HU227805B1 - Porcine circovirus and parvovirus vaccine - Google Patents

Porcine circovirus and parvovirus vaccine Download PDF

Info

Publication number
HU227805B1
HU227805B1 HU0102770A HUP0102770A HU227805B1 HU 227805 B1 HU227805 B1 HU 227805B1 HU 0102770 A HU0102770 A HU 0102770A HU P0102770 A HUP0102770 A HU P0102770A HU 227805 B1 HU227805 B1 HU 227805B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
porcine
vaccine
antigen
virus
pigs
Prior art date
Application number
HU0102770A
Other languages
English (en)
Inventor
Gordon Moore Allan
Brian Martin Meehan
John Albert Ellis
George Steven Krakowka
Jean-Christophe Francis Audonnet
Francis Mcneilly
Original Assignee
Merial Sas
Univ Belfast
Univ Saskatchewan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merial Sas, Univ Belfast, Univ Saskatchewan filed Critical Merial Sas
Publication of HUP0102770A2 publication Critical patent/HUP0102770A2/hu
Publication of HUP0102770A3 publication Critical patent/HUP0102770A3/hu
Publication of HU227805B1 publication Critical patent/HU227805B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/815—Viral vaccine for porcine species, e.g. swine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Sertésircovirus-antigént és sertésparvovirusantigént tartalmazó vakcina
A találmány tárgya· a PWS-tünategyaétes: („Poréin© Múlfiaystérnie Ffest.ing Syndrone azaz sertések multiszisztémás sorvadás tünetegyéttese, más néven POSt~W&&n.ing Malii sist&xác Maszlag SyndroaaM azaz elválasztott malacok cireovírus okozta mu.itiszisztémás sorvadása} elleni vakcina .
Közelebbről/ a találmány tárgyát antigénkészítmények képezik PHWS-tanetegyüttes ellen, amelyek sertéscircovlrusantlgént - előnyösen I.T.~es típusú eireovirusa.n.t igent ~ és sertéspsrvovírus-antigént tartalmaznak; az antigenkészitményt tartalmazó vakcinák; valamint sertéscircovlrus elleni vakcinát és ser tésparvovirus elleni vakcinát tartalmazóvakc in ázó kés z 1 e te k.
Az alábbiakban különböző dokumentumokat idézünk, és az idézett domumentarnokban különböze további dokumentumokra hivatkoznak vagy idézik őket. Semmilyen formában nem. ismerjük el azonban, hogy az idézett dokumentumok bármelyike bármilyen vonatkozásban újdouságrontö lenne a találmányra nézve. Valamennyi idézett dokumentum, és valamennyi/ az idézett dokumentumokban idézett vagy azokban hivatkozásként szereplő dokumentum teljes terjedelmében a ki tani. tás részét képez i.
Aktaszámunk: 93654-2709/PÁ
A. PCV-t {„Porcine Cí.rcoVirassertéscircovírast} eredetileg nem-cítopatogén kontaminánsként azonosították PK/15 elnevezésű sertés vesesejtvonalakban. A vírust a Círcovíridae nemzetségbe sorolták a csirkék vérszegénységét okozó vírussal {„ebieken Anaeraia Vírus; CAV) és a PBFDVvírussal {„Psittaoíne S-esJi and Feather Disease Aires; a papagájok psittacína családjához' tartozó madarak csőr- és tolibetegségét okozó vírussal) együtt. A vírusok kisméretű. (15-24 nm) f külső burokkal, nem-rendelkező vírusok, amelyek közös jellemzője, hogy cirkuláris, egyszálú, 1,76-2,32 kb méretű DKS-genomot tartalmaznak. Először úgy vélték, hogy a genom mintegy 30 kDa poiipeptidet kódol [Todd és mtsai.: Areh, 'Virol. 117, 129 (1991) ) . Újabb vizsgálatok szerint azonban, a vírusgénem transzkripciója sokkal összetettebb (Meéhan B.M. és mtsai.: J. Gén. Virol. 78, 221 {1397}].
Ezen felül, a három ismert circpvírustípus nukleotidszekvenciájában vagy közös antigéndeterminánsaiban nem sikerül jelentős fokú homológíát kimutatni.
A PK/15-sejtekbe1 származó PCV-t nem tekintik patogénnek. A vírus szekvenciája ismert [Meehan B.M. és mtsai.: J. Gén. Virol. 78, 221 {1997}]. Csak a legutóbbi időben merült fel egyes szerzőkben annak lehetősége, hogy PCV-törzsek patogéirek lehetnek, és azok kapcsolatba hozhatók a PAKStünefcegyöttessei [Gupi P.o. Mayar és mtsai.; Can Vet. J.
38, 385 {1997}; valamint Clark F,G. : Proc. Am. Ásson. Swine
Prac. 949 {1997}]., Kavar és munkatársai PCV-DMS-t mutattak ki PCR-aijárassal PC7JS-tüneteggyüt tssbexi szenvedő sertésekben. A Kanadában, Egyesült Államokban és Franciaországban ·♦* * ♦ előforduló PMWS-tünetegyüttest klinikailag fokozatos súlycsökkenés, valamint tachypnoe (szapora légzés), dyspnoe (nshézlégzés) és sárgaság jeliejazld Patológiai szempontból, a betegséget lliafocités vagy granuloci tás beszörődések, nyirokcsomő-megnagyobbodás, ritkábban májgyulladás íhepatitis) és Íimfocitás vagy grannios&atosus nephritis jellemzi {Clark E.G..: Proc, Am. Assoc. Swine Prac. Ό9 (1997); La Sémainé Vétsrinaire 26, La Semaine Vétérinaire (supl.) 834 (1996); 8S7, 54 (1997); La Séma iné Vétérinaire 54, 857 (1997); Gupí P.S. Kavar és mtsai.; Can Vet. J. L8, 385 (1997) ) .
öt új PGV-törzset sikerült izolálnunk tüdő- vagy nyi~ rokcüsomómintákbói, Kanadából, az Egyesült Államokból· (Kaliforniából) es Franciaországból (Brítanny) származó gazdaságokból. A vírusokat PMWS-tünetegyüflesben szenvedő sertések károsodott szöveteiben mutattuk ki, de egészséges sertésekben nem.
A törzsek közül négy genomját msgszekvenáituk, nevezetesen, a Kanadából, Egyesült Államokból, származó törzsek és két Franciaországból származó törzs genomját. A. törzsek nukelotidszinten nagyfokú., 96%-ot meghaladó homológiát mutattak egymással, és sokkal kisebb fokú - mintegy 76% ~ homolőgiát mutattak a PK/15-törszsel. Áz új törzsek tehát a sertésolrcovirusok új típusa képviselőinek tekinthetők, amelyeket a továbbiakban 11-es típusú czreovirusoknak nevezünk, szemben a PK/ld-törzs által képviselt l-es típusú vi♦·* « »
Az öt törzs tisztított Mintáját a mikroorganizmusok szabadalmi, eljárás céljából történő letétbe helyezésének nemzetközi elismeréséről szóló Budapesti Szerződés érteimében 1997 október 2»~án (csütörtöki napon,
V971G02I9 fa leírásban lmp.1008 PCV);
V971002I8 ja leírásban Imp.1010 PCV); és
V97100217 (a leírásban lmp.999 PCV) nyilvántartási számokon, és
1998 január 16.-án (pénteki napon)
V98011608 (a leírásban imp,1011-48 285);
V93Q1I609 (a leírásban Imp. 1011-48 121) ; nyilvántartási számokon letétbe helyzetük az ECACC („European Colleotion of Cell Cultures, Centre of Applied Microbiolgy &. Research, Porton Dewn, Salisbury, Wíitshire SP4 00G, Egyesül Királysáp) gyűjteményében.
Megfigyeltük, hogy amikor a választott sertések multiszisztémás sorvadásának tünetegyüttesét próbáltuk reprodukálni, a sertésparvovirus kombinálása sertéseitcovírussal a betegség tüneteinek súlyosbodásához vezetett.
A találmány tárgyát tehát sertések vakcinázása képezi sertéscircovirus, közelebbről I-es vagy ΙΙ-es típusú, előnyösen ll-es típusú clrcovírus és sertésparvovirus kombinációjának alkalmazásával» Nyilvánvaló, hogy a vakeznázás végezhető bivaiens vakcinával, vagy sertéscircovirus-vakcina és sertésparvovirus-vakcina sertéseknek történő egyidejű beadásával.
Referencia-parvovírustőrzőként a .NABü-2-törzset alkalmaztuk, amely VR-742 nyilvántartási számon hozzáférhető az
ATCC gyűjteményéből, Sertésparvovlrusok elleni vakcinázás szakember számára jól ismert, ás sertésparvovírus elleni vakcinák a kereskedelemben hozzáférhetőek, Megemlíthetők például a Parvovax® {sertésparvovírus okozta betegség elleni Inakéiváit vakcina, forgalmazza a MERIAL}. Lásd még a következő szakirodalmi helyeket: Vannier ?, és havai A. :
Poínt Vét. 25í151), 53 (1993); Elorent G. és mtsai,: Proceedings of the Ninth Congress cf Pig veterinary society, 193 6 július 15--18., Barcelona, Spanyolország. DNSvakcina leírását találjuk például a WG~A~93 03 653 számú nemzetközi közzétételi iratban.
A találmány tárgyát képezi tehát FMdS-tünetegyüttes elleni aniígénkészítmény, amely legalább sertéscircovirusantigént (előnyösen 11-es típusé circovirus-antigéntί és legalább egy sertésparvovirus-antigent tartalmaz. A találmány szerinti megoldással összhangban, a sertésparvovirnsantigén (előnyösen ΙΙ-es típusú circovirus-antigén) és a seréésparvovirus-antigén - egymástól függetlenül ~ lehet attenuált, élő teljes antigén; inaktívált teljes antigén; alegység~antigén; rekombínáns, elő vektor; vagy DNS-vektor. Világos, hogy a találmány szerinti kombinációban bármely alkalmas antigén vagy antigénkészitmény-forma aikaima.zhatö; nyilvánvaló, nogy adott kombináció esetében nem szükségszerűen kell ugyanazt a formát alkalmazni. Az antigénkészitmeny tartalmazhat még állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagot vagy kötőanyagot, valamint - adott esetben - áiiatgyőgyászatilag elfogadható adjuvánst.
A találmány tárgyát képezi továbbá ísamnnogén készítmény vagy vakcina PMWS-tünstegyüfctes ellen, amely hatásos mennyiségű circovixus- és parvo’/lrusant igén--kés zi tményt tartalmaz állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagban vagy kötőanyagban, valamint - adott esetben - állatgyógyászati szempontból elfogadható- adjuvánst tartalmaz. Immunogén készítmények immunválaszt váltanak ki, amely lehet protektiv, de ne® szükségszerűen az. Vakcínakészltmények protektiv választ váltanak ki . Ennek megfeleiden, „immunogén készítményen'' többek között vakcina'készítményt értünk (mivel az lehet protektiv készítmény).
A találmány tárgyát képezi továbbá immunológiai reagenskészie-t vagy vakcinázökésziet, amely - külön csomagolva - a sertéscircovirus elleni antigénkészítményt vagy Immunogén készítményt vagy vakcinát; valamint -sertésparvovírus elleni antigénkéözltményt vagy immunogán készítményt vagy vakcinát tartalmaz. A készlet az antigénkészitmeny vagy immuno gén készítmény vagy vakcina fent ismertetett különböző jellemzőit viselheti.
Az említetteken felül, a találmány tárgyát képezi eljárás PMW5-tünetegyüttes elleni immunizálásra vagy vakcinázásra, amely szerint a sertéscircovirus elleni immunogén készítményt vagy vakcinát és a sertésparvovírus elleni immunogén készítményt vagy vakcinát adunk be; vagy bivalens immunogén készítményt vagy vakcinát adunk be, amely - ugyanabban a formulában - az egyes vírusokra specifikus antigénkés zítményt tastaimaz. Az immuné zárási vagy vakcinázásl eljárásban előnyösen a fenti vakcinákat alkalmazunk.
A találmány tárgyát képezi továbbá, a fenti, parvovírus elleni antígénkészítmény vagy immunogén készítmény vagy vakcina alkalmazása - a círoovlrus elleni antigénkészítaiénnyel vagy immunogén készítménnyel. vagy vakcinával kombinálva - PMWS-tíhaetegy'uttes megelőzésére szánt gyógyászati készítmény előállítására.
Círoovlrus antigénkészítmények előállításához a circovirusokat sejteken, például sejtvonaiakon, közelebbről ΡΚ/15-sejteken passzáijuk. A tenyészet felülászóját vagy extraktumát - adott esetben ismert tisztítási eljárásoknak alávetve - alkalmazhatjuk antigénkészítményként.
Attenuált antígénkészltmények és attenuált immunogén készítmények vagy vakcinák vonatkozásában, az attennálódást ismert eljárásokkal érhetjük el, például sejteken, előnyösen sertéssejteken, közelebbről, sejtvonaiakon, például PK/IS-sejteken végzett passzáiással (például 50-150 passzálássál, közelebbről íOO-as nagyságrendbe eső passzáiással. Ál. taláros Ságban, ezek as ímmnnogén készítmények és vakcinák állatgyógyászatiiag elfogadható hordozóanyagot vagy hígítóanyagot, adott esetben állatgyógyászatiiag elfogadható adjuvánst, valamint - szintén adott esetben - lioriiizáié stabilírátört tartalmaznak.
Előnyösen, az antígénkészitméuyek, immunegén készítmények és vakcinák ICl-iCt TClD-so. attenuált vírust tartalmaznak.
Előállíthatunk ínaktiváit, teljes antigén alapú antigénkészítményeket, immunogen készítményeket és vakcinákat is. Az ínaktiváit ímmnnogén készítmények és vakcinák - áliatgyógyászatilag elfogadható hordozóanyagon vagy hígítóanyagon felül állatgyógyászatilag elfogadható adjuvánst is tartalma znak.
A találmány szerinti ciröovítusokat, az esetleg jelen lévő frakciókkal együtt, szakember számára ismert eljárásokkal ínaktiválhatjuk. Az inaktiválást előnyösén kémiai úton végezzük, például úgy, hogy az antigént kémiai végötlettel, például formaldehiddel (formakínnal) , paraíormeldehiddel, β-propiolaktonnal. vagy etiiéuiminnei vagy azok származékaival érintkeztetjűk. Az. inaktiválást előnyösem kémiai vegyülettei, például etiléniminnel vagy β-propialaktannal történő, éríntkeztetéssei végezzük,
Előnyösen, a találmány szerinti inaktivált antigénkészítményeket, inaktivált ímmunogén készítményeket és vakcinákat adjuvással egészítjük ki, előnyösen úgy, hogy azokat emulzió, például viz-az-olajbán vagy olaj-a-vizben- típusú emulzió formájában szereljük ki, szakember számára ismert módon. Az adjuváns sajátság származhat onnét is, hogy szokásos adjuváns vegyüietet adunk az aktiv összetevőhöz,
Adjuvánskéht alkalmazhatjuk például a felsoroltakat: aiumlnínm-hídroxld, szaponlnok (például Quillaja szaponint vagy Quil A; lásd: Vaccihe Designé, The Subunít and Adjuvant Approach, szeri,: koméi Míchael F. és Nswman Mark J., 210. oldal, Plenum Press, New York és Lón dóri íl £195; }? AvrldineA (Vaccine Designé lát. oldal); DDA. ídíxseti 1-dioktadecil-ammónínm-bromid, Vaccine Design 157. oldal); Polyphosphazene (Vaccine Design 2.04. oldal); vagy alkalmazhatunk ásványi olajokon, szkvalénen (mint például DPT emui* * zió; Vaccíne Design 147. oldal; szkva.iénen (például M59; Vaccíne Designé 185. oldal) alapuló olaj~a~vizben típusú emulziókat; vagy viz-az-olajban típusú emulziókat# például metaboiizáíhatö olajokon (előnyösen, a. WA--A.-94 20071 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett olajokon) alapuló, valamint az US-A-5 42.2 109. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett emulziókat. Alkalmazhatjuk adjuvánsok kombinációját is, például Avidrineb vagy DDA és valamely emulzió kombinációját.
Az antigénkészítmények, immunogén készítmények és vakcinák előnyösen 10h'-lúí: TCIDsx inaktivált teljes vírust tartalmaznak .
Az élő vakcinák esetében, adjuvánsként alkalmazhatjuk as .inaktivált készítmények esetében felsoroltakat. Előnyösen emulziókat alkalmazunk. Az inaktivált vakcináknál említetteken télül, alkalmazhat juk a (70-11-94 16 681 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetetteket.
Liofilízálö stabilizátorként, alkalmazhatjuk például a következőket: SPGA (Bovamik és mtsa.í.; u. Bacteríology 69, 509 (1950); szénhidrátokat, például szorbitot, mannitot, keményítőt, szacharózt, dextránt vagy glükózt; proteineket, például .albumint vagy kazeint; a fenti vegyületek származékait; vagy puftereket, például alkálifém-foszfátokat.
A találmány szerinti antigenkészítméuyek, immunogén készítmények és vakcinák aktív összetevőként (összetevőkként) (antígénként/antígénekként) egy vagy több, találmány szerinti eircovírus- vagy parvovirus-antigént tartalmazhatnak.
A II-es típusú. sertéscircovirus-izolátumok közül négy genoxaját meghatároztuk, és· azok szekvenciáját az 1-4. azonositöszámű szekvenciákon adtak meg. A PK-l5~tÖrzs szekvenciáját az S. a zono-si tő-számú szekvencián mutatjuk be.
Nyilvánvaló, hogy természetszerűleg a találmány tárgyát képezik egyenértékű szekvenciák, azaz olyan szekvenciák, amelyek nem változtatják meg a szekvencia funkcionalitását vagy törzsspecif itásá-t, vagy a szekvencia által kódolt polipeptídeket. Természetesen, a találmány tárgyát képezik azok a szekvenciák is, amelyek a kód degeneráltságában térnek el a találmány szerinti szekvenciától.
A találmány tárgyát képezik továbbá az egyenértékű szekvenciák abban, az értelemben, hogy azok magas tokban sztríngens körülmények mellett képesek hibridizálőoni a fenti szekvenciával és/vagy magas fokú homoiogiát mutatnak a találmány szerinti törzsekkel.
Szék a szekvenciák és azok fragmentumai, megfelelő vektorok közreműködésével előnyösen alkalmazhatok poiipeptidek in vítro vagy in vivő expresszáltatására.
Közelebbről, a fenti célra alkalmazható, találmány szerinti DNS-fragmentumokat képező nyitott olvasási, fázisokat jOKFl-13) II-es típusú circovirusok genomi. szekvenciáján azonosítottuk. A találmány bármely poiioeptidre vonatkozik, amely legalább egy ilyen nyitott olvasási fázist sa megfelelő amínosav-szekvenciát} tartalmaz. Előnyösen, a találmány tárgyat képezi lényegében, az ORFi, 0RF7, OP.FIO vagy 7RF.17 nyitott olvasási fázist tartalmazó: protein.
Alegységek in vit.ro expresszáitatására E. coli vagy baculovirus vektorokat alkalmazhatunk flásd az US--A4 745 051 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást;· . A kódoló szekvenciát (szekvenciákatí vagy azok fragmentumait a baculovírus-genomba (például Autogr,api.a caiifornica nukleáris poliherdrózbsvírus; AcKPV baculovírus genomjába) építhetjük, és az utóbbit rovarsejteken (például opodpptera .frugiperda őf3~sséteken (ATCC CRL 1711} szaporíthatjuk. Az. alegységeket előállíthatjuk továbbá eukarióta sejtekben, például élesztősejtekben (például Sacharoroyces c ere vési a e sejtekben) vagy emlőssejtekben (például CHOvagy BHK-sejtekben).
Az említetteken felül, a találmány tárgyát képezi a fenti módon, in vii.ro expresszáltatott, és ~ adott esetben - ismert eljárásokkal tisztított polipeptidek alegységekként történő alkalmazása, Az alegység típusú immunogén készítmények és; vakcinák legalább egy ily módon előállított polipeptídet vagy fragmentumot tartalmaznak állatgyógyászatiiag elfogadható hordozóanyagban vagy hígítóanyagban, továbbá - adott esetben - áliatgyögyászatilag elfogadható adjuvánst tartalmaznak.
Amennyiben rekombináns., élő vagy Dd'S-típusű iemogén készítményeket vagy vakcinákat kívánunk előállítani az antigének ín vivő erpresszáltatásával, a kódoló szekvenciát (szekvenciákat) vagy azok fragmentumait alkalmas expressziős vektorba Integráljuk, úgy, hogy a polipeptíd(ek) expresszálődhasson (expresssálédhassanak) , Előnyösen, élő vektorokként alkalmazhatunk élő vírusokat, előnyösen sortésebben szaporodni képes, és sertésekre nem-patogén (természetesen nem patogén vagy azzá alakított) vírusokat, szakember számára ismert eljárásokkal. Közelebbről, alkalmazhatunk sertésekben szaporodni képes herpesvírusokat, például sz Aujeszky-betegség vírusát, sertésadenovirust, himlővírusokat, elsősorban vaccíniavírust; madárhímlö-ví.rust; kanárihímiö-vírust, vagy sertéshímlc-vírust. Vektorokként alkalmazhatunk DNS-vektorokat ís. (lásd például a WO--A90 11 092, WG-A-S3 19 813, WO-A-94 21 79? és WO-A-95 20 660 számú nemzetközi közzétételi iratokban, ismertetetteket).
Ugyancsak a találmány tárgyát képezik a vektorok és a fenti módon előállított, rekombináns, élő vagy DNS- (poiinukleotid) típusú immunogén készítmények vagy vakcinák; azok előállítása és alkalmazása; valamint állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagot vagy higitóanyagot is tartaimaző immunogén készítmények és vakcinák.
Definíció szerint, DNS-típusú immunogén készítmények DNS-vektort tartalmaznak, amely lehet antigénhatású poiipeptidet kódoló nukleotidsze-kvenciát magában foglaló és in vivő expresszáió cirkuláris vakcinázó plazmid, szuperspiralizáit vagy egyéb formában, vagy lineáris DNS-molekula.
hekoíóbináns és DNS-típusú immunogén készítmények és vakcinák adjuvánst ís tartalmazhatnak.
Kombinált immunizálási vagy vakcinázásí programok vonatkozásában, a s.ertéscircovirus és sertésparvovirus elleni immunizálást vagy vakcinázást kombinálhatjuk más sertéspatogénnei, közelebbről, a PMbS-tünetegyüttessei kapcsolatba hozható patogénekkel szembeni iiiímunizálással vagy vakolná♦ *
zással. Ennek megfelelően, a találmány -szerinti immunegén készítmény vagy vakcina tartalmazhat további ssrtéspatogénnek megfelelő egyéb valenciát, példát1 a következők közül: PRRS („ Porci.n-e Repródattory and Kespo.ra tory őyndrome; sertések reproduktív- és légzőszerv! tünetegyüttesét okozó vírus) és/vagy Hycoplesma hyopmeumoníae, és/vagy .5. coli és/vagy atrófiás orrnyálkshártya-gyulladás vírusa és/vagy rseadorabíeo (Auje-szky~fél,e betegség) vírusa és/vagy sertés influenza-vírus és Actinobacíllus plearopneamoniaa és/vagy sertéskolera; valamit a felsoroltak kombinációja. Előnyösen, az ímmunizációs vagy v&kcirxázási programokban és a találmány szerinti vakcinákban a circovirts és parvoví.rus elleni immunizálást vakcinázást. RRRS elleni (lásd WO-A93/07 .39β és WO“-A-3é/18 311 számé közzétételi iratok, FR-a2 703 960 számú szabadalmi bejelentés; Charterre és mtsai.: Proceedings of the 15,;h IPVS Co-ngress; Birmingham, Anglia, 137, oldal (1998 július 5-9.(j, Mycoplasma. hyopneumoniae elleti (ER-A-597 852, EP-A-550 477 és ΕΡ-Ά-571 648 számé európai szabadalmi bejelentések; Proceedings of the i5C;' 1PVS Co-ngress; Birmingham, .Anglia, 139. oldal (1998 július 5-9.)], Martinon 0. és mtsai.: 157., 284, és 285. oldal; Reynaud -G. és mtsai.: 150. oldal) és/vagy sertésinfIuenza elleni vakcínázással kombináljuk. Immunogén készítmények vagy vakcinák bármely formáját, elsősorban bármely kereskedelemben hozzáférhető vakcinát kombinálhatjuk a sertéscircovirns és sertésparvovirus elleni immunogén készítménnyel vagy vakcinával.
* 4 * A « »
Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezik muitivalens immunogén készítmények, és vakcinák, multivalens vakcinázökészletek, és kombinált immunízácíós vagy vakcinázásl eljárások, amelyek lehetővé teszik ilyen kombinált immun!záciős vagy vakcinázásl programok alkalmazását.
Miután a találmány szerinti megoldást általánosságban ismertettük, a továbbiakban azt konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
A leírásban utalunk a csatolt ábrákra, amelyeket a következőkben ismertetünk:
Az .1. ábrán az Imp 1011-43 121-törzs genom j ának szekvenciáját mutatjuk be.
A 2. ábrán az Iiap 101.1-48 285-törzs genomjának szekven-
éráját mutatjuk be. Imp 333-törss genomjának szekvenciáját
A 2. ábrán az
mutatjuk be.
A 4. ábrán az nap 1010-törzs genomj ának szekvenciáját
mutatjuk be.
Az S . a.oran a. z ; 1-4. ábrákon bemutatott szekvenciákat
vetettük össze a PCV FK/15-törzs szekvenciájával.
A szekvenciülíütában megadott szekvenciák ismertetése: Az 1. azonosítószámú szekvencián az !mp 1011-48 121törzs genomjának DNS-szekvenciáját mutatjuk be.
A 2. azonos!tőszómé szekvencián az !mp 1011-43 222törzs genomjának DNS-szekvenciáját mutatjuk be.
A 3. azonositószámú szekvencia az Imp 333-törzs g e n om. j ának DN S - s z e kve n c i a j á t képviseli.
& 4. azonosítószámú szekvencián ez Imp 1010-törzs geHonijának öNS~szekvenciáját adtak meg.
Az 5. azonosítószámú szekvencián a PK/iö-törzs genomjárnak DMS-szekvenciáját mutatjuk be.
1. példa
A sertéscircovirus-törzs tenyésztése és izolálása
Szövetmintákat Franciaországban, Kanadában és az USAban gyűjtöttünk sertések tüdejéből és nyirokcsomóiból . Ezek a sertések választott sertések multíszísztémás sorvadására jellemző klinikai tüneteket mutattak. A vírusok Izolálásának megkönnyítésére/ szövetmintákat a boncolást követően azonnal, -70°C-ori lefagyasztottuk.
A. virusizoláláshöZ/ körülbelül 15% szövetmintát tartalmazó szuszpenzíókat készítettünk Earle-féie sokat (EKEM, BioWhittaker UK Ltö,, Uokingham, UK; , penicillint (100 Xü/ml; és streptoiaycint (Űuö pg/mlj tartaimaző minimáltápközegben (MÁM~SA-tápközegben} oly módon, hogy a szöveteket steril mozsár és mozsártörö alkalmazásával, steril homokkal megőröltük. Az ily módon megőrölt készítményt MÉMSA-tápközegben szuszpendáltuk/ 30 percig, 3000 g mellett, 4öC-on centrifugáltuk, majd a felülúszöt összegyűjtöttük.
Mielőtt a sejttenyésseteket beoltottuk volna, 2-2 ml felülűszöhoz 100-100 ml kloroformot adtunk, és az elegyet 10 percig, szobahőmérsékleten folyamatosan kevertük. Ezután, az elegyet mikrocentrifuga-csőhe vittük át, 10 percig, 3000 g mellet centrifágáltuk, és a felOiűszót összegyűjtőttök. Az így kapott felüiűszőt alkalmaztuk ezután, in-okuluxaként a virusizolálásí kísérletekben.
Valamennyi vlrusizolálás! kísérletet ΡΚ/15-sejteken végeztünk, amely ne® volt kontaxainált sertéscircoví tussal (.PCV-vei) , pesti vírusokkal, sertésadenovirusokkai és sertésparvoví tusokkal [Alian G. és mtsai.; Pathogenesis of porcsiné circovirus experímentsi infections of coiostrumdeprived pigiets and examínation of píg foetal matériái, Vet. Mierobiol. 44, 49 [1995}].
A sertéscircovirxxsokat a következő eljárással izoláltuk:
Egyrétegű, tenyészetben növő ?K/15-sej teket trípszinezéssel <tripszin-versene eleggyel) a folyamatos tenyészetekből szétválasztottunk, és '15%, pestivírussal nemkontamináit fötális bortűszerűmet tartalmazó MEM-S.Atápközegbe .(MEM-G-tápközegbe) vittünk át ügy, hogy a sejtek végkoncentráciéja a sznszpenzióban körülbelül 400 000 sejt/ml legyen. A fenti sejtszuszpenziő 10 mi térfogatú mintáit .2-2. ml, fenti módon előállított ínokuiummai elegyítettük, és a kapott elegyet 6 ml térfogatú mintákra osztottuk két 25 ml-es Faicon-csöbe, Ezeket a tenyészeteket 18 órán át, 37°c~-on, 10% CCy-t tartalmazó atmoszférában inkubáltuk, inkubációt követően, a félig összefolyó tenyészeteket 300 Mmol/i D-ginköza®.innal. (katalógusszám; G48 175; SigmaAldrich Company Limited, Poole, UK) kezeltük [Tisohr 1, és mtsai,; Arch, 'Zirci. 96, 39 81987)}, majd az ínkubálást 4872 órán át, 3?°C--on folytattuk. Ezt az utolsó ínkubálást
követően, az Inckuromot tartalmazó két Ealcon-cső egyikét 3 ai.ka lommal ismételten lefagyasztottuk és felolvasztottuk, A maradék Falcon.....csőben található ΡΚ/15-sejleket trípszinversene eleggyel kezeltük, 20 ml MEM~G~tápközegben szuszpendáltuk, majd 75 om.2 felszíné Faicon-csövekbe oltottuk 400 000 sejt/mi koncentrációban. Ezután, a frissen beoltott palackokat 5-5 ml megfelelő, fagyasztás/olvasztás cikluson átesett lízátommal ''szuperfertőztük .
2, példa
Se ő ttenyészet-mínták___________előállítása s e r t é s c i r cοv í ruso k imrnu nfIuoreszcens vagy__in satu hibridizáciős eijárá ssai történő kimutatására
A „szuperfertözött szuszpenziő 5 ml térfogatú mintáját 55 mm átmérőjű, steril és zsírmentes üveg fedőiemezt tartalmazó retri-csészébe oltottuk, A palackokban és az üveg fedőlemezeken található tenyészeteket 37°C-on inkubáltuk, és glükozamlnnai kezeltük az I. példában ismertetettek szerint. Az üveg fedőlemezeken található tenyészeteket a giüközaminos kezelést követően 24-48 órával összegyűjtöttük, és lő percig acetonnal, szobahőmérsékleten, vagy 4 órán át, 10% puffereit formaldehiddel fixáltuk. A fixálást követően, valamennyi üveg fedőiemezt -70°C-o.n, szilikagélen tároltuk, mielőtt azokat az in sara hibridizációs kísérletekben és az immuné1tekerniai jelölési vizsgálatokban alkalmaztuk volna.
3. példa
Eljárások PCV-szekvenciák ín síin hibridizációs technológiával tört énő .ki műt a fás ára
J.n síta hibridizációt beteg sertésekből, gyűjtött és formaldehiddel fixált szöveteken., valamint a vírus izolálásra beoltott, üveg fedőlemezeken fixált sejttenyészetkészítményeken {lásd 2. példa) végeztünk.
A PK/15 elnevezésű sertéscircovírusoknak (PCV-knek) és a fertőző csirkeanémia vírusnak {„ebieken anaemia vírus; CAvj megfelelő teljes genomi próbákat alkalmaztunk. A pPCVl-plazmidot - amely a PCV-genom replikativ formáját tartalmazza egyetlen, 1,7 kilobázispár (kbp) inszertként klónozva ÍMeeban B. és mtsai,: Segnence of poreine circovirus DNA; aff.in.itles wdfcfe plánt circcviruses, J. Gén. Virul, 73, 221 {19.97)] - alkalmaztuk BC7~virus~DN3 forrásaként. Egy, a bentinek megfelelő, pCAAl elnevezésű, a CAV szárnyas circovirus 2,3 kbp replíkativ formáját tartalmazó plazmidot alkalmaztunk negatív kontrollként. A két plazmidot glicerines törzsienyészetből izoláltuk és tisztítottak az alkalikus lízis eljárás szerint (Sambrook J. és mtsai,:; ..Molecular Cloníng, A Laboratory Manual, 2. kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York {1939)), majd azokat templátként alkalmaztuk a próbák előállítására, A. PCV és a CAV teljes genomját képviselő circcví.ruspröbakát a tisztított plazmidok alapján állítottuk elő <1—1 ug próbát) véletlen bexanukieotid-láncinditók és kereskedelemben hozzáférhető, nem-radioaktív jelöiökész» »* *
- 19 « * ♦ # * ·* ·* » ♦ ♦ * *
Λ * * ♦ « *
4:*.* ** *·»*♦ let („MG DMA. lábéi I ing kit; Boehringer Mannheim, Lewes, UK; alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint eljárva.
A digoxigenin-jelölt próbákat 50-100 p.i steril vízben szuszpendáltnk, majd az in sitt hibridizációs kísérletekben.
alkalmaztuk.
A beteg sertésekből származó, paraffinba ágyazott és fixáit szövetmintákat, valamint a fertőzött, formaldehiddel fixált sejttenyészeteket a következőkben ismertetettek szerint készítettük elő a PCV-nufcleínsav kimutatására:
öt-öt pm vastag metszeteket vágtunk l.e paraffinba ágyazott szövetblokkokböl, azokat paraffinmentesítettük, majd csökkenő koncentrációjú alkoholos oldatokban rehidráltuk, A. formaldehiddel fixált szövetmetszeteket és sejttenyészeteket .15 percig, majd 5 percig, 37°C~onf a. következő összetételű: oldatban inkubáituk; 0,5% profeináz-K; 0,05 moi/i lris-HCi~puffer; 5 mmol/i. ΕΠΤΆ (pH^l, 6) . A fedői eme zeket másodpercre autokiávozott, desztillált vízben 1% glicerint tartalmazó oldatba helyeztük, 0,01 mol/1 P3S-pufterrel (foszfátpufférés fiziológiás sóoldattal; (pH-7,2; kétszer mostuk, végül, 5 percig, steril desztillált vízzel mostuk. Azokat levegőn szárítottuk, és a próbákkal érintkeztettnk.
Mindegyik szövet/prőba készítményt tiszta zsirtalanitott üveg fedolemezzel fedtünk, majd 10 percre, +90*C-os hőmérsékletű kemencébe helyeztünk, ezután 1 percre jégblókkal érintkezhettünk, végül, 13 órán át, 37°C-on inkubál.tunk. Ezt követően, a készítményeket rövid időre 2x koncentrált natrinm-cítrát-sö pufferbe (ESC; pH::::7, 0} merítettük a készítmény védelmét szolgáló üveg fedölemez eitáfc * * * * *. ♦ »fc Α χ X» *·* «β* ♦ ♦ ** * voiltásá.ra.; kétszer, 5-5 percig, 2Χ SSC-puf'ferben mostuk; végül, kétszer, 5~S percig, FBS-pufferben mostuk.
A mosásokat követően, a készítményeket 10 percre a következő összetételű oldatban merítettük:: 0,1 mol/i maleinsav; 0, 15 mtci/i KaCl (pn-7, 5} (maieinátpuríer): ; majd 20 percre, 37öc-on, maleinátpufférben oldott blokkoló reagens (katalógusszám: 103617 6; Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK) 1%-os oldatában inkubáituk.
Ezután, a készítményeket 1 órán át, 1/250 arányban blokkoló pufferben hígított anti-digoxigenin monoklonáils ellenanyaggal (Boehringer Mannheim) inkubáituk 37°C~on; PBS-ben mostuk; végül, 30 percig, 37°C~on, biotinezett antí-egér-immungiöfoulín ellenanyaggal inkubáituk. A készítményeket PB5~ben mostuk; az endogén peroxidás-aktivitást oly módon blokkoltuk, hogy a készítményeket 20 percig- 0,5% hidrogén-peroxiddal kezeltük PüS-ben. A készítményeket PBSpufferre! ismét mostuk, és közvetlenül a felhasználás előtt elkészített 3-amíno-9-dietíikarbasoi (AEG) szubsztráttai kezeltük (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK;.
Miután a készítményeket es.apvi.zzel utóig ára még egyszer mostuk, azokat heamatoxílinnal festettük a háttér megfestésére; csapvizzei színteienítettük, és ragasztóanyaggal (Goé. Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK) mikroszkóptárgylemezre rögzítettük. Kísérleti kentroilókként semleges negatív próbát (CAV) , és pozitív próbát (PCV) alkalmaztunk beteg és egészséges sertésekből származó mintákon.
*
Μ» « *»*Se χ X « .ϊ
4. példa
Ε járások PC V i mmun fluoreszcens technológ iával történő kimut atására
Valamennyi, acetonnal fixált sejttenyészet-készítmény első szűrését indirekt Immunfluoreszcens ÍI1F; eljárással végeztük, kifejlett sertések gyűjtött széruma 1/100 hígításának alkalmazásával. £2 a szérnmelegy 25, észak-irországi kifejlett kocából származott, és az sertésvírusok széles skálája, ezen belül PCV, sertésparvovirus, sertés adenovzrus és PPRS-vírus ellen tartalmazott ellenanyagokat. Az IIF-el járást oly módon végeztük, hogy a szérumot {PB3-pufferben hígítva.) egy érán át, 37°C-on. a. sej itenyészstékké! érintkeztettük, majd PBS-ben kétszer mostuk. Ezután, a sejttenyészeteket sertés immunglobüiín ellen nyülban termelt, fluoreszceín-icotiocianáttai jelölt ellenanyag 1/80 arányú hígításával megfestettük egy órán át; végül·, PüSpufferrel mostuk, giicerinpufPerrel rögzítettük, majd ültraibolyafény alatt mikroszkóposán vizsgáltuk.
5. péi da
A beteg sert és e kb ő1 származó szöveteken végzett in sitv hibridizáció eredményei
A francia, kanadai és kaliforniai, választott sertések multiszisztémás sorvadásának jeleit mutató sertések formaldehiddel fixált szöveteiből származó, PCV genom.1 próba alkalmazásával végzett in olts hibridizáció a léziokkai kapcsolatos PCV-nukleinssvak jelenlétét mutatta a vizsgáló elváltozások egy részében. Nem volt szignál megfigyelhető akkor, amikor a PCV genomi próbát betegség jeleit nem mutató sertésekből származó szöveteken alkalmaztuk, vagy amikor a CAV-próbát alkalmaztuk betegségben szenvedő sertések szövetein. A PCV-uukleinsav jelenlétét számos, a kaliforniai sertések tüdőéiválfcozásait ínfiltráló mononukleáris sejt cítoplazmájában és magjában kimutattuk. Szintén PCV-nukleinsav jelenlétét Igazoltuk a tüdő sejtjeiben, a légcső és a bronehiolusok epitheisejtjeiben, valamint az arterio!ák, venniük és nyirokerek endotheisejtjeiben.
A franciaországi beteg sertések esetében, PCV-nukiéinsav jelenlétét mutattuk ki számos follíkulárís iimfocita cítcpiazmájában, és a nyirokcsomó-szinuszokban található mononukleózis sejtekben. Esetenként, szincícíumokban is PCV-nuklernsav volt kimutatható. A fenti kimutatási vizsgálatok eredményei alapján, kaliforniai sertések tüdejéből, francia sertések mezenteriális nyirokcsomóiból és kanadai sertések szerveiből vett mintákból kísérletük meg uj sertéscircovírus-törzsek izolálását.
á. iáéi. da
Az űj s e r t é s c í r ο ο v 1 r n s -1Ö r z s e k vizsgálata sejttenyészetéri, és kimutatásuk immuntlüoreszoens eljárással
A választott sertések muitiszisztémás sorvadásának klinikai jeleit mutató francia sertésekből vett mintákkal (Imp,iOöS-tŐrzzsel), kaliforniai sertésekből vett mintákkal ;imp,999-törzzsel; és kanadai sertésekből vett mintákkal íImp,1010-törzzsel) beoltott sejttenyészeteken nem volt cítcpátiás hatás cy topa tói o eff'ect , CPS) megfigyelhető.
''•J ,χ <·. s O *'*
X X V A < * * »? « , * *> * * < * «Af · » J. X
Amikor azonban a beoltott sejttenyészetek készítményeit acetonnái végzett fixálást követően - sertésektől nyert poiikionális gyűjtött szérum alkalmazásával, iíamunológiaí eljárással jelöltük, a kaliforniai sertések tüdejéből származó mintákkal (imp,999-törzzsel;, a francia sertések, médiástinálís- nyirokcsomóiból származó mintákkal (Imp. 1008törzzsel) és a kanadai sertések szerveiből származó mintákkal ( l'mp. 101 ö-törzssei} beoltott sej ttenyészetek számos sejtjének magjában fluoreszcencia volt megfigyelhető.
7. példa
Genomi DNS ext raháiása_a sert és ο 1 rcov 1 ruso kbó-1 A sertésoircovírus-törzsek (PCV-törzsek) replikativ formáit fertőzött PK/15~sejttenyószet alkalmazásával állítottuk elő (lásd 1. példa.) (10 darab, 75 erő felszíná Falcon-tenyésztőedényben) oly módon, hogy a tenyészeteket lile órás inkubációt követően összegyűjtöttük és glükóz timinnal kezeltük, a CAV replikativ formájának klónozásánál ismertetettek szerint eljárva [född D. és mtsaí.: 'Bot biot hybridization assay fór ebieken anaemia agént uaing a cloned bdA probe , 01 Clin. Mrcrcbiol. 29, 933 (1391;j. Az igy kapott replikativ forma kettősszálű DNS-ét lényegében Hirt eljárásával extraháltak (Kirí B.: „Seiective extraotion cf polyoma. vírus DbA trón infected coli cuitures, 0. Moi. Bioi. 36, 365 {1361;, Molitor és munkatársai által leírt módosításokkal [Moiitor T.ü. és mtsaí.: Perelne parvevirus DMA: Charaoterization of the genomic and »** ♦ « Jf « <
replicatíve form DNA of two vírus isoiates, viroiogy 137, 241 (1934)1,
Az ....íSlr ® 9 9elnevezésű sertése Ircovlrus --- törzs rep 1.1 táti v formájából nyert génom rést.r 1 k.c 16s térképe
A Hirt eljárásával fenti módon extrahált. D'N'S-t (1-5 pg)
Sl-irukleázzal (Ámersham) kezeltük, a gyártó utasításai szerint eljárva, majd est a DNS-t különböző redukáló enzimekkel emésztettük (Boehringer Mannheím, Lewis, Kast Sussex, UK) , és az emésztéssel kapott termékeket 1,5%-os agarőzgélen, etidium-bromíd. jelenlétében végzett elektroforézissei, lődd és munkatársai által leírtak szerint eljárva szétválasztottuk pPurifieatíon and Bío-chemioal eharaetsrization of ebieken anaemia agent, J. Ges. Virol. 71, 519 (1990)].
Az Imp.999-törzs tenyészetéből extrahált DNS egyedi EcoRIhelyet és két Sasi-helyet tartalmazott, és nem hordozott Pstl-heiyet. Sz a. restrikciós mintázat tehát eltér a PK/15 elnevezésű PCV-törzs mintázatától [Meehan 8. és mtsai.: 'Sequencss of porolna cfroovirus DNA; affinities with plánt círcoviruses a. Gén. Virol. 78, 221 (1997)1, amely az •előbbivel szemben Pete-helyet tartalmaz, és nem tartalmaz
SooRI-helyet.
ί
5, példa
A ζ I mp . 999 e in evez é s ű . s e r t éscircovxrus-törzs genomj ának klónozása
Az Xmp.99'9 elnevezésű. 9CV--törzs kettősszálű replikátÍv formájának EcoRI-emésztésével kapott, mintegy .1,-8 kbp restrikciós fragmentumot 1,5%-os agarözgélen végzett elektroforézíst követően, Qiagen-reagenskésziet alkalma zásával· (őJAEXII gél Bxtraction Kit, katalógusszám: 2-0021, Qiagen. Ltd., Crawiey., West Sussex, UK): izoláltuk -(lásd 3. példa) , Ezt, az EcoKi-EcoRI restrikciós fragmentumot ugyanezen restrikciós enzimmel emésztett és defoszforilezett pGEb-7vektorba (Promega; Medical Suply C-ompany, Dublin, Írország) lígáituk, ismert klónozó technológiák alkalmazásával (Samforook J. és mtsai.: Moleeular Cloning. A Laboratory Manual, 2. kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)3- A kapott plazmidot transzformációval. bscnerichí a coli JM109-gazdasejtekbe juttattuk (Stratagene, La aolia, USA), ismert eljárások szerint. Ezen felni, az Imp.999 elnevezésű FCV-törzs ScoEI-EooRi restrikciós fragmentumát pBuleScript SK;+5-vektorba is klónoztuk (Stratagene Inc., La Holla, USA). Az egyes gazdatörzsek esetében kapott kiőnok közül legalább 2, a várakozásnak megfelelő méretű fragmentumokat tartalmazó kiönt szelektáltunk. Ezután, a kapott kiónokat tenyésztettük, éa az Imp.999 elnevezésű PCV- törzs teljes gsnomját tartalmazó piazmidokat kis térfogatú (2 mi) vagy nagy térfogatú (250- ml) tenyészetből, ismert plazmidizolálásr és -tisztítási technológiák szerint tisztítottuk.
fc « * « lö. példa
Az lmp.999 elnevezésű PCV-törzs genomi DNS-ének (kettőse zá1ú repllkativ formásának) szekvenálása
Két ΕοοΒΊ-ϊκιρ ,999-kiőn (pGDM-7/2 és p<3SM- '7/ 8 ) nukleotidszekeenciájét a Sanger-féle didezoxínukleotid eljárással, az „AmplxTaq SNA polymerase FS (katalógusszám: 102 079 PS, Applied B-io.systems, W&rrington, UK) szekvenáló reagenskészlet és egy „Applied SioSystems AB137A típusú automatizált szekvenálókészülék alkalmazásával meghatároztuk, a gyártó utasításai szerint eljárva.. Az első szekvenáXási reakciókat az Ml 3 „előre és „reverz univerzális láncinditók alkalmazásával, végeztük. A későbbi szekvená-Iási reakciókat a „DNS-séta technológia szerint végeztük. Az utóbbi szekvenáiási reakciókhoz szükséges oligonukleoti-dókat Óife Technologies (Inchinnan Business Park, Paísiey, UK) céggel szintet!zálfatfcuk.
A kapott szekvenciákat összeülIrtottuk, és a „MacDNASIS version 3,2' programcsomaggal analizáltuk (katalógusszám: 22020101? Appligene, Durha®, UK). A különböző nyitott olvasási fázisokat a „National Center fór Bioteehnology Information központból (NCB1, Bethesda, MD, USA.) hozzáférhető Hlast-aigorítmussal analizáltuk,
A teljes szekvenciát a 3. azonos!tószámú szekvencián (3. ábra) mutatjuk be, A szekvencia a törzs teljes szekvenciáját tartalmazza, önkényesen az ScoKT-hely elejétől, azaz első nukieotiőként G-nakleotidfcőI kezdve.
♦ ♦ φ Χ Φ ΦΦΧ * * * Φ * Φ φ φ Κ φ φ φ «
Χ*«Χ *♦ Α* Φ*** ΦΧ«Φ
Ά további három izolátum szekvenciáját hasonló módon eljárva határoztuk. meg (lásd az 1., 2. és 1. azonos1tószáou szekvenciákat, a 1 -2> és 4. ábrákon) .
A négy törsz genom j'a következő méretűnek. bizonyult:
Imp 1011-43 121 1767 nukleotid;
Imp 1911-43 2 5' 5 17 67 nukleotid;
Imp 992 1768 nukleotid;
Inc 1010 17637 ' nukleotid.
21. példa
Az W<999 elnevezésű BCV-törzs szekvenciájának analízise
Amikor az rmp,999 elnevezésű PCV-torzs szekvenciáját homológ! a keresés céljából a SenBank adatbázisában tárolt szekvenciákkal hasonlítottuk össze, azt találtuk, hogy az egyetlen jelentősebb mértékű homológ!a - 76% ínukleinsavszinten) - a PK/15-törzs szekvenciájával (nyilvántartási szám: ¥ 09 921 és 0 49 196) mutatható ki (lásd 5, ábra).
Araikor a szekvenciák transzlációs termékeinek aminosavszekvenciáit vetették össze - mind a 6 fázisban - homológ szekvenciákra nézve gz adatbázisokban tárolt szekvenciákkal (Biast XJ-aigorítmnssal & NABI-kiszo-lgálón) , azt találtuk, hogy 94%-os homológia mutatható: ki a növényi circovírácokhoz hasonló BBTV-vírus (a GenBank adatbázisában UK49186 nyi 1 van tartási számon szereplő szekvencia, által kódolt szekvencia; GenSank nyilvántartási szám:: 1841515) feltételezett replíkázának megfelelő nyitott olvasási fázis szekvenciái ával «X ΦΦ ΦΧΦΦ «♦ Φ* φ y X φ φ φ X » φ « φ χ « Φ φφχφ Φ» φ* *»* Φ φφ**
Az adatbázisban szereplő egyéb szekvenciák nem. mutattak jelentősebb mértékű homológiát az Imp.999 elnevezésű. PCVtörzs esetében meghatározott szekvenciával.
A választott sertések multiszisztémás sorvadásának klinikai jeleit mutató kaliforniai sertések elváltozásaiból kitenyésztett Imp„999 elnevezésű FCV-törzs szekvenciájának analízise egyértelműen azt igazolja, hogy ez a városizolátűm valóban űj sertéscircovírus-törzs.
12, pél da ά szekvenciák összehasonlítása
A 4 PCV-fcörzs nuklotídszekvenciáját összevetettük a. PK/15 elnevezésű PCV~törzs szekvenciájával (5. ábra). Homológiamátrixot készítettünk a négy űj törzs és a korábbi, PK/I5-törzs figyelembevételével. Az alábbi eredményeket kaptuk:
1: Imp.1011-48 121;
2, imp. 1011-48 285;
3. Imp.999;
4, Imp.1010;
S. PK/15.
1 1,0050 0,9977 5, 961.5 99621. 0,7600
o 1,0509 0,9621 0,9632 0,7.594
3 1,0005 0,9949 0, 7 560
4 1,9100 0,7566
5 1,0090
* * * * * ♦ »* ·♦
A két francia törsz - lrip.lOIl~48 121 és Imp. 101140 285 közti homológra meghaladja a 99%-ot 00,9977}.
A két észak-amerikai törzs - imp.999 és Imp.1010 - közti homológra is nagyobb, mint 99% (0,9949}. A francia törzsek és észak-amerikai törzsek közti homológra kissé nagyobb, mint 36%.
A fenti törzsek és a ?K/15~törzs közti homológra 7S--7€% nagyságrendbe esik.
Ezek alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a. találmány szerinti törzsek a FK/I5-törzs által képviselt tipustó.1 eltérő, űj sertéscircovírns-tipus képviselői. Ezt az új típust, amelyet PMWS-tunetegyüttes jeleit mutató sertésekből izoláltunk - a FK/15-törzs által képviselt i-es típussal szemben - li-es típusú sertéscircovirusnak neveztük. A rr-es típushoz tartozó törzsek figyelemreméltó nukieotidszekvencia-hoiaogenitást mutatnak, bár azokat igen távoli földrajzi régiókban izoláltuk, lő. példa
A hők-törzsek által kódolt proteinek analízise
Az Imp.1010-törzs nukleotidszekvenciáját tekintettük a választott sertések műitIszisztémás sorvadásával kapcsolatba hozott egyéb circovirustörzsek képviselőjének. Ezt a szekvenciát alaposabban, analizáltuk a BlastX-aigoritmus (Altschui és mtsai.: J, Mól. bioi. 215, 403 (1990;) és
MacVector 6.C—programcsomag programkombinációjának (Oxford Molecuiar Group, Oxford Oz4 4GA, UK) alkalmazásával. A fenti szekvencia (cirkuláris genom! mentén tizenhárom, 20 ami S Ο
Λ ♦ * nosavnál hosszabb nyitott olvasási fázist. („ope.n reao’ing .franc; ORF-et) találtunk. As alábbi 13 ORF-et azonosítóttu k:
Név Kezdet Vég Szál Az ORF mérete (nukleeti dókban; nt i A protein mérete (aminosavakban; aa)
OK Fi 103 210 szensz. 103 nt 35 aa
ORF2 1130 1317 szánsz 138 nt 4 5 a a
ORF3 1363 1524 s zens z 162 nt 53 aa
0RF4 303 1342 s zen s z 945 nt 3 x 4 3. ti
ORF 5 900 1070 szensz 130 nt 59 a a
ÖRF6 12 54 1334 szensz S1 nt 2 6 aa
ORF? 1016 7 04 antíszensz 315 nt 104 a a
0RF8 439 311 sínt a. S Z β Ώ 3 κ. 129 nt 4 2 a a
ORF 9 190 101 antíszensz 90 nt 29 aa
ORFIO 912 733 antíszensz 180 nt 59 aa
ORF11 64 5 565 antiszensz 81 nt 2 6 aa
0RF12 1100 1035 anti szensz 66 nt 21 aa
ORF1 3 314 1361 antíszensz : 702 nt 213 aa
Az egyes ORF-ek start- és végpontjainak, pozícióit .a 1010~törzs genom.jának 4. ábrán bemutatott szekvenciája }4.. azonositoszámú szekvencia} számozása szerint adtuk meg. Az ORFi-13 'határai az Imp.999-törzs esetében is azonosak.. A.
X 4 * * * * * χ*’»* * <e ** Α*χ· * *** * határok a lOIi-48 121- és 1011-48 285-törzs esetében Is megegyeznek az ismertetettekkel, az ORF3 és OR.Fi3 kivételével. :
0RF3: 1432-1539; szensz; 108 nt; 234 aa;
QRF13: 314-1377; anfciszensz; 705 nt; 234 aa.
A 13 ORF közül négy jelentős mértékű homológ! ah mutat a klónozott PK-1S-PCV~virus gsnomján található megfelelő ORFvel. A. választott sertések multiszisztémás sorvadásával kapcsolatba hozott circovirns-izoiátumok genomja mentén elhelyezkedő mindegyik nyitott olvasási fázist analizáltuk. A említett ORF a következő volt;
Hév ί Kezdet vég Szál .k ORF mérete hikieoü dókban; St: ά protein mérete íffidaosao süss; aa) feM'uiat «g
C® 390 1M2 szsnsz 945 st 314 as 37,7 kDa
Outi 1018 7C4 autisxeasz 115 κ Ifi sa 1M kih
ORF310 912 333 astiszensz 120 st 53 aa 5,5 kDa
ÖRH.3 311 .............. ’ ·ι . 1381 antiszem 702 nt 233 sa 27,3 kDa
« ί *
« * ; » ο ♦ί» > <
< ί »♦» « 4 «
ί.
• < ..
X 1
Az egyes ORF-ek start- és végpontjainak pozícióit a 4, ábrán bemutatott szekvencia (4. azonosítószámú szekvencia;
számozása szerint adtuk meg. Az ORF-ek mérete (nukleotidokb&n) magában foglalja a stopködont is,
A PCV-Imp, 1010 és RCV-PK-1R--izo Iá tűrnek genomi szerveződésének összehasonlításával 4 ORF-et azonosítottunk, amelyek a két vírus genomiában konzerváltunk mutatkoztak, Az alábbi táblázatban. osszegezt.uk a megfigyelt homológra mértékét:
X* ««A
ORF Imp.lOlO/ORF PCV-id15 Homológra foka, százalékban
ORF4/ORF1 6 6%
ORF13/QHF2 66, 4%
ORF7/ORF3 61,5% (az átfedő szekvencia mentén (104 aminosav)]
ORP1Q/ORF4 83% (az átfedő szekvencia mentén (59 aminosav))
A legnagyobb fokú szekvencia azonosságot (36%-os hökológiát > az ImpdOlö 0RF4--szekvendá j a és a PK15 ORF1szekvenciája közt találtuk. Ez várható volt, hiszen ez a protein valószínűleg a virus-~DKS replikádójában játszik szerepet, és kulcsfontosságú virusreplikáció szempontjából [Meehan BiM. és másai,; J, Gén. Virol. 7$, 221 (1997);
Manksrtz és mtsai.: J. Gén. Virol. 79, 381 (1993;j .
Kisebb fokú szekvendsazonossagot (66,41 hokológiátj találtunk az lmp.1010 0RE13-szekvendája és a PK15 ORF2szekvenciája közt, de kinőkét ORF magas szinten konzervált N-terminális bázikus régiót tartalmaz, amely megegyezik a CáV-madárcirccvirus fő strukturális proteinjének N-torminál is régiójával [Meehan és mtsai,; Arch.. Virol. 124, 301 (1992)1 . Ezen felül, nagyfokú eltéréseket találtunk az Tmp.lölö ORFd--szekvencia j a és a PK-I5 öRF3-szekvendá j a, valamint az lap.1019 QPElö-szekvenciája és a PK-lő ORF4szekvenciája közt. Mindkét esetben, azt találtuk, hogy célzód történt az ImplOlO-í zoi.átum. CRF7- és ŐREI G-szekvenciájának C-texminális régiójában a PCV-PK-lS 0RF3- és O.RFiszekvenciájához képest. A legnagyobb fokú székvenciahomclégiét as. ORF7/ORF3 (61,5% homoiogia az átfedő szekvencia mentén) és az ORF10/GRF4 (83% homológia az átfedő szekvencia mentén) K~terminális régi óznak összevetésekor figyeltük meg.
Úgy tűnik, a sertéseírcovlms genomi szerveződése a génem kivételes tömöritettségének eredményeképp igen Összetett. A. fő strukturális protein valószínűleg a sertéscircovirus genomjárnak ugyanazon szála, mentén elhelyezkedő több olvasási, fázis közt létrejövő hasitödás í,, spli ring ; révén jön létre. Ennek megfelelően, a fenti táblázatban szereplő ORF-ek bármelyike v0R.Fl~0P.F13) képviselheti valamely, a lles típusú sertéscírccvírusok által kódolt antigénhatásű protein egészét vagy annak egy részét, ezáltal potenciális antigén, amely alkalmazható specifikus diagnosztizálásra és/vagy vaketnázásrs. A találmány tárgyát képezi tehát bármely, a fenti ORF-ek legalább egyikét tartalmazó protein. Előnyösen, a találmány tárgyát lényegében ORFé-et, 0RF7-et, ORFlü-et vagy QRF13~at tartalmazó protein képezi.
Az új törzsekből klónozott PCV-genom. fertőző jellege
Az lMp.99-9 elnevezésű PCV- ize iát um teljes genomját hordozó pGSM-7/S-plazmidot ΡΚ/15-sejtekbs trsnszfektáltuk, Meohan E. és munkatársai eljárásával pCharacterization of viral Odas Írom cells infected. wfth chfeken anaemia agent;
seguence anaiysis of the cloned repiicatfve form and tr ansf estien capabiiitíes of cloned genome fragments, Ár eh. Virol < 124, 301 (19-921 1. A transzfekciőt követően, nem-kontaminált PK/15 - sejteken végzett első passzálás után végzett iarnunf luores'Z-cens analízis szerint, a pGEM-7/S-klón által képviselt plazmid képes volt fertőző PCV-virusok termelődését indukálni. Az, hogy PCV~vírus eredetű fertőző genetikai anyagot tartalmazó klón áll rendelkezésünkre, lehetővé teszi, hogy a vírusgenomo-t kívánt módon módosításuk, ezáltal módosított PCV-vírusokat (sertésekre nézve atte.nuált, vagy detektív vírusokat} állítsunk elő, -amelyek alkalmasak attonnáit vagy rekombináns vakcinák, vagy diagnosztikus reagenskészletekben alkalmazható antigének előállítására .
FCG-antlgének előállítása in vitro; tenyésztésse1
A nem-kost ami máit PK/'lSvs ejtek tenyésztését és a vírusszaporítást az 1. példában ísmertetettekkkel megegyező módon végeztük. A fertőzött sejteket -4 napig, 37'öC-on inkubáltuk, majd tríp-szí ne zéssel összegyűjtöttük, és a sejtszámot meghatároztuk. A következő passzáláshoz 400 000 fertőzött sejtet alkalmaztunk milliliterenként.
iá. példa
A. vlrusant igének inaktív ál ás a.
A vírustenyésztés végen, a fertőzött sejteket összegyűjtöttük, és ultrahang-kezeléssel (Branson Sonifier készülék alkalmazásával; vagy rotor-sztator tipusn koiloidmalommal (UltraTurrax, !KA} li.zá.1 tettük.. Ezután, a szusz-penziót 30 percig, 3700 g mellett centrifugáltuk. A virusszuszpenciöt 0,1% etiiéniminnel történő kezeléssel· inaktiváltuk 18 órán át, +37wC~on; vagy 0,3% béta-propioiaktonnai inaktiváituk 24 órán át, +2SöC-on. .Amennyiben az inaktiválás előtt mért virustíter nem volt megfelelő, a vírusszuszpenziöt u.ttraf iitrácíős eljárással, 300 kDa molekulatömegig áteresztő („cuf-orí paraméterű) membrán (Míilipore PTMK300) alkalmazásával bekoncsntráltnk. Az inaktiváit virusszuszpanziót -ő'-C-ou tároltuk,
17, példa
Vakcina előállítása ásványi.....olaj alapú emu1síó forrnájánan
A vakcinát a következő összetevőkből állítottuk elé:
Ínáktívált sertéseircövirüs-szuszpenzíó: 250 ml;
Píonfanide® ISA 7ö íAüíílü:
750 ml.
A vizes és olajos fázisokat külön-külön, szűréssel sterilizáltuk. Az emulziót az összetevők elegyítésével és homogenizál ásávaí állítottuk elő, Síiverson típusú lapátos turbinás emuigeálőkészülék alkalmazásával.
Sgy vakcinadózis körülbelül lö‘,s TC1D50 vírust tartalmazott. A vakcinadózis térfogata intradarmálís beadásra 0,5 ml, iütramuszkuiáris adagolásra 2 ml volt. Ezt a vakcinát alkalmaztuk választott sertések multi szisztémás; sorvadása elleni vakcinázási programban, a ParvovaxA vakcinával kombinálva.
IS. példa
Vakcina eIőá1Iitass metabolizálhatő, piacalapú emulzió formájában
A vakcinát a következő összetevőkből állítottuk elő:
inaktívált sertéscircovirus-szuszperziő: 200 ml;
Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 ml;
Radia 7204 (Oleofinaj ; 740 ml,
A vizes és olajos fázisokat külön-külön, szűréssel sterilizáltuk. Az emulziót az összetevők elegyítésével és homogenizáiásáva1 állítottuk elő, Síiverson típusú lapátos turbinás emulgeáiókészüiék alkalmazásával.
Egy vakcinadőzis körülbelül 1O''': TCibSO vírust tartalmazott. A vakcinadőzis térfogata intramuszkuláris beadásra mi volt. Ezt a vakcinát választott sertések muitiszísztémás sorvadása elleni vakclnázásí programban alkalmaztuk, a
Parvovax® vakcinával kombinálva.
1.9, példa niperlrmmns zérómmal íPCV-Tr, a PK/1S-sej lekből származó antigén ellen termeit, F99 jelzésű monoklonális ellenanyagok sorozatával, valamint a kanadai, törzs ellen előállított hl per immuno rérummai .végzett índirekt immunfluoreszcens vizsgálatok eredményei az amerikai és francia PCVvirnstörzsek, valamint a PK715-kontamináns vonatkozásában
---- --— :vírus
3K/I5 USA Francé
3CV-T antiserum PCV-C antiserem 399 1H4 F99 4310 399 237 339 2£12 399 1C9 ί 399 2El F99 1H4 k 6400 200 k 10 000 > 10 000 > 10 000 > 10 Oöö i > 10 000 ί > íc ooo I> 10 000 t 1 200 k 6.400 <100 <100 10 0 <100 <100 <100 100 800 > 6.4. 00 löö - <100 <100 <100 : 100 ; <100 j <100 !'..... ——. --------
*: A szérum vagy monoklonális ellenanyag utolsó hígításának recíproka, amely pozitív reakciót adott az indirekt immuntlaoreszcsns vizsgálatban.
Választott sertések múlt Is zá szt értás sorvadásával_járó tünetegynttes előidézése kísérletes úton - 1. protokoll
Három napos, császármetszéssel világra, hozott, izolációs egységben tartott gnotobiotikus sertéseket oltottunk be PCV-ví r usszuszpenziöval. Il-es típusú PCV-vírusokként Imp. 1Ö1 ü-izoiátumot és a beteg ser tésekbő l, származó nyirokcsomók homogéntzátumából nyert vírust alkalmaztunk.
öt csoportot képeztünk. Valamennyi sertést három napos korban, oronazálts úton oltottunk be, 1,5 ml vírusszuszpenziöval, az alábbi terv szerint:
- 4 ö
Csoport Állatok száma Vírus De zis
A 6 N'yi rokonomé- h omo g e n i z á t tm Nem volt meghatározva.
8 5 Imp,1010 {alacsony fokú passzáiás után) lö TCiD;::.
C 4 Imp.1010 (nagyszámú passzáiás után) lö2 1C1DK)
D 7 PCV-vírustői mentes PK15- sejtek Iizátuma
E 3 ......... —
A kísérletes fertőzéssel a következe eredményeket kaptuk;
Az öt hetes megfigyelési időszak alatt a sertéseknél nem jelentkeztek klinikai tünetek, egy, a B-csoportba tartozó állattól, amelynél jelentős kimerültség jelel mutatkoztak. Boncolás során, az A~, 3- és C-csoportba tartozó sertéseknél a nyirokcsomók hiperpláziája volt megfigyelhető ia D- és E-csoportha tartozó állatok nyirokcsomóinál 2-10szer nagyobb méretű nyirokcsomók; , különösen az állkapocs alatti régióban, bronchiáiisan (a hörgők körül), mezenteriálisan, a lágyékiájon és f«morálisan. Ez a híperplázia a kérgi zónák monocitákkal. és makro tagokkal történő beszúródósé következtében bekövetkező jelentős mértékű megnagyobbodására volt visszavezethető.
Az A~, B- és C-csoportba tartozó sertéseknél a bronchíális nyirokszövetek hiperpláziája is megfigyelhető volt.
Az A-, B- és C-esoportban egy-egy sertésnél lépett fel tüdőgyulladás. Annái a B-csoportba tartozó sertésnél, amely kimerültség jeleit mutatta, és még egy, az A-csoportba tartozó sertésnél gyomorfekélyt találtunk.
Az A-, B- és C-csoportba sorolt valamennyi állatnál miositis (izomgyulladás· volt kimutatható a gyomor és bél izomköpenyében.
Az A-, B~ és C-csoportba tartozó állatok többségénél szívizomgyuliadás és többgócú májgyulladás volt észlelhető iimfocita-, makrofág- és eozinophiibeszűrődéssei, valamint kortikális és medniiáris intersiíciális nep'hrítis.
Egyetlen C-csoportba tartozó sertés májának mérete haladta meg a normálisát, amelynél, disszemináit, tisztán kivehető gócok voltak észlelhetők a máj felszínén.
A D- és B-csoportba tartozó sertéseknél nem volt elváltozás megfigyelhető, circovirust sikerült izolálni az B- és C-csoportba tartozó sertések szervedből.
* * Φ Φ * » * * Φ * t « X > φ Φ » Φ χ Φ * » » ♦ Φ * Φ W **♦ φ«» φ .22. példa
Választott sertések multlszlsztémás sorvadásával_______járó tünetegyűttes előlo:éése krsér1etes __ú t οn- 2 .__ós 3 ._____protokell
Szokványos, de a születés után anyjuktól elválasztott malacokét oltottunk be II~es típusú KCV-virusokat; sertésparvoví tusokat tartalmazó szuszpenzíóvai; vagy a két vírus eiegyévei. ll~es típusú PCT--vírusokként imp.1010- és Imp . 1 011-ízotá.tumökst (48 121-torzset) alkalmaztuk,
PPV~vírusként egy kanadai, Imp.1005 elnevezésű törzset alkalmaztunk. Sz a vírus más ismert sertésparvovirus-törzsekkel {HADI»-2 és Hresse-tőrzzsel) megegyező szekvenciát tartalmaz (a szekvenáit genom. 1/3-át) .
Két kísérleti protokoll szerint jártunk el.
2. protokoll:
Három csoportot képeztünk, 3 napos sertésekből, A sertéseket oronazális úton, 1 ml virassznszpenzioval fertőztük, az alábbi terv szerint:
Csoport Állatok száma Vírus Dó zis
A 5 Imp.1010 ló7 TGID50
B 5 Imp .1010 -;· Oxi Ct TüID;,,
Imp.1005
C (kontroll) .......... —
*> φφ φ-«*φ «Φ V» φ ΦΦΧ Φ Φ Φ φ Φ φ φ « « ♦ * φ φ φ * * φ φ «Αφφ *» «Φ «θ'* Φ ΦΦ«»
A kísérletes fertőzéssel a következő' eredményeket kaptuk :
A-csoport: két sertés a fertőzést követően 21 nappal elpusztult, és egy sertést fájdaiomentesen elpusztítottunk a fertőzést követő 24. napon.
B-csoport; 1 sertés a fertőzést követően 23 nappal elpusztult, és egy sertést fájdalo-steentesen elpusztítottunk a fertőzést követő 24. napon.
A fertőzést követően elpusztult sertéseken, végzett boncolás során jelentős makróézköpős elváltozásokat találtunk: folyadékot a pleurális térben,· tüdőödémát, bevérzéseket a vesékben, gombostőtej nagyságú fehéres elváltozásokat a veséken, és mátnekrözist. Ezek az. elváltozások megegyeztek a területen megfigyel eseteknél látottakkal.
Az általunk elpusztított sertések boncolása során nem észleltünk, makroszkópos elváltozásokat.
Az A- és B-csoportba tartozó, fertőzést követően elpusztult sertésekből, valamint a fenti két csoportba tatozó általunk elpusztított sertésekből eltávolított szerveken végzett szövettani vizsgálatok szerint, azokon a választott sertések multiszisztémás sorvadására jellemző, területen megfigyelt elváltozások tipikus és teljes mintázata volt észlelhető: azaz májn.ekrőzís, a. nyirokcsomók nekrőzisa, hasnyálmirigy-nekrőzis, a vesék gőcos nekrőzisa és súlyos bevérzései, színei ci úrnők képződése a tüdőben, valamint a. májsejtek, súlyos nekrőzisa, 'magzárványok jelenlétével.
Megjegyzendő, hogy nagy mennyiségű PCV-ant1gén volt kimutatható valamennyi fenti elváltozásban (az elpusztult
9 9 ♦ * 9 * ♦ 9*9 99 9*í «** X X ♦♦ 9 vagy leolt sertésekben), de ugyanezekben az elváltozásokban PPV-antlgén -jelenlétét nem tudtuk kimutatni.
nem voltak elváltozások észlelhetők a C-csoportba tartozó kontroll sertésekben.
3. protokoll:
Négy csoportot képeztünk, 4 hetes sertésekből. A sertéseket oronazális úton fertőztük, 1 mi vírusszuszpenzlövai, az alább ismertetett terv szerint eljárva:
Csoport Állatok száma Vírus Dózis
A : kontroli) 2 — ...........
B 4 : Imp.1005 (?FV) 10-5 1CAA
C 4 ino.1011 í?CV) 1 u' z c i iy y
D 4 Imp.1005aimp.10 105 uxln
11 ŐCIDsö
A kísérletes fertőzés eredményeit az alábbiakban foglaltuk össze:
Egy „kontroll sertést és mindegyik kísérleti csoportból CB, C és D; 2-2 sertést fájdalommentesen elpusztítottunk, és boncolásnak vetettünk alá a fertőzést követően 2 héttel. A D-csoportba tartozó két sertésnél (ECVeppv fertőzött sertéseknél; jelentős immunhisetológiái elváltozásokat találtunk. Megjegyzendő, hogy sertésparvovirus jelenlétét nem tudtuk kimutatni ezekben az elváltozásokban, bár a D~ csoportba tartózó valamennyi sertésnél szerokonverzió volt ‘3 ♦* ΦΦ Φ**Φ ♦· *·* « Φ » * * * * * Φ
Φ Φ Φ Φ » * * Φ Φ g X * Φ φ*0* φ* φ« «*·*· φ * ♦*φ megf igyelhető a sertésparvovlrussal szemben. A kontroll sertésekben és az egyéb csoportokba tartozó sertéseknél nem voltak észlelhetők sea makroszkópos, seri szövettani elváltozások .
Ügy tűnik tehát, hogy a PCYvppv-kombináció lehetővé teszi a választott sertések multisziszfémás sorvadásával járó tünetegyüttesre jellemző szövettani, elváltozások reprodukálását. A két kísérleti protokoll alapján megfigyelhető volt, hogy csak PCV-vel vagy PCV és PPV kombinációjával végzett fertőzéssel a választott sertések muliiszisztémás sorvadásának tünetegyüttess töbfoé-kevésbé súlyos formában reprodukálható, de csak eircovirus- mutatható ki az elváltozásokban» Ezzel szemben, csak PPV-vei végzett kísérletes fertőzéssel (3. protokoll, B-csoport}' makroszkópos vagy szövettani elváltozások nem válthatók ki; PCV jelenlétében azonban elváltozások megjelenése figyelhető mag 4 hetes sertésekben (:3. protokoll, D~csoport) .

Claims (18)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. Antigáúcészftoáoy sertések mrdtisrisztémás sorvadás©» timetegyústese (/«éw Mtdtóspst&nte FFarting óy.mriwíoT PMWS) ellen, amely ssrtriseireovnus-aíihgém és sertéspsrvöviros-antigént tartalmaz, ahol a sertéseticovirus-ísntigéa ö-es típusú ssrtéscirenvírosból származó antigén.
2. Az 1. igénypont szerinti 'készítmény, amely Π-es típusú sertéscircovirnsból származó antigénként az Európai Sejítonyészet-gyíijteménybcn CWte&»« qfCeli Cutíures”: BCÁCC):
V9710Ö21.9 ayöváatartásí szánton:
V9'71ÖÖ218 nyilvántartási számon;
V97100217 nyilvántartási számon;
V98Ö11608 nyilvántartási számon; vagy
V98Ö11600 nyilvántartási számos letétbe helyezeti eircovirtssból származó antigént tartalmaz,
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény, amely sertéscírcoviuis-antígénként és sertésparvovímsondgénként ~ egymástól tiiggedenái - attensáit, élő, teljes an-igést, makíívált teljes antigént, alegységaatigént, az antigént expresszáltn képes rekombináns: élő vektort vagy sz antigént expsesszátel képes DNS-vetat tartalmaz.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely egyéb seríéspatogénnek megfelelő további valenciát is tartalmaz.
5. A 4. igénypont szerinti készítmény; amely további valenciaként a felsoroltak valsmtelyikének megfelelő valenciát tartalmaz: sertések reproduktív és légzőszerv! tönetegYütíesét (,,?<?«:;>«? írópr-odíícróty ami Eesporaiory Symirama'l FR&Sj okozó város, .W<zy?/űs»5ö mppfísotoHonme, Aoti«©ó«Cí7te p/eufie>p»eí»«OHMtíe, £ co/ξ. atrófiás orrnyólkahártoa-gyuíladás, /WWórőóiés, sertéskolera, sertéslafiaeaza és a felsoroltak kmnbinációi.
6. A 4, igénypont szerinti készítmény, amely további valenciaként PRRS vírus valenciát tartalmaz.
7. Vakcina a FMWS-ttlnetegyüttos ellen, amely .hatásos mennyiségé, az l-ő. igénypontok bármelyike szerinti antigénkész.íímériyt tartalmaz állatgyógyászat! szempomből elfogadható hordozóanyagban, vagy kötőanyagban.
8. A 7, igénypont szerinti vakcina, amely állatgyógyászati szempontból elfogadható adjuvánst is tartalmaz.
9. A 7. vagv 8. igénypont szerinti vakcina, amely több sertéscírcovíntsbói származó antigént tartalmaz.
lö.
A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, amely sertéscímov&trt-eredetó, ORF1 -O.RFI3 jelű nyitott olvasási fázisok {,, opm? reaáing frameÖRFj bármelyike által kódolt eircovírns-arstigént tartalmaz.
11. A 10. igénypont szerinti vakcina, amely a sertéscírcovlms-eredetű ORF4, ÖKF7, ORF'lö vagy ORF13 nyitott olvasási fázisok áhal kódolt eirco vírus-antigént tartalmaz.
12, Á 7-11. igénypontok •bármelyike' szerinti vakcina, amely olyan expressziós vektort tartalmaz, amely sertésben szaporodni képes, de sertésekre nézve nem patogért élő vírus, vagy DNS-vektor, és amely vektor az.ORFet magába foglalja és ezpresszáljs.
13 . A 12 , igénypont szerinti vakcina, amely v írus vektorként sertés-hetpesvhusi, sertésadenovímst vagy felmíőviRtst tartalmaz.
14. A 13. igénypont szerinti vakcina, amely vírusvek torként az Aujeszky-betegség: vírusát, vaecírnavíuisí, madárhlmlő-vioast, kanárihiudő-vírast vagy sertéshimlő-vírtist tartalmaz.
-47* *
15. Víikeinázókészfet, amely - külön csomagolva - tartalmaz sertéscircövirtts elleni vakcinák valamint, sertésparvovíras elfeni vakcinát, ahol a sertéscireovíms elleni vakcina 7-1-4. igénypontok bármelyike szériát definiált sertésoáeovkw-sat-tígéöt tartalmaz,
16. Az 1-6, Igénypontok bármelyike szerinti aniigéakésztasény vagy a 7-14. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, gyógyászati készítmény előállítására történő alkalmazása.
17. Az í-6. igénypontok bármelyike szerinti aiitigeakészítmény vagy a 7-14. igénypontok bármelyike szerinti vakcina alkalmazása PMWS kezelésére szolgáló gyógyászsíi készítmény efeálHiásárs.
18. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti aatígénkészírtnény vagy a 7-14. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, PM'WS kezelésében történő alkalmazásra.
HU0102770A 1998-07-06 1999-06-28 Porcine circovirus and parvovirus vaccine HU227805B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9808777A FR2781159B1 (fr) 1998-07-06 1998-07-06 Vaccin circovirus et parvovirus porcin
PCT/EP1999/004698 WO2000001409A2 (en) 1998-07-06 1999-06-28 Porcine circovirus and parvovirus vaccine

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0102770A2 HUP0102770A2 (hu) 2001-11-28
HUP0102770A3 HUP0102770A3 (en) 2004-10-28
HU227805B1 true HU227805B1 (en) 2012-03-28

Family

ID=9528441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0102770A HU227805B1 (en) 1998-07-06 1999-06-28 Porcine circovirus and parvovirus vaccine

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6217883B1 (hu)
EP (1) EP1094837B1 (hu)
JP (2) JP4749547B2 (hu)
KR (1) KR100730336B1 (hu)
CN (1) CN1168502C (hu)
AT (1) ATE452653T1 (hu)
AU (1) AU746234B2 (hu)
BR (1) BRPI9911870B8 (hu)
CA (1) CA2332627C (hu)
CY (1) CY1110290T1 (hu)
DE (1) DE69941843D1 (hu)
DK (1) DK1094837T3 (hu)
ES (1) ES2338616T3 (hu)
FR (1) FR2781159B1 (hu)
HU (1) HU227805B1 (hu)
MX (1) MXPA00012785A (hu)
PL (1) PL205299B1 (hu)
PT (1) PT1094837E (hu)
RU (1) RU2237492C2 (hu)
TW (1) TWI221774B (hu)
UA (1) UA72891C2 (hu)
WO (1) WO2000001409A2 (hu)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7192594B2 (en) * 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
JP3795751B2 (ja) * 1997-12-11 2006-07-12 ユニバーシティ オブ サスカッチェワン ブタからの離乳後多全身系消耗症候群ウイルス
US6943152B1 (en) * 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
DE10044648A1 (de) * 2000-09-08 2002-03-21 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Vermehrung oder zur Entfernung von Cirocoviren aus biologischem Material
KR100876629B1 (ko) 2001-03-27 2009-01-07 유니버시티 오브 사스카췌완 써코바이러스의 배양 방법
US20030096377A1 (en) * 2001-06-28 2003-05-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2
US7276353B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
EP2390352A1 (en) 2003-03-18 2011-11-30 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
US7468273B2 (en) 2003-05-01 2008-12-23 Meial Limited Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use
US20040258700A1 (en) * 2003-06-23 2004-12-23 Frimann Tine Holland Vaccine formulation with a preservative
CA2545886A1 (en) 2003-11-13 2005-06-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods of characterizing infectious bursal disease virus
MXPA06009452A (es) 2004-02-19 2007-03-15 Univ Alberta Polimorfismos del promotor de leptin y sus usos.
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
DK1833992T3 (da) * 2004-12-30 2015-06-08 Boehringer Ingelheim Vetmed PCV2-immunogene sammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af sådanne sammensætninger
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
WO2006115843A2 (en) 2005-04-25 2006-11-02 Merial Limited Nipah virus vaccines
TW200643171A (en) * 2005-06-07 2006-12-16 Temasek Life Sciences Lab Ltd Porcine circovirus type 2 vaccines
US20080241184A1 (en) 2005-08-25 2008-10-02 Jules Maarten Minke Canine influenza vaccines
KR100693077B1 (ko) * 2005-11-03 2007-03-12 채찬희 돼지 복합 호흡기 질환 예방 및 치료용 생물학적 조성물
US7771995B2 (en) 2005-11-14 2010-08-10 Merial Limited Plasmid encoding human BMP-7
EP2186823A1 (en) 2005-11-14 2010-05-19 Merial Limited Gene therapy for renal failure
CN109125721A (zh) 2005-12-29 2019-01-04 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 Pcv2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途
PL2275132T3 (pl) * 2005-12-29 2021-09-13 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Multiwalentne immunogenne kompozycje PCV2 i sposoby ich wytwarzania
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
EP2076284A4 (en) * 2006-10-05 2010-03-31 Cerebus Biolog Inc METHODS OF TREATING, PREVENTING AND DIAGNOSING TTV INFECTION IN PORK
WO2008064299A2 (en) * 2006-11-22 2008-05-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of reducing porcine circovirus-associated disease outbreaks
EP2859900A1 (en) * 2006-12-11 2015-04-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
CN107412761A (zh) * 2006-12-15 2017-12-01 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 以pcv2抗原治疗猪
EP1941903A1 (en) * 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) * 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
CN101294224B (zh) * 2007-05-08 2011-04-06 深圳太太基因工程有限公司 一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列
JP2010528604A (ja) * 2007-05-30 2010-08-26 ワイス・エルエルシー ブタウィルスの遺伝子を発現するアライグマポックスウィルス
US20090017064A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
ME01156B (me) * 2007-12-21 2013-03-20 Zoetis Services Llc Postupci i kompozicije za imunizaciju svinja protiv svinjskog cirkovirusa
AU2008347235A1 (en) * 2007-12-31 2009-07-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 ORF2 virus like particle with foreign amino acid insertion
EP2242511A4 (en) * 2008-01-23 2012-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmed IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE PCV2, AND METHODS FOR PRODUCING SUCH COMPOSITIONS
US20110033495A1 (en) * 2008-02-15 2011-02-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
US7927586B2 (en) * 2008-07-08 2011-04-19 South Dakota State University Vaccine for porcine post-weaning diarrhea caused by enterotoxigenic Escherichia coli
CN102428099B (zh) 2009-04-03 2016-03-16 梅里亚有限公司 运载新城疫病毒的禽疫苗
TWI627281B (zh) * 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
US8986706B2 (en) 2010-08-31 2015-03-24 Merial, Inc. Newcastle disease virus vectored herpesvirus vaccines
CN101947318B (zh) * 2010-09-09 2012-09-05 扬州优邦生物制药有限公司 一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法
TWI442935B (zh) 2010-12-22 2014-07-01 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２）、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
AU2012240240A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
AU2012240246A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
AU2012245395A1 (en) 2011-04-20 2013-11-14 Merial, Inc. Adjuvanted rabies vaccine with improved viscosity profile
CA2834288A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Advanced Bioscience Laboratories, Inc. Truncated hiv envelope proteins (env), methods and compositions related thereto
EP2714077B1 (en) 2011-06-01 2018-02-28 Merial, Inc. Needle-free administration of prrsv vaccines
HUE035774T2 (hu) 2011-08-12 2018-05-28 Merial Inc Biológiai anyagok, különösen oltóanyagok, vákuummal elõsegített tartósítása
UA113192C2 (xx) 2011-12-06 2016-12-26 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
CN102961742A (zh) * 2012-01-13 2013-03-13 普莱柯生物工程股份有限公司 猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN105749273A (zh) * 2012-01-13 2016-07-13 普莱柯生物工程股份有限公司 猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法
WO2013138776A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Merial Limited Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g
CN102719407B (zh) * 2012-05-25 2013-09-04 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪细小病毒bq-c株及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用
US9556419B2 (en) 2013-03-12 2017-01-31 Merial Inc. Reverse genetics Schmallenberg virus vaccine compositions, and methods of use thereof
WO2014182872A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Protatek International, Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
JP6821429B2 (ja) 2013-09-25 2021-01-27 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー Ｐｃｖ２ｂ分岐ワクチン組成物及び使用方法
WO2015051099A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 protein variant and virus like particles composed thereof
DK3076996T3 (en) * 2013-12-03 2020-03-09 Intervet Int Bv Vaccine mod porcint circovirus type 2
CN104250640A (zh) * 2014-08-22 2014-12-31 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
AU2015343369B2 (en) 2014-11-03 2018-11-22 Georgia Tech Research Corporation Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
CN111560355A (zh) * 2015-03-20 2020-08-21 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
MX2017014414A (es) 2015-05-14 2018-03-16 Merial Inc Metodo para la produccion de circovirus porcino y vacunas pcv2.
BR112017027895A2 (pt) 2015-06-23 2018-11-06 Merial Inc vetores virais recombinantes contendo proteínas menores de prrsv e métodos de fabricação e utilização destes
RU2746127C2 (ru) * 2016-03-23 2021-04-07 Интервет Интернэшнл Б.В. Вакцина для внутрикожного применения против инфекции вируса pcv2 и prrs
CN106435016B (zh) * 2016-08-30 2019-07-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速显色一步法检测猪圆环病毒2型的lamp试剂盒
DK3534939T3 (da) 2016-11-03 2023-04-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine mod porcin parvovirus og porcin reproduktions- og respirationssyndromvirus og fremgangsmåder til fremstilling deraf

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1538305A1 (ru) 1987-07-21 1994-12-15 Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов Госагропрома СССР Ассоциированная вакцина против лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней
US5811103A (en) * 1989-03-19 1998-09-22 Akzo Nobel N.V. Hog cholera virus vaccine and diagnostic
ES2026827A6 (es) 1991-03-26 1992-05-01 Ercros Sa Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino.
FR2751224B1 (fr) * 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0102770A3 (en) 2004-10-28
DK1094837T3 (da) 2010-04-12
BRPI9911870B8 (pt) 2015-09-22
JP2003522106A (ja) 2003-07-22
KR100730336B1 (ko) 2007-06-19
JP4749547B2 (ja) 2011-08-17
PT1094837E (pt) 2010-03-18
CY1110290T1 (el) 2015-01-14
CN1168502C (zh) 2004-09-29
WO2000001409A3 (en) 2000-06-29
JP2010222359A (ja) 2010-10-07
FR2781159A1 (fr) 2000-01-21
US6953581B2 (en) 2005-10-11
AU746234B2 (en) 2002-04-18
EP1094837A2 (en) 2001-05-02
US6217883B1 (en) 2001-04-17
CA2332627C (en) 2010-06-01
WO2000001409A2 (en) 2000-01-13
CA2332627A1 (en) 2000-01-13
ES2338616T3 (es) 2010-05-10
BR9911870B1 (pt) 2014-08-12
PL345948A1 (en) 2002-01-14
DE69941843D1 (de) 2010-02-04
KR20010081991A (ko) 2001-08-29
PL205299B1 (pl) 2010-04-30
CN1311690A (zh) 2001-09-05
AU4907799A (en) 2000-01-24
UA72891C2 (en) 2005-05-16
TWI221774B (en) 2004-10-11
EP1094837B1 (en) 2009-12-23
US20020146431A1 (en) 2002-10-10
ATE452653T1 (de) 2010-01-15
MXPA00012785A (es) 2002-04-24
RU2237492C2 (ru) 2004-10-10
FR2781159B1 (fr) 2000-10-06
HUP0102770A2 (hu) 2001-11-28
BR9911870A (pt) 2001-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU227805B1 (en) Porcine circovirus and parvovirus vaccine
KR100854615B1 (ko) 돼지 서코바이러스, 백신 및 진단시약
US7122192B2 (en) Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents
AU2005220241B2 (en) Reduction of porcine circovirus-2 viral load
RU2283862C2 (ru) Цирковирус свиней типа ii и его применение
AU2002315560B2 (en) Attenuated circovirus
FR2769321A1 (fr) Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostics
WO2002008390A2 (en) Bovine wasting syndrome vaccine
MXPA00003263A (en) Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents