BR9911870B1 - Vacina de parvovírus e circovírus de suíno - Google Patents
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINA DE PARVOVÍRUS E CIRCOVÍRUS DE SUÍNO". A presente invenção retere-se a uma vacina contra a síndrome de PMWS (Síndrome de Emaciação Multissistêmica de Suíno também cha- mado Síndrome de Emaciação Multissistêmica Pós-Desmame). Vários documentos são citados no seguinte texto e vários docu- mentos são referenciados ou citados em documentos citados no seguinte texto. Não há aceitação de que qualquer um destes documentos são de fato da técnica anterior no que diz respeito à presente invenção. Todos os docu- mentos citados aqui e todos os documentos referenciados ou citados nos documentos citados aqui são incorporados por referência. PCV (para "CircoVírus de Suíno") foi originariamente detectado como um contaminante não-citopatogênico em linhas de célula de rim de porco PK/15. Este vírus foi classificado entre a Circoviridae com o vírus de anemia de frango (CAV para Vírus de Anemia de Frango) e vírus de PBFDV (Vírus de Doença de Pena e Bico de Psitacina). Ele é um vírus não envelo- pado pequeno (de 15 a 24 nm) cuja característica comum é conter um ge- noma na forma de um DNA de fio único circular de 1,76 a 2,31 kb. Primeira- mente imaginou-se que este genoma codificou um polipeptídeo de cerca de 30 kDa (Todd e outros, Arch. Virol 1991, 117; 129-135). Trabalho recente, no entanto, mostrou uma tanscrição mais complexa (Meehan B. M. e outros, 1997, 78: 221-227). Além do mais, nenhuma das homologias significativas em seqüência de nucleotídeos ou em determinantes antigênicos comuns são conhecidos entre os três tipos de circovírus conhecidos. O PCV derivado das célula PK/15 é considerado não ser pato- gênico. Sua seqüência é distinguida de B. M. Meehan e outros, J. Gen. Virol 1997 (78) 221-227. Apenas muito recentemente é que alguns autores imagi- naram que cepas de PCV poderiam ser patogênicas e associadas à síndro- me de PMWS (Gupi P.S. Nayar e outros, Can. Vet. J, Vol. 38, 1997; 385-387 e Clark E. G., "Proc. Am. Assoe. Swine Prac. 1997"; 499-501). Nayar e ou- tros, detectaram DNA de PCV em porcos tendo a síndrome de PMWS usan- do-se técnicas de PCR. A síndrome de PMWS detectada no Canadá, nos Estados Uni- dos e na França é clinicamente caracterizada por uma perda gradual de peso e por manifestações tais como taquipnéia, dispnéia e icterícia. A partir do ponto de vista patológico, ela é manifestada por infiltrações granulomato- sas ou linfocíticas, linfadenopatias e, mais raramente, por hepatite e nefrite granulomatosa ou linfocítica (Clark E. G., "Proc. Am. Assoe. Swine Prac." 1997; 499-501; La Semaine Vétérinaire n° 26, suplemento para La Semaine Vétérinaire 1996 (834); La Semaine Vétérinaire 1997 (857): 54; Gupi P.S.
Nayar e outros, "Can. Vet. J," Vol. 38, 1997; 385-387). A requerente foi bem sucedida no isolamento de cinco novas cepas de PCV oriundas de amostras pulmonares ou gangliônicas obtidas a partir de fazendas no Canadá, nos Estados Unidos (Califórnia) e França (Brittany). Estes vírus foram detectados em lesões em porcos com a síndro- me de PMWS, mas não em porcos saudáveis. A requerente, além disso, seqüenciou o genoma de quatro des- tas cepas, a saber as cepas obtidas a partir do Canadá e dos Estados Uni- dos bem como duas cepas Francesas. As cepas exibem uma homologia muito forte entre si no nível de nucleotídeo, excedendo 96% e muito mais fraca com a cepa de PK/15, cerca de 76%. As novas cepas podem assim ser consideradas como sendo representativas de um novo tipo de circovírus de suíno, chamado aqui tipo II, tipo I sendo representado por PK/15.
Preparações purificadas das cinco cepas foram depositadas sob o Tratado de Budapeste na ECACC (Coleção Européia de Culturas de Cé- lula, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido) na quinta feira, 2 de outubro de 1997: n- de acesso V97100219 (chamado aqui Imp. 1008PVC) n9 de acesso V97100218 (chamado aqui Imp. 101OPCV) n9 de acesso V97100217 (chamado aqui Imp. 999PCV), e, na sexta-feira, 16 de janeiro de 1988: n9 de acesso V98011608 (chamado aqui Imp. 1011 -48285) n9 de acesso V98011609 (chamado aqui Imp. 1011-48121). A requerente observou que, em uma experiência para a reprodução experimental da síndrome de emaciação multissistêmica de suíno, um parvovírus de suíno combina- do com o circovírus de suíno poderíam resultar em uma piora da doença. O objetivo da presente invenção é, portanto, uma vacinação de porcos usando-se uma vacina de circovírus de suíno, em particular tipo I ou tipo II, de preferência tipo II, combinada com uma vacinação com uma vaci- na de parcovírus de suíno. Isto é entendido como significando vacinação com ou uma vacina bivalente ou o uso simultâneo, em porcos, de uma vaci- na de circovírus e de uma vacina de parvovírus de suíno. A cepa de parvovírus de referência é a cepa NADL-2 que é acessível a partir da coleção ATCC sob a referência VR-742. Vacinação contra o parvovírus de suíno é bem conhecida por pessoas versadas na téc- nica e vacinas contra o parvovírus de suíno estão comercial mente disponí- veis. Pode ser mencionado a título de exemplo: Parvovax® (vacina inativada contra parvovírus de suíno, distribuída pela MERIAL). Ver também, por exemplo, P. Vannier et A. Lavai., Point. Vét. 1993, 25 (151), 53-60; G. Flo- rent e outros, Proceedings of the Ninth Congress of Pig Veterinary Society, em 15-18 de julho de 1986, Barcelona, Espanha. Para vacinas de DNA, pode-se referir, por exemplo, a WO-A 98 03658. O objetivo da presente invenção é, portanto, uma preparação antigênica direcionada contra a síndrome de PMWS, compreendendo pelo menos um antígeno de circovírus de suíno (de preferência circovírus de tipo II) e pelo menos um antígeno de parvovírus de suíno. De acordo com a in- venção, o antígeno de circovírus de suíno (de preferência circovírus de tipo II) e o antígeno de parvovírus de suíno compreendem, independentemente entre si, um antígeno escolhido do grupo que consiste de um antígeno inteiro vivo atenuado, um antígeno inteiro inativado, um antígeno de subunidade, um vetor vivo recombinante e um vetor de DNA. É entendido que a combi- nação de acordo com a invenção pode envolver o uso de qualquer antígeno apropriado ou forma de preparação antigênica, sendo entendido que não é necessário usar a mesma forma para uma dada combinação. A preparação antigênica pode compreender, além disso, como é conhecido per se, um veículo ou um excipiente aceitável a partir do ponto de vista veterinário, e opcionalmente um auxiliar aceitável a partir do ponto de vista veterinário. O objetivo da presente invenção é também uma composição imunogênica ou uma vacina contra a síndrome de PMWS, compreendendo uma quantidade eficaz da preparação antigênica de circovírus + parvovírus como descrito acima, em um veículo ou excipiente aceitável a partir do ponto de vista veterinário, e opcionalmente um auxiliar aceitável a partir do ponto de vista veterinário. Uma composição imunogênica elicia uma resposta imunológica que pode, mas não precisa ser, protetora. Uma composição de vacina elicia uma resposta protetora. Correspondentemente, o termo "com- posição imunogênica" inclui uma composição de vacina (como o primeiro termo pode ser a composição protetora). O objetivo da invenção é também um kit de vacinação ou imunológico contendo, embalado separadamente, uma preparação antigêni- ca ou uma composição imunogênica ou uma vacina contra o circovírus de suíno e uma preparação antigênica ou uma composição imunogênica ou uma vacina contra o parvovírus de suíno. Este kit pode ter as várias caracte- rísticas indicadas acima para as preparações antigênicas, vacinas e compo- sições imunogênicas. O objetivo da invenção é também um método de imunização ou de vacinação contra a síndrome de PMWS, compreendendo a administração de uma composição imunogênica ou uma vacina contra o circovírus de suíno e de uma composição imunogênica ou uma vacina contra o parovírus de suíno ou a administração de uma vacina ou composição imunogênica biva- lente, compreendendo, na mesma formulação, uma preparação antigênica específica para cada vírus. Este método de imunização ou vacinação usa em particular as vacinas como definidas acima. O objetivo da invenção é também o uso de uma preparação an- tigênica ou de uma composição imunogênica ou uma vacina contra o parvo- vírus, como em particular definido supra, para a preparação de uma compo- sição farmacêutica destinada a ser usada no contexto da prevenção da sín- drome de PMWS, em combinação com uma preparação antigênica ou uma composição imunogênica ou uma vacina contra o circovírus de suíno.
Para a produção de preparações antigênicas de circovírus, os circovírus podem ser obtidos depois da passagem sobre as células, em par- ticular linhas de célula, por exemplo, células PK/15. Os extratos ou sobrena- dantes de cultura, opcionalmente purificados por técnicas padrão podem ser usados como preparação aníigênica.
No contexto de preparações antigênicas atenuadas e vacinas ou composições imunogênicas atenuadas, a atenuação pode ser realizada de acordo com os métodos habituais, por exemplo, por passagem sobre as cé- lulas, de preferência por passagem sobre células de porco, especialmente linhas de célula, tais como células PK/15 (por exemplo, de 50 a 150, especi- almente da ordem de 100 passagens). Estas vacinas e composições imuno- gênicas compreendem em geral um veículo ou diluente aceitável a partir do ponto de vista veterinário, opcionalmente um auxiliar aceitável a partir do ponto de vista veterinário, bem como opcionalmente um estabilizador seco por congelamento.
Estas preparações antigênicas, vacinas e composições imuno- gênicas de preferência compreenderão de 103 a 107 TCID50 do vírus atenu- ado em questão.
Elas podem ser preparações antigênicas, vacinas e composi- ções imunogênicas com base em antígeno inteiro. As vacinas e composi- ções imunogênicas inativadas compreendem, além disso, um veículo ou um diluente aceitável a partir do ponto de vista veterinário, com opcionalmente além de um auxiliar aceitávei a partir do ponto de vista veterinário.
Os circovírus de acordo com a invenção, com as frações as quais devem estar presentes, são inativas de acordo com as técnicas co- nhecidas por pessoas versadas na técnica. A inativação será de preferência realizada pela rota química, por exemplo, por exposição do antígeno a um agente químico tais como tormaldeído (formalina), paraformaldeído, beta- propiolactona ou etilenoimina ou seus derivados. O método preferido de ina- tivação será aqui a exposição a um agente químico e em particular a etile- noimina ou a beta-propiolactona.
De preferência, as preparações antigênicas inativadas e as vaci- nas e composições imunogênicas inativadas de acordo com a invenção se- rão suplementadas com auxiliar, vantajosamente por serem providas na for- ma de emulsões, por exemplo, água em óleo ou óleo em água, de acordo com as técnicas bem conhecidas por pessoas versadas na técnica. Será possível para o caráter auxiliar também vir da incorporação de um composto auxiliar habitual no ingrediente ativo.
Entre os auxiliares que podem ser usados, pode ser mencionado a título de exemplo hidróxido de alumínio, as saponinas (por exemplo, sapo- nina de Quillaja ou Quil A; ver "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, editado por Michael F. Powel and Mark J. Newman, Plen- num Press, New York e Londres, pág. 210), Avridine® (Vaccine Design pág. 148), DDA (brometo de dimetildioctadecilamônio, Vaccine Design pág. 157), Polifosfazeno (Vaccine Design pág. 204), ou alternativamente emulsões de óleo em água com base em óleo mineral, esqualeno (por exemplo, emulsão de SPT, Vaccine Design pág. 147), esqualeno (por exemplo, MF59, Vaccine Design pág. 183), ou emulsões de água em óleo com base em óleo metabo- lizável (de preferência de acordo com a WO-A 94 20071) bem como as emulsões descritas na US-A-5.422.109. É também possível escolher combi- nações de auxiliares, por exemplo, Avridine® ou DDA combinada com emul- são.
Estas preparações antigênicas, vacinas e composições imuno- gênicas de preferência compreenderão de 105 a 108 TCID50 do vírus inteiro inativado em questão.
Os auxiliares para vacinas vivas descritas acima podem ser se- lecionados daqueles dados para os inativados. As emulsões são preferidas.
Para aqueles indicados para a vacina inativada, podem ser adicionados aqueles descritas na WO-A 9416681.
Como estabilizador de secagem por congelamento, pode ser mencionado a título de exemplo SPGA (Bovarnik e outros, J. Bacteriology 59, 505, 950), carboidratos tal como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dex- trano ou glicose, proteínas tal como albumina ou caseína, derivados destes compostos ou tampões tais como fosfatos de metal alcalino.
As preparações antigênicas, vacinas e composições imunogêni- cas de acordo com a presente invenção podem compreender um ou mais ingredientes ativos (antígenos) de um ou mais circovírus e/ou parvovírus de acordo com a invenção. A requerente, além disso, obtinha o genoma de quatro dos iso- lados de circovírus de suíno tipo II, identificado SEQ ID NO; 1 a 4. A se- quência da cepa PK-15 é dada como SEQ ID NO: 5. É evidente que a inven- ção automaticamente cobre as seqüências equivalentes, isto é, as seqüên- cias que não mudam a funcionalidade ou a especificidade de cepa da se- quência descrita ou dos polipeptídeos codificados por esta seqüência. Natu- ralmente serão incluídas as seqüências que se diferem por degeneração do código. A invenção também cobre as seqüências equivalentes no senti- do que elas são capazes de se hibridizar com a seqüência acima sob condi- ções de alta severidade e/ou têm uma alta homoiogia com as cepas da in- venção.
Estas seqüências e seus fragmentos podem ser vantajosamente usados para a expressão in vitro ou in vivo de polipeptídeos com o auxílio de vetores apropriados.
Em particular, os quadros de leitura abertos (ORF1-13), que formam fragmentos de DNA de acordo com a invenção, que podem ser usa- dos para este efeito foram identificados na seqüência genômica dos circoví- rus de tipo II. A invenção se refere a qualquer polipeptídeo contendo pelo menos um destes quadros de leitura abertos {seqüência de aminoácidos correspondentes). De preferência, a invenção se refere a uma proteína es- sencialmente que consiste de ORF4, ORF7, ORF10 ou ORF13.
Para a expressão de subunidades in vitro, como um meio de ex- pressão, E. coli ou baculovírus será de preferência usada (US-A-4.745.051). A(s) seqüência(s) de codificação ou seus fragmentos podem ser integrados no genoma de baculovírus (por exemplo, o baculovírus de vírus de poliedro- se nuclear Autographa californica AcNPV) e o último pode ser então propa- gado sobre células de inseto, por exemplo, Spodoptera frugiperda Sf9 (de- pósito ATCC CRL 1711). As subunidades podem também ser produzidas em células eucarióticas tais como leveduras (por exemplo, Saccharomyces ce- revisiae) ou células de mamífero (por exemplo, CHO, BHK). O objetivo da invenção é também o uso como subunidades dos polipeptídeos que serão produzidos in vitro por estes meios de expressão, e então opcionalmente serão purificados de acordo com as técnicas convenci- onais. As vacinas e composições imunogênicas de subunidade compreen- dem pelo menos um polipeptídeo como assim obtido ou fragmento em um veículo ou diluente aceitável a partir do ponto de vista veterinário e opcio- nalmente um auxiliar aceitável a partir do ponto de vista veterinário.
Para a expressão in vivo para a finalidade de produção de vaci- nas e composições imunogênicas do tipo de DNA ou do tipo vivo recombi- nante, a(s) seqüência(s) de codificação ou seus fragmentos são inseridos em um vetor de expressão apropriado sob condições que permitem a ex- pressão do(s) polipeptídeo(s). Quando apropriados vetores vivos, podem ser usados de preferência vírus vivos, de preferência capazes de se multiplica- rem em porcos, não-patogênicos para porcos (naturalmente não- patogênicos ou tornados como tais), de acordo com as técnicas bem conhe- cidas por pessoas versadas na técnica. Pode ser usado em particular her- pesvírus de porco tais como vírus de doença de Aujesky, adenovírus de suí- no, vírus de pústela, especialmente vírus de vacina, vírus da varíola de aves, vírus da varíola dos canários, vírus da varíola suína. Vetores de DNA podem também ser usados como vetores (WO-A 9011092, WO-A 9319813, WO-A 9421797, WO-A 9520660). O objetivo da invenção é, por esse motivo, também os vetores e as vacinas e composições imunogênicas de tipo de DNA (polinucleotídeo) ou tipo vivo recombinante assim preparados, sua preparação e seu uso, as va- cinas e as composições imunogênicas compreendendo, além disso, um veí- culo ou um diluente aceitável a partir do ponto de vista veterinário.
Por definição, uma vacina ou composição imunogênica de DNA compreende um vetor de DNA que é um plasmídio vacinai circular, superen- rolado ou de outra maneira, ou uma molécula de DNA linear, que incorpora ou que expressa in vivo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um po- lipeptídeo antigênico.
Vacinas e composições imunogênicas de tipo DNA e recombi- nantes podem compreender um auxiliar.
No contexto dos programas de vacinação ou imunização combi- nada, é também possível combinar a imunização ou vacinação contra o cir- covírus de suíno e o parvovírus de suíno com uma imunização ou vacinação contra outros patógenos de porco, em particular aqueles que poderíam estar associados à síndrome de PMWS. A vacina ou composição imunogênica de acordo com a invenção pode, portanto, compreender uma outra valência que corresponde a um outro patógeno de porco escolhido de PRRS (Síndrome Respiratória e Reprodutora de Suíno) e/ou hyponeumoniae Mycopíasma, e/ou E. coli, e/ou Rinite Atrófica, e/ou vírus de Pseudo-raiva (doença de Au- jeszky) e/ou influenza de suíno e/ou pleuropneumonias de Actinobacilus e/ou cólera de Hog, e suas combinações. De preferência, o programa de imuni- zação ou vacinação e as vacinas de acordo com a invenção combinarão imunizações ou vacinações contra o circovírus e o parvovírus, e a PRRS (WO-A-93/07898, WO-A-94/18311, FR-A 2 709 966; C. Charreyre e outros, Proceedings of the 15th IPVS Congress, Birmingham, Inglaterra, em 5-9 de julho de 1998, pág. 139; e/ou hyponeumoniae Mycopíasma (EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A-571 648; O. Martinon e outros, págs. 157, 284, 285 e G. Reynaud e outros, pág. 150, todos referenciados acima no procedings of the 15° IPVS Congress) e/ou influenza de suíno. É assim possível usar qual- quer forma apropriada de vacina ou composição imunogênica em particular qualquer vacina comercial disponível, de modo a combiná-la com a vacina ou composição imunogênica contra o circovírus de suíno e parvovírus de suíno como descritos aqui. O objetivo da presente invenção é, portanto, também vacinas e composições imunogênicas multivalentes, kits de multivacinas e métodos de vacinação ou imunização combinados que tomam possível se usar tais pro- gramas de vacinação ou imunização combinados. A invenção agora será descrita em maior detalhes com o auxílio de concretizações exemplares não limitantes, tomadas com referência ao desenho, em que Figura 1: sequência de DNA do genoma da cepa Imp. 1011 -48121.
Figura 2: seqüência de DNA do genoma da cepa Imp. 1011-48285.
Figura 3: sequência de DNA do genoma da cepa Imp. 999.
Figura 4: seqüência de DNA do genoma da cepa Imp. 1010.
Figura 5: Alinhamento das 4 sequências de acordo com as figuras de 1 a 4 com a seqüência da cepa PK/15 de PCV.
Listagem de Seqüência SEQ ID SEQ ID NO: 1 seqüência de DNA do genoma da cepa Imp. 1011-48121 SEQ ID NO: 2 seqüência de DNA do genoma da cepa Imp. 1011-48285 SEQ ID NO: 3 seqüência de DNA do genoma da cepa Imp. 999 SEQ ID NO: 4 seqüência de DNA do genoma da cepa Imp. 1Ò10 SEQ ID NO: 5 seqüência de DNA do genoma da cepa PK/15 Exemplos Exemplo 1: Cultura e isolamento das cepas de circovírus de suíno Amostras de tecido foram coletadas na França, Canadá e nos Estados Unidos oriundas de pulmão e linfonodos de leitões. Estes leitões exibiram sinais clínicos típicos da síndrome emaciação multissistêmica pós- desmame. Para facilitar o isolamento do vírus, as amostras de tecido foram congelados a -70°C imediatamente após a autópsia.
Para o isolamento viral, suspensões contendo cerca de 15% de amostra de tecido foram preparadas em um meio mínimo contendo sais de Earle (EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham, RU), penicilina (100 lU/ml) e estreptomicina (100 pg/ml) (meio de MEM-AS), por moagem de tecidos com areia estéril usando-se um pilão e almofariz estéreis. Esta preparação moída foi então colocada em MEM-AS, e então foi centrifugada a 3000 g por 3 minutos a +4°C a fim de coletar o sobrenadante.
Antes da inoculação das culturas de célula, um volume de 100 μΐ de clorofórmio foi adicionado a 2 ml de cada sobrenadante e foi misturado continuamente por 10 minutos a temperatura ambiente. Esta mistura foi en- tão transferida para um tubo de microcentrífuga, foi centrifugada a 3000 g por 10 minutos, e então o sobrenadante foi coletado. Este sobrenadante foi então usado como inóculo para as experiências de isolamento viral.
Todos os estudos de isolamento viral foram realizados sobre culturas de célula PK/15, conhecidos como sendo não contaminadas com circovírus de suíno (PCV), pestivírus, adenovírus de suíno e parvovírus de suíno (Allan G. e outros "Pathogenesis of porcine circovírus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal materi- al." Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64). O isolamento dos circovírus de suíno foi realizado de acordo com a seguinte técnica: Monocamadas de células PK/15 foram dissociadas por tripsini- zação (com uma mistura de tripsina-verseno) oriundas de culturas confluen- tes, e foram tomadas em meio de MEM-AS contendo 15% de soro de bezer- ro fetal não contaminado por pestivírus (= meio de MEM-G) em uma con- centração final de cerca de 400.000 células por ml. 10 ml de frações de alí- quota desta suspensão de célula foram então misturados com 2 ml de fra- ções de alíquota dos inóculos descritos abaixo, e as misturas finais foram divididas em alíquotas em volumes de 6 ml em dois frascos Falcon de 25 cm2. Estas culturas foram então incubadas a +37°C por 18 horas sob uma atmosfera contendo C02 a 10%.
Depois da incubação, o meio de cultura das monocamadas se- miconfluentes foram tratadas com D-glucosamina a 300 mM (Cat n- G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, RU) (Tischr I. e outros, Arch. Virol., 1987 96 39-57), então incubação foi continuada por um período adicional de 48-72 horas a +37°C. Após esta última incubação, um dos dois Falcons de cada inóculo foi submetido a 3 ciclos de congelamento/descongelamento sucessivos. As células PK/15 do Falcon remanescente foram tratadas com uma solução de tripsina-verseno, foram ressuspensas em 20 ml de meio de MEM-G e então foram inoculadas em Falcons de 75 cm2 em uma concentra- ção de 400.000 células/ml. Os frascos frescamente inoculados foram então "superinfectados" pela adição de 5 ml de íisados correspondente obtidos de- pois do ciclo de congelamento/descongelamento.
Exemplo 2: Preparação das amostras de cultura de célula para a detecção de circovírus de suíno por imunofluorescência ou por hibridi- zação in situ Um volume de 5 ml da suspensão "superinfectada" foi coletado e foi inoculado em um placa de Petri de 55 mm de diâmetro contendo uma lamínula de vidro livre de gordura estéril. As culturas nos frascos e sobre as lamínulas de vidro foram incubadas a +37°C e foram tratadas com glucosa- mina como descrito no exemplo 1. As culturas sobre as lamínulas de vidro foram coletadas a partir de 24 a 48 horas depois do tratamento com gluco- samina e foram fixadas, ou com acetona por 10 minutos à temperatura am- biente, ou com formaldeído tamponado a 10% por 4 horas. Após esta fixa- ção, todas as lamínulas foram armazenadas a -70°C, sobre sílica gel, antes de seu uso para os estudos de hibridização in situ e os estudos de marcador imunocitoquímico.
Exemplo 3: Técnicas para a detecção de sequências de PCV por hibridização in situ Hibridização in situ foi realizada sobre tecidos coletados a partir de porcos doentes e foram fixados com formaldeído e também sobre as pre- parações de culturas de células inoculadas para o isolamento viral (ver o exemplo 2) e foram fixados sobre lamínulas de vidro.
Sondas genômicas completas que correspondem ao circovírus de suíno PK/15 (PCV) e ao vírus de anemia de frango infeccioso (CAV) fo- ram usadas. O plasmídio pPCV1, contendo a forma replicativa do genoma de PCV, clonado na forma de um inserto de 1,7 quilo pares de base (kbp) único (Meehan B. e outros, "Sequence of porcine circovírus DNA: affinities with plant circovírus", J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227), foi usado como fonte de DNA viral específico para PCV. Um plasmídio análogo, pCAA1 contendo a forma replicativa de 2,3 kbp circovírus de ave CAV foi usado como controle negativo. Os estoques de glicerol respectivos dos dois plasmídios foram usados para a produção e purificação dos plasmídios de acordo com a téc- nica de lise alcalina (Sambrook J. e outros, "Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) de modo que eles são então usados como modelos para a preparação das sondas. As sondas de circovírus representativas dos geno- mas completos de PCV e de CAV foram produzidas a partir dos plasmídios purificados descritos acima (1 μg para cada sonda) e a partir de iniciadores de hexanucleotídeo no uso aleatório de um kit de marcador não radioativo comercial ("kit de marcador de DIG DNA", Boehringer Mannheim, Lewes, RU) de acordo com as recomendações do fornecedor.
Sondas marcadas por digoxigenina foram colocadas em um vo- lume de 50-100 μΙ de água estéril antes de serem usadas para a hibridiza- ção in situ.
As amostras de tecido de porco doente, encerradas em parafina e fixadas com formaldeído, bem como as preparações de culturas de célula infectadas, fixadas com formaldeído, foram preparadas para a detecção dos ácidos nucléicos de PCV de acordo com a seguinte técnica: Seções de 5 μηη de espessura foram cortadas de blocos de teci- do encerrados em parafina, foram tornadas livres, e então foram reidratadas em soluções sucessivas de álcool em concentrações descrescentes. As se- ções de tecido e as culturas de célula fixadas com formaldeído foram incu- badas por 15 minutos e 5 minutos respectivamente a +37°C em uma solução de proteinase K a 0,5% em tampão de Tris-HCI a 0,05 M contendo EDTA a 5 mM (pH 7,6). As lâminas foram então colocadas em uma solução de glicina a 1% em água destilada tratada em autoclave por 30 segundos, foram lava- das duas vezes com tampão de PBS a 0,01 M (solução salina tamponada por fosfato) (pH 7,2), e finalmente foram lavadas por 5 minutos em água destilada estéril. Elas foram finalmente secas no ar livre e foram colocadas em contato com as sondas.
Cada preparação de tecido/sonda foi coberta com uma iamínula de vidro livre de gordura e limpa, e então foi colocada em um forno a +90°C por 10 minutos, e então foi colocada em contato com um bloco de gelo por 1 minuto, e finalmente foi incubada por 18 horas a +37°C. As preparações fo- ram então brevemente imersas em um tampão de sal de citrato de sódio 2x (SSC) (pH 7,0) a fim de remover as lamínuias de vidro protetoras, e então foram lavadas duas vezes por 5 minutos em tampão de SSC 2x e finalmente foram lavadas duas vezes por 5 minutos em tampão de PBS.
Depois destas lavagens, as preparações foram imersas em uma solução de ácido maléico a 0,1 M, NaCI a 0,15 M (pH 7,5) (tampão maléico) por 10 minutos, e então foram incubadas em uma solução a 1% de reagente de bloqueamento (cat ne 1096176, Boehringer Mannheim RU, Lewis, East Sussex, RU) em tampão maléico por 20 minutos a +37°C.
As preparações foram então incubadas com uma solução de 1/250 de um anticorpo monoclonal de anti-digoxigenina (Boehringer Man- nheim), foram diluídas em tampão de bloqueamento, por 1 hora a +37°C, foram lavadas em PBS e finalmente foram incubadas com um anticorpo de imunoglobulina de anticamundongo biotinilado por 30 minutos a +37°C. As preparações foram lavadas com PBS e a atividade de peroxidase endógena foi bloqueada por tratamento com uma solução de peróxido de hidrogênio a 0,5% em PBS por 20 minutos a temperatura ambiente. As preparações fo- ram novamente lavadas em PBS e foram tratadas com um substrato de 3- amino-9-dietilcarbazol (AEG) (Cambridge Bioscience, Cambridge, RU) foram preparadas imediatamente antes do uso.
Depois de uma lavagem final com água de torneira, as prepara- ções foram contra manchadas com hematoxilina, "azuladas'1 sob água de torneira, e foram montadas sobre lamínuias de vidro de microscópio com um fluido de montagem (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, RU).
Os controles experimentais incluíam o uso de sonda negativa não pertinente (CAV) e de uma sonda positiva (PCV) sobre amostras obtidas a partir de porcos doentes e a partir de porcos não doentes.
Exemplo 4: Técnica para a detecção de PCV por imunofluorescên- cia A triagem inicial de todas as preparações de cultura de célula fi- xada com acetona foi realizada por uma técnica de imunofluorescência indi- reta (IIF) usando-se uma diluição 1/100 de uma combinação de soros de porco adulto. Esta combinação de soros compreende soros oriundos de 25 porcas adultas oriundas da Irlanda do Norte e é conhecida como contendo anticorpos contra uma ampla variedade de vírus de suíno, incluindo PCV: parvovírus de suíno, adenovírus de suíno, e vírus de PRRS. A técnica de IIF foi realizada por o soro (diluído em PBS) em contato com as culturas celula- res por uma hora a +37°C, seguido por duas lavagens em PBS. As culturas de célula foram então manchadas com uma diluição de 1/80 em PBS de um anticorpo de imunoglobulina de antiporco de coelho conjugado com isotioci- anato de fluoresceína por uma hora, e então foram lavadas com PBS e fo- ram montadas no tampão de glicerol antes da observação de microscópico sob luz ultravioleta.
Exemplo 5: Resultados da hibridização in situ sobre tecidos de porco doente A hibridização in situ, usando-se uma sonda genômica de PCV, preparada a partir de tecidos coletados a partir de leitões Canadenses e Ca- lifornianos tendo lesões de emaciação e fixados com formaldeído, mostra- ram a presença de ácidos nucléicos de PCV associados à lesões, em várias das lesões estudadas. Nenhum sinal foi observado quando a sonda genômi- ca de PCV foi usada sobre tecidos coletados a partir de porcos não doentes ou quando a sonda de CAV foi usada sobre os tecidos de porco doente. A presença de ácido nucléico de PCV foi identificada no citoplasma e no nú- cleo de numerosas células mononucleares infiltrando as lesões nos pulmões dos leitões californianos. A presença de ácido nucléico PCV também foi de- monstrada nos penumócitos, as células epiteliais bronquiolar e brônquicas, e nas células endoteliais, e nas células endoteliais das ateríolas, as vênulas e vasos linfáticos.
Em porcos franceses doentes, a presença de ácido nucléico de PCV foi detectada no citoplasma de numerosos linfócitos foliculares e nas células mononucleares intrassinosoidal dos nódulos linfáticos. O ácido nu- cléico de PCV foi também detectado em sincícios ocasionais. Dependendo destes resultados de detecção, amostras de pulmões de porcos california- nos, linfonodos mesentéricos de porcos franceses e órgãos de porco cana- dense foram selecionados quanto a finalidade de isolamento de novas cepas de circovírus de suíno.
Exemplo 6: Resultados da cultura de célula das novas cepas de circovírus de suíno e detecção por imunofluorescência Nenhum efeito citopático (CPE) foi observado nas culturas de célula inoculadas com as amostras coletadas a partir de leitões franceses (cepa de Imp. 1008), leitões californianos (cepa de Imp. 999) e leitões cana- denses (cepa de Imp. 1010) que mostram sinais clínicos de síndrome de emaciação multissistêmicas. No entanto, imunomarcação das preparações obtidas a partir das culturas de célula inoculadas, depois da fixação usando- se acetona e com uma combinação de soros policlonaís de porco, fluores- cência nuclear revelada em numerosas células nas culturas inoculadas usando-se os pulmões de leitões californianos (cepa de Imp. 999), usando- se os linfonodos mediastinais de leitões franceses (cepa de Imp. 1008), e usando-se órgãos de leitões canadenses (cepa de Imp. 1010).
Exemplo 7: Extração do DNA genômico dos circovírus de suíno As formas replicativas das novas cepas de circovírus de suíno (PCV) foram preparadas usando-se culturas de célula de PK/15 infectadas (ver o exemplo 1) (10 Falcons de 75 cm2) foram coletadas depois de 72-76 horas de incubação e foram tratadas com glucosamina, como descrito para a clonagem da forma replicativa de CAV (Todd. D. e outros, "Dot Blot hybridi- zation assay for chicken anaemia agent usíng a cloned DNA probe". J. Clin.
Microbiol. 1991, 29, 933-939). O DNA de fio duplo destas formas replicativas foi extraído de acordo com uma modificação da técnica de Hirt (Hirt B. "Se- lective extraction of polyoma vírus DNA form infected cell cultures", J. Mol.
Biol. 1967, 36, 365-369), como descrito por Molitor (Molitor T.W. e outros, Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two vírus isolates”, Virology, 1984, 137, 241-254).
Exemplo 8: Mapa de restrição da forma replicativa do genoma da cepa Imp. 999 de circovírus de suíno O DNA (1-5 pg) extraído de acordo com a técnica de Hirt foi tra- tado com nuclease de S1 (Amersham) de acordo com as recomendações do fornecedor, e então este DNA foi digerido com várias enzimas de restrição (Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, RU) e os produtos de digestão foram separados por eletroforese sobre um gel de agarose a 1,5% na pre- sença de brometo de etídio como descrito por Todd e outros ("Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent". J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823). O DNA extraído das culturas da cepa de Imp. 999 pos- sui um único sítio de EcoRI, 2 sítios de Saci e não possui qualquer sítio de Pstl. Este perfil de restrição é, portanto, diferente do perfil de restrição mos- trado pela cepa de PK/15 de PCV (Meehan B. e outros, "Sequence of porci- ne circovirus DNA: affinities with plant circoviruses", 1997 78, 221-227) que possui em contraste com isso um sítio de Pstl e não possui qualquer sítio de EcoRI.
Exemplo 9: Clonagem do genoma da cepa Imp. 999 de circovirus de suíno O fragmento de restrição de cerca de 1,8 kbp gerado por diges- tão da forma replicativa de fio duplo da cepa de Imp. 999 de PCV com a en- zima de restrição EcoRI foi isolada depois de eletroforese sobre um gel de agarose a 1,5% (ver o exemplo 3) usando-se um kit comercial Qiagen (kit de Extração de gel QIAEXII, cat n° 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, RU). Este fragmento de restrição EcoRI-EcoRI estava então ligado com o vetor pGEM-7 (Promega, Medicai Supply Company, Dublin, Irlanda), anteri- ormente digerido com as mesmas enzimas de restrição e foi desforilado, de acordo com as técnicas de clonagem padrão (Sambrook J. e outros, "Mole- cular Cloning: A Laboratory Manual", 2' ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Coíd Spring Harbor, Nova Iorque, 1989). Os plasmídios obtidos foram trans- formados em uma cepa de hospedeiro JM109 de Escherichia coli (Stratage- ne, La Jolla, USA) de acordo com técnicas padrão. O fragmento de restrição de EcoRI-EcoRI da cepa de Imp. 999 de PCV foi também clonado para dar o sítio de EcoRI do vetor pBlueScript SK+ (Stratagene Inc. La Jolla, EUA). En- tre os clones obtidos para cada cepa de hospedeiro, pelo menos dois clones contendo os fragmentos o tamanho esperado foram selecionados. Os clones obtidos foram então cultivados e os plasmídio contendo o genoma completo da cepa de Imp. 999 foram purificados em um volume pequeno (2 ml) ou em um volume grande (250 ml) de acordo com a preparação de plasmtdio pa- drão e técnicas de purificação.
Exemplo 10: Seqüenciação de um DNA genômico (forma replicati- va de fio duplo) da cepa de imp. 999 de PVC.
A seqüência de nucleotídeos de 2 clones de Imp. 999 de EcoRI (clones pGEM-7/2 e pGEM-7/8) foi determinada de acordo com a técnica de didesoxinucleotídeo de Sanguer usando-se o kit de seqüenciação "AmpliTaq DNA polymerase FS" (cat n- 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, RU) e um aparelho de seqüenciação automático Applied Biosystems AB1373A de acordo com as recomendações do fornecedor. As reações de seqüenciação iniciais foram realizadas com os inicíadores universais M13 "reversos" e "para frente". As seguintes reações de seqüenciação foram ge- radas de acordo com a técnica de "DNA itinerante". Os oligonucleotídeos necessários para estas seqüencíações subsequentes foram sintetizados Life Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, RU).
As sequências geradas foram montadas e foram analisadas por meio do softwares 3.2 versão MacDNASIS (Cat Ns 22020101, Appligene, Durham, RU). Os vários quadros de leitura abertos foram analisados por meio do algoritmo BLAST disponível no servidor "National Center for Biote- chnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA). A seqüência completa (fragmento de EcoRI-EcoRI) está apre- sentada na SEQ ID NO: 3 (figura 3). Ela dá a seqüência total desta cepa, que foi produzida para se iniciar arbitrariamente no início do sítio de EcoRI, isto é, o G como o primeiro nucleotídeo. O procedimento foi realizado de um modo similar para a obten- ção da seqüência dos outros três isolados de acordo com a invenção (ver SEQ ID NO: 1,2 e 4 e figuras 1,2 e 4). O tamanho do genoma destas quatro cepas é I mp. 1011 -48121 1767 nucleotídeos Imp. 1011-48285 1767 nucleotídeos Imp. 999 1768 nucloetídeos Imp. 1010 1768 nucleotídeos Exemplo 11: Análise da seqüência da cepa de Imp. 999 de PCV
Quando a seqüência gerada a partir da cepa de Imp. 999 foi usada para testar quanto a homologia com relação às sequências contidas nos bancos de dados GenBank, a homologia apenas significativa que foi detectada é uma homologia de cerca de 76% (em nível de ácido nucléico) com a seqüência da cepa de PK/15 (números de acesso Y09921 e U49186) (ver a figura no. 5).
Em nível de aminoácido, o teste para homologia na tradução das seqüências nas 6 fases com os bancos de dados (BLAST X algoritmo no servidor NABI) tornou possível demonstrar uma homologia de 94% com o quadro de leitura aberto correspondente à replicase teórica do vírus BBTV similar aos circovírus de plantas (número de identificação de GenBank 1841515) codificado pela seqüência U49186 da GenBank.
Nenhuma outra seqüência contida nos bancos de dados mos- tram homologia significativa com a seqüência gerada a partir da cepa de Imp. 999 de PCV.
Análise das seqüências obtidas a partir da cepa de Imp. 999 cul- tivada usando-se lesões coletadas a partir de leitões californianos tendo si- nais clínicos da síndrome de emaciação muítissistêmica mostra claramente que este isolado viral é uma nova cepa de circovírus de suíno.
Exemplo 12: Análise comparativa das seqüências O alinhamento das seqüências de nucleotídeos das 4 novas ce- pas de PCV foi produzida com a seqüência da cepa de PK/15 de PCV (figura 5). Uma matriz de homologia levando em consideração as quatro novas ce- pas e a cepa de PK/15 anterior foi estabelecida. Os resultados são os se- guintes: 1: Imp. 1011-48121 2: Imp. 1011-48285 3: Imp. 999 4: Imp. 1010 5: PK/15 A homologia entre as duas cepas francesas Imp. 1011-4821 e Imp. 1011-48285 é maior do que 99% (0,9977). A homologia entre as duas cepas norte americanas Imp. 999 e Imp. 1010 é também maior do que 99% (0,9949). A homologia entre as ce- pas francesas e as cepas norte americanas é levemente maior do que 96%. A homologia entre todas as cepas e PK/15 cai em um valor entre 75 e 76%. É deduzido a partir do mesmo que as cepas de acordo com a in- venção são representativas de um novo tipo de circovírus de suíno, diferen- temente do tipo representado pela cepa de PK/15. Este novo tipo, isolado de porcos que exibe a síndrome de PMWS, é chamado circovírus de suíno de tipo II, PK15 que representa tipo 1. As cepas que pertencem a este tipo II exibem homogeneidade de seqüência de nucleotídeos remarcável, embora elas tenham de fato sido isoladas de regiões geográficas muito distantes.
Exemplo 13: Análise das proteínas codificadas pelo genoma das novas cepas de PCV A seqüência de nucleotídeos do isolado de Imp. 1010 foi consi- derada ser representativa de outras cepas de circovírus associadas à sín- drome de emaciação multissistêmica. Esta seqüência foi analisada em maior detalhes com o auxílio do algoritmo BLASTX (Altschul e outros, J. Mol. Bio. 1990, 215. 403-410) e de uma combinação de programas do conjunto de programa MacVector 6.0 (Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, RU).
Foi possível detectar 13 quadros de leitura abertos (ou ORFs) de um tama- nho maior do que 20 aminoácidos sobre esta seqüência (genoma circular).
Estes 13 ORFs são os seguintes: As posições do início e do fim de cada ORF se referem à se- qüência representada na fig. no. 4 (SEQ ID NO: 4), do genoma da cepa 1010. Os limites de ORFs de 1 a 13 são idênticos para cepa 999. Elas são também idênticas para cepas 1011-48121 e 10110-48285, exceto para os ORFs 3 e 13: ORF3 1432-1539, sentido, 108 nt, 35 aa ORF13 314-1377, sem sentido, 705 nt, 234 aa Entre estes 13 ORFs, 4 têm uma homologia significativa com os ORFs análogos situados sobre o genoma do vírus clonado PK-15 de PCV.
Cada um dos quadros de leitura abertos presentes sobre o genoma de todos os isolados de circovírus associados à síndrome de emaciação mulstisistê- mica foi analisada. Estes 4 ORFs são os seguintes: As posições do início e do fim de cada ORF se referem à se- qüência apresentada na fig. no. 4 (SEQ ID NO: 4). O tamanho do ORF (em nucloetídeos = nt) inclui o códon de parada. A comparação entre a organização genômica dos isolados de PK-15 de PCV e Imp. 1010 de PCV permitiu a identificação de 4 ORFs pre- servados no genoma de dois vírus. A tabela abaixo apresenta os graus de homologia observado: A identidade de sequência maior foi observada entre ORF4 Imp. 1010 e ORF1 PK-15 (86% de homologia). Isto foi esperado uma vez que esta proteína é provavelmente envolvida na replicação do DNA viral e é es- sencial para a replicação viral (Meehan e outros, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227; Mankertz e outros, J. Gen. Virol. 1998, 79, 381-384). A identidade de sequência entre ORF13 Imp. 1010 e ORF2 PK- 15 é menos forte (66,4% de homologia), mas cada um destes dois ORFs de fato exibe uma região básica N-terminal altamente conservada que é idênti- ca à região N-terminal da principal proteína estrutural do circovírus de ave de CAV (Meehan e outros, "Arch. Virol". 1992, 124, 301-319). Além do mais, grandes diferenças são observadas entre ORF7 Imp. 1010 e ORF3 PK-15 e entre ORF10 Imp. 1010 e ORF4 PK-15. Em cada caso, há uma deleção da região C-terminal do ORF7 e ORF10 do isolado de Imp. 1010 quando eles são comparados com ORF3 e ORF4 de PK-15 de PCV. A homologia de se- quência maior é observada no nível de regiões N-terminais de ORF7/ORF3 (61,5% de homologia no nível da sobreposição) e de ORF10/ORF4 (83% de homologia no nível da sobreposição).
Parece que a organização genômica do circovírus de suíno é totalmente complexa como uma conseqüência de compacidade extrema de seu genoma. A principal proteína estrutural é provavelmente derivada da união entre vários quadro de leitura situados no mesmo fio do genoma de circovírus de suíno. Pode, portanto, ser considerado que qualquer quadros de leitura aberto pode representar toda ou parte da proteína antigênica codi- ficada pelo circovírus de suíno de tipo II e é portanto potencialmente um an- tígeno que pode ser usado para diagnose específica e/ou para vacinação. A invenção, portanto, se refere a qualquer proteína que compreende pelo me- nos um destes ORFs. De preferência, a invenção se refere a uma proteína essencialmente que consiste de ORF4, ORF7, ORF10 ou ORF13.
Exemplo 14: Caráter infeccioso do genoma de PCV clonado a par- tir das novas cepas O plasmídio pGEM-7/8 contendo o genoma completo (forma re- plicativa) do isolado de Imp. 999 foi tranfectado em células de PK/15 de acordo com a técnica descrita por Meehan B. e outros, ("Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genoma fragments". Arch. Virol. 1992, 124, 301-319). Análise de imunofluorescência (ver o exemplo 4) realizada sobre a primeira passagem depois da transfec- ção sobre células de PK/15 não contaminadas demonstraram que o plasmí- dio do clone pGEM7/8 foi capaz de induzir a produção de vírus de PCV in- feccioso. A disponibilidade de um clone contendo um material genético de PCV infeccioso permite qualquer manipulação útil sobre o genoma viral a fim de produzir vírus de PCV modificados (ou atenuado em porcos ou defeituo- sos) que podem ser usados para a produção de vacinas recombinantes ou atenuadas, ou para a produção de antígenos para kits de diagnósticos.
Exemplo 15: Produção de antígenos de PCV por cultura in vitro A cultura das células de PK/15 não contaminadas e a multiplica- ção viral foram realizadas de acordo com o mesmo método que no exemplo 1. As células infectadas são coletadas depois da tripsinização depois de 4 dias da incubação a 37°C e foram enumeradas. A próxima passagem é ino- culada com 400.000 células infectadas por mol.
Exemplo 16: Inativação dos antígenos virais No fim da cultura viral, as células infectadas são coletadas e são lisadas usando-se ultra-som (Sonicador Branson) ou com o auxílio de moi- nho coloidal de tipo rotor-estator (UltraTurrax, IKA). A suspensão é então centrifugada a 3700 g por 30 minutos. A suspensão viral é inativada com etilenoimina a 0,1% por 18 horas a +37°C ou com beta-propiolactona a 0,5% por 24 horas a +28°C. Se o título de vírus antes da inativação é inadequado, a suspensão viral é concentrada por ultrafiltração usando-se uma membrana com um corte de 300 kDa (Millipore PTMK300). A suspensão viral inativada é armazenada a +5°C.
Exemplo 17: Preparação da vacina na forma de uma emulsão à base de óleo mineral A vacina é preparada de acordo com a seguinte fórmula: suspensão de circovírus de suíno inativada 250 ml Montanide® ISA 70 (SEPPCI): 750 ml A fase aquosa e a fase oleosa são esterilizadass separadamente por filtração. A emulsão é preparada por misturação e homogeneização dos in- gredientes com o auxílio de um emulsificador de turbina Silverson.
Uma dose de vacina contém cerca de 1075 TCID50. O volume de uma dose de vacina é de 0,5 ml para a administração pela rota transdér- mica, e 2 ml para a administração pela rota intramuscular.
Esta vacina é usada em um programa de vacinação contra a síndrome de emaciação multissistêmica em combinação com a vacina Par- vovax®.
Exemplo 18: Preparação da vacina na forma de uma emulsão à base de óleo metabolizável A vacina é preparada de acordo com a seguinte fórmula: - suspensão de circovírus de suíno inativado: 200 ml - Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 ml - Radia 7204 (Olefina): 740 ml A fase aquosa e a fase oleosa são esterilizadas separadamente por filtração. A emulsão é preparada por misturação e homogeneização dos ingredientes com o auxílio de um emulsificador de turbina Silverson.
Uma dose de vacina contém cerca de 107,5 TCID50. O volume de uma dose de vacina é de 2 ml por administração pela rota intramuscular.
Esta vacina é usada em programa de vacinação contra a sín- drome de emaciação multissistêmica em combinação com a vacina Parvo- vax®.
Exemplo 19: A imunofluorescência indireta resulta em relação às cepas de vírus de PCV francesas e americanas e ao contaminante de PK/15 com um soro hiperimune (PCV-T), um painel de anticorpos mo- nocionais F99 preparados a partir de PK/15 e soro hiperimune prepara- do a partir da cepa canadense (PCV-C). • Recíproco da última diluição do soro ou do anticorpo monoclonal que dá uma reação positiva em imunofluorescência direta.
Exemplo 20: Produção experimental da síndrome de emaciação multissistêmica de suíno - protocolo 1 Leitões gnotobióticos de três dias de idade obtidos por cesariana e mantidos em uma unidade de isolamento foram inoculados com soluções de vírus de PCV. Os vírus de PCV de tipo II usados eram o isolado de Imp. 1010 e os vírus obtidos a partir de homogenatos de linfonodo obtidos a partir de porcos doentes.
Cinco grupos foram formados. Os leitões foram todos inoculados na idade de três dias pela rota oronasal com 1,5 ml de solução de vírus de acordo com o seguinte esquema: Resultados do desafio experimental: Durante o período de observação de cinco semanas, os leitões não desenvolveram sinais clínicos, além de um animal no grupo B que mos- trou exaustão substancial. Na autópsia, os porcos nos grupos A, B e C exi- bem hiperplasia dos linfonodos (tamanho de 2 a 10 vezes maior do que para os animais nos grupos D e E), em particular dos gânglios femorais, íliacos, mesentéricos, broquiais e submaxilares. Este hiperplasia está ligada a uma expansão considerável das zonas corticais por infiltração por monócitos e macrófagos. Os leitões nos grupos A, B e C também exibem hiperplasia do tecido linfóide broquial. Um leitão em cada um dos grupos A, B e C tem pneumonia. O leitão no grupo B, que exibiu exaustão substancial, e um lei- tão no grupo A tem uma úlcera gástrica.
Além do mais, todos os animais dos grupos A, B e C têm miosite na túnica muscular do estômago e do intestino. A maioria dos animais nos grupos A, B e C têm miocardite, he- patite multifocal com linfócito, macrófago e infiltração de eosinófilo, bem como nefríte intersticial medular e cortical.
Um leitão no grupo C tem um fígado cujo tamanho é maior do que o normal, com focos claros disseminados em sua superfície.
Nenhuma lesão foi observada nos leitões nos grupos D e E.
Circovírus foi isolado dos órgãos de porcos nos grupos A, B e C.
Exemplo 21: Reprodução experimental da síndrome de emaciação multissistêmica de suíno - protocolos 2 e 3 Leitões convencionais, mas isolados de sua mãe desde o nas- cimento, foram inoculados com soluções virais de PCV de tipo II, de parvoví- rus de suíno ou com uma mistura de dois vírus.
Os vírus de PCV de tipo II usados foram os iolados de Imp. 1011 e Imp. 1010 (cepa 48121). O vírus de PPV usado é um isolado de origem canadense, Imp. 1005. Este vírus tem uma seqüência (1/3 do genoma sequenciado) que é idêntica àquela de outras cepas de parvovírus de suíno conhecidas (cepa de PPV NADL-2 e cepa de Kresse).
Dois protocolos experimentais foram realizados.
Protocolo 2 Três grupos foram formados com leitões de 3 dias de idade. Os leitões foram inoculados pela rota oronasal com 1 ml de solução viral de acordo com o seguinte esquema: Resultados do desafio experimental: Grupo A: 2 leitões mortos 21 dias depois da inoculação e um leitão foi humanitariamente morto 24 dias depois da inoculação.
Grupo B: 1 leitão morto 23 dias depois da inoculação e um leitão foi humanitariamente morto 24 dias depois da inoculação. A autópsia foi realizada nos leitões que morreram depois de in- fecção mostraram a presença de lesões microscópicas substanciais: pre- sença de fluido na cavidade pleural, edema de pulmão, hemorragias nos rins, lesões esbranquiçadas na forma de uma cabeça de pino sobre os rins, necrose hepática. Estas lesões são idênticas aquelas observadas nos casos de campo.
As autópsias realizadas nos leitões sacrificados não mostraram lesões macroscópicas.
Os exames histológicos realizados sobre órgãos removidos dos leitões nos grupos A e B que morreram após uma infecção, bem como nos leitões sacrificados nestes dois grupos, mostraram um padrão completo e típico das lesões de síndrome de emaciação multissistêmica de suíno que são observadas em animais no campo: necrose hepática, necrose dos linfo- nodos, necrose pancreática, necrose focal e hemorragias severas nos rins, presença de sincício nos pulmões, necrose severa dos hepatócitos com a presença de inclusões nucleares.
Deve ser observado que uma quantidade maciça de antígeno de PCV foi encontrada em todas estas lesões (porcos mortos e sacrificados), mas que a presença de antígeno de PPV não podería ser detectado nestas mesmas lesões.
Nenhuma lesão não poderia ser detectada nos leitões de con- trole no grupo C.
Protocolo 3 Quatro grupos foram formados com leitões de quatro semanas de idade. Os porcos foram todos inoculados pela rota oronasal com 1 ml de solução viral de acordo com o seguinte esquema: Resultados do desafio experimental: 1 leitão de "controle" e 2 leitões em cada grupo experimental (B, C e D) foram humanitariamente mortos e foram submetidos à autópsia 2 semanas depois da inoculação. Lesões imuno-histológicas significativas foram obser- vadas nos dois leitões no grupo D (co-infecção de PCV + PPV). Deve ser obervado que não foi possível detectar a presença de parvovírus de suíno nestas lesões, embora uma soroconversão em relação ao parvovírus de suí- no fosse observada em todos os porcos no grupo D.
Nenhuma lesão histológica ou macroscópica podería ser obser- vada no leitão de controle e nos leitões nos outros grupos.
Portanto parece que a combinação de PCV + PPV torna possível reproduzir lesões histológicas típicas de síndrome de emaciação multissis- têmica de suíno. Após estes dois protocolos experimentais, pode ser obser- vado que a inoculação de PCV sozinho, como uma mistura de PCV + PPV, leva a uma reprodução mais ou menos severa da síndrome de emaciação multissistêmica de suíno, mas apenas o circovírus de suíno pode ser detec- tado nas lesões. Em contraste com isso, uma infecção experimental com PPV sozinho {grupo B do protocolo 3) não permite que lesões macroscópi- cas ou histológicas sejam induzidas; no entanto, na presença de PCV, a aparência de lesões é observada em leitões de 4 semanas de idade (grupo D do protocolo 3).
LISTAGEM DE SEQUCIAS
<110> MERIAL
THE QUEEN'S UNIVERSITY OF BELFAST
UNIVERSITY OF SASKATCHEWAN
<120> VACINA DE PARVOVUS E CIRCOVUS DE SUO <130> PCT/EP99/04698 <140> PI 9911870-0 <141> 28-06-1999 <150> FR 98 08777 <151> 06-07-1998 <160> 18 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1767 <212> DNA <213> Circovus suo tipo 2 - cepa Imp 1011-48121 <400> 1 aattcaacct taacctttct tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg ggggtttgag 60 ccccctcctg ggggaagaaa gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120 ggcgttctga ctgtggttcg cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180 aagatgccat ttttccttct ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240 cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctc 300 cttggatacg tcatatctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360 ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg ccgagcaaga agaatggaag 420 aagcggaccc caaccccata aaaggtgggt gttcactctg aataatcctt ccgaagacga 480 gcgcaagaaa atacgggatc ttccaatatc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540 gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600 gacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc 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108 <212> DNA <213> ORF1 <400> 6 atgtccaccg cccaggaggg cgttgtgact gtggtacgct tgacagtata tccgaaggtg 60 cgggagaggc gggtgttgaa gatgccattt ttccttctcc aacggtag 108 <210> 7 <211> 138 <212> DNA <213> ORF2 <400> 7 atggtactcc tcaactgctg tcccagctgt agaagctctc tatcggagga ttacttcctt 60 ggtattttgg aagaatgcta cagaacaatc cacggaggaa gggggccagt tcgtcaccct 120 ttccccccca tgccctga 138 <210> 8 <211> 162 <212> DNA <213> 0RF3 <400> 8 atggttttta ttattcattt agggtttaag tggggggtct ttaagattaa attctctgaa 60 ttgtacatac atggttacac ggatattgta gtcctggtcg tatttactgt tttcgaacgc 120 agcgccgagg cctacgtggt ccacatttcc agaggtttgt ag 162 <210> 9 <211> 943 <212> DNA <213> ORF4 <400> 9 atgcccagca agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg 60 ctgaataatc cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt 120 gattatttta ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg 180 ttcgctaatt ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc 240 tgccacatcg agaaagccaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa 300 ggcaacttac ttattgaatg tggagctcct cgatctcaag gacaacggag tgacctgtct 360 actgctgagt accttgttgg agagcgggag tctggtgacc gttgcagagc agcaccctgt 420 aacgtttgtc agaaatttcc gcgggctggc tgaacttttg aaagtgagcg ggaaaatgca 480 gaagcgtgat tggaagacca atgtacacgt cattgtgggg ccacctgggt gtggtaaaag 540 caaatgggct gctaattttg cagacccgga aaccacatac tggaaaccac ctagaaacaa 600 gtggtgggat ggttaccatg gtgaagaagt ggttgttatt gatgactttt atggctggct 660 gccgtgggat gatctactga gactgtgtga tcgatatcca ttgactgtag agactaaagg 720 tggaactgta ccttttttgg cccgcagtat tctgattacc agcaatcaga ccccgttgga 780 atggtactcc tcaactgctg tcccagctgt agaagctctc tatcggagga ttacttcctt 840 ggtattttgg aagaatgcta cagaacaatc cacggaggaa gggggccagt tcgtcaccct 900 ttccccccca tgccctgaat ttccatatga aataaattac tga 943 <210> 10 <211> 180 <212> DNA <213> ORF5 <400> 10 atgtacacgt cattgtgggg ccacctgggt gtggtaaaag caaatgggct gctaattttg 60 cagacccgga aaccacatac tggaaaccac ctagaaacaa gtggtgggat ggttaccatg 120 gtgaagaagt ggttgttatt gatgactttt atggctggct gccgtgggat gatctactga 180 <210> 11 <211> 81 <212> DNA <213> ORF6 <400> 11 atgctacaga acaatccacg gaggaagggg gccagttcgt caccctttcc cccccatgcc 60 ctgaatttcc atatgaaata a 81 <210> 12 <211> 315 <212> DNA <213> ORF7 <400> 12 taccattggt agggtggtga acaaagatcc accaaaggtc atacaccaaa ggcccagacg 60 ttttaatcgt cgggtaaacg aaaatggtgt gggtccaccg gggtgttact gcacatgtaa 120 ccagaaggtt agtgcgaaga cgtaaaaggg cgagtgaaag ttttcaagtc ggtcgggcgc 180 ctttaaagac tgtttgcaat gtcccacgac gagacgttgc cagtggtctg agggcgagag 240 gttgttccat gagtgtcgtc atctgtccag tgaggcaaca ggaactctag ctcctcgagg 300 tgtaagttat tcatt 315 <210> 13 <211> 180 <212> DNA <213> ORF8 <400> 13 aaagaacgcg agcagaagcc ttcctaataa gtcgcacttg tgggtggaaa atacaccaac 60 cccaggcgaa gaaggtaaga agaacgaccc gtacaacgac gactccacga cggctccacg 120 acggcgacgg cttcacgcga ccattatgaa tgtcgcgtga agaaagcaaa agtcgatact 180 <210> 14 <211> 90 <212> DNA <213> ORF9 <400> 14 taccgtagaa gttgtgggcg gagagggcgt ggaagcctat atgacagttc gcatggtgtc 60 agtgttgcgg gaggacccgc cacctgtact 90 <210> 15 <211> 180 <212> DNA
Claims (16)
1. Preparação antigênica direcionada contra a sindrome de emaciação multissistêmica de suíno (PMWS) caracterizada pelo fato de compreender antígeno de circovírus de suíno do tipo II e antígeno de parvovírus de suíno.
2. Preparação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno de circovírus suíno do tipo II é um antígeno de um circovírus selecionado do grupo que consiste das preparações depositadas no ECACC, sob as seguintes referências: - n£ de acesso V97100219 - n£ de acesso V97100218 - n£ de acesso V97100217 - n£ de acesso V98011608 - n£ de acesso V98011609.
3. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o antígeno de circovírus de suíno e o antígeno de parvovírus de suíno compreendem, independentemente entre si, um antígeno escolhido do grupo que consiste de um antígeno inteiro atenuado, um antígeno inteiro inativado, um antígeno de subunidade, um vetor vivo recombinante e um vetor de DNA.
4. Preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de ainda compreender uma outra valência que corresponde a um outro patógeno de porco.
5. Preparação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de compreender uma outra valência escolhida entre o grupo que consiste de: virus da sindrome respiratória e reprodutiva de suíno (PRRS), Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, rinite atrófica, pseudo-raiva, cólera de Hog, influenza de suíno e suas combinações.
6. Preparação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de compreender uma outra valência sendo vírus da sindrome respiratória e reprodutiva de suino (PRRS).
7. Vacina contra a sindrome de emaciação multissistêmica de suíno (PMWS) caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade eficaz de uma preparação antigênica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em um veículo ou excipiente aceitável sob o ponto de vista veterinário.
8. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender um adjuvante aceitável sob o ponto de vista veterinário.
9. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de compreender antigenos de vários circovirus de suíno.
10. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de compreender antígeno de circovirus codificado por um quadro de leitura aberto de circovirus escolhido entre o grupo que consiste de ORFs de 1 a 13.
11. Vacina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de compreender um antígeno de circovirus codificado por um quadro de leitura aberto de circovirus escolhido entre o grupo que consiste de ORFs 4, 7, 10 e 13.
12. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de expressão selecionado do grupo consistindo de vírus vivos capazes de se multiplicar em porcos sem serem patogênicos para porco e vetores de DNA, este vetor de expressão compreendendo e expressando o referido ORF.
13. Vacina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o vetor viral é um vírus selecionado do grupo consistindo de vírus de herpes de porco, vírus de púsula e adenovírus de porco.
14. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o vetor viral é um vírus selecionado do grupo consistindo de doença de Aujesky, vírus vaccinia, vírus de varíola de ave, vírus de varíola de canários e vírus de varíola suína.
15. Kit de vacina caracterizado pelo fato de compreender, embalados separadamente, uma vacina contra o circovírus de suíno conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 14 e uma vacina contra o parvovírus de suíno.
16. Uso de uma preparação antigênica conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 ou de uma vacina conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 7 a 14 caracterizado pelo fato de ser na preparação deuma composição farmacêutica.
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