KR20090051274A - 돼지 서코바이러스, 백신 및 진단시약 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PMWS 에 의해 영향을 받은 농장으로부터 얻어진 폐 또는 신장 신경절 시료로부터 단리한 새로운 돼지 서코바이러스 균주에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 균주의 정제된 제제, 통상적 약독 또는 불활성화된 백신, 재조합 생 백신, 플라스미드 백신 및 서브유니트 백신, 및 시약 및 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인 비트로 발현 벡터에서 서브유니트의 생산에 사용하거나 또는 인 비보 발현 벡터내 바이러스 또는 플라스미드형에 통합시키는 서열로서 사용할 수 있는 DNA 단편에 관한 것이다.
돼지 서코바이러스, PMWS 증후군

Description

돼지 서코바이러스, 백신 및 진단시약{PORCINE CIRCOVIRUSES, VACCINES AND DIAGNOSTIC REAGENTS}
본 발명은 PMWS 증후군 (Porcine Multisystemic Wasting Syndrome 또는 Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome)과 관련된 새로운 돼지 서코바이러스 균주 (PCV: Porcine CircoVirus), 이러한 균주를 검출할 수 있는 시약 및 방법, 백신 및 백신화방법 및 이러한 시약 및 백신의 제조방법에 관한 것이다.
PCV 는 원래 돼지 신장 세포주 PK/15 내 비세포병원성 오염물로서 검출된다. 이러한 바이러스는 닭 빈혈(anaemia) 바이러스 (CAV : Chicken Anaemia Virus) 및 PBFDV 바이러스 (Pscittacine Beak and Feather Disease Virus) 와 더불어 서코비리대 (Circoviridae) 로 분류된다. 이것은 공통의 특성이 1.76 내지 2.31 kb 의 환형 단일가닥 DNA 의 형태로 게놈을 함유하는 작은 비피막 바이러스 (15 내지 24nm) 이다. 처음에는 이 게놈은 약 30 kDa 의 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 생각되어 졌다 (Todd et al., Arch Virol 1991, 117; 129- 135). 그러나 최근의 작업으로 좀더 복잡한 전사가 밝혀졌다 (Meehan B. M. et al., 1997, 78; 221-227). 더욱이, 뉴클레오티드 서열 또는 공통의 항원 결정요소내 현저한 상동성은 공지된 세가지 유형의 서코바이러스사이에 알려져 있지 않다.
PK/15 세포로부터 유래된 PCV 는 병원성이 아닌 것으로 여겨진다. 이의 서열은 비.엠. 미한등에 의해 알려졌다 [B.M.Meehan et al., J. Gen. Virol 1997 (78) 221-227]. 일부 저자들은 PCV 이 균주가 병원성일 수 있고, PMWS 증후군과 관련있을 수 있다고 생각한 것은 단지 최근에 들어서이다 (Gupi P.S. Nayar et al., Can. Vet. J, vol. 38, 1997: 385-387 and Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501). 나야르 등이 PCR 기술을 이용하여 PMWS 증후군을 가진 돼지에서 PCV DNA 를 검출하였다. 그러나 야생형 PCV 균주는 지금까지 단리 및 정제되지 않았다.
캐나다, 미국 및 프랑스에서 발견된 PMWS 증후군은 체중의 완만한 감소 및 빈삭호흡, 호흡곤란 및 황달과 같은 증상을 임상적특징으로 한다. 병리학적 관점에서 볼때, 이것은 림프구성 또는 그래뉼로마티어스(granulomateus) 침윤, 림프절증 및 좀더 드물게는 간염 및 림프구성 또는 그래뉼로마티어스 신장염에 의해 증명된다 (Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501; La Semaine Veterinaire No. 26, supplement to La Semaine Veterinaire 1996 (834); La Semaine Veterinaire 1997 (857):54; Gupi P.S. Nayar et al., Can. Vet. J, Vol. 38, 1997; 385-387).
본 출원인은 캐나다, 미국(캘리포니아) 및 프랑스(브리타니) 소재의 농장으로부터 얻은 폐 또는 신경절 시료로부터 다섯개의 새로운 PCV 균주를 단리하는데 성공하였고, 이후 이를 본 발명에 따른 서코바이러스로 명명하였다. 이러한 바이러스는 PMWS 증후군의 돼지내 병변에서 검출되었으나, 건강한 돼지에서는 검출되지 않았다.
본 출원인은 또한 이러한 균주들중 네개, 즉 캐나다 및 미국에서 수득한 균주, 및 두개의 프랑스균주의 게놈의 서열을 확인하였다. 이 균주는 뉴클레오티드 수준에서 96% 이상으로 상호간에 매우 강한 상동성을 보이고, PK/15 균주와는 약 76% 으로 꽤 약한 상동성을 보인다. 따라서 새로운 균주는 여기에서 II 형으로 불리우는 새로운 형의 돼지 서코바이러스를 대표한다 할 수 있으며, PK/15 는 I 형을 대표한다.
그러므로 본 발명의 주제는, 전술한 바와 같이, 단리된 또는 정제된 제제 형태의 II 군 돼지 서코바이러스이다.
본 발명은 PMWS 증후군의 병든 돼지유래의 생리학적 시료 또는 조직 시료, 특히, 병변으로부터, 특히 실시예들에 기술된 방법에 따라 단리될 수 있는 임의의 돼지 서코바이러스, 특히 II 형 서코바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 주제는 좀더 구체적으로는, 1997.10.2 (목요일)일자로,
ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom) 에 기탁된 하기 다섯개의 균주의 정제된 제제에 관한 것이다:
- 기탁 번호 V97100219 (여기에서는 Imp.1008PCV 로 칭함)
- 기탁 번호 V9700218 (여기에서는 Imp.1010PCV 로 칭함)
- 기탁 번호 V97100217 (여기에서는 Imp.999PCV 로 칭함)
및 1998.1.16 (금요일)일자로,
- 기탁 번호 V98011608 (여기에서는 Imp.1011-48285 로 칭함)
- 기탁 번호 V98011609 (여기에서는 Imp.1011-48121 로 칭함).
본 발명은 병든 돼지로부터 단리된 돼지 서코바이러스 및/또는 본 발명의 균주와 현저한 혈청학적 유사성을 갖는 서코바이러스 및/또는 PCV PK/15 균주와 혼성화되지 않는 엄격한 조건하에서 본 발명의 균주와 교차혼성화되는 서코바이러스를 목적으로 한다.
PMWS 증후군의 돼지 유래의 생리학적 시료 또는 조직 시료, 특히 병변으로부터 단리된 바이러스 균주는, 유리하게는 복제 또는 특히 항원, 홀(whole)(예, 바이러스) 및/또는 서브유니트 (예, 폴리펩티드)의 제조를 위하여, 세포주, 특히 돼지 신장 세포주, 특히 오염이 없는 PK/15 세포 (특히 PCV 및 페스티바이러스, 돼지 아데노바이러스 및 돼지 파르보바이러스에 대해)상에서 증식시킬 수 있다.
매우 놀랍게도, 이러한 단리물은 바이러스 또는 항원의 생산, 특히 불활성화 백신의 생산에 대해 부정할 수 없는 이점을 갖는, PK/15 세포상에서의 배양에서 매우 생산적임이 입증되었다.
본 발명의 주제는 또한 본 발명에 따른 서코바이러스중 적어도 하나로 감염된 상태에서 인 비트로(in vitro) 에서 배양된 세포, 특히 세포주, 예컨대 PK/15 세포상에서 계대배양후 단리된 서코바이러스 또는 PMWS 증후군을 갖는 돼지 유래의 생리학적 시료 또는 조직 시료, 특히 병변으로부터 단리될 수 있는 임의의 돼지 서코바이러스의 제제이다. 또한 본 발명의 주제는 표준기술로 임의로 정제된 배양 추출물 또는 상층액 및 통상적으로 인 비트로 배양물로부터 수득한 임의의 항원성 제제이다.
본 발명의 주제는 또한 면역원성 활성 성분 및 전술한 바와 같은 하나이상의 항원을 함유하는 백신이다.
이것은 약독생전바이러스에 기초한 면역원성 활성 성분이거나, 또는 이러한 활성성분으로 제조한 백신일 수 있으며, 약독화는 통상의 방법, 예컨대 세포상에서의 계대배양, 바람직하게는 돼지 세포상에서의 계대배양, 특히, 세포주, 예컨대 PK/15 세포 (예컨대, 50 내지 150, 특히 100 정도의 계대배양)으로 실시한다. 이러한 백신은 통상적으로 수의학적 면에서 허용가능한 부형제 또는 희석제, 선택적으로는 수의학적으로 허용가능한 보조제 및 선택적으로는 냉동건조 안정화제를 함유할 수 있다.
