PL198506B1 - Preparat wyizolowanego świńskiego cirkowirusa typu II, sposób wytwarzania świńskiego cirkowirusa typu II, ekstrakt albo nadsącz komórkowy, preparat antygenowy, szczepionka, przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne, wyizolowany świński cirkowirus typu II, fragment kwasu nukleinowego, polipeptyd, wektor, szczepionka, sposób diagnozowania infekcji, preparat przeciwciał, preparat antygenowy, zestaw do diagnozy - Google Patents

Preparat wyizolowanego świńskiego cirkowirusa typu II, sposób wytwarzania świńskiego cirkowirusa typu II, ekstrakt albo nadsącz komórkowy, preparat antygenowy, szczepionka, przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne, wyizolowany świński cirkowirus typu II, fragment kwasu nukleinowego, polipeptyd, wektor, szczepionka, sposób diagnozowania infekcji, preparat przeciwciał, preparat antygenowy, zestaw do diagnozy

Info

Publication number
PL198506B1
PL198506B1 PL339631A PL33963198A PL198506B1 PL 198506 B1 PL198506 B1 PL 198506B1 PL 339631 A PL339631 A PL 339631A PL 33963198 A PL33963198 A PL 33963198A PL 198506 B1 PL198506 B1 PL 198506B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
type
pcv
porcine
nucleic acid
sequence
Prior art date
Application number
PL339631A
Other languages
English (en)
Other versions
PL339631A1 (en
Inventor
Gordon Allan
Brian Meehan
Edward Clark
John Ellis
Deaborah Haines
Lori Hassard
John Harding
Catherine Elisabeth Charreyre
Gilles Emile Chappuis
Original Assignee
Merial Sas
Univ Belfast
Univ Saskatchewan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27253376&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL198506(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from FR9712382A external-priority patent/FR2769321B1/fr
Priority claimed from FR9800873A external-priority patent/FR2769322B1/fr
Priority claimed from FR9803707A external-priority patent/FR2776294B1/fr
Application filed by Merial Sas, Univ Belfast, Univ Saskatchewan filed Critical Merial Sas
Publication of PL339631A1 publication Critical patent/PL339631A1/xx
Publication of PL198506B1 publication Critical patent/PL198506B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0321—Propionic acid bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0323—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin using only lactic acid bacteria, e.g. Pediococcus and Leuconostoc species; Bifidobacteria; Microbial starters in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16741—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16743—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/10064—Methods of inactivation or attenuation by serial passage

Abstract

1. Preparat wyizolowanego swi nskiego cirkowirusa typu II odpowiedzialnego za poodsadzenio- wy wielonarz adowy zespó l wyniszczaj acy (PWMS) u swi n, uzyskany z hodowli komórkowej. 2. Preparat swi nskiego cirkowirusa wybrany z grupy obejmuj acej preparaty zdeponowane w ECACC, pod nast epuj acymi odno snikami: nr dost epu V97100219 nr dost epu V97100218 nr dost epu V97100217 nr dost epu V98011608 nr dost epu V 98011609. 20. Szczepionka indukuj aca odpowied z immunologiczn a przeciwko swi nskiemu cirkowirusowi typu II, znamienna tym, ze obejmuje swi nski cirkowirus typu II odpowiedzialny za PMWS. 28. Fragment kwasu nukleinowego obejmuj acy sekwencj e genomu swi nskiego cirkowirusa typu II (PCV) odpowiedzialn a za poodsadzeniowy wielonarz adowy zespó l wyniszczaj acy (PWMS) u swi n, przedstawion a na Id. Sekw. nr 6. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest preparat wyizolowanego świńskiego cirkowirusa typu II, sposób wytwarzania świńskiego cirkowirusa typu II, ekstrakt albo nadsącz komórkowy, preparat antygenowy, szczepionka, przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne, wyizolowany świński cirkowirus typu II, fragment kwasu nukleinowego, polipeptyd, wektor, szczepionka, sposób diagnozowania infekcji, preparat przeciwciał, preparat antygenowy, zestaw do diagnozy.
Świńskie cirkowirusy PCV (od ang. Porcine CircoVirus) odpowiedzialne są za poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający PMWS (Porcine Multisystemic Wasting Syndrome, zwany również Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome).
PCV po raz pierwszy wykryto jako niecytopatogenne zanieczyszczenie linii komórkowej nerki świńskiej PK/15. Wirus ten zaklasyfikowano do Circoviridae, wraz z wirusem kurzej anemii (CAV od Chicken Anaemia Virus) i wirusem PBFDV (Pscittacine Beak and Feather Disease Virus). Są to małe nieotoczkowe wirusy (15-24 nm), których wspólną cechą charakterystyczną jest genom w postaci kolistego, jednoniciowego DNA wielkości 1,76-2,31 kb. Początkowo uważano, że genom ten koduje polipeptyd wielkości około 30 kDa (Tadd i in., Arch. Virol. 1991, 117:129-135). Ostatnie prace wykazały jednak bardziej skomplikowaną jego transkrypcję (Meehan i in., 1997, 78:221-227). Ponadto, nie znane są istotne homologie sekwencji nukleotydowej, albo dominujących determinant antygenowych pomiędzy trzema znanymi rodzajami cirkowirusów.
PCV pochodzący z komórek PK/15 uważany jest za niepatogenny. Jego sekwencja jest znana z Meehan i in., J. Gen. Virol. 1997, (78) 221-227. Całkiem niedawno niektórzy autorzy opisali, ż e szczepy PCV mogą być patogenne i związane z zespołem PMWS (Gupi Nayar i in., Can. Vet. J. tom. 38, 1997:385-387; Clark, Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997:499-501). Nayar i in., przy użyciu techniki PGR wykryli DNA PCV u świń z zespołem PMWS. Do tej pory nie wyizolowano i nie oczyszczono jednak szczepu PCV typu dzikiego.
Zespół PMWS wykryty w Kanadzie, Stanach Zjednoczonych i Francji klinicznie charakteryzuje się postępującą utratą ciężaru ciała i takimi objawami jak przyspieszony oddech, bezdech i żółtaczka. Z patologicznego punktu widzenia, objawia się naciekami limfocytarnymi i ziarniniakowymi, limfadenopatią i znacznie rzadziej, zapaleniem wątroby i limfocytarnym albo ziarniniakowym zapaleniem nerek (Clark, Proc. Am. Assoc. Swine Prac., 1997:499-501; La Semaine Veterinaire nr. 26, dodatek La Semaine Veterinaire 1996 (834); La Semaine Veterinaire 1997 (857):54; Gupi Nayar i in., Can. Vet. J. tom 38, 1997:385-387).
Twórcy wyizolowali pięć nowych szczepów PCV z próbek pobranych z płuc i węzłów chłonnych, otrzymanych z farm położonych w Kanadzie, Stanach Zjednoczonych (Kalifornia) i Francji (Bretania), określanych dalej jako cirkowirusy według wynalazku. Wirusy te wykryto w zmianach chorobowych u ś wiń z zespoł em PMWS, ale nie u zdrowych ś wiń .
Ponadto twórcy zsekwencjonowali genom czterech spośród tych szczepów, konkretnie szczepu otrzymanego z Kanady i Stanów Zjednoczonych, jak również dwóch szczepów pochodzących z Francji. Szczepy wykazywały silną homologię ze sobą na poziomie nukleotydowym, przekraczającą 96% i znacznie słabszą ze szczepem PK/15, która wynosiła około 76%. Nowe szczepy można więc uważ ać jako reprezentatywne dla nowego rodzaju świńskich cirkowirusów, zwanych typem II, przy czym typ I reprezentowany jest przez PK/15.
Wynalazek dotyczy preparatu wyizolowanego świńskiego cirkowirusa typu II odpowiedzialnego za poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający (PWMS) u świń, uzyskanego z hodowli komórkowej.
Świński cirkowirus można wyizolować z fizjologicznej próbki albo z próbki tkankowej, zwłaszcza ze zmiany, od chorych świń z zespołem PMWS zwłaszcza według sposobu opisanego w przykładach, w szczególności dotyczących cirkowirusa typu II.
Wynalazek również dotyczy preparatu świńskiego cirkowirusa wybranego z grupy obejmującej preparaty zdeponowane w ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Zjednoczone Królestwo), w dniu 2 października, 1997, pod następującymi numerami:
- nr dostę pu V97100219 (okreś lany tu jako Imp. 1008PCV)
- nr dostę pu V97100218 (okreś lany tu jako Imp. 1010PCV)
- nr dostę pu V97100217 (okreś lany tu jako Imp. 999PCV) i zgł oszone 16 stycznia, 1998:
- nr dostę pu V98011608 (okreś lany tu jako Imp. 1011-48285)
- nr dostę pu V98011609 (okreś lany tu jako Imp. 1011-48121).
PL 198 506 B1
Szczepy wirusowe wyizolowane z próbki fizjologicznej albo próbki tkanki, zwłaszcza ze zmiany, od świń z zespołem PMWS można korzystnie namnażać na liniach komórkowych, takich jak linie komórkowe nerki świńskiej, w szczególności komórek PK/15 z zanieczyszczeń (w szczególności dla PCV, jak również pestiwirusów, świńskich adenowirusów i świńskich parwowirusów) w celu ich namnażania albo wytwarzania antygenu, pełnego (np. wirusa) i/lub podjednostkowego (np. polipeptydów).
Co bardzo charakterystyczne i nieoczekiwane, izolaty te okazały się bardzo produktywne w hodowli na komórkach PK/15, które mają niezaprzeczalne zalety wytwarzania w nich wirusa albo antygenu, w szczególności inaktywowanych szczepionek.
Preparat cirkowirusów izoluje się po pasażowaniu na komórkach, zwłaszcza liniach komórkowych, np. komórek PK/15 hodowanych in vitro, w trakcie zakażenia przynajmniej jednym cirkowirusem, albo dowolnym świńskim cirkowirusem zdolnym do wyizolowania go z próbki fizjologicznej albo z próbki tkanki, zwłaszcza ze zmian, od ś wiń z zespołem PMWS.
Wynalazek również dotyczy sposobu wytwarzania świńskiego cirkowirusa typu II odpowiedzialnego za PMWS u świń, w którym hodowane in vitro komórki zakaża się wyizolowanym świńskim cirkowirusem typu II odpowiedzialnym za PWMS u świń i cirkowirus namnaża się na tych komórkach.
W sposobie tym korzystnie stosuje się cirkowirus, który moż e być wyizolowany ze ś wiń cierpią cych na PMWS.
Korzystnie stosuje się cirkowirus zdeponowany w ECACC, pod następującymi numerami:
nr dostępu V97100219 nr dostępu V97100218 nr dostępu V97100217 nr dostępu V98011608 nr dostępu V98011609.
W innym korzystnym wykonaniu sposobu wed ł ug wynalazku stosuje się komórki linii komórkowej nerki świńskiej, korzystniej komórki PK/15.
Zakresem wynalazku objęty jest również sposób, który obejmuje zbieranie i oczyszczanie świńskiego cirkowirusa typu II.
Korzystnie sposób obejmuje zatężanie świńskiego cirkowirusa typu II.
Równie korzystnie sposób obejmuje inaktywację świńskiego cirkowirusa typu II.
Wynalazek ponadto dotyczy ekstraktu albo nadsączu komórkowego zawierającego świński cirkowirus typu II, który może być uzyskany sposobem według wynalazku.
Ekstrakty hodowli albo nadsączu, można ewentualnie oczyszczać technikami standardowymi i ogólnie znanymi dla preparatów antygenowych uzyskanych z hodowli in vitro.
Wynalazek również dotyczy preparatu antygenowego, zawierającego świński cirkowirus typu II, który może być uzyskany sposobem według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi szczepionka indukująca odpowiedź immunologiczną przeciwko świńskiemu cirkowirusowi typu II, która obejmuje świński cirkowirus typu II odpowiedzialny za PMWS.
Korzystnie szczepionka obejmuje atenuowany, żywy, pełny antygen w nośniku albo rozcieńczalniku dopuszczalnym w weterynarii i ewentualnie adiuwant dopuszczalny w weterynarii, jak również ewentualnie, stabilizator liofilizacji.
Korzystnie antygen jest inaktywowany, zaś szczepionka zawiera dodatkowo, nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny w weterynarii i ewentualnie adiuwant dopuszczalny w weterynarii.
Korzystnie szczepionka obejmuje antygeny kilku świńskich cirkowirusów typu II według wynalazku.
Korzystna szczepionka obejmuje dodatkowo przynajmniej jedną inną wartościowość, która odpowiada innemu patogenowi świń, korzystniej wybraną z grupy obejmującej zespół rozrodczooddechowy świń PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, wirus atroficznego zapalenia nosa, wirus pseudowścieklizny, cholery świń i świńskiej grypy.
Korzystna szczepionka obejmuje przynajmniej jedną inną wartościowość wybraną z grupy obejmującej PRRS i Mycoplasma hyopneumoniae.
Wynalazek również dotyczy przeciwciała monoklonalnego albo poliklonalnego wytworzonego przy pomocy cirkowirusa według wynalazku, polipeptydów według wynalazku albo ich fragmentów.
Wyizolowany świński cirkowirus typu II odpowiedzialny za PMWS u świń jest również objęty zakresem wynalazku.
Wynalazek dotyczy cirkowirusa według wynalazku, który jest wyizolowany ze świni cierpiącej na PMWS.
PL 198 506 B1
Ponadto wynalazek dotyczy cirkowirusa, który jest zdeponowany w ECACC, pod następującymi odnośnikami:
nr dostępu V97100219 nr dostępu V97100218 nr dostępu V97100217 nr dostępu V98011608 nr dostępu V98011609.
W korzystnym wykonaniu preparatu według wynalazku świński cirkowirus typu II jest wyizolowany z chorej świni cierpiącej na PMWS.
Korzystnie preparat według wynalazku jest oczyszczony, korzystnie zatężony, również korzystnie inaktywowany.
Rozwiązania według wynalazku pozwalają na wytworzenie składników immunogennie czynnych i szczepionek zawierają cych przynajmniej jeden antygen.
Mogą to być immunogennie czynne składniki oparte na atenuowanych żywych całych wirusach, albo szczepionki wytworzone przy użyciu tych składników czynnych, przy czym atenuowanie przeprowadza się zwykłymi sposobami, np. przez pasażowanie na komórkach, korzystnie, przez pasażowanie na komórkach świńskich, zwłaszcza liniach komórkowych, takich jak komórki PK/15 (przykładowo, od 50 do 150, zwłaszcza w zakresie 100 pasaży). Szczepionki te obejmują zasadniczo nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia, ewentualnie adiuwant dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia, jak również ewentualnie stabilizator liofilizacji.
Szczepionki te korzystnie obejmują od 103 do 106 TCID50.
Mogą one być immunogennie czynnymi składnikami albo szczepionkami opartymi na antygenie cirkowirusa według wynalazku, w stanie inaktywowanym. Szczepionka dodatkowo może obejmować nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia, ewentualnie z adiuwantem dopuszczalnym z weterynaryjnego punktu widzenia.
Cirkowirusy według wynalazku we frakcjach są inaktywowane technikami znanymi specjalistom w dziedzinie. Inaktywację korzystnie przeprowadza się metodą chemiczną, np. przez eksponowanie antygenu na czynnik chemiczny taki jak (formaldehyd) formalina, paraformaldehyd, β-propionolakton albo etylenoimina albo jej pochodne. Korzystnym sposobem inaktywacji jest ekspozycja na czynnik chemiczny, w szczególności etylenoiminę albo β-propionolakton.
Inaktywowane szczepionki mogą być uzupełnione o adiuwant, korzystnie, dostarczony w postaci emulsji, przykładowo emulsji wody w oleju albo oleju w wodzie, według technik dobrze znanych specjalistom. Możliwe jest również włączenie związku adiuwantowego do składnika czynnego w celu zapewnienia charakteru adiuwantowego.
Wśród adiuwantów, które można zastosować, można wymienić przykładowo wodorotlenek glinu, saponiny (np. saponinę Quillaja albo Quil A; patrz, Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Powel i Newman, Plenum Press, Nowy York i Londyn, str. 210), Avridine® (Vaccine Design, str. 148), DDA (bromek dimetylodioktadecyloamoniowy, Vaccine Design, str. 157), Polifosfazeny (Vaccine Design, str. 204) albo alternatywnie, emulsje oleju w wodzie, oparte na oleju mineralnym, skwaleny (np. emulsje SPT, Vaccine Design, str. 147), skwalenie (np. MF59, Vaccine Design, str. 183) albo emulsje wody w oleju oparte na możliwych do metabolizowania olejach (korzystnie, wg WO-A-94 20071) jak również emulsje opisane w patencie USA A-5,422,109. Możliwe jest również wybranie kombinacji adiuwantów, przykładowo Avridine® albo DDA w połączeniu z emulsją.
Szczepionki te korzystnie obejmują od 106 do 108 TCID50.
Adiuwanty dla szczepionek żywych można wybrać z podanych dla szczepionek inaktywowanych. Korzystne są emulsje. Do adiuwantów opisanych dla szczepionek inaktywowanych można dodać adiuwanty opisane w WO-A-9416681.
Jako stabilizator liofilizacji można wykorzystać przykładowo SPGA (Bovarnik i in., J. Bacteriology 59, 509, 950), węglowodany takie jak sorbitol, mannitol, skrobia, sacharoza, dekstran albo glukoza, białka takie jak albumina albo kazeina, pochodne tych związków albo bufory, takie jak fosforany metali alkalicznych.
Twórcy również poznali genom czterech izolatów i zidentyfikowali je jako Id. Sekw. nr 1 do 4 i ewentualnie 6.
Wynalazek więc również dotyczy fragmentu kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję genomu świńskiego cirkowirusa typu II (PCV) odpowiedzialną za poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający (PWMS) u świń, przedstawioną na Id. Sekw. nr 6.
PL 198 506 B1
Wynalazek dotyczy fragmentu kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję genomu PCV typu II, który wykazuje co najmniej 70% homologii do sekwencji według wynalazku.
Wynalazek również dotyczy fragmentu kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję genomu PCV typu II , który jest zdolny do specyficznej hybrydyzacji z fragmentem kwasu nukleinowego według wynalazku, korzystnie hybrydyzacji w ostrych warunkach.
Wynalazek również dotyczy fragmentu kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję genomu świńskiego cirkowirusa typu II (PCV) odpowiedzialną za poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający (PWMS) u świń wybraną z Id. Sekw. nr 1, Id. Sekw. nr 2, Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 4.
Wynalazek ponadto dotyczy fragmentu kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję genomu PCV typu II, który jest zdolny do specyficznej hybrydyzacji z fragmentem kwasu nukleinowego według wynalazku, korzystnie hybrydyzacji w ostrych warunkach.
Wynalazek dotyczy fragmentu kwasu nukleinowego obejmującego całą lub część sekwencji według wynalazku, kodującej epitop zdolny do indukowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko PCV typu II u świń. Korzystnie epitop obejmuje minimum 13 do 25 aminokwasów.
Wynalazek dotyczy fragmentu kwasu nukleinowego obejmującego całą lub część sekwencji według wynalazku, kodującej polipeptyd obejmujący co najmniej jedną otwartą ramkę odczytu (ORF). Korzystnie ORF jest wybrany z ORF od 1 do 13, korzystnie ORF 4, 7, 10 i 13.
Polipeptyd kodowany przez fragment kwasu nukleinowego według wynalazku również wchodzi w zakres wynalazku.
Sekwencje zamienne, czyli sekwencje, które nie zmieniają funkcjonalności albo swoistości opisanych sekwencji albo polipeptydów kodowanych przez te sekwencje można uzyskać dzięki rozwiązaniom według wynalazku. Dotyczy to również sekwencji różniących się z powodu degeneracji kodu genetycznego, jak i sekwencji zamiennych w takim sensie, że są one zdolne do hybrydyzacji z powyższymi sekwencjami w warunkach wysokiej surowości i/lub wykazują silną homologię ze szczepami według wynalazku i należą do określonej wyżej grupy II.
Sekwencje te i ich fragmenty można korzystnie zastosować do ekspresji polipeptydów in vitro i in vivo, przy uż yciu odpowiednich wektorów.
W szczególnoś ci moż na zastosować w tym celu fragmenty DNA, które zidentyfikowano w sekwencji genomowej cirkowirusów typu II jako otwarte ramki odczytu. Dotyczy to dowolnego polipeptydu zawierającego przynajmniej jedną z takich otwartych ramek odczytu (odpowiadającej sekwencji aminokwasowej). Korzystnie, dotyczy białka zasadniczo obejmującego ORF4, ORF7, ORF10 albo ORF13.
W celu ekspresji podjednostek in vitro, do ekspresji stosuje się korzystnie E. coli albo bakulowirusa (US-A-4,745,051). Sekwencje kodujące albo ich fragmenty poddaje się integracji z genomem bakulowirusa (np. bakulowirusa poliedrozy jądrowej AcNPV Autographa californica) i poddaje się propagacji na komórkach owadzich, np. Spodoptera frugiperda Sf9 (depozyt ATCC CRL 1711). Podjednostki można również wytworzyć w komórkach eukariotycznych takich jak drożdże (np. Saccharomyces cerevisiae) albo w komórkach ssaka (np. CHO, BHK).
Wynalazek dotyczy wektora ekspresyjnego obejmującego fragment kwasu nukleinowego według wynalazku i wyrażającego polipeptyd in vitro.
Korzystnie wektor ekspresyjny jest bakulowirusem.
Korzystnie wektor ekspresyjny wyraża polipeptyd w E.coli, komórkach owadzich lub eukariotycznych, korzystnie wybranych z komórek drożdży lub komórek ssaczych.
Wynalazek również dotyczy wektora ekspresyjnego, który obejmuje w swoim genomie fragment kwasu nukleinowego według wynalazku i wyraża polipeptyd in vivo.
Korzystnie wektor ekspresyjny jest wybrany z wirusów naturalnie niepatogennych lub żywych atenuowanych wirusów i plazmidów, korzystnie jest zdolny do namnażania się u świń.
Korzystnie wektor ekspresyjny jest wirusem wybranym spośród świńskich herpeswirusów takich jak wirusy choroby Aujeszky'ego, świńskie adenowirusy, wirusy ospy, zwłaszcza wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirus ospy kanarków, oraz wirus świńskiej ospy.
W zakres wynalazku wchodzi również polipeptyd wytworzony przez wektor ekspresyjny według wynalazku.
Wynalazek również dotyczy szczepionki podjednostkowej obejmującej co najmniej jeden polipeptyd według wynalazku, w rozcieńczalniku albo nośniku dopuszczalnym w weterynarii i ewentualnie adiuwant dopuszczalny w weterynarii.
Korzystnie szczepionka obejmuje antygeny kilku świńskich cirkowirusów typu II według wynalazku.
PL 198 506 B1
Wynalazek dotyczy szczepionki żywej rekombinowanej lub plazmidowej, która obejmuje co najmniej jeden wektor ekspresyjny według wynalazku.
Korzystnie szczepionka obejmuje antygeny kilku świńskich cirkowirusów typu II według wynalazku.
Korzystnie szczepionka dalej obejmuje weterynaryjnie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik.
Polipeptydy można wytworzyć in vitro przez ekspresję, a następnie oczyścić konwencjonalnymi technikami. Szczepionka podjednostkowa obejmuje przynajmniej jeden otrzymany w ten sposób polipeptyd, albo fragment, w nośniku albo rozcieńczalniku dopuszczalnym z weterynaryjnego punktu widzenia i ewentualnie adiuwant dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia.
W celu ekspresji in vivo, do wytworzenia rekombinowanych, żywych szczepionek sekwencje kodujące albo ich fragmenty wprowadza się do odpowiedniego wektora ekspresyjnego w warunkach umożliwiających ekspresję polipeptydów. Jako odpowiednie wektory można zastosować żywe wirusy, korzystnie zdolne do namnażania się w organizmie świń, niepatogenne dla świń (naturalnie niepatogenne albo zmienione tak aby były niepatogenne), według dobrze znanych technik. W szczególności, można zastosować świńskie wirusy herpes, takie jak wirus choroby Aujeszky'ego, świński adenowirus, wirusy ospy, zwłaszcza wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirus ospy kanarków, wirus ospy świńskiej. Jako wektory można również zastosować plazmidowe DNA (WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797, WO-A-95 200660).
Szczepionki żywe atenuowane, inaktywowane, podjednostkowe, rekombinowane i plazmidowe mogą obejmować jeden albo wiele składników czynnych (antygenów) jednego albo wielu (2 albo 3) cirkowirusów według wynalazku.
Wykorzystując każdy z opisanych tutaj rodzajów szczepionki, możliwe jest prowadzenie szczepienia przeciwko świńskiemu cirkowirusowi w kombinacji ze szczepieniem przeciwko innym patogenom świńskim, w szczególności takim, które mogą wiązać się z zespołem PMWS. Takie szczepionki w szczególności inaktywowane, mogą więc obejmować inną wartościowość odpowiadającą innemu świńskiemu patogenowi. Wśród innych patogenów świńskich, można wymienić PRRS - zespół rozrodczo-oddechowy świń (Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome) (specjaliści mogą odnieść się do WO-A-93/07898, WO-A-94/18311, FR-A-2 709 966; Chareyre i in., Proceedings of the 15th IPVS Congress, Birmingham, Anglia, 509 lipca, 1988, str. 139; włączone tu jako odnośnik) i/lub Mycoplasma hyopneumonia (specjaliści mogą odnieść się do EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A-571 648; Martinon i in., str. 157, 284, 285; Reynaud i in., str. 150, wszystkie pochodzące z Proceedings of the 15th IPVS Congress; załączone tu jako odnośnik).Wśród interesujących wartościowości można również wymienić Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, świński wirus atroficznego zapalenia nosa oraz wirus pseudowścieklizny (choroby Aujeszky'ego), świńskiej cholery i świńskiej grypy.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają wywołanie u świń reakcji odpornościowej przeciwko cirkowirusom według wynalazku. Pozwala to na prowadzenie szczepienia, które jest skuteczne dla świń.
Szczepienie świń można prowadzić stosując jedną albo wiele porcji szczepionki. Możliwe jest również połączenie kilku rodzajów szczepionek w tym samym protokole szczepienia.
Szczepionkę można podawać nie tylko dorosłym świniom, ale również młodym świniom i samicom ciężarnym. Szczepienie tych ostatnich umożliwia przeniesienie odporności biernej na noworodki (przeciwciała matczyne).
Wynalazek zapewnia również możliwość diagnozowania obecności cirkowirusów według wynalazku u świń. Wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania infekcji spowodowanej przez PCV typu II odpowiedzialnym za PMWS, który obejmuje kontaktowanie próbki fizjologicznego płynu lub próbki tkanki ze świni z odczynnikiem diagnostycznym specyficznym dla PCV typu II, przy czym jeżeli wykrywa się antygen, przeciwciało lub kwas nukleinowy specyficzny dla PCV typu II diagnozowana jest infekcja PCV typu II.
W korzystnym sposobie odczynnik diagnostyczny obejmuje sondę lub starter obejmują cy sekwencję DNA specyficzną dla PCV typu II.
W korzystnym sposobie odczynnik diagnostyczny obejmuje Id. Sekw. nr 6.
W korzystnym sposobie odczynnik diagnostyczny obejmuje sondę lub starter specyficzne dla PCV typu II, przy czym sonda lub starter obejmuje co najmniej jeden fragment sekwencji Id. Sekw. nr 6.
Korzystny sposób jest oparty na technice hybrydyzacji lub PCR.
W korzystnym sposobie odczynnik diagnostyczny obejmuje antygen specyficzny dla PCV typu II.
W innym korzystnym sposobie odczynnik diagnostyczny obejmuje epitop lub polipeptyd specyficzny dla PCV typu II kodowany przez fragment sekwencji Id. Sekw. nr 6.
PL 198 506 B1
W kolejnym korzystnym sposobie antygen, epitop lub polipeptyd wykrywa w próbce przeciwciała, które są specyficzne dla PCV typu II.
W innym korzystnym sposobie odczynnik diagnostyczny obejmuje przeciwciał o specyficzne dla PCV typu II.
Korzystnie stosuje się również reagent obejmujący antygen specyficzny dla PCV typu II i reagent obejmujący przeciwciało specyficzne dla PCV typu II.
W innym korzystnym sposobie stosuje się metodę Western Blot, immunofluorescencji, ELISA lub rodzaj immunochromatografii.
W następnym korzystnym sposobie stosuje się metody pośrednie, kompetycyjne lub zastępowania.
Wynalazek dotyczy preparatu przeciwciał specyficznych dla PCV typu II odpowiedzialnego za PMWS, który może być wytworzony z PCV typu II lub jego antygenowego fragmentu lub z polipeptydu kodowanego przez fragment sekwencji Id. Sekw. nr 6.
Korzystnie PVC2 typu II jest wybrany ze zdeponowanych w ECACC jako V97100217, V97100218 i V97100219.
W korzystnym wykonaniu preparatu według wynalazku przeciwciała są przeciwciałami poliklonalnymi lub przeciwciałami monoklonalnymi, korzystnie przeciwciała obejmują przeciwciała znakowane, korzystniej są znakowane z wykorzystaniem peroksydazy lub znacznika w postaci cząsteczek, takiego jak złoto koloidalne.
Wynalazek również dotyczy preparatu antygenowego obejmującego antygen specyficzny dla PCV typu II odpowiedzialnego za PMWS, w którym antygen jest rozpoznawany przez przeciwciała specyficzne dla PCV typu II i umożliwia diagnozę infekcji PCV typu II. Znajomość sekwencji różnych cirkowirusów umożliwia określenie wspólnych sekwencji, co pozwala na wytworzenie reagentów zdolnych do rozpoznania znanych świńskich cirkowirusów.
Specjaliści mogą dobrać fragmenty sekwencji odpowiadających regionom wykazującym niewielką albo słabą homologię do sekwencji odpowiedniego cirkowirusa PK/15 w celu przeprowadzenia swoistej diagnostyki.
Przyrównanie sekwencji umożliwia specjalistom wybranie reagenta zależnie od potrzeb.
Pierwszy reagent obejmuje ujawnione tu sekwencje DNA i ich fragmenty, które w szczególności stosuje się jako sondy albo startery w dobrze znanych technikach hybrydyzacji albo PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy).
Drugi reagent obejmuje polipeptydy kodowane przez te sekwencje z wirusa albo wyrażone przy użyciu wektora (patrz, wyżej) albo syntetyzowane metodą chemiczną według konwencjonalnych technik syntezy peptydów.
Trzeci i czwarty reagent obejmuje, odpowiednio, przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, które można wytworzyć według standardowych technik z wirusa, polipeptydów albo fragmentów, ekstrahowanych albo kodowanych przez sekwencje DNA.
Te drugie, trzecie i czwarte reagenty można zastosować w sposobie diagnozowania, w którym przeprowadza się test na próbce płynu fizjologicznego (krew, osocze, surowica itp.) albo na próbce tkanki (węzeł chłonny, wątroba, płuca, nerki itp.) pochodzącej od badanej świni, na obecność antygenu swoistego dla cirkowirusów według wynalazku, przez poszukiwanie samego antygenu albo przeciwciał skierowanych przeciwko temu antygenowi.
Antygeny i przeciwciała według wynalazku można zastosować w dowolnej znanej technice diagnostyki laboratoryjnej.
Jednakże, korzystne jest zastosowanie ich w technikach, które można przeprowadzać bezpośrednio w terenie przez weterynarza, hodowcę albo właściciela zwierzęcia. Specjalistom w dziedzinie znane są techniki laboratoryjne i polowe, w których można zastosować ten antygen i/lub przeciwciała jako reagenty diagnostyczne.
Techniki diagnostyczne, które można korzystnie zastosować obejmują technikę Western blot, immunofluorescencji, ELISA i immunochromatografię.
W odniesieniu do sposobów chromatograficznych, specjaliści mogą odnieść się w szczególności do Zurk i in., Clin. Chem 31/7, 1144-1150 (1985), jak również do patentów albo zgłoszeń patentowych WO-A-88/08534, WO-A-91/12528, EP-A-291 176, EP-A-299 428, EP-A-291 194, EP-A-284 232, US-A-5 120 643, US-A-5 030 558, US-A-5 266 497, US-A-4 740 468, US-A-5 266 497, US-A-4 855 240, US-A-5 451 504, US-A-5 141 850, US-A-5 232 835 i US-A-5 238 652.
Tak więc, korzystnie wykrywa się swoiste przeciwciała w próbce testem pośrednim, przez kompetycję albo przez wypieranie. W tym celu, antygen stosuje się jako reagent diagnostyczny albo frag8
PL 198 506 B1 menty antygenu, zachowujące rozpoznawanie przez przeciwciała. Znakowanie korzystnie można przeprowadzić przez znakowanie peroksydazą albo specjalne znakowanie, korzystnie złotem koloidalnym.
Może być również wskazane wykrywanie samego antygenu w próbce przy pomocy znakowanego przeciwciała swoistego wobec antygenu. Znakowanie korzystnie przeprowadza się, jak to opisano wyżej.
Przez przeciwciało swoiste wobec antygenu, które można zastosować w szczególności do testów kompetycyjnych albo wypierania albo do wykrywania samego antygenu, rozumie się przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne swoiste wobec antygenu, fragmenty tych przeciwciał, korzystnie fragmenty Fab albo F(ab')2.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych albo monoklonalnych swoistych wobec antygenu według wynalazku, przy czym przeciwciała można zastosować w szczególnoś ci jako reagent diagnostyczny do wykrywania antygenu w próbce płynu fizjologicznego albo próbce tkanki, albo nawet do wykrywania przeciwciał występujących w takiej próbce. Dotyczy to fragmentów immunologicznie czynnych przeciwciał, w szczególności fragmentów F(ab) i F(ab')2.
Przeciwciała można wytworzyć zwykłymi technikami. W szczególności można odnieść się do Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, USA albo do Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Inc., których zawartość włączono tu jako odnośnik.
W szczególności moż liwe jest przeprowadzenie fuzji splenocytów myszy immunizowanych antygenem albo przynajmniej jego fragmentem, z odpowiednimi komórkami szpiczaka.
Preparat przeciwciał monoklonalnych albo poliklonalnych swoistych wobec antygenu będzie korzystnie czysty albo zasadniczo czysty, albo nawet surowy, zwłaszcza będą to przeciwciała mysie albo królicze.
Wynalazek umożliwia również określenie interesujących epitopów, zwłaszcza na podstawie opisanych tu sekwencji DNA, w tym epitopów interesujących ze względu na szczepionkę albo epitopów interesujących diagnostycznie. Z sekwencji DNA genomu cirkowirusa według wynalazku, specjalista ma możliwość określenia epitopów według znanych sposobów, przykładowo odpowiednim programem komputerowym albo metodą PEPSCAN. Epitopy są regionami immunodominującymi białek i jako takie są eksponowane na powierzchni białka. Mogą być więc rozpoznawane przez przeciwciała, a więc można je zastosować w dziedzinie diagnostyki do wytwarzania przeciwciał w celu diagnostycznym albo do wytwarzania odpowiednich peptydów, które można zastosować jako odczynniki diagnostyczne.
Epitop jest peptydem o długości od 8 do 9 aminokwasów, korzystnie o długości zasadniczo minimum 13 do 25 aminokwasów.
Specjaliści mogą, stosując jedną albo wiele technik, jak również inne dostępne techniki, znaleźć epitopy w celu zastosowania peptydów albo przeciwciał do celów diagnostycznych.
Wynalazek dotyczy również zestawu do diagnozy infekcji PCV typu II odpowiedzialnego za PMWS, który obejmuje co najmniej jedno przeciwciało i/lub antygen według wynalazku.
Korzystnie zestaw obejmuje środki do diagnozy metodą Western Blot, immunofluorescencji, ELISA lub immunochromatografią, korzystniej środki do diagnozy testami typu pośrednie, kompetycyjne lub zastępowania.
Wynalazek również dotyczy sposobu diagnozowania infekcji przez świński cirkowirus, który obejmuje kontaktowanie próbki fizjologicznego płynu lub próbki tkanki od świni z odczynnikiem diagnostycznym specyficznym dla obu PCV typu II i PCV typu I (świński cirkowirus PK/15), przy czym jeżeli wykrywa się antygen, przeciwciało lub kwas nukleinowy specyficzny dla PCV, diagnozowana jest infekcja PCV.
Korzystnie odczynnik diagnostyczny obejmuje sondę lub starter obejmujący przeciwciało, antygen lub sekwencję DNA. Poniżej opisany jest szczegółowo wynalazek w nieograniczających go przykładach i wykonaniach, w odniesieniu do rysunków, na których:
Na Figurze 1 przedstawiona jest sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1011-48121.
Na Figurze 2 przedstawiona jest sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1011-48285.
Na Figurze 3 przedstawiona jest sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 999.
Na Figurze 4 przedstawiona jest sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1010.
Na Figurze 5 przedstawione jest przyrównanie 4 sekwencji według Fig. 1-4 z sekwencją szczepu PCV PK/15.
Na Figurze 6 przedstawiona jest sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 999, jak określona w pierwotnym zgł oszeniu we Francji 3 paź dziernika, 1997.
Na Figurze 7 przedstawione jest przyrównanie sekwencji Figury 6 z sekwencją szczepu PK/15.
Lista sekwencji
PL 198 506 B1
Id. Sekw. nr 1: Sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1011-48121.
Id. Sekw. nr 2: Sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1011-48285.
Id. Sekw. nr 3: Sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 999.
Id. Sekw. nr 4: Sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1010.
Id. Sekw. nr 5: Sekwencja DNA genomu szczepu PK/15.
Id. Sekw. nr 6: Sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 999, jak określony w pierwotnym zgłoszeniu we Francji 3 października, 1997.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Hodowla i izolacja szczepów świńskich cirkowirusów
Próbki tkanek pobrano we Francji, Kanadzie i USA z płuc i węzłów chłonnych prosiąt. Prosięta te wykazywały kliniczne objawy typowe dla wielonarządowego zespołu wyniszczenia. W celu ułatwienia izolowania wirusów, próbki tkanek zamrażano w -70°C bezpośrednio po sekcji.
W celu wyizolowania wirusa, wytworzono zawiesiny zawierają ce okoł o 15% próbki tkankowej w minimalnej poż ywce zawierają cej sole Earle'a (EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham, UK), penicylinę (100 lU/ml) i streptomycynę (100 μg/ml) (pożywka MEM-SA), przez rozdrabnianie tkanek sterylnym piaskiem w sterylnym moździerzu. Rozdrobnione preparaty pobrano w MEM-SA i odwirowano przy 3000 g przez 30 minut w +4°C w celu zebrania nadsączu.
Przed zaszczepieniem hodowli komórkowych, do 2 ml każdego nadsączu dodano 100 μl chloroformu i ciągle mieszano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę przeniesiono do probówki wirowniczej, odwirowano przy 3000 g przez 10 minut, a następnie zebrano nadsącz. Nadsącz zastosowano do zaszczepienia w doświadczeniach nad izolowaniem wirusa.
Wszystkie badania nad izolowaniem wirusa przeprowadzono na komórkach PK/15, o których było wiadomo, że nie są zanieczyszczone świńskim cirkowirusem (PCV), pestiwirusami, świńskimi adenowirusami i świńskimi parvowirusami (Allan i in., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal materiał, Vet. Microbiol. 1995, 44:49-64).
Izolowanie świńskich cirkowirusów przeprowadzono według następującej techniki:
Pojedyncze warstwy komórek PK/15 oddzielono od podłoża przez trypsynizację (mieszaniną trypsyny z wersenianem) i pobrano w pożywce MEM-SA zawierającej 15% surowicę płodową cielęcą, nie zanieczyszczoną pestiwirusem (= pożywka MEM-G) w gęstości około 400000 komórek na ml. 10 ml porcje tej zawiesiny komórkowej mieszano z 2 ml frakcji zaszczepki opisanej wyżej, po czym mieszaninę końcową dzielono na porcje po 6 ml w dwóch butelkach Falcon po 25 cm2. Hodowle te inkubowano w 37°C przez 18 godzin w atmosferze zawierającej 10% CO2.
Po inkubacji, pożywkę hodowlaną znad warstw komórek traktowano 300 mM D-glukozaminą (nr kat G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, IK) (Tischr i in., Arch. Virol., 1987, 96:39-57), a następnie inkubowano przez dodatkowy okres 48-72 godzin w 37°C. Po ostatniej inkubacji, jedną z dwóch butelek Falcon poddano 3 kolejnym cyklom zamrażania/odmrażania. Komórki PK/15 pozostałej butelki Falcon traktowano roztworem trypsyny-wersenianu, zawieszono w 20 ml pożywki MEM-G, a następnie zaszczepiono na butelkach Falcon 75 cm2, w gęstości 400000 komórek/ml. Świeżo zaszczepione butelki nadkażono przez dodanie 5 ml odpowiedniego lizatu otrzymanego po cyklach zamrażania/odmrażania.
P r z y k ł a d 2: Wytwarzanie próbek hodowli komórkowej do wykrywania świńskich cirkowirusów przez immunofluorescencję albo przez hybrydyzację in situ
Objętość 5 ml nadkażonej zawiesiny pobrano i zaszczepiono na szalkach Petri'ego 55 mm średnicy, zawierających sterylne i odtłuszczone szkiełka nakrywkowe. Hodowle w butelkach i na szklanych szkiełkach nakrywkowych inkubowano w 37°C i traktowano glukozaminą jak to opisano w Przykładzie 1. Hodowle na szkiełkach nakrywkowych zebrano po 24-48 godzinach po traktowaniu glukozaminą i utrwalono, w acetonie przez 10 minut w temperaturze pokojowej albo 10% buforowaną formaliną przez 4 godziny. Po utrwalaniu, wszystkie szkiełka nakrywkowe przechowywano w -70°C na żelu krzemionkowym, przed ich zastosowaniem do hybrydyzacji in situ i barwienia immunocytochemicznego.
P r z y k ł a d 3: Techniki wykrywania sekwencji PCV przez hybrydyzację in situ
Hybrydyzację in situ przeprowadzono na tkankach pobranych od chorych świń i utrwalono formaliną, jak również na preparatach hodowli komórkowych zaszczepionych izolatami wirusa (patrz, Przykład 2) i utrwalonych na szkiełkach nakrywkowych .
Zastosowano kompletne sondy genomowe odpowiadające świńskim cirkowirusom PK/15 (PCV) oraz wirusowi kurzej zakaźnej anemii (CAV). Plazmid pPCV1, zawierający replikacyjną postać genomu PCV, klonowaną w postaci pojedynczej wstawki wielkości 1,7 kbp (Meehan i in. , Sequence of
PL 198 506 B1 porcine circovirus DNA; affinities with plant circoviruses, J. Gen. Virol. 1997, 78:221-227), zastosowano jako swoistą sekwencję DNA dla PCV. Analogiczny plazmid, pCAA1, zawierający postać replikacyjną ptasiego cirkowirusa CAV zastosowano jako kontrolę negatywną. Odpowiednie banki glicerynowe dwóch plazmidów zastosowano do wytworzenia i oczyszczenia plazmidów techniką lizy alkalicznej (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)), a następnie zastosowano je jako matryce do wytworzenia sond. Sondy cirkowirusowe reprezentatywne dla kompletnych genomów PCV i CAV wytworzono z oczyszczonych plazmidów opisanych wyżej (1 μg dla każdej sondy) i losowych starterów heksanukleotydowych stosując dostępny w handlu zestaw do nie-radioaktywnego znakowania (DIG DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim, Lewes, UK) według instrukcji producenta.
Sondy znakowane digoksygeniną pobrano w objętości 50-100 μl sterylnej wody, po czym zastosowano do hybrydyzacji in situ.
Próbki tkankowe od chorych świń, zatopione w parafinie i utrwalone formaliną, jak również preparaty zakażonych hodowli komórkowych utrwalone formaliną przygotowano do wykrywania kwasów nukleinowych PCV według następującej techniki:
Skrawki grubości 5 μm cięto z bloków tkankowych zatopionych w parafinie, uwalniano z parafiny, a następnie uwadniano w kolejnych roztworach alkoholu o malejącym stężeniu. Skrawki tkankowe i hodowle komórkowe utrwalone w formalinie inkubowano przez 15 minut i 5 minut w 37°C, odpowiednio, w 0,5% roztworze proteinazy K w 0,05 M buforze Tris-HCl, zawierającym 5 mM EDTA (pH 7,6). Szkiełka umieszczono w 1% roztworze glicyny w autoklawowanej, sterylnej wodzie na 30 sekund, dwukrotnie płukano 0,01 M PBS (roztwór soli buforowany fosforanem) (pH 7,2), a na koniec płukano przez 5 minut w sterylnej wodzie destylowanej. Na koniec suszono je na świeżym powietrzu i umieszczano w kontakcie z sondami.
Każdy preparat tkanki/sondy przykrywano czystym i odtłuszczonym szkiełkiem nakrywkowym, a następnie umieszczano w piecu w 90°C przez 10 minut, a następnie umieszczano w kontakcie z blokiem lodu przez minutę, zaś na koniec inkubowano przez 18 godzin w 37°C. Następnie preparaty krótko zanurzano w 2X buforze soli z cytrynianem sodu (SSC) (pH 7,0) w celu usunięcia pokrywającego szkiełka, po czym płukano dwukrotnie przez 5 minut w 2X SSC, a na koniec przez 5 minut w buforze PBS.
Po tych płukaniach, preparaty zanurzano w roztworze 0,1 M kwasu jabłkowego, 0,15 M NaCl (pH 7,5) (bufor jabłczanowy) przez 10 minut, a następnie inkubowano w 1% roztworze reagenta blokującego (nr kat. 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK) w buforze jabłczanowym przez 20 minut w 37°C.
Następnie preparaty inkubowano z roztworem 1/250 przeciwciała monoklonalnego przeciwko digoksygeninie (Boehringer Mannheim), rozcieńczano w buforze blokującym przez godzinę w 37°C, płukano w PBS i na koniec inkubowano z biotynowanym przeciwciałem przeciwko mysiej immunoglobulinie przez 30 minut w 37°C. Preparaty płukano w PBS i blokowano endogenną aktywność peroksydazową przez traktowanie roztworem 0,5% nadtlenku wodoru w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Preparaty ponownie płukano PBS i traktowano 3-amino-9-dietylokarbazolem (AEC) (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK) wytworzonym bezpośrednio przed użyciem.
Po końcowym płukaniu w bieżącej wodzie, preparaty podbarwiano hematoksyliną, odbarwiano pod bieżącą wodą i zatapiano na szkiełkach płynem do zatapiania (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK). Kontrole doświadczalne obejmowały zastosowanie niespokrewnionej sondy negatywnej (CAV) i sondy pozytywnej (PCV) na próbkach otrzymanych od chorych i zdrowych świń.
P r z y k ł a d 4 Technika wykrywania PCV przez immunofluorescencję
Początkowe badanie przesiewowe wszystkich preparatów hodowli komórkowych utrwalonych w acetonie przeprowadzono techniką immunofluorescencji pośredniej (IIF) stosując rozcieńczenie 1/100 puli surowicy dorosłych świń. Pula surowic obejmowała surowice od 25 dorosłych macior z Irlandii Północnej, o których wiadomo, że zawierały przeciwciała przeciwko wielu wirusom świńskim, w tym PCV: świńskiemu parvowirusowi, świńskiemu adenowirusowi i wirusowi PRRS. Technikę IIF przeprowadzono przez doprowadzenie do kontaktu pomiędzy surowicą (rozcieńczoną w PBS) z hodowlami komórkowymi (przez godzinę w 37°C, a następnie przez dwa płukania w PBS. Hodowle komórkowe barwiono rozcieńczeniem 1/80 w PBS króliczego przeciwciała przeciwko świńskim immunoglobulinom, sprzęgniętego z izotiocyjanianem fluoresceiny przez godzinę, a następnie płukano w PBS i zatapiano w buforze glicerynowym przed obserwacją pod mikroskopem w świetle ultrafioletowym.
PL 198 506 B1
P r z y k ł a d 5: Wyniki hybrydyzacji in situ na tkankach chorych świń
Hybrydyzacja in situ, z użyciem genomowej sondy PCV, na tkankach pobranych od prosiąt z Francji, Kanady i Kalifornii ze zmianami wyniszczenia wielonarządowego i utrwalonych w formalinie, wykazywały obecność kwasów nukleinowych PCV związanych ze zmianami, w kilku badanych zmianach. Nie obserwowano sygnału gdy sondę genomową PCV zastosowano na tkankach pobranych od świń zdrowych albo gdy zastosowano sondę CAV na tkankach świń chorych. Obecność kwasu nukleinowego PCV zidentyfikowano w cytoplazmie i jądrze wielu komórek jednojądrzastych naciekających zmiany w płucach prosiąt kalifornijskich. Obecność kwasu nukleinowego PCV wykazano również w pneumocytach, komórkach nabłonka oskrzeli i oskrzelików oraz w komórkach śródbłonka tętniczek, żyłek i naczyń limfatycznych.
U chorych świń z Francji, obecność kwasu nukleinowego PCV wykryto w cytoplazmie licznych limfocytów pęcherzykowych oraz w wewnątrz zatokowych komórek jednojądrzastych węzłów chłonnych. Kwas nukleinowy PCV wykrywano również czasami w syncytiach. Zależnie od wyników wykrywania, próbki płuc świń kalifornijskich, trzewnych węzłów chłonnych świń francuskich i narządów świń kanadyjskich wybrano w celu wyizolowania nowych szczepów świńskich cirkowirusów.
P r z y k ł a d 6: Wyniki hodowli komórkowych nowych szczepów świńskich cirkowirusów i wykrywanie przez immunofluorescencję
Nie obserwowano efektu cytopatycznego (CPE) w hodowlach komórkowych zakażonych próbkami pobranymi od prosiąt francuskich (szczep Imp. 1008), prosiąt kalifornijskich (szczep Imp. 999) i prosiąt kanadyjskich (szczep Imp. 1010), wykazujących objawy zespołu wyniszczenia wielonarządowego. Jednakże, znakowanie immunologiczne preparatów otrzymanych z zaszczepionych hodowli komórkowych, po utrwaleniu w acetonie, z użyciem puli świńskich surowic wykazało fluorescencję jądrową licznych komórek w hodowlach zaszczepionych płucami prosiąt kalifornijskich (szczep Imp. 999), trzewnymi węzłami chłonnymi prosiąt francuskich (szczep Imp. 1008) i narządami prosiąt kanadyjskich (szczep Imp. 1010).
P r z y k ł a d 7: Ekstrakcja genomowego DNA świńskich cirkowirusów
Postaci replikacyjne nowych szczepów świńskich cirkowirusów (PCV) wytworzono przy użyciu zakażonych hodowli komórkowych PK/15 (patrz, Przykład 1) (10 butelek Falcon po 75 cm2) zebranych po 72-76 godzinach inkubacji i traktowanych glukozaminą, jak opisano w przypadku klonowania replikacyjnych postaci CAV (Todd i in., Dot blot hybridization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe, J. Clin. Microbiol. 1991, 29:933-939). Dwuniciowy DNA tych postaci replikacyjnych ekstrahowano według modyfikacji techniki Hirt (Hirt, Selective extraction of polyoma wirus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36:365-369), jak opisano w Molitor (Molitor i in., Porcine parvovirus DNA: characterisation of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates, Virol. 1984, 137:241-254).
P r z y k ł a d 8: Mapa restrykcyjna postaci replikacyjnej genomu szczepu Imp. 999 świńskiego cirkowirusa
DNA (1-5 μg) ekstrahowany wg technik Hirt, traktowano nukleazą S1 (Amersham) według instrukcji producenta a następnie, ten DNA trawiono różnymi enzymami restrykcyjnymi (Boehringer Mannheim, Lewis, UK), zaś produkty trawienia rozdzielono przez elektroforezę na 1,5% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny, jak opisano w Todd i in. (Purification and biochemical characterisation of chicken anemia agent, J. Gen. Virol. 1990, 71:819-823). DNA ekstrahowany z hodowli szczepu Imp. 999 posiada unikalne miejsce EcoRI, dwa miejsca SacI i nie posiada żadnego miejsca Pstl. Ten profil restrykcyjny jest różny od profilu restrykcyjnego wykazywanego przez szczep PK/15 (Meehan i in., Sequence of porcine circovirus DNA; affinities with plant circoviruses, J. Gen. Virol. 1997, 78:221-227), które dla odmiany zawierają miejsce Pstl, a nie zawierają miejsca EcoRI
P r z y k ł a d 9: Klonowanie genomu szczepu Imp. 999 świńskiego cirkowirusa
Fragment restrykcyjny wielkości około 1,8 kbp, wytworzony przez trawienie dwuniciowej postaci replikacyjnej szczepu Imp. 999 PCV enzymem EcoRI wyizolowano po elektroforezie na 1,5% żelu agarozowym, (patrz, Przykład 3), z użyciem dostępnego w handlu zestawu Qiagen (QIAEXII Gel Extraction Kit, nr kat. 20021, Qiagen Ltd., Crawley, West Sussex, UK). Fragment restrykcyjny EcoRIEcoRI poddano ligacji do wektora pGEM-7 (Promega, Medical Supply, Company, Dublin, Irlandia), uprzednio trawiony i defosforylowany według standardowej techniki klonowania (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Otrzymane tak plazmidy transformowano do E. coli, szczepu JM10 (Stratagene, La Jolla, USA) według standardowych technik. Fragment restrykcyjny EcoRI-EcoRI szczepu Imp. 999 PCV klonowano również w miej12
PL 198 506 B1 sce EcoRI wektora pBluescript SK+ (Stratagene Inc., La Jolla, USA). Wśród uzyskanych klonów dla każdego szczepu roboczego wyselekcjonowano przynajmniej 2 klony zawierały fragmenty o oczekiwanej długości. Klony otrzymane hodowano i oczyszczano plazmidy zawierające kompletny genom szczepu Imp. 999 w małej objętości (2 ml) albo większej objętości (250 ml) według standardowego sposobu wytwarzania i technik oczyszczania.
P r z y k ł a d 10: Sekwencjonowanie genomowego DNA (dwuniciowa postać replikacyjna) szczepu Imp. 999
Sekwencję nukleotydową dwóch szczepów EcoRI Imp. 999 (klony pGEM-7/2 i pGEM-7/8) określono techniką didezoksynukleotydów Sangera, stosując zestaw do sekwencjonowania Ampli-Taq DNA Polymerase FS (nr kat. 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK) i urządzenie do automatycznego sekwencjonowania Applied Biosystems AB1373A według instrukcji producenta.
Początkową reakcję sekwencjonowania przeprowadzono przy użyciu uniwersalnych starterów M13 „naprzód i „wstecz. Kolejne reakcje sekwencjonowania przeprowadzono techniką „kroczenia po DNA. Oligonukleotydy konieczne do kolejnych reakcji sekwencjonowania syntetyzowano w Life Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, UK).
Wytworzone sekwencje połączono i analizowano przy uż yciu oprogramowania MacDNASIS 3.2 (nr kat. 22020101, Appligene, Durham, UK). Analizowano róż ne otwarte ramki odczytu przy użyciu algorytmu dostę pnego na serwerze National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Kompletna sekwencja (fragment EcoRI-EcoRI) otrzymana początkowo z klonu pGEM-7/8 (Id. Sekw. nr 6) pokazana jest na Figurze 6. Rozpoczyna się ona arbitralnie po G w miejscu EcoRI i wykazuje kilka niejasnoś ci nukleotydowych.
Sekwencjonowanie optymalizowano i Id. Sekw. nr 3 (Figura 3) przedstawia całkowitą sekwencję tego szczepu, rozpoczynając się arbitralnie na początku miejsca EcoRI, z G jako pierwszym nukleotydem.
Procedurę przeprowadzono w sposób podobny do otrzymania sekwencji trzech innych izolatów według wynalazku (patrz, Id. Sekw. nr 1, 2 i 4 oraz Figury 1, 2 i 4).
Wielkość genomu tych czterech szczepów wynosi:
Imp. 1011-48121 1767 nukleotydów
Imp. 1011-48285 1767 nukleotydów
Imp. 999 1768 nukleotydów
Imp. 1010 1768 nukleotydów
P r z y k ł a d 11: Analiza sekwencji szczepu Imp. 999 PCV
Gdy sekwencję wytworzoną ze szczepu Imp. 999 zastosowano do badania homologii w odniesieniu do sekwencji zawartych w GenBank, jedyną istotną homologią, którą wykryto, była homologia wynosząca około 76% (na poziomie nukleotydowym) z sekwencją szczepu PK/15 (nr dostępu Y09921 i U49186) (patrz, Figura nr 5).
Na poziomie aminokwasowym, test homologii po translacji sekwencji w 6 fazach z bankami danych (algorytm BLAST X na serwerze NCBI) umożliwił wykazanie 94% homologii z otwartą ramką odczytu odpowiadającą teoretycznej replikazie wirusa BBTV podobnego do cirkowirusów roślinnych (nr identyfikacyjny GenBank 1841515), kodowanej przez sekwencję GenBank U49186.
Żadna inna sekwencja zawarta w bazie danych nie wykazywała istotnej homologii z sekwencją wytworzoną ze szczepu Imp. 999 PCV.
Analiza sekwencji otrzymanych ze szczepu Imp. 999 hodowanego ze zmian uzyskanych od kalifornijskich prosiąt wykazujących objawy kliniczne zespołu wyniszczenia wielonarządowego jasno pokazuje, że ten izolat wirusowy stanowi nowy szczep świńskiego cirkowirusa.
P r z y k ł a d 12: Porównawcza analiza sekwencji
Przeprowadzono przyrównanie sekwencji nukleotydowych 4 nowych szczepów PCV z sekwencją szczepu PK/15 PCV (Figura 5). Wytworzono matrycę homologii biorącą pod uwagę cztery nowe szczepy i poprzedni szczep PK/15. Otrzymano następujące wyniki:
1: Imp. 1011-48121
2: Imp. 1011-48285
3: Imp. 999
4: Imp. 1010
5: PK/15
PL 198 506 B1
2 3 4 5
1 1, 0000 0,9977 0,9615 0,9621 0, 7600
2 1,0000 0,9621 0,9632 0,7594
3 1,0000 0,9949 0,7560
4 1,0000 0, 7566
5 1, 0000
Homologia pomiędzy dwoma szczepami francuskimi Imp. 1011-48121 i Imp. 1011-48285 wynosiła ponad 99% (0,9977).
Homologia pomiędzy dwoma szczepami północnoamerykańskimi Imp. 999 i Imp. 1010 wynosiła również powyżej 99% (0,9949). Homologia pomiędzy szczepami francuskimi i szczepami północnoamerykańskimi wynosiła nieco powyżej 96%.
Homologia pomiędzy tymi szczepami i PK/15 wynosiła od 75 do 76%.
Wywnioskowano, że szczepy według wynalazku są reprezentatywne dla nowego rodzaju świńskiego cirkowirusa, różnego od rodzaju reprezentowanego przez szczep PK/15. Ten nowy rodzaj, wyizolowany od świń wykazujących zespół PMWS, nazywany jest typem II świńskiego cirkowirusa, przy czym PK/15 stanowi typ I. Szczepy należące do typu II wykazują istotną homogenność sekwencji nukleotydowej, mimo iż wyizolowano je z geograficznie odległych regionów.
P r z y k ł a d 13: Analiza białek kodowanych przez genom nowych szczepów PCV
Sekwencję nukleotydową izolatu Imp. 1010 uznano za reprezentatywną dla innych szczepów cirkowirusów związanych z zespołem wyniszczenia wielonarządowego. Sekwencję tę analizowano szczegółowo przy pomocy algorytmu BLASTX (Altschul i in., J. Mol. Biol. 1990, 215:403-410) i kombinacji programów z zestawu oprogramowania MacVector 6.0 (Oxford Molecular Group, Oxford ) X4 4GA, UK). W sekwencji można było wykryć 13 otwartych ramek odczytu (albo ORF) wielkości ponad 20 aminokwasów (genom kołowy). Omówione 13 ORF-ów przedstawiono niżej:
Nazwa Start Koniec Nić Wielkość ORF (nukleotydy) Wielkość białka (aminokwasy)
ORF 1 103 210 sens 108 35
ORF 2 1180 1317 sens 138 45
ORF 3 1363 1524 sens 162 53
ORF 4 398 1324 sens 945 314
ORF 5 900 1079 sens 180 59
ORF 6 1254 1334 sens 81 26
ORF 7 1018 704 antysens 315 104
ORF 8 439 311 antysens 129 42
ORF 9 190 101 antysens 90 29
ORF 10 912 733 antysens 180 59
ORF11 645 565 antysens 81 26
ORF 12 1100 1035 antysens 66 21
ORF 13 314 1381 antysens 702 213
Położenie startu i końca każdej z ORF dotyczy sekwencji przedstawionej na Fig. 4 (Id. Sekw. nr 4) genomu szczepu 1010. Limity ORF 1 do 13 są identyczne dla szczepu 999. Są one również identyczne dla szczepów 1011-48121 i 1011-48285, z wyjątkiem ORF 3 i 13:
ORF 3 1432-1539, sens, 108 nt, 35 aa.
ORF13 314-1377, antysens, 705 nt, 234 aa.
Wśród tych 13 ORF, 4 wykazywały istotną homologię z analogicznymi ORF położonymi w genomie klonowanego wirusa PCV PK/15. Analizowano każdą z otwartych ramek odczytu obecnych
PL 198 506 B1 w genomie wszystkich izolatów cirkowirusów związanych z zespołem wyniszczenia wielonarzą dowego. Te 4 ORF przedstawiono poniżej:
Nazwa Start Koniec Nić wielkość ORF Wielkość białka Ciężar cząst .
ORF 4 398 1342 sens 945 314 37,7 kDa
ORF 7 1018 704 antysens 315 104 11,8 kDa
ORF 10 912 733 antysens 180 59 6,5 kDa
ORF13 314 1381 antysens 702 233 27,8 kDa
Położenie początku i końca każdej z ORF dotyczą sekwencji przedstawionej na Fig. 4 (Id. Sekw. nr 4). Wielkość ORF (w nukleotydach = nt) obejmuje kodon stop.
Porównanie pomiędzy organizacją genomową izolatów PCV Imp. 1010 i PCV PK/15 umożliwia identyfikację 4 ORF zachowanych w genomie dwóch wirusów. Poniższa tablica przedstawia zaobserwowane stopnie homologii:
ORF Imp. 1010 /ORF PVC PK/15 Procent homologii
ORF4/ORF1 86%
ORF13/ORF2 66,4%
ORF7/ORF3 61,5% (na poziomie nakładki (104 aminokwasy))
ORF10/ORF4 83% (na poziomie nakładki (59 aminokwasów))
Największą identyczność sekwencji zaobserwowano pomiędzy ORF4 Imp. 1010 i ORF1 PK/15 (86% homologii). Było to nieoczekiwane, ponieważ białko to jest prawdopodobnie związane z replikacją wirusowego DNA i jest niezbędne dla replikacji wirusa (Meehan i in., J. Gen. Virol. 1997, 78:221-227; Mankertz i in., J. Gen. Virol. 1998, 79:381-384).
Identyczność sekwencji pomiędzy ORF13 Imp. 1010 i ORF2 PK/15 jest mniejsza (66,4% homologii), ale każda z tych dwóch ORF wykazuje silnie zakonserwowany region końca N, który jest identyczny z regionem końca N głównego białka strukturalnego ptasiego cirkowirusa CAV (Meehan i in., Arch. Virol, 1992, 124:301-319). Ponadto, obserwowano znaczne różnice pomiędzy ORF7 Imp. 1010 i ORF3 PK/15 oraz pomiędzy ORF10 Imp. 1010 i ORF4 PK/15. W każdym przypadku, istniała delecja regiony końca C ORF7 i ORF10 izolatu Imp. 1010, kiedy porównano je z ORF3 i ORF4 PCV PK/15. Najwię kszą homologię sekwencji zaobserwowano na poziomie regionów końca N ORF7/ORF3 (homologia 61.5% na poziomie nakładki) i ORF10/ORF4 (83% homologii na poziomie nakładki).
Wydaje się, że organizacja genomowa świńskiego cirkowirusa jest nieco złożona w konsekwencji skrajnej kondensacji jego genomu. Główne białko strukturalne pochodzi prawdopodobnie ze składania kilku ramek odczytu położonych na tej samej nici genomu świńskiego cirkowirusa. Można więc uznać, że dowolna ramka odczytu (ORF1 do ORF13) jak opisana w powyższej Tablicy może stanowić całość albo część antygenowego białka-kodowanego przez świńskiego cirkowirusa typu II, a stąd jest potencjalnie antygenem, który można zastosować do swoistej diagnostyki i/lub szczepienia. Stąd, wynalazek dotyczy dowolnego białka obejmującego przynajmniej jedną z ORF. Korzystnie, wynalazek dotyczy białka zasadniczo obejmującego ORF4, ORF7, ORF10 albo ORF13.
P r z y k ł a d 14: Zakaźny charakter genomu PCV klonowanego z nowych szczepów
Plazmid pGEM-7/8 zawierający kompletny genom (postać replikacyjną) izolatu Imp. 999 transfekowano do komórek PK/15 techniką opisaną przez Meehan i in., Arch. Virol. 1992, 124:301-319). Analiza metodą immunofluorescencji (patrz, Przykład 4) przeprowadzona na pierwszym pasażu po transfekcji na niezakażonych komórkach PK/15 wykazała, że plazmid klonu pGEM-7/8 był zdolny do indukowania wytwarzania zakaźnego wirusa PCV. Dostępność klonu zawierającego zakaźny materiał genetyczny PCV umożliwia dowolną przydatną manipulację na genomie wirusowym w celu wytworzenia szczepionek atenuowanych albo rekombinowanych, albo w celu wytwarzania antygenów do testów diagnostycznych.
PL 198 506 B1
P r z y k ł a d 15: Wytwarzanie antygenów PCV przez hodowlę in vitro
Hodowlę niezakażonych komórek PK/15 i namnożenie wirusa przeprowadzono według sposobów opisanych w Przykładzie 1. Zakażone komórki zebrano po trypsynizacji po 4 dniach inkubacji w 37°C i policzono. Nastę pny pasaż przeprowadzono przy uż yciu 400000 zakażonych komórek na ml.
P r z y k ł a d 16: Inaktywacja antygenów wirusowych
Na zakończenie hodowli wirusa, zakażone komórki zebrano i poddano lizie stosując ultradźwięki (Branson Sonifier) albo przy użyciu młyna koloidalnego typu rotor-stator (Ultraturrax, IKA). Następnie zawiesinę wirowano przy 3700 g przez 30 minut. Zawiesinę wirusową inaktywowano 0,1% etylenaminą przez 18 godzin w 37°C albo przy użyciu 0,5% beta-propionolaktonu przez 24 godziny w 28°C. Gdy miano wirusa przed inaktywacją był o nieodpowiednie, zawiesinę wirusową zatężano przez ultra-filtrację, stosując membranę o ciężarze odcięcia 300 kDa (Millipore PTMK300). Inaktywowaną zawiesinę wirusową przechowywano w 5°C.
P r z y k ł a d 17: Wytwarzanie szczepionki w postaci emulsji opartej na oleju mineralnym Szczepionkę wytworzono w oparciu o następujący schemat:
- zawiesina inaktywowanego ś wiń skiego cirkowirusa 250 ml
- Montanide® ISA 70 (SEPPIC) 750 ml Fazę wodną i olejową sterylizowano osobno przez filtrowanie. Emulsję wytworzono przez mieszanie i homogenizację składników przy pomocy emulgatora turbinowego Silverson.
Dawka szczepionki zawierała około 107'5 TCID50. Objętość pojedynczej szczepionki wynosiła
0,5 ml do podawania drogą śródskórną i 2 ml do podawania drogą domięśniową.
P r z y k ł a d 18: Wytwarzanie szczepionki w postaci emulsji opartej na metabolizowanym oleju Szczepionkę wytworzono według następującego wzoru:
- zawiesina inaktywowanego ś wiń skiego cirkowirusa 250 ml
- Dehymuls HRE 7 (Henkel) 60 ml
- Radia 7204 (Oleofina) 740 ml
Fazę wodną i olejową sterylizowano osobno przez filtrowanie. Emulsję wytworzono przez mieszanie i homogenizację składników przy pomocy emulgatora turbinowego Silverson.
Dawka szczepionki zawierała około 107'5 TCID50. Objętość pojedynczej szczepionki wynosiła ml do podawania drogą domięśniową.
P r z y k ł a d 19: Wyniki immunofluorescencji poś redniej w odniesieniu do szczepów wirusa
PCV z USA i Francji oraz do zanieczyszczenia PK/15 przy użyciu surowicy hiperimmunizowanej (PCY-T), panel przeciwciał monoklonalnych F99 wytworzono z PK/15 i surowicy hiperimmunizowanej wytworzonej ze szczepu kanadyjskiego
Wirus
PK/15 USA Francja
surowica odpornościowa PCY-T >6400 200 800
surowica odpornościowa PCV-T 200 >6400 >6400
F99 1H4 >10000 <100 100
F99 4B10 >10000 <100 <100
F99 2B7 >10000 100 <100
F99 2E12 >10000 <100 <100
F99 1C9 >10000 <100 100
F99 2E1 >10000 <100 <100
F99 1H4 >10000 100 <100
*0dwrotność ostatniego rozcieńczenia surowicy albo przeciwciała monoklonalnego, które daje pozytywną reakcję w teście immunofluorescencji pośredniej.

Claims (76)

1. Preparat wyizolowanego ś wiń skiego cirkowirusa typu II odpowiedzialnego za poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający (PWMS) u świń, uzyskany z hodowli komórkowej.
2. Preparat świńskiego cirkowirusa wybrany z grupy obejmującej preparaty zdeponowane w ECACC, pod nastę pują cymi odnoś nikami:
nr dostępu V97100219 nr dostępu V97100218 nr dostępu V97100217 nr dostępu V98011608 nr dostępu V98011609.
3. Preparat wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e ś wiń ski cirkowirus typu II jest wyizolowany z chorej ś wini cierpią cej na PMWS.
4. Preparat według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, ż e jest oczyszczony.
5. Preparat według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, ż e jest zatężony.
6. Preparat według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5, znamienny tym, że jest inaktywowany.
7. Sposób wytwarzania ś wiń skiego cirkowirusa typu II odpowiedzialnego za PMWS u ś wiń , znamienny tym, że hodowane in vitro komórki zakaża się wyizolowanym świńskim cirkowirusem typu II odpowiedzialnym za PWMS u świń i cirkowirus namnaża się na tych komórkach.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się cirkowirus, który może być wyizolowany ze świń cierpiących na PMWS.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, ż e stosuje się komórki linii komórkowej nerki świńskiej.
10. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że stosuje się cirkowirus zdeponowany w ECACC, pod następującymi numerami:
nr dostępu V97100219 nr dostępu V97100218 nr dostępu V97100217 nr dostępu V98011608 nr dostępu V98011609.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się komórki PK/15.
12. Sposób według zastrz. 7-11, znamienny tym, że obejmuje zbieranie i oczyszczanie świńskiego cirkowirusa typu II.
13. Sposób według zastrz. 7-11 albo 12, znamienny tym, że obejmuje zatężanie świńskiego cirkowirusa typu II.
14. Sposób według zastrz. 7-11 albo 12-13, znamienny tym, że obejmuje inaktywację świńskiego cirkowirusa typu II.
15. Ekstrakt albo nadsącz komórkowy, zawierający świński cirkowirus typu II, który może być uzyskany sposobem określonym w zastrz. 7-11.
16. Preparat antygenowy, zawierający świński cirkowirus typu II, który może być uzyskany sposobem określonym w zastrz. 7-14.
17. Wyizolowany świński cirkowirus typu II odpowiedzialny za PMWS u świń.
18. Cirkowirus jak określony w zastrz. 1, znamienny tym, że jest wyizolowany ze świni cierpiącej na PMWS.
19. Cirkowirus jak określony w zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest zdeponowany w ECACC, pod nastę pują cymi numerami:
nr dostępu V97100219 nr dostępu V97100218 nr dostępu V97100217 nr dostępu V98011608 nr dostępu V98011609.
20. Szczepionka indukująca odpowiedź immunologiczną przeciwko świńskiemu cirkowirusowi typu II, znamienna tym, że obejmuje świński cirkowirus typu II odpowiedzialny za PMWS.
21. Szczepionka według zastrz. 20, znamienna tym, że obejmuje atenuowany, żywy, pełny antygen w nośniku albo rozcieńczalniku dopuszczalnym w weterynarii i ewentualnie adiuwant dopuszczalny w weterynarii, jak również ewentualnie, stabilizator liofilizacji.
PL 198 506 B1
22. Szczepionka według zastrz. 20, znamienna tym, że antygen jest inaktywowany, zaś szczepionka zawiera dodatkowo, nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny w weterynarii i ewentualnie adiuwant dopuszczalny w weterynarii.
23. Szczepionka według zastrz. 20 albo 21 albo 22, znamienna tym, że obejmuje antygeny kilku świńskich cirkowirusów typu II określonych w zastrzeżeniach 17-19.
24. Szczepionka według zastrz. 20 albo 21 albo 22, znamienna tym, że obejmuje dodatkowo przynajmniej jedną inną wartościowość, która odpowiada innemu patogenowi świń.
25. Szczepionka według zastrz. 24, znamienna tym, że obejmuje przynajmniej jedną wartościowość wybraną z grupy obejmującej zespół rozrodczo-oddechowy świń PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, wirus atroficznego zapalenia nosa, wirus pseudowscieklizny, cholery świń i świńskiej grypy.
26. Szczepionka według zastrz. 24, znamienna tym, że obejmuje przynajmniej jedną inną wartościowość wybraną z grupy obejmującej zespół rozrodczo-oddechowy świń PRRS i Mycoplasma hyopneumoniae.
27. Przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne wytworzone przy pomocy cirkowirusa określonego w zastrz. 17-19.
28. Fragment kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję genomu świńskiego cirkowirusa typu II (PCV) odpowiedzialną za poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający (PWMS) u świń, przedstawioną na Id. Sekw. nr 6.
29. Fragment kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję genomu PCV typu II , który wykazuje co najmniej 70% homologii do sekwencji określonej w zastrz. 28.
30. Fragment kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję genomu PCV typu II , który jest zdolny do specyficznej hybrydyzacji z fragmentem kwasu nukleinowego określonym w zastrz. 28.
31. Fragment kwasu nukleinowego według zastrz. 30, znamienny tym, że jest zdolny do hybrydyzacji w ostrych warunkach.
32. Fragment kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję genomu świńskiego cirkowirusa typu II (PCV) odpowiedzialną za poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający (PWMS) u świń wybraną z Id. Sekw. nr 1, Id. Sekw. nr 2, Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 4.
33. Fragment kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję genomu PCV typu II, który jest zdolny do specyficznej hybrydyzacji z fragmentem kwasu nukleinowego określonym w zastrz. 32.
34. Fragment kwasu nukleinowego według zastrz. 33, znamienny tym, że jest zdolny do hybrydyzacji w ostrych warunkach.
35. Fragment kwasu nukleinowego obejmujący całą lub część sekwencji określonej w dowolnym z zastrz. od 28 do 34, kodującą epitop zdolny do indukowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko PCV typu II u świń.
36. Fragment kwasu nukleinowego według zastrz. 35, znamienny tym, że epitop obejmuje minimum 13 do 25 aminokwasów.
37. Fragment kwasu nukleinowego obejmujący całą lub część sekwencji określonej w dowolnym z zastrz. od 28 do 34, kodującą polipeptyd obejmujący sekwencję odpowiadającą co najmniej jednej otwartej ramce odczytu (ORF).
38. Fragment kwasu nukleinowego według zastrz. 37, znamienny tym, że ORF jest wybrany z ORF od 1 do 13, korzystnie ORF 4, 7, 10 i 13.
39. Polipeptyd kodowany przez fragment kwasu nukleinowego określony w dowolnym z zastrz. 28-38.
40. Wektor ekspresyjny obejmujący fragment kwasu nukleinowego określonego w dowolnym z zastrz. od 28 do 38 i wyrażający polipeptyd in vitro.
41. Wektor ekspresyjny według zastrz. 40, znamienny tym, że jest bakulowirusem.
42. Wektor ekspresyjny według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że wyraża polipeptyd w E.coli, komórkach owadzich lub eukariotycznych, korzystnie wybranych z komórek drożdży lub komórek ssaczych.
43. Polipeptyd wytworzony przez wektor ekspresyjny określony w dowolnym z zastrz. 40-42.
44. Przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne wytworzone przy pomocy, polipeptydów określonych w zastrz. 39 albo 43 albo ich fragmentów.
45. Szczepionka podjednostkowa obejmująca co najmniej jeden polipeptyd określony w zastrz. 39 albo 43, w rozcieńczalniku albo nośniku dopuszczalnym w weterynarii i ewentualnie adiuwant dopuszczalny w weterynarii.
PL 198 506 B1
46. Szczepionka według zastrz. 45, znamienna tym, że obejmuje antygeny kilku świńskich cirkowirusów typu II określonych w zastrzeżeniach 17-19.
47. Wektor ekspresyjny obejmujący w swoim genomie fragment kwasu nukleinowego określonego w dowolnym z zastrz. 28-38 i wyrażający polipeptyd in vivo.
48. Wektor ekspresyjny według zastrz. 47, znamienny tym, że jest wybrany z wirusów naturalnie niepatogennych lub żywych atenuowanych wirusów i plazmidów.
49. Wektor ekspresyjny według zastrz. 48, znamienny tym, że jest zdolny do namnażania się u świń.
50. Wektor ekspresyjny według dowolnego z zastrz. 47-49, znamienny tym, że jest wirusem wybranym spośród świńskich herpeswirusów, takich jak wirusy choroby Aujeszky'ego, świńskie adenowirusy, wirusy ospy, zwłaszcza wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirus ospy kanarków, oraz wirus świńskiej ospy.
51. Szczepionka żywa rekombinowana lub plazmidowa, znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden wektor ekspresyjny określony w dowolnym z zastrz. 47-50.
52. Szczepionka według zastrz. 51, znamienna tym, że obejmuje antygeny kilku świńskich cirkowirusów typu II określonych w zastrzeżeniach 17-19.
53. Szczepionka według zastrz. 51, znamienna tym, że dalej obejmuje weterynaryjnie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik.
54. Sposób diagnozowania infekcji spowodowanej przez PCV typu II odpowiedzialny za PMWS, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie próbki płynu fizjologicznego lub próbki tkanki ze świni z odczynnikiem diagnostycznym specyficznym dla PCV typu II, przy czym jeżeli wykrywa się antygen, przeciwciało lub kwas nukleinowy specyficzny dla PCV typu II diagnozowana jest infekcja PCV typu II.
55. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że odczynnik diagnostyczny obejmuje sondę lub starter obejmujący sekwencję DNA specyficzną dla PCV typu II.
56. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że odczynnik diagnostyczny obejmuje sekwencję określoną w Id. Sekw. nr 6.
57. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że odczynnik diagnostyczny obejmuje sondę lub starter specyficzne dla PCV typu II, przy czym sonda lub starter obejmuje co najmniej jeden fragment sekwencji Id. Sekw. nr 6.
58. Sposób według dowolnego z zastrz. 54-57, znamienny tym, że jest oparty na technice hybrydyzacji lub PCR.
59. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że odczynnik diagnostyczny obejmuje antygen specyficzny dla PCV typu II.
60. Sposób według zastrz 59, znamienny tym, że odczynnik diagnostyczny obejmuje epitop lub polipeptyd specyficzny dla PCV typu II kodowany przez fragment sekwencji Id. Sekw. nr 6.
61. Sposób według zastrz. 59 albo 60, znamienny tym, że antygen, epitop lub polipeptyd wykrywa w próbce przeciwciała, które są specyficzne dla PCV typu II.
62. Sposób według zastrz 54, znamienny tym, że odczynnik diagnostyczny obejmuje przeciwciało specyficzne dla PCV typu II.
63. Sposób według zastrz 54, znamienny tym, że stosuje się reagent obejmujący antygen specyficzny dla PCV typu II i reagent obejmujący przeciwciało specyficzne dla PCV typu II.
64. Sposób według zastrz 59 albo 63, znamienny tym, że stosuje się metodę Western Blot, immunofluorescencji, ELISA lub rodzaj immunochromatografii.
65. Sposób według zastrz 64, znamienny tym, że stosuje się metody pośrednie, kompetycyjne lub przez wypieranie.
66. Preparat przeciwciał specyficznych dla PCV typu II odpowiedzialnego za PMWS, który może być wytworzony z PCV typu II lub jego antygenowego fragmentu lub z polipeptydu kodowanego przez fragment sekwencji Id. Sekw. nr 6.
67. Preparat według zastrz. 66, znamienny tym, że PVC2 typu II jest wybrany ze zdeponowanych w ECACC jako V97100217, V97100218 i V97100219.
68. Preparat według zastrz. 66 albo 67, znamienny tym, że przeciwciała są przeciwciałami poliklonalnymi lub przeciwciałami monoklonalnymi.
69. Preparat według zastrz. 66-68, znamienny tym, że przeciwciała obejmują przeciwciała znakowane.
70. Preparat według zastrz 69, znamienny tym, że przeciwciała są znakowane peroksydazą lub znacznikiem w postaci cząstek, takim jak złoto koloidalne.
PL 198 506 B1
71. Preparat antygenowy obejmujący antygen specyficzny dla PCV typu II odpowiedzialnego za PMWS, znamienny tym, że antygen jest rozpoznawany przez przeciwciała specyficzne dla PCV typu II i umożliwia diagnozę infekcji PCV typu II.
72. Zestaw do diagnozy infekcji PCV typu II odpowiedzialnym za PMWS, znamienny tym, że obejmuje co najmniej jedno przeciwciało i/lub antygen określony w dowolnym z zastrz. 58-63.
73. Zestaw według zastrz. 72, znamienny tym, że obejmuje środki do diagnozy metodą Western Blot, immunofluorescencji, ELISA lub immunochromatografią.
74. Zestaw według zastrz 73, znamienny tym, że obejmuje środki do diagnozy testami typu pośrednie, kompetycyjne lub przez wypieranie.
75. Sposób diagnozowania infekcji przez świński cirkowirus, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie próbki fizjologicznego płynu lub próbki tkanki od świni z odczynnikiem diagnostycznym specyficznym dla obu PCV typu II i PCV typu I (świński cirkowirus PK/15), przy czym jeżeli wykrywa się antygen, przeciwciało lub kwas nukleinowy specyficzny dla PCV, diagnozowana jest infekcja PCV.
76. Sposób według zastrz. 75, znamienny tym, że odczynnik diagnostyczny obejmuje sondę lub starter obejmujący przeciwciało, antygen lub sekwencję DNA.
PL339631A 1997-10-03 1998-10-01 Preparat wyizolowanego świńskiego cirkowirusa typu II, sposób wytwarzania świńskiego cirkowirusa typu II, ekstrakt albo nadsącz komórkowy, preparat antygenowy, szczepionka, przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne, wyizolowany świński cirkowirus typu II, fragment kwasu nukleinowego, polipeptyd, wektor, szczepionka, sposób diagnozowania infekcji, preparat przeciwciał, preparat antygenowy, zestaw do diagnozy PL198506B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9712382A FR2769321B1 (fr) 1997-10-03 1997-10-03 Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostics
FR9800873A FR2769322B1 (fr) 1997-10-03 1998-01-22 Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostic
FR9803707A FR2776294B1 (fr) 1998-03-20 1998-03-20 Nouveaux circovirus porcins ; vaccins et reactifs de diagnostic
PCT/FR1998/002107 WO1999018214A1 (fr) 1997-10-03 1998-10-01 Circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostic

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL339631A1 PL339631A1 (en) 2001-01-02
PL198506B1 true PL198506B1 (pl) 2008-06-30

Family

ID=27253376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL339631A PL198506B1 (pl) 1997-10-03 1998-10-01 Preparat wyizolowanego świńskiego cirkowirusa typu II, sposób wytwarzania świńskiego cirkowirusa typu II, ekstrakt albo nadsącz komórkowy, preparat antygenowy, szczepionka, przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne, wyizolowany świński cirkowirus typu II, fragment kwasu nukleinowego, polipeptyd, wektor, szczepionka, sposób diagnozowania infekcji, preparat przeciwciał, preparat antygenowy, zestaw do diagnozy

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6368601B1 (pl)
EP (4) EP1281760B9 (pl)
JP (5) JP5008218B2 (pl)
KR (4) KR100944144B1 (pl)
CN (2) CN100584948C (pl)
AT (3) ATE387914T1 (pl)
AU (1) AU756554C (pl)
BR (1) BR9812845B1 (pl)
CA (1) CA2305623C (pl)
CY (3) CY1110359T1 (pl)
DE (7) DE122005000009I1 (pl)
DK (4) DK1281760T5 (pl)
ES (4) ES2524359T3 (pl)
FR (1) FR05C0021I2 (pl)
HK (1) HK1095161A1 (pl)
HU (2) HU226247B1 (pl)
NL (1) NL300326I2 (pl)
PL (1) PL198506B1 (pl)
PT (4) PT1386617E (pl)
UA (1) UA78180C2 (pl)
WO (1) WO1999018214A1 (pl)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US20060029617A1 (en) * 1997-10-03 2006-02-09 Charreyre Catherine E Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US7192594B2 (en) * 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
ES2289796T3 (es) * 1997-12-11 2008-02-01 University Of Saskatchewan Virus del sindrome del desmedro post-destete procedente de cerdos.
