerint. A PCVlmp.999-törzsből származó, EcoRI-EcoRI restrikciós fragmenst szintén klónoztuk pBlueScript SK+ (Stratagene Inc., La Jolla, USA) vektor EcoRI-hasítóhelyébe. Az egyes gazdaszervezetek esetén kapott kiónok közül legalább két-két kiónt szelektáltunk, amelyek várható méretű fragmenseket tartalmaztak. A kiónokat tenyésztettük, és az lmp.999-törzs teljes genomját tartalmazó plazmidokat kis térfogatban (2 ml) vagy nagy térfogatban (250 ml) tisztítottuk, standard plazmidpreparálási és tisztítási technikák szerint.
10. példa
PCV-lmp.999-törzs genomi DNS-ének (duplaszálú, replikatív forma) szekvenálása A két EcoRI-lmp.999-klón (pGEM-7/2- és pGEM7/8-klón) nukleotidszekvenciáját Sanger-féle dldezoxinukleotid-technika szerint határoztuk meg, „AmpliTaq DNA polymerase FS” szekvenáló reagenskészlet (Kát. sz. 402079, PE Applied Biosystems, Warrington, UK) és Applied BioSystems AB1373A típusú automata szekvenálókészülék alkalmazásával, a gyártó javaslata szerint. Az első szekvenálóreakciókat az M13 „előre” és „vissza” univerzális láncindító oligonukleotidokkal végeztük. Ezt követően a szekvenálóreakciókat a „DNS-sétálás” („DNA walking”) technika szerint végez8
HU 226 247 Β1 tűk. Ezen, soron következő szekvenálásokhoz szükséges oligonukleotidokat a Life Technologies cégnél szintetizálták (Inchinnan Business Park, Paisley, UK).
A kapott szekvenciákat összeállítottuk, és MacDNASIS-szoftver (3.2 verzió, kát. sz. 22020101, Appli- 5 gene, Durham, UK) alkalmazásával analizáltuk. A különböző nyitott leolvasási fázisokat BLAST-algoritmus alkalmazásával analizáltuk, amely a „National Center fór Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD,
USA) szerverén áll rendelkezésre. 10
A pGEM-7/8-klónból először kapott teljes szekvenciát (EcoRI-EcoRI-fragmens) bemutatjuk a 6. ábrán (6. azonosító számú szekvencia). Kezdőpontját önkényesen jelöltük ki az EcoRI-hasítóhely „G”-nukleotidja után, és a nukleotidok szempontjából néhány bizonyta- 15 lanságot mutat.
Azután optimalizáltuk a szekvenálást, és 3. azonosító számú szekvenciaként (3. ábra) megadjuk a törzs teljes szekvenciáját, amelynek kezdőpontja önkényesen az EcoRI-hasítóhely kezdete, azaz az első nukleo- 20 tid a „G”.
Az eljárást hasonlóan végeztük a találmány szerinti másik három izolátumból származó szekvencia előállításánál (lásd 1., 2. és 4. azonosító számú szekvenciák,
1., 2. és 4. ábra). 25
Ezen négy törzs genomjának mérete:
Imp. 1011-48121 1767 nukleotid
Imp.1011-48285 1767 nukleotid
Imp. 999 1768 nukleotid
Imp. 1010 1768 nukleotid 30
11. példa
PCV-lmp.999-törzs szekvenciájának analízise Ha az lmp.999-törzsből előállított szekvenciát alkalmaztuk a GenBank-adatbankban lévő szekvenciákkal 35 fennálló homológia tesztelésére, az egyetlen szignifikáns, detektált homológia körülbelül 76%-os homológia volt (nukleinsavszinten) a PK/15-törzsből származó szekvenciával (nyilvántartási számai Y09921 és U49186) (lásd az 5. ábrát).
Homoiógiára való, 6 fázisban végzett tesztelés aminosavszinten, az adatbázisokban lévő szekvenciák transzlációjában (BLAST X algoritmus az NCBI-szerveren) lehetővé tette, hogy 94%-os homológiát mutassunk ki a GenBank U49186 sz. szekvencia által kódolt, növények cirkovírusaihoz hasonló BBTV-vírus (GenBank azonosítási száma 1841515) elméleti replikázának megfelelő nyitott leolvasási fázissal.
Az adatbankokban nem volt más szekvencia, amely szignifikáns homológiát mutatott a PCVlmp.999-törzsből előállított szekvenciával.
Multiszisztémás sorvadási szindróma klinikai jeleit mutató, kaliforniai fiatal sertésekből gyűjtött sérülések felhasználásával tenyésztett PCV-lmp.999-törzsből előállított szekvencia analízise világosan megmutatta, hogy ez a vírusizolátum új, sertésből származó cirkovírus-törzs.
12. példa
Szekvenciák összehasonlító analízise
Egymás alá rendeztük a 4 új PCV-törzs nukleotidszekvenciáját a PCV-PK/15-törzs szekvenciájával (5. ábra). Létrehoztunk egy homológiamátrixot, amelyben figyelembe vesszük a négy új törzset és a korábban már ismert ΡΚ/15-törzset. Az eredmények az alábbiak: 1:lmp.1011-48121.
2:lmp.1O11-48285.
3:lmp.999.
4:lmp.1O1O.
5:PK/15.
1 2 3 4 5
1 1,0000 0,9977 0,9615 0,9621 0,7600
2 1,0000 0,9621 0,9632 0,7594
3 1,000 0,9949 0,7560
4 1,0000 0,7566
5 1,0000
A két francia törzs, az Imp. 1011—48121 és az Imp. 1011-48285 törzs közötti homológia nagyobb, mint 99% (0,9977).
A két észak-amerikai törzs, az Imp. 999 és Imp. 1010 közötti homológia szintén nagyobb, mint 99% (0,9949). A francia törzsek és az észak-amerikai törzsek közötti homológia valamivel nagyobb, mint 96%.
A homológia értéke valamennyi törzs és a PK/15 között 75 és 76% közé esik.
Ebből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a találmány szerinti törzsek új típusú, sertésből származó cirkovírust képviselnek, amely eltér a ΡΚ/15-törzs által képviselt típustól. Ezt az új, PMWS-szindrómát mutató sertésekből izolált típust II. típusú, sertésből szár55 mazó cirkovírusnak nevezzük, a PK/15 képviseli az I. típust. Ezen II. típushoz tartozó törzsek jelentős nukleotidszekvencia-homológiát mutatnak, annak ellenére, hogy nagyon távoli földrajzi régiókból izolálták azokat.
13. példa
Az új PCV-törzsek genomja által kódolt fehérjék analízise
Az lmp.1010-izolátum nukleotidszekvenciáját tekintettük a multiszisztémás sorvadási szindrómával asszociált, többi cirkovírus-törzs képviselőjének. Ezt a szekvenciát részletesebben BLASTX-algoritmus [Altschul et al., J. Mól. Bioi. 215, 403-410 (1990)] és Mac9
HU 226 247 Β1
Vector 6.0 szoftverkészletből származó programok kombinációjának (Oxford Molecular Group, Oxford 0X4 4GA, UK) segítségével analizáltuk. Ebben a szekvenciában 13 olyan nyitott leolvasási fázist (ORF-et) detektáltunk, amelyek mérete 20 aminosavnál nagyobb volt (cirkuláris genom). Ez a 13 ORF az alábbi:
Név Eleje Vége Szál ORF mérete (nukleotidok) Fehéijeméret (aminosavak)
ORF1 103 210 szensz 108 nt 35 aa
ORF2 1180 1317 szensz 138 nt 45 aa
ORF3 1363 1524 szensz 162 nt 53 aa
ORF4 398 1342 szensz 945 nt 314 aa
ORF5 900 1079 szensz 180 nt 59 aa
ORF6 1254 1334 szensz 81 nt 26 aa
ORF7 1018 704 antiszensz 315 nt 104 aa
ORF8 439 311 antiszensz 129 nt 42 aa
ORF9 190 101 antiszensz 90 nt 29 aa
ORF10 912 733 antiszensz 180 nt 59 aa
ORF11 645 565 antiszensz 81 nt 26 aa
ORF12 1100 1035 antiszensz 66 nt 21 aa
ORF13 314 1381 antiszensz 702 nt 213 aa
Az egyes ORF-k kezdő és végpontját a 4. ábrán bemutatott szekvenciára (4. azonosító számú szekvencia) hivatkozva adjuk meg, amely a 1010-törzs genomjának szekvenciája. Az ORF1-ORF13 határai ugyanezek a 999-törzs esetén is. Az 1011-48121-törzsre és 30 az 1011-48285-törzsre is ugyanezek, kivéve az ORF3-at és ORF13-at:
ORF3:1432-1539, szensz, 108 nt, 35 aa
ORF13:314-1377, antiszensz, 705 nt, 234 aa.
Ezen 13 ORF közül 4 szignifikáns homológiával rendelkezik a klónozott PCV-PK-15-vírus genomjában lévő, analóg ORF-kel. Azokat a nyitott leolvasási fázisokat analizáltuk, amelyek valamennyi vizsgált, multiszisztémás sorvadást szindrómával asszociált cirkovírus-izolátum genomjában jelen voltak. Ez a négy ORF az alábbi:
Név Eleje Vége Szál ORF mérete (nukleotidok) Fehérjeméret (aminosavak) Molekulatömeg
ORF4 398 1342 szensz 945 nt 314 aa 37,7 kDa
ORF7 1018 704 antiszensz 315 nt 104 aa 11,8 kDa
ORF10 912 733 antiszensz 180 nt 59 aa 6,5 kDa
ORF13 314 1381 antiszensz 702 nt 233 aa 27,8 kDa
Az egyes ORF-k kezdő és végpontját a 4. ábrán bemutatott szekvenciára (4. azonosító számú szekvencia) hivatkozva adjuk meg. Az ORF mérete (nukleotidokban, azaz nt-ben kifejezve) tartalmazza a stopkódont.
A PCV-lmp.1010- és PCV-PK-15-izolátumok genomi szerveződésének összehasonlítása lehetővé tette 4 ORF azonosítását, amely változatlanul fennmaradt a két vírus genomjában. Az alábbi táblázatban bemutatjuk a megfigyelt homológia mértékét:
ORF lmp.1010/ORF PVC-PK-15 Százalékos homológia
ORF4/ORF1 86%
ORF13/ORF2 66,4%
ORF lmp.1010/ORF PVC-PK-15 Százalékos homológia
ORF7/ORF3 61,5% (az átfedés szintjén) (104 aa)
ORF10/ORF4 83% (az átfedés szintjén) (59 aa)
A legnagyobb mértékű szekvenciaazonosságot (86%-os homológia) az lmp.1010-ORF4 és PK-15ORF1 között figyeltük meg. Ez várható volt, mivel ez a fehéije valószínűleg szerepet játszik a virális DNS replikációjában, és esszenciális a virális replikációhoz [Meehan és munkatársai, J. Gén. Virol. 78, 221-227 (1997); Mankertz és munkatársai, J. Gén. Virol. 79, 381-384 (1998)].
HU 226 247 Β1
Az lmp.1010-ORF13 és a PK-15-ORF2 közötti szekvenciaazonosság kevésbé határozott (66,4%-os homológia), de mindkét ORF valóban nagymértékben konzervatív N-terminális bázikus régióval rendelkezik, amely megegyezik a CAV, madáreredetű cirkovírusban lévő, fő strukturális fehérje N-terminális régiójával [Meehan és munkatársai, Arch. Virol. 124, 301-319 (1992)]. Továbbá jelentős különbségeket figyeltünk meg az ORF7-lmp.1010 és ORF3-PK-15 között, valamint az ORF10-lmp.1010 és ORF4-PK-15 között. Valamennyi esetben az lmp.1010-izolátumból származó, ORF7 és ORF10 C-terminális régiója deletálva volt, ha azokat a PCV-PK-15-ből származó, ORF3-hoz és ORF4-hez hasonlítjuk. A legnagyobb szekvenciahomológiát az ORF7/ORF3 (61,5%-os homológia az átfedés szintjén) és az ORF10/ORF4 (83%-os homológia az átfedés szintjén) N-terminális régióinak szintjén figyeltük meg.
Úgy tűnik, hogy a sertésből származó cirkovírus genomi szerveződése egészen összetett, amely genomja különleges kompaktságának következménye. A fő strukturális fehérje valószínűleg a sertéseredetű cirkovírusgenom ugyanazon szálán elhelyezkedő, néhány leolvasási fázis között végbement splicing útján származik. Ezért úgy tekintjük, hogy a fentebb leírt táblázatban szereplő, bármelyik nyitott leolvasási fázis (ORF1-től ORF13-ig) képviselheti a II. típusú, sertéseredetű cirkovírus által kódolt, antigenikus fehérje egészét vagy részét, és ennélfogva potenciális antigén, melyet specifikus diagnózisra és/vagy vakcinációra lehet alkalmazni. A találmány tárgyát képezi ezért bármilyen fehérje, amely ezen ORF-ek közül legalább egyet tartalmaz. A találmány tárgya előnyösen olyan fehérje, amely lényegében ORF4-ből, ORF7-ből, ORF10-ből vagy ORF 13-ból áll.
14. példa
Az új törzsekből klónozott PCV-genom fertőző jellege