이러한 백신은 바람직하게는 103 내지 106 TCID50 를 함유할 것이다.
이것은 불활성화된 상태에서, 본 발명에 따른 서코바이러스 항원에 기초한 면역원성 활성 성분 또는 백신일 수 있다. 백신은 또한 선택적으로 수의학적 면에서 허용가능한 보조제와 더불어, 수의학적 면에서 허용가능한 부형제 또는 희석제를 함유한다.
존재할 수 있는 단편과 더불어, 본 발명에 따른 서코바이러스는 당업자에게 공지된 기술에 따라 불활성화될 수 있다. 불활성화는 바람직하게는 화학적 루트, 예컨대 항원을 포름알데히드(포르말린), 파라포름알데히드, 베타-프로피올락톤 또는 에틸렌이민 또는 이의 유도체와 같은 화학제에 노출시켜 실시한다. 여기에서 불활성화의 바람직한 방법은 화학제, 특히 에틸렌이민 또는 베타-프로피올락톤에 노출시키는 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 불활성화 백신은, 보조제로, 유리하게는 당업자에게 공지된 기술에 따라 에멀션, 예컨대 유중수 또는 수중유 형태로 보충될 것이다. 보조제는 또한 통상의 보조제 화합물의 활성성분으로의 도입으로부터 유래하는 것이 가능할 것이다.
사용할 수 있는 보조제들 중 예로는, 알루미늄 히드록시드, 사포닌 (예, Quillaja saponin or Quil A; 참고 Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Michael F. Powel 및 Mark J. Newman 저, Plennum 출판, 뉴욕 & 런던, p.210), Avridine (등록상표) (Vaccine Design p. 148), DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, Vaccine Design p. 157), 폴리포스파젠 (Vaccine Design p.204) 또는 대안적으로 광물유, 스쿠알렌 (예, SPT 에멀션, Vaccine Design p.147), 스쿠알렌 (예, MF59, Vaccine Design p. 183) 에 기초한 수중유 에멀션, 또는 신진대사성 오일 (바람직하게는 WO-A-94 20071 에 따른 그것) 에 기초한 유중수 에멀션 및 US-A-5,422,109 에 기술된 에멀션을 들 수 있다. 또한, 보조물과의 조합물, 예를 들어 에멀션과 조합된 Avridine
Figure 112009026519635-PAT00001
또는 DDA 를 선택하는 것도 가능하다.
이러한 백신은 바람직하게는 106 내지 108 TCID50 을 포함할 것이다.
생백신 보조제는 불활성화 백신용 보조제들로부터 선택할 수 있다. 에멀션이 바람직하다. 불활성화 백신으로 나타낸 것들에, WO-A-9416681 에 기술된 것들을 포함시킬 수 있다.
냉동건조 안정화제의 예로서, SPGA (Bovarnik et al., J. Bacteriology 59, 509, 950), 탄수화물 예컨대 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로오스, 덱스트란 또는 글루코오스, 단백질, 예컨대 알부민 또는 카제인, 이러한 화합물의 유도체 또는 알칼리 금속 포스페이트와 같은 완충제를 들 수 있다.
본 출원인은 또한 확인된 서열번호 1 내지 4, 및 선택적으로는 6 의 4 개의 단리물의 게놈을 수득하였다.
그러므로, 본 발명의 주제는 이러한 서열중 하나의 일부 또는 전부를 포함하는 DNA 단편이다. 말할 필요도 없이, 본 발명에는 자동적으로 동등한 서열, 즉, 기술된 서열 또는 이 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 기능성 또는 균주-특이성을 변화시키지 않는 서열도 포함된다. 물론 여기에는 코드의 변성에 의해 분화된 서열도 포함된다.
또한 본 발명은 높은 엄격한 조건하에서 상기 서열과 혼성화할 수 있고/있거나 본 발명의 균주와 높은 상동성을 갖고 상술한 II 군에 속하는 의미에서의 동등 서열도 포함한다.
이러한 서열 및 이들의 단편은 유리하게는 적당한 벡터를 이용하여 폴리펩티드의 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로 발현을 위하여 사용할 수 있다.
특히, DNA 단편으로 사용할 수 있는, 본 발명에 따른 DNA 단편을 형성시키는 오픈리딩프레임은 II 형 서코바이러스의 게놈 서열상에서 확인되었다. 본 발명은 이러한 오픈리딩프레임 (아미노산 서열에 해당) 중 하나이상을 함유하는 임의의 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 주로 ORF4, ORF7, ORF10 또는 ORF13 로 구성된 단백질에 관한 것이다.
인 비트로에서의 서브유니트 발현을 위한 발현 수단으로, 대장균 또는 배큘로바이러스를 바람직하게 사용한다 (US-A-4,745,051). 코딩 서열 또는 그들 단편을 배큘로바이러스 게놈 (예, baculovirus Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV) 안에 혼입 시키고, 이를 예로써 Spodoptera frugiperda Sf9 (기탁번호 ATCC CRL 1711)인 곤충 세포 내에서 증폭시킨다. 서브유니트는 이스트 (예, Saccharomyces cerevisiae) 또는 포유동물 세포 (예, CHO, BHK) 내에서 또한 제조할 수 있다.
본 발명의 주제는 또한, 이들 발현 수단에 의해 인 비트로로 제조되어, 임의로 통상기술에 의해 정제되는 폴리펩티드이다. 본 발명의 주제는 또한, 이렇게 하여 수득한, 수의학적 면에서 허용되는 부형제 또는 희석제 내의, 그리고 수의학적 면에서 허용되는 임의의 보조제 내의 폴리펩티드 또는 단편 하나 이상을 포함하는 서브유니트 백신이다.
재조합 생 백신 제조를 위한 인 비보 (in vivo) 발현을 위해서, 코딩 서열 (들) 또는 이들의 단편을, 폴리펩티드(들)의 발현을 가능하게 하는 조건하에서, 적절한 발현 벡터 내로 삽입한다. 적절한 벡터로는, 생 바이러스, 바람직하게는 돼지에서 번식하는 것으로 돼지에게는 병원성 (pathogenic)이 아닌 것으로서, 당업자 공지의 기술에 의거한 것을 사용한다. 아우제스키 (Aujeszky)병 바이러스, 돼지 아데노바이러스, 폭스바이러스, 특히 백시니아바이러스, 아비폭스바이러스, 카나리폭스바이러스, 스와인폭스 바이러스와 같은 돼지 헤르페스바이러스를 사용할 수 있다. 플라스미드 DNA 또한 벡터로 사용할 수 있다 (WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797, WO-A-95 20660).
따라서 본 발명의 주제는, 또한, 벡터 및 재조합 생 백신 또는 제조된 플라스미드 백신 (폴리뉴클레오티드 또는 DNA 백신), 수의학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 백신이다. 본 발명에 따른 백신 (생 증강된, 비활성화된, 서브유니트, 재조합 및 플라스미드 백신)은 본 발명에 따른 서코바이러스의 하나 이상 (2 또는 3)의 활성 성분 (항원) 하나 이상을 함유할 수 있다.
상기한 각 백신 타입에 있어, 본 발명은 또한 다른 돼지 병원체 (pathogen), 특히 PMSW 증후군과 연관될 수 있는 것에 대항한 백신화와, 돼지 서코바이러스에 대항한 백신화를 결합하는 것을 제공한다. 본 발명에 따른 백신, 특히 비활성화 된 것은, 다른 돼지 병원체에 해당하는 다른 밸런시를 함유할 수 있다. 이러한 다 른 돼지 병원으로는, 바람직하게는 PRRS (Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome) (당업자는 다음을 참조할 수 있다: WO-A-93/07898, WO-A-94/18311, FR-A-2 709 966; C.chareyre 등, Proceedings of the 15th IPVS Congress, Birmingham, England, 5-9 July 1998, p139; 거기에 참고로 편입) 및/또는 Mycoplasma hyopneumonia (당업자는 다음을 참조: EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A-571 648; O. Martinon 등, p157, 284, 285 및 G.Reynaud 등, p150, 상기 모두는 Proceedings for the 15th IPVS Congress; 거기에 참고로 편입)를 생각해 볼 수 있다. 다른 흥미로운 수가 중에서, 흉 막폐렴균, 대장균, 돼지 위축성 비염 및 또한 가성 광견병 (에스키 병), 돼지 콜레라, 돼지 인플루엔자를 여전히 언급할 수 있다.
본 발명의 주제는 또한, 본 발명에 따른 서코바이러스에 대한 돼지의 면역반응을 유도할 수 있는 방법에 관한 것이다. 특히 이에 관한 주제로는, 돼지에게 있어 유효한 백신화 방법이다.
