JP2011135875A - ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 - Google Patents
ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011135875A JP2011135875A JP2011004965A JP2011004965A JP2011135875A JP 2011135875 A JP2011135875 A JP 2011135875A JP 2011004965 A JP2011004965 A JP 2011004965A JP 2011004965 A JP2011004965 A JP 2011004965A JP 2011135875 A JP2011135875 A JP 2011135875A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vaccine
- porcine
- sequence
- antigen
- circovirus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 title claims abstract description 93
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 57
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 18
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 14
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 239000012264 purified product Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 241000188845 Porcine adenovirus Species 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 claims description 2
- 201000008283 Atrophic Rhinitis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 claims description 2
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009620 Orthomyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039088 Rhinitis atrophic Diseases 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 claims 3
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 5
- 208000028489 postweaning multisystemic wasting syndrome Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000010399 Wasting Syndrome Diseases 0.000 abstract description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 15
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 101000748061 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 16.1 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 5
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 5
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 5
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 5
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 5
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 5
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 5
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 5
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 5
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 5
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 5
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 5
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101000947615 Clostridium perfringens Uncharacterized 38.4 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000964391 Enterococcus faecalis UPF0145 protein Proteins 0.000 description 5
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 5
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 5
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 5
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 5
- 101000748063 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 11.1 kDa protein in rep-hol intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 5
- 101000790840 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 49.5 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 5
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 5
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 5
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 5
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 5
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 5
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 5
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 5
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 5
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 5
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 5
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 5
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 5
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 5
- 101710110895 Uncharacterized 7.3 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000818108 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 81.3 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101000912350 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) DNA N-6-adenine-methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 101000790844 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 24.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 4
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 3
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 3
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000276427 Poecilia reticulata Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- -1 albumin or casein Chemical compound 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241001302800 Beak and feather disease virus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001533399 Circoviridae Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N avridine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CCCN(CCO)CCO)CCCCCCCCCCCCCCCCCC WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010555 avridine Drugs 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000005101 blood-brain tumor barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000011549 displacement method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005073 lymphatic endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000005015 mediastinal lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000008203 tachypnea Diseases 0.000 description 1
- 206010043089 tachypnoea Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000000264 venule Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
- A23C19/0321—Propionic acid bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
- A23C19/0323—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin using only lactic acid bacteria, e.g. Pediococcus and Leuconostoc species; Bifidobacteria; Microbial starters in general
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16741—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16743—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10061—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2750/10064—Methods of inactivation or attenuation by serial passage
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】ブタ多機能萎縮症候群の原因となる新規なブタサーコウイルス（ＰＣＶ,Porcine Circo Virus)株と、その検出試薬および検出方法の提供。
【解決手段】離乳後多機能萎縮症候群（post-weaning multisystemic syndrome：PMWS）の農場から得られた肺または神経節標本から単離した新規なブタサーコウイルス（circovirus）株と、この株の精製物、その無毒化または不活性化ワクチン、組換え生ワクチン、プラスミドワクチンおよびサブユニットワクチンと、診断試薬および診断方法。インビトロ発現ベクターのサブユニットの製造に用いられるＤＮＡ断片またはウイルスまたはプラスミド型のインビトロ発現ベクターに組み込まれる配列としてのＤＮＡ断片。
【選択図】なし
【解決手段】離乳後多機能萎縮症候群（post-weaning multisystemic syndrome：PMWS）の農場から得られた肺または神経節標本から単離した新規なブタサーコウイルス（circovirus）株と、この株の精製物、その無毒化または不活性化ワクチン、組換え生ワクチン、プラスミドワクチンおよびサブユニットワクチンと、診断試薬および診断方法。インビトロ発現ベクターのサブユニットの製造に用いられるＤＮＡ断片またはウイルスまたはプラスミド型のインビトロ発現ベクターに組み込まれる配列としてのＤＮＡ断片。
【選択図】なし
Description
本発明は、ＰＭＷＳ症候群（ブタ多機能萎縮症候群:Porcine Multisystemic Wasting Syndrome）（離乳後多機能萎縮症候群:Post-weaning Multisystemic Wasting Syndromeともいわれる）の原因となる新規なブタサーコウイルス（ＰＣＶ,Porcine Circo Virus)株と、その検出試薬および検出方法と、ワクチン接種方法と、ワクチンと、これらワクチンおよび試薬の製造方法とに関するものである。
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）はブタ腎臓細胞株ＰＫ／１５中に無毒病原性汚染物質として最初に見い出された。このウイルスＰＣＶはチキン貧血症ウイルス（ＣＡＶ、Chicken Anaemia Virus）および嘴・羽症候群ウイルス（ＰＢＦＤＶ、Pscittacine Beak and Feather Disease Virus)とともにサーコウイルス群（Circoviridae）に分類された。これらのウイルスはエンベロプのない小さなウイルス（１５〜２４ｎｍ）で、その共通な特徴は１．７６〜２．３１ｋｂの環状一本鎖のＤＮＡからなるゲノムを含む点にある。このゲノムは約３０ｋＤａのポリペプチドをコード化すると考えられていた（非特許文献１）が、最近の研究で、複雑な転写がわかってきた（非特許文献２）。さらに、上記３種類のサーコウイルス（circovirus）はそのヌクレオチド配列に有意な相同性はなく、また、共通の抗原決定基もない。
ＰＫ／１５細胞由来のＰＣＶは病原性ではないと考えられる。この配列は「非特許文献３」が明らかにしている。ＰＣＶ株が病原性で、ＰＭＷＳ症候群と関連があるかもしれないと考えられるようになったのはほんの最近のことである（非特許文献４、５）。Nayer達はブタＰＣＶのＤＮＡがＰＭＷＳ症候群を示すことをＰＣＲ法を用いて見い出した。しかし、野生型ＰＣＶ株は単離または精製されていない。
カナダ、米国およびフランスで見られるＰＭＷＳ症候群の臨床的な特徴は、体重を徐々に失い、頻呼吸症、呼吸困難および黄疸等を発症することである。病理的な面では、リンパ性または肉芽種性浸潤、リンパ節腫脹、まれには肝炎およびリンパ性または肉芽種性腎炎を発症する（非特許文献６〜１０）。
Todd et al., Arch Virol 1991, 117; 129-135
Meehan B. M. et al., 1997,78; 221-227
"B. M. Meehan et al., J. Gen. Virol 1997 (78) 221-227"
Gupi P. S. Nayar et al., Can. Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501
Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501；
La Semaine Veterinaire 1996 (834)、
La Semaine Veterinaire No. 26；
La Semaine Veterinaire 1997 (857)：５４；
Gupi P. S. Nayar et al., Can. Vet. J, Vol. 38, 1997: 385-387
本出願人は、カナダ、米国（カリフォルニア）およびフランス（ブリタニー）の農場から得た肺または神経節の標本から５つの新規なＰＣＶ株（以下、本発明のサーコウイルス（circovirus）という）を単離することに成功した。これらのウイルスはＰＭＷＳ症候群のブタの病変部に検出されるが、健康なブタには検出されない。
本出願人はさらに、これらの４種の株（カナダおよび米国の株）と２種のフランスの株のゲノムの配列決定した。これらの株はヌクレオチドレベルで互いに非常に強い相同性（９６％以上）超をを示す、一方、ＰＫ／１５株ははるかに弱い相同性（約７６％）しか示さない。従って、新規のタイプのブタサーコウイルス （circovirus）を代表するものと考えられ、ＰＫ／１５に代表されるタイプＩ（第Ｉ群）に対して、本発明の新規な株はタイプＩＩ（第ＩＩ群）とよぶことにする。
本発明の対象は単離または精製物の形をした上記定義の第ＩＩ群のブタサーコウイルス（circovirus）にある。
本発明はさらに、生理標本または組織標本、特にＰＭＷＳ症候群のブタの病変部の標本から実施例に記載した方法で単離可能なブタのサーコウイルス（circovirus）、特にＩＩ型サーコウイルスを提供する。
本発明はさらに、生理標本または組織標本、特にＰＭＷＳ症候群のブタの病変部の標本から実施例に記載した方法で単離可能なブタのサーコウイルス（circovirus）、特にＩＩ型サーコウイルスを提供する。
本発明の対象はＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom）に寄託された下記の５種の株の精製物にある：
１９９７年１０月２日木曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号（以下、Ｉｍｐ．１００８ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号（以下、Ｉｍｐ．１０１０ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号（以下、Ｉｍｐ．９９９ＰＣＶという）
１９９８年１月１６日金曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５という）
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１という）
１９９７年１０月２日木曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号（以下、Ｉｍｐ．１００８ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号（以下、Ｉｍｐ．１０１０ＰＣＶという）
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号（以下、Ｉｍｐ．９９９ＰＣＶという）
１９９８年１月１６日金曜日寄託：
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５という）
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号（以下、Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１という）
本発明はさらに、病気のブタから単離したブタサーコウイルス（circovirus）および／または本発明株と有意な血清学的類似性を有するサーコウイルスおよび／またはＰＫ／１５のＰＣＶとハイブリダイゼーションが全く無く、厳密な条件下で本発明株とのクロスハイブリダイゼーションを有するサーコウイルスに関するものである。
ウイルス性株の増殖、特に全抗原（例えばウイルス）および／またはサブユニット（例えばポリペプチド）の製造は、ＰＭＷＳ症候群のブタの病変部の生理学標本または組織標本から単離されたウイルス株、特にブタ腎臓株細胞を汚染されていない細胞株（特にＰＣＶ、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルボウイルスに汚染されていないＰＫ／１５細胞）で増殖するのが有利である。
これらの単離株がＰＫ／１５細胞での培養で非常に生産的であり、ウイルスまたは抗原の製造、特に不活性化ワクチンの製造に有利であるということは驚くべきことであり、予想できなかったことである。
これらの単離株がＰＫ／１５細胞での培養で非常に生産的であり、ウイルスまたは抗原の製造、特に不活性化ワクチンの製造に有利であるということは驚くべきことであり、予想できなかったことである。
従って、本発明の他の対象は本発明のサーコウイルス（circovirus）または病変部細胞、特にＰＭＷＳ症候群のブタの細胞株の生理学標本または組織標本から単離される任意のブタサーコウイルスの少なくとも１つに感染された細胞をインビトロで培養した細胞株、特にＰＫ／１５細胞で継代した後に単離されるサーコウイルス（circovirus）の調製方法にある。
本発明のさらに別の対象は上記の培養抽出物または上澄み（必要に応じて一般的な方法でさらに精製されていてもよい）と、一般にインビトロの培養から得られる任意の抗原製剤にある。
本発明のさらに別の対象は免疫抗原性の有効成分と、少なくとも１つの上記定義の抗原を含むワクチンにある。
本発明のさらに別の対象は上記の培養抽出物または上澄み（必要に応じて一般的な方法でさらに精製されていてもよい）と、一般にインビトロの培養から得られる任意の抗原製剤にある。
本発明のさらに別の対象は免疫抗原性の有効成分と、少なくとも１つの上記定義の抗原を含むワクチンにある。
本発明のさらに別の対象は、無毒化した生全ワクチンをベースとする免疫抗原性の有効成分またはこの有効成分を精製して得られるワクチンにある。この無毒化は通常の方法、例えば細胞での継代、好ましくはブタ細胞、特にＰＫ／１５細胞等の株細胞での継代（特に５０〜１５０、特に１００回の継代）で行なわれる。これらのワクチンは一般に獣医学上許容される賦形剤または希釈液と、さらには必要に応じて添加される獣医学上許容される補助剤およびフリーズドライ安定剤とを含むことができる。
上記の抗原製剤およびワクチンは１０3〜１０6のＴＣＩＤ５０を有するのが好ましい。
上記の抗原製剤およびワクチンは１０3〜１０6のＴＣＩＤ５０を有するのが好ましい。
本発明のさらに別の対象は、不活化した本発明のサーコウイルス抗原をベースにした免疫抗原性有効成分またはワクチンにある。このワクチンは獣医学上許容される賦形剤または希釈液、さらには必要に応じて添加される獣医学上許容される補助剤を含むことができる。
本発明のサーコウイルス（断片の形でもよい）は当業者に公知の方法で不活性化される。この不活性化は化学的方法、例えば抗原をホルムアルデヒド（ホルマリン）、パラフォルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミンまたはその誘導体等の試薬で処理して行なうことができる。好ましい不活性化法は試薬、特にエチレンイミンまたはβ−プロピオラクトンで処理する方法である。
本発明の不活性化ワクチンにはアジュバンドを加え、当業者に公知の方法でエマルジョンの形、例えば油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョン等の乳剤の形にするのが好ましい。一般的なアジュバンド化合物を有効成分に添加してアジュバンド処理することもできる。
本発明の不活性化ワクチンにはアジュバンドを加え、当業者に公知の方法でエマルジョンの形、例えば油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョン等の乳剤の形にするのが好ましい。一般的なアジュバンド化合物を有効成分に添加してアジュバンド処理することもできる。
使用可能な補剤（アジュバンド）としては例えば水酸化アルミニウム、サポニン（例えば非特許文献１１参照）、Avridine（商標登録）（非特許文献１２参照）、DDA（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、非特許文献１３参照）、ポリホスファゼン（非特許文献１４参照）、さらには有機油、スクアラン（例えばＳＰＴ乳剤、非特許文献１５参照）、スクアレーン（例えばＭＦ５９、非特許文献１６参照）をベースとする水中油乳剤または代謝可能な油をベースとする油中水乳剤（好ましくは特許文献１、２に記載の乳剤を挙げることができる。補剤の組み合わせ、例えば乳剤AvrＩＤine（商標登録）またはDDAとの組み合せた選択することもできる。
これらのワクチンは１０6〜１０8のＴＣＩＤ５０を有するのが好ましい。
これらのワクチンは１０6〜１０8のＴＣＩＤ５０を有するのが好ましい。
Quillja saponinまたはQuil A；"Vaccin Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Michael F. Powel と Mark J. Newman編、Plennum Press, New-York and London, p.210"
Vaccine Design p. 148
Vaccine Design p. 157
Vaccine Design p. 204
Vaccine Design p. 147
Vaccine Design p. 183
国際特許第WO-A-９４−２００７１号公報
米国特許第５，４２２，１０９号明細書
生ワクチン補剤は不活性化ワクチン用のものから選択するこができる。乳剤が好ましい。不活性化ワクチン用のものには特許文献３に記載のものも加えることができる。
国際特許第WO-A-９４−１６６８１号公報 凍結安定剤としては例えばＳＰＧＡ（非特許文献１７）、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストランまたはグルコース等の炭水化物、アルブミンまたはカゼイン等のプロテイン、これらの化合物の誘導体またはアルカリ金属燐酸塩等の緩衝剤を挙げることができる。
Bovarnik et al., J. Bacteriology 59, 509, 950
本件出願人は配列ＩＤ番号１〜４(必要な場合にはさらに配列ＩＤ番号６)で識別される４つの単離株のゲノムを得た。
本発明のさらに他の対象はこれらの配列の一部または全てを含むＤＮＡ断片にある。本発明がこれと均等な配列すなわち上記配列の株の特徴または上記配列によりコードされるポリペプチドの機能を変更しない配列も含むものであるということは当然である。また、コードの欠失(degenerescence)により変化した配列も含むということは理解てきよう。
本発明はさらに、厳密な条件下で上記配列と混成可能であり、および／または、上記定義の第ＩＩ群に属する本発明株と高い相同性を有するという意味で均等な配列も含むものである。
本発明のさらに他の対象はこれらの配列の一部または全てを含むＤＮＡ断片にある。本発明がこれと均等な配列すなわち上記配列の株の特徴または上記配列によりコードされるポリペプチドの機能を変更しない配列も含むものであるということは当然である。また、コードの欠失(degenerescence)により変化した配列も含むということは理解てきよう。
本発明はさらに、厳密な条件下で上記配列と混成可能であり、および／または、上記定義の第ＩＩ群に属する本発明株と高い相同性を有するという意味で均等な配列も含むものである。
これらの配列およびその断片は適当なベクターを用いてインビトロまたはインビボでポリペプチドの発現に有利に用いることができる。
特に、これに使用可能な本発明のＤＮＡ断片を形成する読み取り枠はタイプＩＩのサーコウイルスのゲノム配列で同定されている。本発明は、少なくともこれらの読み取り枠（対応するアミノ酸配列）の一つを含む全てのポリペプチドに関するものである。特に、本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成されるプロテインに関するものである。
インビトロのサブユニットを発現するための発現手段としてはE. coliまたはバキュロウイルス（特許文献３）を用いるのが好ましい。
米国特許第４，７４５，０５１号明細書
特に、これに使用可能な本発明のＤＮＡ断片を形成する読み取り枠はタイプＩＩのサーコウイルスのゲノム配列で同定されている。本発明は、少なくともこれらの読み取り枠（対応するアミノ酸配列）の一つを含む全てのポリペプチドに関するものである。特に、本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成されるプロテインに関するものである。
インビトロのサブユニットを発現するための発現手段としてはE. coliまたはバキュロウイルス（特許文献３）を用いるのが好ましい。
上記の単数または複数のコード配列またはその断片をバキュロウイルスゲノム（例えばAutographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV）に組み込み、次いで、それを昆虫細胞、例えばSpodoptera fruigiperda Sf9（寄託番号ATCC CRL 1711）で増殖される。また、イースト（例えば酵母)またはほ乳類細胞（例えばCHO、BHK）等の真核細胞でサブユニットを製造することもできる。
本発明のさらに他の対象は、これらの発現手段によってインビトロで製造され、必要に応じて一般的な方法で精製されたポリペプチドにある。本発明のさらに他の対象は、このようにして得られた少なくとも１つのポリペプチドまたはその断片を獣医学上許容される賦形剤または希釈液(必要に応じて獣医学上許容される補助剤をさらに含むことができる)中に含むサブユニットワクチンにある。
組み換え生ワクチンの製造時にインビボ発現させるには単数または複数のコード化配列またはその断片を単数または複数のポリペプチドを発現できる条件下で適当な発現ベクターに挿入する。適切なベクターとしては好ましくはブタで増殖可能でブタに対しては非病原性の生ウイルスを当業者に周知の方法で使用することができる。特に、アウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等を用いることができる（特許文献４〜７）。
国際特許第WO-A-９０−１１０９２号公報
国際特許第WO-A-９３−１９８１３号公報
国際特許第WO-A-９４−２１７９７号公報
国際特許第WO-A-９５−２０６６０号公報
従って、本発明の他の対象は、このようにして精製されたベクターと、組み換え生ワクチンまたはプラスミドワクチン（ポリヌクレオチドまたはＤＮＡワクチン）にある。これらのワクチンは獣医学上許容される賦形剤または希釈液を含むことができる。
本発明のワクチン（無毒化、不活性化、サブユニット、組み換えおよびプラスミド生ワクチン）は本発明の一つまたは複数（２、３つ）のサーコウイルスから成る一つまたは複数の有効成分（抗原）を含むことができる。
本発明のワクチン（無毒化、不活性化、サブユニット、組み換えおよびプラスミド生ワクチン）は本発明の一つまたは複数（２、３つ）のサーコウイルスから成る一つまたは複数の有効成分（抗原）を含むことができる。
本発明の上記各種ワクチンはブタの他の病原体に対するワクチンと組み合わせることができる。特にＰＭＳＷ症候群に関連する病原体に対するワクチンと組み合わせることができる。本発明のワクチン、特に不活性化ワクチンはブタの他の病原体に対応する他のワクチン価を含むことができる。これらのブタの他の病原体の中では好ましくはＰＲＲＳ（Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome :ブタ生殖器および呼吸器症候群）（特許文献８〜１０および非特許文献１８を参照）および／またはMycoplasma hyopneumonia（特許文献１１〜１３および非特許文献１９を参照）を挙げることができる。他の重要なワクチン価の中ではアクチノバシラス胸膜肺炎菌、E. coli、ブタ萎縮鼻炎（porcine Atrophic Rhinitis）、仮性狂犬病（アウジェスキー病）、ブタコレラ、ブタインフルエンザを挙げることができる。
本発明のさらに他の対象は、本発明のサーコウイルスに対してブタの免疫反応を誘発する方法、特にブタに有効なワクチン接種方法にある。
このワクチン接種方法では上記ワクチンを一回または複数回にわたってブタに投与する。同じワクチン接種プロトコルで複数種の前記ワクチンを組み合わせることも可能である。
このワクチンは大人のブタだけでなく、若いブタまたは妊娠中の雌に対して投与することができる。妊娠中の雌にワクチン接種することによって新生児に受動免疫（母親抗体：maternal antibody）を与えることができる。
このワクチン接種方法では上記ワクチンを一回または複数回にわたってブタに投与する。同じワクチン接種プロトコルで複数種の前記ワクチンを組み合わせることも可能である。
このワクチンは大人のブタだけでなく、若いブタまたは妊娠中の雌に対して投与することができる。妊娠中の雌にワクチン接種することによって新生児に受動免疫（母親抗体：maternal antibody）を与えることができる。
本発明はさらに、本発明のブタサーコウイルスの存在を診断する方法を提供する。従って、本発明の他の対象は診断テストと下記試薬を用いたテスト方法にある。
互いに異なるサーコウイルスの配列が分かると共通の配列を定義でき、公知の全てのブタサーコウイルスを識別できる試薬を製造することができる。
当業者は特定の診断を実施するために対応するＰＫ／１５サーコウイルスの配列とほとんどまたは全く相同性を示さない領域に対応する配列の断片を選択することができる。
互いに異なるサーコウイルスの配列が分かると共通の配列を定義でき、公知の全てのブタサーコウイルスを識別できる試薬を製造することができる。
当業者は特定の診断を実施するために対応するＰＫ／１５サーコウイルスの配列とほとんどまたは全く相同性を示さない領域に対応する配列の断片を選択することができる。
配列を並べることによって当業者は所望の試薬を選択することができる。
第１の試薬は上記ＤＮＡ配列およびその断片で構成され、それは周知のハイブリッド法またはＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）法によってプローブまたはプライマーとして用いられる。
第２の試薬は上記ウイルスの配列によってコードされたポリペプチドまたはベクター（前記参照）を用いて発現されたまたは公知のペプチド合成法によって化学的に合成されたポリペプチドで構成される。
第３および第４の試薬はウイルス、ポリペプチドまたは断片、抽出物またはＤＮＡ配列でコードされたものから一般的な方法で製造可能なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる。
第１の試薬は上記ＤＮＡ配列およびその断片で構成され、それは周知のハイブリッド法またはＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）法によってプローブまたはプライマーとして用いられる。
第２の試薬は上記ウイルスの配列によってコードされたポリペプチドまたはベクター（前記参照）を用いて発現されたまたは公知のペプチド合成法によって化学的に合成されたポリペプチドで構成される。
第３および第４の試薬はウイルス、ポリペプチドまたは断片、抽出物またはＤＮＡ配列でコードされたものから一般的な方法で製造可能なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる。
上記の第２、第３および第４の試薬は本発明の対象である診断法で用いることができる。この診断法では検査するブタから得られた生理学的液体標本（血液、血漿、血清等）または組織標本（神経節、肝臓、肺、腎臓等）中に本発明のサーコウイルスに特有な抗原の存在を調べて抗原自体を検出するか、この抗原に対する抗体を検出する。
本発明の抗原および抗体は公知の任意の臨床診断法で用いることができるが、
上記の抗原および抗体を獣医、ブリーダーまたは動物の飼い主が直接現場で使用可能な方法で用いるのが好ましい。臨床技術および現場技術を有する当業者は上記の抗原および／または抗体を試薬として用いることができる。
上記の抗原および抗体を獣医、ブリーダーまたは動物の飼い主が直接現場で使用可能な方法で用いるのが好ましい。臨床技術および現場技術を有する当業者は上記の抗原および／または抗体を試薬として用いることができる。
本発明で用いるのに好ましい診断法はウェスタンブロット法、免疫抗体法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）および免疫クロマトグラフィーである。
免疫クロマトグラフィー法に関しては特に非特許文献２０と特許文献１４〜２９を参照することができる。
免疫クロマトグラフィー法に関しては特に非特許文献２０と特許文献１４〜２９を参照することができる。
"Robert F. Zulk et al., Clin. Chem. 31/7, 1144-1150 (1985) "
国際特許第WO-A-８８−０８５３４号公報
国際特許第WO-A-９１−１２５２８号公報
欧州特許第２９１，１７６号公報
欧州特許第２９９，４２８号公報
欧州特許第２９１，１９４号公報
欧州特許第２８４，２３２号公報
米国特許第５，１２０，６４３号明細書
米国特許第５，０３０，５５８号明細書
米国特許第５，２６６，４９７号明細書
米国特許第４，７４０，４６８号明細書
米国特許第５，２６６，４９７号明細書
米国特許第４，８５５，２４０号明細書
米国特許第５，４５１，５０４号明細書
米国特許第５，１４１，８５０号明細書
米国特許第５，２３２，８３５号明細書
米国特許第５，２３８，６５２号明細書
標本中に特有な抗体は間接法、競合法または置換法によって検出するのが好ましい。そのためには抗原自体を診断試薬として用いるか、抗体の認識を保持する抗原断片を診断試薬として用いる。標識化はペルオキシダーゼを用いた標識化または特殊な標識化、好ましくはコロイド性金を用いた標識化が有利である。
標本中の抗原自体をこの抗原に特有な標識化した抗体を用いて検出することもできる。標識化は上記のものが有利である。
競合法または置換法または抗原自体の検出に用いられる抗原に特有な抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナール抗体、これら抗体の断片、好ましくはFabまたはF(ab)'2断片であるである。
標本中の抗原自体をこの抗原に特有な標識化した抗体を用いて検出することもできる。標識化は上記のものが有利である。
競合法または置換法または抗原自体の検出に用いられる抗原に特有な抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナール抗体、これら抗体の断片、好ましくはFabまたはF(ab)'2断片であるである。
本発明はさらに、上記抗体を生理学的液体標本または組織標本中の抗原の検出またはこれら標本または試験片中に存在する抗体の検出のための診断試薬として使用可能な本発明抗原に特有のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の製造方法に関するものである。本発明はものでさらに、これらの抗体の免疫機能を有する断片、特にF(ab)およびF(ab)'2断片は本発明に含まれる。
抗体は一般的な方法で製造することができる。特に非特許文献２１または非特許文献２２を参照することができる。これらの内容は本件明細書の一部を成す。
特に、抗原またはその断片の少なくとも１つで免疫化されたネズミの脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合（この方法自体は公知）することができる。
"Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, USA" "J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Inc.,"
抗体は一般的な方法で製造することができる。特に非特許文献２１または非特許文献２２を参照することができる。これらの内容は本件明細書の一部を成す。
特に、抗原またはその断片の少なくとも１つで免疫化されたネズミの脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合（この方法自体は公知）することができる。
"Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, USA" "J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Inc.,"
本発明の他の対象は上記抗原に特有なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、特にネズミまたはウサギの抗体の純粋または部分的に純粋な製剤或いは粗原料からなる製剤にある。
本発明では上記のＤＮＡ配列を基にした所望のエピトープ（ワクチン用エピトープまたは診断用エピトープ）を決めることができる。本発明のサーコウイルスのゲノムのＤＮＡ配列から、エピトープを決めることができる。当業者は公知の方法、例えば適切なコンピュータプログラムまたはPEPSCANを用いてエピトープを求めることができる。このエピトープはプロテインの免疫優性領域であり、プロテインの表面に露出した領域である。このエピトープは抗体によって認識され、診断の分野において診断目的の抗体の調製または診断試薬として用いられる対応するペプチドの製造に用いられる。
少なくともエピトープは８〜９個のアミノ酸を有するペプチドである。一般には最小でも１３〜２５個のアミノ酸が好ましい。
本発明では上記のＤＮＡ配列を基にした所望のエピトープ（ワクチン用エピトープまたは診断用エピトープ）を決めることができる。本発明のサーコウイルスのゲノムのＤＮＡ配列から、エピトープを決めることができる。当業者は公知の方法、例えば適切なコンピュータプログラムまたはPEPSCANを用いてエピトープを求めることができる。このエピトープはプロテインの免疫優性領域であり、プロテインの表面に露出した領域である。このエピトープは抗体によって認識され、診断の分野において診断目的の抗体の調製または診断試薬として用いられる対応するペプチドの製造に用いられる。
少なくともエピトープは８〜９個のアミノ酸を有するペプチドである。一般には最小でも１３〜２５個のアミノ酸が好ましい。
当業者は一つまたは複数の上記技術および利用可能なその他の技術を用いて診断用のペプチドまたは抗体で用いるエピトープを見付けることができる。
従って、本発明の他の対象はこの抗原および／またはこの抗原に特有なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む診断キットにある。これらは特に、前記の診断技術による診断キットである。
従って、本発明の他の対象はこの抗原および／またはこの抗原に特有なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む診断キットにある。これらは特に、前記の診断技術による診断キットである。
以下、下記の図を参照して本発明の実施例をさらに詳細に説明する。しかし、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
配列ＩＤリスト
配列ＩＤ番号１ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号２ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号３ ＝ Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号４ ＝ Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号５ ＝ PK/15株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号６ ＝ １９９７年１０月３日のフランスの最初の出願におけるＩｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤリスト
配列ＩＤ番号１ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号２ ＝ Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号３ ＝ Ｉｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号４ ＝ Ｉｍｐ．１０１０株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号５ ＝ PK/15株のゲノムのＤＮＡ配列
配列ＩＤ番号６ ＝ １９９７年１０月３日のフランスの最初の出願におけるＩｍｐ．９９９株のゲノムのＤＮＡ配列
実施例１
ブタサーコウイルス（circovirus）株の培養および分離
組織標本はフランス、カナダおよび米国で子豚の肺およびリンパ節から集めた。これらの子豚は離乳後多機能萎縮症候群に典型的な臨床的徴候を示したものである。ウイルスを単離するため組織標本は死体解剖直後に−７０℃で冷凍した。
ウイルス単離のために無菌の乳鉢と乳棒を用いて無菌の砂で組織を粉砕し、イール（Earl）塩 （EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Workingham, UK）、ペニシリン（１００IU/ml）およびストレプトマイシン（１００μｍ／ｍｌ）を含む最小培地（ＭＥＭ−ＳＡ培地）中に約１５％の組織標本を含む懸濁液を調製した。粉砕物をＭＥＭ−ＳＡに溶解し、+４℃、３０００ｇで３０分間、遠心分離にかけて上澄みを回収した。
ブタサーコウイルス（circovirus）株の培養および分離
組織標本はフランス、カナダおよび米国で子豚の肺およびリンパ節から集めた。これらの子豚は離乳後多機能萎縮症候群に典型的な臨床的徴候を示したものである。ウイルスを単離するため組織標本は死体解剖直後に−７０℃で冷凍した。
ウイルス単離のために無菌の乳鉢と乳棒を用いて無菌の砂で組織を粉砕し、イール（Earl）塩 （EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Workingham, UK）、ペニシリン（１００IU/ml）およびストレプトマイシン（１００μｍ／ｍｌ）を含む最小培地（ＭＥＭ−ＳＡ培地）中に約１５％の組織標本を含む懸濁液を調製した。粉砕物をＭＥＭ−ＳＡに溶解し、+４℃、３０００ｇで３０分間、遠心分離にかけて上澄みを回収した。
細胞培地の接種前に、１００μｌのクロロホルムを２ｍｌの各上澄みに添加し、室温で１０分間混合した。この混合物を超遠心分離管に移し、１０分間３０００ｇで遠心分離して上澄みを回収した。次いで、この上澄みをウイルス分離実験で種菌として用いた。
全てのウイルス単離研究はブタサーコウイルス(ＰＣＶ)、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルヴォウイルスに感染していないことが分かっているＰＫ／１５細胞培地で実施した（非特許文献２３）。
Allan G. et al., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64
全てのウイルス単離研究はブタサーコウイルス(ＰＣＶ)、ペスチウイルス、ブタアデノウイルスおよびブタパルヴォウイルスに感染していないことが分かっているＰＫ／１５細胞培地で実施した（非特許文献２３）。
Allan G. et al., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64
ブタサーコウイルスの単離は下記方法によって実施した：
ＰＫ／１５細胞の単一層をトリプシン処理（トリプシン−versene混合物）によって集密的な培養から解離し、最終濃度が約４００，０００細胞/１ｍｌであるペスチウイルス（=ＭＥＭ−Ｇ培地）に感染していない１５％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ−ＳＡ培地に溶解した。次に、この細胞懸濁液の１０ｍｌの部分標本を２ｍｌの前記接種材料の部分標本と混合し、最終混合物を２つの２５ｃｍ2ファルコンフラスコに６ｍｌの容積に分取した。+３７℃で１８時間、１０％のＣｏ２を含む雰囲気下で培養した。
ＰＫ／１５細胞の単一層をトリプシン処理（トリプシン−versene混合物）によって集密的な培養から解離し、最終濃度が約４００，０００細胞/１ｍｌであるペスチウイルス（=ＭＥＭ−Ｇ培地）に感染していない１５％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ−ＳＡ培地に溶解した。次に、この細胞懸濁液の１０ｍｌの部分標本を２ｍｌの前記接種材料の部分標本と混合し、最終混合物を２つの２５ｃｍ2ファルコンフラスコに６ｍｌの容積に分取した。+３７℃で１８時間、１０％のＣｏ２を含む雰囲気下で培養した。
培養後、半集密的な単一層を３００ｍＭのＤ−グルコサミン（Cat # G48175、Sigma-Aldrich株式会社、Poole, UK）で処理し（非特許文献２４）、さらに３７℃で４８〜７２時間培養を続けた。この最終培養に続いて、２つのファルコンの１方を３回凍結／融解サイクルにかけた。残りのファルコンのＰＫ／１５細胞はトリプシン−versene溶液で処理し、２０ｍｌのＭＥＭ−Ｇ培地中に再懸濁し、４００，０００細胞／ｍｌ濃度で７５ｃｍ2ファルコン中に接種した。新しく接種されたフラスコは凍結／融解サイクル後に得られた対応する可溶化液５ｍｌを添加して「超感染」させた。
Tischr I. et al., Arch. Virol., 1987 96 39-57
Tischr I. et al., Arch. Virol., 1987 96 39-57
実施例２
免疫抗体法または切片上ハイブリッド形成法によるブタサーコウイルスを検出するためのするための細胞培地標本の調製
５ｍｌの容積の「超感染」した懸濁液を回収し、無菌で脱脂したカバーガラスを含む直径５５ｍｍのペトリ皿中に接種した。フラスコ中およびカバーガラス上で+３７℃で培養し、実施例１に記載のグルコサミンで処理した。カバーガラス上での培養はグルコサミン処理後２４〜４８時間で回収し、室温で１０分間アセトンを用いて、または４時間緩衝剤処理した１０％のホルムアルデヒドを用いて固定した。この固定後、全てのカバーガラスをシリカゲル上で−７０℃で貯蔵してから、ハイブリッド形成の研究および細胞免疫の研究に使用した。
免疫抗体法または切片上ハイブリッド形成法によるブタサーコウイルスを検出するためのするための細胞培地標本の調製
５ｍｌの容積の「超感染」した懸濁液を回収し、無菌で脱脂したカバーガラスを含む直径５５ｍｍのペトリ皿中に接種した。フラスコ中およびカバーガラス上で+３７℃で培養し、実施例１に記載のグルコサミンで処理した。カバーガラス上での培養はグルコサミン処理後２４〜４８時間で回収し、室温で１０分間アセトンを用いて、または４時間緩衝剤処理した１０％のホルムアルデヒドを用いて固定した。この固定後、全てのカバーガラスをシリカゲル上で−７０℃で貯蔵してから、ハイブリッド形成の研究および細胞免疫の研究に使用した。
実施例３
ハイブリッド形成法(in situ)によるＰＣＶ配列の検出法
ハイブリッド形成法(in situ)は病気のブタから集めた組織に対して実施し、ホルムアルデヒドで固定し、ウイルス単離（実施例２参照）用に接種した細胞培地の調整で用い、カバーガラスに固定した。
ＰＫ／１５ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）および感染性ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）に対応する完全なゲノムプローブを用いた。１．７キロの塩基ペア（kbp）の挿入断片の形にクローン化されたＰＣＶゲノムの複製型を含むプラスミドpPCVI（Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circovirus, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227）をＰＣＶ固有ＤＮＡ源として用いた。２．３ｋｂｐの鳥サーコウイルスＣＡＶの複製型を含む鳥プラスミドpCAAIを負対照として用いた。２つのプラスミドのグリセロール源をアルカリ法（非特許文献２５）によってプラスミドの製造および精製で用い、これらはプローブ調製用のテンプレートとして用いた。ＰＣＶおよびＣＡＶの完全なゲノムを表すサーコウイルスプローブはメーカ推薦の方法で市販の非放射性ラベリングキット（"DIG DNA Labelling Kit"、Boehringer Mannheim, Lewis, UK）を用いて上記精製プラスミド（各プローブに１μｇ）およびヘキサヌクレオチドプライマーから製造した。
Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988
ハイブリッド形成法(in situ)によるＰＣＶ配列の検出法
ハイブリッド形成法(in situ)は病気のブタから集めた組織に対して実施し、ホルムアルデヒドで固定し、ウイルス単離（実施例２参照）用に接種した細胞培地の調整で用い、カバーガラスに固定した。
ＰＫ／１５ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）および感染性ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）に対応する完全なゲノムプローブを用いた。１．７キロの塩基ペア（kbp）の挿入断片の形にクローン化されたＰＣＶゲノムの複製型を含むプラスミドpPCVI（Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circovirus, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227）をＰＣＶ固有ＤＮＡ源として用いた。２．３ｋｂｐの鳥サーコウイルスＣＡＶの複製型を含む鳥プラスミドpCAAIを負対照として用いた。２つのプラスミドのグリセロール源をアルカリ法（非特許文献２５）によってプラスミドの製造および精製で用い、これらはプローブ調製用のテンプレートとして用いた。ＰＣＶおよびＣＡＶの完全なゲノムを表すサーコウイルスプローブはメーカ推薦の方法で市販の非放射性ラベリングキット（"DIG DNA Labelling Kit"、Boehringer Mannheim, Lewis, UK）を用いて上記精製プラスミド（各プローブに１μｇ）およびヘキサヌクレオチドプライマーから製造した。
Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988
ハイブリッド形成法(in situ)で使用する前に、プローブをジゴキシジェニンで標識化し、容積５０〜１００μｌの純水に溶解した。
パラフィンに包み、ホルムアルデヒドで固定した病気のブタの組織標本と、ホルムアルデヒドで固定した感染細胞培地の製剤を下記方法でＰＣＶ核酸検出のために調製した：
５μｍ厚の切片をパラフィンに包まれた組織塊から切り出し、濃度を次第に薄くしたアルコール溶液中で再水和した。ホルムアルデヒドで固定した組織切片および細胞培地を１５分間および５分間それぞれ５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝剤（ｐＨ７．６）を用いた０．５％のプロテナーゼＫ溶液中で+３７℃で培養した。次に、スライドガラスを加圧滅菌した蒸留水中の１％グリシン溶液中に３０秒配置し、０．０１ＭのＰＢＳ緩衝剤（燐酸緩衝食塩水）（ｐＨ７．２）で２度洗浄し、最後に無菌蒸留水で５分間洗浄した。スライドガラスを最後に外気で乾燥し、プローブと接触させた。
パラフィンに包み、ホルムアルデヒドで固定した病気のブタの組織標本と、ホルムアルデヒドで固定した感染細胞培地の製剤を下記方法でＰＣＶ核酸検出のために調製した：
５μｍ厚の切片をパラフィンに包まれた組織塊から切り出し、濃度を次第に薄くしたアルコール溶液中で再水和した。ホルムアルデヒドで固定した組織切片および細胞培地を１５分間および５分間それぞれ５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝剤（ｐＨ７．６）を用いた０．５％のプロテナーゼＫ溶液中で+３７℃で培養した。次に、スライドガラスを加圧滅菌した蒸留水中の１％グリシン溶液中に３０秒配置し、０．０１ＭのＰＢＳ緩衝剤（燐酸緩衝食塩水）（ｐＨ７．２）で２度洗浄し、最後に無菌蒸留水で５分間洗浄した。スライドガラスを最後に外気で乾燥し、プローブと接触させた。
各組織／プローブ製剤を清潔な脱脂カバーガラスで被覆し、+９０℃の炉内に１０分間配置した後、氷塊と１分間接触させ、最後に+３７℃で１８時間培養した。次に、調整物を２Ｘクエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）緩衝剤（ｐＨ７．０）に短時間含浸した後、２ＸのＳＳＣ緩衝剤中で５分間、２回洗浄し、最後にＰＢＳ緩衝剤中で５分間、２回洗浄した。
洗浄後、調整物を０．１Ｍのマレイン酸、０．１５ＭのＮａＣＬ（ｐＨ７．５）（マレイン緩衝剤）の溶液中に１０分間含浸し、マレイン緩衝剤中の遮断試薬の１％溶液（Cat # 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK）中で+３７℃で２０分間培養した。
洗浄後、調整物を０．１Ｍのマレイン酸、０．１５ＭのＮａＣＬ（ｐＨ７．５）（マレイン緩衝剤）の溶液中に１０分間含浸し、マレイン緩衝剤中の遮断試薬の１％溶液（Cat # 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK）中で+３７℃で２０分間培養した。
次に、調整物を遮断緩衝剤で希釈された抗ジゴキシジェニンモノクローナル性抗体（Boehringer Mannheim）の１／２５０溶液中で+３７℃で１時間培養し、ＰＢＳ中で洗浄し、最後に抗ネズミ免疫グロブリン抗体を用いて+３７℃で３０分間培養した。調整物をＰＢＳで洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ作用を室温で２０分間、ＰＢＳ中の０．５％水酸化ペルオキシド溶液で処理して遮断した。調整物を再度ＰＢＳ中で洗浄し、使用直前に調製した３−アミノ−９−ジエチルカルバゾル（ＡＥＣ）基質（CambrＩＤge Bioscience, CambrＩＤge, UK）で処理した。
最後に水道水で洗浄した後、調整物をヘマトキシリンで逆染色し、水道水で"青色化"して固定液（GVA Mount, CambrＩＤge Bioscience, CambrＩＤge, UK）で顕微鏡のカバーガラスに固定した。対照実験には無関係な負プローブ（ＣＡＶ）と正プローブ（ＰＣＶ）を病気のブタおよび病気ではないブタから得られた標本で使用することが含まれる。
最後に水道水で洗浄した後、調整物をヘマトキシリンで逆染色し、水道水で"青色化"して固定液（GVA Mount, CambrＩＤge Bioscience, CambrＩＤge, UK）で顕微鏡のカバーガラスに固定した。対照実験には無関係な負プローブ（ＣＡＶ）と正プローブ（ＰＣＶ）を病気のブタおよび病気ではないブタから得られた標本で使用することが含まれる。
実施例４
免疫抗体法によるＰＣＶの検出法
アセトンを用いて固定した全ての細胞倍地の最初のスクリーニングを貯蔵した大人のブタ血清の１／１００希釈を用いた間接免疫抗体法（ＩＩＦ）で実施した。この貯蔵血清は北アイルランドの２５匹の大人の雌ブタからの血清を含み、ＰＣＶ：ブタパルボウイルス、ブタアデノウイルスおよびＰＲＲウイルスを含む広範囲のブタのウイルスに対する抗体を含むことで知られている。血清（ＰＢＳで希釈）を細胞培地と+３７℃で１時間接触させた後、ＰＢＳ中で２回洗浄してＩＩＦを実施した。細胞培地をイソチオシアン酸フルオレセインに結合したＰＢＳで１／８０に希釈したウサギの抗ブタ免疫グロブリン抗体を用いて１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、グリセロール緩衝剤に固定し、紫外線下で顕微鏡観察した。
免疫抗体法によるＰＣＶの検出法
アセトンを用いて固定した全ての細胞倍地の最初のスクリーニングを貯蔵した大人のブタ血清の１／１００希釈を用いた間接免疫抗体法（ＩＩＦ）で実施した。この貯蔵血清は北アイルランドの２５匹の大人の雌ブタからの血清を含み、ＰＣＶ：ブタパルボウイルス、ブタアデノウイルスおよびＰＲＲウイルスを含む広範囲のブタのウイルスに対する抗体を含むことで知られている。血清（ＰＢＳで希釈）を細胞培地と+３７℃で１時間接触させた後、ＰＢＳ中で２回洗浄してＩＩＦを実施した。細胞培地をイソチオシアン酸フルオレセインに結合したＰＢＳで１／８０に希釈したウサギの抗ブタ免疫グロブリン抗体を用いて１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、グリセロール緩衝剤に固定し、紫外線下で顕微鏡観察した。
実施例５
病気のブタの組織における切片上ハイブリッド形成結果
フランス、カナダおよびカリフォルニアの多機能性萎縮病変を有する子豚から集めた組織から調製したＰＣＶゲノムプローブを用いた切片上ハイブリッド形成法から、研究された複数の病変部に病変部に関連するＰＣＶ核酸の存在が示された。これに対してＰＣＶゲノムプローブを病気でないブタから集めた組織に用い時またはＣＡＶプローブを病気のブタの組織に用いた時には何の徴候も見られなかった。ＰＣＶ核酸の存在はサイトプラズムおよびカリフォルニアの子豚の肺の病変部を浸潤する多数の単核細胞の核に認められた。ＰＣＶ核酸の存在は肺細胞、気管支および細気管支の上皮細胞および細動脈、細静脈およびリンパ管の内皮細胞にも見られた。
病気のブタの組織における切片上ハイブリッド形成結果
フランス、カナダおよびカリフォルニアの多機能性萎縮病変を有する子豚から集めた組織から調製したＰＣＶゲノムプローブを用いた切片上ハイブリッド形成法から、研究された複数の病変部に病変部に関連するＰＣＶ核酸の存在が示された。これに対してＰＣＶゲノムプローブを病気でないブタから集めた組織に用い時またはＣＡＶプローブを病気のブタの組織に用いた時には何の徴候も見られなかった。ＰＣＶ核酸の存在はサイトプラズムおよびカリフォルニアの子豚の肺の病変部を浸潤する多数の単核細胞の核に認められた。ＰＣＶ核酸の存在は肺細胞、気管支および細気管支の上皮細胞および細動脈、細静脈およびリンパ管の内皮細胞にも見られた。
病気のフランスのブタではＰＣＶ核酸の存在は多数の濾胞性リンパ細胞のサイトプラズマおよびリンパ節の同様な毛細血管内の単核細胞に検出された。また、ＰＣＶ核酸は一次的合胞体にも検出された。これらの検出結果から、カリフォルニアのブタの肺、フランスのブタの腸間膜リンパ節およびカナダのブタの器官の標本を新規なブタサーコウイルス株の単離用に選択した。
実施例６
新規なブタサーコウイルス株の細胞培養結果と、免疫抗体法による検出
多機能性萎縮症候群の臨床的徴候を示すフランスの子豚（Imp. 1008株）、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）およびカナダの子豚（Imp. 1010株）から集めた標本を培養した細胞培地には細胞変性作用（ＣＰＥ）は全く見られなかった。しかし、アセトンを用いて固定した後、貯蔵されたブタのポリクローン化した血清を用いて培養した細胞培地から得られた製剤を免疫標識化することによって、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）の肺、フランスの子豚（Imp. 1008株）の縦隔リンパ節およびカナダの子豚（Imp. 1010株）の器官を用いて培養した培地中の多数の細胞に核蛍光が現れた。
新規なブタサーコウイルス株の細胞培養結果と、免疫抗体法による検出
多機能性萎縮症候群の臨床的徴候を示すフランスの子豚（Imp. 1008株）、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）およびカナダの子豚（Imp. 1010株）から集めた標本を培養した細胞培地には細胞変性作用（ＣＰＥ）は全く見られなかった。しかし、アセトンを用いて固定した後、貯蔵されたブタのポリクローン化した血清を用いて培養した細胞培地から得られた製剤を免疫標識化することによって、カリフォルニアの子豚（Imp. 999株）の肺、フランスの子豚（Imp. 1008株）の縦隔リンパ節およびカナダの子豚（Imp. 1010株）の器官を用いて培養した培地中の多数の細胞に核蛍光が現れた。
実施例７
ブタサーコウイルスのゲノムＤＮＡの抽出
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の新規な株の複製型を７２〜７６時間の培養後に回収した感染したＰＫ／１５細胞培地（実施例１参照）（７５ｃｍ2ファルコン１０個）を用いて調製し、ＣＡＶの複製型のクローン化で記載したグルコサミンで処理した（非特許文献２６）。この複製型の２本鎖ＤＮＡはHirt法（非特許文献２７）の変形法で抽出した(非特許文献２８に記載)。
ブタサーコウイルスのゲノムＤＮＡの抽出
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の新規な株の複製型を７２〜７６時間の培養後に回収した感染したＰＫ／１５細胞培地（実施例１参照）（７５ｃｍ2ファルコン１０個）を用いて調製し、ＣＡＶの複製型のクローン化で記載したグルコサミンで処理した（非特許文献２６）。この複製型の２本鎖ＤＮＡはHirt法（非特許文献２７）の変形法で抽出した(非特許文献２８に記載)。
Todd. D. et al., Dot blot hybrＩＤization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 933-939
Hirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365-369
Molitor T. W. et al. Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates, Virology, 1984, 137, 241-254
実施例８
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムの複製型の制限地図
Hirt法で抽出されたＤＮＡ（１〜５μｇ）をメーカの推薦する方法に従ってＳ１ヌクレアーゼ（Amersham）で処理し、各種制限酵素(Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK)で消化し、消化物をTodd達が記載の方法（非特許文献２９）で、臭化エチジウムの存在下、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動で分離した。Imp.999株の培地から抽出したＤＮＡは独特のEcoRI部位、２つのSacI部位を有し、PstI部位は全く持たない。従って、この制限プロフィールは、逆にPstI部位を有し、EcoRI部位を全く持たないＰＣＶのＰＫ／１５株（非特許文献３０）が示す制限プロフィールとは異なっている。
Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823 Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus） DNA: affinities with plant circovirus, 1997, 78, 221-227
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムの複製型の制限地図
Hirt法で抽出されたＤＮＡ（１〜５μｇ）をメーカの推薦する方法に従ってＳ１ヌクレアーゼ（Amersham）で処理し、各種制限酵素(Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK)で消化し、消化物をTodd達が記載の方法（非特許文献２９）で、臭化エチジウムの存在下、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動で分離した。Imp.999株の培地から抽出したＤＮＡは独特のEcoRI部位、２つのSacI部位を有し、PstI部位は全く持たない。従って、この制限プロフィールは、逆にPstI部位を有し、EcoRI部位を全く持たないＰＣＶのＰＫ／１５株（非特許文献３０）が示す制限プロフィールとは異なっている。
Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823 Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus） DNA: affinities with plant circovirus, 1997, 78, 221-227
実施例９
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムのクローン化
制限酵素EcoRIを有するＰＣＶ Imp.999株の２本鎖複製型の消化で生じた約１．８ｋｂｐの制限断片を市販のQiagen kit（QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK）を用いて１．５％アガロースゲル（実施例３参照）上で電気泳動で分離した。次に、このEcoRI−EcoRI制限断片を標準クローン化法（非特許文献３１）によって予め同じ制限酵素を用いて消化し、脱リン酸したベクターpGEM-7（Promega, Medical Supply Company, Dublin, Ireland）と結合した。得られたプラスミドを標準的方法によってEscherichia coli JM109宿主株（Stratagene, La Jolla, USA）に変換した。同じく、ＰＣＶ Imp.999株のEcoRI−EcoRI制限断片をベクターpBlueScript SK+（Stratagene, La Jolla, USA）のEcoRI部位にクローン化した。各宿主株に対して得られたクローンの中から所望の大きさの断片を有する少なくとも２つのクローンを選択した。次に、得られたクローンを培養し、Imp.999株の完全なゲノムを含むプラスミドを標準的なプラスミド調製および精製法によって少容量（２ｍｌ）または大容量（２５０ｍｌ）に精製した。
Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988
ブタサーコウイルス Imp.999株のゲノムのクローン化
制限酵素EcoRIを有するＰＣＶ Imp.999株の２本鎖複製型の消化で生じた約１．８ｋｂｐの制限断片を市販のQiagen kit（QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK）を用いて１．５％アガロースゲル（実施例３参照）上で電気泳動で分離した。次に、このEcoRI−EcoRI制限断片を標準クローン化法（非特許文献３１）によって予め同じ制限酵素を用いて消化し、脱リン酸したベクターpGEM-7（Promega, Medical Supply Company, Dublin, Ireland）と結合した。得られたプラスミドを標準的方法によってEscherichia coli JM109宿主株（Stratagene, La Jolla, USA）に変換した。同じく、ＰＣＶ Imp.999株のEcoRI−EcoRI制限断片をベクターpBlueScript SK+（Stratagene, La Jolla, USA）のEcoRI部位にクローン化した。各宿主株に対して得られたクローンの中から所望の大きさの断片を有する少なくとも２つのクローンを選択した。次に、得られたクローンを培養し、Imp.999株の完全なゲノムを含むプラスミドを標準的なプラスミド調製および精製法によって少容量（２ｍｌ）または大容量（２５０ｍｌ）に精製した。
Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988
実施例１０
ＰＣＶ Imp.999株のゲノムＤＮＡの配列（２本鎖複製型）
２つのEcoRI Imp.999のクローン配列（クローンpGEM-7/2およびpGEM-7/8）をメーカー推薦の方法で配列キット"AmpliTaq DNA polymerase FS"（Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK）および"Applied BioSystems AB1373A automatic sequencing apparatus"を用いてSangerのジデオキシヌクレオチド法で決定した。最初の配列反応はM13「前方」および「後方」自在プライマーを用いて実施した。続く配列反応は「ＤＮＡ歩行」法によって実施した。その後の配列に必要なオリゴヌクレオチドはLife Technology（Inchinnan Business Park, Paisley, UK）によって合成された。
ＰＣＶ Imp.999株のゲノムＤＮＡの配列（２本鎖複製型）
２つのEcoRI Imp.999のクローン配列（クローンpGEM-7/2およびpGEM-7/8）をメーカー推薦の方法で配列キット"AmpliTaq DNA polymerase FS"（Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK）および"Applied BioSystems AB1373A automatic sequencing apparatus"を用いてSangerのジデオキシヌクレオチド法で決定した。最初の配列反応はM13「前方」および「後方」自在プライマーを用いて実施した。続く配列反応は「ＤＮＡ歩行」法によって実施した。その後の配列に必要なオリゴヌクレオチドはLife Technology（Inchinnan Business Park, Paisley, UK）によって合成された。
得られた配列は集め、MacDNASIS version 3.2のソフトウェア（Cat # 22020101, Appligene, Durham, UK）を用いて分析した。各種の読み取り枠を"National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)サーバーで入手可能なBLAST algorithmを用いて解析した。
クローンpGEM-7/8（配列ＩＤ番号６）から最初に得られた完全な配列（EcoRI-EcoRI）は図１３、１４に表してある。この配列はEcoRI部位のＧの後に任意に始まり、ヌクレオチドに関してはいくつか不安定な部分を有している。
次いで、この配列が最適化された。配列ＩＤ番号３（図９〜１４）はこの株の配列を全て表しており、EcoRI部位の始めすなわち最初のヌクレオチドとしてＧから任意に始まる。
クローンpGEM-7/8（配列ＩＤ番号６）から最初に得られた完全な配列（EcoRI-EcoRI）は図１３、１４に表してある。この配列はEcoRI部位のＧの後に任意に始まり、ヌクレオチドに関してはいくつか不安定な部分を有している。
次いで、この配列が最適化された。配列ＩＤ番号３（図９〜１４）はこの株の配列を全て表しており、EcoRI部位の始めすなわち最初のヌクレオチドとしてＧから任意に始まる。
同様の方法本発明の他の３つの分離株の配列を得た（配列ＩＤ番号１、２、４および図１〜４および図７、８参照）。これら４つの株のゲノムの大きさは下記の通りである：
Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．９９９ １７６８個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１０ １７６８個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５ １７６７個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．９９９ １７６８個のヌクレオチド
Ｉｍｐ．１０１０ １７６８個のヌクレオチド
実施例１１
ＰＣＶ Imp.999株の配列の分析
Imp.999株から得られた配列をGenBankのデータバンクに収容された配列との相同性テストで用いた結果、検出された有意な相同性はＰＫ／１５株の配列（寄託番号Y09921）（図９〜１２参照）と約７６％の相同性であった。
データバンク（NCBIサーバーのBLAST X algorithm）を用いた６つのフェーズでの配列の翻訳の相同性テストでは、アミノ酸レベルで、GenBank U49186配列でコードされるプラント（GenBank番号1841515）のサーコウイルスに類似のＢＢＴＢウイルスの理論的レプリカーゼに対応する読み取り枠と９４％の相同性を示すということが分かった。
ＰＣＶ Imp.999株から得られた配列と有意な相同性を示すものはデータバンクに収容された他の配列にはなかった。
多機能萎縮症候群の臨床的徴候を示すカリフォルニアの子豚から得られた病変部を用いて培養されたImp.999株から得られた配列のには解析から、この単分離ウイルスが新規なブタサーコウイルス株であることが明らかになった。
ＰＣＶ Imp.999株の配列の分析
Imp.999株から得られた配列をGenBankのデータバンクに収容された配列との相同性テストで用いた結果、検出された有意な相同性はＰＫ／１５株の配列（寄託番号Y09921）（図９〜１２参照）と約７６％の相同性であった。
データバンク（NCBIサーバーのBLAST X algorithm）を用いた６つのフェーズでの配列の翻訳の相同性テストでは、アミノ酸レベルで、GenBank U49186配列でコードされるプラント（GenBank番号1841515）のサーコウイルスに類似のＢＢＴＢウイルスの理論的レプリカーゼに対応する読み取り枠と９４％の相同性を示すということが分かった。
ＰＣＶ Imp.999株から得られた配列と有意な相同性を示すものはデータバンクに収容された他の配列にはなかった。
多機能萎縮症候群の臨床的徴候を示すカリフォルニアの子豚から得られた病変部を用いて培養されたImp.999株から得られた配列のには解析から、この単分離ウイルスが新規なブタサーコウイルス株であることが明らかになった。
実施例１２
配列の比較分析
新規な４つのＰＣＶ株のヌクレオチド配列とＰＣＶのＰＫ／１５株の配列（図９〜１２）とを整列比較した。新規な４つの株と公知のＰＫ／１５株とに関する相同性マトリクスを作成した。結果は下記の通りである：
１：Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１
２：Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５
３：Ｉｍｐ．９９９
４：Ｉｍｐ．１０１０
５：ＰＫ／１５
配列の比較分析
新規な４つのＰＣＶ株のヌクレオチド配列とＰＣＶのＰＫ／１５株の配列（図９〜１２）とを整列比較した。新規な４つの株と公知のＰＫ／１５株とに関する相同性マトリクスを作成した。結果は下記の通りである：
１：Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１
２：Ｉｍｐ．１０１１−４８２８５
３：Ｉｍｐ．９９９
４：Ｉｍｐ．１０１０
５：ＰＫ／１５
２つのフランス株Imp. 1011-48121とImp. 1011-48285の相同性は９９％以上（０．９９７７）である。２つの北米株Imp. 999とImp. 1010の相同性も９９％以上（０．９９４９）以上である。フランス株と北米株との相同性はわずかに９６％以上である。
これら全ての株とＰＫ／１５株との相同性は７５〜７６％の値に落ちる。
このことから、本発明の株はＰＫ／１５株に代表される種類とは異なる新規なブタサーコウイルスの代表であると言える。ＰＫ／１５がタイプＩを表すのに対し、ＰＭＷＳ症候群を示すブタから単離されたこの新規な株をタイプＩＩのブタサーコウイルスとよぶことにする。このタイプＩＩに属する株は実際には非常に離れた地理的領域から単離されたにもかかわらず、驚くべきヌクレオチド配列の相同性を示す。
これら全ての株とＰＫ／１５株との相同性は７５〜７６％の値に落ちる。
このことから、本発明の株はＰＫ／１５株に代表される種類とは異なる新規なブタサーコウイルスの代表であると言える。ＰＫ／１５がタイプＩを表すのに対し、ＰＭＷＳ症候群を示すブタから単離されたこの新規な株をタイプＩＩのブタサーコウイルスとよぶことにする。このタイプＩＩに属する株は実際には非常に離れた地理的領域から単離されたにもかかわらず、驚くべきヌクレオチド配列の相同性を示す。
実施例１３
新規なＰＣＶ株のゲノムによってコードされるプロテインの分析
Imp.1010単離株のヌクレオチド配列は多機能性萎縮症候群に関する他のサーコウイルス株を代表するものと考えられる。この配列をBLASTX algorithm（非特許文献３２）と、ソフトウェアMacVector 6.0（Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK）のプログラムとを組み合わせを用いて詳細に分析した。この配列（環状ゲノム）上には２０個のアミノ酸より大きいサイズの読み取り枠（またはＯＲＦ）が１３個検出できた。この１３個のＯＲＦは下記の通りである：
Altschl et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410
新規なＰＣＶ株のゲノムによってコードされるプロテインの分析
Imp.1010単離株のヌクレオチド配列は多機能性萎縮症候群に関する他のサーコウイルス株を代表するものと考えられる。この配列をBLASTX algorithm（非特許文献３２）と、ソフトウェアMacVector 6.0（Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK）のプログラムとを組み合わせを用いて詳細に分析した。この配列（環状ゲノム）上には２０個のアミノ酸より大きいサイズの読み取り枠（またはＯＲＦ）が１３個検出できた。この１３個のＯＲＦは下記の通りである：
Altschl et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410
各ＯＲＦの開始位置および終了位置は株１０１０のゲノムの図７、８に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦ１〜１３の端部は株９９９と同一である。これらは下記ＯＲＦ３と１３を除き、株１０１１−４８１２１および１０１１−４８２８５とも同一である：
ＯＲＦ３ １４３２−１５３９、センス、１０８ｎｔ、３５ａａ
ＯＲＦ３ ３１４−１３７７、アンチセンス、７０５ｎｔ、２３４ａａ
これら１３のＯＲＦの内で４つがクローン化ウイルスＰＣＶ ＰＫ／１５のゲノム上に位置する類似のＯＲＦと有意な相同性を有する。多機能性萎縮症候群に関連するサーコウイルス単離株全てのゲノム上に存在する読み取り枠をそれぞれ分析した。これら４つのＯＲＦは下記の通り：
ＯＲＦ３ １４３２−１５３９、センス、１０８ｎｔ、３５ａａ
ＯＲＦ３ ３１４−１３７７、アンチセンス、７０５ｎｔ、２３４ａａ
これら１３のＯＲＦの内で４つがクローン化ウイルスＰＣＶ ＰＫ／１５のゲノム上に位置する類似のＯＲＦと有意な相同性を有する。多機能性萎縮症候群に関連するサーコウイルス単離株全てのゲノム上に存在する読み取り枠をそれぞれ分析した。これら４つのＯＲＦは下記の通り：
各ＯＲＦの始めと終わりの位置は図７、８に表された配列（配列ＩＤ番号４）を参照する。ＯＲＦの大きさ（ヌクレオチド=ｎｔで）は終止コドンを含む。
ＰＣＶ Imp. 1010とＰＣＶ ＰＫ−１５の単離株のゲノム機構の比較からから、２つのウイルスのゲノムに保存された４つのＯＲＦが同定できた。下記の表は観察された相同性の程度を表す：
ＰＣＶ Imp. 1010とＰＣＶ ＰＫ−１５の単離株のゲノム機構の比較からから、２つのウイルスのゲノムに保存された４つのＯＲＦが同定できた。下記の表は観察された相同性の程度を表す：
最大の相同性はＯＲＦ４ Imp. 1010とＯＲＦ１ ＰＫ−１５との間に見られた（８６％相同性）。このプロテインはおそらくウイルスのＤＮＡ複製に含まれ、ウイルスの複製に必須であるため、このことは予想されることである（非特許文献３３）。
ＯＲＦ１３ Imp. 1010とＯＲＦ２ ＰＫ−１５との間の配列同一性は余り強くない（６６．４％の同一性）が、この２つのＯＲＦはそれぞれ、鳥サーコウイルスＣＡＶ（非特許文献３４）の主構造プロテインのＮ−末端領域と同一な良く保存されたＮ−末端基本領域を有している。さらに、ＯＲＦ７ Imp. 1010とＯＲＦ３ ＰＫ−１５との間と、ＯＲＦ１０ Imp. 1010とＯＲＦ４ ＰＫ−１５との間に大きな違いが見られた。ＰＣＶ ＰＫ−１５のＯＲＦ３とＯＲＦ４と比較すると、それぞれにImp. 1010分離株のＯＲＦ７とＯＲＦ１０のＣ−末端領域に欠失がある。最大の配列相同性はＯＲＦ７／ＯＲＦ３（重複部分の水準において６１．５％の相同性）とＯＲＦ１０／ＯＲＦ４（重複部分の水準において８３％の相同性）のＮ−末端領域の水準において見られる。
Meehan et al., Gen. Virol. 1997,78; 221-227；Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 381-384 Meehan et al., Arch. Virol. 1992, 124. 301-319
ＯＲＦ１３ Imp. 1010とＯＲＦ２ ＰＫ−１５との間の配列同一性は余り強くない（６６．４％の同一性）が、この２つのＯＲＦはそれぞれ、鳥サーコウイルスＣＡＶ（非特許文献３４）の主構造プロテインのＮ−末端領域と同一な良く保存されたＮ−末端基本領域を有している。さらに、ＯＲＦ７ Imp. 1010とＯＲＦ３ ＰＫ−１５との間と、ＯＲＦ１０ Imp. 1010とＯＲＦ４ ＰＫ−１５との間に大きな違いが見られた。ＰＣＶ ＰＫ−１５のＯＲＦ３とＯＲＦ４と比較すると、それぞれにImp. 1010分離株のＯＲＦ７とＯＲＦ１０のＣ−末端領域に欠失がある。最大の配列相同性はＯＲＦ７／ＯＲＦ３（重複部分の水準において６１．５％の相同性）とＯＲＦ１０／ＯＲＦ４（重複部分の水準において８３％の相同性）のＮ−末端領域の水準において見られる。
Meehan et al., Gen. Virol. 1997,78; 221-227；Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 381-384 Meehan et al., Arch. Virol. 1992, 124. 301-319
ブタサーコウイルスのゲノム構造はゲノムが極端に高密度であるため非常に複雑であるように見える。主構造プロテインはおそらくブタサーコウイルスゲノムの同じ鎖上に位置する複数の読み取り枠間のスプライシングに由来するものである。従って、上記の表に記載の全ての読み取り枠（ＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３）でタイプＩＩのブタサーコウイルスにコードされた抗原プロテインの全てまたは一部を表すことができ、これらは特有の病気および／またはワクチン接種に使用可能な抗原である。本発明はこれらのＯＲＦを少なくとも１つ含む全てのプロテインに関するものである。本発明は主としてＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１０またはＯＲＦ１３で構成されるプロテインに関するものである。
実施例１４
新規な株からクローンされたＰＣＶゲノムの感染特性
Imp. 999単離株の完全なゲノム（複製型）を含むプラスミドpGEM-7/8をMeehan B. 達に記載の方法によってＰＫ／１５細胞に形質移入した（非特許文献３５）。未感染のＰＫ／１５細胞に形質移入した後の最初の継代に対して実施された免疫抗体法の分析（実施例４参照）から、クローンpGEM-7/8のプラスミドは感染性ＰＣＶウイルスを誘導することが示された。感染性ＰＣＶの遺伝物質を含むクローンが利用可能になったことによってウイルス性ゲノムに任意の有用な処置をして無毒化ワクチンまたは組み換えワクチンを製造し、或いは診断キット用抗原を製造することができ、変成ＰＣＶウイルス（ブタで無毒化または欠失）を製造することができるようになった。
Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome gragments. Arch. Virol. 1992, 124. 301-319
新規な株からクローンされたＰＣＶゲノムの感染特性
Imp. 999単離株の完全なゲノム（複製型）を含むプラスミドpGEM-7/8をMeehan B. 達に記載の方法によってＰＫ／１５細胞に形質移入した（非特許文献３５）。未感染のＰＫ／１５細胞に形質移入した後の最初の継代に対して実施された免疫抗体法の分析（実施例４参照）から、クローンpGEM-7/8のプラスミドは感染性ＰＣＶウイルスを誘導することが示された。感染性ＰＣＶの遺伝物質を含むクローンが利用可能になったことによってウイルス性ゲノムに任意の有用な処置をして無毒化ワクチンまたは組み換えワクチンを製造し、或いは診断キット用抗原を製造することができ、変成ＰＣＶウイルス（ブタで無毒化または欠失）を製造することができるようになった。
Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome gragments. Arch. Virol. 1992, 124. 301-319
実施例１５
インビトロ培養によるＰＣＶ抗原の製造
感染していないＰＫ／１５細胞の培養およびウイルス処置を実施例１と同じ方法で実施した。感染細胞を３７℃で４日間培養後、トリプシン処理し、回収し、命名した。次の継代は１ｍｌにつき４００，０００個の感染細胞を接種した。
インビトロ培養によるＰＣＶ抗原の製造
感染していないＰＫ／１５細胞の培養およびウイルス処置を実施例１と同じ方法で実施した。感染細胞を３７℃で４日間培養後、トリプシン処理し、回収し、命名した。次の継代は１ｍｌにつき４００，０００個の感染細胞を接種した。
実施例１６
ウイルス性抗原の不活化
ウイルス培養の最後に、感染した細胞を回収し、超音波（Branson Sonifier）またはロータースタータータイプのコロイドミル（UltraTurrax, IKA）を用いて溶解した。次に、懸濁液を３７００ｇで３０分間、遠心分離した。このウイルス懸濁液を+３７℃で１８時間、０．１％エチレンイミンで、或いは、+２８℃で２４時間、β−プロピオラクトンで不活化した。ウイルス価が不十分な場合にはウイルス懸濁液を３００kDaのメンブレン（Millipore PTMK300）を用いた限外濾過で濃縮した。不活化ウイルス懸濁液は+５℃で貯蔵した。
ウイルス性抗原の不活化
ウイルス培養の最後に、感染した細胞を回収し、超音波（Branson Sonifier）またはロータースタータータイプのコロイドミル（UltraTurrax, IKA）を用いて溶解した。次に、懸濁液を３７００ｇで３０分間、遠心分離した。このウイルス懸濁液を+３７℃で１８時間、０．１％エチレンイミンで、或いは、+２８℃で２４時間、β−プロピオラクトンで不活化した。ウイルス価が不十分な場合にはウイルス懸濁液を３００kDaのメンブレン（Millipore PTMK300）を用いた限外濾過で濃縮した。不活化ウイルス懸濁液は+５℃で貯蔵した。
実施例１７
有機油をベースにしたワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液 ： ２５０ｍｌ
MondanＩＤe（商標登録）ISA 70（SEPPIC) : ７５０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソン・タービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約１０7.5のTCＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉経路の投与量は２ｍｌである。
有機油をベースにしたワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液 ： ２５０ｍｌ
MondanＩＤe（商標登録）ISA 70（SEPPIC) : ７５０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソン・タービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約１０7.5のTCＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉経路の投与量は２ｍｌである。
実施例１８
代謝可能な油ベースのワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液： ２００ｍｌ
Dehymuls HRE 7（Henkel) : ６０ｍｌ
Radia 7204（Oleofina) : ７４０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソン・タービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約１０7.5のTCＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉内経路の投与量は２ｍｌである。
代謝可能な油ベースのワクチン乳剤の製造
下記処方でワクチンを調製した：
不活化ブタサーコウイルス懸濁液： ２００ｍｌ
Dehymuls HRE 7（Henkel) : ６０ｍｌ
Radia 7204（Oleofina) : ７４０ｍｌ
水相および油相は濾過によって別々に滅菌した。この乳剤はシルバーソン・タービン乳化機を用いて各成分を混合し、均質化して調製した。
一回のワクチン投与量は約１０7.5のTCＩＤ50を含む。皮膚経路の一回のワクチン投与容量は０．５ｍｌ、筋肉内経路の投与量は２ｍｌである。
実施例１９
過免疫血清（ＰＣＶ−Ｔ）、ＰＫ／１５から調製されたモノクローナル抗体Ｆ９９およびカナダ株から調製された過免疫血清（ＰＣＶ−Ｃ）で汚染されたアメリカおよびフランスのＰＣＶウイルス株およびＰＫ／１５の間接免疫抗体法の結果
過免疫血清（ＰＣＶ−Ｔ）、ＰＫ／１５から調製されたモノクローナル抗体Ｆ９９およびカナダ株から調製された過免疫血清（ＰＣＶ−Ｃ）で汚染されたアメリカおよびフランスのＰＣＶウイルス株およびＰＫ／１５の間接免疫抗体法の結果
Claims (29)
- タイプＩＩのブタサーコウイルス（circovirus）の精製物。
- ＥＣＡＣＣに下記寄託番号で寄託された精製物から成る群の中から選択されるブタサーコウイルスの精製物：
寄託番号第Ｖ９７１００２１９号
寄託番号第Ｖ９７１００２１８号
寄託番号第Ｖ９７１００２１７号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０８号
寄託番号第Ｖ９８０１１６０９号。 - ＰＭＷＳ症候群のブタの生理標本または組織標本、特に病変部から分離されるブタサーコウイルスに感染したインビトロ細胞培地の細胞で産成され、単離されたブタサーコウイルスの精製物。
- ブタの腎臓株細胞で産成され、単離される請求項３に記載のブタサーコウイルスの精製物。
- ＰＣＶに汚染されていないＰＫ／１５細胞で産成され、単離される請求項４に記載のブタサーコウイルスの精製物。
- 請求項１のサーコウイルスに感染した細胞のインビトロ細胞培地から集められた培養抽出物または上澄み。
- 請求項１に記載のサーコウイルスに感染した細胞のインビトロの細胞培地から集められた抗原製剤。
- 抗原としてブタサーコウイルスを含む請求項７に記載の抗原製剤を含むワクチンまたは請求項６に記載の培養の上澄みまたは抽出物。
- 無毒化した生の全抗原を獣医学上許容される賦形剤または希釈液中（必要に応じて獣医学上許容される補助剤およびフリーズドライ安定剤をさらに含むことができる）に含む請求項８に記載のワクチン。
- 抗原が不活性化されており、ワクチンが獣医学上許容される賦形剤または希釈液（必要に応じて獣医学上許容される補助剤を含むことができる）を含む請求項９に記載のワクチン。
- 下記配列群の中から選択される配列を含むＤＮＡ断片：
配列ＩＤ番号：１
配列ＩＤ番号：２
配列ＩＤ番号：３
配列ＩＤ番号：４
配列ＩＤ番号：６ - ＯＲＦ１〜１３から成る群の中から選択されるＯＲＦを含むＤＮＡ断片。
- ＯＲＦ４，７，１０および１３から成る群の中から選択されるＯＲＦを含む請求項１２に記載のＤＮＡ断片。
- 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片でコード化されたポリペプチド。
- 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列または断片がゲノム中に組み込まれ、インビトロで発現可能なインビトロ発現ベクター。
- E. coliおよびバキュロウイルスの中から選択される請求項１５に記載の発現ベクター。
- 必要に応じて精製された、請求項１５または１６に記載の発現ベクターによって製造されたポリペプチド。
- 獣医学上許容される賦形剤または希釈液（必要に応じて獣医学上許容される補助剤をさらに含むことができる）中に請求項１４または１７に記載のポリペプチドを少なくとも１つ含むサブユニットワクチン。
- 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載ＤＮＡ配列または断片がゲノム中に組み込まれ、インビボで発現可能なインビボ発現ベクター。
- ブタには病原性ではなく、ブタで増殖可能な生ウイルスとプラスミドの中から選択される請求項１９に記載の発現ベクター。
- ウイルス性ベクターがアウジェスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス等のブタヘルペスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ブタポックスウイルス等のポックスウイルスから選択される請求項２０に記載の発現ベクター。
- 獣医学上許容される賦形剤または希釈液中に請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む生ワクチンまたはプラスミド。
- 請求項１〜４に定義の複数のブタサーコウイルスの抗原を含む請求項８〜１０、１８および２２のいずれか一項に記載のワクチン。
- ブタの他の病原体に対応する少なくとも１つの他のワクチン価を有する請求項８〜１０、１８、２２、２３のいずれか一項に記載のワクチン。
- ＰＲＲＳ、Mycoplasma hyopneumonia、アクチノバシラス胸膜肺炎菌、E. coli、ブタ萎縮鼻炎、仮性狂犬病、ブタコレラ、ブタインフルエンザから成る群の中から選択される少なくとも１つの他のワクチン価を有する請求項２４に記載のワクチン。
- ＰＲＲＳおよびMycoplasma hyopneumoniaから成る群の中から選択される少なくとも１つの他のワクチン価を有する請求項２４に記載のワクチン。
- 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の配列の全てまたは一部を含むプローブまたはプライマー。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載のサーコウイルス、請求項１４または１７に記載のポリペプチド、またはこれらの断片から調製されるモノクローナル抗原またはポリクローナル抗原。
- テストするブタの生理学的液体標本または組織標本で抗原の存在をテストし、抗原自体またはこの抗原に対する抗体を検出するブタサーコウイルスの検出方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR97/12382 | 1997-10-03 | ||
| FR9712382A FR2769321B1 (fr) | 1997-10-03 | 1997-10-03 | Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostics |
| FR98/00873 | 1998-01-22 | ||
| FR9800873A FR2769322B1 (fr) | 1997-10-03 | 1998-01-22 | Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostic |
| FR9803707A FR2776294B1 (fr) | 1998-03-20 | 1998-03-20 | Nouveaux circovirus porcins ; vaccins et reactifs de diagnostic |
| FR98/03707 | 1998-03-20 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007254101A Division JP4680245B2 (ja) | 1997-10-03 | 2007-09-28 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011135875A true JP2011135875A (ja) | 2011-07-14 |
| JP5362750B2 JP5362750B2 (ja) | 2013-12-11 |
Family
ID=27253376
Family Applications (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000515010A Expired - Lifetime JP5008218B2 (ja) | 1997-10-03 | 1998-10-01 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
| JP2007254101A Expired - Lifetime JP4680245B2 (ja) | 1997-10-03 | 2007-09-28 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
| JP2011004965A Expired - Lifetime JP5362750B2 (ja) | 1997-10-03 | 2011-01-13 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
| JP2012060619A Ceased JP2012193179A (ja) | 1997-10-03 | 2012-03-16 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
| JP2014255849A Expired - Lifetime JP5869658B2 (ja) | 1997-10-03 | 2014-12-18 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000515010A Expired - Lifetime JP5008218B2 (ja) | 1997-10-03 | 1998-10-01 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
| JP2007254101A Expired - Lifetime JP4680245B2 (ja) | 1997-10-03 | 2007-09-28 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012060619A Ceased JP2012193179A (ja) | 1997-10-03 | 2012-03-16 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
| JP2014255849A Expired - Lifetime JP5869658B2 (ja) | 1997-10-03 | 2014-12-18 | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6368601B1 (ja) |
| EP (4) | EP1019510B1 (ja) |
| JP (5) | JP5008218B2 (ja) |
| KR (4) | KR100736129B1 (ja) |
| CN (2) | CN101724606B (ja) |
| AT (3) | ATE245191T1 (ja) |
| AU (1) | AU756554C (ja) |
| BR (1) | BR9812845B1 (ja) |
| CA (1) | CA2305623C (ja) |
| CY (3) | CY1110359T1 (ja) |
| DE (7) | DE05014998T1 (ja) |
| DK (4) | DK1019510T3 (ja) |
| ES (4) | ES2246001T3 (ja) |
| FR (1) | FR05C0021I2 (ja) |
| HK (1) | HK1095161A1 (ja) |
| HU (2) | HU226247B1 (ja) |
| NL (1) | NL300326I2 (ja) |
| PL (1) | PL198506B1 (ja) |
| PT (4) | PT1741785E (ja) |
| UA (1) | UA78180C2 (ja) |
| WO (1) | WO1999018214A1 (ja) |
Families Citing this family (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6391314B1 (en) * | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
| FR2781159B1 (fr) * | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
| US7211379B2 (en) * | 1997-10-03 | 2007-05-01 | Merial Sas | Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2 |
| US7192594B2 (en) * | 1997-10-03 | 2007-03-20 | Merial Limited | Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs |
| US20060029617A1 (en) * | 1997-10-03 | 2006-02-09 | Charreyre Catherine E | Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use |
| US6517843B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
| US20040062775A1 (en) * | 1997-12-05 | 2004-04-01 | Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments | Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD) |
| FR2772047B1 (fr) * | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| RU2000118777A (ru) * | 1997-12-11 | 2002-07-10 | Университи Оф Саскачеван (Ca) | Вирус синдрома мультисистемного истощения свиньи у поросят-отъемышей |
| EP1816200B1 (en) | 1997-12-11 | 2016-03-09 | Merial | Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs |
| US6497883B1 (en) * | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
| US6943152B1 (en) * | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
| ES2170622B1 (es) * | 1999-12-03 | 2004-05-16 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
| JP2004503234A (ja) * | 2000-06-15 | 2004-02-05 | パーデュー・リサーチ・ファウンデーション | ブタの先天性振せん用ワクチン |
| US7018638B2 (en) * | 2000-12-19 | 2006-03-28 | Wyeth | Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine |
| DK1379671T3 (da) * | 2001-03-27 | 2009-06-29 | Univ Saskatchewan | Fremgangsmåder til dyrkning af circovirus |
| US6706523B2 (en) | 2001-07-20 | 2004-03-16 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Attenuated rabies virus with nucleoprotein mutation at the phosphorylation site for vaccination against rabies and gene therapy in the CNS |
| US7279166B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| US7276353B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-02 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| ME00810B (me) * | 2002-08-26 | 2012-03-20 | Zoetis Services Llc | Vakcina za infekcije respiratornog i reproduktivnog sistema kod stoke |
| KR20040021988A (ko) * | 2002-09-06 | 2004-03-11 | 서상희 | 바이러스 증식용 돼지 신장 상피 세포주, 및 이의 용도 |
| UA95602C2 (ru) | 2004-12-30 | 2011-08-25 | Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. | Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции |
| US7700285B1 (en) | 2005-12-29 | 2010-04-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| US7833707B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
| US8834891B2 (en) | 2005-03-14 | 2014-09-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis |
| KR101369656B1 (ko) * | 2005-04-13 | 2014-03-04 | 메리얼 리미티드 | 돼지 써코바이러스 제조 방법 및 제조 모니터링을 위한검정법 |
| EP1792996A1 (en) * | 2005-12-01 | 2007-06-06 | Consejo Superior de Investigaciones Cientificas | Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| JP5394750B2 (ja) * | 2005-12-29 | 2014-01-22 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド | 多価ｐｃｖ２免疫原性組成物及び当該組成物を製造する方法 |
| MX338626B (es) | 2005-12-29 | 2016-04-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Uso de una composicion inmunogenica de pcv2 para producir los sintomas clinicos en cerdos. |
| KR100870077B1 (ko) * | 2006-10-27 | 2008-11-25 | 권영득 | 이유후 전신소모성증후군(ｐｍｗｓ)의 치료용 복합제조성물 |
| WO2008073464A2 (en) | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections |
| PL2481420T3 (pl) | 2006-12-15 | 2019-08-30 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Jednodawkowa szczepionka anty-PCV2 dla świń |
| EP1941903A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
| EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
| DK2155246T3 (da) * | 2007-05-11 | 2013-04-02 | Temasek Life Sciences Lab Ltd | Fremstilling af en homogen cellelinje højtolerant til porcine circovirus type 2 (pcv2)-infektion |
| KR100948127B1 (ko) * | 2007-06-27 | 2010-03-18 | 주식회사 중앙백신연구소 | 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물 |
| US20090017064A1 (en) * | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Wyeth | Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus |
| US7829274B2 (en) * | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
| ME01156B (me) * | 2007-12-21 | 2013-03-20 | Zoetis Services Llc | Postupci i kompozicije za imunizaciju svinja protiv svinjskog cirkovirusa |
| CN101932336B (zh) * | 2007-12-31 | 2014-07-09 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 有外来氨基酸插入的pcv2 orf2病毒样颗粒 |
| CN101980720A (zh) | 2008-01-23 | 2011-02-23 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法 |
| TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| TWI508974B (zh) | 2010-12-22 | 2015-11-21 | Sbc Virbac Ltd | 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用 |
| EP2564869A1 (en) | 2011-09-02 | 2013-03-06 | Ceva Sante Animale | Synthetic capsid proteins and uses thereof |
| EP2789346A1 (en) | 2013-04-11 | 2014-10-15 | CEVA Santé Animale SA | Fusion polypeptides and vaccines |
| WO2014182872A1 (en) | 2013-05-08 | 2014-11-13 | Protatek International, Inc. | Vaccine for pcv2 and mycoplasma |
| BR112016006192A2 (pt) | 2013-09-25 | 2017-09-26 | Zoetis Services Llc | composição de vacina de divergente de pcv2b e métodos de uso |
| ES2778425T3 (es) | 2013-10-02 | 2020-08-10 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Variante de la proteína ORF2 del PCV2 y partículas similares a virus compuestas por esta |
| CN104383527A (zh) * | 2014-11-18 | 2015-03-04 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种猪圆环病毒2型灭活冻干疫苗的制备方法 |
| EP3034609A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-22 | Ceva Sante Animale | Recombinant swinepox virus and vaccines |
| US9944904B2 (en) | 2015-05-14 | 2018-04-17 | Merial Inc. | Method for porcine circovirus production and PCV2 vaccines |
| EP3254692A1 (en) | 2016-06-10 | 2017-12-13 | Ceva Sante Animale | Multivalent recombinant spv |
| US20200390878A1 (en) | 2017-12-08 | 2020-12-17 | Ceva Sante Animale | Recombinant swinepox virus and vaccines |
| EA202092216A1 (ru) | 2018-03-26 | 2021-06-11 | Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. | Способ получения иммуногенной композиции |
| JP2021527073A (ja) | 2018-06-11 | 2021-10-11 | セヴァ サンテ アニマレＣｅｖａ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ | ブタサーコウイルスに対するワクチン接種 |
| KR102124260B1 (ko) * | 2018-10-19 | 2020-06-26 | 대한민국(관리부서 질병관리본부장) | 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 콜레라균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 |
| MX2023001024A (es) | 2020-07-24 | 2023-02-15 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vacuna porcina combinada. |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| US4740468A (en) | 1985-02-14 | 1988-04-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Concentrating immunochemical test device and method |
| US5030558A (en) | 1986-11-07 | 1991-07-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Qualitative immunochromatographic method and device |
| US5232835A (en) | 1986-11-07 | 1993-08-03 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Qualitative immunochromatographic method and device |
| CA1303983C (en) | 1987-03-27 | 1992-06-23 | Robert W. Rosenstein | Solid phase assay |
| EP0560411B1 (en) | 1987-04-27 | 2000-07-26 | Unilever N.V. | Specific binding assays |
| US4855240A (en) | 1987-05-13 | 1989-08-08 | Becton Dickinson And Company | Solid phase assay employing capillary flow |
| US5120643A (en) | 1987-07-13 | 1992-06-09 | Abbott Laboratories | Process for immunochromatography with colloidal particles |
| IE60950B1 (en) * | 1987-09-28 | 1994-09-07 | Beecham Inc | Inactivation of viruses and bacteria |
| ATE165516T1 (de) | 1989-03-21 | 1998-05-15 | Vical Inc | Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren |
| FR2649013B1 (fr) | 1989-07-03 | 1991-10-25 | Seppic Sa | Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable |
| US5141850A (en) | 1990-02-07 | 1992-08-25 | Hygeia Sciences, Inc. | Porous strip form assay device method |
| ES2112274T5 (es) | 1990-05-29 | 2006-03-01 | Wyeth Holdings Corporation | Vacuna contra la pneumonia en cerdos y metodo para la preparacion de la misma. |
| US5238652A (en) | 1990-06-20 | 1993-08-24 | Drug Screening Systems, Inc. | Analytical test devices for competition assay for drugs of non-protein antigens using immunochromatographic techniques |
| US5565205A (en) | 1990-08-16 | 1996-10-15 | Solvay Animal Health, Inc. | Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof |
| US5266497A (en) | 1990-08-31 | 1993-11-30 | Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. | Immunochromatographic assay with improved colored latex |
| US5451504A (en) | 1991-07-29 | 1995-09-19 | Serex, Inc. | Method and device for detecting the presence of analyte in a sample |
| JPH07501049A (ja) | 1991-10-14 | 1995-02-02 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | ブタ生殖・呼吸系症候群ワクチン及び診断方法 |
| US5338543A (en) * | 1992-02-27 | 1994-08-16 | Ambico, Inc. | Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
| DE9204303U1 (de) | 1992-03-30 | 1992-06-25 | Marx, Günter Wolfgang, 7953 Bad Schussenried | Trainingsgerät |
| EP0571648A1 (en) | 1992-05-26 | 1993-12-01 | Chung-Nan Weng | Vaccine protecting against mycoplasmal pneumonia |
| US6592873B1 (en) * | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
| FR2700957B1 (fr) | 1993-01-29 | 1995-03-03 | Seppic Sa | Composition de vaccin sous-unitaire recombinant vivant et procédé de préparation. |
| ES2152304T3 (es) | 1993-02-08 | 2001-02-01 | Bayer Ag | Procedimiento para el crecimiento del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino y su uso en vacunas. |
| FR2702373B1 (fr) | 1993-03-08 | 1996-06-07 | Rhone Merieux | Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable. |
| EP0620277A1 (en) | 1993-03-18 | 1994-10-19 | Merck & Co. Inc. | Nucleic acid pharmaceuticals |
| ES2074950B1 (es) | 1993-09-17 | 1996-03-16 | Iberica Cyanamid | Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda. |
| DE69536091D1 (de) | 1994-01-27 | 2010-09-09 | Univ Massachusetts Medical | Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit |
| ES2165405T3 (es) * | 1994-04-11 | 2002-03-16 | Akzo Nobel Nv | Cepas de vacuna europeas del virus del sindrome reproductor y respiratorio porcino (prrsv). |
| CA2196865C (en) * | 1994-08-05 | 2001-07-03 | Karl P. Schneider | Self-chamfering drill bit |
| FR2781159B1 (fr) * | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
| FR2772047B1 (fr) * | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| RU2000118777A (ru) * | 1997-12-11 | 2002-07-10 | Университи Оф Саскачеван (Ca) | Вирус синдрома мультисистемного истощения свиньи у поросят-отъемышей |
| KR100298125B1 (ko) * | 1999-04-15 | 2001-09-13 | 정명식 | 구리의 화학 증착에 유용한 유기 구리 전구체 |
-
1998
- 1998-01-10 UA UA2000042372A patent/UA78180C2/uk unknown
- 1998-05-21 US US09/082,558 patent/US6368601B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 DE DE05014998T patent/DE05014998T1/de active Pending
- 1998-10-01 ES ES02017134T patent/ES2246001T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 PT PT50149988T patent/PT1741785E/pt unknown
- 1998-10-01 CN CN200910252636.4A patent/CN101724606B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 EP EP98946547A patent/EP1019510B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 ES ES98946547T patent/ES2203984T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 EP EP03016998A patent/EP1386617B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 ES ES03016998T patent/ES2302885T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 HU HU0003756A patent/HU226247B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 1998-10-01 AT AT98946547T patent/ATE245191T1/de active
- 1998-10-01 EP EP05014998.8A patent/EP1741785B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 AT AT03016998T patent/ATE387914T1/de active
- 1998-10-01 PL PL339631A patent/PL198506B1/pl unknown
- 1998-10-01 DK DK98946547T patent/DK1019510T3/da active
- 1998-10-01 DE DE69830858T patent/DE69830858T4/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 KR KR1020007003628A patent/KR100736129B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-10-01 DE DE200512000009 patent/DE122005000009I1/de active Pending
- 1998-10-01 HU HU0800330A patent/HU230340B1/hu unknown
- 1998-10-01 CA CA002305623A patent/CA2305623C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 KR KR1020087004310A patent/KR100904852B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-10-01 DE DE69816460T patent/DE69816460T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 KR KR1020067010174A patent/KR100854615B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-10-01 BR BRPI9812845-0A patent/BR9812845B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-10-01 DK DK02017134T patent/DK1281760T5/da active
- 1998-10-01 PT PT98946547T patent/PT1019510E/pt unknown
- 1998-10-01 DK DK03016998T patent/DK1386617T3/da active
- 1998-10-01 CN CN98810652A patent/CN100584948C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 WO PCT/FR1998/002107 patent/WO1999018214A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1998-10-01 EP EP02017134A patent/EP1281760B9/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 PT PT03016998T patent/PT1386617E/pt unknown
- 1998-10-01 AT AT02017134T patent/ATE299531T1/de active
- 1998-10-01 AU AU93555/98A patent/AU756554C/en not_active Expired
- 1998-10-01 DK DK05014998.8T patent/DK1741785T3/da active
- 1998-10-01 KR KR1020097009112A patent/KR100944144B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-10-01 ES ES05014998.8T patent/ES2524359T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 DE DE69830858A patent/DE69830858D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 PT PT02017134T patent/PT1281760E/pt unknown
- 1998-10-01 JP JP2000515010A patent/JP5008218B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-01 DE DE122008000069C patent/DE122008000069I1/de active Pending
- 1998-10-01 DE DE69839227T patent/DE69839227T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-04-26 FR FR05C0021C patent/FR05C0021I2/fr active Active
- 2005-10-07 CY CY20051101221T patent/CY1110359T1/el unknown
-
2007
- 2007-01-31 HK HK07101074.0A patent/HK1095161A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-09-28 JP JP2007254101A patent/JP4680245B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2007-12-18 NL NL300326C patent/NL300326I2/nl unknown
-
2008
- 2008-06-03 CY CY20081100583T patent/CY1108113T1/el unknown
-
2011
- 2011-01-13 JP JP2011004965A patent/JP5362750B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-03-16 JP JP2012060619A patent/JP2012193179A/ja not_active Ceased
-
2014
- 2014-11-13 CY CY20141100947T patent/CY1115749T1/el unknown
- 2014-12-18 JP JP2014255849A patent/JP5869658B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6007010700; Ｔｉｓｃｈｅｒ Ｉ， Ｍｉｅｌｄｓ Ｗ， Ｗｏｌｆｆ Ｄ， Ｖａｇｔ Ｍ， Ｇｒｉｅｍ Ｗ．: 'Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ．Ｔｉｓｃｈｅｒ Ｉ， Ｍｉｅｌｄｓ Ｗ， Ｗｏｌｆｆ Ｄ， Ｖａｇｔ Ｍ' Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．， （１９８６） ９１， ｐ．２７１-２７６ Ｖｏｌ．９１， Ｎｏ．３-４, 1986, ｐ．２７１-２７６ * |
| JPN6007010701; Ｎａｙａｒ ＧＰ， Ｈａｍｅｌ Ａ， Ｌｉｎ Ｌ．: 'Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉ' Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．， （Ｊｕｎ．１９９７） ３８， ｐ．３８５-３８６ Ｖｏｌ．３８， Ｎｏ．６, 199706, ｐ．３８５-３８６ * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5869658B2 (ja) | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 | |
| JP4749547B2 (ja) | ブタサーコウイルスおよびパルボウイルスワクチン | |
| US6391314B1 (en) | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents | |
| RU2283862C2 (ru) | Цирковирус свиней типа ii и его применение | |
| AU2002302120B2 (en) | Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents | |
| MXPA00003263A (en) | Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120209 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120918 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121109 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130402 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130610 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130806 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130904 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |