ES2338616T3 - Vacuna elaborada a partir de circovirus y parvovirus porcino. - Google Patents

Abstract

Preparación antigénica dirigida contra el síndrome multisistémico de emaciación porcino, que comprende antígeno de circovirus porcino y antígeno de parvovirus porcino; en el que comprende antígeno de circovirus porcino de tipo II.

Description

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Vacuna elaborada a partir de circovirus y parvovirus porcino.

La presente invención se refiere a una vacuna contra el síndrome PMWS (síndrome multisistémico de emaciación porcino, también denominado síndrome multisistémico de emaciación posdestete porcino).

En el siguiente texto se citan diversos documentos, y se hace referencia o se citan diversos documentos en los documentos citados en el texto siguiente. No hay reconocimiento de que cualquiera de estos documentos sea, de hecho, técnica anterior a la presente invención.

El PCV (por "circovirus porcino") fue detectado originalmente como un contaminante no citopatógeno en líneas celulares PK/15 de riñón de cerdo. Este virus se clasificó entre los Circoviridae con el virus de la anemia del pollo (CAV por virus de la anemia del pollo) y el virus PBFDV (virus de la enfermedad del pico y las plumas de psitaciformes). Es un pequeño virus sin envuelta (entre 15 y 24 nm) cuya característica común es contener un genoma en forma de ADN de cadena sencilla circular de 1,76 a 2,31 kb. Primero se pensó que este genoma codificaba un polipéptido de 30 kDa aproximadamente (Todd y col., Arch Virol 1991, 117; 129-135). No obstante, un trabajo reciente ha demostrado una transcripción más compleja (Meehan B. M. y col., 1997, 78; 221-227). Además, no se conocen homologías significativas en la secuencia de nucleótidos o en los determinantes antigénicos comunes entre los tres tipos de circovirus conocidos.

El PCV derivado de las células PK/15 se considera que no es patógeno. Su secuencia es conocida de B.M. Meehan y col., J. Gen. Virol 1997 (78) 221-227. Sólo muy recientemente algunos autores han pensado que cepas de PCV podrían ser patógenas y estar asociadas al síndrome PMWS (Gupi P.S. Nayar y col., Can. Vet. J, vol. 38, 1997: 385-387 y Clark E.G., Proc. Am. As. soc. Swine Prac. 1997; 499-501). Nayar y col. han detectado ADN de PCV en cerdos que tienen el síndrome PMWS usando técnicas de PCR.

El síndrome PMWS detectado en Canadá, Estados Unidos y Francia está caracterizado clínicamente por una pérdida gradual del peso y por manifestaciones tales como taquipnea, disnea e ictericia. Desde el punto de vista patológico, se manifiesta por infiltraciones linfocíticas o granulomatosas, linfadenopatías y, más raramente, por hepatitis y nefritis linfocítica o granulomatosa (Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501; La Semaine Vétérinaire No. 26, suplemento de La Semaine 1996 (839): La Semaine Vétérinaire 1997 (857): 54; Gupi P.S Nayer y col., Can. Vet. J, vol. 38, 1997; 385-387).

El documento WO 99/18214 describe cepas de circovirus porcino aisladas procedentes de especímenes pulmonares y ganglionares de ganado que padece de síndrome multisistémico de emaciación posdestete y vacunas que comprenden preparaciones antigénicas.

El solicitante ha tenido éxito en el aislamiento de cinco nuevas cepas de PCV a partir de muestras pulmonares o ganglionares obtenidas en granjas situadas en Canadá, Estados Unidos (California) y Francia (Bretaña). Estos virus han sido detectados en lesiones de cerdos con el síndrome PMWS, pero no en cerdos sanos.

Además, el solicitante ha secuenciado el genoma de cuatro de estas cepas, a saber, las cepas obtenidas en Canadá y en Estados Unidos así como dos cepas de Francia. Las cepas presentan un homología muy alta entre sí a nivel de nucleótidos, que supera el 96% y mucho más débil con la cepa PK/15, el 76% aproximadamente. Así, se puede considerar que las nuevas cepas son representativas de un nuevo tipo de circovirus porcino, denominado aquí como tipo II, estando el tipo I representado por PK/15.

Las preparaciones purificadas de cinco cepas se depositaron bajo el Tratado de Budapest en la ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido) el jueves 2 de octubre de 1997:

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Nº de acceso V97100219 (denominado aquí Imp. 1008PCV)

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Nº de acceso V9700218 (denominado aquí Imp. 1010PCV)

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Nº de acceso V97100217 (denominado aquí Imp. 999PCV), y, el viernes 16 de enero de 1998:

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Nº de acceso V98011608 (denominado aquí Imp. 1011-48285)

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Nº de acceso V98011609 (denominado aquí Imp. 1011-48121).

El solicitante ha observado que, en un ensayo para la reproducción experimental del síndrome multisistémico de emaciación porcino, un parvovirus porcino combinado con el circovirus porcino podría dar lugar a un empeoramiento de la enfermedad.

En un aspecto, la presente invención proporciona una preparación antigénica dirigida contra el síndrome multisistémico de emaciación porcino, que comprende un antígeno de circovirus porcino y un antígeno de parvovirus porcino; en el que comprende un antígeno de circovirus porcino de tipo II.

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En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna contra el síndrome multisistémico de emaciación porcino, que comprende una cantidad eficaz de una preparación antigénica según la presente invención, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario.

Además, la presente invención proporciona en otro aspecto, un kit de vacunación que contiene, empaquetadas por separado, una vacuna contra el circovirus porcino, y una vacuna contra el parvovirus porcino; en el que dicha vacuna contra el circovirus porcino comprende un antígeno de un circovirus porcino como se define en el presente documento.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una preparación antigénica según la presente invención o una vacuna según la presente invención para su uso en la preparación de una composición farmacéutica.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una preparación antigénica según la presente invención o una vacuna según la presente invención en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del síndrome multisistémico de emaciación porcino.

En el presente documento se describe la vacunación de cerdos usando una vacuna de un circovirus porcino, en particular de tipo I o de tipo II, preferentemente de tipo II, combinada con una vacunación con una vacuna de parvovirus porcino. Se entiende que significa vacunación con una vacuna bivalente, o el uso simultáneo, en cerdos, de una vacuna de circovirus porcino y de una vacuna de parvovirus porcino.

La referencia de la cepa de parvovirus es la cepa NADL-2 que está accesible en la colección ATCC bajo la referencia VR-742. La vacunación contra el parvovirus porcino es muy conocida por personas expertas en la materia y están disponibles comercialmente vacunas contra el parvovirus porcino. Se pueden mencionar a modo de ejemplo: Parvovax® (vacuna inactivada contra parvovirosis porcina, distribuida por MERIAL). Véase también, por ejemplo, P. Vannier y A. Laval., Point. Vét. 1993, 25 (151), 53-60; G. Florent y col., Proceedings of the Ninth Congress of Pig Veterinary Society, 15-18 de Julio, 1986, Barcelona, España. Para vacunas de ADN, se puede hacer referencia, por ejemplo, al documento WO-A-98 03658.

En el presente documento se menciona una preparación antigénica dirigida contra el síndrome PMWS, que comprende al menos un antígeno de circovirus porcino (preferentemente circovirus de tipo II) y al menos un antígeno de parvovirus porcino. De acuerdo con la descripción, el antígeno de circovirus porcino (preferentemente circovirus de tipo II) y el antígeno de parvovirus porcino comprenden, independientemente el uno del otro, un antígeno seleccionado del grupo constituido por un antígeno vivo completo atenuado, un antígeno completo inactivado, una subunidad del antígeno, un vector vivo recombinante y un vector de ADN. Se entiende que la combinación según la descripción puede suponer el uso de cualquier forma de antígeno o de preparación antigénica apropiada, entendiéndose que no es necesario usar la misma forma para una combinación dada. La preparación antigénica puede comprender, además, como es conocido per se, un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, y opcionalmente un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario.

En el presente documento se menciona una composición inmunógena o una vacuna contra el síndrome PMWS, que comprende una cantidad eficaz de preparación antigénica de circovirus + parvovirus como se ha descrito anteriormente, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, y opcionalmente un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario. Una composición inmunógena provoca una respuesta inmunógena que puede ser, aunque no es necesario que sea, protectora. Una composición de vacuna provoca una respuesta protectora. Por consiguiente, el término "composición inmunógena" incluye una "composición de vacuna" (al igual que el último término puede ser composición protectora).

En el presente documento se menciona un kit inmunológico o de vacunación que contiene, empaquetadas por separado, una preparación antigénica o una composición inmunógena o una vacuna contra el circovirus porcino y una preparación antigénica o una composición inmunógena o una vacuna contra el parvovirus porcino. Este kit puede presentar las diversas características expuestas anteriormente para las preparaciones antigénicas, composiciones inmunógenas y vacunas.

En el presente documento también se menciona un procedimiento de inmunización o de vacunación frente al síndrome PMWS, que comprende la administración de una composición inmunógena o una vacuna contra el circovirus porcino y de una composición inmunógena o una vacuna contra el parvovirus porcino o la administración de una composición inmunógena o una vacuna bivalentes, que comprende, en la misma formulación, una preparación antigénica específica para cada virus. Este procedimiento de inmunización o vacunación usa, en particular, vacunas como las definidas anteriormente.

En el presente documento se menciona el uso de una preparación antigénica o de una composición inmunógena o de una vacuna contra el parvovirus, como se ha definido en particular anteriormente, para la preparación de una composición farmacéutica prevista para su uso en el contexto de la prevención del síndrome PMWS, en combinación con una preparación antigénica o una composición inmunógena o una vacuna contra el circovirus porcino.

También es el objeto de la invención una preparación antigénica como se describe en el presente documento o una vacuna como se describe en el presente documento para su uso en la preparación de una composición farmacéutica.

Para la producción de preparaciones antigénicas de circovirus, los circovirus se pueden obtener después del paso a través de células, en particular líneas celulares, por ejemplo, células PK/15. Los sobrenadantes o los extractos del cultivo, opcionalmente purificados mediante técnicas habituales, se pueden usar como preparación antigénica.

En el contexto de preparaciones antigénicas atenuadas o composiciones inmunógenas atenuadas o vacunas, la atenuación se puede llevar a cabo según los procedimientos habituales, por ejemplo, mediante el paso a través de células, preferentemente mediante el paso a través de células de cerdo, especialmente líneas celulares, tales como las células PK/15 (por ejemplo, entre 50 y 150, especialmente del orden de 100 pasos). Estas composiciones inmunógenas y vacunas en general comprenden un vehículo o diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario, opcionalmente un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario, así como opcionalmente un estabilizante de crio-desecación.

Estas preparaciones antigénicas, composiciones inmunógenas y vacunas preferente comprenderán entre 10^{3} y 10^{7} TCID50 del virus atenuado en cuestión.

Pueden ser preparaciones antigénicas, composiciones inmunógenas y vacunas basadas en antígenos completos inactivados. Las composiciones inmunógenas inactivadas y vacunas comprenden, además, un vehículo o diluyente aceptable desde el punto de vista de veterinario, opcionalmente con un adyuvante adicional aceptable desde el punto de vista veterinario.

Los circovirus para su uso según la descripción con las fracciones que pueden estar presentes, se inactivan según técnicas conocidas por personas expertas en la materia. Preferentemente la inactivación se llevará a cabo mediante la vía química por ejemplo, exponiendo el antígeno a un agente químico tal como formaldehído (formalina), paraformaldehído, \beta-propiolactona o etilenimina y sus derivados. El procedimiento de inactivación preferido en el presente documento será la exposición a un agente químico y, en particular, a etilenimina o a \beta-propiolactona.

Preferentemente, las preparaciones antigénicas inactivadas y las composiciones inmunógenas inactivadas y vacunas según la descripción se suplementarán con un adyuvante, que de manera ventajosa se suministra en forma de emulsiones, por ejemplo, agua en aceite o aceite en agua, según técnicas muy conocidas por personas expertas en la materia. También será posible que el carácter del adyuvante también provenga de la incorporación de un compuesto adyuvante habitual al principio activo.

Entre los adyuvantes que se pueden usar, se pueden mencionar a modo de ejemplo el hidróxido de aluminio, las saponinas (por ejemplo, saponina Quillaja o Quil A; véase Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, editado por Michael F. Powel y Mark J. Newman, Plennum Press, Nueva York y Londres, p. 210), Avridine® (Vaccine Design p. 148), DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio, Vaccine Design p. 157), Polifosfaceno (Vaccine Design p. 204), o alternativamente emulsiones de aceite en agua basadas en aceite mineral, escualeno (por ejemplo, emulsión SPT, Vaccine Design p. 147), escualeno (por ejemplo, MF59, Vaccine Design p. 183), o emulsiones de agua en aceite basadas en aceites metabolizables (preferentemente según el documento WO-A-94 20071) así como las emulsiones descritas en el documento US-A-5.422.109. También es posible seleccionar combinaciones de adyuvantes, por ejemplo, Avridine® o DDA combinados con una emulsión.

Estas preparaciones antigénicas, composiciones inmunógenas y vacunas preferentemente comprenderán entre 10^{5} y 10^{8} TCID50 del virus completo inactivado en cuestión.

Los adyuvantes para vacunas vivas descritos anteriormente se pueden seleccionar entre aquellos dados para los inactivados. Se prefieren las emulsiones. A aquellos indicados para la vacuna inactivada, se pueden añadir aquellos descritos en el documento WO-A-9416681.

Como estabilizante de crio-desecación, se puede mencionar a modo de ejemplo el SPGA (Bovarnik y col., J. Bacteriology 59, 509, 950), carbohidratos tales como sorbitol, manitol, fécula, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína, derivados de estos compuestos, o tampones tales como fosfatos de metales alcalinos.

Las preparaciones antigénicas, las composiciones inmunógenas y las vacunas según la descripción pueden comprender uno o más principios activos (antígenos) de uno o más circovirus y/o parvovirus descritos en el presente documento.

Además, el solicitante ha obtenido el genoma de cuatro de los circovirus porcinos de tipo II aislados, identificados como SEQ ID NO: 1 a 4. La secuencia de la cepa PK-15 se da como SEQ ID NO: 5. Huelga decir que la descripción cubre automáticamente el uso de secuencias equivalentes, es decir, las secuencias que no varían la funcionalidad o la especificidad de la cepa de la secuencia descrita o de los polipéptidos codificados por estas secuencias. Naturalmente están incluidas las secuencias que difieren por degeneración del código genético.

La descripción también cubre el uso de secuencias equivalentes en el sentido de que sean capaces de hibridarse con la secuencia anterior en condiciones de alta rigurosidad y/o que tienen una homología elevada con las cepas mencionadas en el presente documento.

Estas secuencias y sus fragmentos se pueden usar de manera ventajosa para la expresión in vitro o in vivo de polipéptidos con la ayuda de vectores apropiados.

En particular, los marcos de lectura abiertos (ORF 1-13), que forman fragmentos de ADN mencionados en el presente documento, que se pueden usar a este efecto han sido identificados sobre la secuencia genómica de los circovirus de tipo II. La descripción se refiere al uso de cualquier polipéptido que contiene al menos uno de estos marcos de lectura abiertos (secuencia de aminoácidos correspondientes). Preferentemente, la descripción se refiere al uso de una proteína que consta esencialmente del ORF4, ORF7, ORF10 u ORF13.

Para la expresión de subunidades in vitro, como medio de expresión, preferentemente se usará E. coli o un baculovirus (US-A-4.745.051). La secuencia(s) codificante o sus fragmentos se pueden integrar en el genoma del baculovirus (por ejemplo, el baculovirus virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica, AcNPV) y este último a continuación se puede propagar en células de insecto, por ejemplo, Spodoptera frugiperda Sf9 (depósito ATCC CRL 1711). Las subunidades también se pueden producir en células eucariotas tales como levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) o células de mamífero (por ejemplo, CHO, BHK).

En el presente documento se ha mencionado el uso de los polipéptidos como subunidades que serán producidos in vitro por estos medios de expresión, y a continuación se purificarán opcionalmente según técnicas convencionales. Las composiciones inmunógenas y vacunas subunitarias comprenden al menos un polipéptido obtenido de esta forma, o un fragmento, en un vehículo o diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario y opcionalmente un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario.

Para la expresión in vivo con el fin de producir composiciones inmunógenas y vacunas del tipo vivo recombinante o de tipo ADN, la secuencia(s) codificante o sus fragmentos se insertan en un vector de expresión apropiado en condiciones que permitan la expresión del polipéptido(s). Como vectores vivos apropiados, preferentemente se pueden usar virus vivos, preferentemente capaces de multiplicarse en cerdos, no patógenos para los cerdos (no patógenos naturalmente o hechos no patógenos), según técnicas muy conocidas por las personas expertas en la materia. En particular se pueden usar herpesvirus de cerdo tales como el virus de la enfermedad de Aujeszky, adenovirus porcino, poxvirus, especialmente virus de la vacuna, virus avipox, virus canarypox, virus swinepox. También se pueden usar vectores de ADN como vectores (WO-A-9011092, WO-A-9319813, WO-A-9421797, WO-A-
9520660).

En el presente documento se mencionan los vectores y las composiciones inmunógenas o vacunas de tipo vivo recombinante o de tipo ADN (polinucleótidos) preparadas de esta forma, su preparación y su uso, las composiciones inmunógenas y las vacunas que comprenden, además, un vehículo o diluyente aceptable desde el punto de vista veterinario.

Por definición, una composición inmunógena o vacuna de ADN comprende un vector de ADN que es un plásmido de vacuna circular, superenrollado o con otra forma, o una molécula de ADN lineal, que se incorpora y expresa in vivo una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antigénico.

Las composiciones y vacunas inmunógenas recombinantes y de tipo ADN pueden comprender un adyuvante.

En el contexto de los programas de inmunización o vacunación combinados, también es posible combinar la inmunización o vacunación contra el circovirus porcino y el parvovirus porcino con una inmunización o vacunación contra otros patógenos del cerdo, en particular aquellos que podrían estar asociados al síndrome PMWS. La composición inmunógena o vacuna según la descripción por tanto puede comprender otra valencia correspondiente a otro patógeno del cerdo seleccionado entre el virus PRRS (síndrome reproductor y respiratorio porcino) y/o virus de Mycoplasma hyopneumoniae, y/o E. coli, y/o rinitis atrófica, y/o Pseudorabies (enfermedad de Aujeszky) y/o gripe porcina y/o Actinobacillus pleuropneumoniae y/o cólera del cerdo, y sus combinaciones. Preferentemente, el programa de inmunización o vacunación y las vacuna según la descripción combinarán inmunizaciones o vacunaciones contra el circovirus y el parvovirus, y el virus PRRS (WO-A-93/07898, WO-A-94/18311, FR-A-2 709 966; C. Charreyre y col., Proceedings of the 15th IPVS Congress, Birmingham, Inglaterra, 5-9 de Julio de 1998, p 139; y/o Mycoplasma hyopneumoniae (EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A571 648; O. Martinon y col. p 157, 284, 285 y G. Reynaud y col., p 150, todos los documentos en el Congreso Proceedings of the 15th IPVS Congress mencionado anteriormente) y/o gripe porcina. Así, es posible usar cualquier forma apropiada de composición inmunógena o vacuna, en particular cualquier vacuna comercial disponible, para así combinarla con la composición inmunógena o vacuna contra el circovirus porcino y el parvovirus porcino como se describe en el presente
documento.

En el presente documento se mencionan composiciones inmunógenas y vacunas multivalentes, kits multivacuna, y procedimientos de inmunización o vacunación combinados que hacen posible el uso de esos programas de inmunización o vacunación combinados.

Ahora la invención se describirá con mayor detalle con la ayuda de formas de realización ejemplares no limitantes, tomando como referencia los dibujos, en los que:

Figura 1. Secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 1011-48121

Figura 2: Secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 1011-48285

Figura 3: Secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 999

Figura 4: Secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 1010

Figura 5: Alineamiento de las 4 secuencias según las Figuras 1 a 4 con la secuencia de la cepa PK/15 de PCV.

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Listado de secuencias SEQ ID

SEQ ID No: 1 Secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 1011-48121

SEQ ID No: 2 Secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 1011-48285

SEQ ID No: 3 Secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 999

SEQ ID No: 4 Secuencia de ADN del genoma de la cepa Imp. 1010

SEQ ID No: 5 Secuencia de ADN del genoma de la cepa PK/15.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Cultivo y aislamiento de cepas de circovirus porcino

Se recogieron muestras de tejido en Francia, Canadá y EE.UU. del pulmón y los nódulos linfáticos de lechones. Estos lechones presentaban signos clínicos típicos del síndrome multisistémico de emaciación posdestete porcino. Para facilitar el aislamiento de los virus, las muestras de tejidos se congelaron a -70ºC inmediatamente después de la autopsia.

Para el aislamiento vírico, se prepararon suspensiones que contienen el 15% de muestra de tejido aproximadamente en un medio mínimo que contiene sales de Earle (EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham, RU), penicilina (100 IU/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml) (medio MEM-SA), moliendo los tejidos con arena estéril usando un mortero y una mano estériles. A continuación esta preparación molida se recogió en MEM-SA, y se centrifugó a 3000 g durante 30 minutos a +4ºC para recoger el sobrenadante.

Antes de la inoculación de los cultivos celulares, se añadió un volumen de 100 \mul de cloroformo a 2 ml de cada sobrenadante y se mezcló continuamente durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación esta mezcla se transfirió a un tubo de microcentrífuga, se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos, y a continuación se recogió el sobrenadante. Este sobrenadante se usó como inóculo para los experimentos de aislamiento vírico.

Todos los estudios de aislamiento vírico se llevaron a cabo sobre cultivos de células PK/15, que se sabe que no estaban contaminados con el circovirus porcino (PCV), pestivirus, adenovirus porcino y parvovirus porcino (Allan G. y col., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64).

El aislamiento de los circovirus porcinos se llevó a cabo según la técnica siguiente:

Monocapas de células PK/15 se disociaron por tripsinización (con una mezcla de tripsina-verseno) a partir de cultivos confluentes, y se recogieron en medio MEM-SA que contiene el 15% de suero fetal bovino no contaminado por pestivirus (= medio MEM-G) en una concentración final de 400.000 células por ml aproximadamente. A continuación fracciones alícuotas de 10 ml de esta suspensión celular se mezclaron con fracciones alícuotas de 2 ml de los inóculos descritos anteriormente, y se tomó alícuotas de las mezclas finales en volúmenes de 6 ml en dos tubos Falcon de 25 cm^{2}. A continuación estos cultivos se incubaron a 37ºC durante 18 horas en una atmósfera que contiene el 10% de CO_{2}.

Después de la incubación, el medio de cultivo de las monocapas semi- confluentes se trató con D-glucosamina 300 mM (Cat # G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, RU) (Tischr 1. y col., Arch. Virol., 1987 96 39-57), y a continuación se prosiguió con la incubación durante un periodo adicional de 48-72 horas a +37ºC. Después de esta última incubación, uno de los dos Falcons de cada inóculo se sometió a 3 ciclos de congelación/descongelación sucesivos. Las células PK/15 de los Falcon restantes se trataron con una disolución de tripsina-verseno, se resuspendieron en 20 ml de medio MEM-G, y a continuación se inocularon en Falcons de 75 cm^{2} a una concentración de 400.000 células/ml. A continuación los tubos recién inoculados se "superinfectaron" con la adición de 5 ml del lisado correspondiente obtenido después de los ciclos de congelación/descongelación.

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Ejemplo 2

Preparación de las muestras de cultivo celular para la detección de circovirus porcino por inmunofluorescencia o por hibridación in situ

Un volumen de 5 ml de la suspensión "superinfectada" se recogió y se inoculó en una placa Petri de 55 mm de diámetro que contiene un cubreobjetos de vidrio estéril y exento de grasa. Los cultivos en los tubos y sobre los cubreobjetos de vidrio se incubaron a 37ºC y se trataron con glucosamina como se describe en el Ejemplo 1. Los cultivos sobre los cubreobjetos de vidrio se recogieron entre 24 y 48 horas después del tratamiento con glucosamina y se fijaron, bien con acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente, o bien con formaldehído tamponado al 10% durante 4 horas. Después de esta fijación, todos los cubreobjetos de vidrio se almacenaron a -70ºC, sobre gel de sílice, antes de su uso para los estudios de hibridación in situ y los estudios de marcaje inmunocitoquímico.

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Ejemplo 3

Técnicas para la detección de secuencias del PCV por hibridación in situ

La hibridación in situ se llevó a cabo sobre tejidos recogidos de cerdos enfermos y fijados con formaldehído y también sobre las preparaciones de cultivos celulares inoculadas para el aislamiento vírico (véase Ejemplo 2) y fijadas sobre cubreobjetos de vidrio.

Se usaron sondas genómicas completas correspondientes a los circovirus porcinos (PCV) PK/15 y al virus de la anemia del pollo infecciosa (CAV). El plásmido PPCV1, que contiene la forma replicativa del genoma del PCV, clonado en forma de un solo inserto de 1,7 kilopares de bases (kpb) (Meehan B. y col. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227), se usó como fuente de ADN vírico específica para el PCV. Un plásmido análogo, el pCAA1, que contiene la forma replicativa de 2,3 kbp del circovirus aviar CAV se usó como control negativo. Las respectivas disoluciones madre de glicerol de los dos plásmidos se usaron para la producción y purificación de los plásmidos según la técnica de lisis alcalina (Sambrook J. y col. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) de manera que a continuación se usan como moldes para la preparación de las sondas. Las sondas de circovirus representativas de los genomas completos de PCV y de CAV se produjeron a partir de los plásmidos purificados descritos anteriormente (1 \mug para cada sonda) y a partir de cebadores de hexanucleótidos aleatorios usando un kit de marcaje no radiactivo comercial ("DIG DNA labelling kit", Boehringer Mannheim, Lewes, RU) según las recomendaciones del
fabricante.

Las sondas marcadas con digoxigenina se recogieron en un volumen de 50-100 \mul de agua estéril antes de ser usadas para la hibridación in situ.

Las muestras de tejido de cerdo enfermo, embebidas en parafina y fijadas con formaldehído, así como las preparaciones de cultivos celulares infectados, fijados con formaldehído, se prepararon para la detección de los ácidos nucleicos del PCV según la técnica siguiente:

Secciones de 5 \mum de espesor se cortaron de los bloques de tejido embebido en parafina, se eliminó la parafina, y a continuación se rehidrató en disoluciones sucesivas de alcohol en concentraciones decrecientes. Las secciones de tejido y los cultivos celulares fijados con formaldehído se incubaron durante 15 minutos y 5 minutos, respectivamente, a 37ºC en una disolución de proteinasa K al 0,5% en tampón Tris-HCl 0,05 M que contiene EDTA 5 mM (pH 7,6). A continuación los cortes se pusieron en una disolución de glicina al 1% en agua destilada autoclavada, durante 30 segundos, se lavaron dos veces con tampón PBS 0,01 M (tampón fosfato salino) (pH 7,2), y finalmente se lavaron durante 5 minutos en agua destilada estéril. Finalmente se secaron al aire libre y se pusieron en contacto con las sondas.

Cada preparación de tejido/sonda se cubrió con un cubreobjetos de vidrio limpio y exento de grasas, y a continuación se puso en un horno a 90ºC durante 10 minutos, posteriormente se puso en contacto con un bloque de hielo durante 1 minuto, y finalmente se incubó durante 18 horas a 37ºC. A continuación las preparaciones se sumergieron brevemente en un tampón de sal de citrato sódico 2X (SSC) (pH 7,0) para retirar los cubreobjetos de vidrio protectores, y a continuación se lavaron dos veces durante 5 minutos en tampón SSC 2X y finalmente se lavaron dos veces durante 5 minutos en tampón PBS.

Después de estos lavados, las preparaciones se sumergieron en una disolución de ácido maleico 0,1 M, NaCl 0,15 M (pH 7,5) (tampón maleico) durante 10 minutos, y a continuación se incubaron en una disolución al 1% de reactivo de bloqueo (Cat # 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, RU) en tampón maleico durante 20 minutos a +37ºC.

A continuación las preparaciones se incubaron con una disolución 1/250 de un anticuerpo monoclonal anti-digoxigenina (Boehringer Mannheim), diluido en tampón de bloqueo, durante 1 hora a +37ºC, se lavó en PBS y finalmente se incubó con un anticuerpo inmunoglobulina anti-ratón biotinilado durante 30 minutos a +37ºC. Las preparaciones se lavaron en PBS y la actividad peroxidasa endógena se bloqueó por tratamiento con una disolución de peróxido de hidrógeno al 0,5% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las preparaciones se lavaron de nuevo en PBS y se trataron con un sustrato 3-amino-9-dietilcarbazol (AEC) (Cambridge Bioscience, Cambridge, RU) preparado inmediatamente antes de su uso.

Después de un lavado final con agua del grifo, las preparaciones se contratiñeron con hematoxilina, "azularon" con el agua grifo, y se montaron sobre portaobjetos de vidrio de microscopio con un fluido de montaje (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, RU). Los controles experimentales incluían el uso de una sonda negativa no pertinente (CAV) y de una sonda positiva (PCV) sobre muestras obtenidas a partir de cerdos enfermos y de cerdos no
enfermos.

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Ejemplo 4

Técnica para la detección del PCV por inmunofluorescencia

La selección inicial de todas las preparaciones de cultivos celulares fijadas con acetona se llevó a cabo mediante una técnica de inmunofluorescencia indirecta (IIF) usando una dilución 1/100 de una reserva de suero de cerdo adulto. Esta reserva de suero comprende suero procedente de 25 cerdas adultas de Irlanda del Norte y que se sabe que contienen anticuerpos contra una amplia variedad de virus porcinos, incluyendo el PCV: parvovirus porcino, adenovirus porcino, y virus PRRS. La técnica IIF se llevó a cabo poniendo en contacto el suero (diluido en PBS) con los cultivos celulares durante una hora a 37ºC, seguido de dos lavados en PBS. A continuación los cultivos celulares se tiñeron con una dilución 1/80 en PBS de un anticuerpo inmunoglobulina anti-cerdo de conejo conjugado con isotiocianato de fluoresceína durante una hora, y a continuación se lavó con PBS y se montó en tampón glicerol antes de la observación al microscopio bajo luz ultravioleta.

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Ejemplo 5

Resultados de la hibridación in situ sobre tejidos de cerdo enfermo

La hibridación in situ, usando una sonda genómica del PCV, preparada a partir de tejidos recogidos de los lechones de Francia, Canadá y California con lesiones de emaciación multisistémicas y fijados con formaldehído, mostraban la presencia de ácidos nucleicos del PCV asociados a las lesiones, en diversas de las lesiones estudiadas. No se observó ninguna señal cuando la sonda genómica del PCV se usó sobre tejidos recogidos de cerdos no enfermos o cuando la sonda del CAV se usó sobre los tejidos de cerdo enfermo. La presencia de los ácidos nucleicos del PCV se identificó en el citoplasma y en el núcleo de numerosas células mononucleares que se infiltran en las lesiones en los pulmones de los lechones de California. La presencia de los ácidos nucleicos del PCV también se demostró en los neumocitos, las células epiteliales bronquiales y bronquiolares, y en las células endoteliales de las arteriolas, las vénulas y los vasos linfáticos.

En los cerdos de Francia enfermos, la presencia de los ácidos nucleicos del PCV se detectó en el citoplasma de numerosos linfocitos foliculares y en las células mononucleares intrasinusoidales de los nódulos linfáticos. Los ácidos nucleicos del PCV también se detectaron en sincitios ocasionales. Dependiendo de estos resultados de detección, las muestras de los pulmones de los cerdos de California, los nódulos linfáticos mesentéricos de los cerdos de Francia, y los órganos de los cerdos de Canadá se seleccionaron con el fin de aislar nuevas cepas de circovirus
porcino.

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Ejemplo 6

Resultados de los cultivos celulares de las nuevas cepas de circovirus porcino y detección por inmunofluorescencia

No se observó efecto citopático (CPE) en los cultivos celulares inoculados con las muestras recogidas de los lechones de Francia (cepa Imp. 1008), los lechones de California (cepa Imp. 999) y los lechones de Canadá (cepa Imp. 1010) que presentan signos clínicos de síndrome multisistémico de emaciación. No obstante, el inmunomarcaje de las preparaciones obtenidas a partir de los cultivos celulares inoculados, después de la fijación usando acetona y con una reserva de suero policlonal de cerdo, reveló fluorescencia nuclear en numerosas células en los cultivos inoculados usando los pulmones de los lechones de California (cepa Imp. 999), usando los nódulos linfáticos mediastinales de los lechones de Francia (cepa Imp. 1008), y usando órganos de los lechones de Canadá (cepa Imp.
1010).

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Ejemplo 7

Extracción del ADN genómico de los circovirus porcinos

Las formas replicativas de las nuevas cepas de circovirus porcino (PCV) se prepararon usando cultivos de células PK/15 infectadas (véase Ejemplo 1) (10 Falcons de 75 cm^{2}) recogidas después de 72-76 horas de incubación y tratadas con glucosamina, como se describe para la clonación de la forma replicativa del CAV (Todd. D. y col. Dot blot hybridization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 933-939). El ADN de doble cadena de estas formas replicativas se extrajo según una modificación de la técnica de Hirt (Hirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365-369), como se describe por Molitor (Molitor T.W. y col. Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates, Virology, 1984, 137, 241-254).

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Ejemplo 8

Mapa de restricción de la forma replicativa del genoma de la cepa Imp. 999 del circovirus porcino

El ADN (1-5 \mug) extraído según la técnica de Hirt se trató con Sl nucleasa (Amersham) según las recomendaciones del fabricante, y a continuación este ADN se digirió con diversas enzimas de restricción (Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, RU) y los productos de digestión se separaron por electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,5% en presencia de bromuro de etidio como se describe por Todd y col. (Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823). El ADN extraído de los cultivos de la cepa Imp. 999 posee un único sitio EcoRI, 2 sitios SacI y no posee ningún sitio PstI. Este perfil de restricción por tanto es diferente del perfil de restricción presentado por la cepa PK/15 del PCV (Meehan B. y col. Sequence of porcine circovirus DNA; affinities with plant circoviruses, 1997 78, 221-227) que, en contraste, posee un sitio PstI y no posee ningún sitio
EcoRI.

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Ejemplo 9

Clonación del genoma de la cepa Imp. 999 del circovirus porcino

El fragmento de restricción de 1,8 kpb aproximadamente generado por digestión de la forma replicativa de doble cadena de la cepa Imp. 999 del PCV con la enzima de restricción EcoRI se aisló después de electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,5% (véase Ejemplo 3) usando un kit comercial de Qiagen (QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, RU). A continuación este fragmento de restricción EcoRI-EcoRI se ligó con el vector pGEM-7 (Promega, Medical Supply Company, Dublín, Irlanda), digerido previamente con las mismas enzimas de restricción y desfosforilado, según técnicas de clonación habituales (Sambrook J. y col. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Los plásmidos obtenidos se transformaron en una cepa hospedadora JM109 de Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) según técnicas habituales. El fragmento de restricción EcoRI-EcoRI de la cepa Imp. 999 del PCV también se clonó en el sitio EcoRI del vector pBlueScript SK+ (Stratagene Inc. La Jolla, EE.UU.). Entre los clones obtenidos para cada cepa hospedadora, se seleccionaron al menos 2 clones que contienen los fragmentos del tamaño esperado. A continuación los clones obtenidos se cultivaron y los plásmidos que contienen el genoma completo de la cepa Imp. 999 se purificaron en un volumen pequeño (2 ml) o en un volumen grande (250 ml) según técnicas de preparación y purificación de plásmidos habituales.

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Ejemplo 10

Secuenciación de un ADN genómico (forma replicativa de doble cadena) de la cepa Imp. 999 del PCV

La secuencia de nucleótidos de 2 clones de Imp. 999 EcoRI (clones pGEM-7/2 y pGEM-7/8) se determinó según la técnica de didesoxinucleótidos de Sanger usando el kit de secuenciación "AmpliTaq DNA polymerase FS" (Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, RU) y un aparato de secuenciación automático de Applied BioSystems AB1373A según las recomendaciones del fabricante. Las reacciones de secuenciación iniciales se llevaron a cabo con los cebadores universales de M13 "directo" e "inverso". Se generaron las siguientes reacciones de secuenciación según la técnica del "paseo de ADN". Los oligonucleótidos necesarios para estas secuenciaciones posteriores fueron sintetizados por Life Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, RU).

Las secuencias generadas se ensamblaron y se analizaron por medio del software MacDNASIS versión 3.2 (Cat # 22020101, Appligene, Durham, RU). Los diversos marcos de lectura abiertos se analizaron por medio del algoritmo BLAST en el servidor del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.).

La secuencia completa (fragmento EcoRI-EcoRI) se presenta en la SEQ ID NO: 3 (Figura 3). Da la secuencia total de esta cepa, que se hizo comenzar arbitrariamente en el inicio del sitio EcoRI, es decir, la G como primer
nucleótido.

El procedimiento se llevó a cabo de una manera similar para obtener la secuencia de los otros tres aislados mencionados en el presente documento (véase SEQ ID No: 1, 2 y 4 y Figuras 1, 2 y 4).

\newpage

El tamaño del genoma de estas cuatro cepas es:

Imp. 1011-48121

1767 nucleótidos

Imp. 1011-48285

1767 nucleótidos

Imp. 999

1768 nucleótidos

Imp. 1010

1768 nucleótidos.

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Ejemplo 11

Análisis de la secuencia de la cepa Imp. 999 del PCV

Cuando la secuencia generada a partir de la cepa Imp. 999 se usó para comprobar la homología con respecto a las secuencias contenidas en el banco de datos GenBank, la única homología significativa que se detectó es una homología del 76% aproximadamente (a nivel de los ácidos nucleicos) con la secuencia de la cepa PK/15 (números de acceso Y09921 y U49186) (véase Figura Nº 5).

A nivel de los aminoácidos, la prueba para la homología en la traducción de las secuencias en las 6 fases con los bancos de datos (algoritmo BLAST X en el servidor NABI) hizo posible demostrar una homología del 94% con el marco de lectura abierto correspondiente a la replicasa teórica del virus BBTV similar a los circovirus de plantas (número de identificación del GenBank 1841515) codificado por la secuencia U49186 del GenBank.

Ninguna otra secuencia contenida en los bancos de datos muestra una homología significativa con la secuencia generada a partir de la cepa Imp. 999 del PCV.

El análisis de las secuencias obtenidas a partir de la cepa Imp. 999 cultivada usando lesiones recogidas de lechones de California que tienen signos clínicos del síndrome multisistémico de emaciación muestra claramente que este aislado vírico es una nueva cepa de circovirus porcino.

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Ejemplo 12

Análisis comparativo de las secuencias

Se llevó a cabo el alineamiento de las secuencias de nucleótidos de las 4 nuevas cepas del PCV con la secuencia de la cepa PK/15 del PCV (Figura 5). Se estableció una matriz de homología teniendo en cuenta las cuatro nuevas cepas y la cepa PK/15 previa. Los resultados son los siguientes:

1.

Imp. 1011-48121

2.

Imp. 1011-48285

3:

Imp. 999

4:

Imp. 1010.

5:

PK/15

1

La homología entre las dos cepas de Francia Imp. 1011-48121 e Imp. 1011-48285 es superior al 99% (0,9977).

\newpage

La homología entre las dos cepas de Norteamérica Imp. 999 e Imp. 1010 también es superior al 99% (0,9949). La homología entre las cepas de Francia y las cepas de Norteamérica es ligeramente superior al 96%.

La homología entre todas estas cepas y la PK/15 está en un valor entre el 75 y el 76%.

De ello se deduce que las cepas descritas en el presente documento son representativas de un nuevo tipo de circovirus porcino, distintas del tipo representado por la cepa PK/15. Este nuevo tipo, aislado a partir de cerdos que presentan el síndrome PMWS, se denomina circovirus porcino de tipo II, con la cepa PK/15 que representa el tipo I. Las cepas que pertenecen a este tipo II presentan una homogeneidad de secuencia de nucleótidos remarcable, aunque de hecho se han aislado en regiones geográficas muy distantes.

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Ejemplo 13

Análisis de las proteínas codificadas por el genoma de las nuevas cepas del PCV

La secuencia de nucleótidos del aislado Imp. 1010 se consideraba que era representativa de las otras cepas de circovirus asociadas al síndrome multisistémico de emaciación. Esta secuencia se analizó con mayor detalle con ayuda del algoritmo BLASTX (Altschul y col. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410) y de una combinación de programas a partir del paquete de software MacVector 6.0 (Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, RU). Fue posible detectar 13 marcos de lectura abiertos (o ORFs) de un tamaño superior a 20 aminoácidos sobre esta secuencia (genoma circular). Estos 13 ORFs son los siguientes:

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2

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Las posiciones del inicio y el final de cada ORF se refieren a la secuencia representada en la Figura Nº 4 (SEQ ID Nº 4), del genoma de la cepa 1010. Los límites de los ORFs 1 a 13 son idénticos para la cepa 999. También son idénticos para las cepas 1011-48121 y 1011-48285, excepto para los ORFs 3 y 13:

ORF3 1432-1539, sentido, 108 nt, 35 aa

ORF13 314-1377, antisentido, 705 nt, 234 aa.

\newpage

Entre estos 13 ORFs, 4 tienen una homología significativa con ORFs análogos situados en el genoma de los virus clonados PK-15 del PCV. Se analizó cada uno de los marcos de lectura abiertos presentes sobre el genoma de todos los aislados de circovirus asociados al síndrome multisistémico de emaciación. Estos 4 ORFs son los siguientes:

3

Las posiciones del inicio y el final de cada ORF se refieren a la secuencia presentada en la Figura Nº 4 (SEQ ID No. 4). El tamaño del ORF (nucleótidos = nt) incluye el codón de detención.

La comparación entre la organización genómica de los aislados Imp. 1010 del PCV y PK-15 del PCV permitió la identificación de 4 ORFs preservados en el genoma de los dos virus. La tabla siguiente presenta los grados de homología observados:

4

La identidad de secuencia más alta se observó entre el ORF4 de Imp. 1010 y el ORF1 de PK-15 (86% de homología). Esto era esperable puesto que esta proteína probablemente está involucrada en la replicación del ADN del virus y es esencial para la replicación vírica (Meehan y col. J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227; Mankertz y col. J. Gen. Virol. 1998. 79. 381-38d).

La identidad de secuencia entre el ORF13 de Imp. 1010 y el ORF2 de PK-15 es menos fuerte (66,4% de homología), pero cada uno de estos dos ORFs de hecho presenta una región básica N-terminal altamente conservada que es idéntica a la región N-terminal de la proteína estructural principal del circovirus aviar CAV (Meehan y col. Arch. Virol. 1992. 124. 301-319). Además, se observan grandes diferencias entre el ORF7 de Imp. 1010 y el ORF3 de PK-15 y entre el 0RF10 de Imp. 1010 y el ORF4 de PK-15. En cada caso, hay una deleción de la región C-terminal del ORF7 y del 0RF10 del aislado Imp. 1010 cuando se comparan con el ORF3 y el ORF4 de PK-15 del PCV. La homología de secuencia más grande se observa a nivel de las regiones N-terminales de los ORF7/ORF3 (61,5% de homología a nivel del solapamiento) y del ORF10/ORF4 (83% de homología a nivel del solapamiento).

Parece que la organización genómica del circovirus porcino es bastante compleja como consecuencia de la extrema compactación de su genoma. La proteína estructural principal probablemente procede del procesamiento alternativo entre diversos marcos de lectura situados sobre la misma hebra del genoma del circovirus porcino. Por tanto se puede considerar que cualquier marco de lectura abierto (ORF1 a ORF13) como se describe en la tabla anterior puede representar todas o parte de una proteína antigénica codificada por el circovirus porcino de tipo II y, por tanto, potencialmente es un antígeno que se puede usar para el diagnóstico específico y/o para la vacunación. Por tanto la invención se refiere al uso de cualquier proteína que comprenda al menos uno de estos ORFs. Preferentemente, una proteína que consta esencialmente del ORF4, ORF7, ORF10 u ORF13.

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Ejemplo 14

Carácter infeccioso del genoma del PCV clonado a partir de las nuevas cepas

El plásmido pGEM-7/8 que contiene el genoma completo (forma replicativa) del aislado Imp. 999 se transfectó en células PK/15 según la técnica descrita por Meehan B. y col. (Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome fragments. Arch. Virol. 1992, 124, 301-319). Los análisis de inmunofluorescencia (véase Ejemplo 4) llevados a cabo en el primer paso después de la transfección sobre células PK/15 no contaminadas han demostrado que el plásmido del clon pGEM7/8 era capaz de inducir la producción del virus PCV infeccioso. La disponibilidad de un clon que contiene un material genético del PCV infeccioso permite cualquier manipulación útil sobre el genoma vírico para producir virus PCV modificados (ya sean atenuados en cerdos, o defectivos) que se pueden usar para la producción de vacunas atenuadas o recombinantes, o para la producción de antígenos para kits diagnósticos.

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Ejemplo 15

Producción de antígenos del PCV mediante cultivo in vitro

El cultivo de las células PK/15 no contaminadas y la multiplicación vírica se llevaron a cabo según los mismos procedimientos que en el Ejemplo 1. Las células infectadas se recogieron después de tripsinización tras 4 días de incubación a 37ºC y se enumeraron. El siguiente paso se inoculó con 400.000 células infectadas por ml.

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Ejemplo 16

Inactivación de los antígenos víricos

Al final del cultivo vírico, las células infectadas se recogieron y se lisaron usando ultrasonidos (Branson Sonifier) o con la ayuda de un molino para coloides de tipo rotor-estator (UltraTurrax, IKA). A continuación la suspensión se centrifugó a 3700 g durante 30 minutos. La suspensión vírica se inactivó con etilenimina al 0,1% durante 18 horas a +37ºC o con \beta-propiolactona al 0,5% durante 24 horas a +28ºC. Si la titulación de virus antes de la inactivación es inadecuada, la suspensión vírica se concentra por ultrafiltración usando una membrana con un límite de 300 kDa (Millipore PTMK300). La suspensión vírica inactivada se almacena a +5ºC.

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Ejemplo 17

Preparación de la vacuna en forma de emulsión basada en aceite mineral

La vacuna se prepara según la fórmula siguiente:

- suspensión de circovirus porcino inactivado:

250 ml

- Montanide® ISA 70 (SEPPIC):

750 ml.

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La fase acuosa y la fase oleosa se esterilizan por separado mediante filtración. La emulsión se prepara mezclando y homogenizando los principios con la ayuda de un emulsionador de turbina Silverson.

Una dosis de vacuna contiene 10^{7.5} TCID50 aproximadamente. El volumen de una dosis de vacuna es de 0,5 ml para la administración por vía intradérmica, y de 2 ml para la administración por vía intramuscular.

Esta vacuna se usa en el programa de vacunación contra el síndrome multisistémico de emaciación en combinación con la vacuna Parvovax®.

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Ejemplo 18

Preparación de la vacuna en forma de emulsión metabolizable con base de aceite

La vacuna se prepara según la fórmula siguiente:

- suspensión de circovirus porcino inactivado:

200 ml

- Dehymuls HRE 7 (Henkel):

60 ml

- Radia 7204 (Oleofina):

740 ml.

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La fase acuosa y la fase oleosa se esterilizan por separado mediante filtración. La emulsión se prepara mezclando y homogenizando los principios con la ayuda de un emulsionador de turbina Silverson.

\newpage

Una dosis de vacuna contiene 10^{7.5} TCID50 aproximadamente. El volumen de una dosis de vacuna es de 2 ml para la administración por vía intramuscular.

Esta vacuna se usa en el programa de vacunación contra el síndrome multisistémico de emaciación en combinación con la vacuna Parvovax®.

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Ejemplo 19

Los resultados de inmunofluorescencia indirecta en relación con las cepas del virus PCV de EE.UU. y Francia y del contaminante PK/15 con un suero hiperinmune (PCV-T), un plantel de anticuerpos monoclonales F99 preparados a partir de PK/15 y un suero hiperinmune preparado a partir de la cepa de Canadá (PCV-C)

5

*

\begin{minipage}[t]{140mm} recíproco de la última dilución del suero o del anticuerpo monoclonal que da una reacción positiva en inmunofluorescencia indirecta. \end{minipage}

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Ejemplo 20

Producción experimental del síndrome multisistémico de emaciación porcino - protocolo 1

Lechones gnotobióticos de tres días de edad obtenidos por cesárea y mantenidos en una unidad de aislamiento fueron inoculados con disoluciones del virus PCV. Los virus PCV de tipo II usados eran el aislado Imp. 1010 y el virus obtenido a partir de homogeneizados de nódulo linfático obtenidos de cerdos enfermos.

Se formaron cinco grupos. Todos los lechones fueron inoculados a la edad de tres días por vía oronasal con 1,5 ml de disolución vírica según el esquema siguiente:

6

Resultados de la exposición experimental

Durante el periodo de observación de 5 semanas, los lechones no desarrollaron signos clínicos, aparte de un animal en el grupo B que presentó un agotamiento importante. Tras la autopsia, los cerdos de los grupos A, B y C presentaban hiperplasia de los nódulos linfáticos (tamaño de 2 a 10 veces superior que los animales de los grupos D y E), en particular de los ganglios submaxilares, bronquiales, mesentéricos, ilíacos y femorales. Esta hiperplasia está ligada a una expansión considerable de las zonas corticales por infiltración por monocitos y macrófagos.

Los lechones de los grupos A, B y C también presentan hiperplasia del tejido linfoide bronquial.

Un lechón de cada uno de los grupos A, B y C presenta neumonía.

El lechón del grupo B, que presentaba un agotamiento sustancial, y un lechón grupo A tienen una úlcera gástrica.

Además, todos los animales de los grupos A, B y C presentan miocarditis, hepatitis multifocal con infiltración de linfocitos, macrófagos y eosinófilos, así como nefritis intersticial cortical y medular.

Un lechón de grupo C tiene un hígado cuyo tamaño es superior al normal, con focos claros diseminados en su superficie.

No se observó lesión en los lechones de los grupos D y E.

El circovirus se aisló de los órganos de cerdos de los grupos A, B y C.

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Ejemplo 21

Reproducción experimental del síndrome multisistémico de emaciación porcino - protocolos 2 y 3

Lechones convencionales, pero aislados de su madre desde su nacimiento, fueron inoculados con disoluciones víricas del PCV de tipo II, de parvovirus porcino, o con una mezcla de los dos virus.

Los virus PCV de tipo II usados fueron los aislados Imp. 1010 e Imp. 1011 (cepa 48121).

El virus PPV usado es un aislado de origen canadiense, el Imp. 1005. Este virus tiene una secuencia (1/3 del genoma secuenciado) que es idéntica a la de otras cepas de parvovirus porcino conocidas (cepa NADL-2 de PPV y cepa Kresse).

Se llevaron a cabo dos protocolos experimentales.

Protocolo 2

Se formaron tres grupos con lechones de 3 días de edad. Todos los lechones fueron inoculados por vía oronasal con 1 ml de disolución vírica según el esquema siguiente:

7

Resultados de la exposición experimental

Grupo A:

2 lechones murieron 21 días después de la inoculación y un lechón fue sacrificado 24 días después de la inoculación.

Grupo B:

1 lechón murió 23 días después de la inoculación y un lechón fue sacrificado 24 días después de la inoculación.

Las autopsias llevadas a cabo sobre los lechones que murieron después de una infección mostraron la presencia de lesiones macroscópicas importantes: presencia de fluido en la cavidad pleural, edema pulmonar, hemorragias en los riñones, lesiones blanquecinas en forma de cabeza de alfiler en los riñones, necrosis hepática. Estas lesiones son idénticas a aquellas observadas en los casos de campo.

Las autopsias llevadas a cabo sobre los lechones sacrificados no mostraron lesiones macroscópicas.

Los exámenes histológicos realizados sobre los órganos extraídos de los lechones de los grupos A y B que murieron después de una infección, así como en los cerdos sacrificados en estos 2 grupos, mostraron un patrón típico y completo de las lesiones del síndrome multisistémico de emaciación porcino que se observan en animales en el campo: necrosis hepática, necrosis de los nódulos linfáticos, necrosis pancreática, necrosis focal y hemorragias severas en los riñones, presencia de sincitios en los pulmones, necrosis severa de los hepatocitos con la presencia de inclusiones nucleares. Se debe indicar que se encontró una cantidad masiva de antígeno PCV en todas las lesiones (cerdos muertos o sacrificados), pero que la presencia del antígeno PPV no pudo ser detectada en estas mismas lesiones.

No se pudieron detectar lesiones en los lechones control en el grupo C.

Protocolo 3

Se formaron cuatro grupos con lechones de 4 semanas de edad. Todos los lechones fueron inoculados por vía oronasal con 1 ml de disolución vírica según el esquema siguiente:

8

Resultados de la exposición experimental

1 lechón "control" y 2 lechones de cada grupo experimental (B, C y D) fueron sacrificados y se sometieron a autopsia 2 semanas después de la inoculación. Se observaron lesiones inmunohistológicas importantes en los dos lechones del grupo D (co-infección de PCV + PPV). Se debe indicar que no fue posible detectar la presencia de parvovirus porcino en estas lesiones, aunque se observó una seroconversión en relación al parvovirus porcino en todos los cerdos del grupo D. No se pudo observar lesión macroscópica o histológica en el lechón control y en los lechones de los otros grupos. Por tanto parece que la combinación PCV + PPV hace posible reproducir lesiones histológicas típicas del síndrome multisistémico de emaciación porcino.

Siguiendo estos dos protocolos experimentales, se puede observar que la inoculación del PCV solo, en forma de mezcla de PCV + PPV, da lugar a una reproducción más o menos severa del síndrome multisistémico de emaciación porcino, pero sólo se puede detectar el circovirus porcino en las lesiones. En contraste, una infección experimental con PPV solo (grupo B del protocolo 3) no permite que se induzcan lesiones macroscópicas o histológicas; no obstante, en presencia del PCV, la aparición de las lesiones se observa en los cerdos de 4 semanas de edad (grupo D del protocolo 3).

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9918214 A [0006]

\bullet WO 9421797 A [0041]

\bullet WO 9803658 A [0017]

\bullet WO 9520660 A [0041]

\bullet WO 9420071 A [0030]

\bullet WO 9307898 A [0045]

\bullet US 5422109 A [0030]

\bullet WO 9418311 A [0045]

\bullet WO 9416681 A [0032]

\bullet FR 2709966 A [0045]

\bullet US 4745051 A [0039]

\bullet EP 597852 A [0045]

\bullet WO 9011092 A [0041]

\bullet EP 550477 A [0045]

\bullet WO 9319813 A [0041]

\bullet EP 571648 A [0045]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bulletTodd et al. Arch Virol, 1991, vol. 117, 129-135 [0003]

\bullet B. M. Meehan et al. J. Gen. Virol, 1997, 221-227 [0004]

\bulletGupi P. S. Nayar et al. Can. Vet. J, 1997, vol. 38, 385-387 [0004]

\bulletClark E. G. Proc. Am. As.soc. Swine Prac., 1997, 499-501 [0004]

\bulletClark E. G. Proc. Am. Assoc. Swine Prac., 1997, 499-501 [0005]

\bullet La Semaine Vétérinaire No. 26, 1996 [0005]

\bullet La Semaine Vétérinaire, 1997, 54 [0005]

\bulletGupi P. S Nayer et al. Can. Vet. J, 1997, vol. 38, 385-387 [0005]

\bullet P. Vannier; A. Laval. Point. Vét., 1993, vol. 25 (151), 53-60 [0017]

\bullet G. Florent et al. Proceedings of the Ninth Congress of Pig Veterinary Society, 15 July 1986 [0017]

\bullet Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach. Plennum Press, 1995, 210 [0030]

\bulletBovarnik et al. J. Bacteriology, vol. 59 (509), 950 [0033]

\bullet C. Charreyre et al. Proceedings of the 15th IPVS Congress, 05 July 1998, 139 [0045]

\bulletAllan G. et al. Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol., 1995, vol. 44, 49-64 [0051]

\bulletTischr 1. et al. Arch. Virol., 1987, vol. 96, 39-57 [0054]

\bulletMeehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses. J. Gen. Virol., 1997, vol. 78, 221-227 [0057]

\bulletSambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0057]

\bulletTodd. D. et al. Dot blot hybridization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol., 1991, vol. 29, 933-939 [0069]

\bulletHirt B. Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures. J. Mol. Biol., 1967, vol. 36, 365-369 [0069]

\bulletMolitor T. W. et al. Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates. Virology, 1984, vol. 137, 241-254 [0069]

\bulletTodd et al. Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol., 1990, vol. 71, 819-823 [0070]

\bulletMeehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA; affinities with plant circoviruses, 1997, vol. 78, 221-227 [0070]

\bulletSambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0071]

\bulletAltschul et al. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403-410 [0086]

\bulletMeehan et al. J. Gen. Virol., 1997, vol. 78, 221-227 [0091]

\bulletMankertz et al. J. Gen. Virol., 1998, vol. 79, 381-38d [0091]

\bulletMeehan et al. Arch. Virol., 1992, vol. 124, 301-319 [0092]

\bulletMeehan B. et al. Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: séquense analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome fragments. Arch. Virol., 1992, vol. 124, 301-319 [0094]

Claims (17)

1. Preparación antigénica dirigida contra el síndrome multisistémico de emaciación porcino, que comprende antígeno de circovirus porcino y antígeno de parvovirus porcino; en el que comprende antígeno de circovirus porcino de tipo II.

2. Preparación según la reivindicación 1, en la que el antígeno de circovirus porcino de tipo II es un antígeno de un circovirus seleccionado del grupo constituido por las preparaciones depositadas en la ECACC bajo las siguientes referencias:

-

Nº de acceso: V97100219

-

Nº de acceso: V97100218

-

Nº de acceso: V97100217

-

Nº de acceso: V98011608

-

Nº de acceso: V98011609.

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3. Preparación según la reivindicación 1 ó 2, en la que el antígeno de circovirus porcino y el antígeno de parvovirus porcino comprenden, independientemente el uno del otro, un antígeno seleccionado del grupo constituido por un antígeno vivo completo atenuado, un antígeno completo inactivado, una subunidad de un antígeno, un vector vivo recombinante capaz de expresar dicho antígeno y un vector de ADN capaz de expresar dicho antígeno.

4. Preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que comprende, además, otra valencia que corresponde a otro patógeno del cerdo.

5. Preparación según la reivindicación 4, en la que comprende otra valencia seleccionada entre el grupo constituido por el virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, rinitis atrófica, Pseudorabies, cólera del cerdo, gripe porcina y sus combinaciones.

6. Preparación según la reivindicación 4, en la que comprende otra valencia que es el virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino.

7. Vacuna contra el síndrome multisistémico de emaciación porcino, que comprende una cantidad eficaz de una preparación antigénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario.

8. Vacuna según la reivindicación 7, en la que comprende un adyuvante aceptable desde el punto de vista veterinario.

9. Vacuna según la reivindicación 7 u 8, en la que comprende antígenos de diversos circovirus porcinos.

10. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que comprende antígeno de circovirus porcino codificado por un marco de lectura abierto de circovirus seleccionado entre el grupo constituido por los ORFs 1 a
13.

11. Vacuna según la reivindicación 10, en la que comprende antígeno de circovirus porcino codificado por un marco de lectura abierto de circovirus seleccionado entre el grupo constituido por los ORFs 4, 7, 10 y 13.

12. Vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en la que comprende un vector de expresión seleccionado del grupo constituido por virus vivos capaces de multiplicarse en cerdos sin ser patógenos para el cerdo, y vectores de ADN, este vector de expresión que comprende y que expresa dicho ORF.

13. Vacuna según la reivindicación 12, en la que el vector vírico es un virus seleccionado del grupo constituido por herpesvirus de cerdo, adenovirus porcino y poxvirus.

14. Vacuna según la reivindicación 13, en la que el vector vírico es un virus seleccionado del grupo constituido por el virus de la enfermedad de Aujeszky, virus de la vacuna, virus avipox, virus canarypox, virus swinepox.

15. Kit de vacunación que contiene, empaquetadas por separado, una vacuna contra el circovirus porcino, y una vacuna contra el parvovirus porcino; en la que dicha vacuna contra el circovirus porcino comprende un antígeno de circovirus porcino como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14.

\newpage

16. Una preparación antigénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 para su uso en la preparación de una composición farmacéutica.

17. Uso de una preparación antigénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del síndrome multisistémico de emaciación porcino.