상기 방법은, 상기 백신의 하나 이상 분량을 돼지에게 투여하는 것을 제공한다. 동일 백신화 프로토콜로 상기 각종의 백신들을 조합하는 것 또한 가능하다.
이러한 방법은 성숙한 돼지 뿐 아니라, 어린 돼지 또는 임신한 암컷에 대한 투여를 제공한다. 후자에 대한 백신화는, 신생 돼지에 대한 수동적인 면역화를 가능하게 한다 (모성 항체).
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 서코바이러스의 돼지 내 존재 여부의 진단 가능성을 제공한다. 따라는, 이러한 주제는, 하기에서 설명되는 진단 시험 및 시 약 사용과 연관된 방법에 관한 것이다.
상이한 서코바이러스의 서열 정보는, 알려진 모든 돼지 서코바이러스를 인지할 수 있는 시약을 제조하는 것을 가능하게 하는, 일반 서열의 규명을 가능하게 한다.
당업자는, 특정 진단을 수행하기 위해, 해당 PK/15 서코바이러스 서열과 유사성이 없거나 적은 영역에 해당하는 서열의 단편을 또한 선택할 수 있다.
서열 비교는, 당업자가 그들 목적에 따른 시약의 선택이 가능하도록 한다.
제 1 시약은, 여기에 개시된 DNA 서열 및 그들 단편, 특히 공지의 하이브리다이제이션 또는 PCR (polymerase chain reaction) 기술에서 프로브 또는 프라이머로 사용될 수 있는 것을 포함한다.
제 2 시약은, 벡터(상기 참조)의 도움으로 발현되는, 또는 바이러스 서열로부터 코딩되는 폴리펩티드, 또는, 펩타이드 합성에서 통상 기술에 따르는 화학경로에 의해 합성되는 폴리펩티드를 포함한다.
제 3 및 제 4 시약은, 테스트하고자하는 돼지의 생리액체 (피, 혈장, 혈청 등) 샘플, 또는 조직 샘플 (신경절, 간, 폐, 신장 등) 상에서, 항원 자체 또는 이들 항원에 대항하는 항체를 조사함으로써, 본 발명에 따른 서코바이러스 특이 항원의 존재를 위한 테스트를 시행하는, 본 발명의 주제인 진단 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항원과 항체는, 임의의 공지 실험 진단 기술에서도 사용될 수 있다.
그러나, 수의사, 동물 사육자 또는 소유자 현장의 기술 내에서 이들을 직접 사용하는 것이 바람직하다. 당업자는, 다양한 실험 및 현장 기술 영역을 가지며, 따라서 이들 항원 및/또는 항체를 진단 시약 (들)으로 사용하도록 응용하는데 완벽한 위치에 놓여 있다.
본 발명의 구조 내에서 바람직하게 사용되는 진단 기술은, 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 형광법(immunofluorescence), ELISA 및 면역크로마토그래피(immunochromatography)이다.
면역크로마토그래피법의 사용에 관하여, 전문가는 특히 Robert F. Zurk 등의 Clin.Chem. 31/7 1144-1150 (1985) 및 하기의 특허 및 특허 출원을 참조할 수 있다: WO-A-88/08 534, WO-A-91/12528, EP-A-291 176, EP-A-299 428, EP-A-291 194, EP-A-284 232, US-A-5 120 643, US-A-5 030 558, US-A-5 266 497, US-A-4 740 468, US-A-5 266 497, US-A-4 855 240, US-A-5 451 504, US-A-5 141 850, US-A-5 232 835 및 US-A-5 238 652.
따라서, 경쟁 또는 치환에 의한 간접 테스트에 의해 샘플 내의 특이 항체를 측정하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 항원 자체, 또는 항원체 인식을 소지한 이들 항원 단편을 진단 시약으로 사용한다. 표지화는, 유리하게는 퍼옥시다제 표지화, 또는 바람직하게는 콜로이드성 금 (colloidal gold)인 특수 표지화이다.
이러한 항원에 대해 특이적인 표지화 항체를 이용하여 샘플 내의 항원 자체를 측정하는 것 또한 바람직하다. 표지화는 상기에 유리하게 기술되었다.
특히 경쟁 또는 치환에 사용되거나 항원 자체 검증에 사용되는 항원 특이성 항체는, 항원 특이성의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 이들 항체의 단편, 바람직하게는 Fab 또는 F(ab)'2 단편이다.
본 발명의 다른 주제는, 본 발명에 따른 항원에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조에 관한 것으로, 이들 항체를 이용하여, 생리 액체 샘플 또는 조직 샘플 내의 항원을 측정하고, 나아가 그러한 샘플 또는 시험 대상에 존재하는 항체의 측정을 위한 진단 시약으로 특히 사용하는 것에 관한다. 본 발명은 또한, 특히 Fab 또는 F(ab)'2 단편인, 이들 항체의 면역학적으로 기능성인 단편을 포함한다.
항체는 공지 방법으로 제조할 수 있다. 참고 문헌은 하기와 같으며, 이들의 내용은 여기에 참고로 편입된다: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, USA, 또는 J.W. Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice, Academic Press Inc.
특히, 이미 알려진 바와 같이, 항원 또는 그들 단편 하나 이상으로 면역화된 마우스의 비장 세포를, 적절한 골수 (myelomatus) 세포와 융합시키는 것이 가능하다.
본 발명의 주제는 또한, 바람직하게는 순수한, 또는 부분적으로 순수한, 또는 정제되지 않은, 항원에 특이성인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 특히 토끼 또는 마우스 항체의 제조에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 관심상의 백신의 에피토프, 또는 진단용 관심상의 에피토프 인, 여기에 기술된 DNA 서열에 특히 기초한 관심상의 에피토프 측정을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 서코바이러스 게놈의 DNA 서열로부터, 당업자는 공지의 기술, 예로써 적절한 컴퓨터 프로그램 또는 PEPSCAN에 의하여 에피토프를 측정할 수 있다. 에피토프는 단백질의 면역 결정 영역으로, 단백질 표면의 노출 영역이다. 따라서 이들은, 항체에 의해 인지되어 진단용의 항체 제조, 또는 진단 시약으로 사용될 수 있는 해당 펩타이드 제조를 위한 진단 분야에 특히 사용된다.
아주 최소한으로, 에피토프는 8 내지 9 개 아미노산을 소지한 펩타이드이다. 최소한 13 내지 25개의 아미노산이 바람직하다.
따라서 당업자는, 이들 기술 및 기타 사용 가능한 기술을 이용하여, 진단 목적의 펩타이드 또는 항체를 사용하여 에피토프를 찾아낼 수 있다.
본 발명의 주제는 또한, 이들 항원 및/또는 이들 항원에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함하는 진단용 키트에 관한 것이다. 이들 키트는 특히, 상기 진단 기술에 해당하는 진단 키트이다.
본 발명은 PMWS 증후군 (Porcine Multisystemic Wasting Syndrome 또는 Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome)과 관련된 새로운 돼지 서코바이러스 균주 (PCV: Porcine CircoVirus), 이러한 균주를 검출할 수 있는 시약 및 방법, 백신 및 백신화방법 및 이러한 시약 및 백신의 제조방법을 제공한다.
본 발명을 이제, 비제한적인 예시적 구현예와 하기의 도면을 참조하여 보다 자세히 설명하고자한다.
도 1: Imp.1011-48121주 게놈의 DNA 서열
도 2: Imp.1011-48285주 게놈의 DNA 서열
도 3: Imp.999주 게놈의 DNA 서열
도 4: Imp.1010주 게놈의 DNA 서열
도 5: 도 1 내지 4의 4개 서열과, PCV PK/15주 서열의 비교
도 6: 1997.10.03 프랑스에서 최초 출원된 바와 같은, Imp.999주 게놈의 DNA 서열
도 7: 도 6 서열과 PK/15주 서열의 비교
서열표 목록의 서열번호
서열번호 1 Imp. 1011-48121 균주의 게놈의 DNA 서열
서열번호 2 Imp. 1011-48285 균주의 게놈의 DNA 서열
서열번호 3 Imp. 999 균주의 게놈의 DNA 서열
서열번호 4 Imp. 1010 균주의 게놈의 DNA 서열
서열번호 5 PK/15 균주의 게놈의 DNA 서열
서열번호 6 첫 번째 출원 (프랑스, 1997년 10월 3일)에서 정의된 바와 같은
Imp. 999 균주의 게놈의 DNA 서열
실시예
실시예 1: 돼지 서코바이러스 균주의 배양 및 분리
조직 시료를 프랑스, 캐나다 및 미국에서 새끼 돼지의 폐 및 림프절로 부터 취합하였다. 상기 새끼 돼지는 이유기후 다전신성 쇠약 증후군의 전형적인 임상적 징후를 나타낸다. 바이러스의 분리를 용이하게 하기 위해서, 조직시료를 검시후 즉시 -70 ℃에서 동결시켰다.
바이러스 분리를 위해서, 약 15 % 조직시료를 함유하는 현탁액을, 조직을 멸균 막자 및 막자사발을 이용하여 멸균 모래와 함께 분쇄하여, Earle's 염(EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham, UK), 페니실신 (100 IU/ml) 및 스트렙토마이신 (100 ㎍/ml)을 함유하는 최소 배지(MEM-SA 배지)중에서 제조하였다. 상기 분쇄 제조물을 이어서 MEM-SA 중에서 수합한 다음 +4 ℃에서 30분간 3000g 로 원심분리하여 상청액을 수득하였다.
세포 배양액의 접종전에, 100 ㎕ 부피의 클로로포름을 2 ml의 각 상청액에 첨가하고 실온에서 10 분간 지속적으로 혼합한다. 이러한 혼합물을 이어서 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 3000g 로 10분간 원심분리한 다음, 상청액을 수득하였다. 이러한 상청액은 이어서 바이러스 분리 실험용 접종물로서 사용된다.
모든 바이러스 분리 연구는, 돼지 서코바이러스 (PCV), 페스티바이러스, 돼지 아데노바이러스 및 돼지 파르보바이러스로 오염되지 않은 것으로 알려진 PK/15 세포 배양액에서 수행된다 [Allan G. et al Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64].
돼지 서코바이러스의 분리는 하기 방법에 따라서 수행된다:
PK/15 세포의 단일층을 콘플루엔트 배양액으로부터 (트립신-베르센 혼합물로의)트립신화에 의해서 유리시키고, 페스티바이러스로 오염되지 않은 15% 소 태아 혈청을 함유하는 MEM-SA 배지 (=MEM-G 배지)에서 ml당 약 400,000 세포의 최종농도로 수합하였다. 상기 세포 현탁액의 10 ml 분주 분획을 이어서 상기 기재된 접종물의 2 ml의 분주 분획과 혼합하고, 최종 혼합물을 2 개의 25 cm2 의 팔콘 플라스크에 6 ml의 부피로 분주한다. 상기 배양액을 이어서 10% CO2 를 함유하는 대기하에서 +37 ℃로 18 시간 동안 항온배양시킨다.
항온배양 후, 세미-콘플루엔트 단일층의 배양 배지를 300 mM D-글루코사민 (Cat # G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, UK)으로 처리하고 [Tischr I. et al., Arch. Virol., 1987 96 39-57], 이어서 +37 ℃에서 추가적으로 48-72 시간 동안 항온배양을 계속하였다. 상기 마지막 항온배양에 이어서, 각 접종물의 2 개의 팔콘중 하나를 3 회의 연속적인 동결/해동 사이클을 수행한다. 나머지 팔콘의 PK/15 세포를 트립신-베르센 용액으로 처리하고, 20 ml의 MEM-G 배지에 재현탁시키고, 이어서 75 cm 팔콘에 400,000 세포/ml의 농도로 접종하였다. 새롭게 접종된 플라스크를 이어서 동결/해동 사이클 후 수득된 용해물을 5 ml 첨가하여 "중감염(superinfected)"시켰다.
실시예 2: 면역형광법 또는 인시츄 혼성화에 의한 돼지 서코바이러스의 검출을 위한 세포 배양액 시료의 제조
5 ml 부피의 "중감염된" 현탁액을 수합하여, 멸균되고 기름끼 없는 유리 커버슬립을 포함하는 직경 55 mm 의 페트리디쉬에 접종한다. 플라스크내 및 유리 커버슬립상에서의 배양물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 +37 ℃에서 항온배양하고, 글루코사민으로 처리한다. 유리 커버슬립상에서의 배양물을 글루코사민 처리 24 내지 48 시간 후 수합하고, 실온에서 10 분간 아세톤으로 또는 10 % 완충화된 포름알데히드로 4 시간 동안 고정시킨다. 고정시킨 다음, 모든 유리 커버슬립을, 인시츄 혼성화 (in situ hybridization) 연구 및 면역세포화학적 표지 연구를 위해 사용전에, 실리카겔상에서 -70 ℃로 보관한다.
실시예 3: 인시츄 혼성화에 의한 PCV 서열의 검출 방법
인시츄 혼성화는 병든 돼지로부터 수합하여 포름알데히드로 고정시킨 조직, 및 또한 바이러스 분리 (실시예 2 참조)를 위해 접종되고 유리 커버슬립상에 고정된 세포 배양액의 제조물에서 수행되었다.
PK/15 돼지 서코바이러스 (PCV) 및 전염성 닭 빈혈증 바이러스 (CAV)에 해당하는 완전 게놈성 프로브가 사용된다. 하나의 1.7 킬로 염기쌍 (kbp) 삽입물의 형태로 클론된, PCV 게놈의 복제형 분자를 함유하는 플라스미드 pPCV1 [Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227] 가 PCV 용 특이적 바이러스 DNA 원료로서 사용된다. 조류 서코바이러스 CAV 의 2.3 kbp 복제형 분자를 함유하는, 유사한 플라스미드 pCAA1 이 네가티브 콘트롤로서 사용된다. 상기 두 플라스미드의 각각의 글리세롤 저장물이 알칼리성 용해 방법 [Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 따라서 플라스미드 생성 및 정제를 위해 사용되므로, 그들은 이어서 프로브 제조를 위한 주형으로도 사용된다. PCV 및 CAV의 완전 게놈의 대표적인 서코바이러스 프로브는, 공급자의 추천에 따라서 시판되는 비방능성 표지 키트 ("DIG DNA labelling kit", Boehringer Mannheim, Lewes, UK) 를 이용하여 무작위로 헥사뉴클레오티드 프라이머 및 상기 기재된 정제되어진 정제된 플라스미드 (각 프로브를 위해 1 ㎍) 로부터 제조된다.
디곡시게닌-표지된 프로브를 인시츄 혼성화를 위해 사용하기 전에 멸균수 50-100 ㎕ 부피로 수합한다.
파라핀으로 싸여있고 포름알데히드로 고정된 병든 돼지 조직 시료, 및 포름알데히드로 고정된 감염된 세포 배양액의 제조물이 하기 방법에 따라 PCV 핵산의 검출을 위해 제조되었다:
5 ㎛ 두께 부분을 파라핀으로 싸여진 조직 덩어리에서 잘라내고, 파라핀을 제거한 다음 알콜용액으로 연속적으로 재수화시켜 농도를 감소시킨다. 조직 부분 및 포름알데히드로 고정된 세포 배양액을 5 mM EDTA를 함유하는 0.05 M 트리스-HCl 완충액 (pH 7.6)중 0.5 % 프로테이나제 K 용액중에서 +37 ℃ 로 15분 및 5분간 각각 항온배양시킨다. 슬라이드를 이어서 오토클레이브한 증류수중 1 % 글리신 용액내에 30 초간 위치시키고, 0.01 M PBS 완충액 (인산 완충된 식염수) (pH 7.2) 로 2회 세척하고, 마지막으로 멸균 증류수로 5분간 세척한다. 이들을 최종적으로 열린 공기중에서 건조시키고 프로브와 접촉되도록 위치시킨다.
각 조직/프로브 제조물을 깨끗하고 기름끼 없는 유리 커버슬립으로 덮은 다음 +90 ℃의 오븐내에 10분간 위치시키고, 이어서 얼음 덩어리와 1분간 접촉시키고, 마지막으로 +37 ℃에서 18시간 동안 항온배양시킨다. 상기 제조물을 이어서 2×시트르산나트륨염 (SSC) 완충액 (pH 7.0) 중에 잠시 담그었다가 보호용 유리 커버슬립을 제거하고, 이어서 2×SSC 완충액으로 5분간 2회 세척하고, 최종적으로 PBS 완충액으로 5분간 2회 세척한다.
상기 세척 후, 제조물을 0.1 M 말레산, 0.15 M NaCl (pH 7.5)의 용액 (말레산 완충액)에 10 분간 침지시킨 다음, 말레산 완충액중 블로킹 시약 (Cat # 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK)의 1 % 용액중에서 +37 ℃로 20분간 항온배양시킨다.
상기 제조물을 이어서 항-디곡시게닌 모노클론성 항체 (Boehringer Mannheim)의 1/250 용액과 함께 항온배양하고, 블록킹 완충액으로 +37 ℃ 에서 1시간 동안 희석시키고, PBS 로 세척한 다음 마지막으로 비오티닐화 항-마우스 이뮤노글로블린 항체와 함께 +37 ℃ 에서 30분간 항온배양시킨다.
상기 제조물을 PBS 로 세척하고, 내생적 퍼옥시다제 활성을 PBS 중 0.5 % 과산화수소 용액으로 실온에서 20분산 처리하여 차단시킨다. 상기 제조물을 다시 PBS 로 세척하고 사용 직전에 제조된 3-아미노-9-디에틸카르바졸 (AEC) 기질 (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK)로 처리한다.
수돗물로 최종 세척 후, 상기 제조물을 수돗물에서 "파란색"을 나타내는 헤마토크실린으로 대비염색시키고, 현미경 유리 커버슬립위에 마운팅액 (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK)과 함께 올려놓는다. 시험 콘트롤로는 병든 돼지 및 병들지 않은 돼지로부터 수득된 시료에 대해 관련성없는 네가티브 프로브 (CAV) 및 포지티브 프로브 (PCV)가 사용된다.
실시예 4: 면역형광법에 의한 PCV 의 검출방법
아세톤으로 고정된 모든 세포 배양 제조물의 초기 스크리닝은 성장한 돼지 혈청 풀의 1/00 희석액을 이용하여 간접적인 면역형광법 (IIF)에 의해 수행된다. 상기 혈청 풀은 북아일랜드산 25 마리의 성장한 암퇘지로부터의 혈청으로 이루어지고 PCV 를 포함하여 다양한 종류의 돼지 바이러스: 돼지 파르보바이러스, 돼지 아데노바이러스, 및 PRRS 바이러스에 대한 항체를 함유하는 것으로 알려져있다. 상기 IIF 방법은 상기 혈청(PBS 중에 희석)을 세포 배양물과 +37 ℃에서 1 시간 동안 접촉시킨 다음, PBS 로 2 회 세척함으로써 수행된다. 상기 세포 배양물을 이어서 플루오레세인 이소티아시아네이트와 접합된 토끼 항-돼지 이뮤노글로불린 항체의 PBS 중 1/80 희석액으로 1 시간 동안 염색한 다음, PBS 로 세척하고 글리세롤 완충액에 위치시킨 후 현미경으로 자외선하에 관찰한다.
실시예 5: 병든 돼지 조직상에서 인시츄 혼성화의 결과
다전신성 쇠약 장애를 가진 프랑스, 캐나다 및 캘리포니아산 새끼 돼지로부터 취합된 조직으로부터 제조되고 포름알데히드로 고정된 PCV 게놈 프로브를 이용한, 인시츄 혼성화는 연구된 몇몇 장애에서 장애와 연관된 PCV 핵산의 존재를 나타내었다. PCV 게놈 프로브가 병들지 않은 돼지로부터 취합된 조직에 사용되거나 또는 CAV 프로브가 병든 돼지 조직상에 사용된 경우에는 아무런 시그날도 관찰되지 않았다. PCV 핵산의 존재는 캘리포니아산 새끼 돼지의 폐에 상기 장애가 침투한 수많은 단핵성 세포의 세포질 및 핵에서 확인되었다. PCV 핵산의 존재는 폐포세포, 기관지 및 세기관지 상피세포, 및 소동맥, 소정맥 및 림프관의 내피세포에서 증명되었다.
병든 프랑스산 돼지에서, PCV 핵산의 존재는 수많은 소포의 림프구의 세포질 및 림프절의 동양혈관내 단핵세포에서 검출되었다. PCV 핵산은 또한 예비 합포체에서 검출되었다. 상기 검출 결과에 따라, 캘리포니아산 돼지 폐, 프랑스산 돼지 장간막 림프절 및 캐나다산 돼지 장기의 시료를 신규한 돼지 서코바이러스 균주의 분리를 위해 선별하였다.
실시예 6: 신규한 돼지 서코바이러스 균주의 세포 배양 및 면역형광법에 의한 검출의 결과
다전신성 쇠약 증후군의 임상적 증후를 나타내는 프랑스산 새끼 돼지 (Imp.1008 균주), 캘리포니아산 새끼 돼지 (Imp.999 균주) 및 캐나다산 새끼 돼지 (Imp.1010 균주) 로부터 취합한 시료로 접종된 세포 배양액에서는 세포변성 효과 (cytopathic effect; CPE)가 관찰되지 않았다. 그러나, 아세톤을 이용하여 고정시킨 후 상기 접종된 세포 배양액으로부터 수득된 제조물의 돼지 폴리클론성 혈청 풀로의 면역표지는 캘리포니아산 새끼 돼지 (Imp.999 균주)의 폐, 프랑스산 새끼 돼지 (Imp.1008 균주)의 장간막 림프절, 및 캐나다산 새끼 돼지 (Imp.1010 균주)의 장기를 이용하여 접종된 배양물에서의 수많은 세포내에서 핵의 형광성을 나타낸다.
실시예 7: 돼지 서코바이러스의 게놈 DNA 의 추출
CAV 의 복제형 분자의 클로닝에 대해 기재된 바와 같이 [Todd. D. et al. Dot blot hybridization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 933-939], 돼지 서코바이러스 (PCV)의 새로운 균주의 복제형 분자는 72-76 시간 항온배양 후 수합되고 글루코사민 처리된 감염된 PK/15 세포 배양물 (실시예 1 참조) (10개의 75 cm2 의 팔콘)를 이용하여 제조되었다. 상기 복제형 분자의 이중-가닥 DNA 를, Molitor (Molitor T.W. et al. Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates, Virology, 1984, 137, 241-254)에 의해 기재된 바와 같이, Hirt 방법의 변법 [Hirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365-369] 에 따라 추출하였다.
실시예 8: 돼지 서코바이러스 Imp.999 균주의 게놈의 복제형 분자의 제한효소 지도
Hirt 방법에 따라 추출된 DNA (1-5 ㎍)를 공급자의 추천에 따라 S1 뉴클레아제 (Amersham)으로 처리한 다음, 상기 DNA 를 각종 제한효소(Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, UK)로 절단시키고, Todd 등에 의해 기재된 바와 같이 [Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823], 절단된 생성물을 에티듐브로마이드의 존재하에 1.5 % 아가로스 겔상에서 전기영동하여 분리하였다. Imp.999 균주의 배양물로부터 추출된 DNA 는 하나의 EcoRI 부위, 2 개의 SacI 부위를 포함하고, PstI 부위는 없다. 그러므로, 이러한 제한효소 프로파일은, 대조적으로 PstI 부위는 포함하고 있으나 EcoRI 부위는 전혀 포함하지 않고있는 PCV PK/15 균주에 의해 나타난 제한효소 프로파일 [Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA; affinities with plant circoviruses, 1997 78, 221-227]과는 다르다.
실시예 9: 돼지 서코바이러스 Imp.999 균주의 게놈의 클로닝
PCV Imp.999 균주의 이중가닥 복제형 분자를 제한효소 EcoRI 으로 절단하여 생성된 약 1.8 kbp 의 제한 단편을 시판되는 퀴아젠 키트 (QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK)를 이용하여 1.5 % 아가로스 겔상에서의 전기영동 (실시예 3 참조)하여 분리하였다. 상기 EcoRI-EcoRI 제한 단편을 이어서, 표준적인 클로닝 방법 [Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 따라, 미리 동일한 제한효소로 절단하고 탈인산화시킨, 벡터 pGEM-7 (Promega, Medical Supply Company, Dublin, Ireland)에 결찰시켰다. 수득된 플라스미드를 표준 방법에 따라 대장균 JM109 숙주균주 (Stratagene, La Jolla, USA)로 형질전환시켰다. PCV Imp.999 균주의 EcoRI-EcoRI 제한 단편을 또한 벡터 pBlueScript SK+ (Stratagene Inc. La Jolla, USA)의 EcoRI 부위로 클론시켰다. 각 숙주균주에 대해 수득된 클론중에, 예측되는 크기의 단편들을 함유하는 2 개 이상의 클론을 선별하였다. 수득된 클론을 이어서 배양하고 Imp.999 균주의 완전한 게놈을 함유하는 플라스미드를, 표준 플라스미드 제법 및 정제 방법에 따라서, 소량 부피 (2 ml) 또는 대량 부피 (250 ml)로 정제하였 다.
실시예 10: PCV Imp.999 균주의 게놈 DNA (이중가닥 복제형 분자)의 서열분석
2 개의 EcoRI Imp.999 클론 (클론 pGEM-7/2 및 pGEM-7/8)의 뉴클레오티드 서열을, 시퀀싱 키트 "AmpliTaq DNA polymerase FS" (Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK) 및 공급자의 추천에 따른 Applied BioSystems AB1373A 자동 서열분석기를 이용하는, 생거 디데옥시뉴클레오티드 방법에 따라서 결정하였다. 초기 시퀀싱 반응을 M13 "전방성" 및 "후방성" 유니버설 프라이머로 수행하였다. 다음 시퀀싱 반응은 "DNA walking" 방법에 따라서 이루어졌다. 상기 잇따른 시퀀싱에 필요한 올리고뉴클레오티드를 라이프 테크놀로지 (Inchinnan Business Park, Paisley, UK)에 의해 합성하였다.
생성된 서열을 모아서 MacDNASIS 버전 3.2 소프트웨어 (Cat # 22020101, Appligene, Durham, UK)로 분석하였다. 다양한 오픈 리딩 프레임을 "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) 서버상에서 이용가능한 BLAST 알고리듬에 의해서 분석하였다.
클론 pGEM-7/8 (서열번호 6)으로부터 처음에 수득된 완전 서열 (EcoRI-EcoRI 단편)을 도 6에 나타내었다. 이는 EcoRI 부위의 G 이후부터 임의대로 출발하여 뉴클레오티드의 측면에서 몇가지 불확실성을 나타낸다.
시퀀싱은 이어서 최대한 활용되고 서열번호 3 (도 3)은 상기 균주의 전체 서열을 나타내는데, 이는 EcoRI 부위에서 시작으로하여 임의대로 출발한 것으로, 즉 G 가 첫 번째 뉴클레오티드이다.
상기 방법은 본 발명에 따른 또 다른 3 개의 분리물의 서열을 수득하기 위해 유사한 방법으로 수행되었다 (서열번호 1, 2 및 4 및 도 1, 2 및 4 참조)
상기 4 개의 균주의 게놈 크기는 하기와 같다 :
Imp. 1011-48121 1767 뉴클레오티드
Imp. 1011-48285 1767 뉴클레오티드
Imp. 999 1768 뉴클레오티드
Imp. 1010 1768 뉴클레오티드
실시예 11: PCV Imp.999 균주의 서열 분석
Imp.999 균주로부터 생성된 서열을 사용하여 진뱅크 데이타뱅크에 포함된 서열에 대해서 상동성을 시험하여, 검출된 유일한 의미있는 상동성은 PK/15 균주 (기탁번호 Y09921 및 U49186)의 서열에 대해 (핵산 수준에서) 약 76 % 의 상동성이었다 (도 5 참조).
아미노산 수준에서, 데이타뱅크 (NCBI 서버에 대한 BLAST X 알고리듬)을 이용한 6 가지 상태에서 서열의 번역상의 상동성에 대한 시험은 GenBank U49186 서열에 의해 코드된 식물의 서코바이러스 (GenBank identification number 1841515)과 유사한 BBTV 바이러스의 이론상의 레클리카제에 상응하는 오픈 리딩 프레임과 94 % 상동성을 나타낼 수 있다.
PCV Imp.999 균주로부터 생성된 서열과 의미있는 상동성을 나타내는 데이타뱅크에 포함된 다른 서열은 없다.
다전신성 쇠약 증후군의 임상적 증후를 가진 캘리포니아산 새끼 돼지로부터 취합한 장애를 이용하여 배양된 Imp.999 균주로부터 수득된 서열의 분석은 상기 바이러스 분리물이 신규한 돼지 서코바이러스 균주라는 것을 분명히 나타낸다.
실시예 12: 서열의 비교 분석
4 개의 새로운 PCV 균주의 뉴클레오티드 서열을 PCV PK/15 균주의 서열과 정렬시켰다 (도 5). 4 개의 새로운 균주 및 이전의 PK/15 균주를 설명하는 상동성 행렬을 구축하였다. 결과는 하기와 같다:
1: Imp. 1011-48121
2: Imp. 1011-48285
3: Imp. 999
4: Imp. 1010
5: PK/15
1 2 3 4 5
1 1.0000 0.9977 0.9615 0.9621 0.7600
2 1.0000 0.9621 0.9632 0.7594
3 1.0000 0.9949 0.7560
4 1.0000 0.7566
5 1.0000
두 프랑스산 균주 Imp. 1011-48121 및 Imp. 1011-48285 사이의 상동성은 99 % 초과 (0.9977)이다.
두 북아메리카산 균주 Imp. 999 및 Imp. 1010 사이의 상동성 또한 99 % 초과 (0.9949)이다. 프랑스산 균주 및 북아메리카산 균주 사이의 상동성은 96 % 보다 약간 크다.
상기의 모든 균주와 PK/15 사이의 상동성은 75 내지 76 % 의 값이다.
이로부터 본 발명에 따른 균주가, PK/15 균주로 나타내는 형태와는 차이가 있는, 대표적인 새로운 형태의 돼지 서코바이러스라는 것이 추정된다. PMWS 증후군을 나타내는 돼지로부터 분리된, 상기의 새로운 타입을 타입 II 돼지 서코바이러스, 타입 I 으로 나타낸 PK/15로 부른다. 상기 타입 II 에 속하는 균주들은, 그들이 사실상 매우 떨어진 지리학적 지역으로부터 분리되었다해도, 뉴클레오티드 서열의 상당한 동질성을 나타낸다.
실시예 13: 신규한 PCV 균주의 게놈에 의해 코드되는 단백질의 분석
Imp. 1010 분리물의 뉴크레오티드 서열은 다전신성 쇠약 증후군과 관련된 대표적인 또 다른 서코바이러스 균주인 것으로 간주된다. 상기 서열을 BLASTX 알고리듬 (Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410) 및 MacVector 6.0 소프트웨어 세트 (Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK)의 프로그램 조합을 이용하여 보다 상세하게 분석하였다. 상기 서열 (고리형 게놈)상에서 20 개 초과 아미노산의 크기의 오픈 리딩 프레임 (또는 ORF) 13 개를 검출할 수 있었다. 상기 13 개의 ORF 는 하기와 같다:
이름 출발 끝 가닥 ORF 의 크기 (뉴클레오티드(nt)) 단백질 크기 (아미노산 (aa))
ORF1 103 210 센스 108 nt 35 aa
ORF2 1180 1317 센스 138 nt 45 aa
ORF3 1363 1524 센스 162 nt 53 aa
ORF4 398 1342 센스 945 nt 314 aa
ORF5 900 1079 센스 180 nt 59 aa
ORF6 1254 1334 센스 81 nt 26 aa
ORF7 1018 704 안티센스 315 nt 104 aa
ORF8 439 311 안티센스 129 nt 42 aa
ORF9 190 101 안티센스 90 nt 29 aa
ORF10 912 733 안티센스 180 nt 59 aa
ORF11 645 565 안티센스 81 nt 26 aa
ORF12 1100 1035 안티센스 66 nt 21 aa
ORF13 314 1381 안티센스 702 nt 213 aa
각 ORF의 출발 및 끝 위치는 균주 1010 의 게놈에 대한 도 4 (서열번호 4) 에 나타낸 서열로 언급한다. ORF 1 내지 13 의 범위는 균주 999 와 동일하다. 그들은 또한 ORF 3 및 13 을 제외하고, 균주 1011-48121 및 1011-48285 와 동일하다:
ORF3 1432-1539, 센스, 108 nt, 35 aa
ORF13 314-1377, 안티센스, 705 nt, 234 aa.
상기 13 개의 ORF 중, 4 개는 클론된 바이러스 PCV PK-15 의 게놈상에 위치하는 유사한 ORF 와 상당한 상동성이 있다. 다전신성 쇠약 증후군과 연관된 모든 서코바이러스 분리물의 게놈상에 나타난 각각의 오픈 리딩 프레임을 분석하였다. 이러한 4 개의 ORF 는 하기와 같다:
이름 출발 끝 가닥 ORF 의 크기 (뉴클레오티드(nt)) 단백질 크기 (아미노산 (aa)) 분자량
ORF4 398 1342 센스 945 nt 314 aa 37.7 kDa
ORF7 1018 704 안티센스 315 nt 104 aa 11.8 kDa
ORF10 912 733 안티센스 180 nt 59 aa 6.5 kDa
ORF13 314 1381 안티센스 702 nt 233 aa 27.8 kDa
각 ORF의 출발 및 끝 위치는 도 4 (서열번호 4) 에 나타낸 서열로 언급한다. ORF (뉴클레오티드=nt)의 크기는 정지코돈을 포함한다.
PCV Imp. 1010 의 게놈 조직과 PCV PK-15 분리물 사이의 비교는 두 바이러스의 게놈내에 보존되는 4 개의 ORF 의 동일성을 나타낸다. 하기 표는 관찰된 상동성 정도를 나타낸다:
ORF Imp. 1010/ORF PVC PK-15 상동성 퍼센트
ORF4/ORF1 86 %
ORF13/ORF2 66.4 %
ORF7/ORF3 61.5 % (오버랩 수준에서 (104 aa))
ORF10/ORF4 83 % (오버랩 수준에서 (59 aa))
가장 큰 서열 동일성은 ORF4 Imp. 1010 및 ORF1 PK-15 사이에서 관찰되었다 (86 % 상동성). 상기 단백질은 아마도 바이러스 DNA 의 복제에 포함되기 때문에 바이러스 복제에 중요한 것으로 예측된다 [Meehan et al. J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227; Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 381-384].
ORF13 Imp. 1010 및 ORF2 PK-15 사이의 서열 동일성은 덜 강하지만 (66.4 % 상동성), 상기 두 ORF 각각은 실제로 CAV 조류 서코바이러스의 주요 구성 단백질의 N-말단 영역과 동일한 고보존성 N-말단 기본적 영역을 나타낸다 [Meehan et al. Arch. Virol. 1992. 124. 301-319]. 더욱이, 가장 큰 차이는 ORF7 Imp. 1010 및 ORF3 PK-15 사이, 및 ORF10 Imp. 1010 및 ORF4 PK-15 사이에서 관찰된다. 각 경우에서, 그들을 PCV PK-15 의 ORF3 및 ORF4 와 비교하는 경우 Imp. 1010 분리물의 ORF7 및 ORF10 의 C-말단 영역에서의 결실이 있다. 가장 큰 서열 상동성은 ORF7/ORF3 (오버랩 수준에서의 상동성 61.5 %) 및 ORF10/ORF4 (오버랩 수준에서의 상동성 83 %) 의 N-말단 영역의 수준에서 관찰된다.
돼지 서코바이러스의 게놈 조직은 그의 게놈의 극도의 압축성의 결과로서 매우 복잡한 것으로 나타난다. 주요 구성 단백질은 아마도 돼지 서코바이러스 게놈의 동일한 가닥상에 위치하는 몇몇 리딩 프레임 사이의 스플라이싱으로부터 유래한다. 그러므로, 이는 상기 표에 기재된 바와 같이 임의의 오픈 리딩 프레임 (ORF1 내지 ORF13)이 타입 II 돼지 서코바이러스에 의해 코드되는 항원성 단백질 모두 또는 일부를 나타낼 수 있고, 그러므로 잠정적으로 특이적 진단 및/또는 백신화를 위해 사용될 수 있는 항원인 것으로 여겨진다. 그러므로, 본 발명은 하나 이상의 상기 ORF를 함유하는 임의 단백질에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 ORF4, ORF7, ORF10 또는 ORF13으로 주요 구성된 단백질에 관한 것이다.
실시예 14: 신규한 균주로부터 클론된 PCV 게놈의 전염성 특성
Imp.999 분리물의 완전한 게놈 (복제형 분자)를 함유하는 플라스미드 pGEM-7/8 을 문헌 [Meehan B. et al., Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome fragments. Arch. Virol. 1992, 124, 301-319]에 기재된 방법에 따라서 PK/15 세포로 형질감염시킨다. 비오염된 PK/15 세포상에 형질감염 후 첫 번째 계대상에서 수행된 면역형광 분석(실시예 4 참조)은 클론 pGEM7/8 의 플라스미드가 전염성 PCV 바이러스의 생성을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 감염성 PCV 유전자 물질을 함유하는 클론의 이용은, 약독화 또는 재조합 백신의 생성 또는 진단용 키트를 위한 항원의 제조를 위해 사용될 수 있는 변형된 PCV 바이러스 (돼지에서 약독화되거나 또는 불완 전)를 생성하기 위한 바이러스 게놈상에서 어떠한 유용한 조작도 가능케한다.
실시예 15: 인 비트로 배양에 의해 PCV 항원의 생산
비오염된 PK/15 세포의 배양 및 비아러스 다중화는 실시예 1에서와 동일한 방법에 따라서 수행되었다. 감염된 세포를 37 ℃ 에서 4일간 항온배양한 후 수합하여 계산하였다. 다음 계대를 ml 당 400,000 감염된 세포수로 접종한다.
실시예 16: 바이러스 항원의 불활성화
바이러스 배양 말기에, 감염된 세포를 수합하여 초음파 (Branson Sonifier)를 이용하거나, 로터-스타터 타입 콜로이드 분쇄기 (UltraTurrax, IKA)를 이용하여 용해시킨다. 현탁액을 이어서 3700 g 에서 30 분간 원심분리시킨다. 바이러스 현탁액을 0.1 % 에틸렌이민으로 +37 ℃에서 18 시간 동안 또는 0.5 % 베타-프로피오락톤으로 +28 ℃ 에서 24 시간 동안 불활성화시킨다. 불활성화 전에 바이러스 적정이 부적절하다면, 바이러스 현탁액을 300 kDa 컷-오프를 가진 막 (Millipore PTMK300) 을 이용하여 초여과법에 의해 농축시킨다. 불활성화된 바이러스 현탁액을 +5 ℃에 저장한다.
실시예 17: 미네랄 오일을 기재로 하는 유액 형태인 백신의 제조
백신을 하기 구성에 따라 제조한다:
- 불활성화된 돼지 서코바이러스 현탁액: 250 ml
- 만타니드
Figure 112009026519635-PAT00002
ISA 70 (SEPPIC): 750 ml
수성상 및 오일상을 개별적으로 여과하여 멸균시킨다. 유액을 실버슨 터빈 유화기를 이용하여 성분들을 혼합 및 균질화시켜 제조한다.
한 백신은 약 107.5 TCID50을 함유한다. 백신 투여량의 부피는 피내 투여의 경우 0.5 ml 이고, 근육내 투여인 경우는 2 ml 이다.
실시예 18: 대사가능한 오일-기재 유액 형태의 백신의 제조
백신은 하기 구성에 따라 제조된다:
- 불활성화된 돼지 서코바이러스 현탁액: 200 ml
- 데하이멀스 HRE 7 (Henkel): 60 ml
- 라디아 7204 (Oleofina): 740 ml
수성상 및 오일상을 개별적으로 여과하여 멸균시킨다. 유액을 실버슨 터빈 유화기를 이용하여 성분들을 혼합 및 균질화시켜 제조한다.
한 백신은 약 107.5 TCID50을 함유한다. 백신 투여량의 부피는 근육내 투여인 경우 2 ml 이다.
실시예 19: 간접적인 면역형광법은 미국산 및 프랑스산 PCV 바이러스 균주, 및 PK/15 오염물과, 고도면역 혈청 (PCV-T), PK/15으로부터 제조된 일련의 모노클론성 항체 F99 및 캐나다산 균주로부터 제조된 고도면역 혈청 (PCV-C)의 관계를 나타낸다.
바이러스
PK/15 미국 프랑스
PCV-T 항혈청 ≥6400 200 800
PCV-C 항혈청 200 ≥6.400 ≥6.400
F99 1H4 ≥10 000 <100 100
F99 4B10 ≥10 000 <100 <100
F99 2B7 ≥10 000 100 <100
F99 2E12 ≥10 000 <100 <100
F99 1C9 ≥10 000 <100 100
F99 2E1 ≥10 000 <100 <100
F99 1H4 ≥10 000 100 <100
* 간접적인 면역형광법에서 양성 반응을 나타내는 혈청 또는 모노클론성 항체의 상호적인 최종 분포.
도 1: Imp.1011-48121주 게놈의 DNA 서열
도 2: Imp.1011-48285주 게놈의 DNA 서열
도 3: Imp.999주 게놈의 DNA 서열
도 4: Imp.1010주 게놈의 DNA 서열
도 5: 도 1 내지 4의 4개 서열과, PCV PK/15주 서열의 비교
도 6: 1997.10.03 프랑스에서 최초 출원된 바와 같은, Imp.999주 게놈의 DNA 서열
도 7: 도 6 서열과 PK/15주 서열의 비교

Claims (17)

  1. 8 개 이상의 아미노산을 갖는 하나 이상의 PCV-II 에피토프를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 6 에 기재된 PCV-II 게놈 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부와 동일하거나 상보적이고, 서열번호 5 에 기재된 PCV-I 게놈 뉴클레오티드 서열의 어느 부분과도 동일하거나 상보적이지 않은, 단리된 DNA.
  2. 제 1 항에 있어서, 에피토프가 13 개 이상의 아미노산을 갖는 DNA.
  3. 제 1 항에 있어서, 에피토프가 25 개 이상의 아미노산을 갖는 DNA.
  4. 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 6 에 기재된 PCV-II 게놈 뉴클레오티드 서열의 어느 하나에 96% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 DNA
  5. ORF 1 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 PCV-II 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열번호 4 에 따른 각 ORF에 대한 시작점과 종결점이 하기에 나타나는, 단리된 DNA:
    Figure 112009026519635-PAT00003
  6. 제 5 항에 있어서, ORF가 ORF 4, 7, 10 또는 13 인 DNA.
  7. PCV-II ORF 4, 7, 10 또는 13 의 폴리펩티드 서열에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 DNA.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 DNA에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 DNA를 포함하는 발현 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서, 벡터가 배큘로바이러스 벡터인 벡터.
  11. 제 9 항에 있어서, 벡터가 인 비보 발현 벡터인 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서, 벡터가 돼지 헤르페스 바이러스, 돼지 아데노바이러스, 또는 폭스바이러스에서 유래한 벡터.
  13. 제 12 항에 있어서, 돼지 헤르페스 바이러스가 아우제스키병(Aujeszky's disease) 바이러스인 벡터.
  14. 제 12 항에 있어서, 폭스바이러스가 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스, 카나리폭스 바이러스, 또는 스와인폭스 바이러스인 벡터.
  15. 수의학적 면에서 허용가능한 희석제 또는 부형제 내에 제 8 항에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 서브유니트 백신.
  16. 제 15 항에 있어서, 폴리펩티드가 수의학적 면에서 허용가능한 보조제 내에서 추가로 정제되는 서브유니트 백신.
  17. 제 8 항에 따른 폴리펩티드로부터 제조된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체.
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Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US20060029617A1 (en) * 1997-10-03 2006-02-09 Charreyre Catherine E Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use
US7192594B2 (en) * 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
EP1816200B1 (en) * 1997-12-11 2016-03-09 Merial Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs
PT2363488E (pt) * 1997-12-11 2015-01-13 Univ Belfast Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos
US6943152B1 (en) 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
US6497883B1 (en) * 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
WO2001096377A2 (en) * 2000-06-15 2001-12-20 Purdue Research Foundation Vaccine for congenital tremors in pigs
US7018638B2 (en) * 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
MY148759A (en) * 2001-03-27 2013-05-31 Univ Saskatchewan Methods to culture circovirus
CA2454397A1 (en) 2001-07-20 2003-06-05 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Attenuated rabies virus with nucleoprotein mutation at the phosphorylation site for vaccination against rabies and gene therapy in the cns
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7279166B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
OA12915A (en) * 2002-08-26 2006-10-13 Pfizer Prod Inc Vaccine for respiratory and reproductive system infections in cattle.
KR20040021988A (ko) * 2002-09-06 2004-03-11 서상희 바이러스 증식용 돼지 신장 상피 세포주, 및 이의 용도
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US8834891B2 (en) * 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
EP1869471B1 (en) * 2005-04-13 2016-06-08 Merial, Inc. Method for porcine circovirus production
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
PL1968630T3 (pl) 2005-12-29 2018-08-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multiwalentne immunogenne kompozycje PCV2
CN104383526B (zh) * 2005-12-29 2018-09-18 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 Pcv2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途
KR100870077B1 (ko) * 2006-10-27 2008-11-25 권영득 이유후 전신소모성증후군(ｐｍｗｓ)의 치료용 복합제조성물
US20100129397A1 (en) * 2006-12-11 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
EP2094872B2 (en) 2006-12-15 2020-02-19 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Treatment of anti-PCV2 antibody seropositive pigs with PCV2 antigen
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
CA2687146C (en) * 2007-05-11 2015-07-21 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Production of a homogeneous cell line highly permissive to porcine circovirus type 2 (pcv2) infection
KR100948127B1 (ko) * 2007-06-27 2010-03-18 주식회사 중앙백신연구소 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물
US20090017064A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
EP2225367A1 (en) * 2007-12-21 2010-09-08 Wyeth LLC Methods and compositions for immunizing pigs against porcine circovirus
US20110020394A1 (en) * 2007-12-31 2011-01-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 virus like particle with foreign amino acid insertion
EP2242511A4 (en) * 2008-01-23 2012-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmed IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE PCV2, AND METHODS FOR PRODUCING SUCH COMPOSITIONS
AR078253A1 (es) * 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
TWI442935B (zh) 2010-12-22 2014-07-01 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２）、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
EP2564869A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Ceva Sante Animale Synthetic capsid proteins and uses thereof
EP2789346A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 CEVA Santé Animale SA Fusion polypeptides and vaccines
US9649370B2 (en) 2013-05-08 2017-05-16 Protatek International, Inc. Vaccine for PCV2 and mycoplasma
JP6821429B2 (ja) 2013-09-25 2021-01-27 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー Ｐｃｖ２ｂ分岐ワクチン組成物及び使用方法
EA035265B1 (ru) 2013-10-02 2020-05-21 Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. Вариант белка opc2 pcv2 и содержащие его вирусоподобные частицы
CN104383527A (zh) * 2014-11-18 2015-03-04 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪圆环病毒2型灭活冻干疫苗的制备方法
EP3034609A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ceva Sante Animale Recombinant swinepox virus and vaccines
US9944904B2 (en) 2015-05-14 2018-04-17 Merial Inc. Method for porcine circovirus production and PCV2 vaccines
EP3254692A1 (en) 2016-06-10 2017-12-13 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant spv
EP3720485A1 (en) 2017-12-08 2020-10-14 Ceva Sante Animale Recombinant swinepox virus and vaccines
JP7162072B2 (ja) 2018-03-26 2022-10-27 ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド 免疫原性組成物を製造する方法
WO2019238611A1 (en) 2018-06-11 2019-12-19 Ceva Sante Animale Vaccination against porcine circoviruses
KR102124260B1 (ko) * 2018-10-19 2020-06-26 대한민국(관리부서 질병관리본부장) 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 콜레라균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주
BR112023001324A2 (pt) 2020-07-24 2023-02-14 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Combinação de vacina de suíno

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4740468A (en) 1985-02-14 1988-04-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Concentrating immunochemical test device and method
US5232835A (en) 1986-11-07 1993-08-03 Syntex (U.S.A.) Inc. Qualitative immunochromatographic method and device
US5030558A (en) 1986-11-07 1991-07-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Qualitative immunochromatographic method and device
CA1303983C (en) 1987-03-27 1992-06-23 Robert W. Rosenstein Solid phase assay
EP1248112A3 (en) 1987-04-27 2004-08-25 Inverness Medical Switzerland GmbH Immunochromatographic specific binding assay device
US4855240A (en) 1987-05-13 1989-08-08 Becton Dickinson And Company Solid phase assay employing capillary flow
US5120643A (en) 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
DK175379B1 (da) * 1987-09-28 2004-09-20 Pfizer Anvendelse af transmitterbart svine-gastro-enteritisvirus samt fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine
EP1026253B2 (en) 1989-03-21 2012-12-19 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
US5141850A (en) 1990-02-07 1992-08-25 Hygeia Sciences, Inc. Porous strip form assay device method
JP3187419B2 (ja) 1990-05-29 2001-07-11 アメリカン・サイアナミド・カンパニー ブタ肺炎ワクチンおよびその製造方法
US5238652A (en) 1990-06-20 1993-08-24 Drug Screening Systems, Inc. Analytical test devices for competition assay for drugs of non-protein antigens using immunochromatographic techniques
US5565205A (en) 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
US5266497A (en) 1990-08-31 1993-11-30 Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. Immunochromatographic assay with improved colored latex
US5451504A (en) 1991-07-29 1995-09-19 Serex, Inc. Method and device for detecting the presence of analyte in a sample
WO1993007898A1 (en) 1991-10-14 1993-04-29 Akzo Nobel N.V. Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
US5338543A (en) * 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
DE9204303U1 (de) 1992-03-30 1992-06-25 Marx, Günter Wolfgang, 7953 Bad Schussenried Trainingsgerät
EP0571648A1 (en) 1992-05-26 1993-12-01 Chung-Nan Weng Vaccine protecting against mycoplasmal pneumonia
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
FR2700957B1 (fr) 1993-01-29 1995-03-03 Seppic Sa Composition de vaccin sous-unitaire recombinant vivant et procédé de préparation.
ATE197314T1 (de) 1993-02-08 2000-11-15 Bayer Ag Verfahren zum vermehren des das reproduktions- und atemwegs-syndrom verursachenden schweinevirus und dessen verwendung als impfstoff.
FR2702373B1 (fr) 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.
IL108915A0 (en) 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
DE69536091D1 (de) 1994-01-27 2010-09-09 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit
DE69522984T2 (de) * 1994-04-11 2002-04-25 Akzo Nobel Nv Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins
CA2196865C (en) * 1994-08-05 2001-07-03 Karl P. Schneider Self-chamfering drill bit
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
PT2363488E (pt) * 1997-12-11 2015-01-13 Univ Belfast Síndrome multi-sistémica do definhamento pós-desmame de porcos
KR100298125B1 (ko) * 1999-04-15 2001-09-13 정명식 구리의 화학 증착에 유용한 유기 구리 전구체

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