Az lmp.999-izolátum teljes genomját (replikatív formában) tartalmazó pGEM-7/8-plazmidot PK/15-sejtekbe transzfektáltuk Meehan, B. és munkatársai által leírt [Arch. Virol. 124, 301-319 (1992)] eljárás szerint. Immunfluoreszcenciát alkalmazó analízist végeztünk (lásd 4. példát) a transzfekció utáni első passzáláson nem szennyezett ΡΚ/15-sejtekre, amelynek eredménye azt mutatta, hogy a pGEM7/8-klónnak megfelelő plazmid képes volt fertőző PCV-vírus termelődését indukálni. Fertőző PCV genetikai anyagot tartalmazó klón hozzáférhetősége lehetővé tesz bármilyen hasznos manipulációt a vírusgenomban, módosított PCVvírusok (sertésekben gyengített vagy detektív) előállítása céljából, amelyeket gyengített vagy rekombináns vakcinák, vagy diagnosztikai reagenskészletekben felhasználható antigének előállítására lehet alkalmazni.
15. példa
PCV-antigének termeltetése in vitro tenyészetben
Nem szennyezett ΡΚ/15-sejtek tenyésztését és a vírus szaporítását az 1. példában leírt módszer szerint végeztük. A fertőzött sejteket tripszines kezeléssel választottuk el 4 napos, 37 °C-on végzett inkubáció után, és megszámoltuk. A következő passzálás ml-ként
400 000 fertőzött sejtet tartalmazott.
16. példa
A vírusantigének inaktiválása
A vírustenyésztés végén a fertőzött sejteket elkülönítettük, és lízisnek vetettük alá ultrahang alkalmazásával (Branson Sonifier) vagy forgó-álló („rotor-stator”) típusú kolloid malom (UltraTurrax, IKA) segítségével. A szuszpenziót azután centrifugáltuk 3700 g-n, 30 percig. A vírusszuszpenziót azután inaktiváltuk 0,1% etilén-iminnel 18 óra hosszáig, 37 °C-on, vagy 0,5% bétapropiolaktonnal 24 óra hosszáig, 28 °C-on. Ha a vírus titere inaktiválás előtt nem volt megfelelő, a vírusszuszpenziót ultraszűréssel koncentráltuk, 300 kDa molekulatömeg fölött visszatartó membrán (Millipore PTMK300) alkalmazásával. Az inaktivált vírusszuszpenziót +5 °C-on tároltuk.
17. példa
Vakcina előállítása ásványi olajra alapuló emulzió formájában
A vakcinát az alábbi formula szerint állítjuk elő: inaktivált sertéseredetű cirkovírusszuszpenzió: 250 ml,
Montanide® ISA 70 (SEPPIC): 750 ml.
A vizes fázist és az olajos fázist külön-külön sterilizáltuk szűréssel. Az emulziót az alkotórészek összekeverésével és homogenizálásával állítjuk elő Silverson turbina emulgeálóberendezés segítségével.
Egy vakcinadózis körülbelül 107·5 TCID50-et tartalmaz. Egy vakcinadózis térfogata 0,5 ml intradermális úton való beadásra, és 2 ml intramuszkuláris úton való beadásra.
18. példa
Vakcina előállítása metabolizálható olajra alapuló emulzió formájában
A vakcinát az alábbiak szerint állítjuk elő: inaktivált sertéseredetű, cirkovírusszuszpenzió: 200 ml,
Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 ml,
Radia 7204 (Oleofina): 740 ml.
A vizes fázist és az olajos fázist külön-külön sterilizáltuk szűréssel. Az emulziót az alkotórészek összekeverésével és homogenizálásával állítjuk elő Silverson turbina emulgeálóberendezés segítségével.
Egy vakcinadózis körülbelül 107·5 TCID50-et tartalmaz. Egy vakcinadózis térfogata 2 ml intramuszkuláris úton való beadásra.
19. példa
Közvetett immunfluoreszcencia eredményei az amerikai egyesült államokbeli és francia PCVvírustörzsek és a PK/15-szennyeződés vonatkozásában, hiperimmunszérummal (PCV-T), PK/15-ből előállított F99 monoklonális ellenanyagpanellel és a kanadai törzsből előállított hiperimmunszérummal (PCV-C)
HU 226 247 Β1
Vírus
PK/15 USA Francia- ország
PCV-T antiszérum >6 400 200 800
PCV-C antiszérum 200 >6400 >6400
F99 1H4 >10 000 >100 100
F99 4B10 >10 000 <100 <100
F99 2B7 >10 000 100 <100
F99 2E12 >10 000 <100 <100
F99 1C9 >10 000 <100 100
F99 2E1 >10 000 <100 <100
F99 1H4 >10 000 100 <100
‘ A szérum vagy a monoklonális ellenanyag utolsó hígításának reciproka, amely pozitív reakciót ad közvetett immunfluoreszcenciában.

Claims (31)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Izolált, sertéseredetű II. típusú cirkovírus, amely képes sertésekben multiszisztémás sorvadási szindrómát (PMWS-t) előidézni.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti cirkovírus, amely PMWSben szenvedő beteg sertésből izolálható.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti cirkovírus, amely az ECACC-ben, a következő nyilvántartási számok bármelyikén lett deponálva:
    - V97100219
    - V97100218
    - V97100217
    - V98011608
    - V98011609.
  4. 4. Izolált, sertéseredetű II. típusú cirkovírust tartalmazó készítmény, amely cirkovírus képes sertésekben multiszisztémás sorvadási szindrómát (PMWS-t) előidézni, és tenyésztett sejtekből lett izolálva.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti készítmény, ahol a sertéseredetű II. típusú cirkovírus PMWS-ben szenvedő beteg sertésből izolálható.
  6. 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti készítmény, amely az ECACC-ben, a következő nyilvántartási számokon deponált készítmények bármelyike:
    - V97100219
    - V97100218
    - V97100217
    - V98011608
    - V98011609.
  7. 7. A 4-6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tisztított.
  8. 8. A 4-7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely koncentrált.
  9. 9. A 4-8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely inaktivált.
  10. 10. Eljárás olyan, sertéseredetű II. típusú cirkovírus előállítására, amely képes sertésekben multiszisztémás sorvadási szindrómát (PMWS-t) előidézni, azzal jellemezve, hogy in vitro olyan sejteket tenyésztünk, melyek 1-3. igénypontok bármelyike szerinti cirkovírussal vannak infektálva, ahol a cirkovírus képes a tenyésztett sejteken szaporodni.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tenyésztett sejtekként egy sertésvese-sejtvonalat alkalmazunk.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tenyésztett sejtekként PKL/15 sejteket alkalmazunk.
  13. 13. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sertéseredetű II. típusú cirkovírust begyűjtjük és tisztítjuk.
  14. 14. A 10-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sertéseredetű II. típusú cirkovírust koncentráljuk.
  15. 15. A 10-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sertéseredetű II. típusú cirkovírust inaktiváljuk.
  16. 16. Tenyészet felülúszója vagy extraktuma, amely olyan sertéseredetű II. típusú cirkovírust tartalmaz, amely előállítható a 10-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárással.
  17. 17. Antigén-sajátságú készítmény, amely 10-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállítható, sertéseredetű II. típusú cirkovírust tartalmaz.
  18. 18. Vakcina, amely képes immunválaszt indukálni II. típusú sertéseredetű cirkovírus (II. típusú PCV) ellen, és amely olyan II. típusú sertéseredetű cirkovírust tartalmaz inaktivált formában, amely aktív formában képes sertésekben multiszisztémás sorvadási szindrómát (PMWS-t) előidézni.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a II. típusú PCV PMWS-ben szenvedő beteg sertésből származó fiziológiai vagy szövetmintából izolálható.
  20. 20. A 18. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a II. típusú PCV olyan törzsből származik, amely az ECACC-ben, a következő nyilvántartási számok bármelyikén lett deponálva:
    - V97100219
    - V97100218
    - V97100217
    - V98011608
    - V98011609.
  21. 21. A 18-20. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy 10θ—108 TCID50 II. típusú PCV-t tartalmaz.
  22. 22. A 18-21. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy adjuvánst is tartalmaz.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy alumínium-hidroxidot, szaponint, Avridine®-t, DDA-t vagy polifoszfazént tartalmaz.
  24. 24. A 18-21. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy emulzió formájában van kiszerelve.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti vakcina azzal jellemezve, hogy „olaj a vízben” típusú emulzió formájában van kiszerelve.
    HU 226 247 Β1
  26. 26. A 24. igénypont szerinti vakcina azzal jellemezve, hogy „víz az olajban” típusú emulzió formájában van kiszerelve.
  27. 27. A 18-26. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a benne található II. típu- 5 sú PCV kémiai ágens alkalmazásával lett inaktiválva, előnyösen a következő kémiai ágensek bármelyikének alkalmazásával: formaldehid, paraformaldehid, β-propiolakton, etilén-imin és etilén-imin-származékok. 10
  28. 28. A 18-27. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a benne található II. típusú PCV egy sejtvonal, előnyösen sertéssejtvonal alkalmazásával lett szaporítva.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti vakcina azzal jellemezve, hogy a benne található II. típusú PCV PK/15 sejtek alkalmazásával lett szaporítva.
  30. 30. A 18-29. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy tartalmaz legalább egy további hordozót, amely a következők bármelyike: a sertés reprodukciós és respirációs szindróma (PRRS) kórokozója, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinlobacillus pleuropneumoniae, E. coli, az atrophic rhinitis kórokozója, az Aujeszky-féle betegség vírusa, a klasszikus sertésláz kórokozója és a sertésinfluenza vírusa.
  31. 31. A 30. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy PRRS és/vagy Mycoplasma hyopneumoniae hordozót tartalmaz.
HU0003756A 1997-10-03 1998-10-01 Newly isolated porcine circoviruses, circovirus vaccines and diagnostic reagents HU226247B1 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9712382A FR2769321B1 (fr) 1997-10-03 1997-10-03 Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostics
FR9800873A FR2769322B1 (fr) 1997-10-03 1998-01-22 Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostic
FR9803707A FR2776294B1 (fr) 1998-03-20 1998-03-20 Nouveaux circovirus porcins ; vaccins et reactifs de diagnostic
PCT/FR1998/002107 WO1999018214A1 (fr) 1997-10-03 1998-10-01 Circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostic

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0003756A2 HUP0003756A2 (hu) 2001-02-28
HUP0003756A3 HUP0003756A3 (en) 2003-03-28
HU226247B1 true HU226247B1 (en) 2008-07-28

Family

ID=27253376

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0800330A HU230340B1 (hu) 1997-10-03 1998-10-01 Újonnan izolált, sertésből származó cirkovírusokból származó szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok és ezeket tartalmazó vakcinák
HU0003756A HU226247B1 (en) 1997-10-03 1998-10-01 Newly isolated porcine circoviruses, circovirus vaccines and diagnostic reagents

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0800330A HU230340B1 (hu) 1997-10-03 1998-10-01 Újonnan izolált, sertésből származó cirkovírusokból származó szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok és ezeket tartalmazó vakcinák

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6368601B1 (hu)
EP (4) EP1019510B1 (hu)
JP (5) JP5008218B2 (hu)
KR (4) KR100736129B1 (hu)
CN (2) CN101724606B (hu)
AT (3) ATE245191T1 (hu)
AU (1) AU756554C (hu)
BR (1) BR9812845B1 (hu)
CA (1) CA2305623C (hu)
CY (3) CY1110359T1 (hu)
DE (7) DE05014998T1 (hu)
DK (4) DK1741785T3 (hu)
ES (4) ES2203984T3 (hu)
FR (1) FR05C0021I2 (hu)
HK (1) HK1095161A1 (hu)
HU (2) HU230340B1 (hu)
NL (1) NL300326I2 (hu)
PL (1) PL198506B1 (hu)
PT (4) PT1386617E (hu)
UA (1) UA78180C2 (hu)
WO (1) WO1999018214A1 (hu)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US20060029617A1 (en) * 1997-10-03 2006-02-09 Charreyre Catherine E Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use
US7192594B2 (en) * 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
EP1816200B1 (en) * 1997-12-11 2016-03-09 Merial Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs
PT2363488E (pt) * 1997-12-11 2015-01-13 Univ Belfast Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos
US6943152B1 (en) 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
US6497883B1 (en) * 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
WO2001096377A2 (en) * 2000-06-15 2001-12-20 Purdue Research Foundation Vaccine for congenital tremors in pigs
US7018638B2 (en) * 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
MY148759A (en) * 2001-03-27 2013-05-31 Univ Saskatchewan Methods to culture circovirus
CA2454397A1 (en) 2001-07-20 2003-06-05 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Attenuated rabies virus with nucleoprotein mutation at the phosphorylation site for vaccination against rabies and gene therapy in the cns
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7279166B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
OA12915A (en) * 2002-08-26 2006-10-13 Pfizer Prod Inc Vaccine for respiratory and reproductive system infections in cattle.
KR20040021988A (ko) * 2002-09-06 2004-03-11 서상희 바이러스 증식용 돼지 신장 상피 세포주, 및 이의 용도
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US8834891B2 (en) * 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
EP1869471B1 (en) * 2005-04-13 2016-06-08 Merial, Inc. Method for porcine circovirus production
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
PL1968630T3 (pl) 2005-12-29 2018-08-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multiwalentne immunogenne kompozycje PCV2
CN104383526B (zh) * 2005-12-29 2018-09-18 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 Pcv2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途
KR100870077B1 (ko) * 2006-10-27 2008-11-25 권영득 이유후 전신소모성증후군(ｐｍｗｓ)의 치료용 복합제조성물
US20100129397A1 (en) * 2006-12-11 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
EP2094872B2 (en) 2006-12-15 2020-02-19 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Treatment of anti-PCV2 antibody seropositive pigs with PCV2 antigen
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
CA2687146C (en) * 2007-05-11 2015-07-21 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Production of a homogeneous cell line highly permissive to porcine circovirus type 2 (pcv2) infection
KR100948127B1 (ko) * 2007-06-27 2010-03-18 주식회사 중앙백신연구소 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물
US20090017064A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
EP2225367A1 (en) * 2007-12-21 2010-09-08 Wyeth LLC Methods and compositions for immunizing pigs against porcine circovirus
US20110020394A1 (en) * 2007-12-31 2011-01-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 virus like particle with foreign amino acid insertion
EP2242511A4 (en) * 2008-01-23 2012-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmed IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE PCV2, AND METHODS FOR PRODUCING SUCH COMPOSITIONS
AR078253A1 (es) * 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
TWI442935B (zh) 2010-12-22 2014-07-01 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２）、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
EP2564869A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Ceva Sante Animale Synthetic capsid proteins and uses thereof
EP2789346A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 CEVA Santé Animale SA Fusion polypeptides and vaccines
US9649370B2 (en) 2013-05-08 2017-05-16 Protatek International, Inc. Vaccine for PCV2 and mycoplasma
JP6821429B2 (ja) 2013-09-25 2021-01-27 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー Ｐｃｖ２ｂ分岐ワクチン組成物及び使用方法
EA035265B1 (ru) 2013-10-02 2020-05-21 Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. Вариант белка opc2 pcv2 и содержащие его вирусоподобные частицы
CN104383527A (zh) * 2014-11-18 2015-03-04 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪圆环病毒2型灭活冻干疫苗的制备方法
EP3034609A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ceva Sante Animale Recombinant swinepox virus and vaccines
US9944904B2 (en) 2015-05-14 2018-04-17 Merial Inc. Method for porcine circovirus production and PCV2 vaccines
EP3254692A1 (en) 2016-06-10 2017-12-13 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant spv
EP3720485A1 (en) 2017-12-08 2020-10-14 Ceva Sante Animale Recombinant swinepox virus and vaccines
JP7162072B2 (ja) 2018-03-26 2022-10-27 ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド 免疫原性組成物を製造する方法
WO2019238611A1 (en) 2018-06-11 2019-12-19 Ceva Sante Animale Vaccination against porcine circoviruses
KR102124260B1 (ko) * 2018-10-19 2020-06-26 대한민국(관리부서 질병관리본부장) 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 콜레라균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주
BR112023001324A2 (pt) 2020-07-24 2023-02-14 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Combinação de vacina de suíno

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4740468A (en) 1985-02-14 1988-04-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Concentrating immunochemical test device and method
US5232835A (en) 1986-11-07 1993-08-03 Syntex (U.S.A.) Inc. Qualitative immunochromatographic method and device
US5030558A (en) 1986-11-07 1991-07-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Qualitative immunochromatographic method and device
CA1303983C (en) 1987-03-27 1992-06-23 Robert W. Rosenstein Solid phase assay
EP1248112A3 (en) 1987-04-27 2004-08-25 Inverness Medical Switzerland GmbH Immunochromatographic specific binding assay device
US4855240A (en) 1987-05-13 1989-08-08 Becton Dickinson And Company Solid phase assay employing capillary flow
US5120643A (en) 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
DK175379B1 (da) * 1987-09-28 2004-09-20 Pfizer Anvendelse af transmitterbart svine-gastro-enteritisvirus samt fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine
EP1026253B2 (en) 1989-03-21 2012-12-19 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
US5141850A (en) 1990-02-07 1992-08-25 Hygeia Sciences, Inc. Porous strip form assay device method
JP3187419B2 (ja) 1990-05-29 2001-07-11 アメリカン・サイアナミド・カンパニー ブタ肺炎ワクチンおよびその製造方法
US5238652A (en) 1990-06-20 1993-08-24 Drug Screening Systems, Inc. Analytical test devices for competition assay for drugs of non-protein antigens using immunochromatographic techniques
US5565205A (en) 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
US5266497A (en) 1990-08-31 1993-11-30 Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. Immunochromatographic assay with improved colored latex
US5451504A (en) 1991-07-29 1995-09-19 Serex, Inc. Method and device for detecting the presence of analyte in a sample
WO1993007898A1 (en) 1991-10-14 1993-04-29 Akzo Nobel N.V. Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
US5338543A (en) * 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
DE9204303U1 (de) 1992-03-30 1992-06-25 Marx, Günter Wolfgang, 7953 Bad Schussenried Trainingsgerät
EP0571648A1 (en) 1992-05-26 1993-12-01 Chung-Nan Weng Vaccine protecting against mycoplasmal pneumonia
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
FR2700957B1 (fr) 1993-01-29 1995-03-03 Seppic Sa Composition de vaccin sous-unitaire recombinant vivant et procédé de préparation.
ATE197314T1 (de) 1993-02-08 2000-11-15 Bayer Ag Verfahren zum vermehren des das reproduktions- und atemwegs-syndrom verursachenden schweinevirus und dessen verwendung als impfstoff.
FR2702373B1 (fr) 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.
IL108915A0 (en) 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
DE69536091D1 (de) 1994-01-27 2010-09-09 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit
DE69522984T2 (de) * 1994-04-11 2002-04-25 Akzo Nobel Nv Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins
CA2196865C (en) * 1994-08-05 2001-07-03 Karl P. Schneider Self-chamfering drill bit
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
PT2363488E (pt) * 1997-12-11 2015-01-13 Univ Belfast Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos
KR100298125B1 (ko) * 1999-04-15 2001-09-13 정명식 구리의 화학 증착에 유용한 유기 구리 전구체

Also Published As

Publication number Publication date
JP5869658B2 (ja) 2016-02-24
DE69839227T2 (de) 2009-03-12
JP2008086317A (ja) 2008-04-17
CN101724606B (zh) 2016-02-24
EP1386617B1 (fr) 2008-03-05
BR9812845A (pt) 2000-08-08
HUP0003756A2 (hu) 2001-02-28
HU0800330D0 (en) 2008-07-28
EP1386617A1 (fr) 2004-02-04
PT1281760E (pt) 2005-11-30
EP1741785A1 (fr) 2007-01-10
ES2203984T3 (es) 2004-04-16
DE69816460T2 (de) 2004-05-27
DK1741785T3 (da) 2014-11-10
ES2246001T3 (es) 2006-02-01
CY1110359T1 (el) 2015-04-29
NL300326I2 (nl) 2008-04-01
BR9812845B1 (pt) 2010-03-09
DK1019510T3 (da) 2003-11-10
CY1115749T1 (el) 2017-01-25
DE05014998T1 (de) 2008-11-20
FR05C0021I1 (hu) 2005-05-27
AU9355598A (en) 1999-04-27
DE122008000069I1 (de) 2009-11-05
ATE299531T1 (de) 2005-07-15
EP1281760A1 (fr) 2003-02-05
EP1019510B1 (fr) 2003-07-16
US6368601B1 (en) 2002-04-09
EP1281760B9 (fr) 2005-12-28
JP5008218B2 (ja) 2012-08-22
EP1281760B1 (fr) 2005-07-13
KR100904852B1 (ko) 2009-06-25
CY1108113T1 (el) 2014-02-12
WO1999018214A1 (fr) 1999-04-15
KR100944144B1 (ko) 2010-02-24
DE69816460D1 (de) 2003-08-21
JP2015109840A (ja) 2015-06-18
HU230340B1 (hu) 2016-02-29
KR100736129B1 (ko) 2007-07-06
KR100854615B1 (ko) 2008-08-27
PT1386617E (pt) 2008-06-17
KR20090051274A (ko) 2009-05-21
JP2001519159A (ja) 2001-10-23
DK1281760T5 (da) 2006-04-18
DE69830858T4 (de) 2006-12-21
CA2305623C (en) 2008-04-01
AU756554C (en) 2003-09-18
CN101724606A (zh) 2010-06-09
EP1019510A1 (fr) 2000-07-19
DE69830858T2 (de) 2006-04-20
PT1741785E (pt) 2014-11-13
PL339631A1 (en) 2001-01-02
DE69830858D1 (de) 2005-08-18
DK1386617T3 (da) 2008-07-07
NL300326I1 (nl) 2008-03-03
ATE245191T1 (de) 2003-08-15
JP2011135875A (ja) 2011-07-14
JP5362750B2 (ja) 2013-12-11
JP4680245B2 (ja) 2011-05-11
ATE387914T1 (de) 2008-03-15
KR20060079256A (ko) 2006-07-05
ES2302885T3 (es) 2008-08-01
FR05C0021I2 (hu) 2005-10-21
CN100584948C (zh) 2010-01-27
CN1278301A (zh) 2000-12-27
DE122005000009I1 (de) 2005-08-04
HK1095161A1 (en) 2007-04-27
UA78180C2 (uk) 2007-03-15
EP1741785B1 (fr) 2014-10-01
DE69839227D1 (de) 2008-04-17
ES2524359T3 (es) 2014-12-05
HUP0003756A3 (en) 2003-03-28
DK1281760T3 (da) 2005-10-31
PT1019510E (pt) 2003-11-28
KR20010030930A (ko) 2001-04-16
AU756554B2 (en) 2003-01-16
JP2012193179A (ja) 2012-10-11
PL198506B1 (pl) 2008-06-30
KR20080023271A (ko) 2008-03-12
CA2305623A1 (fr) 1999-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100854615B1 (ko) 돼지 서코바이러스, 백신 및 진단시약
RU2237492C2 (ru) Иммуногенная композиция, вызывающая иммунный ответ против парвовируса и цирковируса свиньи, вакцина против многосистемного синдрома истощения свиней (pmws) (варианты), набор для вакцинации и способ ее осуществления
US6391314B1 (en) Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
RU2283862C2 (ru) Цирковирус свиней типа ii и его применение
AU2002302120B2 (en) Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents
MXPA00003263A (en) Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents

Legal Events

Date Code Title Description
AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: INACTIIVED TYPE 2 PORCINE CIRCOVIRUS (PCU2), "CIRCOVAC"; REG. NO/DATE:; FIRST REG.: EU EU/2/07/075/001-004 20070621

Spc suppl protection certif: S0800013

Filing date: 20081003

Expiry date: 20181001

AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: INACTIVATED TYPE 2 PORCINE CIRCOVIRUS (PCU2) "CIRCOVAC"; REG. NO/DATE: EU/2/07/075/001-004 20070621; FIRST REG.: FR ATVAP 04/009 20041119

Spc suppl protection certif: S0800021

Filing date: 20081209

Expiry date: 20181001

AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: INACTIVED TYPE 2 PORCINE CIRCOVIRUS (PCV2), "CIRCOVAC"; REG. NO/DATE: EU/2/07/075/001-004 20070621; FIRST REG.: DE MERIAL 2004.07.22. 20040803

Spc suppl protection certif: S0800022

Filing date: 20081209

Expiry date: 20181001

Spc suppl protection certif: S0800022

Filing date: 20081209

Expiry date: 20181001

Effective date: 19981010