MXPA00003263A - Circovirus porcinos, vacunas y reactivos de diagnostico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a cepas de circovirus porcinos aisladas de especímenes pulmonares y ganglionares derivados de ganado que sufren del síndrome de decaimiento multisistémico post-destete (PMWS). Esta se refiere a las preparaciones purificadas de dichas cepas, las vacunas estándares atenuadas o inactivadas, las vacunas vivas recombinantes, las vacunas plasmídicas y las vacunas subunitarias, asícomo los reactivos y métodos de diagnóstico. La invención también se refiere a los fragmentos de ADNútiles para producir subunidades en un vector de expresión in vitro o como secuencias que van a ser integradas en un vector de expresión in vivo del tipo virus o plásmido.

Description

CIRCOVIRUS PORCINOS, VACUNAS Y REACTIVOS DE DIAGNÓSTICO Descripción de la Invención 5 La presente invención está relacionada con las nuevas cepas de circovirus porcino (PCV para CircoVirus Porcino) responsables del síndrome PMWS (Síndrome de Desperdicio Multisistémico Porcino o Síndrome de Desperdicio Multisistémico Post-Destete incluso denominado síndrome de decaimiento generalizado post-destete), con reactivos y métodos que permiten su detección, con métodos de vacunación y con vacunas, asi como los métodos de producción de estos reactivos y vacunas. El PCV ha sido en el origen, detectado como contaminante no citopatógeno en las lineas celulares de riñones de cerdo PK/15. Este virus ha sido clasificado entre los Circoviridae con el virus de la anemia de pollo (CAV para Virus de la Anemia de Pollo) y el virus PBFDV (Virus de la Enfermedad de Pico y Pluma de Pscittacine) . Se trata de virus pequeños (de 15 a 24 nm) no envueltos, cuya característica común es la de contener un genoma bajo la forma de un ADN simple de hebra circular de REF.: 119206 1.76 a 2.31 kb . Se ha pensado primeramente que este genoma codifica para un polipéptido de aproximadamente 30 kDa (Todd y colaboradores, Arch Virol 1991, 117: 129-135). Estos trabajos recientes han mostrado no obstante una transcripción más compleja (Meehan B. M. y colaboradores, 1997, 78: 221-227) . Por otra parte, no se han conocido homologías significativas de la secuencia nucleotidica ni de los determinantes antigénicos comunes entre los tres tipos de circovirus conocidos . El PCV proveniente de las células PK/15 es considerado como que no es patógeno. Se conoce la secuencia según B. M. Meehan y colaboradores, J Gen Virol 1997 (78) 221-227. ' No es más que recientemente que los autores han pensado que las cepas ?e PCV podrían ser patógenas y asociadas al síndrome PMWS (Gupi P. S. Nayar y colaboradores Can Vet J, vol. 38, 1997: 385-387 y Clark E. G., Proc Am Assoc Swine Prac 1997: 499-501). Nayar y colaboradores han detectado el ADN de PCV en cerdos que presentan el síndrome PMWS mediante técnica de PCR. Ninguna cepa silvestre de PCV ha sido no obstante asilada y purificada a la fecha.

El síndrome PMWS detectado en Canadá, en los Estados Unidos y en Francia se caracteriza en el plano clínico por una pérdida progresiva de peso y por manifestaciones tales como taquipnea, dispnea e hictericia. En el plano patológico, éste se traduce en infiltraciones linfocitarias o granulomatosas, linfadenopatias y, más raramente, por hepatitis y nefritis linfocitarias o granulomatosas (Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 499-501; La Semaine Vétérinaire no. 26, supplément a la Semaine Vétérinaire 1996 (834); La Semaine Vétérinaire 1997 (857) : 54: Gupi P. S. Nayar y colaboradores, Can Vet J, vol, 38, 1997: 385-387). La solicitante ha conseguido aislar cinco cepas novedosas de PCV a partir de muestras pulmonares o ganglionares que provienen de ganaderías situadas en Canadá, los Estados Unidos (California) y en Francia (Bretaña) , posteriormente denominadas circovirus de acuerdo a la invención. Estos virus han sido puestos en evidencia en las lesiones de cerdos aquejados del síndrome PMWS, pero no en cerdos sanos. La solicitante ha secuenciado además el genoma de cuatro de estas cepas, a saber las cepas provenientes de Canadá y los Estados Unidos asi como dos cepas de Francia. Las cepas presentan entre ellas una muy fuerte homología a nivel nucleotidico que sobrepasa 96% y mucho más débil con la cepa PK/15, de aproximadamente 76%. Las novedosas cepas pueden ser pues consideradas como representativas de un nuevo tipo de circovirus porcino, denominado aquí tipo II, siendo el tipo I representado por la PK/15. La presente invención tiene pues por objetivo el circovirus porcino del grupo II, tal como se define anteriormente, aislado o bajo la forma de preparación purificada. La invención se refiere a todo circovirus porcino susceptible de ser aislado de una muestra fisiológica o de una toma tisular, principalmente de lesiones, de un cerdo enfermo que presenta el síndrome PMWS, principalmente siguiendo el método descrito en los ejemplos, en particular el circovirus del tipo II. La presente invención tiene además particularmente por objetivo las preparaciones purificadas de cinco cepas, que han sido depositadas en la ECACC (Colección Europea de Cultivos de Células, Centro para la Microbiología e Investigación Aplicada, Portón Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Remo Unido) el jueves 2 de octubre de 1997 : n° de acceso V97100219 (denominado aqui Imp. 1008PCV) n° de acceso V97100218 (denominado aquí Imp. 1010PCV) n de acceso V97100217 (denominado aquí Imp 999PCV) . y, el viernes 16 de enero de 1998: - n° de acceso V98 011608 (denominado aquí Imp. 1011-48285) n° de acceso V98 011609 (denominado aquí Imp . 1011-48121) La invención pretende considerar los circovirus porcinos aislados de un cerdo enfermo y/o los circovirus que tienen un parentesco serológico significativo con las cepas de la invención y/o los circovirus que tienen una hibridación acrecentada con las cepas de la invención en las condiciones de exigencia tales que no existe hibridación con la cepa PCV PK/15. Las cepas virales aisladas de una muestra fisiológica o de una muestra tisular, principalmente de una lesión, de un cerdo que presenta el síndrome PMWS pueden ser venta osamente propagadas sobre líneas celulares principalmente tales como las líneas celulares de riñon de cerdo, en particular las células PK/15 indemnes de contaminación (en particular para PCV, así como para pestivirus, adenovirus porcino y parvovirus porcino) con miras a su multiplicación o específicamente para la producción de antigeno, completo (por ejemplo virus) y/o subunidades (por ejemplo polipéptidos). De manera muy notable e inesperada, estos aislados se revelan muy productivos en cultivos sobre células PK/15, lo que presenta ventajas innegables para la producción de virus o de antígeno, en particular para la producción de vacuna inactiva . La presente invención tiene también por objetivo las preparaciones de circovirus aisladas después de pases sobre células, principalmente lineas celulares, por ejemplo células PK/15, cultivadas in vitro siendo infectadas por al menos uno de los circovirus de acuerdo a la invención o de cualquier circovirus porcino susceptible de ser aislado de una muestra fisiológica o de una muestra tisular, principalmente de lesiones de un cerdo que presenta el síndrome PMWS. Ésta tiene también por objetivo los sobrenadantes o extractos de cultivo, eventualmente purificados por las técnicas estándares, y de manera general cualquier preparación antigénica obtenida a partir de cultivos in vitro. La invención tiene también por objetivo los principios activos inmunógenos y las vacunas que contienen al menos un antigeno tal como se define anteriormente . Se puede tratar de principios activos inmunógenos a base de virus completos vivos atenuados, o vacunas preparadas con estos principios activos, la atenuación es efectuada de acuerdo a los métodos usuales, por ejemplo mediante pase sobre células, de preferencia por pase sobre células de cerdo, principalmente líneas, tales como las células PK/15 (por ejemplo de 50 a 150, principalmente del orden de 100 pases) . Estas vacunas comprenden en general un vehículo o diluyente aceptable en el plano veterinario, eventualmente un adyuvante aceptable en el plano veterinario así como eventualmente un estabilizador de liofilización. Estas preparaciones antigénicas y vacunas comprenderán de preferencia de 10"3 a 10 TCID50. Se puede tratar también de principios activos inmunógenos o de vacunas a base de antígeno de circovirus de acuerdo a la invención, en el estado inactivado. Las vacunas comprenden además un vehículo o diluyente aceptable en el plano veterinario, eventualmente además con un adyuvante aceptable en el plano veterinario. Los circovirus de acuerdo a la invención, con las fracciones que pueden estar presentes, son inactivadas de acuerdo a las técnicas conocidas por el experto en la materia. La inactivación será efectuada de preferencia por la via química, por ejemplo por exposición del antígeno a un agente químico tal como formaldehido (formol) paraformaldehído, ß-propiolactona o etilenimina o sus derivados. El método de inactivación preferido será aquí la exposición a un agente químico y en particular a la etilenimina o a la ß-propiolactona. De preferencia, las vacunas inactivadas de acuerdo a la invención serán adyuvadas, ventajosamente estando presentes bajo la forma de emulsiones, por ejemplo agua en aceite o aceite en agua, de acuerdo a las técnicas bien conocidas por el experto en la materia. El carácter adyuvante podrá también provenir de la incorporación al principio activo, de un compuesto adyuvante usual.

