HU230340B1 - Újonnan izolált, sertésből származó cirkovírusokból származó szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok és ezeket tartalmazó vakcinák - Google Patents

Újonnan izolált, sertésből származó cirkovírusokból származó szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok és ezeket tartalmazó vakcinák Download PDF

Info

Publication number
HU230340B1
HU230340B1 HU0800330A HUP0800330A HU230340B1 HU 230340 B1 HU230340 B1 HU 230340B1 HU 0800330 A HU0800330 A HU 0800330A HU P0800330 A HUP0800330 A HU P0800330A HU 230340 B1 HU230340 B1 HU 230340B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
expression vector
vector according
seq
acid sequence
expression
Prior art date
Application number
HU0800330A
Other languages
English (en)
Inventor
Gordon Allan
Brian Meehan
Edward Clark
John Ellis
Deborah Haines
Lori Hassard
John Harding
Gilles Emile Chappuis
Francis Mcneilly
Catherine Elisabeth Charreyre
Original Assignee
Merial
The Queen's University Of Belfast
University Of Saskatchewan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27253376&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU230340(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from FR9712382A external-priority patent/FR2769321B1/fr
Priority claimed from FR9800873A external-priority patent/FR2769322B1/fr
Priority claimed from FR9803707A external-priority patent/FR2776294B1/fr
Application filed by Merial, The Queen's University Of Belfast, University Of Saskatchewan filed Critical Merial
Publication of HU0800330D0 publication Critical patent/HU0800330D0/hu
Publication of HU230340B1 publication Critical patent/HU230340B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0321—Propionic acid bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0323—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin using only lactic acid bacteria, e.g. Pediococcus and Leuconostoc species; Bifidobacteria; Microbial starters in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16741—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16743—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/10064—Methods of inactivation or attenuation by serial passage

Description

A találmány szerótti megoldás előnyösen alkalmazható PCV-feriézmel összefoggő midéiíenességek megelőzéséi és ke zeiésém
K'V-í emdedleg .isem-eitopatogőn sz&rmyeződéskórá detektáltak PX/1 ó-jelit, sertésvesébő; származó .sejtvonai\ .«no i t ,<' ·! >ke \o<. \O > ta> , A.x'otr.?,’ t te’u\> a--5 tev o ©e \\ anv v i et
Artaemia Vsru») és PBfDV'Virussal {.üPscittacine Beák and Festhet Disease Vinte'} együtt.. Kis, nent-becsomagelt urusfote 24 ínat, amiknek alkdanos mliem/ej», tmgs geoomml 1,'e 2 M 1.0 muoht, esteid.ne, eg\szálé DNS formájában tartalmazza. Eleinte azt gondolták. hogy ez a genom körülbelül 30 kDa mérető polipep>dzt \ ,\a pl ki i ' M '..Ó V, 1 > Í Ő I k ,o 3 \ kt , . \ ,i C í- I ><. i Oss 'g ,·, ' tgmtergei'tel \,m \<·» tMertem B te <>. ettem , I vms terel te 2.\Í'X,'M les.fopa vaiti-tetemk - e nte bino» tezigiíilákátís isomotógia a Jtakleobdazekveserák között, vagy nátes: közös ateigéndelemtmásts a.három. etrkovsras-sptistein.
\ !> \ 1' m U \ < r ·«, > ' \ \ i, \ ,\ ,b >. N \ <· ι Λ \1 \k \t λ n ístarsat ir« iák te {J, Górt, Visel, 78, 221-227 0777)(, Csák igen friss teásokban nébády szerző állítja. hogy a PCV-tŐszsek pátogéoek lehetsek, és PMWtesziüötőtőávid asszociállak l'Gttpi P.S. Nayar ós sátsáL, Ca Vet. .1. 38. 385-237 0777); és Gfoík E, G,. Prbe. Am, Assoe, Steítse Práé, 477-501 (.lW?jj, Nayar és teonkatárste PCV-DN'S-t PCRleehnikák alkaliíatzásávakáotektáiiak PMWb-szIridréitiábaíi szenvedő sertésekben. Vad őgosd PCV-torzset odóig azonban w# izoláltak és tisztítottak.
A. PMWS-szitterőmsi kóstedáhtm, az U8 A-bass és .FtatíOiaotezágban detektálták és iokozatök tőtssegvesztés, és példázd szapora légzés, nehéz légzés és sárgaság rriegoMlteőidíisávte jellemeztek klítekskag. Patológiai szsmpottibol lissioedjkas vagy grasmiomás mEltráeiokéní, liőitádebepátiákéíti és ritkábban Itep&titiszkéíti és límfoeltikos vagy gtanulótnás óeíriiiszkéitt üvílvátlid tttég (Clark E, G„ Pröö, Atte Assoe, Stvitze Frae. 479-301 {197?g La Sentaine Vétérsnade No. 26, suppletoeoi La Sentaine Vétórinaite'>-ho2 S.d- 857 (177?t; Gépi P. S Nayar és nFtet,C,m tea á ϊ\
Cit ej Pite - törzse· líkiiíiií mM.'livtsik kzssadai, Ι’^Ά-ΟνΟ i kalitka·.! z* e» tkm,i seraaigi (Brrtam t ünnvkívl szártnazó,. tüdő vagy gatigiiotiálís iteMákből, srteiyefeet tt továbbiükbaa s feírasbati taláknaBy szentet eitköviíB' soknak nevez&nk. Ezeket a zhúsokat PMWS-szindrőmában szenvedő sertésekben előforduló sérülésekben detektáltok, de egészséges sértésékbtm nem.
l»i ibka ivet! um-ek koad ncg'.nek >zektuubak a gee.otsgat, όΆη?ί m kanatethvl es l S k teé, \ thiiote kot 1ίθΌ„ΒΌ<agted s.a'u.azo .evs \ fomsek namot e e\ őröket megbaLdo hon\< oviét un.anvo egymással stikleotid-szteien, és kisebb rnériékik körüibelte 7633-oa homölégíát ínotattt&k a PKi 1 S-terzzseL Az áj törzseket így áj tiptisú, «tésHI ázármszó· cífkovfrusok képvmlöinek tekinthetjük, melyeket a leírásban II. taposnak hívunk, tóig: 321. típust s Ffe/l 5 képviseli,
A találmány tárgyát tehát a fentebb definiáltak szerint, IL tipu.su, sertésből szármázd csrkevirusekböl származés szekvenesákat tartalmazó evpresszíöa vektorok képezik,
A találmány táí'gyköréfíez tartozik bármilyen olyan settésetedeía eiskovirus, amelyet FMWS-szind.rómáfeán szenvedő sertésből származó Ijzieléglaí mintabői vagy szövetmintából tehet izolálni, különösen sérülésekbők főleg a példákban leírt eljárást követve, különösen II. íipusti eükovirus,
A tsláímsrsy tárgya konkrétabban meghatározva. öt törzsből tisztítöft preparátum, amelyeket az ECÁCC-hs® (Essnpean Cofteodou oí CeH Culíures, Centre fór Applied Mierotiiológy & Peseareh, Portón lóösva, Salisbíity, Wtkshire SP4 (Uö, Egyesült Királyság) deponáltank 1997. október 2-án, esöíörtökös:
nyilvántartási száné: V97'100239 fa leírásba» Intp, iöÖkPCV-nek sevezzük), nyilvájítartási szám: ¥971.002 Iá (a leírásban Isnp, KH9PCV-nek nevezzük), nyilvántartási szám: V97I90217 (a leírásban hap, 999PCV-nek nevezzük}» és amelyeket 599b, január lö-áu, pénteken deponáltunk:
Rviivámartási száén: V9891 főbb (a leírásban írn.p. 591ϊ-48285-nek nevezzük), nyiivásíartás! szám: V9kÖliőö9 (a leírásban Itnp. KH 1-49121 -aek nevezzük).
A tsüáümány tárgykoréhoz tartozónak tekintjük azokat a sertésből származó cirkovirusokat, amelyeket beteg v te<-\ 1 í <<k tik <\k í < k'^ ' .bek \ a t > s v wii -o- ' ic\V te köznek a. találmány szerinti törzsekkel, -éstvagy azokat a cirkövirusokaí, mételyek sziringeas körülmények között képesek keresztinhrkbzáiíb a faláltlráay szerinti törzsekkel, Így tehát nincs hibridizáció a PCV-PK/f S-törztzsél. FMWS-szindrőmáhan szenvedő sertésből származó fiziológia! iróniából vagy szövetmintából, különösen sérti lésekből Izolált vinsstörzsek előnyösen szaporhhatök sejtvonalakon, például elsősorban seríésveséböl származó védvonalakon, különösen szennyeződéstől mentes PK/ló-sejíekbot? (főleg PCV. valamim pestivfrusok, sertésből származó sáenovlrnsok és sertésből származó panovirusek esetén) íbiszaporiíásuk céljából vagy speciálisan antigén termeltetése céljából, egész antigén (például vírus) és/vagy alegységek (például polípeptidek) íbrrnájában, Nagyon szokatlanul és váraikmni, ezek az izoláínmok nagyon teímelékenynek bizonyultak tet w*· et\ tl'K «5sojteken, amelyek kétségtelenül előnyösek vi'tus vagy antigén elöálbtására, különöseit inskiiváit vakcina elöáltitksára, .A találmány tárgyköréin::·: nntozoak sejtekre passzálás mán izolált eirkovfrrss-preparáíumok is, különösen sejtvonalakra, például PK/tÓ-seitekm, melyeket bs váor? tenyésztünk, miközben megfertőzünk a taláimány szerinti legalább egy efekovitnssak vagy bármilyen olyan sertéseredefü eirkcvírussal, amelyet PMWS-szindrömában szenvedő sertésből származó fiziológiai mintából vagy szövetmintából lehet Izolálni, különösen sérülésekből. Szintén A találmány tárgyköréhez: tartozik, a tenyészetből előállított eytrak.tmn vagy léiülüszó, adott esetben standard íeemakákkaf tisztítva, és általában bármilyen anügeníkus preparátum, melyeket m vám tenyészetekből áliirunk elő.
Színién a találmány tárgyköréhez tartoznak az a fentebb definiált immunodért hatóanyagok és legalább egy antigént tsHalmazo vakeijták.
Lehetnek legyengített, élő, teljes vírusokra alapuló, isnsnunogérs hatóanyagok, vagy ezen hatóanyagokkal eiőáb btott vakmák, amelyben a legyesgitést szokásos eljárások szenet végezzük, például sejtekre passzálással, előnyösen Sertéseredciü sejtekre pssszálássab ktil.önösea seiívoaalakra, például .ΡΚ/75-selíekre (például 59-159, * *
A.» •5különösen lö'Ő-as nagyságrendű :passa:álásőkkalj., Ezek a vakcinák általában.állatorvosi szempontból elfogadható segédanyagot vagy hígítódért tartalmaznak, adott esetben .állatorvosi azempotrfoöl elfogadható adjuváost, va· lamlni adott esether- Ifoislizáiáslsoz stabilizáló Szert.
Ezek a vakcinák előnyösen 1 0'-1 0° TClD5Ö-et tartalmaznak.
Lehetnek a találmány szerint feltárt elrkovirns-anilgénre aiapahk unmonotógiadag aktív hatóanyagok vagy vakcinák, Inaktívák állapotban, A vakcinák állatában állatorvosi szetapotúból elfogadható segédanyagot vagy hlgitószert tartalmaznak, továbbá átlőtt esetben állatorvosi szempontból elfogadható adiuváast.
A találosásy szerint feltárt eirkoviresokat, az esetleg jelenlévő frakciókkal, szakember által Ismert technikákkal inítköválluk, Az ioaktlválásí előnyösen kémiai úton végezzük, poklául az antigént: kémiai ágens, például ióretaldebtil (formailag p&rafonaaídehid, β-propiolakton vagy etüén-imin vagy származékaik hatásának tesszük ki, Az inaktiválásra alkalmazott hdairaárty szerint előnyös módszer kémiai ágens, különösen etiléo-nnin vagy β-propjolakfon alkalmazása,
A találmány tárgyköréhez tartozó inaktívak vakcinákat előnyösen kiegésziíhetjűk adinvártssal. így azokat előnyösen emiilrivk m ferewtjul', például oiz a? obiban' vagy „okit a \ tzben lomtára borúik szakember áltál jól ismert technikák. szeréit Az atljavátts-felaidouság származfeth onnan is, hogy egy szokásos adjuváss-komponeast beépítünk a hatóanyagba.
Az aikttírmizhafo adjuvánsok között megemlíthetjük példáid az ahmbibsun-hidroxídot, a szappanokat Ipéldsnl Quiiiaja saponm vagy Outi A; lásd „Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach 11995}, szerk, \l A n í l'ouel ami Μ.Έ J \eon\m y\ unm fom* VaLD .tud 1 '«dér ’P oldj ksidncö p \uc eme Design’ 148. old.}, DDA-t {dkuebl-dfoktadecií-sfiutfortium-bromid, „Vaccise Design” 157. old.}, pohfesz·· iázént („Vacolse Design” 204. old,), vagy tnás módszer szerint, ásványi olajra alapuló „olaj a vízben'- emulziókat (például SPT-omuIzfot, „Vaceise Design” '14?. old.}, szkvalént (például MF59, „Vaccine Design” 183. old.}, vagy nret&boíizáih&tó olajra alapuló ..víz az olajban emulziókat (előnyösen WO-AADDÖO? I. sz. nemzetköz! \ κ . e nts. vtoamim: az o ~ ‘re \ > v \ he j sbu sím u -bt is«\ s.n st ut «unokát, Adjuvsns-kombfoáeiókni is lehet választat». például Avridme@-t vagy DDA-t egy emulzióval kombinálva.
Ezek a vakcinák előnyösen I. Öft- 10s TCÍI)50-et tartalmaznak.
Elő vakcitta-adjovánsokat azok közül lehet választású, .amiket megadtunk az inaktivák vakcináim vonulko.wm. Az: emulziókat részesítjük előnyben. Az inaktlvált vakcinákra leírtakhoz még hozzávehetpik a A ti A-'D Innál, sz. nemzetközi közzétételi iratban leírtakat.
Eioítlizáláslioz alkalmazott stabilizáló szerként megemlíthetjük például SPDA-í [Eovaírés. és mtsai., .1, Baéíeri·· ' ' > >' Ά E lói >, κ í pi fon,, - ,. ?' o «5» rt O k<'íi ·. V i U '.ac Μίλζ do^r'nt v. i \ >11\ ·> !
fohérjéket például albummt vagy kazeint, ezen vegyüietek származékait, vagy púdereket, például alkálifémfoszlatokat.
Előállítottuk a négy izotánmfoét származó genomot, melyeket l-4„ és adott esethess ö. azonosítószámú szekvenciaként azonosítottunk.
A találmány tárgya ennélfogva ezen szekvenciák egyikének egészéi vagy részéi tartalmazó DNS-fragmens. Küldő említés nélkül, automatikusan a találmány tárgyát képezik ekvivalens szekvenciák, azaz olyan szekvenciák, amelyek nem változtatják meg & leírt .szekvenciák vagy ezen szekvenciák által kódolt poligeptidek funkcióját vagy törzs-spéci Irtását, Természetesen a találmány tárgyát képezik a kódon degenerátlsága következtében eltérő szekvenciák.
» * :
♦« ί„. A
Sünién a tóáhuány tárgyát képezik ekvivalens szekvenciák abban az énefemben, hogy nagymértékben sztringens körülmények között képesek hibridlzáiódni a fenti szekvenciákkal és/vagy nagymértékű homológjával ren•«feikeznefe a találmány szerinti törzsekkel, és a fentebb öedniáít: Π. csoporthoz tartoznak.
Ezek a szekvenciák és íragmenseik előnyösen alkalmazhatók poilpeptldek i« viíro vagy ;« ww· expremáiására, meg telelő vektorok segítségévei.
Konkfémn, a találmány szerinti DNS-fmgmeaseket kialakító, a (feniI célokra· alkalmazható nyitott leolvasást fázisokat azososiíoíinnk 11, tlpusá eh'kovfruxok genond szekvenciákig. A találmány tárgyköréhez tartozik bármilyen poíipeptíd, amely ezen nyitott leolvasási fázisoknak megtelek) aminosav-szekvenclák közöl legalább egyet tartalmaz, A találmány tárgyköréhez tartozik előnyösen olyan lekérje, amely lényegében ORF4-böí, ORO-böi, □Rí· 10-óőí vagy Okéi s-bői száímazik.
Alegységek fe vitra expresszálása eéljábób az expresszié eszközeként előnyösen £, co/rt vagy. bacnktvihísl alkaitnaxmfe (4.745.051. szántó USA-beíi szabadalmi leiráss, .Fragmenseik kódoló szekvenciáját (szekvenciáit) baeolovirns-geuomba integráíjnk (példáni .4«og«g>Áö nuieáds pohheörozis tárasba, AcNFV), és ez
Ptófcbií azután rovarsej teken szaporítjuk., pékiául ójJOíhgrteíO St0~en (ATCC CKI, 171 i -ként .deponálva). Az alegységeket enkaóóta sejtekben is termeltethetjük, például élesztőben (például Őő'czáíz.-orfjyí'i's i-ozev/nzíe) vagy emlős sejtekben (például Cl IC, B11K t.
A találmány tárgyköréhez, tartoznak olyan pehpoptidek is, amelyek ezekkel az expressziós eszközökkel fe tdírp termeltethetek, és azután adott esetben szokásos technikákkal meg vannak tisztítva. A találmány tárgyköréhez tartoznak alegység-vakcinák is, amelyek lega'áhh egy,, így előállított pollpepftdeí vagy ivagutertst tartalmaznak, állatorvosi szempontból elfogadható segédanvaebno vagy higliósaeíbem és adott esetben állatorvosi szempontból elfogadható adtuvánsí,
Rehem blnárss elő vaké itták előállítása céljából, ót vivő expresszióra a kódoló szekvenciát (szekvenciákat) vagy Iragmcnsctket megfelelő expressziös vektorba inszerláííuk olyan körülmények között, hegy az lehetővé tegye a pollpeplíó(ek) evpresszsöját, Alkalntas vektorként alkuim ázhatunk élő virnsokat, előnyösen sertésekben szaporodni képes, sertésekre ncm-patogéti városokat (természetes körülmények között nem patogén, vagy ilyenné van alakítva), szakember által jói ismert technikák szerint Különösen sertésből származó herpeszvírnst, például az Aujeszky-f'éle betegség vírusát, sertésereöeiü adenovintst, himlővlrust, külöttöseo íohéókímiö-Yinssí, madáfhitttiö-virust, kanáríhnolő-vsrust vagy sertéshímíö vírust alkalmazhatunk. Vektorként plazsmo-feNS-ekcí ;s alkat' mázhatunk (W'O-A-óÖ.· j 1092., WO-A-bJ/ibblJ . WÜ-A-94'2t?9? , WÖ-A-ÓSTVöóÖ. sz. nemzetközi koszénteli irat szerint).
\ üli mt's tt eve'\Zpeus onte gtiuuh lottxek'O'kv rexo'rt'‘ü^e o \ak ma» v-ö p zm'ov \ einák (polinukleottd- vagy DNS-vakcinák) Is. amely vakcinák továbbá állatorvosi szempontból elfogadható segédanyagot vagy hígitöszert íartshnaznak,
A találmány szerinti vakcinák félő legyengkeit, inakíivált, alegység, rekombináns és pkizmidvakcinák) a találmány szeműi, egy vagy több (2. vagy ő) arkovintóhól származó, egy vagy több hatóanyagot (antigént) tartalmazhatnak,
A lentebb leüt egyes vakcinátipusok esetén, a találmány szerinti megoldás lehetőséget biztosit kombinációs \akcm,is wa is sertesertcet'-í <. rkotsrusok ellen, nuo serk^-pategrurg Alen' v ekemben, a, cgym kukm-'svn olyanok ellen, amelyek PMSW-szlodrómávai asszociáltak. A találmány szerinti vakcinák, különösen az Inaktsváít vakolnák ezért tartalmazhatnak más seriés-patogénrek megfelelő, másik valenciát, őzen más sertés5 <·♦ Ο
-spaíogének közűi előnyösen megemltibeti ük a PRES-t {„Pereme Repreductory and Respiratoty Svndrome. aaaz < e-\. Α>'·\ ' \ ’·<· w» ^λ». vw)) nsz mes--'ok h \ v,t'<x Ü A \ v. g \ fe W0’A-94'Ö83P1, sz. nemzetközi közzétételi iratokat; FR-A-2 707 766. sz. francia közzétételi iratot; C. Chareyre és tatsai., „Procevdings oftbe 15-a IPVS Cosgress, Birmingham, Ertghutd, 1:978. jólius 5-9,, 139, oki, me', <. \ i ί k \ <i ' s , v\ t ( í í <’ > <>),'>> u s t-<< htn búrod·· ' cl> t\ t -< <
sok: EP-A-597 852-, EP-A-55Ö 477.,, EP-A-571 648. az.· európai krlzzefeieií. iratok; „Ptcceediitgs of áss 15“' IPVS Cengres's-hen O. Maximon és sötsai,, 157., 284., 285. oki, és G, Reyrtaud és rntsai., 150. oki, xtrelyete: a kitaudas részének tekintünk). Más. jelentős valenciák 'közül még ütegemliíhesjok »to?t, F í-'o/tt, sertésbö! származó Atrophic thmíríst {servadásos ortnyálkahártya-gyulladásl) és Pseudorahiest (veszeöséget, Aujes:zky«iéJe betegséget), sertéskolerát és sertésirtfiuext'/At.
A taMtarimy tárgyköréhez. tartozik egy eljárás is immunválasz iadnkátásm sertésekben, a találmány .szerinti cirkovinísok elten.. A találmány tárgya különösen -sertésekben hatékony, vakét náexős eljárás,.
Az eljárásban sertéseknek beadnák a lentebb leírt vakcinából egy vagy több eöagot. A fentebb leírt vakcinák közül kvntbmalm ís n<4ui»« tmost, uroanabban j vakcináét, ebaxa'baf!
Az-eljárásban nemcsak kifejlet: sertéseknek adunk be vakcinát, hanem Patai sertéseknek vagy vemhes nőstényeknek is. Ez utóbbiak vakcinácioja pozitív immunitást biztosíthat az újszülötteknek (anyai ellenanyagok).
A találmány szerint leltárt megoldás lehetőségei biztosit a találttiány szerinti cixkovírusok teknietexk diugnosztizálásártt is sertésekben. Tehát A találmány tárgyköréhez·: tartoznak, ide vonatkozó diagnos/txlat tesztek. es eljárások, a lentebb leirt.reagenskésaletek alkalmazásával, .A különb»''/»' ea'Ao «tusok .uekvencunuk i&mexete lehetővé teszt közös,-szekvenciák definiálását, amely lehetővé tesz vaiaíoeuoyi ismert, sertáseiredéiő cirkovirust fölismert» képes reagensek előállítását.
Szakember arra Is képes, hogy olyas szekvencia*- fragmenseket -szelektáljon:, amelyek a megfelelő Pfi/I.S eitkovtVos-szekvenciával kisiífertékd bomoíógiát mutató: régióknak vagy homológját nem mutató régióknak feleinek meg, specifikus diagnózis· elvégzésé céljából.
Szekvenciák egymás- alá rendezése szakember számára lehetővé tesz igény szer lati reagens szelektálását Az .első reagensnek megfelelnek a tatáhnáoy szerinti DNS-szekvenciák és fragmémei, amelyeket elsősorban próbaként vagy láncinditö nhgonuklcet idkém alkalmazunk jól ismert hibridizációs vagy PCR-techrtikákban t'polimsráz láncreakcióban),
A ofesodik reagensnek azok a poöpephdek felelnek, meg. atneh eket .von \ ooss/ok’. enctak k»x\»’nak, »<?pv vektor (lásd föntebb) segítségévei czprosszálódtak, vagy kémiai óién lettek vmtcn/ahz stuka»»'*. peppdszoí'éz.isre szolgáló technikák szerint,
A harmadik, és· negyedik reagenst a megfeleld poliklonális és monok lónál is. cllenato aguk jelentik, .amelyeket a vírus, a poiipeptidek vagy Iragtrtersselk alkalmazásával fertnefiethefimk, extrabálhatunk szokásos technikák sze.ríni, vagy & DNS-szekvenciák kódolhatják azokat.
Ezért második, harmadik és negyedik -reagenst olyan diagittí,«etikai eljárásban alkalmazhatjuk, amely .A saláímány tárgyköréhez tartózik, amelyben egy tesztet hajtunk végre tesztelendő sertésből vett fiziológiai folyadékítűsőáA (vér, plazma, szérum és hasonlók) vagy szövetmintán (iőegdüc, máj:, tüdő, vese és hasonlók) a találmány szerinti cirkovimsta specifikus aoiigép jelenlétére úgy, hogy megkíséreljük detektálni magái az antigént, vagy ezért antigénre specifikus eilenaayag<>k.at.
A találmány szerinti antigéneket és ellenanyagokat bfeailyext ismert iaheraferiumi diagüf's/nku teclunkuban a* «* *:·* * idkaünazhafjnk.
Mindazonáltal előnyösen alkalmazhatjuk azokat olyan technikákban, amelyeket közvetlenül állatorvos, az állatik tenvvagy tub(«Ionosa .dkahn.tz a tensC^ztonch^n.. Szakember számára sok, különféle iahozaióritmü es »eo>csXs'h.‘lyen eheg<./be?.o tevhmko all undetUzesre. ea etmélfogvit tökéletes helyzetben van ahhoz, hogy a, anugentes \ag> ellenanyagokat timgnes/nkrtí veageoskcm: való alkalmazásra adaptálja..
Λ találnám} keretet kozott dooyosvn alkaitnazhato diagnosztikai technikák lehetnek: Wesíens-blottoiás, rm:m.irbluore<zenem. KI IS.-* es irrsmunktomatográéa
Immunkromatogtáftás módszerek alkalmazásának tekintetében, szakembernek szók) hivatkozások főleg az tlsObsak' Kokon 1' Zotk es unsto , Ckn t fent ál ?, i t-W-lbn <jogySi v-fentiru «zabadahnt letrasnk es lx <cLvess- Ib’UtVU WC \ Ά ',2',’s s. nemeiken ke, vteíe ; ',κ,ηΛ lF\?s\ l”o i 8 \
428., Kk-A-29i 194., KF-A-284 282. sz. európai közzétételi írások, 5.I2Ö.642,, 5,038.558., 5,266.497, 4.740.468, 5:260,49?.. 4.855.240, 5.451.584,, 5,141.850, 5,222.825. és 5.238.652, sz. USA-bek szabadalmi leírások.
Ennek megfelelően. a mintában előnyösen megkísérelünk speclflkos ellenanyagokat detektálni közvetett teszt, kompetlelö vagy leszorítás alkalmazásával. Ennek elvégzése céljából magát az antigént alkalmazzuk diagnosztikai reagensként, vagy ezen antigén olyan fragmeosét, amely megőrizte az ellenanyag általi iellsmerhetöségét. A jelölést előnyösen peroxidázzal vagy speciál is jelölővek előnyösen kollöidálts arannyal végezzük.
Az is kívánatos lehet, hogy magát az antigént detektállak a mintában. ezen antigénre speclftkos, jelölt elicnanyag.-segítségével. Az előnyös jelölési a fentebb leírtak szerint végezzük.
Főleg kcamelieíöban vagy leszorításban vagy magának az antigénnek detektálásában alkalmazott. az antigénné speetbkus ellen,msagon az anttgéare «pecotkus monokíonáhs saej pohklerahs ,'Ilonám,ag>óm, ezen ellen· anyagok fragmenselt, előnyösen Pah- vagy F(ábjb-fragsseascket énünk.
A találmány másik vonatkozásában, A találmány tárgyköréhez tartozik eljárás a találmány szerinti antigénre specifikus polikimádís vagy nnutokíonáils •elllemmyag' előállítására, amely lehetővé teszi, begy azután ezeket az ellenanyagokat lóként diagnosztika? reagestskéni alkalmazzuk fiziológiai shiyadökhan vagy szövetmintában lévő antigéstí detektálására, sót, ilyen: iróniákat? vagy tájban lévő ellenanyagok detektálására, A találmány tárgyköréhez tartoznak ezen ellenanyagok smnnmolőgíaitag működőképes fragmensei, különösen rab- vagy ktab}’;?Iragí&enset,
Ellenanyagokat ttzokásós technikák alkalmazásával lehet előáilüsni. Hivatkozásként lásd főleg: „Antifeödíes, A Eáhoraíory .Mattnál”, Cold Sodoz Harbor Laboratory (1988), USA, vagy ,1. vy (óxbng.,,ki emóciónál Astiboölv 1 s ja s k ? <' 1' ? ta.<. 4 u, F , u , <. k ni n s! s t 'nt)s »t>k íknu t, önmagában is ístnert eljárásban elsősorban olyan fúziót lehet végezni, amelyben az antigémtet vagy legalább cvs higmenses'eí mmtam/áh égésekből szemező tepsiteket fnzmnalunk .dk.dma.^mekmta-sejtekkel \ te'aboán', Lsígsko ebe' tntoztk v urte?.m, specifikus j«s> x klonabs \ags pefeloral \ <21 manvig<'k preparálátná is, előnyösen tiszta vagy részlegeseit tiszta, sőt akár nyers formában, különösen egérben vagy nyálban termelteted ellenanyagok,
A találmány szerinti megoldás lehetővé tesz kérdéses epkópok meghatározását Is, főleg a leírás szerbül DNSszekvenciák alapján, akár vakcina .szempontjából; jelentős;, akár diagnosztikai szempontból jelentős egííógokst. Szakember abban a helyzetben van, hogy a találmány szerinti üiíkovínt» gersongápak öNS-szekvenciájából képes meghatározót epiíépokat ismert módszerek szerint, például meglnielo számítógépes program vagy
--7PEESCAN alkalmazásávai, Az o^hópok fehérjék inzsstsiolégisíiag domináns- régtől és mint tlyea régiók, a fehérjék felszínén, kitett helyen lévő régiók. Ezért elfertanyagok képesek ezt felismerni,. és exért töfő-nö-sen sikálmasak diagnosztikai iettiíeten való télhasznáiásra, akár'-eiienanyagök elöólíüása céljából diagnosztikai· oélokm, i\ i íüU <. vk .ióíu» e 0uif 'sí i xtW V íg 0\ ín » fs X ife ’l fii í < Adm ! ni
Egt epuop legalább K-ví aminosjrboiaife pepiid Altdkdvm minimum 15-25 aniuiosdt eíofnes '•.'(kin b. i nhb< n a h, E ube3,'<fn Α>ά e u ,e<.Oi d.m A* u <. »αμΜ<\ skru tub Tct A ike.ev álló ísctókákat alkalmazva képes epltópokat találtn pepbdek vagy ellenanyagok diagnosztikai célokra való aikahnazására.
Λ -találmány tárgyköréhez tartozik diagtioszltkai reagenskészlci is. amely ez; az antigént étvágy ezen antigénre speerírkns. polikle-tsslis vagy montAlonális ellenanyagokat tartahoae. Ezek különösen olyan diagnosztikai reagenskészletek, átaelyek ntegfefelnek a fentebb leírt diagnosztikai technikáknak..
A tnlálnsány szerion tnegoldásl részletesebben példaként berotáaímt, előnyős megvalósítási módok segítségévei ismerte-lök, amelyekkel nem kívánjuk korlátozni az Igényeit ohaltni kört., és amelyekben az ábrákra hivatfcoz-n-k. amelyek;
1. ábra; Az ímp. lö l I -4kl21 -törzs gerjotslásak DNS-szekvenciája.
2. ábra; Az Irap. 101I-482h5-törzs genonjartak DNS-szekvenciája.
3. ábra: Az ímp,ü99~törzs genomjánsk DNS-szekvenelájn.
4. ábra; Az íorp.íülibiörzs genonzjásak DblS-szekvenciája, .§, ábra: Az 1-4, ábrák szerinti, 4 szekvencia és a ECV-EKA5-iötzs szfilívenctajának egymás alá rendezése, ó. ábra: Az Imp.ÜÓÓ-iörzs gcnontjának DK 8-szekvenciája, ahogyan sz élső. I'rapeiserszági benyújtás alkalmával definiáltok 190?. október 3-án.
7. ábra: A ö. ábrán lévő szekvencia és a EK I«- <' /\ szekvenciájának egymás alá -rendezése,
Szekvenciálist»:
1, azonosltöszáma. szekvencia: az bag,! ö 11 -48121 -törzs generojának DNS-szekvenciájn,
2, awsxoshészámá szekvencia: az bnp. lül 1 -48285-íörzs gesrentjának ÖNS-szekvenciája.
3. azonosítószántá szekvencia; az knp.ÖfeAtörzs genoipj ának fefeSs-szekvenciája.
4. azonositószároíi szekvencia; az Imp.lbtÖ-tbrzs genontjának DNS-szekveneíáta.
5, az-onositószánni szekvencia; a PKZ15-törzs genonijának ÖfeS-szek vé ne iája.
6. nzonosiíöszútnü szekvencia: az l'mp9§9-ldrzs. genotfeaaak DfeE-szekveneíála, ahogyan az első, trandaországt benyújtás alkalmával definiáltuk 199?, október 3-án.
?. péá&i
Ser£é s bid
A szevetmintákat Emnclaoíszághao, Kanadában es »' t A V-han gyüjlölfek baísl sertések tüdejéből és nyirokcsomóiból. Ezek a sertések elválasztás utáni, nttdüst .sztemás sorvadást szindróma tipikus kbnikai jeleit matatták. A vírusok izolálásának elősegítése céljából a szó vetőn utakat tegynsxioiöjk -?ö':C-;a közvetlenül a boncolás ttíás.
Vfeusízoláláshoz körülbelül 15% szövetmintát tsrisírnazö szsszpesziókat készítettünk Earie-fele sókat (EMEM, SloWhiUaker UK l.td.< Wokloghasn. klK), penieübnt t SOÖ líönü) és sztreptonüemt (löö pgönl) tartalmazó isi»#», A ί-% tűmül -tápkőzegben LMFM-SA-táptözeg}, és a szöveteket megőrültük steril homokkal, steril mozsarat és tőrőt dkalntazva, Ez; az őrtemény-preparíttímíot azotán felvettük MhAI-SA-Oar;, és azután centrifugálták 3000 g-n. 3Ö percig, 4oC-ou & feiőlásző kinyerése céljából, ?\ sejttenyészetek beoltása dcat 100 pl íéríogaiú kloroformot adtunk az egyes 2 mi térfogaté felülószókhoz, és folyamatosan kevsrtettok azokat -szóbaltőmérsékíeten: 10 percig.. A keveréket azután .«átvittük mikrocentríloga'·csövekbe, 3000 g-n eettóíög|huk. lő peréig, és dadán a feiöiószőt elkülönítettük, Azután ezt a fclüíászóí haszdátiuk oltásra a vlrasjzolálási kísértetekhez.
Valamennyi vírusizolálásl kísérletet, olyan ΡΚ/15-sejttenyészeteken végeztünk, amelyekről tudtuk, hogy nem íartahnazo&k seermyeződéskdd sertésből származó <;lrksmrust, (PCV), pestívírusökat, settesböl származó adeuovirusokat és sertésből származó parvo-virusohaf (Aiteít ö, és sufsai,. Vet. M'icrobsoL 44,49-64 (1995)], bertéseredsta eizkovwsok izolálását az alábbi tedisúka szedet hajtották végre;
Egyrétegű PICI5-sejteket tripszlnnol -dtsszoeiáitus (tripszis-verzért keverékkel) kondnens tenyészetekből és felvettük 1 S% magzati botjöszérötnef tartalmazó MEM-SÁ-tápkőzegben, amely nem volt sZeónyézétt peStfvírttssal f~ hfCM-G-tápkeccgb köraibeibl 40Q.9ÖO sejkml végkohceoíráciőbas, Azután ezen seltszuszpeszíóbál 0' -fe ahksdlmkuckm összeget értünk s Vmebh leső ottnasoagukb-d s/amtözO 2 tnl es ddootd.ikcd'dd. ;-.i see-o k. re „se-et n w .ertog'tu dx Ótokban sz, <e tc.iu- két Ά ue , ’Λλ <'Ο««.Μ\ ( λ ν,ο r ,e>\v •szereket azután 3?“C-oí3,15 óra hosszáig tnkabálsok 10% szás-dioxidot tartalmazó atmoszférában.
A betiltást után szemíkoítflaens,: egyrétegű sejték tenyésztési tápközeget 36Θ tnM D-glükőzatnlhnal (KatsZ. G48175, Sigma-Áldric'h Company Limited., Foole, UK.) kezelőik (Tisebr .1. és mtsai,, Areh. Vírol. 96, 39-5? í195?)], azután az inkabálávt további 45-72 óm hosszáig, folytattuk 3?*€-on, Ezen utolsó inkubálást kővetően, :az egyes oltóanyagokat tartalmazó, kél Fafeon-cső közül az egyikei 3 egymás utáni fitgyasztásV-felölvasztásh ciklusnak vetettük alá. A matmkk 1 .dcon-vsobeu 'eu' PK í^-xedCKe» tssm/mou-en-dustt d ke.wu* ,'o ml MEM-G-tépközegben felszuszpendáltuk, és azután ráoltoouk 95 cm-es Falc-ónra, 409.000 scjbml-cc koncentrálom 5 s\\x ! el o t e<. e s'. a ,s .isi \ ü'fe.tO/t A s d s he'<« .t< 1:,001-,0-,, Ábel , <s v?pd« megfelelő ifeátmn hozzáadásával.
A pcófe
VEÜJibndizádéval felül fertőzött, 5 snl Séribgatü szuszpenziót elkülönítettünk, és 55 mm átmérőjű Petri-csészébc.oltottuk, amely steril és zsírmentes, üveg fédőlemezl tartalmazott. A tenyésztőcdényekbea és az üveg; fedőlemezekea lévő tenyészeteket ST’C-o» tnkubáfek, és glíikózamlnnal kezeltük az I - példában leírtak szerint. Az üveg fédőtemezeken lévő tenyészeteket a glükőzanböos kezelés után. 24-45 órával dkalmníötmk és -nsáítuk aeetotmal, 10' peréig, szobahőmérsékleten, vagy 10% pofiért tartalmazó- formaldehiddel, 4-óra hosszáig; A fixálást kővetően valamennyi üveg-fedőtemezt -flKC-on, .ssálikagélen tároltunk kr Ahr hibridizációs kísérletekben vagy jmmuocítokénbal jelölési kísérletekben való felhasználás dö-t λ /feőfc £ElcS££klS15Í;kLd^ ’< >> 'i'xf-íős a <' bsti'g-'Vídscs'vd vagodA «> o\dde od\! η\„ { /;d,\o ο \ n -o n 'sze?-' s,\ <φ.
·φ· φ φ φ ΦΦ * ΦΦ
- 9 ..
<>5,» is ' ,t\ ne ,,ke, <' v ustoLisbu’ K> Whok (. Ásd ' 2 i'Ckn? e neg cd<detne,el-cn na
u.si?k.
ΡΚ./15-eirkovirusokrsok íB€Vj és lertőzö csirkeanéntia- vit-usnítk ;CAV.í roegieleió, ídjes genom) próbákat aikatmazumk. A pKlVl-plaztnidot [Meehan B. és sasai.. 1 Geo. VtroL 78, 221-227 (1997)1 alkalmaztuk, specifikus- virális DHS-tbrráskest rCV-re, amely plaxosld a. PC’V-geaosn repbkatlv iörtnáját t&stahnazta, egyetlen, 1,7' ktlöbázis-gklr (kbp) méretű inszert kírmágaba·: k lónozva. Madátetedelü cirkos-tus (CA V) repltkaüv formáját tan tekaazó, 2,3 khp méretű, analóg pCAAl-grlazmidot aikahnaztuak negatív kontrollként. A két plazmi-d u-egtéleló gheerhtss tőrzsoldatak alkalmaztak a plazmidok előállítására és tisztítására, aikaiikus lizistechnlka szerint {Sausbsook. .1. és latsai.,. 'Aloleeuhu dórikig: A I.ahotoíory Manoai, 2. kiadás, Coki Spring Harbor Laboratory, Coki Spring Harbor, New York (í 9S9}j, úgy, ángy szokat azután terop latként alkalmaztuk a próbák «iöáilüásá! \ ,k \ i - a t \\ te’-cnn»',n \er\í'.jo i. fK·· n.·, nobtsat a les i,b,> les-t s a <ο, Ham a A''- >»,' pg az egyes próbákra) és «tudom lárteindítö kevanokleotidokbői áilitonuk elé, kereskedeletríben elérhetik nem-radloaktiv jelölő reageaskészler:(„OIG DMA labeiltog kkC Boebrútger Mauatóta. I..ewes, UK) aíkaltnazásávak a. gyártó áltat ajsnknf eljárás szerint.
\ ó!,''-',); ·,! n - <!,> t ψ»\μ a' >« \b-hraffia,κbee s de ak tiitAza' t \ sed,k Ό 1 ,>« μϊ, trt s m Beteg sertésekből származó, paraffinba zárt és formaldehiddel Avdt tornákat, \.daennl fertőzött se-netw.s?elekből .származó. lorsrtaldehiddeí fixált preparátumokat az ainbbí teehtakt alk tinta?ásásul kesíueuíle.k ele PCYnaklelns&vak detektálására:
Paraffinba zárt, szövelblokkokból levágtunk 5 nm vastagságú szeleteket, pantflrmnentesítetlük, és azután re.i-ldrátáitok egyórás után olyas alkoholos oldatokban, amelyek csökkenő koncentrációban tartalmaztak alkoholt. Formaldehiddel fend szövet metszeteket és spittenyészetekef 15 percig vagy 5 percig, sorrendben, iakubáltonk 5*5. mM EDTA-t tartalmazó, 0,05 M Tris-d-ICi-pmíerben (pH Aői oldott, ÜAe«->\s pum-má>KOÍdab\tn. \ »átgyiemeseket azután antoklávozott, desztillált vizbeu oldott, 1Άο\ gb»'o«n-<'ldu»bA hd\e/»ok ?Ö n-'r-'re, kétszer mostuk 0.01 M PBS-pnfferrei (íesziat-purterok nátriutn-kiorsd oldat» {pH ~,2k es \cgú? 5 per, tg mostuk steril, desztillált vízben. Végül levegőn utegszdritottnk azokat, és ét uttkv.üertük a próbákkal.
Az egyes szövet/pró.ba.“prepgfátuotokat tiszta, zsírmentes, üveg tenoienUYZöl letakartok, és azután fűthető termosztátba: helyeztük OiVC-ön, 10 perereóes azoiást jéggel érintkezíeitúk 1 percre, és végül S£> óra hosszáig inánhaltuk áíffi'-esx A preparátorsokaí azután sővid Időre 2 X náSriam-eiiráí-ső-pnflérbe (SSC) (pH7,0) merítettük, a védd, üveg iebőiemexefc elidvohtása eélljáböi, és azután kétszer mostuk 5 percig 2 X SSC-puftoben, és végül ·,(.!'ϊ\ί s ό<“··Ά rhx-i'ulk-tol:,
Ezen mosások után a. prepaármmokat belemeriteítük 0,1 M maíemsavar és 0,15 'M náiriunukíoridot tartalmazó oldatba (pH 7,5) (nsaleío-puffier) 10 percre, és azután blokkoló reagens (Kst.sz. 1Ő9617é, Heeiiringer Mamiheim kik., Lewis, kast bossex, UKymajein-pnflerben oldott íés-os otoában tnkubáíutk 20 percig, 3?!íC-on,
A preparátumokat azttlán auil-dígOKigerúrs rooaoklonáks ellenanyag íBcehrit-ger Ma-mhehn) H250-Oldatávai raknbálsuk. 1 óra hosszáig,: 37öC-ot·:, melyet blokkoló pufteffien hígítottunk, majd PBS-ben mostak és végül biotiuiláií. aati-egér immunogiobubn-eUenanyaggal jokobáltuk 80 percig. 3?X-on, A ptvp.uúiumokat PBS-feen tnostuk, és az endogén peroxsőáz-aktivitást ügy blokkoltak, hogy PHS-ben oldott, D,5%-es hídr^gen-getoviddal kezeltük 2Ő percig, szobahőmérsékleten. A preparáSarftokrú újra umsipk PBS-ei, és 5 ,amt»>' v dtotd kaibazolszafesztrádai (ÁkC) (Cantbridge Biosesence, Cambridge, UK) kezeltük, melyet közvetlenül lelhaszuálás előtt készítettünk el.
f «X
- íö Az utolsó mosási csapvízaol végeztük,: a preparáítanokat btmatoxylijwl ufán-sziaoztük, ,,kékhetrtík:’ csapvfe alnts <s nnkseszkepte' irteg-tedeíentc/rc vstíük montíroz? tefyuóek u'AA Mount, C unbndge Bm-vn-mee Cambtiáge,. UK) alJkalmtmtsával. Kísérteti kontro&éat nem .irtevonatteó negatív próbái (C A V), és pozitív· próbát (PŐ'V) aíkateáztaük beteg sertésekből és ítem-beteg sertésekből származó mintákímz, á, /te&óz
PCV detektálási technikája )mmun^uőreszeg!iteiayg)
Αχ aeetonnsi üxáit, vsíamennyi sejittenyészebpr^aráftort: első szkríneiését közvetett immrurtluoíssz^enpiüt aii. íbstezé technikával (Í1F) végezték, kifejlett sertésekből származó, 3/1Őö-arányban bigiiort, egyesítés szénen lélteisznáiásávaít. Ez az egyesüeit száram 25 ks:icjtea koeáből származott Észak-írországból, és sokteie sertesvteSeiü vt'res elten tártál nmaft eileoanyagote, többek között ECV-re és példáéi: sértésből: származó parvovintsste sertésből származó sáeoovirtjsm és: PRRS- vausra. Az KE- teehrnkát ágy hajtottak végre, hogy a szérumot (P&S-el higítvas érintkezteitük: 1 éra hosszáig, 3?aG-on a sejtíenyészetekkei, axt követően kétszer mostuk ESSbon. A sejtteayészeteke; azu-áa 1 óra hosszáig festettük l/hO arányban PBS-el bigééit, nyúiban termeltetett, fl«oreszeeia--mxioeia.»áttsl konjugák, ami-sertés ímmusoglobalts-ellenaayaggal, azután PBS-et mostuk, és ghoeri'¢--.,\rt\'be» v\n e' '/,í..í' r k‘vs,«.npbt'i 1 \ \ j\ ah, vse >akus
MalE-z «tetemes són^dast v-ralesekkel rendelkező. ínmeteemzag!. kanadai ó- UHbnti.u tetet sértésekből g\ totóé és tbrnteldehiddel fixált szövetekből előállítóé PCY senoréi próbát alkalmazó, m són hibridizációban Idmotarajk: a. sérülésekkel asszociált PCV-rmkieinsavakjeiertléíét, számos vizsgáé sérülésben. Nem Sgyeitank meg jelei akkor, ha PCV genom; próbát nem-beteg sertésekből gyűjtött szövetekre alkalmaztunk, vagy ha CAV-próbát alkslmazéutik beteg sertésekből száfrasző szöveteken:, PCV-imkicissovat azonosítotUask a eitoplazmábart, és Számos ojötiorarkleáris sejt magjában, melyek beszűrődtek kabíőraiaí Ernái sertések tüdejében lévő sérülésekbe, PÜV-nukleiassvat kimutattunk a pnenmocitákban, a és hrtsnehioiárts epitél sej tsklxm, és az «rteríoiáfc, a hajszálerek és nyirok-erek extrtotol sejtjeiben is,
Pranciaországi, beteg sertésekben a PCV-nofclemsav jelenlétéi számos ibUikalárts bmíőcita eitepiaznráíábaa, és a nyirokcsomók immtenusold mononuk.teárjs tjeiben detektákuk. PCV-nukieinsavaí alkalmi syncytiumokbsn is detektáltunk. Ezen detektálási eredmények alapján, kaliforniai sertésekből számlázó ttklummtakat, tontete sertésekből származó, hélföíiorhox tartozó nyirokcsomó-mintákat. és kanadai sertésekből s/mma/o szüzeket szeiekiálhmk ki az: új, seriéseredeiá Církovlryz-törzsek izolálására.
skpéőfe «HÍ
Nem EcvelttoJk meg mmvtohtte tettes; iCPl i tnalüszurtotnás sorvadásos szfedsónta kltókai jeleit mutató francia fiatal sertésekből (smpáöök-íörzs), kaiifbrniat Iratai: sertésekből :(lmp.bP9-törzs} és kanadai fiatal sertésekből /no őrt' ,o ?s' g\>,noft etisva el < t -c tn 'ves.xte socu V e tea ses\>uesv Oéh-'toev mok üomameiölésével jacemmtai való Eaáiás titán) és sertésből: származó, egyesített polikkmáhs szőrömmel vjΛ ί* ί
φφ* φ φ φ· φ$φφ *· *
- η vzoot kimuíai&mk ookteőrfr ííuoresxeenei&s ka&foraiai fisfcai sertésekből szármszo tüdő {f ovo.9^:^40 w), francia fkího menésekből szánoazó OKd&stinaíis nyirokcsomó (impJOOkoörzs) es kanadai fisod sertésekből szármázó szervek: (Imp.iOiO-torzs) féJbeszí-óíiósSv-d okot; íeeyészeíekben tevő számos sejtbem
£. péfr/s
Sertóshólszánngzóetrkuyfoimjk.ggnom).ÍW:Á|Sckgxfoakei6ia
A seriéseredető eiekovlnssok (FCV) áj törzseinek reptikalri fetmájáf fertőzött kK/lö-sejtleayészetek (10 Faleon-csö, 7S csreI tók.bnre/ásóv&í állítottsk ele (lásd 1, példát;, ateiyeket 72--76 órás lakóból»» eme elkőlőmtettónk és glőkózanb-ma) kezeltük, CAV replikatlv forreájásresk klónozására. leírtaik· szerint (Todd, D, és reísai,, J. Cila. Mtcrobiol. 29,933-939 U991)) üzen ntplikatív formák duplaszálú DNS-ét Hírt által leírt [Hírt B., J. Moí. Biot 36, 365-369 (it967)1,. Moíttcr [kifolitór, Ti W.. és· mtsai., Vstefogy 137, 241-254 (1954)( által módosítóit technika szerint extrabáltuk,
ÁjíóW
Hm-kle technika -szerint «χ-öábáll totál DNS-t (I - 5 ng? S1 -nukleázzal kezeltük (Antersham), a gyártó áltól ajánlati eljárás szerint, és-srntán: ez; a DNS-t különbőzé restrikciós enzimekkel {Boebrlnger Manohemx, Lewis, kast Süsse*, UK) etaésztettak, és a emésztés termékeit elektroforézissei választottuk el 1,5%-os agaröz-gélben, eskiiom-fotsitsídiglenléiéböxí, Tedd és munkatársai áltól leirtók.szerint (J.. Gén, Virul, 71, 819-523 (1990)1. Az lrep.999-törzs -enyészeteiből extrákéit DNS egyedi TeöRl-kasifohellycl, 2 Seeí-basltóhcllyel rendelkezik, és nem rendelkezik Psíl-ltóslfóhetlyel. Fz a restrikciós -mintázat ezért eltér a FCV-OK/l 5-tórzare kfomtatóit restrikciós mintázattól [Meehmre ö. és-mtsaL, 1. Gén. Vtrol. ?8, 221-22? (1997)), amely ezzel ellentétben s-esfoelkexik PsíMsasítóhellyel és nesz rendelkezik FctóU-hasítóheltyel,
9, /50½
A FCV-:ltóp.999-.forzs dupla szálú, repiikatív formájának LcoRf-jeiö restrikciós enzimes emésztésével előállított, körülbelül 1,8 kbp méretű restrikciós fragreeusi Izolál tank 1,5%-os agaróz-gélben (lásd 3. példát), kereskedelemben elérhető •Qia^eis-reag.enskészlet alkalmazásával (QlALXlf Gél Estraeúon tóit, kaí.sz. 29021, QiiAGkN l.íd,, Grereíey, West Sossex, UK). Azután ezt az EcoRÍ-EcoRl restrikciós fragmenst előzőleg ugyanezen restrikciós enzimekkel emésztett és defosz.forilált pÖEM-7-vektorral (Fromega, Medical Supply Companv, Dublin, irelsnd) Iigáltnk, standard klónozó technikák szemű (Samhrook, 1. és mtsai., Molecular Cioning: A . it >n 2*u t i t ' si'd. u lispr Ikttót. b-' !><.v vkVitis. 1 > re> \>t \, í\ ! tóttó kapott piazmidoksí rireóerfoáó? co/i ÍM199 g&zdalörzsbe (Stretagene, ka Jolía, USA) transzformáltuk standard technikák szerint. A- Ff.’V-lmp.999-törz»böl származó. OeeRl-beeRI restrikciós ftagmeast szintén któaozluk. pBliieSeript SK+ (Soatógene Inc,, La Joila, USA) vektor FcciRl-hastfohefyébe, Az egyes gazdaszerveretek ese\tó„\i:Li''isA\l er tkhb t-U-l-a 0 mtéles? bak ut\!vx u utó u eret, is re 5amseket G rere» iák, A klóitokat tenyésztettük, és az imp,999-forzs teljes genongát tórerireaeri plazmlitókat kis térfogaiban (2 ml) vagy nagy térfogatban (250 ml) dszbotínk, standard pbznbdpreparálási és tisztítási teelsnikák szerint.
X **»
Λ
ΦΟ* **
φ *<·
A két EcoRMmp.W-klón (pG£M-7<'2· és pGbM-V.k.kkm) nukleotidszekvenciáját Saoger-lefe dsdezöxmiikle* otid-lechoika szedni határoztuk roeg, „AmpilTag DNA pelyrnerase ES szekvenáló reagenskészlcl fK;x.sz. •+02070, PE Apphed Biosysten-s, Warrn-gton, UK) es Applied BioSy^k-jns A.BU'CIA· típusú auíoroata szekve·· sál© készülék alkalmazásával, s gyártó javaslata szedni. Az üsd -szekvenáló reaketókaí az MI3 „előre” és „vissza” urnversáld láaeindité ebgotmkleeödokkal végeztek. Ezt követben a szekvenáló· reakciókat a „DNS-séálás'' (JÖN A veik;víg'): teobpiká szedni végeztük. Ezer!, sor©» kővetkező szekvenáiásokhoz szükséges olígonukieolidokai a Life Technologies cégnél szintetizálták (Inehmnan Business Park, Padley, UK).
A kapott szekvenciákat osszeálbíoíiuk, és MacDNASiS-szoííver (3:.2 verzió, kat.sz. 22(120 KM, Apphgene, Durhnm. UK) alkalmazásával analizáltuk. A különböző nyitott leoivasás! fázisokat BUASI-aigoritntus alkalmazásával anahzákuk, amely a „National Center tor Blotechnology Information” (NCBI, Bethesda, Mf>, VSA) szerverén áll reítdelüezésre,
A pCEkdrdf-kiöttbőt először kapott teljes szekvenciát tlcoddtroRMríigtneusf bemutatjuk a ő, ábrás <6, ez©msftószámn szekvencia}.. Kezdőpontját önkényesen telelőik G az EcoRl-teitőhety „ET-ítukleoEdia után, es a nnkleofttbk szompontjáhöl néhány bizonytataságot írtnál
Ázsián optimalizáltak a szekvenalást, és 3, azonosltöszámö szekvenciaként (3. ábra): megadjuk a törzs teljes szekvenciáját, amelynek kezdőpontja önkényesen az EeofU-hasítóhely kezdete, azaz az. első nukleoiid a ,,G”.
Az eljárást hasonlóan végeztük a találmány >.zö;'ij;tí másik báron; Izolátumból származó szekvencia eiöállitasá nál (lásd l,, 2. és 4. azonosítószámú szekvenciák, I... 2. és 4. ábrák),
Ezen négy töm geaöíújáüák méreteírnp. 1011-48121. Irep. 1011-48285. Imp. 909. ltop, H)]ö.
1767 nukleoiid
1767 nukleoiid
1768 öákileoild I768 nyitleotíd / /. péüfn
Ha az Imp.öúö-íörzsböl eioáílkotl: .szekvenciát alkalmaztuk a Gon Bank -adu fbankh&n lévő szekvenciákkal fennálló bontolőgía tesztelésére, az egyetlen szignifikáns, detektált homo-lögia körülbelül 7ő%-os. homológja, volt íuukieínssív-színterd a EKG S-törzsből: származó szekvenciával (nyilvántartási szánmi: ¥09421 és U44I8Ó) (lásd az. 5. ábrát),
Homológiára való. n fázisban végzett tesztelés aminosav-szlote»:, az adatbázisokban lévő szekvenciák transzlációjában (B1..AST X algernnms az NüBbszerveran) lehetővé tette, begy 94%-es botnelégiáí matassunk ki a GóttBöok U49I86. sz. szekvencia által ködeik sövények eirkevímssíböz nasenlő BBTV-vínts (GestBaak azonosítási szánni 1841S1 S) elméleti reptikázának coegfdelö nyitóit leolvasást fázissá!.
Az adatbankokban nem vök más szekvencia, ameiy szignifikáns homológját mulatott a iX?V-lrnp.9?d-;ötzshő; előállított szekvenciával.
Multiszisztémás sorvadás! szindróma klinikai jeleit mutató, kalllörtüsl füstid sertésekből gyditött sérülések felhöszuaiííyasat tenwk-Íf !\ k -bnp ‘Xb'Mőtzshoi emaEnou szeh'.uku anahz.yc v>hg>^an megingatta, b<.p\ ez
Λ · ηa vírasizoíáínsri ti), sertésbe! származó drfevsm-iőrzs, npéw •feteíiálsilS^íaSSSsMW^B'
Egymás alá rendeztük a 4 u Λ \ -tor’', t usleo uKrek^ κ ajat a PCV-fK/15-íörzs· szekvenciájával (5. ábra). Létttttastank egy Mow'toyvn. 3. i\ot a ue.vben Ιι^ΗόηΊν \u< a négy új törzset és a korábban mátriw« Pk 15-söröset Az erednem m v ők O,
1: tn=p. ls% 1-48121.
.: Imp. löt 1-405.
' bnp C9U
O?ip 1010,
Pk i?
2 5 4 5
1 1,0000 0,9977 0.9615 0,962! 0,7600
·> 1,0000 0,9621 0,9632 9,7594
5 1,000 0,9040 0.,7560
4 1,0000 0,7566
5 1,0000
A két francia 'törzs, az hnp. löt 1-48121. és az Issrtp. 1011-48285. törzs közötti honső,tögiís nagyobb, adni. 99% (0,9977).
A két éssstk-amerikas törzs, az önp. 999. és ímp. lölö.. közötti tanolőgta szinté» nagyeim, nnm ^'e ν' '*«49 > A francia törzsek és az észak-smerikar törzsek köz&tti hcanoiőgk; vafeimvel nagye-bb, mint 96%.
A bosnológsa értéke valamennyi törzs és a PK715 közön 75 és 76% közé esik.
kőből azt a következtetést s^nhatjuk ie, hogy a taláfenáuy szerinti törzsek aj típasú, sertésből származó cirkovírast: képviselnek, amely eltér <t PR? 15-förzs által képviselt hpnstós, Ezt az hj, FMWS-szinárómát mulató sertésekből izolált típust II. típusú. sertésből származó cirkovirustiak nevezzük, a PK.15 képvisel? az 1 típust. Ezen 11. típushoz tartozó törzsek jelentős nukleuüdszekvencta-bcsmológiát mutatnak, annak ellenére, hogy nagyon távolt földrajzi íéglökből izolálták azokat.
Ah/föhfö
Az ímp.lÖ!9-izoláttmr nukleolidszekvenciáját tekintettük a ntuitíszisztémás sorvadást -színáróstávai asszociálj többi ebko vírus-törzs képviselőjének. Ezt a szekvenciái részletesebben Bi.ASTX-algoriunus [.Aitscbd <; ah, J. Moh Siói. 215, 403—410 (1990lj és MacVector 6.0 szoft vérkészletből származó programok kombinát: ípjának (Oxford Moiecuhr üroup, Oxford 0X4 40A, 1J.K) segítségével analizáltuk. Ebben a szekvenciában 13 olyan nyitott leolvasási fázist (ORF-et) detektáltunk. amelyek mérete 20 aminosavttái nagyobb volt (cirknhtris genom). Ez a O ŐRE az alábbi:
Név Beje Vége Szál 0X1 tv 'te fvtih.ömjv.é 5 Fehésjeinéret (annnösavak) :
ŐREI OA 210 szerisz 108 sk 35 aa
ORE2 i ISO 131? szensz 5.0 Öt 45 aa
i *
ÖRF3 1363 15.24 szensz 162 nt 5 3 aa
ORF4 598 1342 szensz 943 nt .314 íííí
0105 nsO 1079 szensz 189 nt 59 aa
0RF6 1 1254 1334 szensz· 81 nt 26 na
ORF? 1015 704 antiszensz 315 ni i 64 aa
0RF8 439 3 0 antiszsnsz 129 rtl 4 .2 aa
ORE9 190 101 anfeszeosz 90 ni 29 ás
OREIO 912 733 aatiszensz 180 m 59 aa
ŐREI I 645 565 smiiszertsz 81 m 26 na
ŐRE 12 3 100 1035 antiszsnsz 6ő n; 21 aa
ORF 13 314 1.381 aniiszensz 702: sít 213 aa
Az egyes ÖRF-k kezdő és végpontját a 4. ábrán bemutatott szekvenciára (4, azonosítószámú szekvencia) hivatki’UMtkixj, 'ns. Ne' ti · jt ΆΟι’Κ ap vo(*'l ORÍ < bnOn tzvnv. ck < Ov->
ΐνίΛν^ηκ N. O'J íM?< wzsk Cs 4' K'U -82Ό ís ug\an< /ek l.ne\eaz OR) 5 ?η <ϊ< ORt · 3 ti ORF3: 1432-1539. sz-ensz, 10:8 m„ 35 aa
ORFI3: 314-137?. amiszensz, ?Ö5 m, 234 na.
Ezen 13 ORF közöl 4 szignifikáns homológiával rendelkezik a klőnezoR FCV-FK-15-vlnis genomjában lévő, analóg ORF-kel, Azolmt a nyitott leolvasási fázisokat ansiízálsak, amelyek valamennyi: vizsgáik mntezilsztémás sorvadás! szindrómával asszociált ctrkovírus-izolátum gemmtiáhan jelen voltak. Ez a négy ORF az alábbi:
Név Élese j Vége 1 Szál OR.F mérete (nukieotidok) Fehérjémére! (arnrnrsí-avak) Molekula- tösneg
ÖRF4 398 } 5.342 szen.sz 945 ni 314 aa 370 kOa
ORF? 1018 i 704 antiszensz 315 nt 104 aa 11,8 kDa
ŐRE 10 912 j 733 anfezensz 189 nt 59 aa 6,5 kDa
ŐRE 13 314 i $ ’-ϊ ^ i antíszeasz 702 sít 233 aa 27,8 kOií
Az egyes ORF-h kezdő év végpontját a 4, ábrán bemutatott szekvenciára (4. azonosítószámú szekvencia) hivatkozva adjuk meg. Az ORF mérete (sukleotidokhan, azaz nt.-be» kifejezve) tartalmazza, a stop-kódom.
A PCV-lmp. 1010- os PCV-PK-lS-izoiáíumok genomi szerveződésének összshasoafhása lehetővé teste 4 ORF ' ·> N i >?<< ,'i 1 k j '>'<,<.'> < k' t m»- *. ne u Rt -,υ \ λ! bfe b i, it > i s \int it s ► í mi ügyeli homológja mértékét:
ORF Imp. I tWO&F RVC-FR- I S Százalékos homológja
ORE4/ORE1 8655
ORRBORÉ? 66,476
ORF7/ORF3 61,5% 1 az átfedés szintjén) (104 aa s
OREIO/ORE4 8<b. uz. asfed.es s/imfent (59 ííál
t e\>, , Jtses u s ' ovsxtg·. 's km> ' 1'{'k óORlu'sfki OR1 i kzsott
I3gyesii.sk meg. Ez várható volt, mi vei ez a fehérje valószínűleg szerepet játszik a vitális DNS replikáetőjában, és ,w '< i '< i''* ·, κ ' \* 'tó 3' \ hv , ν' 1 < m' 3 s'í'í 'S ' i Ό' v!° 1 \i,iek.! - e\ 5í ki 1
Gén. Vinó. G. 531-344 (lOOkjj.
Az imp.lOiO-ORFD és a K-15-ORF2 kozott! szekvencia-azonosság: kevésbe határozott (60,4%~os homoiógia), de· mindkét ŐRE valóban nagymértékben Amzervatlv N-termioáiis hazíkus régióval rendelkezik, amely megegyezik & CAV, madáraredeíi! -eííkovkusbaa lévő, 1ö struktürábs fehérje N-terminálls régiójával (Medián, és mtsai,. Areh. VboL O4>: 301-319 {i992jj. Továbbá jole»IŐs különbségeket figyeltünk meg az ÖRF7Itup.IÓlü és ORE5-PK-15 között vafemsat-az ORFiö-l:n3pJ:Oiő és ORE4-PK-15 között. Vatamnyt esetben az hnp b’IV zolaumiN'i. s^a-mau, ARI ·,* t At to e -ta inntah4- íegmu oelet.d\? uh, ha izéért a 1\ \ l’k 15-böl származó, ÖRF3-boz és ORiA-hez hasonlítjuk. A legnagyobb szekvenm-bomulögíát az ÖRF7/ÖRF3 í6i,S%-os homologsa az átfedés szintién) és· az ORF11FORF4 (33%-<ss honmlógia az -átfedés szintfenl Nterminális régióinak szintiéit Rgyettük. meg, ügy dióik, hogy a sertésből származó ckknviras genomi szerveződése egészest összetett, amely gencmja különleges kompskiságársak következménye. A lő struklnráiis fehérje valószínűleg: a sertésereáetű ctik©vins?-.ge»om ngyanazöst szálán elhelyezkedő. néhány ieol vasast lássa között végbement spliemg álján származik. Ezért ágy íekintjők, bögy a fentebb leírt táblázatban szereplő, bármelyik nyitott leolvasási fess (ÖRFI -töt ŐRE I 3-lg) képviselheti a 0. itpnsá, sertéseredeta cirkovírnsbsál állal kódolt. antigenikns febésje egészér vagy részét, és ennélfogva pofeáeiáiis antigén, melyet speciSkw diagnózisra és/vagy vskemáeróra lehet alkalmazni, A találmány tárgyköréhez: tartozik ezért hártndyen fehérje, amely ezen ÜRi'-ek közül legalább egyet tartalmaz, A találmány tárgya előnyösen o!> ,m fehérje, amely lényegében QRR-höf, O8 F?-bő;, ORE1 Ö-bőI vagy 08 p 13 -hői ál 1,
M pé&fe
BÜV,“ülfeF2díL^ \ m-p -,οο οΙ,ηο η í'hvs -v i<m ;a f ev!r>i s. r i mna' > tiíi ua v potV> x FK » m tew tmoszfektáltuk Meehan, lk és munkatársai által leírt fAmb. Virul, 124, 301-319 f i 9Ü2)J eljárás szerint. immunlltsoreszeeueiát alkalmazó anahztsi végeztünk {lásd 4, példát) st íranszfékoiö alánt ebö passzáláson nemszesmyszed PR715-sejtekre, amelynek eredménye azt mutatta, hegy a pOBM7/b-kfe«ak megfelelő plaztnld képes volt fertőző FCV-vfrus termelődését indukálni. Fertőző ECV genetikai anyagot tartalmazó klón hozzáférhetőségé fejtetővé tesz bármilyen hasznos manipulációt a Arnsgenomban, módosított FCV-vírnscsk (sextósekíteo gyengíteti vagy detektív) előállítása. céljából, amelyeket gyengített vagy rekomblnám, vakcinák, vagy diagnösztikal reagenskész letekben feíbaBzoálható antigének előállítására lehet alkalmazni.
/5, /.>éő/«
IRAyusníigfer^^
Nem szennyezett P8 ’5 sepek t>x\> - «--»« <s a zoas szaporítását az 1, példában lein módszer szerint végeztük. A fertőzőit sejtekéi tripszmes kezeléssel választottuk el 4 napos, 37<:C-«:>« végzett inkubáció márt, és megszámoltuk. A kővetkező passzálás ml-kértl 400,000 fertőzőit sejtet tartalmazott.
M pé&fe
A viriistensevztés végén a fertőzőit sejteket eikolönlfeltak, és Iszisnek vetettük alá ultrahang alkalmazásával (Rmusón Somrier) vagy fórgö-áiió („roteí-slatoü') típusé kolloid maiont {üllraTtirras, 5RA) segítségévei, A «$
- 16 szuszpenziót ezután centri&gáltek 2700 g-n, 89 percig, A vires-szuszpenziőt azután inakúváltuk 0,1% etilé;© IsasHöd 18 óra besszáig, ŐO^Oi-on, vagy 9,5% bétíopmpiolakleswi 24 óra hosszáig, 20°C~on, l-ia a virító them inaktiválás előtt nem volt megfelelő, a vints-szuszpenziéi aliraszüréssei koncentráltuk, 800 kPa molekulatömeg lelőtt vssszatai'tő membrán (Mlilipom F2'MK300) alkalmazásával. Az isaktivált vims-szcíszpeaziói f 5cC-on támitnk.
í .·. .ífiWití
Vakcina cKíábrfása ásványi afstka alnputő ctnalzfá formájában
A vakcinát az alábbi íömuda szerint álilOttk elő:
inak ti vált seríésereáetö cirkovirus-sznszpenziő; 250 mi
Momnnkle'U ISA 7(5 íSEPPiG.t; 750 ml & vizes fázist és az olajos fázist knlőn-knlön sterilizáltak szűréssé·- Az etnuMót az alkotórészek összekeverésével és htíínogenizálásávai áfiitj«k elő SOverson tarblm-miulgeátó berendezés segítségévei.
Egy vakcina-dózis kőrfUbclül W!'' lV'lP50-et tartalmaz. Egy vakciíía-döxis iőrfcgata 9,5 mi mtradermális átmt való: beadásra, és 2 mi iníramuszknláris ólon való beadásra.
M né&íu
A vakusnál az alábbiak szerint áliitjufc elő:
isiakti vált sastéseredeth, cirkovlRis-szeszpenzsó; 200 ml pehysosil.s F1RE 7 (Fiánkéit; 60 ml
Radia 7204 (Öieoiina): 740 ml
A vizes &ist és az olajos fázist kölött-kOlőst sterilizáltak szűréssel. Az etnulziót az alkotórészek Összekeverésével és homogenizáiásávai állítjuk elő Sdversnn íö.rblns-emvdgeá.ló aemndszés segítségével.
Egy vakcina-dózis kőrölbelbi 1Ö7 TCK2$ö-ei tartalmaz. Egy v&koma-uózís térfogata 2 mi mkzomszktilárfs úton való beadásra.
USA-belí és Kanala OCV-vKestőrzsek és a ΡΚ·; I 5-szennyeződés vonatkozásában, biperimman-széttimmai (ECV-T), FK7I5-őöi előállított F99 monoklonáiis eliesanyag-pao-rfid és a kanadai törzsből előállított .bíperlöwan.-széfusniHaí (RCV-C)
VÍRUS
PA 15 USA Franciaország
FCV-T antsszéruta > Ő400 200 800
PC V -C stnt · szertan 200 €>4*00 :> .6400·
F09 IK4 2: i 0000 < 100 100
F09 4B1Ö >10000 < 100 < 100
EOy 2B7 >10000 100 < 100
F09 2E12 > 10000 < 100 V 100
F99 ICO .;·.·10000 < 100 100
~ π-
E99 2EI > 10000 < 100 < illő
F99 H M > 10000 100 < 100
* A szérum vagy a monoklnnális ellenanyag utolsó hígításának reclpraka, amely pozitív reakciót ad közvetett ámnunfluoreszcenóában-

Claims (13)

  1. SZABADALMI KIÉNYPDNI'OK.
    1. Expressziós vektor,. amely íí. típusé sertéseredetö eirkovirnsból (PGV lí-ből) származó nukleinsavszekvenciát tartalmaz» amely riukíeinsav-szekverscia a következők közöl van kiválasztva, vagy -azok. mindegyikéi tartalmazza:
    a SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2, SEQ ?D NO: 3, SEQ ID NO: 4 vagy SEQ ÍD NO: ó szedtói szekvencia szánsz szálasak 348-1342, nnkteotídjai által ffieghaMrozott ORF 4 és a SEQ 10 NO: I, SBQ ID NO: 2, SBQ I.D NO: 3, SLQ I D NO: 4 vagy SkQ ÍD NO: Ó szerinti szekvencia antiszensz szálának 334-3383. nakleoíMjal által meghat árokéit ORF13,
  2. 2. Az I. igénypont szerinti expressziós vektor, amely gazdasejíbert m vivő expresszálódni képes miklemsnv-szekveneiát tartalmaz.
  3. 3. Az i. igénypont szerinti expressziós vektor, amely g&zdásejíben /« yio-o expresszálődm képes nnkíeinsav-szekvencsát tartalmaz.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti expressziős vektor, amely baeulovifus alkalmazásával expresszáiódrn képes rnikleinsav-szekvenclál tartalmaz.
  5. 5. Á 3. Igénypont szerinti expressziós vektor, amely Rcobban expresszáiódm képes nukleinsavszekvenciái: tartalmaz.
    b, A 3. igénypont szerinti expressziós vektor, amely enkariőia sejtben expresszálődsri képes uukileíns&v·· szekvenciát tartalmaz.
  6. 7, A 3. igénypont szerinti expressziós vektor, amely élesztőben expresszálódni képes nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
  7. 8. A 3, igénypont szerinti expressziós vektor, amely emlős sejtben expresszátodni képes nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
  8. 9, .Az 1-8, igénypont szerinti expressziős vektor, amely vírus.
  9. 10. A 9, igénypont: szerinti expressziós vektor, amely a következők bármelyike: sertésheípesz-vlrus, seríeseredeíű adenovirus és bitniövlrus.
    31 . A lö. igényper)! szerinti expressziéi» vektor, amely a következők bármelyike: az Aujeszky-I'éle betegség vírusa, vaceírbavirns, madárbhnlö-virus és sértési) hrdö-virus,
    32. A 10. igénypont szerinti expressziós vektor, amely knnáríliíprlő-viriis.
    3 3. Az I -8· igénypont szerinti expressziós vektor, amely plazmid.
  10. 14. Vakcina, amely 1-13. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektort tartalmaz állatorvosi szempontból elfogadható higítószerben vagy hordozóban.
  11. 15. Izolált, ímrmmogért PCV H poilpeptid, amelyet az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektor kódol.
    - 18 M. Vakcina, amely 15. igénypont szerinti immunogén FCV H polipeptidet tartalmaz állatorvost szempontból elfogadható hlgttószerhen vagy hordozóban és adott esetben állatorvosi szempontból elfogadható adjnvánst is tartalmaz.,
  12. 17. Az 1-13 igent pontok bárrodv ike vű ra>t expt zászlós vektor alkalmazása FCV Π elleni immunválasz kiváltására szolgáló gyógyszer előállítására.
  13. 18. A 15. igénypont szerinti immunogén FCV 11 poltpeptíd alkábnazása PCV II elleni immunválasz kiváltására szolgáló gyógyszer előáll ítására.
HU0800330A 1997-10-03 1998-10-01 Újonnan izolált, sertésből származó cirkovírusokból származó szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok és ezeket tartalmazó vakcinák HU230340B1 (hu)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR97/12382 1997-10-03
FR9712382A FR2769321B1 (fr) 1997-10-03 1997-10-03 Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostics
FR98/00873 1998-01-22
FR9800873A FR2769322B1 (fr) 1997-10-03 1998-01-22 Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostic
FR98/03707 1998-03-20
FR9803707A FR2776294B1 (fr) 1998-03-20 1998-03-20 Nouveaux circovirus porcins ; vaccins et reactifs de diagnostic
PCT/FR1998/002107 WO1999018214A1 (fr) 1997-10-03 1998-10-01 Circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostic

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU0800330D0 HU0800330D0 (en) 2008-07-28
HU230340B1 true HU230340B1 (hu) 2016-02-29

Family

ID=27253376

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0800330A HU230340B1 (hu) 1997-10-03 1998-10-01 Újonnan izolált, sertésből származó cirkovírusokból származó szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok és ezeket tartalmazó vakcinák
HU0003756A HU226247B1 (en) 1997-10-03 1998-10-01 Newly isolated porcine circoviruses, circovirus vaccines and diagnostic reagents

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0003756A HU226247B1 (en) 1997-10-03 1998-10-01 Newly isolated porcine circoviruses, circovirus vaccines and diagnostic reagents

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6368601B1 (hu)
EP (4) EP1281760B9 (hu)
JP (5) JP5008218B2 (hu)
KR (4) KR100904852B1 (hu)
CN (2) CN101724606B (hu)
AT (3) ATE245191T1 (hu)
AU (1) AU756554C (hu)
BR (1) BR9812845B1 (hu)
CA (1) CA2305623C (hu)
CY (3) CY1110359T1 (hu)
DE (7) DE122008000069I1 (hu)
DK (4) DK1386617T3 (hu)
ES (4) ES2524359T3 (hu)
FR (1) FR05C0021I2 (hu)
HK (1) HK1095161A1 (hu)
HU (2) HU230340B1 (hu)
NL (1) NL300326I2 (hu)
PL (1) PL198506B1 (hu)
PT (4) PT1281760E (hu)
UA (1) UA78180C2 (hu)
WO (1) WO1999018214A1 (hu)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US20060029617A1 (en) * 1997-10-03 2006-02-09 Charreyre Catherine E Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US7192594B2 (en) * 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
PT2363488E (pt) * 1997-12-11 2015-01-13 Univ Belfast Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos
EP1816200B1 (en) * 1997-12-11 2016-03-09 Merial Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
US6943152B1 (en) * 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
CA2410229A1 (en) * 2000-06-15 2001-12-20 Purdue Research Foundation Vaccine for congenital tremors in pigs
US7018638B2 (en) * 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
ES2324466T3 (es) * 2001-03-27 2009-08-07 University Of Saskatchewan Metodos para cultivar circovirus.
MXPA04000589A (es) 2001-07-20 2005-06-17 Univ Georgia Res Found Virus de la rabia atenuado con mutacion de nucleoproteina en el sitio de fosforilacion para vacunacion contra la rabia y terapia genetica en el snc.
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
PL216541B1 (pl) * 2002-08-26 2014-04-30 Pfizer Prod Inc Kompozycja immunogenna oraz kompozycja do szczepienia i jej zastosowanie
KR20040021988A (ko) * 2002-09-06 2004-03-11 서상희 바이러스 증식용 돼지 신장 상피 세포주, 및 이의 용도
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
SI1869471T1 (sl) * 2005-04-13 2016-09-30 Merial, Inc. Postopek za izdelavo prašičjega cirkovirusa
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
CN109125721A (zh) * 2005-12-29 2019-01-04 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 Pcv2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途
RU2488407C2 (ru) * 2005-12-29 2013-07-27 Берингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. Поливалентные иммуногенные композиции pcv2 и способы получения таких композиций
KR100870077B1 (ko) * 2006-10-27 2008-11-25 권영득 이유후 전신소모성증후군(ｐｍｗｓ)의 치료용 복합제조성물
US20100129397A1 (en) * 2006-12-11 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
PT2094872T (pt) 2006-12-15 2017-04-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Tratamento de porcos seropositivos para o anticorpo anti-pcv2 com antigénio de pcv2
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US8518696B2 (en) * 2007-05-11 2013-08-27 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Production of homogeneous cell line highly permissive to porcine circovirus type 2 (PCV2) infection
KR100948127B1 (ko) * 2007-06-27 2010-03-18 주식회사 중앙백신연구소 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물
US20090017064A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US7829274B2 (en) * 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
EP2225367A1 (en) * 2007-12-21 2010-09-08 Wyeth LLC Methods and compositions for immunizing pigs against porcine circovirus
CA2710558A1 (en) * 2007-12-31 2009-07-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 virus like particle with foreign amino acid insertion
CA2712006A1 (en) * 2008-01-23 2009-10-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
AR078253A1 (es) * 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
TWI508974B (zh) 2010-12-22 2015-11-21 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
EP2564869A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Ceva Sante Animale Synthetic capsid proteins and uses thereof
EP2789346A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 CEVA Santé Animale SA Fusion polypeptides and vaccines
EP2994162B1 (en) 2013-05-08 2021-04-07 Pharmgate Biologics Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
KR20160046879A (ko) 2013-09-25 2016-04-29 조에티스 서비시즈 엘엘씨 Pcv2b 분지형 백신 조성물 및 사용 방법
KR102409183B1 (ko) 2013-10-02 2022-06-15 베링거 인겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인크. Ｐｃｖ2 ｏｒｆ2 단백질 변이체 및 이로 이루어진 바이러스 유사 입자
CN104383527A (zh) * 2014-11-18 2015-03-04 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪圆环病毒2型灭活冻干疫苗的制备方法
EP3034609A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ceva Sante Animale Recombinant swinepox virus and vaccines
WO2016183423A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 Merial Inc. Method for porcine circovirus production and pcv2 vaccines
EP3254692A1 (en) 2016-06-10 2017-12-13 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant spv
US20200390878A1 (en) 2017-12-08 2020-12-17 Ceva Sante Animale Recombinant swinepox virus and vaccines
MX2020010018A (es) 2018-03-26 2020-10-14 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Metodo para producir una composicion inmunogenica.
MX2020013484A (es) 2018-06-11 2021-05-27 Ceva Sante Animale Vacunacion contra circovirus porcinos.
KR102124260B1 (ko) * 2018-10-19 2020-06-26 대한민국(관리부서 질병관리본부장) 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 콜레라균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주
EP4185321A2 (en) 2020-07-24 2023-05-31 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Combination porcine vaccine

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4740468A (en) 1985-02-14 1988-04-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Concentrating immunochemical test device and method
US5030558A (en) 1986-11-07 1991-07-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Qualitative immunochromatographic method and device
US5232835A (en) 1986-11-07 1993-08-03 Syntex (U.S.A.) Inc. Qualitative immunochromatographic method and device
CA1303983C (en) 1987-03-27 1992-06-23 Robert W. Rosenstein Solid phase assay
JPH0746107B2 (ja) 1987-04-27 1995-05-17 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ 検定法
US4855240A (en) 1987-05-13 1989-08-08 Becton Dickinson And Company Solid phase assay employing capillary flow
US5120643A (en) 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
ES2067474T3 (es) * 1987-09-28 1995-04-01 Beecham Inc Virus tgev del cerdo como vacuna para perros.
CA2489769A1 (en) 1989-03-21 1990-10-04 Philip L. Felgner Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
US5141850A (en) 1990-02-07 1992-08-25 Hygeia Sciences, Inc. Porous strip form assay device method
EP0597852B2 (en) 1990-05-29 2005-08-10 Wyeth Holdings Corporation Swine pneumonia vaccine and method for the preparation thereof
US5238652A (en) 1990-06-20 1993-08-24 Drug Screening Systems, Inc. Analytical test devices for competition assay for drugs of non-protein antigens using immunochromatographic techniques
US5565205A (en) 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
US5266497A (en) 1990-08-31 1993-11-30 Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. Immunochromatographic assay with improved colored latex
US5451504A (en) 1991-07-29 1995-09-19 Serex, Inc. Method and device for detecting the presence of analyte in a sample
WO1993007898A1 (en) 1991-10-14 1993-04-29 Akzo Nobel N.V. Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
US5338543A (en) * 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
DE9204303U1 (hu) 1992-03-30 1992-06-25 Marx, Guenter Wolfgang, 7953 Bad Schussenried, De
EP0571648A1 (en) 1992-05-26 1993-12-01 Chung-Nan Weng Vaccine protecting against mycoplasmal pneumonia
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
FR2700957B1 (fr) 1993-01-29 1995-03-03 Seppic Sa Composition de vaccin sous-unitaire recombinant vivant et procédé de préparation.
DK0683816T3 (da) 1993-02-08 2001-01-08 Bayer Ag Fremgangsmåde til dyrkning af porcinreproduktions- og respirationssygdom-virus og dets anvendelse i vacciner
FR2702373B1 (fr) 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.
IL108915A0 (en) 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
ATE475668T1 (de) 1994-01-27 2010-08-15 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch impfung von dns transkriptionseinheit
DK0676467T3 (da) * 1994-04-11 2002-01-21 Akzo Nobel Nv Europæiske vaccinestammer af det porcine reproduktive respiratoriske syndromvirus (PRRSV)
CA2196865C (en) * 1994-08-05 2001-07-03 Karl P. Schneider Self-chamfering drill bit
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
PT2363488E (pt) * 1997-12-11 2015-01-13 Univ Belfast Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos
KR100298125B1 (ko) * 1999-04-15 2001-09-13 정명식 구리의 화학 증착에 유용한 유기 구리 전구체

Also Published As

Publication number Publication date
AU756554B2 (en) 2003-01-16
DE69830858D1 (de) 2005-08-18
AU756554C (en) 2003-09-18
CY1108113T1 (el) 2014-02-12
KR100736129B1 (ko) 2007-07-06
FR05C0021I2 (hu) 2005-10-21
CN101724606B (zh) 2016-02-24
PT1281760E (pt) 2005-11-30
BR9812845B1 (pt) 2010-03-09
PT1019510E (pt) 2003-11-28
JP5362750B2 (ja) 2013-12-11
DK1019510T3 (da) 2003-11-10
CY1115749T1 (el) 2017-01-25
NL300326I1 (nl) 2008-03-03
JP5869658B2 (ja) 2016-02-24
PT1741785E (pt) 2014-11-13
NL300326I2 (nl) 2008-04-01
DE05014998T1 (de) 2008-11-20
HUP0003756A3 (en) 2003-03-28
CA2305623A1 (fr) 1999-04-15
EP1019510B1 (fr) 2003-07-16
AU9355598A (en) 1999-04-27
US6368601B1 (en) 2002-04-09
PT1386617E (pt) 2008-06-17
CA2305623C (en) 2008-04-01
EP1741785B1 (fr) 2014-10-01
CN101724606A (zh) 2010-06-09
EP1019510A1 (fr) 2000-07-19
ATE299531T1 (de) 2005-07-15
DK1281760T5 (da) 2006-04-18
KR100904852B1 (ko) 2009-06-25
KR100854615B1 (ko) 2008-08-27
EP1281760B9 (fr) 2005-12-28
ES2302885T3 (es) 2008-08-01
ES2203984T3 (es) 2004-04-16
KR20080023271A (ko) 2008-03-12
DE69816460T2 (de) 2004-05-27
DK1281760T3 (da) 2005-10-31
CN1278301A (zh) 2000-12-27
UA78180C2 (uk) 2007-03-15
ATE387914T1 (de) 2008-03-15
JP4680245B2 (ja) 2011-05-11
CY1110359T1 (el) 2015-04-29
KR20060079256A (ko) 2006-07-05
DK1386617T3 (da) 2008-07-07
EP1741785A1 (fr) 2007-01-10
PL339631A1 (en) 2001-01-02
JP2001519159A (ja) 2001-10-23
DE69816460D1 (de) 2003-08-21
DK1741785T3 (da) 2014-11-10
BR9812845A (pt) 2000-08-08
EP1281760A1 (fr) 2003-02-05
ES2246001T3 (es) 2006-02-01
JP2012193179A (ja) 2012-10-11
FR05C0021I1 (hu) 2005-05-27
DE122008000069I1 (de) 2009-11-05
HU0800330D0 (en) 2008-07-28
EP1386617B1 (fr) 2008-03-05
JP2015109840A (ja) 2015-06-18
ATE245191T1 (de) 2003-08-15
DE69830858T4 (de) 2006-12-21
DE122005000009I1 (de) 2005-08-04
JP5008218B2 (ja) 2012-08-22
KR20010030930A (ko) 2001-04-16
EP1281760B1 (fr) 2005-07-13
CN100584948C (zh) 2010-01-27
KR100944144B1 (ko) 2010-02-24
KR20090051274A (ko) 2009-05-21
EP1386617A1 (fr) 2004-02-04
DE69839227T2 (de) 2009-03-12
JP2008086317A (ja) 2008-04-17
HU226247B1 (en) 2008-07-28
JP2011135875A (ja) 2011-07-14
DE69839227D1 (de) 2008-04-17
ES2524359T3 (es) 2014-12-05
WO1999018214A1 (fr) 1999-04-15
HK1095161A1 (en) 2007-04-27
PL198506B1 (pl) 2008-06-30
DE69830858T2 (de) 2006-04-20
HUP0003756A2 (hu) 2001-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230340B1 (hu) Újonnan izolált, sertésből származó cirkovírusokból származó szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok és ezeket tartalmazó vakcinák
RU2744193C2 (ru) Иммуногенные композиции для иммунизации свиней против цирковируса типа 3 и способы их получения и применения
Barderas et al. Antigenic and immunogenic properties of a chimera of two immunodominant African swine fever virus proteins
Pecora et al. First finding of genetic and antigenic diversity in 1b-BVDV isolates from Argentina
KR20210092762A (ko) 아프리카 돼지 열병 바이러스에 대한 면역원성 조성물
HU230576B1 (hu) Kiméra fertőző DNS-klónok, kiméra sertés cirkovírusok, és alkalmazásuk
CN107073101A (zh) 猪流行性腹泻病毒疫苗
TW201225975A (en) Porcine circovirus type 2, immunogenic composition containing the same, test kit, and application thereof
Lightowlers et al. Vaccines against cysticercosis and hydatidosis
EA012965B1 (ru) Композиция для получения реассортантного рекомбинантного вируса гриппа, способ получения указанного вируса и реассортантный рекомбинантный вирус гриппа
KR20190110605A (ko) 돼지 코로나바이러스 백신
CN102459578A (zh) 基于在北美狗中循环的犬瘟热病毒的免疫原性组合物、疫苗和诊断方法
Jeggo et al. Serial inoculation of sheep with two bluetongue virus types
CN113748203A (zh) 重组经典猪瘟病毒
JP5190383B2 (ja) ブタコレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ）に対するキメラワクチン抗原
AU2017380107B2 (en) Isolation of a novel pestivirus causing congenital tremor A
Toth et al. Expression of the E2 envelope glycoprotein of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) elicits virus-type specific neutralising antibodies
EP0833903B1 (en) Multivalent bovine coronavirus vaccine and method of treating bovine coronavirus infection
AU2002253542B2 (en) Purified subfragment encoding neuroaminidase, recombinant neuroaminidase and its use in zooprophylaxis
US6432408B1 (en) Swine hepatitis E virus and uses thereof
JP3262273B2 (ja) ブタコレラを含むペスチウイルス感染の如き感染に対する保護法、ヌクレオチド配列およびワクチンの開発および診断に使用されるポリペプチド
RU2803427C1 (ru) Иммуногенные композиции для иммунизации свиней против цирковируса типа 3 и способы их получения и применения
RU2765658C9 (ru) Выделение нового пестивируса, вызывающего врожденный тремор а
WO2011144360A1 (en) Marker vaccine for classical swine fever
CN117088967A (zh) 猪伪狂犬病病毒阳性血清及其制备方法和应用