BR9812845B1 - vacina induzindo uma resposta imune ao circovìrus suìno do tipo ii. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINAINDUZINDO UMA RESPOSTA IMUNE AO CIRCOVÍRUS SUÍNO DO TIPO II".

A presente invenção é relativa a novas cepas de circovírus suí-nos (PCV para Porcine Circo Virus) responsáveis pela síndrome PMWS(Porcine Multisystemic Wasting Syndrome ou Post-Weaning MultisystemicWasting Syndrome ainda denominada síndrome de deperecimento generali-zado de pós-desmame), a reagentes e métodos, permitindo sua detecção, amétodos de vacinação e a vacinas, assim como a métodos de produçãodesses reagentes e vacinas.

O PCV foi na origem detectado como contaminador citopatogê-nico em linhagens celulares de rins de porcos PK/15. Esse vírus foi classifi-cado dentre os Circoviridae com o vírus da anemia do frango (CAV paraChieken Anemia Virus) e o vírus PBFDV (Pseittaeine Beak and Feather Di-sease Virus). Trata-se de pequenos vírus (de 15 a 24 nm) não envolvidos,cuja característica comum é de conter um genoma sob a forma de um DNAsimples filamento circular de 1,76 a 2,31 kb. Pensou-se inicialmente queesse genoma codificava para um polipeptídeo de aproximadamente 30 kDa(Todd et al., Arch ViroIJ991, 117: 129-135). Trabalhos recentes mostraram,todavia, uma transcrição mais complexa (Meehan Β. M. Et al., 1997, 78:221-227). Por outro lado, não se conheciam homologias significativas deseqüência nucleotídica, nem determinantes antigênicos comuns entre ostrês tipos de circovírus conhecidos.

O PCV proveniente das células PK/15 é considerado como nãosendo patogênico. Conhece-se essa seqüência a partir de B.M. Meehan et al., JGen Virol 1997 (78) 21-227. Apenas muito recentemente foi que autores pensa-ram que cepas de PCV poderiam ser patogênicos e associados à síndromePMWS (Gupi P.S. Nayar et al., Can Vet J. vol. 38, 1997: 385-387 e Clark E.G.,Proc Am Assoc Swine Prac 1997: 499-501). Nayar et al. detectaram ADN dePCV em porcos que apresentavam a síndrome PMWS por técnicas de PCR.Nenhuma cepa selvagem de PCV foi, todavia, isolada e purificada até hoje.

A síndrome PMWS, detectada no Canadá, nos Estados Unidose na França, se caracteriza no plano clínico por uma perda progressiva depeso e por manifestações tais como taquipnéia, dispnéia e amarelecimento.No plano patológico, traduz-se por infiltrações linfocitárias ou granulomato-sas, Iinfoadenopatias e, mais raramente, por hepatites e nefrites linfocitáriasou granulomatosas (Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 499-501;A Semana Veterinária N9 26, suplemento à Semana Veterinária 1996 (834); ASemana Veterinária 1997 (857): 54; Gupi P.S. Nayar et al., Can Vet J. vol. 38,1997:385-387).

O depositante conseguiu isolar cinca cepas novas de PCV, a par-tir de amostras pulmonares ou ganglionárias, provenientes de criações noCanadá, nos Estados Unidos (Califórnia) e na França (Bretanha), a seguirdenominadas circovírus, de acordo com a invenção. Esses vírus foram colo-cados em evidência em lesões de porcos atingidos pela síndrome PMWS,mas não nos porcos sadios.

O depositante, além disso, seqüenciou o genoma de quatro des-ses cepas, a saber as cepas provenientes do Canadá e dos Estados Unidos,assim como duas cepas franceses. As cepas apresentavam, entre elas, umahomologia muito forte ao nível nucleotídico ultrapassando 96 % e muito menorcom a cepa PK/15, aproximadamente 76%. Os novas cepas podem, portanto,ser consideradas como representativas de um novo tipo de circovírus suíno,denominado no caso tipo II, o tipo I estando representado pela PK/15.

A presente invenção tem, portanto, por objeto o circovírus suínodo grupo II, tal como definido anteriormente, isolado ou sob forma de prepa-rado purificado.

a invenção refere-se a todo circovírus porcino capaz de serisolado de uma amostra fisiológica ou de uma amostra de tecidos, notada-mente de lesões, de um suíno doente apresentando a síndrome PMWS,notadamente segundo o método descrito nos exemplos, em particular circo-vírus do tipo II.

a presente invenção íesn mais particularmente por objeto prepara-dos purificados de cinca cepas, que foram depositados na ECACC (EuropeanCollection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research,Porton Down1 Salisbury, Wiltshire SP4 OJG1 Royaume-Uni), quinta-feira 2de outubro de 1997:

- N5 de acesso V97100219 (denominado no caso Imp. 1008PCV)

- N9 de acesso V97100218 (denominado no caso lmp.1010PCV)

- N2 de acesso V97100217 (denominado no caso lmp.999PCV)e, na sexta-feira, 16 de janeiro de 1998:

- N5 de acesso V98 011608 (denominado no caso Imp 1011 -48285);

- N5 de acesso V98 011609 (denominado no caso Imp 1011 -48121).

A invenção entende considerar os circovírus suínos isolados deum porco doente e/ou os circovírus com um parentesco sorológico significa-tivo com as cepas da invenção e/ou os circovírus com uma hibridação cru-zada com as cepas da invenção em condições de estringência tais que nãohá hibridação com a cepa PCV PK/15.

As cepas virais isoladas de uma amostra fisiológica ou de umaamostra de tecidos, notadamente de uma lesão, de um porco que apresen-tou a síndrome PMWS podem ser vantajosamente propagados sobre linha-gens celulares tais quais notadamente linhagens celulares de rim de porco,em particular células PK/15 indenes de contaminação (em particular paraPCV, assim como para pestivírus, adenovírus suínò e parvovírus suíno),com vistas à sua multiplicação ou especificamente para produção de antí-geno, completo (isto é, vírus) e/ou subunidades (isto é, polipeptídeos).

De maneira muito notável e inesperada, esses isolados se re-velaram muito produtivos em cultura sobre células PK/15, o que apresentavantagens inegáveis para produção de vírus ou de antígeno, em particularpara a produção de vacina inativada.

A presente invenção tem também por objeto os preparados decircovírus isolados, após passagens sobre células, notadamente linhagenscelulares, isto é, células PK/15, cultivadas in vitro, sendo infectadas por pelomenos um dos circovírus, de acordo com a invenção, ou qualquer circovírussuíno capaz de ser isolado de uma amostra fisiológica ou de uma amostrade tecidos, notadamente de lesões, de um suíno que apresentava a síndromePMWS. Ela tem também por objeto os resíduos ou extratos de cultura, even-tualmente purificados por técnicas padrão, e, de maneira geral, qualquer pre-parado antigênico obtido a partir das culturas in vitro.

A invenção tem também por objeto os princípios ativos imuno-gênicos e as vacinas contendo pelo menos um antígeno, tal como definido acima.

Pode tratar-se de princípios ativos imunogênicos à base de víruscompletos, vivos atenuados, ou vacinas preparadas com princípios ativos, aatenuação sendo feita segundo os métodos usuais, isto é, por passagemsobre células, de preferência por passagem sobre células de suíno, nota-damente linhagens, tais quais células PK/15 (por exemplo de 50 a 150, no-tadamente da ordem de 100, passagens). Essas vacinas compreendem, emgeral, um veículo ou diluente aceitável no plano veterinário, eventualmenteum adjuvante aceitável no plano veterinário, assim como eventualmente umestabilizador de liofilização.

Esses preparados antigênicos e vacinas compreenderão, depreferência, de 103 a 106TCID50.

Pode tratar-se também de princípios ativos imunogênicos ou devacinas à base de antígeno de circovírus, de acordo com a invenção, noestado inativado. As vacinas compreendem, além disso, um veículo ou dilu-ente aceitável no plano veterinário, com eventualmente, além disso, um ad-juvante aceitável no plano veterinário.

Os circovírus, de acordo com a invenção, com frações que po-dem estar presentes, foram inativados segundo as técnicas conhecidas dotécnico. A inativação será feita, de preferência, por via química, isto é, porexposição do antígeno a um agente químico, tal qual formaldeído (formol),paraformaldeído, β-propiolactona ou etileno imina ou seus derivados. Ométodo de inativação preferido será no caso a exposição a um agente quí-mico e, em particular, ao etileno imina ou à β-propiolactona.

De preferência, as vacinas inativadas, de acordo com a inven-ção, serão acrescentados vantajosamente, sendo apresentados sob a formade emulsões, por exemplo água-no-óleo ou óleo-na-água, segundo as téc-nicas bem conhecidas do técnico. O caráter adjuvante poderá também serproveniente da incorporação ao princípio ativo de um composto adjuvanteusual.

Dentre os adjuvantes que podem ser utilizados, podem-se citar,a título de exemplo, o hidróxido de alumina, as saponinas (isto é, Quilaja sa-ponin ou Quil A; ver Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach,1995, editado por Michael F. Powel et Mark J. Newman, Plennum Press,New-York and London, p.210), a Avridine ® (Vaccine Design p. 148), o DDA(dimetildioctadecilamônio bromida, Vaccine Design p. 157), o Polifosfazeno(Vaccine Design ρ 204) ou ainda emulsões óleo-na-água à base de óleo mi-neral, escalano (isto é, emulsão SPT, Vaccine Design p. 147), de escaleno(istoé, MF59, Vaccine Design p.183) ou água-no-óleo à base de óleo meta-bolizável (de preferência segundo WO-A-94 20071), assim como as emul-sões descritas em US-A-5 422 109. Pode-se também escolher associaçõesde adjuvantes, por exemplo Avridine® ou DDA associado a uma emulsão.

Essas vacinas compreenderão, de preferência, de 106 a 108 TCID50.

Os adjuvantes da vacina viva poderão ser escolhidos dentreaqueles dados para a vacina inativada. Preferir-se-ão as emulsões. Àquelasindicadas para a vacina inativada, podem-se acrescentar aquelas descritasem WO-A-9416681.

Como estabilizador de liofilização, podem-se citar, por exemplo,o SPGA (Bovarnik èt al., J. Bacteriology 59, 509, 950), hidratos de carbono,tais como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas,tais quais albumina ou caseína, derivados desses compostos ou tampões,tais quais fosfatos de metais alcalinos.

O depositante obteve, além disso, o genoma de quatro dos isola-dos, identificados SEQ ID NO: 1 a 4 e eventualmente 6.

A presente invenção tem, portanto, por objeto um fragmento deADN contendo no total ou parcialmente uma dessas seqüências. É evidenteque a invenção abrange automaticamente as seqüências equivalentes, istoé, as seqüências que não mudam a funcionalidade, nem a especificidade decepa da seqüência descrita, nem os polipetídeos codificados por essa se-qüência. Serão naturalmente incluídas as seqüências que diferem por de-generescência do código.

A invenção abrange igualmente as seqüências equivalentes nosentido de serem capazes de se tornarem híbridas na seqüência acima, emcondições de estringência elevadas e/ou terem uma elevada homologia comas cepas da invenção e pertencerem ao grupo Il definido mais acima.

Essas seqüências e seus fragmentos poderão vantajosamenteser utilizados para a expressão in vitro ou in vivo de polipetídeos com o au-xílio de vetores apropriados.

Em particular, quadros abertos de leitura, formando fragmentosde ADN, de acordo com a invenção, utilizáveis para isso foram identificadosna seqüência genômica dos circovírus de tipo II. A invenção refere-se aqualquer polipeptídeo contendo pelo menos um quadro aberto de leitura(seqüência em aminoácidos correspondente). De preferência, a invençãorefere-se a uma proteína formada essencialmente pelas COL4, COL7,COLIOe COL13.

Para a expressão de subunidades in vitro, como meio de expressão,ter-se-á, de preferência, recorrido a E. coli ou ao bacilovírus (US-A-4 745 051).Integra(m)-se a ou as seqüência(s) codificante(s) ou seus fragmentos no ge-noma do bacilovírus (por exemplo o bacilovírus Autographa californica Nu-clear Polyhedrosis Virus AcNPV) e este é em seguida propagado sobre cé-lulas de insetos, por exemplo Spodoptera frugiperda Sf9 (depósito ATCCCRL 1711). Pode-se ainda produzir as subunidades em células eucariotes,tais quais lêvedos (por exemplo Saccharomyces cerevisiae) ou células demamíferos (por exemplo CHO, BHK).

A invenção tem também por objeto os polipeptídeos que serãoproduzidos in vitro por esses meios de expressão, depois eventualmentepurificados segundo as técnicas tradicionais. Ela tem também por objeto asvacinas de subunidade, compreendendo pelo menos um polipeptídeo, talcomo assim obtido, ou fragmento, em um veículo ou diluente aceitável no pla-no veterinário e eventualmente um adjuvante aceitável no plano veterinário.

Para a expressão in vivo com vistas à realização de vacinas vivasrecombinantes, insere(m)-se a ou as seqüência(s) codificante(s) ou seusfragmentos em um vetor de expressão apropriado em condições que permi-tem a expressão do ou dos polipeptídeos. Como vetores apropriados, po-dem-se utilizar vírus vivos, de preferência capazes de se multiplicarem nosuíno, não-patogênicos para o suíno (naturalmente não-patogênico ou assimtornado), segundo as técnicas bem conhecidas do técnico. Poder-se-ão nota-damente utilizar herpesvírus do suíno, tais comò o vírus do Mal de Aujeszky, oadenovírus suíno, poxvírus, notadamente vírus da vacina, avipox, canarypox,swinepox. Podem-se também utilizar, como vetores, ADNs plasmídicos(WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797, WO-A-95 20660).

A invenção tem, portanto, por objeto os vetores e as vacinasvivas recombinantes ou plasmídicas (vacinas polinucleotídicas ou ADN) as-sim realizadas, as vacinas compreendendo, além disso, um veículo ou dilu-ente aceitável no plano veterinário.

As vacinas, de acordo com a invenção (vivas atenuadas, inati-vadas, subunidades, vivas recombinantes, plasmídicas), poderão compre-ender um ou princípio(s) ativo(s) (antígenos) de um ou de vários (2 ou 3)dos circovírus, de acordo com a invenção.

A invenção prevê também associar, para cada um dos tipos devacinas descritas acima, a vacinação contra o circovírus suíno a uma vaci-nação contra outros patogênicos do suíno, em particular aqueles que podemser associados à síndrome PMWS. As vacinas, de acordo com a invenção,notadamente inativadas, poderão, portanto, compreender uma outra valênciacorrespondente a um outro patogênico do suíno. Dentre esses outros patogêni-cos do suíno, podem-se citar, de preferência, o PRRS (Porcine Reproductoryand Respiratory Syndrome) (o técnico poderá se reportar a WO-93/07898,WO-A-94/18311, FR-A-2 709 966; C. Chareyre et al., Proceedings of the 15th IPVS Congress Brimingham, England, 5-9 julho de 1998, p. 139; incorpora-dos por referência) e/ou Mycoplasma hyopneumoniae (o técnico poderá sereportar a EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A-571 648, O. Martinon et al.,p.157, p.284. p. 285 e G, Reynaud et al., p. 150 do Proceedings of the 15 thIPVS Congress acima; incorporados por referência). Dentre as outras valên-cias interessantes, podem-se citar Actinobacillus pleuropneumoniae, E. colie Rinite atrópica do suíno, ou ainda Mal de Aujeszky, peste suína tradicional(Hog Cholera), gripe suína.

A presente invenção tem também por objeto um método quepermite induzir uma resposta imunitária no porco, face aos circovírus, deacordo com a invenção. Ela tem, em particular, por objeto um método devacinação eficaz no porco.

Esse método prevê a administração no porco, em uma ou váriasvezes, de uma vacina citada. Também é possível combinar vários tipos devacinas acima em um mesmo protocolo de vacinação.

Esse método prevê não somente a administração nos porcosadultos, mas também nos jovens ou nas fêmeas gestantes. A vacinação des-tas permite conferir uma imunidade passiva aos recém-nascidos (anticorposmaternos).

A presente invenção oferece também a possibilidade de diagnos-ticar a presença dos circovírus, de acordo com a invenção, no porco. Ela tem,portanto, por objeto testes de diagnóstico e métodos a isso relativos, queutilizam e aplicam os reagentes que vão ser descritos a seguir.

O conhecimento das seqüências dos diferentes circovírus per-mite definir seqüências comuns que permitem produzir reagentes aptos aidentificar o conjunto dos circovírus suínos conhecidos.

O técnico poderá também escolher fragmentos das seqüênciascorrespondentes a regiões que apresentam pouca ou nenhuma homologiacom a seqüência correspondente do circovírus PK/15, afim de poder efetuarum diagnóstico específico.

Os alinhamentos de seqüências permitem ao técnico escolherum reagente, conforme os desejos.

Um primeiro reagente consiste nas seqüências de ADN divulga-das no caso e seus fragmentos, que serão notadamente utilizados comosondas ou esboços em técnicas de hibridação ou de PCR ("PolymeraseChain Reaction") bem conhecidas.

Um segundo reagente consiste nos polipeptídeos codificadospor essas seqüências a partir do vírus ou expressos com o auxílio de umvetor (ver acima), ou sintetizados por via química, segundo as técnicas tra-dicionais de síntese peptídica.

Um terceiro e quarto reagentes consistem em anticorpos res-pectivamente policlonais e monoclonais que poderão ser produzidos segun-do as técnicas usuais, a partir do vírus, polipeptídeos ou fragmentos, extraí-dos ou codificados pelas seqüências de ADN.

Esses segundo, terceiro e quarto reagentes poderão ser utiliza-dos em um método de diagnóstico, objeto da invenção, no qual se busca,em uma amostra de fluido fisiológico (sangue, plasma, soro, etc) ou amostrade tecido (gânglios, fígado, pulmões, rins, etc) proveniente de um suíno aser testado, a presença de um antígeno específico de um circovírus, deacordo com a invenção, procurando detectar seja o próprio antígeno.

Os antígenos e anticorpos, de acordo com a invenção, poderãoser utilizados em todas as técnicas de diagnóstico de laboratório conhecidas.

Todavia, preferir-se-á utilizá-los em técnicas que possam seraplicadas diretamente no terreno pelo veterinário, o criador ou o proprietáriodo animal. O técnico dispõe do conjunto das técnicas de laboratório e doterreno, e está, portanto, em condições de adaptá-las à utilização desseantígeno e/ou dos anticorpos como reagente(s) de diagnóstico.

As técnicas de diagnóstico que serão preferencialmente aplica-das no âmbito da presente invenção são o Western Blot, a imunofluores-cência, ELISAe imunocromatografia.

No que se refere à aplicação de métodos por imunocromatografia,o versado poderá se reportar notadamente a Robert F. Zurk et al., Clin. Chem.31/7, 1144-1150 (1985), assim como as patentes ou pedidos de patente WO-A-88/08 534, WO-A-91/12528, EP-A-291 176, EP-A-299 428, EP-A-291 194,EP-A-284 232, US-A-5120 643, US-A-5 030 558, US-A-5 266 497, US-A-4 740 468,US-A-5 266 497, US-A-4 855 240, US-A-5 451 504, US-A-5 141 850, US-A-5 232 835 e US-A-5 238 652.

Assim, busca-se, de preferência, detectar os anticorpos especí-ficos na amostra por teste indireto, por competição ou por deslocamento.Para isso, utiliza-se o próprio antígeno como reagente de diagnóstico, ouum fragmento desse antígeno, conservando a identificação dos anticorpos.A marcação pode vantajosamente ser uma marcação à peroxidase ou umamarcação particular, de preferência ao outro coloidal.

Pode-se procurar detectar o próprio antígeno na amostra com oauxílio de um anticorpo marcado específico desse antígeno. A marcação évantajosamente conforme descrito acima.

Por anticorpo específico do antígeno utilizável notadamente emcompetição ou deslocamento ou para a detecção do próprio antígeno, en-tendem-se anticorpos monoclonais e policlonais específicos do antígeno,fragmentos desses anticorpos, de preferência fragmentos Fab ou F(ab)'2.

Um outro aspecto da invenção é a produção de anticorpos, poli-clonais ou monoclonais, específicos do antígeno, de acordo com a inven-ção, esses anticorpos podendo ser em seguida utilizados notadamentecomo reagentes de diagnóstico para a detecção do antígeno em uma amos-tra de fluido fisiológico ou em uma amostra de tecido, ou mesmo para a de-tecção de anticorpos presentes nessa amostra ou retirada. A invenção incluitambém os fragmentos imunologicamente funcionais desses anticorpos, emparticular os fragmentos F(ab) e F(ab)'2.

Anticorpos poderão ser preparados pelas técnicas usuais. Pode-se notadamente fazer referência a Antibodies, A Laboratory Manual, 1988,Cold Spring Harbor laboratory, USA ou a J.W. Goding, Monoclonal Antibo-dies: Principies and Practice, Academic Press Inc., cujos conteúdos são in-corporados, no caso, por referência.

Poder-se-á notadamente proceder, conforme conhecido em si, àfusão de células esplênicas de ratos imunizados pelo antígeno ou por pelomenos um de seus fragmentos, com células mielomatosas adequadas.

A invenção tem igualmente por objeto um preparado, de prefe-rência puro ou parcialmente purificado, ou mesmo bruto de anticorpos mo-noclonais ou policlonais específicos do antígeno, notadamente anticorposde rato ou de coelho.

A presente invenção permite igualmente determinar epítopos deinteresse notadamente na base de seqüências de ADN descritas no caso,quer sejam epítopos de interesse vacinai ou epítopos de interesse em diagnósti-co. A partir da seqüência de ADN do genoma do circovírus, de acordo com a in-venção, o técnico deve mesmo determinar epítopos segundo os métodos co-nhecidos, por exemplo programa informático apropriado ou PEPSCAN: Osepítopos são regiões imunodominantes de proteínas e são a esse respeitoregiões expostas à superfície das proteínas. Eles podem ser, portanto, iden-tificados por anticorpos e assim ser particularmente empregados no domíniodo diagnóstico seja para o preparo de anticorpos para fins de diagnóstico,seja para a realização de peptídeos correspondentes utilizáveis a título dereagentes de diagnóstico.

No mínimo, um epítopo é um peptídeo que tem de 8 a 9 aminoá-cidos. Preferir-se-á, em geral, um mínimo de 13 a 25 aminoácidos.

O técnico está, portanto, em condições de, aplicando uma ouvárias dessas técnicas, assim como outras técnicas disponíveis, encontrarepítopos para a utilização de peptídeos ou de anticorpos para fins de dia-gnóstico.

A invenção tem igualmente por objeto um kit de diagnóstico,comportando esse antígeno e/ou anticorpos policlonais ou monoclonais es-pecíficos desse antígeno. Trata-se em particular de kits de diagnóstico cor-respondentes às técnicas de diagnóstico descritas mais acima.

A invenção vai ser descrita mais detalhadamente como auxíliode exemplos de realização não-limitativos, considerados com referência aodesenho, no qual:

Figura 1: seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 1011-48121

Figura 2: seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 1011-48285

Figura 3: seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 999

Figura 4: seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 1010

Figura 5: alinhamento das 4 seqüências, segundo as figuras 1 a 4, com a seqüência da cepa PCV PK/15

Figura 6: seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 999, talcomo definida no primeiro depósito na França de 3 de outubro de 1997

Figura 7: alinhamentos da seqüência da figura 6 com a seqüên-cia da cepa PK/15

Lista das seqüências SEQ ID

SEQ ID N01: seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 1011 -48121SEQ ID N0 2: -seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 1011 -48285SEQ ID N0 3: seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 999SEQ ID N0 4: seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 1010SEQ ID N0 5: seqüência de ADN do genoma da cepa PK/15, segundo as

SEQ ID N0 6: seqüência de ADN do genoma da cepa Imp 999, talcomo definida no primeiro depósito na França em 3 de outubro de 1997

Exemplos

Exemplo 1: cultura e isolamento das cepas de circovírus suínos:

Amostras de tecidos foram coletadas na França, no Canadá enos Estados Unidos, a partir de pulmões e de gânglios linfáticos de suínos.Esses suínos apresentavam sinais clínicos típicos da síndrome de depere-cimento generalizado de pós-desmame. Para facilitar o isolamento do vírus,as amostras de tecidos foram congeladas a -70°C imediatamente após au-tópsia.

Para o isolamento viral, suspensões contendo aproximadamente15 % de amostra de tecido foram preparadas em um meio mínimo contendosais de Earl (EMEM, BioWhittaker UK Ltda, Wokingham, UK), penicilina(100 Ul/ml) e estreptomicina (100 μg/ml) (meio MEM-SA), por moagem dostecidos com areia estéril por meio de argamassa e de pilão estéreis. Essepreparado moído foi então recuperado em MEM-SA, depois centrifugada a3000 g, durante 30 minutos a + 4°C para coletar o resíduo.

Previamente à inseminação das culturas de células, um volumede 100 μΙ de clorofórmio foi acrescentado a 2 ml de cada resíduo e mistura-do em contínuo durante 10 minutos à temperatura ambiente. Essa misturafoi então transferida em um tubo de microcentrifugadora, centrifugado a3000 g durante 10 minutos, depois o resíduo foi coletado. Esse resíduo foiem seguida utilizado como inóculo pelas experiências de isolamento viral.

Todos os estudos de isolamento viral foram feitos sobre culturasde células PK/15, conhecidos para não serem contaminados pelo circovírussuíno (PCV)1 os pestevírus, os âdenovírus suínos e o parvovírus suíno(Allan G. et al. Pathogenesis of porciné circovirus experimental infections ofcolostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Mi-crobiol. 1995. 44. 49-64).

O isolamento dos circovírus suínos foi feito de acordo com aseguinte técnica:

Monocamadas de células PK/15 foram dissociadas por tripsinação(com uma mistura tripsina-verseno), a partir de culturas confluentes, e retomadasem meio MEM-SA contendo 15 % de soro fetal de bezerro não-contaminadopor pestivírus (=meio MEM-G) sob uma concentração final de aproximada-mente 400.000 células por ml. Frações alíquotas de 10 ml dessa suspensãocelular foram então misturadas com frações alíquotas de 2 ml de inóculosdescritos acima, e as misturas finais foram colocadas em alíquotas em volu-mes de 6 ml em dois frascos Falcon de 25 cm2. Essas culturas foram entãoincubadas a + 37 0C1 durante 18 horas em atmosfera contendo 10 % de CO2.

Após incubação, o meio de cultura das monocamadas semicon-fluentes foi tratado com 300 mM de D-glicosamina (Cat n° G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, UK) (Tischr I. et al., Arch. Virol. 1987 96 39-57),depois a incubação prosseguir durante um período suplementar de 48-72 ho-ras a +37°C. Na seqüência desta última incubação, um dos dois Frascos decada inóculo sofreu 3 ciclos sucessivos de congelamento/descongelamento.As células PK/15 do Frasco restantes foram tratadas com uma solução detripsina-verseno, novamente suspensas em 20 ml de meio MEM-G, depoisinseminadas em Frascos de 75 cm2 a uma concentração de 400.000 célu-las/ml. Os frascos recentemente inseminados foram então "superinfectados"por adição de 5 ml do Iisato correspondente obtido após os ciclos de con-gelamento/descongelamento.

Exemplo 2: preparo das amostras de cultura celular para detecção dos cir-covírus suínos por imunofluorescência ou por hibridação in situ

Um volume de 5 ml da suspensão "superinfectada" foi retirada einseminada em uma caixa Petri de 55 mm de diâmetro contendo uma lâminade vidro estéril e desengordurada. As culturas de frascos e sobre lâminasde vidro foram incubadas a + 37°C e tratadas com a glicosamina conformedescrito no exemplo 1. As culturas sobre lâminas de vidro foram coletadasde 24 a 48 horas, após o tratamento com a glicosamina e fixadas seja com aacetona durante 10 minutos à temperatura ambiente, seja com 10 % de for-maldeído tamponado, durante 4 horas. Após essa fixação, todas as lâminasde vidro foram armazenadas a -70°C, sobre sílica gel, antes de sua utiliza-ção para os estudos de hibridação in situ é os estudos de marcação imuno-citoquímica.

Exemplo 3: técnicas de detecção de seqüências PCV por hibridação in situ

A hibridação in situ foi feita sobre os tecidos retirados de suínosdoentes e fixados no formaldeído e igualmente sobre os preparados de cul-turas de células inoculadas para o isolamento viral (ver exemplo 2) e fixadassobre lâminas de vidro.

Sondas genômicas completas correspondentes aos circovírussuínos PK/15 (PCV) e ao vírus da anemia infecciosa do frango (chickenanemia virus = CAV) foram utilizadas. O plasmídeo pPCV1, contendo a for-ma replicativa do genoma PCV clonado sob a forma de um enxerto único de1,7 quilopares de bases (kpb) (Meehan B. et al. Sequence of porcine circovi-rus DNA: affinities with plant circoviruses. J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227)foi utilizado como fonte de ADN viral específico para PCV. Um plasmídeoanálogo, pCAA1, contendo a forma replicativa 2,3 kpb do circovírus aviárioCAVfoi utilizado como controle negativo. Os estoques de gliceróis respecti-vos desses dois plasmídeos foram utilizados para a produção e a purifica-ção dos plasmídeos, segundo a técnica de Iise alcalina (Sambrook J. et al.Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor La-boratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989), a fim de que sirvam em se-guida de matrizes para o preparo das sondas. As sondas circovírus repre-sentativos dos genomas completos de PCV e de CAV foram produzidas apartir dos plasmídeos purificados descritos acima (1 μg para cada sonda) ede esboços de hexanucleotídicos ao acaso, utilizando um kit comercial demarcação não-radioativo ("DIG DNA Iabelling kit", Boehringer Mannheim,Lewes, UK), segundo as recomendações do fornecedor.

As sondas marcadas com a digoxigenina foram recuperadas sobum volume de 50-110 μΙ de água estéril, antes de sua utilização para a hi-bridação in situ.

As amostras de tecidos de suínos doentes, incluídas na parafinae fixadas no formaldeído, conforme os preparados de culturas de célulasinfectadas, fixadas no formaldeído, foram preparadas para a detecção dosácidos nucléicos PCV1 de acordo com a seguinte técnica:

Seções de 5 μιτι de espessura foram recortadas a partir de blo-cos de tecidos incluídos na parafina, desparafinados, depois reidratados emsoluções sucessivas de álcool de concentração decrescente. As seções detecidos e as culturas de células fixadas no formaldeído foram incubadas,respectivamente, durante 15 minutos e 5 minutos a +37°C em uma soluçãode proteinase K a 0,5 % em tampão Tris-HCI 0,05 M, EDTA 5 mM (pH 7,6).

As lâminas foram então colocadas em uma solução de glicina a 1 % emágua destilada autoclavada, durante 30 segundos, lavadas duas vezes comum tampão PBS (phosphate buffer saline) 0,01 M (pH 7,2), e, enfim, lavadasdurante 5 minutos em água destilada estéril. Elas foram finalmente secas aoar livre e colocadas em contato com as sondas.

Cada preparado tecido/sonda foi recoberto com uma lâminaprópria e desengordurada, depois colocado em um forno a + 90°C durante10 minutos, em seguida colocado em contato com um bloco de gelo durante1 minuto, e, enfim, incubado durante 18 horas a + 37°C. Os preparados fo-ram, em seguida, imersos brevemente em um tampão de sal de sódio-citrato(SSC) 2X (pH 7,0) para eliminar as lâminas protetoras, depois lavados 2 vezesdurante 5 minutos em tampão SSC 2X e, enfim, lavados 2 vezes durante 5minutos em tampão PBS.

Após essas lavagens, os preparados foram imersos em umasolução de ácido maléico 0,1 M, NaCI 0,15 M (pH 7,5) (tampão maléico) du-rante 10 minutos, depois incubados em uma solução de 1 % de reagentebloqueador (Cat n° 1096176, Boering Mannheim UK, Lewis, East Sussex,UK) em tampão maléico durante 20 minutos a + 37°C.Os preparados foram, então, incubados com uma solução a1/250 de um anticorpo monoclonal antidigoxigenina (Boehringer Mannheim),diluído em tampão bloqueador, durante 1 hora a + 37°C, lavados em PBS e,enfim, incubados com um anticorpo biotinilado antiimunoglobulina de ratosdurante 30 minutos a + Z1°C. Os preparados foram lavados em PBS e a ati-vidade peroxidase endógena foi bloqueada por um tratamento com uma so-lução de peróxido de hidrogênio a 0,5 % em PBS durante 20 minutos à tem-peratura ambiente. Os preparados foram lavados uma outra vez em PBS etratados com um substrato 3-amino-9-dietilcarbazol (AEC) (Cambridge Bios-cience, Cambridge, UK) preparado extemporaneamente.

Após uma última lavagem com água de rua, os preparados fo-ram contracoloridos com hematoxilina, "azulados" sob água de rua, e mon-tados sob lâminas microscópicas com um líquido de montagem (GVA Mount,Cambridge Bioscience1 Cambridge, UK). Os controles de experiência incluí-ram a utilização de uma sonda negativa não pertinente (CAV) e de umasonda positiva (PCV) sobre amostras provenientes de porcos doentes e deporcos não doentes.

Exemplo 4: Técnica de detecção do PCV por imunofluorescência

A crivação inicial de todos os preparados de cultura celular fixa-dos à acetona foi feita por uma técnica de imunofluorescência indireta (IFl)1utilizando uma diluição a 1/100 de um pool de soros de porcos adultos.Esse pool de soros compreende soros de 25 porcas adultas da Irlanda doNorte, e é conhecido por conter anticorpos contra uma grande variedade devirus suínos, aí compreendidos PCV: parvovirus suíno, adenovirus suíno evirus PRRS. A técnica IFI foi realizada por um contato do soro (diluído emPBS) com as culturas celulares durante uma hora a + 37°C, seguida de duaslavagens em PBS. As culturas de células foram, então, coloridas com umadiluição a 1/80 e, PBS de um anticorpo de coelho antiimunoglobulina deporco conjugado a isotiocianato de fluoresceína durante uma hora, depoislavadas em PBS e montadas em tampão de glicerol anteriormente à obser-vação microscópica sob iluminação ultravioleta.

Exemplo 5: Resultados da hibridação in situ sobre os tecidos de porcos do-entes

A hibridação in situ, utilizando uma sonda genômica PCV, feitaem tecidos retirados de leitões franceses, canadenses e californianos, apre-sentando lesões de deperecimento generalizado e fixadas ao formaldeído,revelou a presença de ácidos nucléicos PCV associados às lesões, em vári-as das lesões estudadas. Nenhum sinal foi observado quando a sonda ge-nômica PCV foi utilizada em tecidos retirados de porcos não doentes ouquando a sonda CAV foi utilizada em tecidos de porcos doentes. A presençade ácido nucléico PCV foi identificada no citoplasma e o núcleo de numero-sas células mononucleares infiltrando as lesões nos pulmões dos leitõescalifornianos. A presença de ácido nucléico PCV foi igualmente posta emevidência nos pneumócitos, nas células epiteliais brônquicas e bronquiola-res, e nas células endoteliais das pequenas artérias, vênulas e vasos linfáticos.

Entre os porcos franceses, a presença de ácido nucléico PCVfoi detectada no citoplasma de numerosos linfócitos foliculares e nas célulasmononucleares intra-sinusoidais dos gânglios linfáticos. O ácido nucléicoPCV foi igualmente detectado em sincícios ocasionais. Em função dessesresultados de detecção, amostras de pulmões de porcos californianos, degânglios linfáticos mesentéricos de porcos franceses e de órgãos de porcoscanadenses foram escolhidos para fins de isolamento de novas cepas decircovírus suínos.

Exemplo 6: Resultados da cultura celular de novas cepas de circovírus suí-nos e detecção por imunofluorescência

Nenhum efeito citopático (ECP) foi observado nas culturas decélulas inoculadas com as amostras retiradas dos leitões franceses (cepa Imp.1008), californianos (cepa Imp. 999) e canadenses (cepa Imp. 1010) mostrandosinais clínicos da síndrome do deperecimento generalizado. Entretanto, aimuno-marcação dos preparos provenientes das culturas de células inocula-das, após fixação à acetona e com um pool de soros policlonais de porcos,revelou uma fluorescência nuclear em numerosas células nas culturas ino-culadas a partir de pulmões de leitões californianos (cepa Imp. 999), a partirde gânglios linfáticos mediastinais dos leitões franceses (cepa Imp. 1008), ea partir de órgãos dos leitões canadenses (cepa Imp. 1010).Exemplo 7: Extração do ADN genômico dos circovírus suínos.

As formas replicativas dos novas cepas de circovírus suínos(PCV) foram preparadas a partir de culturas de células PK/15 infectadas (verexemplo 1) (10 Frascos de 75 cm2) colhidas após 72-76 horas de incubação etratadas com a glucosamina, conforme descrito para a clonagem da forma repli-cativa da CAV (Todd. D. et al. Dot blot hybridization assay for chicken anemiaagent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991. 29. 933-939). OADN de duplo filamento dessas formas replicativas foi extraído de acordocom uma modificação da técnica de Hirt (Hirt B. Selective extraction of po-Iyoma virus DNAfrom infected cell cultures. J. Mol. Biol. 1967. 36. 365-369),conforme descrito por Molitor (Molitor T. W, et al. Porcine parvovirus DNA:characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isola-tes. Virology. 1984. 137. 241-254).

Exemplo 8: Carta de restrição da forma replicativa do genoma da cepa Imp.999 de circovírus suíno

O ADN (1-5 μg) extraído segundo a técnica de Hirt foi tratadopela nuclease S1 (Amersham) de acordo com as recomendações do fornece-dor, após esse ADN ter sido digerido por diferentes enzimas de restrição(Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, UK) e os produtos da digestãoforam separados por eletroforese sobre gel de agarose a 1,5 % em presença debrometo de etídio, conforme descrito por Todd et al. (Purification and biochemi-cal characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990.71. 819-823).

Ό ADN extraído das culturas da cepa Imp. 999 possui um únicosítio EcoRI, 2 sites Sacl e não possui sítio Pstl. Esse perfil de restrição é,portanto, diferente do perfil de restrição apresentado pela cepa PCV PK/15(Meehan B. et al. Sequence of porcine circovírus DNA: affinities with plantcircoviruses. 1997. 78. 221-227) que possui, ao contrário, um sítio Pstl enão possui sítio EcoRI.

Exemplo 9: Clonagem do genoma da cepa Imp. 999 de circovírus suínos

O fragmento de restrição de aproximadamente 1,8 kpb, geradopor digestão da forma replicativa de duplo filamento da cepa PCV Imp. 999com a enzima de restrição EcoRI, foi isolado após eletroforese sobre gel deagarose a 1,5 % (ver exemplo 3), utilizando-se um kit comercial Qiagen(QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat n° 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, WestSussex, UK). Esse fragmento de restrição EcoRI-EcoRI foi em seguida liga-do com o vetor pGEM-7 (Promega, Medicai Supply Company, Dublin, Ire-land), previamente digerido pelas mesmas enzimas de restrição e desfosfo-rilado, em seguida, as técnicas padronizadas de clonagem (Sambrook J. etal. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2a Edition. Cold Spring HarborLaboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Os plasmídeos obtidosforam transformados em uma cepa hospedeira Escherichia coli JM 109(Stratagene, La Jolla, USA), de acordo com as técnicas padronizadas. Ofragmento de restrição EcoRI-EcoRI da cepa PCV Imp. 999 foi igualmenteclonado no sítio EcoRI do vetor pBlueScript SK + (Stratagene Inc. La Jolla,USA). Dentre os clones obtidos para cada cepa hospedeira, pelo menos2 clones contendo os fragmentos do tamanho esperado foram selecionados.

Os clones obtidos foram então cultivados e os plasmídeos contendo o geno-ma completo da cepa Imp. 999 foram purificados em pequeno volume (2 ml)ou em grande volume (250 ml), de acordo com as técnicas padrão de prepa-ro e de purificação dos plasmídeos.

Exemplo 10: Seqüenciamento do ADN genômico (forma replicativa de duplofilamento) da cepa PCV Imp. 999

A seqüência nucleotídica de 2 clones EcoRI Imp. 999 (clonespGEM-7/2 e pGEM-7/8) foi determinada de acordo com a técnica dos dideo-xinucleotídeos de Sanger, utilizando-se o kit de seqüenciamento "AmpIiTaqDNA polymerase FS" (Cat n° 402079 PE Applied Biosystems, Warrington,UK) e um aparelho de seqüenciamento automático Applied BiosystemsABI373A, segundo as recomendações do fornecedor. As reações de se-qüenciamento iniciais foram feitas com os primers universais M13 "forward"e "reverse". As reações de seqüenciamento seguintes foram geradas deacordo com a técnica de "marcha sobre o ADN". Os oligonucleotídeos ne-cessários a esses seqüenciamentos posteriores foram sintetizados por LifeTechnologies (Inchinnan Business Park, Paisley1 UK).

As seqüências gerais foram reunidas e analisadas por meio dosoftware MacDNASIS versão 3.2. (Cat n° 22020101, Appligene1 Durham1UK). Os diferentes quadros abertos de leitura foram analisados por meio doalgoritmo BLAST1 disponível no servidor do "National Center for Biotechno-Iogy Information" (NCBI1 Bethesda1 MD1 USA).

A seqüência completa (frsgmento EcoRI-EcoRI) obtida inicial-mente a partir do clone pGEM-7/8 (SEQ ID NO : 6) é apresentada na figuran° 6. Ela começa arbitrariamente após o G do sítio EcoRI1 e apresenta al-gumas incertezas sobre o plano dos nucleotídicos.

O seqüenciamento foi em seguida otimizado e a SEQ ID N0 3(figura 3) dá a seqüência total dessa cepa, que se fez começar arbitraria-mente no início do sítio EcoRI, seja o G como primeiro nucleotídeo.

Procedeu-se de maneira similar para a obtenção da seqüênciados três outros isolados, de acordo com a invenção (ver SEQ ID N0: 1, 2 e 4e figuras 1, 2 e 4).

0 tamanho do genoma dessas quatra cepas é:Imp 1011-48121 1767 nucleotídeosIMP 1011-48285 1767 nucleotídeosImp 999 1768 nucleotídeosImp 1010 1768 nucleotídeos

Exemplo 11: Análise da seqüência da cepa PCV Imp. 999

Quando a seqüência gerada a partir da cepa Imp.999 foi utiliza-da para uma pesquisa de homologia face a seqüências contidas no banco dedados GenBank1 a única homologia significativa que foi detectada é uma ho-mologia de aproximadamente 76 % (ao nível ácido nucléico) com a seqüênciada cepa PK/15 (números de acesso Y09921 e U49186) (ver a figura N0 5).

Ao nível aminoácidos, a pesquisa de homologia da tradução dasseqüências nas 6 fases com os bancos de dados (algoritmo BLAST X sobreo servidor NCBI) permitiu colocar em evidência uma homologia de 94 % como quadro aberto de leitura correspondente à réplica teórica do vírus BBTVsimilar ao circovírus de plantas (número de identificação GenBank 1841515)codificada pela seqüência GenBank U49186.

Nenhuma outra seqüência contida nos bancos de dados mostrahomologia significativa com a seqüência gerada a partir da cepa PCVlmp.999.

A análise das seqüências obtidas a partir da cepa Imp 999 culti-vada a partir de lesões retiradas sobre suínos californianos que apresenta-vam sinais clínicos da síndrome de deperecimento generalizado mostra cla-ramente que esse isolado viral é uma nova cepa de circovírus suíno.

Exemplo 12: Análise comparativa das seqüências

O alinhamento das seqüências nucleotídicas das 4 novas cepasPCV foi feita com a seqüência da cepa PCV PK/15 (figura 5). Uma matriz dehomologia, considerando as quatro novas cepas e a cepa anterior PK/15 foirealizada. Os resultados foram os seguintes:

<table>table see original document page 22</column></row><table>

A homologia entre as duas cepas franceses Imp 1011-48121 eImp 1011-48285 é superior a 99 % (0,9977).

A homologia entre as duas cepas norte-americanas Imp 999 eImp 1010 é também superior a 99 % (0,9949). A homologia entre cepasfrancesas e cepas norte-americanas é um pouco superior a 96 %.

A homologia de todas essas cepas com PK/15 cai para um valorcompreendido entre 75 e 76 %.Deduz-se daí que as cepas, de acordo com a invenção, são re-presentativas de um novo tipo de circovírus suíno, distinto do tipo repre-sentado pela cepa PK/15. Esse novo tipo, isolado de suínos apresentando asíndrome PMWS, é denominado circovírus suíno de tipo II, a PK/15 repre-sentando o tipo I. As cepas pertencentes a esse tipo Il apresentam uma no-tável homogeneidade de seqüência nucleotídica, então mesmo que tenhamsido isoladas em regiões geográficas muito afastadas.

Exemplo 13: Análise das proteínas codificadas pelo genoma dos novas cepas PCV

A seqüência nucleotídica do isolado Imp. 1010 foi consideradacomo representativa das outras cepas de circovírus associadas à síndromede deperecimento generalizado. Essa seqüência foi analisada mais deta-lhadamente com o auxílio do algoritmo BLASTX (Altschul et al. J. Mol. Biol.1990. 215. 403-410) e de uma combinação de programas do conjunto desoftwares MacVector 6.0 (Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK).Foi possível detectar 13 quadros abertos de leitura (ou COLs) de um tama-nho superior a 20 aminoácidos sobre essa seqüência (genoma circular).

Esses 13 COLs são os seguintes:

<table>table see original document page 23</column></row><table>As posições de começo e de fim de cada COL se referem à se-qüência apresentada na figura N0 4 (SEQ ID N0 4), do genoma da cepa 1010.Os limites dos COLs 1 a 13 idênticos para a cepa 999. Elas o são tambémpara as cepas 1011-48121 e 1011-48285, salvo para os COLs 3 e 13:

COL3 1432-1539, sentido, 108 nt, 35aa

COL 13 314-1377, anti-sentido, 705 nt, 234 aa.

Dentre esses 13 COLs, 4 apresentam uma homologia significativacom COLs análogos situados sobre o genoma do vírus clonado PCV PK-15.Cada um dos quadros abertos de leitura presentes sobre o genoma de to-dos os isolados de circovírus associados à síndrome de deperecimento ge-neralizado foi analisado. Esses 4 COLs são os seguintes:

<table>table see original document page 24</column></row><table>

As posições de começo e de fim de cada COL se referem à se-qüência apresentada na figura N0 4 (SEQ ID N0 4). O tamanho do COL (emnucleotídeos = nt) inclui o codon stop.

A comparação entre a organização genômica dos isolados PCVImp. 1010 e PCV PK-15 permitiu a identificação de 4 COLs conservados nogenoma dos dois vírus. A tabela abaixo apresenta os graus de homologiaobservados:

<table>table see original document page 24</column></row><table>A maior identidade de seqüência foi observada entre o COL4lmp.1010 e o COL1 PK-15 (86 % de homologia). Isto era esperado, à medi-da que essa proteína estava provavelmente implicada na réplica do ADNviral e era essencial para a réplica viral (Meehan et al. J. Gen. Virol. 1997.78. 221-227; Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998. 79, 381-384).

A identidade de seqüência entre o COL 13 Imp. 1010 e o COL2PK-15 é menos forte (66,4 % de homologia), mas cada um desses doisCOLs apresenta bem uma região básica N-terminal muito conservada, que éidêntica à região N-terminal da proteína estrutural maior do circovírus aviárioCAV (Meehan et al. Arch. Virol. 1992. 124. 301-319. Maiores diferenças sãoobservadas entre ÇOL7 Imp. 1010 e COL3 PK-15 e entre COL 10 Imp. 1010 eCOL4 PK-15. Em cada caso, existe uma deleção da região C-terminal dasCOL7 e COL 10 do isolado Imp. 1010 quando se comparam com as COL3 eCOL4 de PCV PK-15. A mais alta homologia de seqüência foi observada nonível das regiões N-terminasi de COL7/COL3 (61,5% de homologia nível daabrangência) e de COL10/COL4 (83 % de homologia em nível da abrangência).

A organização genômica do circovírus suíno é bastante complexana extrema compacidade de seu genoma. A proteína estrutural maior é pro-vavelmente oriunda de um entrelaçamento entre vários quadros de leiturasituados no mesmo filamento do genoma do circovírus suíno. Pode-se, por-tanto, considerar que qualquer quadro aberto de leitura (COL1 a COL13), talcomo descrito na tabela acima, pode representar, total ou parcialmente, umaproteína antigênica codificada pelo circovírus suíno de tipo Il e é, portanto,potencialmente um antígeno utilizável para o diagnóstico específico e/ou paraa vacinação. A invenção refere-se, portanto, a qualquer proteína compreen-dendo elo menos um desses COLs. De preferência, a invenção refere-se auma proteína formada essencialmente pelas COL4, COL7, COL10 ou COL13.

Exemplo 14: Caráter infeccioso do genoma PCV clonado, a partir das novascepas.

O plasmídeo pGEM-7/8 contendo o genoma completo (formareplicativa) do isolado lmp.999 foi transfectado em células PK/15 segundo atécnica descrita por Meehan B. et al. (Characterization of viral DNAs formcells infected with chicken anemia agent sequence analysis of the clonedreplicative from and transfection capabilities of cloned genome fragments.Arch. Virol. 1992. 124. 301-319). A análise por imunofluorescência (verexemplo 4) feita sobre a primeira passagem, após transfecção sobre célulasPK/15 não contaminadas mostrou que o plasmídeo do clone pGEM7/8 eracapaz de induzir a produção de vírus PCV infeccioso. A disponibilidade deum clone, contendo um material genético PCV infeccioso permite qualquermanipulação útil sobre o genoma viral, a fim de produzir vírus PCV modifi-cados (seja atenuados no porco, seja defectivos) utilizáveis para a produçãode vacinas atenuadas ou recombinadas, ou para a produção de antígenospara feixes de diagnóstico.

Exemplo 15: Produção dos antígenos PCV por cultura in vitro.

A cultura das células PK/15 não contaminadas e a multiplicaçãoviral foram realizadas segundo as mesmas modalidades que no exemplo 1. Ascélulas infectadas foram coletadas após tripsinação, após 4 dias de incuba-ção a 37°C e numeradas. A passagem seguinte foi inoculada com 400 000células infectadas por ml.

Exemplo 16: Inativação dos antígenos virais

Em fim de cultura viral, as células infectadas foram coletadas eIisadas por ultra-sons (Branson Sonifer) ou com o auxílio de um moedor co-Ioidal de tipo rotor-estator (Ultra Turrax, IKA). A suspensão foi em seguidacentrifugada a 3700 g, durante 30 minutos. A suspensão viral foi inativadapor 0,1 % de etileno imina durante 18 horas a + 37°C ou por 0,5 % de beta-propiolactona, durante 24 horas a + 28°C. Se o título do vírus antes da inati-vação for insuficiente, a suspensão viral será concentrada por uItrafiItração,utilizando-se uma membrana com um limite de corte de 300 kDa (MiliporoPTMK300). A suspensão viral inativada foi conservada a +5°C.

Exemplo 17: Preparo da vacina sob a forma de emulsão à base de óleo mineral.

A vacina foi preparada de acordo com a seguinte fórmula:

- suspensão de circovírus suíno inativado: 250 ml- Montanide ® ISA 70 (SEPPIC): 750 ml

A fase aquosa e a fase oleosa foram esterilizadas separada-mente por filtração. A emulsão foi preparada por mistura e homogeneizaçãodos ingredientes com o auxílio de um emulsionante com turbina Silverson.

Uma dose de vacina contém aproximadamente 107,5 DICT50. Ovolume de uma dose de vacina foi de 0,5 ml para administração por via in-tradérmica, e de 2 ml para administração por via intramuscular.

Exemplo 18: Preparo da vacina sob a forma de emulsão à base de óleometabolizável.

A vacina foi preparada de acordo com a seguinte fórmula:

- suspensão de circovírus suíno inativado: 200 ml

- Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 ml

- Radia 7204 (Oleofina): 740 ml

A fase aquosa e a fase oleosa foram esterilizadas separada-mente por filtragem. A emulsão foi preparada por mistura e homogeneizaçãodos ingredientes como auxílio de um emulsionante com turbina Silverson.

Uma dose de vacina contém aproximadamente 107,5 DICT50. Ovolume de uma dose de vacina foi de 2 ml para administração por via intra-muscular.

Exemplo 19: Resultados de imunofluorescência indireta face às cepas devírus PCV US e francesas e do contaminador PK/15 com um soro hyperim-mun (PCV-T), um painel de anticorpos monoclonais F99, preparados a partirde PK/15 e um soro hyperimmun preparado a partir da cepa canadense (PCV-C).

VIRUS <table>table see original document page 27</column></row><table>(Continuação)

<table>table see original document page 28</column></row><table>

* inverso da última diluição do soro ou do anticorpo monoclonal que dá umareação positiva em imunofluorescência indireta.

Claims (13)

1. Vacina induzindo uma resposta imune ao circovírus suinodo tipo II (PCV tipo II), caracterizada pelo fato de quecompreende um circovírus suíno do tipo II isoladoresponsável pela síndrome de deperecimento generalizado depós-desmame (PMWS), na forma inativada, e um veículo oudiluente aceitável no plano veterinário, um adjuvanteaceitável no plano veterinário, assim como um estabilizadorde Iiofilização.

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que PCV tipo II é isolado a partir de umaamostra fisiológica ou amostra de tecido a partir de umsuíno sofrendo de PMWS.

3. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o PCV tipo II é obtido a partir de uma dascepas depositadas no ECACC sob as referências:- V97 100219- V97 100218- V97 100217- V98 011608- V98 011609.

4. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende de IO6 a-IO8 de PCV tipo II.

5. vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que compreende hidróxido de alumínio,saponina, Avridina®, DDA oupolifosfazeno.

6. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é formulada na formade uma emulsão.

7. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato de que é formulada na forma de uma emulsão óleo-em-água.

8. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato de que é formulada na forma de uma emulsão água-em-óleo.

9. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que PCV tipo II éinativado por um agente químico, notavelmente um agenteselecionado dentre:formaldeído, paraformaldeído,β-propiolactona, etileno imina e um derivado de etilenoimina.

10. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o PCV tipo II épropagado em uma linhagem celular, preferivelmente umalinhagem celular de porco.

11. Vacina, de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que as células são célulasΡΚ/15.

12. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende pelomenos um outro vetor selecionado dentre sindromereprodutória e respiratória suina (PRRS), Mycoplasmahyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli,rinite atrópica, mal de Aujeszky, peste suina tradicional egripe suina.

13. Vacina, de acordo coma reivindicação 12, caracterizadapelo fato de que compreende um veiculo de PRRS e/ou umveiculo de Mycoplasma Hyopeneumoniae.