EP1816200B1 (en) 1997-12-11 2016-03-09 Merial Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs
US6943152B1 (en) * 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
WO2001096377A2 (en) * 2000-06-15 2001-12-20 Purdue Research Foundation Vaccine for congenital tremors in pigs
US7018638B2 (en) * 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
CN1840656B (zh) * 2001-03-27 2010-06-02 萨斯喀彻温大学 培养环状病毒的方法
CA2454397A1 (en) 2001-07-20 2003-06-05 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Attenuated rabies virus with nucleoprotein mutation at the phosphorylation site for vaccination against rabies and gene therapy in the cns
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7276353B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
CA2496750C (en) * 2002-08-26 2014-10-21 Pfizer Products Inc. Vaccine for respiratory and reproductive system infections in cattle
KR20040021988A (ko) * 2002-09-06 2004-03-11 서상희 바이러스 증식용 돼지 신장 상피 세포주, 및 이의 용도
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
CA2604691C (en) * 2005-04-13 2013-12-31 Merial Limited Method for porcine circovirus production and assays for monitoring production
EP1792996A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
MY180002A (en) 2005-12-29 2020-11-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing compositions
PL2371383T3 (pl) * 2005-12-29 2016-01-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Zastosowanie kompozycji immunogennej do zmniejszania objawów klinicznych u świń
KR100870077B1 (ko) * 2006-10-27 2008-11-25 권영득 이유후 전신소모성증후군(ｐｍｗｓ)의 치료용 복합제조성물
EP2101815A4 (en) 2006-12-11 2010-10-06 Boehringer Ingelheim Vetmed EFFICIENT PROCESS FOR THE TREATMENT OF PORCINE CIRCOVIRUS AND LAWSONIA INTRACELLULARIS INFECTIONS
MX2009006066A (es) 2006-12-15 2009-06-17 Boehringer Ingelheim Vetmed Tratamiento de cerdos con el antigeno pcv.
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) * 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
CA2687146C (en) * 2007-05-11 2015-07-21 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Production of a homogeneous cell line highly permissive to porcine circovirus type 2 (pcv2) infection
KR100948127B1 (ko) * 2007-06-27 2010-03-18 주식회사 중앙백신연구소 복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물
US20090017064A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US7829274B2 (en) * 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
CA2710247C (en) * 2007-12-21 2014-02-18 Wyeth Llc Methods and compositions for immunizing pigs against porcine circovirus
CA2710558A1 (en) * 2007-12-31 2009-07-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 virus like particle with foreign amino acid insertion
BRPI0907438A2 (pt) 2008-01-23 2015-08-04 Boehringer Ingelheim Vetmed Composições imunogênicas para mycoplasma hyopneumoniae e pcv2 e métodos para produzir tais composições
TWI627281B (zh) * 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
TWI442935B (zh) 2010-12-22 2014-07-01 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２）、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
EP2564869A1 (en) 2011-09-02 2013-03-06 Ceva Sante Animale Synthetic capsid proteins and uses thereof
EP2789346A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 CEVA Santé Animale SA Fusion polypeptides and vaccines
ES2882374T3 (es) 2013-05-08 2021-12-01 Pharmgate Biologics Inc Vacuna para PCV2 y micoplasma
KR102319843B1 (ko) 2013-09-25 2021-10-29 조에티스 서비시즈 엘엘씨 Pcv2b 분지형 백신 조성물 및 사용 방법
DK3052516T3 (da) 2013-10-02 2020-03-23 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc PCV2-ORF2-proteinvariant og viruslignende partikler sammensat deraf
CN104383527A (zh) * 2014-11-18 2015-03-04 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪圆环病毒2型灭活冻干疫苗的制备方法
EP3034609A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ceva Sante Animale Recombinant swinepox virus and vaccines
US9944904B2 (en) 2015-05-14 2018-04-17 Merial Inc. Method for porcine circovirus production and PCV2 vaccines
EP3254692A1 (en) 2016-06-10 2017-12-13 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant spv
WO2019110822A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Ceva Sante Animale Recombinant swinepox virus and vaccines
KR20200135505A (ko) 2018-03-26 2020-12-02 베링거 인겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인크. 면역원성 조성물의 제조방법
MX2020013484A (es) 2018-06-11 2021-05-27 Ceva Sante Animale Vacunacion contra circovirus porcinos.
KR102124260B1 (ko) * 2018-10-19 2020-06-26 대한민국(관리부서 질병관리본부장) 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 콜레라균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주
KR20230044474A (ko) 2020-07-24 2023-04-04 베링거 인겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인크. 조합 돼지 백신

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4740468A (en) 1985-02-14 1988-04-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Concentrating immunochemical test device and method
US5232835A (en) 1986-11-07 1993-08-03 Syntex (U.S.A.) Inc. Qualitative immunochromatographic method and device
US5030558A (en) 1986-11-07 1991-07-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Qualitative immunochromatographic method and device
CA1303983C (en) 1987-03-27 1992-06-23 Robert W. Rosenstein Solid phase assay
DE560410T1 (de) 1987-04-27 2001-12-20 Unilever Nv Testgerät zur Durchführung von spezifischen Bindungsprüfungen.
US4855240A (en) 1987-05-13 1989-08-08 Becton Dickinson And Company Solid phase assay employing capillary flow
US5120643A (en) 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
ES2067474T3 (es) * 1987-09-28 1995-04-01 Beecham Inc Virus tgev del cerdo como vacuna para perros.
ATE277193T1 (de) 1989-03-21 2004-10-15 Vical Inc Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
US5141850A (en) 1990-02-07 1992-08-25 Hygeia Sciences, Inc. Porous strip form assay device method
DE69128361T3 (de) 1990-05-29 2006-04-13 Wyeth Holdings Corp. Impfstoff gegen die pneumonie bei schweinen und verfahren zu seiner herstellung
US5238652A (en) 1990-06-20 1993-08-24 Drug Screening Systems, Inc. Analytical test devices for competition assay for drugs of non-protein antigens using immunochromatographic techniques
US5565205A (en) 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
US5266497A (en) 1990-08-31 1993-11-30 Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. Immunochromatographic assay with improved colored latex
US5451504A (en) 1991-07-29 1995-09-19 Serex, Inc. Method and device for detecting the presence of analyte in a sample
ES2083764T5 (es) 1991-10-14 2009-04-01 Intervet International Bv Vacuna para el sindrome respiratorio reproductivo porcino (srrp) y diagnostico.
US5338543A (en) * 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
DE9204303U1 (pl) 1992-03-30 1992-06-25 Marx, Guenter Wolfgang, 7953 Bad Schussenried, De
EP0571648A1 (en) 1992-05-26 1993-12-01 Chung-Nan Weng Vaccine protecting against mycoplasmal pneumonia
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
FR2700957B1 (fr) 1993-01-29 1995-03-03 Seppic Sa Composition de vaccin sous-unitaire recombinant vivant et procédé de préparation.
WO1994018311A1 (en) 1993-02-08 1994-08-18 Bayer Corporation Process for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its use in vaccines
FR2702373B1 (fr) 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.
IL108915A0 (en) 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
ES2348013T3 (es) 1994-01-27 2010-11-26 University Of Massachusetts Medical Center Inmunización por inoculación de una unidad de transcripción de adn.
ATE206455T1 (de) * 1994-04-11 2001-10-15 Akzo Nobel Nv Europäische vakzinstämme des fortplanzungs- atmungs-syndromsvirus des schweins
WO1996004091A1 (en) * 1994-08-05 1996-02-15 Schneider Karl P Self-chamfering drill bit
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
ES2289796T3 (es) * 1997-12-11 2008-02-01 University Of Saskatchewan Virus del sindrome del desmedro post-destete procedente de cerdos.
KR100298125B1 (ko) * 1999-04-15 2001-09-13 정명식 구리의 화학 증착에 유용한 유기 구리 전구체

Also Published As

Publication number Publication date
CA2305623A1 (fr) 1999-04-15
JP5869658B2 (ja) 2016-02-24
ATE299531T1 (de) 2005-07-15
JP2011135875A (ja) 2011-07-14
EP1281760B1 (fr) 2005-07-13
HU0800330D0 (en) 2008-07-28
DE69816460D1 (de) 2003-08-21
CN1278301A (zh) 2000-12-27
KR100854615B1 (ko) 2008-08-27
DE69839227D1 (de) 2008-04-17
DK1741785T3 (da) 2014-11-10
JP2008086317A (ja) 2008-04-17
PT1281760E (pt) 2005-11-30
DE69830858T4 (de) 2006-12-21
UA78180C2 (uk) 2007-03-15
ATE245191T1 (de) 2003-08-15
CY1115749T1 (el) 2017-01-25
NL300326I2 (nl) 2008-04-01
DE69830858D1 (de) 2005-08-18
WO1999018214A1 (fr) 1999-04-15
KR100944144B1 (ko) 2010-02-24
PT1741785E (pt) 2014-11-13
HUP0003756A2 (hu) 2001-02-28
CY1110359T1 (el) 2015-04-29
EP1281760B9 (fr) 2005-12-28
FR05C0021I2 (pl) 2005-10-21
JP2015109840A (ja) 2015-06-18
ES2203984T3 (es) 2004-04-16
HU226247B1 (en) 2008-07-28
HUP0003756A3 (en) 2003-03-28
ES2246001T3 (es) 2006-02-01
CN100584948C (zh) 2010-01-27
AU756554B2 (en) 2003-01-16
DE69816460T2 (de) 2004-05-27
DE69839227T2 (de) 2009-03-12
JP4680245B2 (ja) 2011-05-11
JP5008218B2 (ja) 2012-08-22
DK1281760T5 (da) 2006-04-18
HK1095161A1 (en) 2007-04-27
CN101724606B (zh) 2016-02-24
ES2524359T3 (es) 2014-12-05
EP1281760A1 (fr) 2003-02-05
EP1741785A1 (fr) 2007-01-10
JP5362750B2 (ja) 2013-12-11
US6368601B1 (en) 2002-04-09
NL300326I1 (nl) 2008-03-03
DK1281760T3 (da) 2005-10-31
DK1019510T3 (da) 2003-11-10
DE122005000009I1 (de) 2005-08-04
CY1108113T1 (el) 2014-02-12
ATE387914T1 (de) 2008-03-15
KR20060079256A (ko) 2006-07-05
FR05C0021I1 (pl) 2005-05-27
KR20090051274A (ko) 2009-05-21
JP2012193179A (ja) 2012-10-11
BR9812845A (pt) 2000-08-08
EP1019510B1 (fr) 2003-07-16
EP1386617A1 (fr) 2004-02-04
CA2305623C (en) 2008-04-01
KR100736129B1 (ko) 2007-07-06
DE05014998T1 (de) 2008-11-20
EP1741785B1 (fr) 2014-10-01
HU230340B1 (hu) 2016-02-29
AU9355598A (en) 1999-04-27
PL339631A1 (en) 2001-01-02
AU756554C (en) 2003-09-18
JP2001519159A (ja) 2001-10-23
KR20080023271A (ko) 2008-03-12
KR20010030930A (ko) 2001-04-16
DE69830858T2 (de) 2006-04-20
BR9812845B1 (pt) 2010-03-09
DE122008000069I1 (de) 2009-11-05
ES2302885T3 (es) 2008-08-01
KR100904852B1 (ko) 2009-06-25
PT1019510E (pt) 2003-11-28
EP1386617B1 (fr) 2008-03-05
CN101724606A (zh) 2010-06-09
EP1019510A1 (fr) 2000-07-19
DK1386617T3 (da) 2008-07-07
PT1386617E (pt) 2008-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL198506B1 (pl) Preparat wyizolowanego świńskiego cirkowirusa typu II, sposób wytwarzania świńskiego cirkowirusa typu II, ekstrakt albo nadsącz komórkowy, preparat antygenowy, szczepionka, przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne, wyizolowany świński cirkowirus typu II, fragment kwasu nukleinowego, polipeptyd, wektor, szczepionka, sposób diagnozowania infekcji, preparat przeciwciał, preparat antygenowy, zestaw do diagnozy
US6391314B1 (en) Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
AU746234B2 (en) Porcine circovirus and parvovirus vaccine
RU2283862C2 (ru) Цирковирус свиней типа ii и его применение
AU2002302120B2 (en) Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents
MXPA00003263A (en) Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents