DE69830858T2

DE69830858T2 - Schweinecircoviren

Info

Publication number: DE69830858T2
Application number: DE69830858T
Authority: DE
Inventors: Gordon Allan; Brian Meehan; Edward Saskatoon Clark; John Saskatoon Ellis; Deborah Saskatoon Haines; Lori Saskatoon Hassard; John Harding; Catherine Elisabeth Charreyre; Gilles Emile Chappuis; Francis Mc Neilly
Original assignee: University of Saskatchewan; Merial SAS; Queens University of Belfast
Current assignee: University of Saskatchewan; Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS; Queens University of Belfast
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-01
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2018-10-02
Also published as: JP5869658B2; DE69839227T2; JP2008086317A; CN101724606B; EP1386617B1; BR9812845A; HUP0003756A2; HU0800330D0; EP1386617A1; PT1281760E; EP1741785A1; ES2203984T3; HU226247B1; DE69816460T2; DK1741785T3; ES2246001T3; CY1110359T1; NL300326I2; BR9812845B1; DK1019510T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Stämme und Präparate von porcinem Circovirus (PCV für porcines Circovirus), das für das PMWS-Syndrom (Porcine Multisystemic Weaning Syndrome oder Post-Weaning Multisystemic Weaning Syndrome, auch allgemeines Verkümmerungssyndrom nach Entwöhnung genannt) verantwortlich ist, sowie Verfahren zur Herstellungen dieser Circoviren.
Das PCV wurde ursprünglich als nicht cytopathogene Verunreinigung in PK/15-Zelllinien aus Schweinenieren nachgewiesen. Dieses Virus wurde zusammen mit dem Hühner-Anämievirus (CAV für Chicken Anemia Virus) und dem PBFDV-Virus (Pscittacine Beak and Feather Disease Virus) der Klasse der Circoviridae zugeordnet. Es handelt sich um kleine Viren (15 bis 24 nm) ohne Hülle, deren allgemeines Merkmal darin besteht, ein Genom in Form einer einzelsträngigen ringförmigen DNA von 1,76 bis 2,31 kb zu enthalten. Zuerst wurde davon ausgegangen, dass dieses Genom ein Polypeptid von ca. 30 kDa kodiert (Todd et al., Arch Virol 1991, 117: 129–135). Allerdings haben neuere Arbeiten eine komplexere Transkription gezeigt (Meehan B. M. et al., 1997, 78: 221–227). Ferner sind weder die bezeichnenden Nucleotidsequenz-Homologien noch die gemeinsamen antigenen Determinanten zwischen den drei bekannten Circovirus-Typen bekannt.
Das PCV aus den PK/15-Zellen wird als nicht pathogen angesehen. Nach B. M. Meehan et al., Gen Virol 1997 (78) 221–227, ist davon die Sequenz bekannt. Erst unlängst haben Autoren in Betracht gezogen, dass PCV-Stämme pathogen sein könnten und mit dem PMWS-Syndrom in Verbindung stehen könnten (Gupi P. S. Nayar et al., Can Vet J., Bd. 38, 1997: 385–387 und Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac 1997: 499–501). Nayar et al. haben die PCV-DNA bei Schweinen mit dem PMWS-Syndrom durch die PCR-Techniken nachgewiesen. Bis heute wurde allerdings noch kein PCV-Wildtyp-Stamm isoliert und gereinigt.
Das vor einiger Zeit in Kanada, in den USA und in Frankreich nachgewiesene PMWS-Syndrom ist klinisch gekennzeichnet durch einen fortschreitenden progressiven Gewichtsverlust und durch Manifestationen, wie Tachypnoe, Dyspnoe und Ikterus. Pathologisch äußert es sich in lymphozytären oder granulomatösen Infiltrationen, Lymphadenopathien und seltener in lymphozytärer oder granulomatöser Hepatitis und Nephritis (Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 499–501; La Semaine Vétérinaire Nr. 26, Supplement zu La Semaine Veterinaire 1996 (834); La Semaine Veterinaire 1997 (857): 54; Gupi P. S. Nayar et al., Can Vet J., Bd. 38, 1997: 385–387).
Der Anmelderin ist die Isolierung von fünf neuen PCV-Stämmen aus pulmonalen oder ganglionären Entnahmen gelungen, die aus Zuchten in Kanada, den Vereinigten Staaten (Kalifornien) und in Frankreich (Bretagne) stammten, die im Folgenden als erfindungsgemäße Circoviren bezeichnet werden. Diese Viren wurden in Läsionen von Schweinen mit dem PMWS-Syndrom, jedoch nicht bei gesunden Schweinen nachgewiesen.
Die Anmelderin hat ferner das Genom von vier dieser Stämme sequenziert, nämlich von den Stämmen aus Kanada und den Vereinigten Staaten sowie von zwei französischen Stämmen. Die Stämme zeigen auf Nucleotidniveau untereinander eine sehr hohe Homologie von über 96% und mit dem Stamm PK/15 eine viel geringere Homologie von etwa 76%. Die neuen Stämme können also als Repräsentanten eines neuen porcinen Circovirustyps betrachtet werden, der hier als Typ II bezeichnet wird, wobei der Typ I von PK/15 repräsentiert wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach das porcine Gruppe-II-Circovirus, wie vorstehend definiert, isoliert oder in Form von gereinigtem Präparat.
Die Erfindung betrifft jedes porcine Circovirus, das zur Isolierung aus einer physiologischen Probe oder einer Gewebeentnahme, insbesondere aus Läsionen eines kranken Schweins mit PMWS-Syndrom, insbesondere unter Befolgung des in den Beispielen beschriebenen Verfahrens geeignet ist, insbesondere das Circovirus Typ II.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere gereinigte Präparate von fünf Stämmen, die bei der ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbioloy & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Royaume-Uni) am Donnerstag, den 2. Oktober 1997 hinterlegt wurden:

– Hinterlegungsnummer V97100219 (hier Imp. 1008PCV genannt)
– Hinterlegungsnummer V97100218 (hier Imp. 1010PCV genannt)
– Hinterlegungsnummer V97100217 (hier Imp. 999PCV genannt). und am Freitag, den 16. Januar 1998 hinterlegt wurden:
– Hinterlegungsnummer V98011608 (hier Imp. 1011-48285 genannt)
– Hinterlegungsnummer V98011609 (hier Imp. 1011-48121 genannt).

Die Erfindung betrifft die porcinen Circoviren, die aus einem kranken Schwein isoliert wurden, und/oder die Circoviren mit einer signifikanten serologischen Verwandtschaft mit den erfindungsgemäßen Stämmen und/oder die Circoviren, die mit den erfindungsgemäßen Stämmen unter stringenten Bedingungen kreuzhybridisieren, derart, dass keine Hybridisierung mit dem Stamm PCV PK/15 erfolgt.
Die aus einer physiologischen Probe oder einer Gewebeentnahme, insbesondere einer Läsion, von einem Schwein mit dem PMWS-Syndrom isolierten Virus-Stämme können im Hinblick auf ihre Vervielfältigung oder speziell zur Antigen-Produktion, gesamt (z.B. Virus) und/oder Untereinheiten (z.B. Polypeptide), zweckmäßigerweise auf Zelllinien, wie insbesondere Zelllinien aus Schweinenieren, insbesondere PK/15-Zellen, die von Verunreinigung unversehrt sind, propagiert werden (insbesondere für PCV, sowie für das Pestivirus, porcines Adeno- und Parvovirus).
Bemerkenswert und unerwartet haben sich diese Isolate in Kultur auf PK/15-Zellen als sehr produktiv erwiesen, was unleugbare Vorteile für die Virus- oder Antigen-Produktion, insbesondere für die Produktion von inaktiviertem Impfstoff, hat.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Circovirus-Präparate, die nach einem Durchgang durch Zellen isoliert werden, insbesondere Zelllinien, z.B. PK/15-Zellen, die in vitro kultiviert werden, wobei sie mit mindestens einem der erfindungsgemäßen Circoviren oder mit jedem porcinen Circovirus, das zur Isolierung aus einer physiologischen Probe oder einer Gewebeentnahme, insbesondere Läsionen von einem Schwein mit dem PMWS-Syndrom geeignet ist, infiziert werden. Gegenstand sind auch die Kultur-Überstände oder -Extrakte, die gegebenenfalls durch Standardtechniken gereinigt werden, und allgemein jedes Antigen-Präparat, das aus in vitro Kulturen erhalten wird.
Die erfindungsgemäßen Circoviren mit den Fraktionen, die vorhanden sein können, werden nach dem Fachmann bekannten Techniken inaktiviert. Vorzugsweise wird die Inaktivierung chemisch durchgeführt, z.B. durch Exposition des Antigens gegenüber einem chemischen Mittel, wie Formaldehyd (Formol), Paraformaldehyd, β-Propiolacton oder Ethylenimin oder seine Derivate. Das bevorzugte Inaktivierungsverfahren ist hier die Exposition gegenüber einem chemischen Mittel und insbesondere gegenüber Ethylenimin oder β-Propiolacton.
Die Anmelderin hat ferner das Genom von vier der Isolate erhalten, die als SEQ-ID. Nr. 1 bis 4 und gegebenenfalls 6 identifiziert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt demnach ein DNA-Fragment bereit, das die gesamte oder einen Teil von einer dieser Sequenzen enthält. Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung automatisch die äquivalenten Sequenzen abdeckt, d.h. die Sequenzen, die weder die Funktionalität noch die Spezifität des Stamms der beschriebenen Sequenz noch die durch diese Sequenz kodierten Polypeptide ändern. Selbstverständlich sind auch die Sequenzen eingeschlossen, die sich durch Degeneration des Codes unterscheiden.
Die Erfindung betrifft auch die in dem Sinne äquivalenten Sequenzen, dass sie in der Lage sind, mit der o.g. Sequenz unter erhöhten Stringenzbedingungen zu hybridisieren, und/oder die eine hohe Homologie mit den erfindungsgemäßen Stämmen aufweisen und der vorstehend definierten Gruppe II angehören.
Die Erfindung wird nun mit Hilfe von nicht einschränkenden Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ausführlich beschrieben. Es zeigen:
1: Die DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 1011-48121.
2: Die DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 1011-48285.
3: Die DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 999.
4: Die DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 1010.
5: Den Vergleich der vier Sequenzen der 1 bis 4 mit der Sequenz des PCV-Stamms PK/15.
6: Die DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 999, wie in der ersten Hinterlegung in Frankreich vom 3. Oktober 1997 definiert.
7: Vergleiche der Sequenz der 6 mit der Sequenz des Stamms PK/15.
Listung der Sequenzen SEQ-ID

SEQ-ID. Nr. 1 DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 1011-48121.
SEQ-ID. Nr. 2 DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 1011-48285.
SEQ-ID. Nr. 3 DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 999.
SEQ-ID. Nr. 4 DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 1010.
SEQ-ID. Nr. 5 DNA-Sequenz des Genoms des Stamms PK/15.
SEQ-ID. Nr. 6 DNA-Sequenz des Genoms des Stamms Imp. 999, wie in der ersten Hinterlegung in Frankreich vom 3. Oktober 1997 definiert.

BEISPIELE
Beispiel 1: Kultur und Isolierung der porcinen Circovirusstämme
Gewebeproben wurden in Frankreich, Kanada und in den USA aus Lungen und Lymphknoten von Ferkeln gewonnen. Diese Ferkel zeigten typische klinische Anzeichen des allgemeinen Verkümmerungssyndroms nach Entwöhnung. Zur leichteren Isolierung der Viren wurden die Gewebeproben bei –70°C unmittelbar nach der Autopsie tiefgefroren.
Zur Virus-Isolierung wurden Suspensionen, die etwa 15% der Gewebeproben enthalten, in einem Minimalmedium, das Earl-Salze (EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham, UK), Penicillin (100 UI/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) (MEM-SA-Medium) enthielt, durch Zerreiben der Gewebe mit sterilisiertem Sand mittels einem sterilisierten Mörser und Pistill, hergestellt. Dieses zerriebene Präparat wurde dann in MEM-SA aufgenommen, anschließend bei 3000 × g 30 min bei +4°C zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen.
Vor dem Aussäen der Zellkulturen wurde ein Volumen von 100 μl Chloroform zu jeweils 2 ml Überstand zugesetzt und 10 min bei Umgebungstemperatur kontinuierlich vermischt. Dieses Gemisch wurde dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen übergeführt, bei 3000 × g 10 min zentrifugiert, und anschließend wurde der Überstand gewonnen. Sodann wurde dieser Überstand als Inokulum für die Virus-Isolierexperimente eingesetzt.
Alle Virus-Isolierstudien wurden mit Kulturen von PK/15-Zellen durchgeführt, die bekanntermaßen nicht mit dem porcinen Circovirus (PCV), dem Pestivirus, dem porcinen Adenovirus und dem porcinen Parvovirus verunreinigt waren (Allan G. et al., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49–64).
Die Isolierung von porinen Circoviren wurde nach der folgenden Technik durchgeführt:
Monoschichten von PK/15-Zellen wurden durch Trypsinisierung (mit einem Gemisch von Trypsin-Versen), ausgehend von konfluenten Kulturen, dissoziiert und wieder in MEM-SA-Medium, das 15% fetales Kälberserum, das nicht mit dem Pestivirus verunreinigt war (= MEM-G-Medium), enthielt, in einer Endkonzentration von etwa 400000 Zellen pro ml aufgenommen. Aliquote Fraktionen von 10 ml dieser Zellsuspension wurden nun mit aliquoten Fraktionen von 2 ml der vorstehend beschriebenen Inokula gemischt, und die Endgemische wurden in Volumina von 6 ml in 2 Falcon-Kulturschalen von 25 cm² aliquotiert. Diese Kulturen wurden dann 18 h bei +37°C unter einer Atmosphäre, die 10% CO₂ enthielt, inkubiert.
Nach der Inkubation wurde das Kulturmedium der semikonfluenten Monoschichten mit 300 mM D-Glucosamin (Cat-Nr. G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, UK) (Tischr I. et. al., Arch. Virol. 1987 96 39–57) behandelt, anschließend wurde die Inkubation für zusätzliche 48–72 h bei +37°C fortgesetzt. Im Anschluss an diese letzte Inkubation wurde einer der beiden Falcon-Kulturschalen eines jeden Inokulums drei aufeinander folgenden Frost/Tau-Wechseln unterzogen. Die PK/15-Zellen aus den restlichen Falcon-Kulturschalen wurden mit einer Trypsin-Versen-Lösung behandelt, in 20 ml MEM-G-Medium resuspendiert und anschließend wieder in die Falcon-Kulturschalen von 75 cm² bei einer Konzentration von 400000 Zellen/ml ausgesät. Die frisch angesäten Kulturschalen wurden dann durch Zugabe von 5 ml entsprechendem Lysat, das nach den Gefrier/Tau-Wechseln erhalten wurde, "aninfiziert".
Beispiel 2: Herstellung von Zellkulturproben zum Nachweis von porcinen Circoviren durch Immunfluoreszenz oder durch Hybridisierung in situ
Ein Volumen von 5 ml der "aninfizierten" Suspension wurde entnommen und in einer Petrischale von 55 mm Durchmesser ausgesät, die ein Plättchen aus sterilem und entfettetem Glas enthielt. Die Kulturen in Schalen und auf Glasplättchen wurden bei +37°C inkubiert und mit Glucosamin, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Die Kulturen auf Glasplättchen wurden von 24 bis 48 h nach der Glucosamin-Behandlung geerntet und entweder 10 min mit Aceton bei Umgebungstemperatur oder 4 h mit 10% Formaldehyd-Puffer fixiert. Nach dieser Fixierung wurden sämtliche Glasplättchen vor ihrer Verwendung für die Hybridisierungsstudien in situ und die immunocytochemischen Markierungsstudien bei –70°C auf Kieselgel gelagert.
Beispiel 3: Nachweistechniken für die PCV-Sequenzen durch Hybridisierung in situ
Die in situ Hybridisierung wurde an von kranken Schweinen entnommenen und in Formaldehyd fixierten Geweben sowie an Präparaten von zur Virusisolierung geimpften (siehe Beispiel 2) und auf Glasplättchen fixierten Zellen durchgeführt.
Komplette genomische Sonden, die dem porcinen Circovirus PK/15 (PCV) und dem infektiösen Hühner-Anämievirus (chicken anemia virus = CAV) entsprachen, wurden verwendet. Das Plasmid pPCV1, das die replikative Form des PCV-Genoms, kloniert in die Form eines einmaligen Inserts von 1,7 Kilobasenpaaren (kb), enthielt (Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses. J. Gen. Virol. 1997, 78, 221–227), wurde als für PCV-spezifische virale DNA-Quelle verwendet. Ein analoges Plasmid, pCAA1, das die replikative 2,3 kb-Form des aviären Circovirus CAV enthielt, wurde als negative Kontrolle verwendet. Die jeweiligen Glycerin-Stammlösungen dieser beiden Plasmide wurden zur Herstellung und Reinigung der Plasmide nach der alkalischen Lysetechnik verwendet (Sambrook J. et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York, 1989), um anschließend als Matrices zur Herstellung der Sonden zu dienen. Die repräsentative Circovirussonden der kompletten Genome des PCV und CAV wurden ausgehend von den vorstehend beschriebenen gereinigten Plasmiden (1 μg für jede Sonde) und von zufälligen Hexanucleotid-Teilstücken unter Verwendung eines handelsüblichen nicht radioaktiven Markierungskits ("DIG DNA labelling kit", Boehringer Mannheim, Lewes, UK) nach den Empfehlungen des Herstellers hergestellt.
Die mit Digoxigenin markierten Sonden wurden vor ihrer Verwendung zur Hybridisierung in situ in einem Volumen von 50–100 μl sterilem Wasser aufgenommen.
Die Gewebeproben von kranken Schweinen, die in Paraffin eingeschlossen und mit Formaldehyd fixiert waren, sowie die Präparate von Kulturen von mit Formaldehyd fixierten infizierten Zellen wurden zum Nachweis der PCV-Nucleinsäuren nach der folgenden Technik hergestellt:
5 μm dicke Schnitte wurden von Blöcken von in Paraffin eingeschlossenen Geweben abgeschnitten, von Paraffin befreit, anschließend in aufeinander folgenden Lösungen von Alkohol mit zunehmender Konzentration rehydratisiert. Die Gewebeschnitte und die Kulturen von in Formaldehyd fixierten Zellen wurden jeweils 15 min und 5 min bei +37°C in einer 0,5% Proteinase K-Lösung in 0,05 M Tris-HCl-Puffer, 5 mM EDTA, (pH 7,6), inkubiert. Die Plättchen wurden dann 30 Sek. in eine 1% Glycinlösung in autoklaviertem destilliertem Wasser verbracht, zweimal mit 0,01 M (pH 7,2) PBS-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) und schließlich 5 min in sterilem destilliertem Wasser gewaschen. Sie wurden schließlich an der offenen Luft getrocknet und mit den Sonden in Kontakt gebracht.
Jedes Gewebe-/Sondenpräparat wurde mit einem sauberen und entfetteten Deckglas bedeckt, anschließend 10 min in einen Ofen bei +90°C verbracht und sodann 1 min mit einem Eisblock in Kontakt gebracht und schließlich 18 h bei +37°C inkubiert. Sodann wurden die Präparate kurz in Natriumcitratpuffer 2× (SSC) (pH 7,0) eingetaucht, um die schützenden Deckgläser zu entfernen, anschließend 2 × 5 min in 2×-SSC-Puffer gewaschen und schließlich 2 × 5 min in PBS-Puffer gewaschen.
Nach diesen Waschvorgängen wurden die Präparate 10 min in eine Lösung von 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl (pH 7,5) (Maleinsäurepuffer) eingetaucht, anschließend 20 min in einer Lösung von 1% von Blockierreagens (Kat-Nr.1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK) in Maleinsäurepuffer bei +37°C inkubiert.
Sodann wurden die Präparate in einer 1/250-Lösung eines in Blockierpuffer verdünnten monoclonalen Anti-Digoxigenin-Antikörpers (Boehringer Mannheim) 1 h bei +37°C inkubiert, in PBS gewaschen und schließlich mit einem biotinylierten Antiimmunglobulin-Mausantikörper 30 min bei +37°C inkubiert. Die Präparate wurden in PBS gewaschen, und die endogene Peroxygenaseaktivität wurde durch eine Behandlung mit einer 0,5% Wasserstoffperoxidlösung in PBS 20 min bei Umgebungstemperatur blockiert. Die Präparate wurden erneut mit PBS-Puffer gewaschen und mit einem nach Rezept hergestellten 3-Amino-9-diethylcarbazolsubstrat (AEC) (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK) behandelt.
Nach einem letzten Waschen mit Leitungswasser wurden die Präparate mit Hämatoxylin angefärbt, das unter Leitungswasser "blau" wurde und auf Mikroskop-Deckgläschen mit einer Fixierflüssigkeit befestigt (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK). Die experimentellen Kontrollen umfassten die Verwendung einer negativen Blind-Sonde (CAV) und einer positiven Sonde (PCV) für die Proben die von kranken Schweinen und von nicht erkrankten Schweinen stammten.
Beispiel 4: PCV Nachweistechnik durch Immunfluoreszenz
Das anfängliche Screening sämtlicher Zellkultur-Präparate, die in Aceton fixiert waren, wurde durch eine indirekte Immunfluoreszenztechnik (IFI) unter Verwendung einer 1/100-Verdünnung eines Pools von Seren von adulten Schweinen durchgeführt. Dieser Pool von Seren umfasst Seren von 25 adulten Zuchtsauen aus Nordirland und enthält bekanntlich Antikörper gegen eine große Vielzahl von Schweineviren, einschließlich PCV: porcines Parvovirus, porcines Adenovirus und PRRS-Virus. Die IFI-Technik wurde durch einen 1 h-Kontakt des Serums (verdünnt in PBS) mit den Zellkulturen bei +37°C und anschließend zwei Waschvorgänge in PBS durchgeführt. Die Zellkulturen wurden dann mit einer 1/80-Verdünnung in PBS eines porcinen Kanninchen-Antümmunglobulin-Antikörpers, konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat, 1 h angefärbt, anschließend in PBS gewaschen und vor der mikroskopischen Beobachtung unter UV-Licht in Glycerinpuffer fixiert.
Beispiel 5: Ergebnisse der in situ Hybridisierung mit Geweben von kranken Schweinen
Die in situ Hybridisierung unter Verwendung einer genomischen PCV-Sonde, die mit zuvor von französischen, kanadischen und kalifornischen Ferkeln, die Läsionen von allgemeiner Entwöhnung zeigten, entnommenen und in Formaldehyd fixierten Geweben durchgeführt wurde, ergab in mehreren studierten Läsionen die Gegenwart von mit den Läsionen zusammenhängenden PCV-Nucleinsäuren. Wurden die PCV-Genomsonde mit zuvor von nicht erkrankten Schweinen entnommenen Geweben verwendet oder wurde die CAV-Sonde mit Geweben von kranken Schweinen verwendet, wurde kein Signal beobachtet. Die Gegenwart von PCV-Nucleinsäure wurde in Cytoplasma und im Kern von zahlreichen mononuklearen Zellen nachgewiesen, die die Läsionen in die Lungen der kalifornischen Ferkel infiltrieren. Die Gegenwart von PCV-Nucleinsäure wurde auch in den Pneumozyten, den bronchialen Epithelzellen und in den Bronchiolen und in den Endothelzellen der kleinen Arteriolen, Venolen und lymphatischen Gefäßen nachgewiesen.
Bei den kranken französischen Schweinen wurde die Gegenwart von PCV-Nucleinsäure im Cytoplasma von zahlreichen follikulären Lymphozyten und in den intrasinusoidalen mononukleären Zellen und in den Lymphknoten nachgewiesen. Die PCV-Nucleinsäure wurde auch in den gelegentlichen Synzytia nachgewiesen. In Abhängigkeit von diesen nachgewiesenen Ergebnissen wurden Proben von kalifornischen Schweinelungen, mesenterischen Lymphknoten von französischen Schweinen und von Organen kanadischer Schweine zur Isolierung von neuen porcinen Circovirusstämmen gewählt.
Beispiel 6: Ergebnisse der Zellkultur von neuen porcinen Circovirusstämmen und Nachweis durch Immunfluoreszenz
In den mit den zuvor entnommenen Proben von französischen Ferkeln (Stamm Imp. 1008), kalifornischen Ferkeln (Stamm Imp. 999) und kanadischen Ferkeln (Stamm Imp. 1010), die klinische Anzeichen des allgemeinen Entwöhnungssyndroms zeigten, geimpften Zellkulturen wurde keine cytopathische Wirkung (ECP) festgestellt. Dennoch hat die Immunmarkierung der Präparate, die aus geimpften Zellkulturen stammen, nach Fixierung in Aceton und mit einem Pool von polyclonalen Schweine-Seren eine nukleäre Fluoreszenz bei zahlreichen Zellen in den geimpften Kulturen aus den Lungen von kalifornischen Ferkeln (Stamm Imp. 999), aus den mediastinalen Lymphknoten der französischen Ferkel (Stamm Imp. 1008) und aus den Organen der kanadischen Ferkel (Stamm Imp. 1010) ergeben.
Beispiel 7: Extraktion von genomischer DNA von porcinen Circoviren
Die replikativen Formen der neuen porcinen Circovirusstämmen (PCV) wurden ausgehend von infizierten PK/15-Zellkulturen (siehe Beispiel 1) (10 Schalen von 75 cm²) hergestellt, nach 72–76 h Inkubation geerntet und mit Glucosamin behandelt, wie für die Klonierung der replikativen Form von CAV beschrieben (Todd. D. et al. Dot blot hybridization assay for chicken anemia agent using a cloned DNA-Probe. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 933–939). Die doppelsträngige DNA dieser replikativen Formen wurde nach einer Modifikation der Technik von Hirt (Hirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from intected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365–369), wie von Molitor (Molitor T. W. et al., Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replikative form DNA of two virus isolates. Virology, 1984, 137, 241–254) beschrieben, extrahiert.
Beispiel 8: Restriktionskartierung der replikativen Form des Genoms des porcinen Circovirusstamms Imp. 999
DNA (1–5 μg), extrahiert nach der Technik von Hirt, wurde durch Nuclease S1 (Amersham) nach den Empfehlungen des Herstellers behandelt, anschließend wurde diese DNA durch verschiedene Restriktionsenzyme (Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, UK) abgebaut, und die Abbauprodukte wurden durch Elektrophorese auf 1,5%igem Agarosegel in Gegenwart von Ethidiumbromid, wie von Todd et al. beschrieben (Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819–823), aufgetrennt.
Die von den Kulturen des Stamms Imp. 999 extrahierte DNA besitzt eine einmalige EcoRI-Schnittstelle, 2 SacI-Stellen und keine PstI-Stelle. Daher ist dieses Restriktionsprofil von dem Restriktionsprofil verschieden, das der PCV-Stamm PK/15 zeigt (Meehan B. et al., Sequence of procine circovirus DNA: affinities with plant circovirus, 1997, 78, 221–227), der im Gegensatz dazu eine PstI-Stelle und keine EcoRI-Stelle besitzt.
Beispiel 9: Klonierung des Genoms des porcinen Circovirusstamms Imp. 999
Das durch Abbau der replikativen doppelsträngigen Form des PCV-Stamms Imp. 999 mit dem Restriktionsenzym EcoRI erzeugte Restriktionsfragment von etwa 1,8 kb wurde nach Elektrophorese auf 1,5%igem Agarosegel (siehe Beispiel 3) unter Verwendung eines handelsüblichen Qiagen-Kits (QIAEXII Gel Extraction Kit, Kat-Nr. 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK) isoliert. Dieses EcoRI-EcoRI-Restriktionsfragment wurde anschließend mit dem Vector pGEM-7 (Promega, Medical Supply Company, Dublin, Ireland), der zuvor durch die gleichen Restriktionsenzyme abgebaut und dephosphoryliert wurde, unter Befolgung der Klonierungsstandardtechniken (Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York, 1989) ligiert. Die erhaltenen Plasmide wurden nach den Standardtechniken in einen Escherichia coli-Wirtsstamm JM109 (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Das EcoRI-EcoRI-Restriktionsfragment des PCV-Stamms Imp. 999 wurde ebenfalls in die EcoRI-Stelle des Vektors pBlueScript SK + (Stratagene, La Jolla, USA) kloniert. Unter den für jeden Wirtsstamm erhaltenen Klonen wurden mindestens zwei Klone ausgewählt, die die Fragmente der erwarteten Größe enthielten. Die erhaltenen Klone wurden nun kultiviert, und die Plasmide, die das vollständige Genom des Stamms Imp. 999 enthielten, wurden nach den Standardtechniken zur Herstellung und Reinigung von Plasmiden in einem kleinen Volumen (2 ml) oder in einem großen Volumen (250 ml) gereinigt.
Beispiel 10: Sequenzierung der Genom-DNA (replikative doppelsträngige Form) des PCV-Stamms Imp. 999
Die Nucleotidsequenz von 2 EcoRI-Imp. 999-Klonen (die Klone pGEM-7/2 und pGEM-7/8) wurden nach der Technik der Dideoxynucleotide von Sanger unter Verwendung des Sequenzierungskits "Ampli-Taq DNA-Polymerase FS" (Kat-Nr. 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK) und eines automatischen Sequenziergeräts Applied Biosystems ABI373A nach den Empfehlungen des Herstellers bestimmt. Die ersten Sequenzierungsreaktionen wurden mit den Universalprimern M13 "vorwärts" und "rückwärts" durchgeführt. Die folgenden Sequenzierungsreaktionen wurden nach der Technik "Vormarsch auf der DNA" generiert. Die für diese weiteren Sequenzierungen notwendigen Oligonucleotide wurde von Life-Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, UK) synthetisiert.
Die erzeugten Sequenzen wurden zusammengefügt und mittels Logiciel MacDNASIS-Version 3.2. (Kat-Nr. 22020101, Appligene, Durham, UK) analysiert. Die verschiedenen offenen Leseraster wurden mittels des BLAST-Algorithmus, der über den Server von "National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) verfügbar war, analysiert.
Die vollständige Sequenz (EcoRI-EcoRI-Fragment), die ursprünglich ausgehend von dem Klon pGEM-7/8 (SEQ-ID. Nr. 6) erhalten wurde, ist in 6 gezeigt. Willkürlich beginnt sie nach dem G der EcoRI-Stelle und zeigt einige Unsicherheiten hinsichtlich der Nucleotide.
Anschließend wurde die Sequenzierung optimiert, und die SEQ-ID. Nr. 3 (3) gibt die gesamte Sequenz dieses Stamms an, die man willkürlich am Anfang der EcoRI-Stelle beginnen lässt, d.h. das G als erstes Nucleotid.
Ebenso wurde zum Erhalt der Sequenz der drei anderen erfindungsgemäßen Isolate (siehe SEQ-ID. Nr. 1, 2 und 4 und 1, 3 und 4) vorgegangen.
Die Größe des Genoms dieser vier Stämme ist folgende:

Imp 1011-48121 1767 Nucleotide

Imp. 1011-48285 1767 Nucleotide

Imp. 999 1768 Nucleotide

Imp. 1010 1768 Nucleotide
Beispiel 11: Analyse der Sequenz des PCV-Stamms Imp. 999
Wenn die ausgehend von dem Stamm Imp. 999 erzeugte Sequenz für eine Ermittlung der Homologie zu den in der Datenbank GenBank enthaltenen Sequenzen verwendet wurde, besteht die einzige signifikante Homologie, die nachgewiesen wurde, in einer Homologie von etwa 76% (auf Nucleinsäureniveau) mit der Sequenz des Stamms PK/15 (Hinterlegungsnummern YO9921 und U49188) (siehe Figur Nr. 5).
Auf Aminosäureniveau ergab die Homologiesuche nach Übersetzung der Sequenzen in die 6 Leserahmen in den Datenbanken (BLAST-Algorithmus X auf dem Server NCBI) den Beweis einer Homologie von 94% mit dem offenen Leseraster, entsprechend der theoretischen Replikase des BBTV-Virus, das dem Circovirus von Pflanzen (GenBank-Identifikations-Nr. 1841515), das durch die GenBank-Sequenz U49186 kodiert wird, ähnlich ist.
Keine andere in den Datenbanken enthaltene Sequenz zeigt eine signifikante Homologie mit der ausgehend von dem PCV-Stamm Imp. 999 erzeugten Sequenz.
Die Analyse der erhaltenen Sequenzen, die ausgehend von dem Stamm Imp. 999 erhalten wurden, der ausgehend von Läsionen kultiviert wurde, die zuvor den kalifornischen Ferkeln entnommen wurden, die klinische Anzeichen des allgemeinen Entwöhnungssyndroms aufwiesen, zeigte eindeutig, dass dieses Virus-Isolat ein neuer porciner Circovirusstamm ist.
Beispiel 12: Vergleichsanalyse der Sequenzen
Der Vergleich der Nucleotidsequenzen der 4 neuen PCV-Stämme wurde mit der Sequenz des Stamms PCV PK/15 vorgenommen (5). Eine Homologiematrix, die die vier neuen Stämme und den alten Stamm PK/15 berücksichtigt, wurde erstellt. Die Ergebnisse sind folgende:

1: Imp. 1011-48121
2: Imp. 1011-48285
3: Imp. 999
4: Imp. 1010
5: PK/15

Die Homologie zwischen den beiden französischen Stämmen Imp. 1011-48121 und Imp. 1011–48285 liegt bei über 99% (0,9977).
Die Homologie zwischen den beiden nordamerikanischen Stämmen Imp. 999 und Imp. 1010 liegt ebenfalls bei über 99% (0,9949). Die Homologie zwischen französischen und nordamerikanischen Stämmen liegt etwas unter 96%.
Die Homologie von allen diesen Stämmen mit PK/15 sinkt auf einen Wert zwischen 75 und 76%.
Daraus wurde abgeleitet, dass die erfindungsgemäßen Stämme Repräsentanten eines neuen porcinen Circovirustyps sind, der von dem durch den Stamm PK/15 dargestellten Typ unterschiedlich ist. Dieser neue aus Schweinen, die das PMWS-Syndrom aufwiesen, isolierte Typ wird als porcines Circovirus Typ II bezeichnet, wobei PK/15 den Typ I darstellt. Die diesem Typ II zugehörigen Stämme zeigen eine bemerkenswerte Nucleotidsequenz-Homologie, obwohl sie in geographischen sehr weit auseinander liegenden Regionen isoliert wurden.
Beispiel 13: Analyse der durch das Genom der neuen PCV-Stämme kodierten Proteine
Die Nucleotidsequenz des Isolats Imp. 1010 wurde als repräsentativ für andere Circovirusstämme betrachtet, die mit dem allgemeinen Verkümmerungssyndrom im Zusammenhang stehen. Diese Sequenz wurde in weiteren Einzelheiten mit Hilfe des BLASTX-Algorithmus (Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990, 215, 403–410) und einer Kombination von allen den Logiciels-Programmen, Mac-Vektor 6,0 (Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK), analysiert. Es war möglich, 13 offene Leseraster (oder COLs) einer Größe von über 20 Aminosäuren auf dieser Sequenz (ringförmiges Genom) nachzuweisen. Diese 13 COLs sind die folgenden:
Die Positionen am Anfang und am Ende eines jeden COL beziehen sich auf die in Figur Nr. 4 (SEQ-ID. Nr. 4) dargestellte Sequenz des Genoms des Stamms 1010. Die Grenzen der COL 1 bis 13 sind für den Stamm 999 sowie für die Stämme 1011-48121 und 1011-48285, außer für die COL 3 und 13, identisch:

COL3 1432–1539, sense, 108 nt, 35 Aminosäuren

COL13 314–1377, antisense, 705 nt, 234 Aminosäuren
Unter diesen 13 COL weisen 4 eine signifikante Homologie mit den COL-Analogen auf, die auf dem Genom des PCV-Virusklons PK/15 liegen. Jedes der offenen Leseraster, die auf dem Genom von allen Circovirus-Isolaten vorhanden sind, die mit dem allgemeinen Verkümmerungssyndrom zusammenhängen, wurde analysiert. Diese 4 COL sind die folgenden:
Die Positionen am Anfang und am Ende eines jeden COL beziehen sich auf die in 4 dargestellten Sequenzen (SEQ-ID. Nr. 4). Die Größe von COL (in Nucleotiden = nt) schließt das Stoppcodon ein.
Der Vergleich zwischen der genomischen Organisation der PCV-Isolate Imp. 1010 und PCV PK-15 gestattete die Identifizierung von 4 COL, die in dem Genom der beiden Viren konserviert waren. Die nachstehende Tabelle gibt die festgestellten Homologiegrade an.
Die größte Sequenz-Übereinstimmung wurde zwischen COL4 Imp. 1010 und COL1 PK-15 (86 % Homologie) festgestellt. Dies wurde in dem Maße erwartet, in dem dieses Protein wahrscheinlich an der Replikation der Virus-DNA beteiligt und für die virale Replikation essentiell ist (Meehan et al. J. Gen. Virol. 1997, 78, 221–227; Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998, 79, 381–384).
Die Sequenzidentität zwischen COL13 IMP. 1010 und COL2 PK-15 ist weniger stark (66,4% Homologie), allerdings zeigt jedes dieser beiden COL doch eine basische N-terminale Region, die stark konserviert ist und mit der N-terminalen Region des größeren Strukturproteins des aviären Circovirus CAV identisch ist (Meehan et al. Arch. Virol. 1992, 124, 301–319). Größere Unterschiede werden zwischen COL7 Imp. 1010 und COL3 PK-15 und zwischen COL10 Imp. 1010 und COL4 PK-15 festgestellt. In jedem Fall existiert eine Deletion der C-terminalen Region von COL7 und COL10 des Imp. 1010-Isolats bei einem Vergleich mit COL3 und COL4 von PCV PK-15. Die höchste Sequenzhomologie wird auf dem Niveau der N-terminalen Regionen von COL7/COL3 (61,5% Homologie bei Gewinnung) und von COL10/COL4 (83% Homologie bei Gewinnung) festgestellt.
Es scheint, dass die genomische Organisation des porcinen Circovirus in Folge der extremen Kompaktheit seines Genoms recht komplex ist. Das größere Strukturprotein ist wahrscheinlich das Ergebnis einer Spleißung zwischen mehreren Leserastern, die auf dem gleichen Strang des Genoms des porcinen Circovirus liegen. Somit kann davon ausgegangen werden, dass jedes offene Leseraster (COL1 bis COL13), wie in der Tabelle vorstehend beschrieben, alles oder einen Teil eines Antigen-Proteins darstellen kann, das von dem porcinen Circovirus Typ II kodiert wird, und es doch potentiell ein Antigen ist, das zur spezifischen Diagnose und/oder Impfung geeignet ist. Daher betrifft die Erfindung jedes Protein, das mindestens eines dieser COL umfasst. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Protein, das im Wesentlichen von COL4, COL7, COL10 oder COL13 gebildet wird.
Beispiel 14: Infektiöser Charakter des aus den neuen Stämmen klonierten PCV Genoms
Das Plasmid pGEM-7/8, das das komplette Genom (replikative Form) des Isolats Imp. 999 enthält, wurde nach der von Meehan B. et al. beschriebenen Technik (Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome fragments. Arch Virol. 1992, 124, 301–319) in PK/15-Zellen transfiziert. Die Immunfluoreszenz-Analyse (siehe Beispiel 4), die nach dem ersten Transfektionsdurchgang mit nicht verunreinigten PK/15-Zellen durchgeführt wurde, hat gezeigt, dass das Plasmid des Klons pGEM7/8 die Produktion von infektiösem PCV-Virus auszulösen vermochte. Die Verfügbarkeit eines Klons, der ein genetisches infektiöses PCV-Material enthält, erlaubt jede Manipulation an dem viralen Genom, die geeignet ist, um modifizierte PCV-Viren (entweder abgeschwächt beim Schwein oder fehlerhaft) zu produzieren, die für die Produktion von abgeschwächten oder rekombinanten Impfstoffen oder zur Produktion von Antigenen für diagnostische Kits geeignet sind.
Beispiel 15: Produktion der PCV-Antigene durch in vitro Kultur
Die Kultur der nicht verunreinigten PK/15-Zellen und die virale Vervielfältigung werden nach den gleichen Vorgehensweisen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die infizierten Zellen werden nach Trypsinisierung nach 4 Tagen Inkubation bei 37°C geerntet und gezählt. Der folgende Durchgang wird mit 400000 infizierten Zellen pro ml geimpft.
Beispiel 16: Inaktivierung von viralen Antigenen
Nach der Viruskultur werden die infizierten Zellen geerntet und durch Ultraschall (Branson Sonifier) oder mit Hilfe eines Kolloidmischers vom Typ Rotor-Stator (UltraTurrax, IKA) lysiert. Anschließend wird die Suspension bei 3700 × g 30 min zentrifugiert. Die Virussuspension wird durch 0,1% Ethylenimin 18 h bei +37°C oder mit 0,5% (3-Propiolacton 24 h bei +28°C inaktiviert. Wenn der Titer des Virus vor der Inaktivierung unzureichend ist, wird die Virussuspension durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 300 kDa (Millipore PTMK300) konzentriert. Die inaktivierte Virussuspension wird bei +5°C aufbewahrt.
Beispiel 17: Herstellung des Impfstoffs in Emulsionsform auf der Basis von Mineralöl
Der Impfstoff wird nach der folgenden Formel hergestellt:

- Suspension von inaktiviertem porcinem Circovirus: 250 ml

- Montanide^®ISA 70 (SEPPIC): 750 ml
Die wässrige Phase und die Ölphase werden getrennt durch Filtration sterilisiert. Die Emulsion wird durch Mischen und Homogenisieren der Bestandteile mit Hilfe einer Silverson-Rotor-Stator-Emulgiermaschine hergestellt.
Eine Impfstoffdosis enthält etwa 10^7,8 DICT50. Das Volumen einer Impfstoffdosis beträgt 0,5 ml zur intradermalen Verabreichung und 2 ml zur intramuskulären Verabreichung.
Beispiel 18: Herstellung des Impfstoffs in Emulsionsform auf der Basis von metabolisierbarem Öl
Der Impfstoff wird nach der folgenden Formel hergestellt:

- Suspension von inaktiviertem porcinem Circovirus: 200 ml

- Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 ml

- Radia 7204 (Oleofina): 740 ml
Die wässrige Phase und die Ölphase werden getrennt durch Filtration sterilisiert. Die Emulsion wird durch Mischen und Homogenisieren der Bestandteile mit Hilfe einer Silverson-Rotor-Stator-Emulgiermaschine hergestellt.
Eine Impfstoffdosis enthält etwa 10^7,5 DICT50. Das Volumen einer Impfstoffdosis beträgt 2 ml zur intramuskulären Verabreichung. Beispiel 19: Die indirekten Immunfluoreszenz-Ergebnisse der US- und französischen PCV-Virusstämme und des verunreinigenden PK/15 gegenüber einem Hyperimmunserum (PCV-T), einem Panel von monoclonalen F99-Antikörpern, hergestellt aus PK/15, und einem Hyperimmunserum, hergestellt aus dem kanadischen Stamm (PCV-C)

* Umkehr der letzten Verdünnung des Serums oder des monoclonalen Antikörpers, die eine positive indirekte Immunfluoreszenzreaktion ergibt.

Claims

Isoliertes porcines Circovirus Typ II, das beim Schwein für das PMWS-Syndrom ("Post Weaning Multisystemic Wasting Syndrome") verantwortlich ist.
Circovirus nach Anspruch 1, das von einem kranken Schwein, das das PMWS-Syndrom aufweist, isoliert werden kann.
Circovirus nach Anspruch 1 oder 2, das beim ECACC unter den folgenden Nummern hinterlegt ist: – V97100219 – V97100218 – V97100217 – V98011608 – V98011609.
Isoliertes porcines Circovirus-Typ-II-Präparat, das beim Schwein für das PMWS-Syndrom ("Post Weaning Multisystemic Wasting Syndrome") verantwortlich ist und aus einer Zellkultur stammt.
Präparat nach Anspruch 4, wobei das porcine Circovirus Typ II von einem kranken Schwein, das das PMWS-Syndrom aufweist, isoliert werden kann.
Präparat nach Anspruch 4 oder 5, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus den bei der ECACC unter folgenden Nummern hinterlegten Präparaten: – V97100219 – V97100218 – V97100217 – V98011608 – V98011609.
Gereinigtes Präparat nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
Konzentriertes Präparat nach einem der Ansprüche 4 bis 7.
Inaktiviertes Präparat nach einem der Ansprüche 4 bis 8.
Herstellungsverfahren für porcines Circovirus Typ II, das beim Schwein für das PMWS-Syndrom verantwortlich ist, wobei die Zellen in Zellkultur in vitro mit einem Circovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 infiziert sind und wobei sich der Circovirus auf den Zellen vervielfältigt.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem als Zellen Zellen aus einer Schweinenierenzelllinie verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 11, in dem PK/15-Zellen verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, umfassend die Gewinnung und die Reinigung des porcinen Circovirus Typ II.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, umfassend das Konzentrieren des porcinen Circovirus Typ II.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend die Inaktivierung des porcinen Circovirus Typ II.
Kulturextrakt oder -überstand, der ein porcines Circovirus Typ II enthält, das durch die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 12 erhalten werden kann.
Antigenes Präparat, das ein porcine Circovirus Typ II enthält, das durch die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 15 erhalten werden kann.