Entre los adyuvantes que pueden ser utilizados, se puede citar a manera de ejemplo el hidróxido de alúmina, las saponinas (por ejemplo la saponina Quillaja o Quil A; ver Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, editada por Michael F. Powel y Mark J. New an, Plennum Press, New-York y Londres, p 210), Avridine® (Vaccine Design p. 148), el DDA (bromuro de dimetildioctacecilamonio, Vaccine Design p. 157), el polifosfazeno (Vaccine Design p. 204), o incluso las emulsiones aceite en agua a base de aceite mineral, de escualeno (por ejemplo emulsión SPT, Vaccine Design p. 147), de escualeno (por ejemplo MF59, Vaccine Design p. 183), o agua en aceite a base de aceite metabolizable (de preferencia de acuerdo a WO-A-94 20071) así como las emulsiones descritas en la patente Norteamericana US-A-5 422 109. Se pueden también elegir las asociaciones de adyuvantes, por ejemplo Avridine® o DDA asociado a una emulsión. Estas vacunas comprenderán de preferencia de 106 a 108 TCID50. Los adyuvantes de vacuna vivos podrán ser elegidos entre aquellos dados para la vacuna inactivada. Se preferirán las emulsiones. Para ?ß aquellas indicadas para la vacuna inactivada, se pueden agregar aquellas descritas en WO-A-9416681. Como estabilizador de la liofilización, se puede citar a manera de ejemplo el SPGA (Bovarnik y colaboradores, J. Bacteriology 59, 509, 950), los hidratos de carbono tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, las proteínas tales como la albúmina o la caseína, los derivados de estos compuestos, o los amortiguadores tales como los fosfatos de metales alcalinos. La solicitante ha obtenido además el genoma de cuatro de los aislados, identificados como SEQ ID NO: 1 a 4 y eventualmente 6. La presente invención tiene pues por objetivo un fragmento de ADN que contiene toda o parte de una de estas secuencias. Es un hecho que la invención cubre automáticamente las secuencias equivalentes, es decir las secuencias que no cambian la funcionalidad ni la especificidad de la cepa de la secuencia descrita ni de los polipéptidos codificados por esta secuencia. Por supuesto, serán incluidas las secuencias que difieren por degeneración del código. La invención cubre igualmente las secuencias equivalentes en este sentido que son capaces de .*saate«fc*f*)«s»- hibridarse a la secuencia supra en las condiciones de exigencia elevadas y/o tienen una fuerte homología con las cepas de la invención y pertenecen al grupo II definido anteriormente. Estas secuencias y sus fragmentos podrán ser ventajosamente utilizadas para la expresión in vitro o in vivo de polipéptidos con la ayuda de vectores apropiados . En particular, los marcos abiertos de lectura, que forman los fragmentos de ADN de acuerdo a la invención, utilizables para este efecto han sido identificados sobre la secuencia genómica de los circovirus del tipo II. La invención se refiere a cualquier polipéptido que contiene al menos uno de estos marcos abiertos de lectura (secuencia de aminoácidos correspondientes). De preferencia, la invención se refiere a una proteína formada esencialmente por los COL4, COL7, COL10, o C0L13. Para la expresión de subunidades in vitro, como medio de expresión se habrá recurrido de preferencia a E. coli o al baculovirus (patente Norteamericana US-A-4 745 051) . Se integra la o las secuencias codificantes y sus fragmentos en el genoma del baculovirus (por ejemplo, el baculovirus de Autographa californica Virus de la Polihedrosis Nuclear (Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV) ) y este último es enseguida propagado sobre células de insectos, por ejemplo Spodoptera frugiperda Sf9 (depósito ATCC CRL 1711). Se pueden incluso 5 producir subunidades en las células eucariotas tales como las levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) o células de mamíferos (por ejemplo CHO, BHK) . La invención tiene también por objetivo los polipéptidos que serán producidos in vitro por estos medios de expresión, luego eventualmente purificados de acuerdo a las técnicas clásicas. Ésta tiene también por objetivo las vacunas de subunidad que comprenden al menos un polipéptido tal como el que es así obtenido, o el fragmento, en un vehículo o diluyente aceptable en el plano veterinario, y eventualmente un adyuvante aceptable en el plano veterinario . Para la expresión in vivo con miras a la realización de vacunas vivas recombinantes, se insertan la o las secuencias codificantes o sus fragmentos en un vector de expresión apropiado en las condiciones que permiten la expresión del o de los polipéptidos. Como vectores apropiados, se pueden utilizar los virus vivos, de preferencia capaces de multiplicarse en el cerdo, no patógenos para el cerdo (naturalmente no patógeno o hecho así), de acuerdo a las técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Se podrán utilizar principalmente los herpesvirus de cerdo tales como el virus de la enfermedad de Aujeszky, el adenovirus porcino, el poxvirus, principalmente virus de la vaccinia, de la viruela aviar, de la viruela del canario, de la viruela del cerdo. Se pueden también utilizar como vectores los ADN plasmídicos (WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797, WO-A-95 20660) . La invención tiene pues también por objetivo los vectores y las vacunas vivas recombinantes o plasmídicas (vacunas polinucleotídicas o ADN) realizadas así, las vacunas que comprenden además un vehículo o diluyente aceptable en el campo veterinario . Las vacunas de acuerdo a la invención (vivas atenuadas, inactivadas, subunidades, vivas recombinantes, plasmídicas) podrán comprender uno o los principios activos (antígenos) de uno o varios (2 ó 3) de los circovirus de acuerdo a la invención. La invención prevé también asociar, para cada uno de los tipos de vacuna descritos anteriormente, la vacunación contra el circovirus «&£*£ porcino para una vacunación contra otros patógenos de cerdo, en particular aquellos que pueden estar asociados al síndrome PMWS. Las vacunas de acuerdo a la invención, principalmente inactivadas, podrán pues comprender otra valencia correspondiente a otro patógeno de cerdo. Entre estos otros patógenos de cerdo, se pueden citar de preferencia los PRRS Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino) (el experto en la materia podrá referirse a WO-A-93/07898, WO-A-94/ 18311 , FR-A-2 709 966; C. Chareyre y colaboradores, Proceedings of the 15th IPVS Congress Birmingham, Inglaterra 5-9 Julio 1998, p. 139; incorporados por referencia) y/o Mycoplasma hyopneumoniae (el experto en la materia podrá referirse a EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A-571 648, O. Martinon y colaboradores, p. 157, p. 284 y G. Reynaud y colaboradores p. 150 du Proceedings of the 15th IPVS Congress descrito anteriormente; incorporados por referencia) . Entre las otras valencias interesantes, se pueden citar incluso el Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli y la rinitis atrófica del cerdo, o incluso la enfermedad de Aujeszky, la peste porcina clásica (cólera del cerdo), gripe porcina.

La invención tiene también por objetivo un método que permite inducir una respuesta inmune en el cerdo frente a los circovirus de acuerdo a la invención. Ésta tiene en particular por objetivo un método de vacunación eficaz en el cerdo. Este método prevé la administración en el cerdo, una o varias veces, de una vacuna como se mencionó anteriormente. Es también posible combinar varios tipos de vacunas como se describieron anteriormente en un mismo protocolo de vacunación. Este método prevé no solamente la administración en cerdos adultos, sino también en los jóvenes o en las hembras en gestación. La vacunación de estas últimas permite conferir una 15 inmunidad pasiva a los neonatos (anticuerpos maternos) . La presente invención ofrece también la posibilidad de diagnosticar la presencia de circovirus de acuerdo a la invención en el cerdo. 20 Ésta tiene pues por objetivo las pruebas de diagnóstico y los métodos relacionados que ponen en operación los reactivos que van a ser descritos más adelante en la presente. El conocimiento de las secuencias de 25 diferentes circovirus permite definir las secuencias ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^Q^^^^^^^^^^Í comunes que permiten producir los reactivos adaptados para reconocer el conjunto de los circovirus porcinos conocidos. El experto en la materia podrá también 5 elegir los fragmentos de las secuencias correspondientes a las regiones que presentan poca o ninguna homología con la secuencia correspondiente del circovirus PK/15 con el fin de poder efectuar un diagnóstico específico. 10 Los alineamientos de las secuencias permiten al experto en la materia elegir un reactivo de acuerdo a sus deseos. Un primer reactivo consiste en las secuencias de ADN divulgadas aqui y sus fragmentos, que serán principalmente utilizados como sondas o cebadores en las técnicas de hibridación o de PCR ("Reacción en Cadena de Polimerasa") bien conocidas. Un segundo reactivo consiste en los polipéptidos codificados por estas secuencias a 20 partir de virus o expresados con la ayuda de un vector (ver anteriormente) , o sintetizados por la vía química de acuerdo a las técnicas clásicas de síntesis peptídica. Un tercero y cuarto reactivos consisten en 25 los anticuerpos respectivamente policlonales y ,.- „. i£?lú¿SS0tlií ~%S£c¿?^?ae? 11 monoclonales que podrán ser producidos de acuerdo a las técnicas usuales a partir de virus, de polipéptidos o de fragmentos, extractos o codificados por las secuencias de ADN. Estos segundo, tercero y cuartos reactivos podrán ser utilizados en un método de diagnóstico, el objetivo de la invención, en el cual se busca, en una muestra de fluido fisiológico (sangre, plasma, suero, etc.) o muestra de tejido (ganglios, hígado, pulmones, riñones, etc.) que proviene de un cerdo a probar, la presencia de un antígeno específico de un circovirus de acuerdo a la invención, buscando detectar ya sea el antígeno mismo, o bien los anticuerpos dirigidos contra este antígeno. Los antígenos y los anticuerpos de acuerdo a la invención podrán ser utilizados en todas las técnicas de diagnóstico de laboratorio conocidas. No obstante, se preferirá recurrir a las técnicas que puedan ser puestas en operación directamente en el terreno por el veterinario, el cuidador o el propietario del animal. El experto en la materia dispone del conjunto de las técnicas de laboratorio y de campo y está pues perfectamente en condiciones de adaptarlos a la utilización de este antigeno y/o de los anticuerpos como reactivo (s) de diagnóstico . Las técnicas de diagnóstico que serán preferentemente utilizadas en el marco de la presente invención son la transferencia de Western (Western Blot) , la inmunofluorescencia, el ELISA y la inmunocromatografía . En lo que respecta a la puesta en operación de los métodos mediante inmunocromatografía, el especialista podrá recurrir principalmente a Robert F. Zurk y colaboradores, Clin. Chem. 31/7, 1144-1150 (1985) así como a las patentes o solicitudes de patente WO-A-88/08 534, WO-A-91/ 12528 , EP-A-291 176, EP-A-299 428, EP-A-291 194, EP-A-284 232, US-A-5 120 643, US-A-5 030 558, US-A-5 266 497, US-A-4 740 468, US-A-5 266 497, US-A-5 855 240, US-A-5 451 504, US-A-5 141 850, US-A-5 232 835 y US-A-5 238 652. Así pues, se busca de preferencia detectar los anticuerpos específicos en la muestra mediante prueba indirecta, por competencia o por desplazamiento. Para hacer esto, se utiliza el antígeno mismo como reactivo de diagnóstico, o un fragmento de este antígeno que conserva el reconocimiento de los anticuerpos. La marcación puede ser ventajosamente una marcación con ?9 peroxidasa o una marcación particular, de preferencia con oro coloidal. Se puede también buscar detectar el antigeno mismo en la muestra con la ayuda de un anticuerpo marcado específico de este antígeno. La marcación es ventajosamente como se describe anteriormente. Por anticuerpo específico del antígeno utilizable principalmente en competencia o en desplazamiento o para la detección del antígeno mismo, se entienden los anticuerpos monoclonales y policlonales específicos del antígeno, los fragmentos de estos anticuerpos, de preferencia los fragmentos Fab o F(ab) '2. Otro aspecto de la invención es la producción de anticuerpos, policlonales o monoclonales, específicos del antigeno de acuerdo a la invención, pudiendo ser enseguida estos anticuerpos utilizados principalmente como reactivos de diagnóstico para la detección del antígeno en una muestra de fluido fisiológico o en una muestra de tejido, o incluso para la detección de anticuerpos presentes en tal muestra. La invención incluye también los fragmentos inmunológicamente funcionales de estos anticuerpos, en particular los fragmentos F(ab) y F(ab) '2.

Los anticuerpos podrán ser preparados mediante las técnicas usuales. Se puede hacer referencia principalmente a Antibodies, A Laboratory Manual 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, USA o a 5 J.W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, Inc., cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia. Se podrá proceder principalmente, como es ya conocido per se, a la fusión de células esplénicas de ratones inmunizados con el antígeno o con al menos uno de sus fragmentos, con las células mielomatosas adecuadas. La invención tiene igualmente por objetivo una preparación, de preferencia pura o parcialmente purificada, o incluso bruta de los anticuerpos monoclonales o policlonales, específicos del antígeno, principalmente anticuerpos de ratón o de conejo . La presente invención permite igualmente determinar los epítopes de interés, principalmente con base en las secuencias de ADN descritas aquí ya sea que sean los epitopes de interés para vacuna o los epitopes de interés en diagnóstico. A partir de la secuencia de ADN del genoma del circovirus de acuerdo a la invención, el experto en la materia es &S^^^s>.^^^^^^SÁ^A,.is'^? ^f& sL^¿¡^S^^^&S capaz de determinar los epitopes según los métodos conocidos, por ejemplo el programa informático apropiado o PEPSCAN. Los epítopes son regiones inmunodominantes de las proteínas y son de este 5 modo, las regiones expuestas en la superficie de las proteínas. Éstos pueden ser pues reconocidos por los anticuerpos y también ser particularmente empleados en el dominio del diagnóstico, o bien para la preparación de anticuerpos para fines de 10 diagnóstico o bien para la realización de péptidos correspondientes utilizables a manera de reactivos de diagnóstico. A lo mínimo, un epítope es un péptido que tiene de 8 a 9 aminoácidos. Se preferirá en general 15 un mínimo de 13 a 25 aminoácidos. El experto en la materia está pues en condiciones, utilizando una o varias de estas técnicas, así como las otras técnicas disponibles, de encontrar los epítopes para la puesta en 20 operación de los péptidos o los anticuerpos para fines de diagnóstico. La invención tiene igualmente por objetivo un equipo de diagnóstico que incluye este antigeno y/o los anticuerpos policlonales o monoclonales específicos de este antígeno. Se trata en particular de equipos de diagnóstico correspondientes a las técnicas de diagnóstico descritas anteriormente. La invención va a ser ahora descrita más en 5 detalle con la ayuda de los ejemplos de realización no limitantes, tomados con referencia al dibujo, en el cual: Figura 1: secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1011-48121 10 Figura 2: secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1011-48285 Figura 3: secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 999 Figura 4: secuencia de ADN del genoma de la 15 cepa Imp 1010 Figura 5: alineamiento de 4 secuencias de acuerdo a las figuras 1 a 4 con la secuencia de la cepa PCV PK/15 Figura 6: secuencia de ADN del genoma de la 20 cepa Imp 999 tal como se define en el primer depósito en Francia el 3 de Octubre de 1997 Figura 7: Alineamientos de la secuencia de la figura 6 con la secuencia de cepa PK/15 -i^^S^^S^S^t^^^^^^ii- Listado de secuencias SEQ ID SEQ ID NO: 1 secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1011-48121 SEQ ID NO: 2 secuencia de ADN del genoma de la cepa I p 1011-48285 SEQ ID NO: 3 secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 999 SEQ ID NO: 4 secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 1010 SEQ ID NO: 5 secuencia de ADN del genoma de la cepa PK/15 SEQ ID NO: 6 secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp 999 tal como se define en el primer depósito en Francia el 3 de Octubre de 1997.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Cultivo y aislamiento de las cepas de circovirus porcinos: Han sido recolectadas muestras de tejidos en Francia, Canadá y en los Estados Unidos a partir de pulmones y de ganglios linfáticos de lechones. Estos lechones presentaban signos clínicos típicos del síndrome de debilitamiento generalizado del jSj^^g ^g^gÉ ^ post-destete. Para facilitar el aislamiento de los virus, las muestras de tejido fueron congeladas a -70°C inmediatamente después de la autopsia. Para el aislamiento viral, las suspensiones que contiene aproximadamente 15% de la muestra de tejido fueron preparadas en un medio mínimo que contenía las sales de Earl (EMEM, BioWhittaker Reino Unido Ltd., Wokingham, Reino Unido), penicilina (100 Ul/ml) y estreptomicina (100 µg/ml) (medio MEM-SA) , mediante trituración de los tejidos con arena estéril por medio de un mortero y de un pistilo estériles. Esta preparación triturada fue luego recogida en MEM-SA, después centrifugada a 3000 g durante 30 minutos a +4°C para recolectar el sobrenadante. Previamente a la siembra de los cultivos de las células, se agregó un volumen de 100 µl de cloroformo a 2 ml de cada sobrenadante y se mezcló en forma continua durante 10 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla fue luego transferida en un tubo de microcentrí fuga, se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos, luego el sobrenadante se recolectó. Este sobrenadante fue enseguida utilizado como inoculo para los experimentos de aislamiento viral.

Todos los estudios de aislamiento viral han sido realizados en cultivos de células PK/15, conocidas por estar no contaminadas por el circovirus porcino (PCV), los pestivirus, los adenovirus porcinos y el parvovirus porcino (Alian G. y colaboradores, Patogénesis de infecciones experimentales por circovirus porcino de lechones privados de calostro y examen del material fetal de cerdo. Vet Micriobiol, 1995. 44. 49-64). El aislamiento de los circovirus porcinos ha sido realizado de acuerdo a la técnica siguiente: Monocapas de células PK/15 fueron disociadas mediante tripsinación (con una mezcla de tripsina-verseno) a partir de cultivos confluentes, y recogidas en medio MEM-SA que contenía 15% de suero fetal de ternera no contaminada con pestivirus (= medio MEM-G) bajo una concentración final de aproximadamente 400,000 células por ml . Las fracciones alícuotas de 10 ml de esta suspensión celular han sido luego mezcladas con fracciones alícuotas de 2 ml de los inóculos descritos anteriormente, y las mezclas finales fueron tomadas como alícuotas en volúmenes de 6 ml en dos matraces Falcon de 25 cm2. Estos cultivos fueron luego *<$ééá8 & ¿ iH incubados a +37°C durante 18 horas en atmósfera que contenía 10% de C02. Después de la incubación, el medio de cultivo de las monocapas semiconfluentes fue tratado con 300 mM de D-glucosamina (Cat # G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, Reino Unido) (Tischr I. y colaboradores, Arch. Virol 1987 96 39-57), luego la incubación fue proseguida durante un periodo suplementario de 48-72 horas a +37°C. Subsecuente a esta última incubación, uno de los dos matraces de cada inoculo sufrió 3 ciclos sucesivos de congelamiento/descongelamiento. Las células PK/15 del matraz restantes fueron tratadas con una solución de tripsina-verseno, resuspendidas en 20 ml de medio MEM-G, luego sembradas en matraces de 75 cm2 a una concentración de 400,000 células/ml. Los matraces recién sembrados fueron luego "sobreinfectados" mediante la adición de 5 ml del lisado correspondiente, obtenido después de los ciclos de congelamiento/descongelamiento.

Ejemplo 2: Preparación de muestras de cultivo celular para la detección de los circovirus porcinos mediante inmunofluorescencia o por hibridación in situ .

Un volumen de 5 ml de la suspensión "sobreinfectada" fue tomado y sembrado en una caja de Petri de 55 mm de diámetro que contenía una laminilla de vidrio estéril y desengrasada. Los cultivos en matraces y sobre laminillas de vidrio fueron incubados a +37°C y tratados con glucosamina como se describe en el ejemplo 1. Los cultivos sobre laminillas de vidrio fueron recolectados de 24 a 48 horas después del tratamiento con la glucosamina y fijados, ya sea con acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente, o bien con 10% de formaldehído amortiguado durante 4 horas. Después de esta fijación, todas las laminillas de vidrio fueron almacenadas a -70°C, sobre gel de sílice, antes de su utilización para los estudios de hibridación in situ y los estudios de marcación inmunocitoquímica 2» Ejemplo 3: Técnicas de detección de las secuencias PCV mediante hibridación in sít La hibridación in si tu fue realizada sobre 5 tejidos tomados de los cerdos enfermos y fijadas a formaldehído e igualmente sobre las preparaciones de cultivo de células inoculadas para el aislamiento viral (ver ejemplo 2) y fijadas sobre laminillas de vidrio . 0 Las sondas genómicas completas correspondientes al circovirus porcino PK/15 (PCV) y al virus de la anemia infecciosa de pollo (virus de la anemia de pollo = CAV) fueron utilizados. El plásmido pPCVl, que contiene la forma replicativa 5 del genoma PCV clonado bajo la forma de un inserto único de 1.7 kilopares de bases (kpb) (Meehan B. y colaboradores Secuencia de ADN de circovirus porcino: afinidades con circovirus vegetales J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227) fue utilizado como fuente 0 de ADN viral específico para PCV. Un plásmido análogo, pCAAl, que contiene la forma replicativa de 2.3 kpb del circovirus aviar CAV, fue utilizado como control negativo. Las reservas de gliceroles respectivos de estos dos plásmidos fueron utilizadas para la producción y la purificación de los &&*,r^¿í' ^fe^- plásmidos de acuerdo a la técnica de lisis alcalina (Sambrook J. y colaboradores Molecular cloning: A Laboratory Manual 2a Edición. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. New York. 1989) con el fin de que sirvan enseguida de matrices para la preparación de las sondas. Las sondas de circovirus representativas de los genomas completos de PCV y de CAV fueron producidas a partir de plásmidos purificados descritos anteriormente (1 µg para cada sonda) y de cebadores hexanucleotídicos aleatorios utilizando un equipo comercial de marcación no radiactiva ("equipo de marcación de ADN DIG", Boehringer Mannheim, Lewes, Reino Unido) de acuerdo a las recomendaciones del proveedor. Las sondas marcadas con digoxigenina fueron tomadas bajo un volumen de 50-100 µl de agua estéril antes de su utilización para la hibridación i n si t u . Las muestras de tejidos de cerdos enfermos, incluidas en parafina y fijadas con formaldehído, así como las preparaciones de cultivos de células infectadas, fijadas con formaldehído, se prepararon para la detección de ácidos nucleicos PCV de acuerdo a la técnica siguiente: Secciones de 5 µm de espesor fueron recortadas a partir de los bloques de tejidos 39 incluidos en la parafina, desparafinizadas, luego rehidratadas en soluciones sucesivas de alcohol a concentración decreciente. Las secciones de tejidos y los cultivos de células fijadas con formaldehído fueron incubados respectivamente durante 15 minutos y 5 minutos a +37°C en una solución de proteinasa K a 0.5% en amortiguador Tris-HCl 0.05 M, EDTA 5 mM (pH 7.6) . Las laminillas son luego colocadas en una solución de glicina al 1% en agua destilada esterilizada en autoclave, durante 30 segundos, lavadas dos veces con un amortiguador PBS (solución salina amortiguadora de fosfato) 0.01 M (pH 7.2), y finalmente lavadas durante 5 minutos en agua destilada estéril. Éstas son finalmente secadas al aire libre y colocadas en contacto con las sondas. Cada preparación de tejido/sonda es recubierta con una laminilla adecuada y desengrasada, luego colocada en un horno a +90°C durante 10 minutos, colocada en seguida en contacto con un bloque hielo durante 1 minuto, y finalmente incubada durante 19 horas +37°C, Las preparaciones son enseguida sumergidas previamente en un amortiguador de sal de sodio-citrato (SSC) 2X (pH 7.0) para eliminar las laminillas protectoras, después lavadas 2 veces durante 5 minutos en sf^i ^esSr '-,5 -» 'Í~A ¡faaar J9 amortiguador SSC 2 X y finalmente lavadas dos veces durante 5 minutos en amortiguador PBS. Después de estos lavados, las preparaciones son sumergidas en una solución de ácido maleico 0.1 M, NaCl 0.15 M (pH 7.5) (amortiguador maleico) durante 10 minutos, luego incubadas en una solución al 1% del reactivo bloqueador (Cat # 1096176, Boehringer Mannheim, Reino Unido, Lewis, East Sussex, Reino Unido) en amortiguador maleico durante 20 minutos a +37°C. Las preparaciones han sido luego incubadas con una solución a 1/250 de un anticuerpo monoclonal anti-digoxigenina (Boehringer Mannheim) , diluido en amortiguador bloqueador durante 1 hora a +37°C, lavadas en PBS y finalmente incubadas con un anticuerpo biotinilado anti-inmunoglobulina de ratón, durante 30 minutos a +37°C. Las preparaciones son luego lavadas en PBS y la actividad de peroxidasa endógena es bloqueada mediante un tratamiento con una solución de peróxido de hidrógeno al 0.5% en PBS durante 20 minutos, a temperatura ambiente. Las preparaciones son lavadas una vez más en PBS y tratadas con un substrato de 3-amino-9-dietilcarbazol (AEC) (Cambridge Bioscience, ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ v.

Cambridge, Reino Unido) , preparado extemporáneamente . Después de un último lavado con agua de la llave, las preparaciones son contracoloreadas con hematoxilina, "azuladas" bajo agua de la llave, y montadas bajo laminillas o portaobjetos microscópicos con un líquido de montaje (GVA Mount, Bioscience, Cambridge, Reino Unido). Los controles del experimento han incluido la utilización de una sonda negativa no pertinente (CAV) y de una sonda positiva (PCV) sobre muestras provenientes de cerdos enfermos y de cerdos no enfermos.

Ejemplo 4: Técnica de detección de PCV mediante inmunofluorescencia El cribado inicial de todas las preparaciones de cultivo celular fijadas con acetona ha sido realizado mediante una técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) utilizando una dilución a 1/100 de un combinado de sueros de cerdos adultos. Este combinado de sueros comprende los sueros de 25 cerdos adultos de Irlanda del Norte y se sabe que contienen anticuerpos contra una gran variedad de virus porcinos, comprendido el PCV: parvovirus porcino, adenovirus porcino, y el virus PRRS . La técnica IFI ha sido realizada mediante un contacto del suero (diluido en PBS) con los cultivos celulares durante una hora a +37°C, seguido de dos lavados en PBS. Los cultivos de las células son luego coloreados con una dilución a 1/80 en PBS de un anticuerpo de conejo anti-inmunoglobulina de cerdo conjugado al isotiocianato de fluoresceína durante una hora, luego lavados en PBS y montados en amortiguador de glicerol previamente a la observación microscópica bajo luz ultravioleta.

Ejemplo 5: Resultados de la hibridación in si tu sobre los tejidos de cerdos enfermos La hibridación i n si t u , utilizando una sonda genómica PCV, realizada sobre tejidos tomados de lechones franceses, canadienses y californianos que presentan lesiones de debilitamiento generalizado y fijadas con formaldehído, ha revelado la presencia de ácidos nucleicos PCV asociados a las lesiones, en varias de las lesiones estudiadas. No ha sido observada ninguna señal cuando la sonda genómica de PCV ha sido utilizada sobre los tejidos tomados de los cerdos no enfermos o cuando la sonda CAV ha sido utilizada sobre los tejidos de cerdos enfermos. La presencia del ácido nucleico PCV ha sido identificada en el citoplasma y el núcleo de numerosas células mononucleares que infiltran las lesiones en los pulmones de los lechones californianos . La presencia del ácido nucleico PVC ha sido igualmente puesta en evidencia en los neumocitos, las células epiteliales de los bronquios y los bronquiolos, y en las células endoteliales de las pequeñas arteriolas, vénulas y vasos linfáticos. En los cerdos enfermos franceses, la presencia de ácido nucleico PCV ha sido detectada en el citoplasma de numerosos linfocitos foliculares y en las células mononucleares intrasinusoidales de los ganglios linfáticos. El ácido nucleico PCV ha sido igualmente detectado en sincitios ocasionales. En fnnción de estos resultados de detección, las muestras de pulmones de cerdos californianos, de ganglios linfáticos mesentéricos de cerdos franceses, y de órganos de cerdos canadienses, han sido elegidas para fines de aislamiento de las novedosas cepas de circovirus porcino.

Ejemplo 6: Resultados del cultivo celular de nuevas cepas de circovirus porcino y detección mediante inmunofluorescencia Ningún efecto citopático (ECP) ha sido observado en los cultivos de células inoculadas con las muestras tomadas de lechones franceses (cepa Imp. 1008), californianos (cepa Imp . 999) y canadienses (cepa Imp. 1010) que muestran signos clínicos del síndrome de debilitamiento generalizado. No obstante, la inmunomarcación de las preparaciones que provienen de los cultivos de células inoculadas, después de la fijación con acetona o con un combinado de sueros policlonales de cerdos, ha revelado una fluorescencia nuclear en numerosas células en los cultivos inoculados, a partir de los pulmones de lechones californianos (cepa I p. 999), a partir de ganglios linfáticos mediastinos de los lechones franceses (cepa Imp. 1008), y a partir de órganos de los lechones canadienses (cepa Imp. 1010).

Ejemplo 7: Extracción del ADN genómico de los circovirus porcinos Las formas replicativas de las nuevas cepas de circovirus porcino (PCV) han sido preparadas a partir de cultivos de células PK/15 infectadas (ver ejemplo 1) (10 frascos de 75 cm2) recolectados después de 72-76 horas de incubación y tratadas con glucosamina, como se describe para la clonación de la forma replicativa de CAV (Todd. D. y colaboradores. Ensayo de hibridación de transferencia por puntos para el agente de la anemia de pollos utilizando una sonda de ADN clonado. J. Clin. Micriobiol. 1991. 29. 933-939). El ADN de doble hebra de estas formas replicativas ha sido extraído de acuerdo a una modificación de la técnica de Hirt (Hirt B. Extracción selectiva del ADN del virus de polioma proveniente del cultivos de células infectadas. J. Mol. Biol. 1967. 36. 365-369), como se describe por Molitor (Molitor T.W. y colaboradores ADN de parvovirus porcino: caracterización de la forma genómica y replicativa del ADN de dos aislados virales. 1984. 137. 241-254) .

Ejemplo 8: Mapa de restricción de la forma replicativa del genoma de la cepa Imp. 999 de circovirus porcino.

El ADN (1.5 µg) extraído de acuerdo a la técnica de Hirt ha sido tratado con la nucleasa SI (Amersham) de acuerdo a las recomendaciones del proveedor, después este ADN ha sido digerido con diferentes enzimas de restricción (Boehringer .Mannheim, Lewis, East Sussex, Reino Unido) y los productos de la digestión se separaron mediante electroforesis sobre gel de agarosa al 1.5% en presencia de bromuro de etidio, como se describe por Todd y colaboradores (Purificación y caracterización bioquímica del agente de la anemia de pollo J. Gen. Virol. 1990. 71. 819-823). El ADN extraído de los cultivos de la cepa Imp. 999 posee un sitio único EcoRI, 2 sitios Sacl y no posee un sitio Pstl. Este perfil de restricción es pues diferente del perfil de restricción presentado por la cepa PCV PK/15 (Meehan B. y colaboradores, Secuencia de ADN de circovirus porcino: afinidades con circovirus vegetales 1997. 78. 221-227) que posee por el contrario un sitio PstI y no posee el sitio EcoRI .

. --.J¡?¿¡t?!lít!^^^git,*MJ,^¿^^tí^^^gS6^,~sí¡n.^ Adi áám*?&!e*.¿! 3« Ejemplo 9: Clonación del genoma de la cepa Imp. 999 del circovirus porcino El fragmento de restricción de aproximadamente 1.8 kpb generado por digestión de la forma replicativa de doble hebra de la cepa PCV Imp. 999 con la enzima de restricción EcoRI, ha sido aislado después de electroforesis sobre gel de agarosa al 1.5% (ver ejemplo 3) utilizando un equipo comercial Qiagen (Equipo de extracción de gel QIAEXII Cat. # 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, Reino Unido) . Este fragmento de restricción EcoRI-EcoRI fue enseguida ligado con el vector pGEM-7 (Promega, Medical Supply Company, Dublín, Irlanda) , previamente digerido con las mismas enzimas de restricción y desfosforilado siguiendo las técnicas estándares de clonación (Sambrook J. y colaboradores Molecular cloning: A Laboratory Manual 2a Edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New york 1989) . Los plásmidos obtenidos fueron transformados en una cepa huésped de Esch eri chi a col i JM109 (Stratagene, La Jolla, EUA) de acuerdo a las técnicas estándares. El fragmento de restricción EcoRI-EcoRI de la cepa PCV Imp . 999 fue igualmente clonado en el sitio EcoRI ^J?i?^^i i^S^.?&? del vector pBlueScript Jiflc + (Stratagene, Inc. La Jolla, EUA) . Entre los clones obtenidos para cada cepa huésped, al menos dos clones que contienen los fragmentos del tamaño esperado han sido seleccionados. Los clones obtenidos fueron luego cultivados y los plásmidos que contienen el genoma completo de la cepa Imp . 999 fueron purificados en un volumen pequeño (2 ml) o en un volumen grande (250 ml) de acuerdo a las técnicas estándares de preparación y de purificación de plásmidos.

Ejemplo 10: Secuenciamiento del ADN genómico (forma replicativa de doble hebra) de la cepa PCV Imp . 999.

La secuencia nucleotídica de 2 clones EcoRI Imp. 999 (clones pGEM-7/2 y pGEM-7/8) fue determinada de acuerdo a la técnica de los didesoxinucleótidos de Sanger utilizando el equipo de secuenciamiento "AmpliTaq ADN polymerase FS" (Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) y un aparato de secuenciamiento automático Applied BioSystems AB1373A de acuerdo a las recomendaciones del proveedor. Las reacciones de secuenciamiento iniciales fueron realizadas con los cebadores universales M13 "delantero" e "inverso".

Las reacciones de secuenciamiento siguientes fueron generadas de acuerdo a la técnica de "marcha sobre el ADN". Los oligonucleótidos necesarios para estos secuenciamientos ulteriores fueron sinterizados por Life Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, Reino Unido) . Las secuencias generadas fueron ensambladas y analizadas por medio del programa MaCDNASIS versión 3.2. (Cat # 22020101, Appligene, Durham, Reino Unido) . Los diferentes marcos abiertos de lectura fueron analizados por medio del algoritmo BLAST disponible en el servidor de "National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EUA) . La secuencia completa (fragmento EcoRI- EcoRI) obtenida inicialmente a partir del clon pGEM-7/8 (SEQ ID NO: 6) se presenta en la figura No. 6. Esta comienza arbitrariamente después de la G del sitio EcoRI y presenta algunas certidumbres sobre el plano de los nucleótidos. El secuenciamiento fue enseguida optimizado y la SEQ ID NO: 3 (Figura 3) da la secuencia total de esta cepa, que se ha comenzado arbitrariamente al comienzo del sitio EcoRI, o la G como primer nucleótido.

Se procedió de una manera similar para la obtención de la secuencia de los otros tres aislados de acuerdo a la invención (ver SEQ ID NO: 1, 2 y 4 y figuras 1, 2 y 4 ) . El tamaño del genoma de estas cuatro cepas es : Imp 1011-48121 1767 nucleótidos Imp 1011-48285 1767 nucleótidos Imp. 999 1768 nucleótidos I p 1010 1768 nucleótidos Ejemplo 11: análisis de la secuencia de la cepa PCV Imp. 999.

Cuando fue utilizada la secuencia generada a partir de la cepa Imp. 999 para una búsqueda de la homología frente a las secuencias contenidas en el banco de datos GenBank, la única homología significativa que ha sido detectada es una homología de aproximadamente 75% (al nivel del ácido nucleico) con la secuencia de la cepa PK/15 (Números de acceso Y09921 y U49186) (ver figura N°5) . Al nivel de los aminoácidos, la búsqueda de la homología de la traducción de las secuencias en las 6 fases con los bancos de datos (algoritmo BLAST X sobre el servidor NCBI) ha permitido poner en evidencia una homología de 94% con el marco abierto de lectura correspondiente a la replicasa teórica del virus BBTV similar a los circovirus de plantas (número de identificación GenBank 1841515) codificado por la secuencia GenBank U49186. Ninguna otra secuencia contenida en los bancos de datos muestra la homología significativa con la secuencia generada a partir de la cepa PCV Imp. 999. El análisis de las secuencias obtenidas a partir de la cepa Imp. 999 cultivada a partir de lesiones tomadas de lechones californianos, que presentan signos clínicos del síndrome de debilitamiento generalizado, muestra claramente que esta aislado viral es una nueva cepa de circovirus porcino .

Ejemplo 12: Análisis comparativo de las secuencias El alineamiento de las secuencias nucleotídicas de las 4 novedosas cepas PCV se realizó con la secuencia de la cepa PCV PK/15 (figura 5) . Una matriz de homología que toma en cuenta las cuatro novedosas cepas y la cepa anterior »? ;¡fc>« .áSsn?s sOí^^» PK/15 fue realizad Los resultados son los siguientes : Imp 1011-48121 Imp 1011-48285 Imp. 999 Imp 1010 PK/15 La homología entre las dos cepas francesas I p 1011-48121 e Imp 1011-48285 es superior a 99% (0.9977) . La homología entre las dos cepas norteamericanas Imp 999 e Imp 1010 es también superior a 99% (0.9949). La homología entre las cepas francesas y las cepas norteamericanas es un poco superior a 96%. La homología de todas estas cepas con PK/15 cae en un valor comprendido entre 75 y 76%. ii¿s=á¿-,- &- a-s- üi Se deduce que las cepas de acuerdo a la invención son representativas de un novedoso tipo de circovirus porcino, distinto del tipo representado por la cepa PK/15. Este novedoso tipo, aislado de cerdos que presentan el síndrome PMWS, es denominado circovirus porcino del tipo II, la PK/15 representa el tipo I. Las cepas que pertenecen a este tipo II presentan una notable homogeneidad de la secuencia nucleotídica, no obstante que éstas hayan sido aisladas en regiones geográficas muy distantes .

Ejemplo 13: Análisis de proteínas codificadas por el genoma de las novedosas cepas PCV.

La secuencia nucleotídica del aislado Imp. 1010 fue considerada como representativa de las otras cepas de circovirus asociadas al síndrome de debilitamiento generalizado. Esta secuencia fue analizada con más detalle con la ayuda del algoritmo BLASTX (Altschul y colaboradores J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410) y de una combinación de programas del conjunto de programas MacVector 6.0 (Oxford Molecular Group, Oxford 0X4 4GA. Reino Unido) . Ha sido posible detectar 13 marcos abiertos de lectura (o COLs) de un tamaño superior a 20 aminoácidos sobre esta secuencia (genoma circular) . Estos 13 COLs son los siguientes: Las posiciones del comienzo y del final de cada COL se refieren a la secuencia presentada en la figura N° 4 (SEQ ID N° 4), del genoma de la cepa 1010. Los límites de los COLs 1 a 13 son idénticos *,.^a para la cepa 999. Esto es también para las cepas 1011-48121 y 10.11-48285, salvo para los COLs 3 y 13: COL3 1432-1539, sentido, 108 nt, 35aa COL13 314-1377, antisentido, 705 nt, 234 -aa. Entre estos 13 COLs, 4 presentan una homología significativa con los COLs " análogos situados sobre el genoma del virus clonado PCV PK/15. Cada uno de los marcos abiertos de lectura presentes sobre el genoma de todos los aislados de circovirus asociados al síndrome de debilitamiento generalizado, han sido analizados. Estos 4 COLs son los siguientes: Las posiciones del comienzo y del final de cada COL se refieren a la secuencia presentada en la figura N° 4 (SEQ ID N° 4). El tamaño de COL (en nucleótidos = nt) incluye el codón de detención. La comparación entre la organización genómica de los aislados PCV Imp. 1010 y PCV PK-15 ha permitido la identificación de 4 COLs conservados en el genoma de dos virus. La tabla siguiente presenta los grados de homología observados: La identidad más grande de secuencia ha sido observada entre el COL4 Imp . 1010 y COL1 PK-15 (86% de homología) . Esto sería esperado en la medida donde esta proteína está probablemente implicada en la replicación del ADN viral y es esencial para la replicación viral (Meehan y colaboradores J. Gen. Virol 1997. 78. 221-227: Mankertz y colaboradores J.Gen Virol. 1998. 79. 381-384). La identidad de la secuencia entre el COL13 Imp. 1010 y el COL2 PK-15 es menos fuerte (66.4% de homología) , pero cada uno de estos dos COLs presenta muy bien una región básica N-terminal bien conservada, que es idéntica a la región N-terminal de la proteína estructural mayor de circovirus aviar CAV (Meehan y colaboradores Arch. Virol. 1992. 124. 301-319) . Son observadas diferencias más grandes entre COL7 I p . 1010 y C0L3 PK-15 y entre COL10 Imp . 1010 y COL4 PK-15. En cada caso, existe una supresión de la región C-terminal de los COL7 y COL10 del aislado Imp. 1010 cuando se les compara a los COL3 y COL4 de PCV PK-15. La homología más alta de secuencia es observada al nivel de las regiones N-terminales de COL7/COL3 (61.5% de homología al nivel del recubrimiento) y de COL10/COL4 (83% de homología al nivel de recubrimiento) . Parece que la organización genómica del circovirus porcino es muy compleja debido a la extrema compactación de su genoma. La proteína estructural mayor es probablemente proveniente de un empalme entre varios marcos de lectura situados sobre la misma hebra del genoma del circovirus porcino. Se puede pues considerar que todo marco abierto de lectura (COL1 a COL13) tal como se describe en la tabla anterior, puede representar toda o parte de una proteína antigénica codificada por el circovirus porcino de tipo II y es pues potencialmente un antígeno utilizable para el diagnóstico específico y/o para la vacunación. La invención se refiere pues a toda proteína que comprende al menos uno de estos COLs. De preferencia, la invención se refiere a una proteína formada esencialmente por los C0L4, C0L7, COL10 o C0L13.

Ejemplo 14: Carácter infeccioso del genoma PCV clonado a partir de nuevas cepas El plásmido pGEM-7/8 que contiene el genoma completo (forma replicativa) del aislado Imp . 999 ha sido transfectado en las células PK/15 de acuerdo a la técnica descrita por Meehan B. y colaboradores (Caracterización de los ADNs virales provenientes de células infectadas con el agente de la anemia de pollo: análisis de la secuencia de la forma replicativa clonada y capacidades de transfección de los fragmentos del genoma clonado. Arch. Virol. 1992. 124. 301-319). El análisis mediante inmunofluorescencia (ver ejemplo 4) realizado sobre el primer pase después de la transfección sobre células PK/15 no contaminadas, ha mostrado que el plásmido del clon pGEM7/8 sería capaz de inducir la producción de virus PCV infecciosos. La disponibilidad de un clon que contiene un material genético con PCV infeccioso permite cualquier manipulación útil sobre el genoma viral con el fin I3Í *?S,¿ de producir los virus PCV modificados (ya sea atenuados en el cerdo, o bien defectuosos) utilizables para la producción de vacunas atenuadas o recombinadas, o para Ta producción de antígenos para equipos de diagnóstico.

Ejemplo 15: Producción de antigenos PCV por cultivo in vi tro El cultivo de las células PK/15 no contaminadas y la multiplicación viral se realizan según las mismas modalidades del ejemplo 1. Las células infectadas son recolectadas después de la tripsinización después de 4 días de incubación a 37°C y numeradas. El pase siguiente es inoculado con 400,000 células infectadas por ml .

Ejemplo 16: Inactivación de los antígenos virales Al final del cultivo viral, las células infectadas son recolectadas y lisadas por ultrasonido (Branson Sonifier) o con la ayuda de un triturador coloidal del tipo rotor-estator (UltraTurrax, Reino Unido) . La suspensión es en seguida centrifugada a 3700 g durante 30 minutos. * z.<¡?JSZa¡?S&i!ÍB*- La suspensión viral es inactivada con 0.1% de etilenimina durante 18 horas a +37°C o con 0.5% de beta-propiolactona durante 24 horas a +28°C. Si el título del virus antes de la inactivación es 5 insuficiente, la suspensión viral es concentrada mediante ultrafiltración utilizando una membrana con un umbral de corte de 300 kDa (Millipore PTMX300) . La suspensión viral inactivada es conservada a +5°C.

Ejemplo 17: Preparación de la vacuna bajo la forma de emulsión a base de aceite mineral.

La vacuna se prepara de acuerdo a la fórmula siguiente : 15 - suspensión de circovirus porcino inactivado: 250 ml - Montanide® ISA 70 (SEPPIC) : 750 ml La fase acuosa y la fase aceitosa son esterilizadas separadamente mediante filtración. La emulsión se prepara mediante la mezcla y homogenización de los ingredientes con la ayuda de un emulsificador de turbina Silverson. Una dosis de vacuna contiene aproximadamente 107'5DICT50. El volumen de una dosis de vacuna es de ^^^^^^^^^^^^^^& ¡^^^^jé^^^^i¡^^^^ 0.5 ml para la administración por vía intradérmica, y de 2 ml para administración por vía intramuscular.

Ejemplo 18: Preparación de vacuna bajo la forma de emulsión a base de aceite metabolizable .

La vacuna se prepara de acuerdo a la fórmula siguiente : - suspensión de circovirus porcino inactivado: 200 ml - Dehymuls HRE 7 (Henkel) : 60 ml - Radia 7204 (Oleofina) : 740 ml La fase acuosa y la fase aceitosa se esterilizan separadamente mediante filtración. La emulsión se prepara mediante mezcla y homogeneización de los ingredientes con la ayuda de un emulsificador de turbina Silverson. Una dosis de vacuna que contiene aproximadamente 10/-bDICT50. El volumen de una dosis de vacuna es de 2 ml para la administración por vía intramuscular .

Ejemplo 19: Resultados de la inmunofluorescencia indirecta frente a la cepa de virus PCV norteamericana y francesa y del contaminante PK/15 con un suero hipepnmune (PCV-T) , un panel de anticuerpos monoclonales F99, preparados a partir de PK/15 y un suero hiperinmune preparado a partir de la cepa canadiense (PCV-C) * inverso de la última dilución del suero o del anticuerpo monoclonal que da una reacción positiva en inmunofluoresencia indirecta.

^-JiáSbáSíll S jaß?lAi fe Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención

Claims (29)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. La preparación purificada del circovirus porcino del tipo II.

2. La preparación purificada del circovirus porcino, caracterizado porque es elegido del grupo que consiste de las preparaciones depositadas ante la ECACC, bajo las referencias siguientes : - N° de acceso V97100219 - N° de acceso V97100218 - N° de acceso V97100217 - N° de acceso V98011608 - N° de acceso V98011609.

3. La preparación del circovirus porcino producido sobre, y aislado de células en cultivo qelular in vitro, caracterizado porque estas células han sido infectadas por un circovirus porcino susceptible de ser aislado de una muestra fisiológica o de una muestra tisular, principalmente de lesiones, de un cerdo que presenta el síndrome PMWS.

4. La preparación del circovirus porcino de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque es producido sobre, y aislado de una línea celular de riñon de cerdo.

5. La preparación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque es producida sobre, y aislada de células PK/15 libres de contaminación por PCV.

6. El extracto o sobrenadante de cultivo, caracterizado porque es recogido de un cultivo celular in vitro de células que han sido infectadas con la ayuda de un circovirus de conformidad con la reivindicación 1.

7. La preparación antigénica, caracterizada porque es recogida de un cultivo celular in vitro de células que han sido infectadas con la ayuda de un circovirus de conformidad con la reivindicación 1. 5

8. Una vacuna, caracterizada porque comprende una preparación antigénica de conformidad con la reivindicación 7, o un sobrenadante o extracto de cultivos de conformidad con la reivindicación 6, que comprende circovirus porcino como antígeno.

9. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la vacuna comprende el antígeno completo vivo atenuado, en un vehículo o diluyente aceptable en el campo veterinario, y eventualmente un adyuvante aceptable en el campo veterinario, así como eventualmente un estabilizador de la liojfilización.

10. La vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el antígeno es inactivado y la vacuna comprende además un vehículo o diluyente aceptable en el campo veterinario y eventualmente un adyuvante aceptable en el campo veterinario.

11. El fragmento de ADN, caracterizado porque contiene una secuencia elegida del grupo que consiste de las secuencias referidas SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6.

12. El fragmento de ADN, caracterizado porque contiene un COL elegido del grupo que consiste de COLs 1 a 13.

13. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque éste contiene un COL elegido del grupo que consiste de los COLs 4, 7, 10 y 13.

14. El polipéptido codificado por un fragmento de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

15. El vector de expresión in vitro, caracterizado porque comprende, integrado en su genoma, una secuencia o fragmento de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, de manera para poder ser expresado in vitro . «r

16. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque es elegido entre E. coli y berculovirus. 5

17. Los polipéptidos, ca-racterizados porque son producidos por un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, eventualmente purificados. 10

18. La vacuna de subunidad, caracterizada porque comprende al menos un polipéptido de conformidad con la reivindicación 14 ó 17, en un diluyente o vehículo aceptable en el campo veterinario, y eventualmente un adyuvante aceptable 15 en el campo veterinario.

19. El vector de expresión in vivo, caracterizado porque comprende, integrado en su genoma, un fragmento de ADN de conformidad con 20 cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, de manera para poder expresarse in vivo.

20. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque es 25 elegido entre los virus vivos capaces de -asgass^^ifet^g^ ^ ¿, *s?e?*tá **!tei?, yl multiplicarse en el cerdo sin ser patógenos para este animal, y los plásmidos.

21. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el vector viral es elegido entre los herpesvirus de cerdo, tales como el virus de la enfermedad de Aujeszky, el adenovirus porcino, el poxvirus o virus de la viruela, principalmente el virus de la vaccinia, la viruela aviar, la viruela del canario, y la viruela del cerdo.

22. La vacuna viva o plasmídica, caracterizada porque comprende un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en un vehículo o diluyente aceptable en el campo veterinario.

23. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, 18 y 22, caracterizada porque comprende los antígenos de varios circovirus tales como se definen en las reivindicaciones 1 a 4.

24. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, 18, 22, 23, caracterizada porque comprende además al menos otra valencia correspondiente a otro patógeno de cerdo.

25. La vacuna de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende al menos otra valencia elegida del grupo que consiste de PRRS, Micoplasma hyopneu oniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E.coli, rinitis atrófica, enfermedad de Aujeszky, peste porcina clásica, gripe porcina .

26. La vacuna de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende al menos otra valencia elegida del grupo que consiste de PURS y micoplasma hyopneumoniae.

27. La sonda o cebador, caracterizada porque comprende toda o parte de la secuencia de conformidad con una de las reivindicaciones 11 a 13.

28. Los anticuerpos policlonales o monoclonales preparados a partir de circovirus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, los polipéptidos de conformidad con la reivindicación 14 ó 17 o sus fragmentos. ?

29. El método de detección de circovirus porcino, en el cual, en una. muestra de fluido fisiológico, o una muestra de tejido de un cerdo a probar, se busca la presencia de un antígeno buscando detectar ya sea el antigeno mismo o bien los anticuerpos dirigidos contra este antígeno. X.*sr3&M CIRCOVIRUS PORCINOS, VACUNAS Y REACTIV DIAGNÓSTICO RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a cepas de circovirus porcinos aisladas de especímenes 5 pulmonares y ganglionares derivados de ganado que sufren del síndrome de decaimiento multisistémico post-destete (PMWS). Esta se refiere a las preparaciones purificadas de dichas cepas, las vacunas estándares atenuadas o inactivadas, las 10 vacunas vivas recombinantes, las vacunas plasmídicas y las vacunas subunitarias , así como los reactivos y métodos de diagnóstico. La invención también se refiere a los fragmentos de ADN útiles para producir subunidades en un vector de expresión in vitro o 15 como secuencias que van a ser integradas en un vector de expresión in vivo del tipo virus o plásmido .