PT1094837E - Vacina de circovírus e parvovírus porcinos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "VACINA DE CIRCOVÍRUS E PARVOVÍRUS PORCINOS" A presente invenção refere-se a uma vacina contra a sindrome PMWS (Síndrome do Depauperamento Multissistémico Porcino também chamada Síndrome do Depauperamento Multissistémico Porcino Pós-Desmame) . Vários documentos são citados no texto seguinte e vários documentos são referenciados ou citados em documentos citados no texto seguinte. Não se reconhece que qualquer destes documentos seja, de facto, técnica anterior da presente invenção. 0 PCV (de "Circovirus Porcino") foi originalmente detectado como um contaminante não citopatogénico em linhas celulares de rim suino PK/15. Este vírus foi classificado entre os Circoviridae com o vírus da anemia de galinha (CAV de Vírus da Anemia de Galinha) e o vírus PBFDV (Vírus da Doença do Bico e Plumagem de Psittacine). É um pequeno vírus sem envelope (de 15 a 24 nm), cuja característica comum é conter um genoma na forma de um ADN de cadeia simples circular de 1,76 a 2,31 kb. Pensou-se inicialmente que este genoma codificava um polipéptido de cerca de 30 kDa (Todd et al., Arch Virol 1991, 117; 129-135). Contudo, trabalho recente mostrou uma transcrição mais complexa (Meehan B. M. et al., 1997, 78; 221-227). Além do mais, não se conhecem quaisquer homologias significativas na sequência nucleotídica ou em determinantes antigénicos comuns entre os três tipos de circovirus conhecidos. 1 0 PCV derivado das células PK/15 é considerado como não sendo patogénico. A sua sequência é conhecida de B.M. Meehan et al., J. Gen. Virol 1997 (78) 221-227. Foi apenas muito recentemente que alguns autores pensaram que as estirpes de PCV poderiam ser patogénicas e associadas à sindrome PMWS (Gupi P.S. Nayar et al., Can. Vet. J, vol. 38, 1997: 385-387 e Clark E.G., Proc. Am. As.soc. Swine Prac. 1997; 499-501). Utilizando técnicas de PCR, Nayar et al. detectaram ADN de PCV em suinos tendo a sindrome PMWS. A sindrome PMWS detectada no Canadá, Estados unidos e França é clinicamente caracterizada por uma perda gradual de peso e por manifestações, tais como taquipneia, dispneia e icterícia. Do ponto de vista patológico, é manifestada por infiltrações linfocíticas ou granulomatosas, linfadenopatias e, mais raramente, por hepatite e nefrite linfocítica ou granulomatosa (Clark E.G., Proc. Am. Assoe. Swine Prac. 1997; 499-501; La Semaine Vétérinaire N° 26, suplemento para La Semaine 1996 (839) : La Semaine Vétérinaire 1997 (857) : 54; Gupi P.S Nayer et al., Can.Vet. J, vol. 38, 1997; 385-387). O documento W099/18214 descreve estirpes de circovírus porcino, isoladas de espécimes pulmonares e ganglionares, isolados de gado sofrendo de sindrome do depauperamento multissistémico pós-desmame e vacinas compreendendo preparações antigénicas. A requerente foi bem-sucedida no isolamento de cinco novas estirpes de PCV de amostras pulmonares ou gangliónicas, obtidas de quintas situadas no Canadá, Estados Unidos (Califórnia) e França (Bretanha). Estes vírus foram detectados em lesões em suínos com a sindrome PMWS mas não em suínos saudáveis. 2 A requerente sequenciou, adicionalmente, o qenoma de quatro destas estirpes, nomeadamente as estirpes obtidas do Canadá e Estados Unidos, assim como duas estirpes Francesas. As estirpes exibem uma homologia muito forte entre si, ao nível nucleotídico, excedendo 96% e muito mais fraca com a estirpe PK/15, cerca de 76%. As novas estirpes podem ser, deste modo, consideradas como sendo representativas de um novo tipo de circovírus porcino, aqui denominado tipo II, sendo o tipo I representado por PK/15.

Preparações purificadas de cinco estirpes foram depositadas, nos termos do Tratado de Budapeste, no ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, wiltshire SP4 OJG, Reino Unido) na quinta-feira, 2 de Outubro de 1997: N° de depósito V97100219 (aqui denominado Imp. 1008PCV) N° de depósito V9700218 (aqui denominado Imp. 1010PCV) N° de depósito V97100217 (aqui denominado Imp. 999PCV) e na sexta-feira, 16 de Janeiro de 1998: N° de depósito V98011608 (aqui denominado Imp. 1011-48285) N° de depósito V98011609 (aqui denominado Imp. 1011-48121). A requerente observou que, num ensaio para reprodução experimental da síndrome do depauperamento multissistémico porcino, um parvovírus porcino combinado com o circovírus porcino poderia poderia conduzir a um agravamento da doença. 3

Num aspecto, a presente invenção proporciona uma preparação antigénica dirigida contra a Sindrome de Depauperamento Multissistémico Porcino, compreendendo o antigénio de circovirus porcino e o antigénio de parvovirus porcino; em que esta compreende o antigénio de circovirus porcino de tipo II.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona uma vacina contra a Sindrome de Depauperamento Multissistémico Porcino, compreendendo uma quantidade eficaz de uma preparação antigénica de acordo com a presente invenção, num veiculo ou excipiente aceitável do ponto de vista veterinário.

Além disso, a presente invenção proporciona, noutro aspecto, um kit de vacinação contendo, acondicionadas separadamente, uma vacina contra o circovirus porcino e uma vacina contra o parvovirus porcino; em que a referida vacina contra o circovirus porcino compreende um antigénio de circovirus porcino, como aqui definido.

Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma preparação antigénica de acordo com a presente invenção ou uma vacina de acordo com a presente invenção para utilização na preparação de uma composição farmacêutica. É proporcionada, noutro aspecto adicional da presente invenção, a utilização de uma preparação antigénica de acordo com a presente invenção ou uma vacina de acordo com a presente invenção, na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção da Sindrome do Depauperamento Multissistémico Porcino. 4 É aqui descrita a vacinação de suínos, utilizando uma vacina de circovírus porcino, em particular de tipo I ou tipo II, de um modo preferido tipo II, combinada com uma vacinação com uma vacina de parvovírus porcino. Isto é compreendido como significando vacinação quer com uma vacina bivalente ou a utilização simultânea, em suínos, de uma vacina de circovírus porcino e uma vacina de parvovírus porcino. A estirpe de referência de parvovírus é a estirpe NADL-2 que está acessível a partir da colecção ATCC, sob a referência VR-742. A vacinação contra o parvovírus porcino é bem conhecida dos especialistas na técnica e as vacinas contra o parvovírus porcino estão comercialmente disponíveis. A título exemplificativo podem ser mencionadas: Parvovax® (vacina inactivada contra a parvovirose porcina, distribuída pela MERIAL).Ver, também, e. g., P. Vannier et A. Lavai., Point. Vét. 1993, 25 (151), 53-60; G. Florent et ai., Proceedings of the

Ninth Congress of Pig Veterinary Society, Julho, 15-18, 1986,

Barcelona, Espanha. Para vacinas de ADN, pode referir-se, e. g., o documento WO-A-98 03658. É aqui mencionada uma preparação antigénica, dirigida contra a síndrome PMWS compreendendo, pelo menos, um antigénio de circovírus porcino (de um modo preferido, circovírus de tipo II) e, pelo menos, um antigénio de parvovírus porcino. De acordo com a descrição, o antigénio de circovírus porcino (de um modo preferido, circovírus de tipo II) e o antigénio de parvovírus porcino compreendem, independentemente um do outro, um antigénio escolhido do grupo consistindo num antigénio completo vivo atenuado, um antigénio completo inactivado, um antigénio subunitário, um vector vivo recombinante e um vector de ADN. Compreende-se que a combinação de acordo com a descrição pode 5 envolver a utilização de qualquer antigénio ou forma de preparação antigénica apropriados, sendo compreendido que não é necessário utilizar a mesma forma para uma determinada combinação. A preparação antigénica pode compreender, adicionalmente, como é conhecido per se, um veiculo ou excipiente aceitável do ponto de vista veterinário e, opcionalmente, um adjuvante aceitável do ponto de vista veterinário. É aqui mencionada uma composição imunogénica ou uma vacina contra a sindrome PMWS, compreendendo uma quantidade eficaz de preparação antigénica de circovirus + parvovirus, como anteriormente descrita, num veiculo ou excipiente aceitável do ponto de vista veterinário e, opcionalmente, um adjuvante aceitável do ponto de vista veterinário. Uma composição imunogénica deduz uma resposta imunológica que pode, mas não necessita de ser, protectora. Uma composição de vacina deduz uma resposta protectora. Consequentemente, o termo "composição imunogénica" inclui uma "composição de vacina" (visto que o último termo pode ser composição protectora). É aqui mencionado um kit imunológico ou de vacinação contendo, acondicionadas separadamente, uma preparação antigénica ou uma composição imunogénica ou uma vacina contra o circovirus porcino e uma preparação antigénica ou uma composição imunogénica ou uma vacina contra o parvovirus porcino. Este kit pode ter as várias caracteristicas expostas anteriormente para as preparações antigénicas, composições imunogénicas e vacinas. É aqui, também, mencionado um método de imunização ou de vacinação contra a sindrome PMWS, compreendendo a administração de uma composição imunogénica ou uma vacina contra o circovirus 6 porcino e de uma composição imunogénica ou uma vacina contra o parvovirus porcino ou a administração de uma composição imunogénica ou vacina bivalente compreendendo, na mesma formulação, uma preparação antigénica especifica de cada vírus. Este método de imunização ou vacinação utiliza, em particular, as vacinas como anteriormente definidas. É aqui mencionada a utilização de uma preparação antigénica ou de uma composição imunogénica ou uma vacina contra o parvovirus, em particular como definidas supra, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a ser utilizada no contexto da prevenção da síndrome PMWS, em combinação com uma preparação antigénica ou uma composição imunogénica ou uma vacina vacina contra o circovírus porcino. É, também, um objectivo da invenção uma preparação antigénica, como aqui se descreve, ou uma vacina, como aqui se descreve, para utilização na preparação de uma composição farmacêutica.

Para a produção de preparações antigénicas de circovírus, os circovírus podem ser obtidos após passagem em células, em particular linhas celulares, e. g., células PK/15. Os sobrenadantes ou extractos de cultura, opcionalmente purificados por técnicas padrão, podem ser utilizados como preparação antigénica.

No contexto de preparações antigénicas atenuadas e composições imunogénicas ou vacinas atenuadas, a atenuação pode ser efectuada de acordo com os métodos habituais, e. g., por passagem em células, de um modo preferido, por passagem em células de suíno, especialmente linhas celulares, tal como 7 células PK/15 (por exemplo, desde 50 a 150, especialmente da ordem de 100 passagens). Estas composições imunogénicas e vacinas compreendem, em geral, um veiculo ou diluente aceitável do ponto de vista veterinário, opcionalmente um adjuvante aceitável do ponto de vista veterinário, assim como, opcionalmente, um estabilizador de liofilização.

Estas preparações antigénicas, composições imunogénicas e vacinas irão, de um modo preferido, compreender desde 103 a 107 TCID50 do vírus atenuado em questão.

Estas podem ser preparações antigénicas, composições imunogénicas e vacinas baseadas em antigénio completo inactivado. As composições imunogénicas e vacinas inactivadas compreendem, adicionalmente, um veículo ou um diluente aceitável do ponto de vista veterinário, adicionalmente, opcionalmente, com um adjuvante aceitável do ponto de vista veterinário.

Os circovirus para utilização de acordo com a descrição, com as fracções que podem estar presentes, são inactivados de acordo com técnicas conhecidas dos especialistas na técnica. A inactivação irá ser, de um modo preferido, efectuada pela via quimica, e. g., por exposição do antigénio a um agente químico, tais como formaldeído (formalina), paraformaldeído, β-propiolactona ou etilenoimina ou os seus derivados. O método de inactivação preferido irá ser, aqui, a exposição a um agente químico e, em particular, a etilenoimina ou a β-propiolactona.

De um modo preferido, as preparações antigénicas inactivadas e as composições imunogénicas e vacinas inactivadas, de acordo com a descrição, irão ser suplementadas com adjuvante, de um modo vantajoso, sendo proporcionado na forma de emulsões, por exemplo água-em-óleo ou óleo-em-água, de acordo com técnicas bem conhecidas de especialistas na técnica. Irá ser possivel que o carácter de adjuvante provenha, também, da incorporação de um composto adjuvante habitual dentro do ingrediente activo.

De entre os adjuvantes que podem ser utilizados, podem ser mencionados, a titulo exemplificativo, hidróxido de alumínio, as saponinas (e. g., saponina Quillaja ou Quil A; ver Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, editado por Michael F. Powel e Mark J. Newman, Plennum Press, Nova Iorque e Londres, p. 210), Avridine® (Vaccine Design p. 148), DDA (Brometo de dimetildioctadecilamónio, Vaccine Design p. 157), Polifosfazeno (Vaccine Design p. 204) ou, alternativamente, emulsões de óleo-em-água à base de óleo mineral, esqualeno (e. g., emulsão SPT, Vaccine Design p. 147), esqualeno (e. g., MF59, Vaccine Design p. 183) ou emulsões de água-em-óleo, à base de óleo metabolizável (de um modo preferido, de acordo com o documento WO-A-94 20071), assim como as emulsões descritas no documento US-A-5422109. É, também, possivel escolher combinações de adjuvantes, por exemplo, Avridine® ou DDA combinado com uma emulsão.

Estas preparações antigénicas, composições imunogénicas e vacinas irão, de um modo preferido, compreender desde 105 a 108 TCID50 do vírus completo inactivado em questão.

Os adjuvantes para vacinas vivas anteriormente descritas, podem ser seleccionados daqueles proporcionados para as inactivadas. São preferidas as emulsões. Para aqueles indicados para a vacina inactivada, podem ser adicionados aqueles descritos no documento WO-A-9416681. 9

Como estabilizantes de liofilização, podem ser mencionados, a título exemplificativo, SPGA (Bovarnik et al.r J. Bacteriology 59, 509, 950), hidratos de carbono, tais como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrano ou glucose, proteínas, tais como albumina ou caseína, derivados destes compostos ou tampões, tal como fosfatos de metais alcalinos.

As preparações antigénicas, composições imunogénicas e vacinas de acordo com a descrição podem compreender um ou mais ingredientes activos (antigénios) de um ou mais circovírus e/ou parvovírus aqui descritos. A requerente obteve, adicionalmente, o genoma de quatro dos isolados de circovírus porcinos de tipo II, identificados SEQ ID N° 1 a 4. A sequência da estirpe PK-15 é proporcionada como SEQ ID N° 5. Não é preciso dizer que a descrição abrange automaticamente a utilização de sequências equivalentes, isto é, as sequências que não alteram a funcionalidade da especificidade de estirpe da sequência descrita ou dos polipéptidos codificados por estas sequências. Irão estar, certamente, incluídas as sequências diferindo por degeneração do código. A descrição abrange, também, a utilização de sequências equivalentes, no sentido de que são capazes de se hibridar com a sequência anterior sob condições de elevada restringência e/ou tenham uma elevada homologia com as estirpes aqui mencionadas.

Estas sequências e os seus fragmentos podem ser utilizados, de um modo vantajoso, para a expressão in vitro ou in vivo de polipéptidos com a ajuda de vectores apropriados. 10

Em particular, as fases de leitura aberta (0RF1-13), formando fragmentos de ADN aqui mencionados que podem ser utilizadas para este efeito, foram identificadas na sequência genómica dos circovirus de tipo II. A descrição refere-se à utilização de qualquer polipéptido contendo, pelo menos, uma destas fases de leitura aberta (sequência de aminoácidos correspondente). De um modo preferido, a descrição refere-se à utilização de uma proteína consistindo essencialmente em 0RF4, 0RF7, ORFlO ou 0RF13.

Para a expressão de subunidades in vitro, como um meio de expressão, irão ser utilizados, de um modo preferido, E. coli ou um baculovirus (documento US-A-4745051). A(s) sequência(s) codificante (s) ou os seus fragmentos pode (podem) ser integrada(s) no genoma do baculovirus (e. g., o baculovirus do Virus da Poliedrose Nuclear Autographa californica, AcNPV) e este último pode ser, depois, propagado em células de insecto, e. g., Sf9 de Spodoptera frugiperda (depósito ATCC CRL 1711). As subunidades podem ser, também, produzidas em células eucarióticas, tais como leveduras (e. g., Saccharomyces cerevisiae) ou células de mamífero (e. g., CHO, BHK) É aqui mencionada a utilização, como subunidades, dos polipéptidos que irão ser produzidos in vitro por estes meios de expressão e, depois, opcionalmente purificados de acordo com técnicas convencionais. As composições imunogénicas e vacinas subunitárias compreendem, pelo menos, um polipéptido como obtido deste modo, ou fragmento, num veículo ou diluente aceitável do ponto de vista veterinário e, opcionalmente, um adjuvante aceitável do ponto de vista veterinário. 11

Para a expressão in vivo, para efeitos de produção de composições imunogénicas e vacinas do tipo vivo recombinante ou tipo ADN, a(s) sequência(s) codificante (s) ou os seus fragmentos é (são) inserida(s) dentro de um vector de expressão apropriado, sob condições permitindo a expressão do(s) polipéptido(s). Como vectores vivos apropriados, podem ser utilizados, de um modo preferido, virus vivos, de um modo preferido, capazes de se multiplicarem em suinos, não patogénicos para suinos (naturalmente não patogénicos ou tornados como tal), de acordo com técnicas bem conhecidas dos especialistas na técnica. Podem ser utilizados, em particular, herpesvirus de suínos, tais como o vírus da doença de Aujeszky, adenovírus porcino, poxvírus, especialmente vírus da vacínia, vírus avipox, vírus da varíola dos canários, vírus da varíola suína. Os vectores de ADN podem ser, também, utilizados como vectores (documentos W0-A-9011092, WO-A-9319813, WO-A-9421797, WO-A-9520660) . São aqui mencionados os vectores e as composições imunogénicas ou vacinas de tipo vivo recombinante ou de tipo ADN (polinucleótido) preparados deste modo, a sua preparação e a sua utilização, as composições imunogénicas e as vacinas compreendendo, adicionalmente, um veículo ou diluente aceitável do ponto de vista veterinário.

Por definição, uma composição imunogénica ou vacina de ADN compreende um vector de ADN que é um plasmídeo circular de vacina, superenrolado ou de outro modo ou uma molécula de ADN linear, incorporando e expressando, in vivo, uma sequência nucleotídica codificando um polipéptido antigénico.

As composições imunogénicas e vacinas recombinantes e de tipo ADN podem compreender um adjuvante. 12

No contexto dos programas combinados de imunização ou vacinação é, também, possível combinar a imunização ou vacinação contra o circovírus porcino e o parvovírus porcino com uma imunização ou vacinação contra outros patogénios suínos, em particular aqueles que poderiam estar associados à síndrome PMWS. A composição imunogénica ou vacina de acordo com a descrição pode, por conseguinte, compreender outra valência correspondendo a outro patogénio suíno escolhido de vírus PRRS (Síndrome Reprodutora e Respiratória Porcina) e/ou Mycoplasma hyopneumoniae, e/ou E. coli, e/ou Rinite Atrófica, e/ou vírus da Pseudo-raiva (doença de Aujeszky) e/ou influenza porcina e/ou Actinobacillus pleuropneumoniae e/ou cólera Suína e combinações destes. De um modo preferido, o programa de imunização ou vacinação e as vacinas, de acordo com a descrição, irão combinar imunizações ou vacinações contra o circovírus e o parvovírus, e o vírus PRRS (documentos WO-A-93/07898, WO-A-94/18311, FR-A-2 709 966; C. Charreyre et al., Proceedings of the 15th IPVS Congress, Birmingham, Inglaterra, 5-9 de Julho de 1998, p 139; e/ou Mycoplasma hyopneumoniae (documentos EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A571 648; O. Martinon et al. p 157, 284, 285 e G. Reynaud et al., p 150, todos no Proceedings of the 15th IPVS Congress referenciado anteriormente) e/ou influenza porcina. É, deste modo, possível utilizar qualquer forma apropriada de composição imunogénica ou vacina, em particular qualquer vacina comercial disponível, de forma a combinar a mesma com a composição imunogénica ou vacina contra o circovírus porcino e parvovírus porcino, como aqui descritos. São aqui mencionadas composições imunogénicas e vacinas multivalentes, kits multivacina e métodos combinados de imunização ou vacinação que tornam possível a utilização de tais programas combinados de imunização ou vacinação. 13 A invenção irá ser, agora, descrita em maior detalhe com a ajuda de formas de realização exemplificativas não limitativos, tomadas com referência aos desenhos, nos quais:

Figura 1: Sequência de ADN do genoma da estirpe

Imp. 1011-48121

Figura 2: Sequência de ADN do genoma da estirpe Imp. 1011-48285

Figura 3: Sequência de ADN do genoma da estirpe Imp. 999 Figura 4: Sequência de ADN do genoma da estirpe Imp. 1010 Figura 5: Alinhamento das 4 sequências, de acordo com as Figuras 1 a 4, com a sequência da estirpe PK/15 de PCV Listagem de sequências SEQ ID SEQ ID N2 1 Sequência Imp. 1011-48121 de ADN do genoma da estirpe SEQ ID N2 2 Sequência Imp. 1011-48285 de ADN do genoma da estirpe SEQ ID N2 3 Sequência Imp. 999 de ADN do genoma da estirpe SEQ ID N2 4 Sequência Imp. 1010 de ADN do genoma da estirpe SEQ ID N2 5 Sequência PK/15 de ADN do genoma da estirpe 14

EXEMPLOS

Exemplo 1: Cultura e isolamento das estirpes de circovírus porcino:

As amostras de tecidos foram recolhidas em França, Canadá e EUA a partir de pulmão e nódulos linfáticos de porquinhos. Estes porquinhos exibiam sinais clinicos tipicos da sindrome do depauperamento multissistémico pós-desmame. De modo a facilitar o isolamento dos virus, as amostras de tecido foram congeladas a -70 °C, imediatamente após autópsia.

Para o isolamento virai, foram preparadas suspensões contendo cerca de 15% de amostra de tecido num meio mínimo, contendo sais de Earle (EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham, UK), penicilina (100 IU/mL) e estreptomicina (100 pg/mL) (meio MEM-SA), por trituração de tecidos com areia estéril, utilizando um pilão e almofariz estéril. Esta preparação triturada foi, depois, integrada em MEM-SA e, depois, centrifugada a 3000 g, durante 30 minutos, a +4 °C, para recolher o sobrenadante.

Antes da inoculação das culturas celulares, um volume de 100 pL de clorofórmio foi adicionado a 2 mL de cada sobrenadante e agitado continuamente, durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Esta mistura foi, depois, transferida para um tubo de microcentrifugadora, centrifugada a 3000 g, durante 10 minutos e, depois, o sobrenadante foi recolhido. Este sobrenadante foi, depois, utilizado como inoculo para as experiências de isolamento virai. 15

Todos os estudos de isolamento virai foram efectuados em culturas de células PK/15, conhecidas por não serem contaminadas com o circovirus porcino (PCV), pestivírus, adenovirus porcinos e parvovirus porcinos (Allan G. et al. Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64). 0 isolamento dos circovirus porcinos foi efectuado de acordo com a seguinte técnica:

Monocamadas de células PK/15 foram dissociadas por tripsinização (com uma mistura tripsina-verseno) de culturas confluentes e integradas em meio MEM-SA, contendo soro fetal de vitelo a 15% não contaminado por pestivírus (= meio MEM-G), numa concentração final de cerca de 400000 células por mL. Fracções de alíquotas de 10 mL desta suspensão celular foram, depois, misturadas com fracções de alíquotas de 2 mL dos inóculos anteriormente descritos e as misturas finais foram aliquotadas, em volumes de 6 mL, em dois frascos Falcon de 25 cm2. Estas culturas foram, depois, incubadas a +37 °C, durante 18 horas, sob uma atmosfera contendo C02 a 10%.

Após incubação, o meio de cultura destas monocamadas semiconfluentes foi tratado com D-glucosamina a 300 mM (Cat N° G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, UK) (Tischr I. et al., Arch. Virol., 1987 96 39-57), depois a incubação continuou durante um período adicional de 48-72 horas, a +37 °C. A seguir a esta última incubação, um dos dois Falcons de cada inoculo foi submetido a 3 ciclos sucessivos de congelação/descongelação. As células PK/15 do Falcon restante foram tratadas com uma solução tripsina-verseno, ressuspensas em 16 20 mL de meio MEM-G e, depois, inoculadas em Falcons de 75 cm2, a uma concentração de 400000 células/mL. Os frascos inoculados de fresco foram, depois, "superinfectados" por adição de 5 mL do lisado correspondente, obtido após os ciclos de congelação/descongelação.

Exemplo 2: Preparação das amostras de cultura celular para a detecção de circovírus porcinos por imunofluorescência ou por hibridação in situ

Um volume de 5 mL da suspensão "superinfectada" foi recolhido e inoculado numa placa de Petri de 55 mm em diâmetro, contendo uma lamela de vidro estéril e isenta de gordura. As culturas nos frascos e nas lamelas de vidro foram incubadas a +37 °C e tratadas com glucosamina, como descrito no Exemplo 1. As culturas nas lamelas de vidro foram recolhidas, de 24 em 48 horas após o tratamento com glucosamina e fixadas com acetona, durante 10 minutos, à temperatura ambiente ou com formaldeido tamponizado a 10%, durante 4 horas. A seguir a esta fixação, todas as lamelas de vidro foram armazenadas a -70 °C, em silica gel, antes da sua utilização para os estudos de hibridação in situ e os estudos de marcação imunocitoquímica.

Exemplo 3: Técnicas para a detecção de sequências de PCV por hibridação in situ A hibridação in situ foi efectuada em tecidos recolhidos de suinos doentes e fixados com formaldeido e, também, nas preparações de culturas celulares inoculadas para o isolamento virai (ver o Exemplo 2) e fixadas em lamelas de vidro. 17

Foram utilizadas sondas genómicas completas, correspondendo aos circovírus porcinos PK/15 (PCV) e ao virus da anemia de galinha (CAV) infeccioso. 0 plasmídeo PPCVl, contendo a forma replicativa do genoma de PCV, clonado na forma de um único inserto de 1,7 quilo pares de bases (kpb) (Meehan B. et al. Sequence of porcine circovírus DNA: affinities with plant círcovíruses, J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227), foi utilizado como fonte de ADN virai específica para PCV. Um plasmídeo análogo, pCAAl, contendo a forma replicativa de 2,3 kpb do circovírus aviário CAV, foi utilizado como controlo negativo. As respectivas reservas de glicerol dos dois plasmídeos foram utilizadas para a produção e purificação dos plasmídeos de acordo com a técnica de lise alcalina (Sambrook j. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) de modo a serem, depois, utilizados como moldes para a preparação das sondas. As sondas de circovírus representativas dos genomas completos de PCV e de CAV foram produzidas a partir dos plasmídeos purificados, anteriormente descritos (1 pg para cada sonda) e a partir de iniciadores hexanucleotídicos aleatoriamente, utilizando um kit de marcação não radioactivo comercial ("DIG DNA labelling kit", Boehringer Mannheim, Lewes, UK), de acordo com as recomendações do fornecedor.

As sondas marcadas com digoxigenina foram integradas num volume de 50-100 pL de água estéril, antes de serem utilizadas para a hibridação in situ.

As amostras de tecidos de suínos doentes, encerradas em parafina e fixadas com formaldeído, assim como as preparações de culturas celulares infectadas, fixadas com formaldeído, foram 18 preparadas para a detecção dos ácidos nucleicos de PCV, de acordo com a técnica seguinte:

Secções de 5 pm de espessura foram cortadas de blocos de tecidos encerrados em parafina, libertadas de parafina e, depois, re-hidratadas em soluções sucessivas de álcool em concentrações decrescentes. As secções de tecidos e as culturas celulares fixadas com formaldeido foram incubadas, durante 15 minutos e 5 minutos, respectivamente a +37 °C, numa solução de proteinase K a 0,5% em tampão Tris-HCl a 0,05 M, contendo EDTA a 5 mM (pH 7,6). As lâminas foram, depois, colocadas numa solução de glicina a 1% em água destilada autoclavada, durante 30 segundos, lavadas duas vezes com tampão PBS a 0,01 M (solução salina tamponada com fosfatos) (pH 7,2) e, por fim, lavadas durante 5 minutos em água destilada estéril. Foram, por fim, secas ao ar e colocadas em contacto com as sondas.

Cada preparação de tecido/sonda foi coberta com uma lamela de vidro limpa e isenta de gordura e, depois, colocada numa estufa a +90 °C, durante 10 minutos e, depois, colocada em contacto com um bloco de gelo, durante 1 minuto e, por fim, incubada, durante 18 horas, a +37 °C. As preparações foram, depois, resumidamente imersas num tampão de citrato de sódio salino 2X (SSC) (pH 7,0), para remover as lamelas de vidro protectoras e, depois, lavadas duas vezes, durante 5 minutos, em tampão 2X SSC e, por fim, lavadas duas vezes, durante 5 minutos, em tampão PBS.

Após estas lavagens, as preparações foram imersas numa solução de ácido maleico a 0,1 M, NaCl a 0,15 M (pH 7,5) (tampão maleico), durante 10 minutos e, depois, incubadas numa solução de 1% de reagente de bloqueio (Cat N° 1096176, Boehringer 19

Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK) em tampão maleico, durante 20 minutos, a +37 °C.

As preparações foram, depois, incubadas com uma solução 1/250 de um anticorpo monoclonal anti-digoxigenina (Boehringer Mannheim), diluídas em tampão de bloqueio, durante 1 hora, a +37 °C, lavadas em PBS e, por fim, incubadas com um anticorpo de imunoglobulina biotinilado anti-murganho, durante 30 minutos, a +37 °C. As preparações foram lavadas em PBS e a actividade de peroxidase endógena foi bloqueada por tratamento com uma solução de peróxido de hidrogénio a 0,5% em PBS, durante 20 minutos, à temperatura ambiente. As preparações foram de novo lavadas em PBS e tratadas com um substrato de 3-amino-9-dietilcarbazole (AEC) (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK), preparado imediatamente antes da utilização.

Após uma lavagem final com água da torneira, as preparações foram contrastadas com hematoxilina, "azuladas" com água da torneira e montadas sobre lamelas de vidro de microscopia com um fluido de montagem (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK). Os controlos experimentais incluíram a utilização de uma sonda negativa não pertinente (CAV) e de uma sonda positiva (PCV) em amostras obtidas de suínos doentes e de suínos não doentes.

Exemplo 4: Técnica para a detecção de PCV por imunofluorescência O rastreio inicial de todas as preparações de culturas celulares fixadas com acetona foi efectuado por uma técnica de imunofluorescência indirecta (IIF), utilizando uma diluição 20 1/100 de um agregado de soros de suínos adultos. Este agregado de soros compreende soros de 25 porcas adultas da Irlanda do Norte, conhecidas por conterem anticorpos contra uma ampla variedade de vírus porcinos, incluindo PCV, parvovírus porcino, adenovírus porcino e vírus PRRS. A técnica IIF foi efectuada por colocação do soro (diluído em PBS) em contacto com as culturas celulares, durante uma hora, a +37 °C, seguida de duas lavagens em PBS. As culturas celulares foram, depois, coradas com uma diluição de 1/80 em PBS de um anticorpo de imunoglobulina de coelho anti-suíno, conjugado com isotiocianato de fluoresceína, durante uma hora e, depois, lavadas com PBS e montadas em tampão de glicerol, antes da observação microscópica sob luz ultravioleta.

Exemplo 5: Resultados da hibridação in situ em tecidos de suínos doentes A hibridação in situ, utilizando uma sonda genómica de PCV, preparada a partir de tecidos recolhidos de porquinhos franceses, canadianos e californianos, tendo lesões do depauperamento multissistémico e fixados com formaldeído, mostrou a presença de ácidos nucleicos de PCV associados às lesões, em várias das lesões estudadas. Não foi observado qualquer sinal quando a sonda genómica de PCV foi utilizada em tecidos recolhidos de suínos não doentes ou quando a sonda de CAV foi utilizada nos tecidos de suínos doentes. A presença de ácido nucleico de PCV foi identificada no citoplasma e no núcleo de numerosas células mononucleares infiltrando as lesões nos pulmões dos porquinhos californianos. A presença de ácido nucleico de PCV foi, também, demonstrada nos pneumócitos, nas 21 células epiteliais brônquicas e bronquiolares e nas células endoteliais das arteríolas, das vénulas e vasos linfáticos.

Nos suinos franceses doentes, a presença de ácido nucleico de PCV foi detectada no citoplasma de numerosos linfócitos foliculares e nas células mononucleares intrasinusoidais dos nódulos linfáticos. 0 ácido nucleico de PCV foi, também, detectado em sincicia ocasional. Dependendo destes resultados de detecção, as amostras de pulmões de suinos californianos, nódulos linfáticos mesentéricos de suinos franceses e órgãos de suínos canadianos foram seleccionadas para efeitos de isolamento de novas estirpes de circovírus porcino.

Exemplo 6: Resultados da cultura celular das novas estirpes de circovírus porcino e detecção por imunofluorescência Não foi observado qualquer efeito citopático (CPE) nas culturas celulares inoculadas com as amostras recolhidas de porquinhos franceses (estirpe Imp.1008), porquinhos californianos (estirpe Imp.999) e porquinhos canadianos (estirpe lmp.1010), mostrando sinais clínicos de síndrome de deperdição multissistémica. Contudo, a imunomarcação das preparações obtidas das culturas celulares inoculadas, após fixação utilizando acetona e com um agregado de soros policlonais suínos, revelou fluorescência nuclear em numerosas células nas culturas inoculadas utilizando os pulmões de porquinhos californianos (estirpe Imp.999), utilizando os nódulos linfáticos mediastinais de porquinhos franceses (estirpe Imp.1008) e utilizando órgãos de porquinhos canadianos (estirpe Imp.1010) . 22

Exemplo 7: Extracção do ADN genómico dos circovírus porcinos

As formas replicativas das novas estirpes de circovírus porcinos (PCV) foram preparadas utilizando culturas de células PK/15 infectadas (ver o Exemplo 1) (10 Falcons de 75 cm2), recolhidas após 72-76 horas de incubação e tratadas com glucosamina, como descrito para a clonagem da forma replicativa de CAV (Todd. D. et al. Dot blot hybridization assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 933-939). O ADN de cadeia dupla destas formas replicativas foi extraído de acordo com uma modificação da técnica de Hirt (Hirt B. Selective extraction of polyoma vírus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol. 1967, 36, 365-369), como descrita por Molitor (Molitor T.W. et al. Porcine parvovirus DNA: characterization of the genomic and replicative form DNA of two vírus isolates, Vírology, 1984, 137, 241-254) .

Exemplo 8: Mapa de restrição da forma replicativa do genoma da estirpe Imp. 999 de circovírus porcino. O ADN (1-5 pg) extraído de acordo com a técnica de Hirt foi tratado com nuclease SI (Amersham), de acordo com as recomendações do fornecedor e, depois, este ADN foi digerido com diversas enzimas de restrição (Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, UK) e os produtos de digestão foram separados por electroforese num gel de agarose a 1,5%, na presença de brometo de etídio, como descrito por Todd et al. {Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990, 71, 819-823). O ADN extraído das culturas da estirpe Imp. 999 possui um sítio EcoRI único, 2 sítios Saci e 23 não possui qualquer sítio PstI. Este perfil de restrição é, por conseguinte, diferente do perfil de restrição mostrado pela estirpe PK/15 de PCV (Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA; affinities with plant circoviruses, 1997 78, 221-227) que possui, em contraste, um sítio PstI e não possui qualquer sítio EcoRi.

Exemplo 9: Clonagem do genoma da estirpe Imp. 999 de circovirus porcino 0 fragmento de restrição de cerca de 1,8 kpb, produzido por digestão da forma replicativa de cadeia dupla da estirpe Imp.999 de PCV com a enzima de restrição EcoRi, foi isolado após electrof orese num gel de agarose a 1,5% (ver o Exemplo 3) utilizando um kit comercial Qiagen (QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat N° 20021, QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK). Este fragmento de restrição EcoRl-EcoRl foi, depois, ligado com o vector pGEM-7 (Promega, Medicai Supply Company, Dublin, Irlanda), anteriormente digerido com as mesmas enzimas de restrição e desfosforilado, de acordo com técnicas de clonagem padrão (Sambrook J. et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) . Os plasmídeos obtidos foram transformados numa estirpe hospedeira JM109 de Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, EUA), de acordo com técnicas padrão. O fragmento de restrição EcoRI-EcoRI da estirpe Imp. 999 de PCV foi, também, clonado dentro do sítio EcoRI do vector pBlueScript SK+ (Stratagene inc. La Jolla, EUA). De entre os clones obtidos para cada estirpe hospedeira foram seleccionados, pelo menos, 2 clones contendo os fragmentos do tamanho esperado. Os clones obtidos foram, depois, cultivados e os plasmídeos contendo o 24 genoma completo da estirpe Imp. 999 foram purificados num pequeno volume (2 mL) ou num grande volume (250 mL), de acordo com técnicas padrão de preparação e purificação de plasmideos.

Exemplo 10: Sequenclação de um ADN genómlco (forma replicativa de cadeia dupla) da estirpe Imp. 999 de PCV. A sequência nucleotidica de 2 clones EcoRI Imp.999 (clones pGEM-7/2 e pGEM-7/8) foi determinada de acordo com a técnica do didesoxinucleótido de Sanger, utilizando o kit de sequenciação "AmpliTaq DNA polymerase FS" (Cat N° 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK) e um aparelho de sequenciação automática AB1373A da Applied BioSystems, de acordo com as recomendações do fornecedor. As reacções de sequenciação iniciais foram efectuadas com os iniciadores universais "directo" e "inverso" de M13. As reacções de sequenciação seguintes foram geradas de acordo com a técnica de "ADN walking". Os oligonucleótidos necessários para estas sequenciações subsequentes foram sintetizados pela Life Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, UK).

As sequências geradas foram agrupadas e analisadas por meio do software MacDNASIS, versão 3.2 (Cat N° 22020101, Appligene, Durham, UK). As várias fases de leitura aberta foram analisadas por meio do algoritmo BLAST, disponível no servidor do "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, EUA). A sequência completa (fragmento EcoRi-EcoRl) é apresentada em SEQ ID N° 3 (Figura 3). A mesma proporciona a sequência total desta estirpe que foi preparada para começar, de um modo 25 arbitrário, no inicio do sitio EcoRI ou seja, G como o primeiro nucleótido. 0 processo foi efectuado num modo semelhante para a obtenção da sequência dos outros três isolados aqui mencionados (ver SEQ ID N° 1, 2 e 4 e as Figuras 1, 2 e 4). 0 tamanho do genoma destas quatro estirpes é:

Imp. 1011-48121 Imp. 1011-48285 Imp. 999 Imp. 1010 1767 nucleótidos 1767 nucleótidos 1768 nucleótidos 1768 nucleótidos

Exemplo 11: Análise da sequência da estirpe Imp. 999 de PCV.

Quando a sequência produzida a partir da estirpe Imp. 999 foi utilizada para testar para homologia, em relação às sequências contidas no banco de dados GenBank, a única homologia significativa que foi detectada é uma homologia de cerca de 76% (ao nivel de ácido nucleico) com a sequência da estirpe PK/15 (números de depósito Y09921 e U49186) (ver a Figura N° 5) .

Ao nivel de aminoácido, o teste para homologia na tradução das sequências nas 6 fases com os bancos de dados (algoritmo BLAST X no servidor NABI), tornou possível demonstrar uma homologia de 94% com a fase de leitura aberta correspondendo à replicase teórica do vírus BBTV, semelhante aos circovírus de 26 plantas (número de identificação GenBank 1841515), codificada pela sequência U49186 do GenBank.

Nenhuma outra sequência contida nos bancos de dados mostra homologia significativa com a sequência produzida a partir da estirpe imp. 999 de PCV. A análise das sequências obtidas da estirpe Imp.999, cultivada utilizando lesões recolhidas dos porquinhos californianos, tendo sinais clínicos da síndrome de deperdição multissistémica, mostra claramente que este isolado virai é uma nova estirpe de circovírus porcino.

Exemplo 12: Análise comparativa das sequências 0 alinhamento das sequências nucleotídicas das 4 novas estirpes de PCV foi realizado com a sequência do PCV. Estirpe PK/15 (Figura 5). Foi estabelecida uma matriz de homologia tendo em conta as quatro novas estirpes e a estirpe PK/15 anterior. Os resultados são os seguintes: 1. Imp. 1011-48121 2. Imp. 1011-48285 3: Imp. 999 4: Imp. 1010. 5: PK/15 27 1 2 3 4 5 1 1,0000 0,9977 0,9615 0,9621 0,7600 2 1,0000 0,9621 0,9632 0,7594 3 1,0000 0,9949 0,7560 4 1,0000 0,7566 5 1,0000 A homologia entre as duas estirpes francesas

Imp. 1011-48121 e Imp. 1011-48285 é superior a 99% (0,9977). A homologia entre as duas estirpes norte-americanas Imp. 999 e Imp. 1010 é, também, superior a 99% (0,9949). A homologia entre as estirpes francesas e as estirpes norte-americanas é ligeiramente superior a 96%. A homologia entre todas estas estirpes e PK/15 situa-se num valor entre 75 e 76%.

Deduz-se dai que as estirpes aqui descritas são representativas de um novo tipo de circovirus porcino, distinto do tipo representado pela estirpe PK/15. Este novo tipo, isolado de suinos exibindo a sindrome PMWS, é denominado circovirus porcino de tipo II, o PK/15 representando o tipo I. As estirpes pertencendo a este tipo II exibem notável homogeneidade de sequência nucleotidica, embora as mesmas tenham, de facto, sido isoladas de regiões geográficas muito distantes. 28

Exemplo 13: Análise das proteínas codificadas pelo genoma das novas estirpes de PCV. A sequência nucleotídica do isolado Imp. 1010 foi considerada como sendo representativa das outras estirpes de circovirus associadas à síndrome de deperdição multissistémica. Esta sequência foi analisada em maior detalhe com a ajuda do algoritmo BLASTX (Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410) e de uma combinação de programas do conjunto do software MacVector 6.0 (Oxford Molecular Group, Oxford 0X4 4GA, UK). Foi possível detectar nesta sequência 13 fases de leitura aberta (ou ORF) de um tamanho superior a 20 aminoácidos (genoma circular). Estas 13 ORF são as seguintes:

Nome Início Fim Cadeia Tamanho da ORF (nucleótidos (nt) ) Tamanho de proteína (aminoácidos (aa) ) ORF1 103 210 sentido 108 nt 35 aa ORF 2 1180 1317 sentido 138 nt 45 aa ORF 3 1363 1524 sentido 162 nt 53 aa ORF 4 398 1342 sentido 945 nt 314 aa ORF 5 900 1079 sentido 180 nt 59 aa ORF 6 1254 1334 sentido 81 nt 26 aa ORF 7 1018 704 anti-sentido 315 nt 104 aa ORF 8 439 311 anti-sentido 129 nt 42 aa ORF 9 190 101 anti-sentido 90 nt 29 aa ORF 10 912 733 anti-sentido 180 nt 59 aa 29 (continuação)

Nome Início Fim Cadeia Tamanho da ORF (nucleótidos (nt) ) Tamanho de proteína (aminoácidos (aa) ) ORF 11 645 565 anti-sentido 81 nt 26 aa ORF 12 1100 1035 anti-sentido 66 nt 21 aa ORF 13 314 1381 anti-sentido 702 nt 213 aa

As posições do início e fim de cada ORF referem-se à sequência apresentada na Figura N° 4 (SEQ ID N° 4), do genoma da estirpe 1010. Os limites das ORF 1 a 13 são idênticos para a estirpe 999. Os mesmos são, também, idênticos para as estirpes 1011-48121 e 1011-48285, à excepção das ORF 3 e 13: ORF3 1432-1539, sentido, 108 nt, 35 aa ORF13 314-1377, anti-sentido, 705 nt, 234 aa.

De entre estas 13 ORF, 4 têm uma homologia significativa com ORF análogas situadas no genoma do vírus PK-15 de PCV clonado. Foi analisada cada das fases de leitura aberta presentes no genoma de todos os isolados de circovírus associados à síndrome do depauperamento multissistémico. Estas 4 ORF são as seguintes: 30

Nome início Fim Cadeia Tamanho da ORF (nt) Tamanho de proteína (aa) Massa molecular ORF 4 398 1342 sentido 945 nt 314 aa 37,7 kDa ORF 7 1018 704 anti- sentido 315 nt 104 aa 11,8 kDa ORF 10 912 733 anti- sentido 180 nt 59 aa 6,5 kDa ORF 13 314 1381 anti- sentido 702 nt 233 cLcL 27,8 kDa

As posições do início e fim de cada ORF referem-se à sequência apresentada na Figura N° 4 (SEQ ID N° 4). 0 tamanho da ORF (em nucleótidos = nt) inclui o codão de terminação. A comparação entre a organização genómica dos isolados Imp. 1010 de PCV e PK-15 de PCV permitiu a identificação de 4 ORF conservadas no genoma dos dois vírus. A tabela abaixo apresenta os graus de homologia observados: ORF Imp. 1010/ORF PK-15 de PVC Percentagem de homologia ORF4/ORF1 86% ORF13/ORF2 66,4% ORF7/ORF3 61,5% (ao nível da sobreposição (104 aa)) ORF10/ORF4 83% (ao nível da sobreposição (59 aa)) 31 A maior identidade de sequência foi observada entre a 0RF4 de Imp. 1010 e ORFl de PK-15 (homologia de 86%) . Tal era esperado, visto que esta proteína está provavelmente envolvida na replicação do ADN virai e é essencial para a replicação virai (Meehan et al. J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227; Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998. 79. 381-38d). A identidade de sequência entre a ORF13 de Imp. 1010 e a ORF2 de PK-15 é menos forte (homologia de 66,4%) mas cada destas duas ORF exibe, de facto, uma região básica N-terminal altamente conservada que é idêntica à região N-terminal da proteína estrutural principal do circovírus aviário CAV (Meehan et al. Arch. Virol. 1992. 124. 301-319). Além disso, observam-se grandes diferenças entre a ORF7 de imp. 1010 e a ORF3 de PK-15 e entre a ORF10 de Imp. 1010 e a ORF4 de PK-15. Em cada caso, existe uma deleção da região C-terminal da ORF7 e ORF10 do isolado Imp. 1010, quando as mesmas são comparadas com a ORF3 e ORF4 de PK-15 de PCV. A maior homologia de sequência é observada ao nível das regiões N-terminais de ORF7/ORF3 (homologia de 61,5% ao nível da sobreposição) e de ORF10/ORF4 (homologia de 83% ao nível da sobreposição).

Parece que a organização genómica do circovírus porcino é bastante complexa como uma consequência da extrema compacidade do seu genoma. A proteína estrutural principal é provavelmente derivada da excisão entre várias fases de leitura situadas na mesma cadeia do genoma do circovírus porcino. Pode, por conseguinte, considerar-se que qualquer fase de leitura aberta (ORFl a ORF13), como descrita na tabela anterior, pode representar a totalidade ou parte de uma proteína antigénica codificada pelo circovírus porcino de tipo II e é, por conseguinte, potencialmente um antigénio que pode ser utilizado 32 para diagnóstico especifico e/ou para vacinação. A invenção refere-se, por conseguinte, à utilização de qualquer proteína compreendendo, pelo menos, uma destas ORF. De um modo preferido, uma proteína essencialmente consistindo de 0RF4, 0RF7, ORFIO ou ORF13.

Exemplo 14: Carácter infeccioso do genoma de pCV clonado a partir das novas estirpes. O plasmídeo pGEM-7/8, contendo o genoma completo (forma replicativa) do isolado Imp. 999, foi transfectado para células PK/15 de acordo com a técnica descrita por Meehan B. et al. Characterization of virai DNAs frorn cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome fragments. Arch. Virol. 1992, 124, 301-319). A análise de imunofluorescência (ver o Exemplo 4), efectuada na primeira passagem após transfecção, em células PK/15 não contaminadas mostrou que o plasmídeo do clone pGEM7/8 foi capaz de induzir a produção de vírus PCV infeccioso. A disponibilidade de um clone, contendo um material genético de PCV infeccioso, permite qualquer manipulação no genoma virai, para produzir vírus PCV modificados (quer atenuados em suínos ou defeituosos) que podem ser utilizados para a produção de vacinas atenuadas ou recombinantes ou para a produção de antigénios para kits de diagnóstico. 33

Exemplo 15: Produção de antigénios de PCV por cultura in vitro A cultura das células PK/15 não contaminadas e a multiplicação virai foram efectuadas de acordo com os mesmos métodos como no Exemplo 1. As células infectadas são recolhidas após tripsinização, após 4 dias de incubação, a 37 °C e enumeradas. A passagem seguinte é inoculada com 400000 células infectadas por mL.

Exemplo 16: Inactivação dos antigénios virais

No fim da cultura virai, as células infectadas são recolhidas e lisadas utilizando ecografia (Branson Sonifier) ou com a ajuda de um moinho de coloidização de tipo rotor-estator (UltraTurrax, IKA). A suspensão é, depois, centrifugada a 3700 g, durante 30 minutos. A suspensão virai é inactivada com etilenoimina a 0,1%, durante 18 horas, a +37 °C ou com beta-propiolactona a 0,5%, durante 24 horas, a +28 °C. Se o titulo virai antes da inactivação for inadequado, a suspensão virai é concentrada por ultrafiltração, utilizando uma membrana com uma exclusão de 300 kDa (Millipore PTMK300). A suspensão virai inactivada é armazenada a +5 °C.

Exemplo 17: Preparação da vacina na forma de uma emulsão à base de óleo mineral. A vacina é preparada de acordo com a seguinte fórmula:

suspensão de circovirus porcino inactivado: 250 mL 34

750 mL

Montanide® ISA 70 (SEPPIC) : A fase aquosa e a fase oleosa são esterilizadas separadamente por filtração. A emulsão é preparada por mistura e homogeneização dos ingredientes com a ajuda de um emulsionador de turbina Silverson.

Uma dose de vacina contém cerca de 107'5 TCID50. O volume de uma dose de vacina é 0,5 mL para administração pela via intradérmica e 2 mL para administração pela via intramuscular.

Esta vacina é utilizada num programa de vacinação contra a sindrome de deperdição multissistémica, em combinação com a vacina Parvovax®.

Exemplo 18: Preparação da vacina na forma de uma emulsão à base de óleo metabolizável. A vacina é preparada de acordo com a seguinte fórmula:

- suspensão de circovirus porcino inactivado: 200 mL

- Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 mL

- Radia 7204 (Oleofina): 740 mL A fase aquosa e a fase oleosa, são esterilizadas separadamente por filtração. A emulsão é preparada por mistura e homogeneização dos ingredientes com a ajuda de um emulsionador de turbina Silverson. 35

Uma dose de vacina contém cerca de 107'5 TCID50. O volume de uma dose de vacina é de 2 mL para administração pela via intramuscular.

Esta vacina é utilizada num programa de vacinação contra a sindrome de deperdição multissistémica, em combinação com a vacina Parvovax®.

Exemplo 19: Resultados de imunofluorescência indirecta em relação às estirpes do vírus PCV dos EUA e França e ao contaminante PK/15 com um soro hiperimune (PCV-T), um painel de anticorpos monoclonais F99 preparados a partir de PK/15 e um soro hiperimune preparado a partir da estirpe Canadiana (PCV-C) VÍRUS PK/15 EUA França Anti-soro PCV-T >6400 200 800 Anti-soro PCV-C 200 >6400 >6400 F99 1H4 >10000 <100 100 F99 4B10 >10000 <100 <100 F99 2B7 >10000 100 <100 F99 2E12 >10000 <100 <100 F99 1C9 > 10000 <100 100 F99 2E1 >10000 <100 <100 F99 1H4 >10000 100 <100 36 (continuação) VÍRUS PK/15 EUA França * Inverso da última diluição do soro ou do anticorpo monoclonal que proporciona uma reacção positiva em imunofluorescência indirecta.

Exemplo 20: Produção experimental da síndrome de deperdição multisslstémlca porcina - protocolo 1

Porquinhos gnotobióticos, de três dias de idade, obtidos por cesariana e mantidos numa unidade de isolamento foram inoculados com soluções virais de PCV. Os vírus PCV de tipo II utilizados foram o isolado Imp 1010 e o vírus obtido de homogeneizados de nódulos linfáticos obtidos de suínos doentes.

Foram formados cinco grupos. Os porquinhos foram todos inoculados com a idade de três dias pela via oronasal com 1,5 mL de solução virai de acordo com o seguinte esquema:

Grupo Número Vírus Dose A 6 Homogeneizado de nódulo linfático ND B 5 Imp. 1010 (baixa passagem) 102 TCID50 C 4 Imp. 1010 (elevada passagem) 102 TCID50 D 2 Lisado de células PK15 isento de vírus PCV E 3 — — 37

Resultados do desafio experimental:

Durante o periodo de observação de 5 semanas, os porquinhos não desenvolveram sinais clínicos, além de um animal no grupo B que mostrou exaustão substancial. Na autópsia, os suinos nos grupos A, B e C exibem hiperplasia dos nódulos linfáticos (tamanho 2 a 10 vezes superior àquele para os animais nos grupos D e E), em particular dos gânglios submaxilares, brônquicos, mesentéricos, ilíacos e femorais. Esta hiperplasia está ligada a uma expansão considerável das zonas corticais por infiltração por monócitos e macrófagos.

Os porquinhos nos grupos A, B e C exibem, também, hiperplasia do tecido linfóide brônquico.

Um porquinho em cada dos grupos A, B e C tem pneumonia. O porquinho no grupo B, que exibiu exaustão substancial, e um porquinho no grupo A têm uma úlcera gástrica.

Além do mais, todos os animais nos grupos A, B e C têm miosite na túnica muscular do estômago e do intestino. A maioria dos animais nos grupos A, B e C tem miocardite, hepatite multifocal com infiltração de linfócitos, macrófagos e eosinófilos, assim como nefrite intersticial cortical e medular. Um porquinho no grupo C tem um fígado, cujo tamanho é superior ao normal, com focos claros disseminados à sua superfície. Não foi observada qualquer lesão nos porquinhos nos grupos D e E. 38

0 circovírus foi isolado dos órgãos de suinos nos grupos A B e C.

Exemplo 21: Reprodução experimental da sindrome de deperdição multissistémica porcina - protocolos 2 e 3

Porquinhos convencionais, mas isolados das suas progenitoras desde o nascimento, foram inoculados com soluções virais de PCV de tipo li, de parvovirus porcino ou com uma mistura dos dois virus.

Os virus PCV de tipo II utilizados foram os isolados Imp. 1010 e Imp. 1011 (estirpe 48121). O virus PPV utilizado é um isolado de origem canadiana, Imp. 1005. Este virus tem uma sequência (1/3 do genoma sequenciado) que é idêntica àquela de outras estirpes conhecidas de parvovirus porcino (estirpe de PPV NADL-2 e estirpe Kresse). Foram efectuados dois protocolos experimentais.

Protocolo 2

Foram formados três grupos com porquinhos de 3 dias de idade. Os porquinhos foram todos inoculados pela via oronasal com 1 mL de solução virai de acordo com o seguinte esquema: 39

Grupo Número Virus Dose A 5 Imp. 1010 107 TCID50 B 5 Imp. 1010 + Imp. 1005 5xl06 TCID50 C (controlo) 2 — —

Resultados do desafio experimental:

Grupo A: 2 porquinhos morreram 21 dias após a inoculação e um porquinho foi morto, com humanidade, 24 dias após a inoculação.

Grupo B: 1 porquinho morreu 23 dias após a inoculação e um porquinho foi morto, com humanidade, 24 dias após a inoculação.

As autópsias efectuadas nos porquinhos que morreram a seguir a uma infecção mostraram a presença de lesões macroscópicas substanciais: presença de fluido na cavidade pleural, edema pulmonar, hemorragias nos rins, lesões esbranquiçadas na forma de uma cabeça de alfinete nos rins, necrose hepática. Estas lesões são idênticas àquelas observadas nos casos de campo.

As autópsias efectuadas nos porquinhos sacrificados não mostraram lesões macroscópicas.

Os exames histológicos realizados em órgãos removidos dos porquinhos nos grupos A e B que morreram a seguir a uma infecção, assim como nos suinos sacrificados nestes 2 grupos, mostraram um padrão tipico e completo das lesões da sindrome de 40 deperdição multissistémica porcina que são observadas em animais no campo: necrose hepática, necrose dos nódulos linfáticos, necrose pancreática, necrose focal e hemorragias graves nos rins, presença de sincicia nos pulmões, necrose grave dos hepatócitos com a presença de inclusões nucleares.

Deve ser notado que se verificou uma quantidade maciça de antigénio de PCV em todas estas lesões (suínos mortos ou sacrificados) mas que a presença de antigénio de PPV não pôde ser detectada nestas mesmas lesões. Não pôde ser detectada qualquer lesão no controlo em porquinhos no grupo C.

Protocolo 3

Foram formados quatro grupos com porquinhos de 4 semanas de idade. Os suínos foram todos inoculados pela via oronasal com 1 mL de solução virai de acordo com o seguinte esquema:

Grupo Número Vírus Dose A (controlo) 2 — — B 4 Imp. 1005 (PPV) 105'3TCID50 C 4 Imp. 1011 (PCV) 105 TCID50 D 4 Imp. 1005 + Imp. 1011 10s + 5xlO4 TCID50 41

Resultados do desafio experimental: 1 porquinho de "controlo" e 2 porquinhos em cada grupo experimental (B, C e D) foram mortos, dignamente, e submetidos a autópsia, 2 semanas após inoculação. Observaram-se lesões imuno-histológicas significativas em dois dos porquinhos no grupo D (coinfecção PCV + PPV) . Deve ser notado que não foi possível detectar a presença de parvovirus porcino nestas lesões, embora tenha sido observada uma seroconversão em relação ao parvovirus porcino em todos os suínos no grupo D. Não pôde ser observada qualquer lesão macroscópica ou histológica no porquinho de controlo e nos porquinhos nos outros grupos.

Por conseguinte, parece que a combinação PCV + PPV torna possível a reprodução de lesões histológicas típicas da síndrome de deperdição multissistémica porcina.

No seguimento destes dois protocolos experimentais, pode observar-se que a inoculação apenas de PCV, como uma mistura PCV + PPV, conduz a uma reprodução mais ou menos grave da síndrome de deperdição multissistémica porcina, mas apenas o circovírus porcino pode ser detectado nas lesões. Em contraste, uma infecção experimental apenas com PPV (grupo B do protocolo 3) não permite a indução de lesões macroscópicas ou histológicas; contudo, na presença de PCV, observa-se o surgimento de lesões em suínos de 4 semanas de idade (grupo D do protocolo 3).

Lisboa, 11 de Março de 2010 42

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Preparação antigénica dirigida contra a Síndrome do Depauperamento Multissistémico Porcino, compreendendo o antigénio de circovirus porcino e o antigénio de parvovírus porcino; em que esta compreende o antigénio de circovirus porcino de tipo II.
2. 2. Preparação de acordo com a reivindicação 1, em que o antigénio de circovirus porcino de tipo II é um antigénio de um circovirus seleccionado do grupo consistindo nas preparações depositadas no ECACC, sob as seguintes referências: - N° de depósito V97100219 - N° de depósito V97100218 - N° de depósito V97100217 - N° de depósito V98011608 - N° de depósito V98011609
3. 3. Preparação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o antigénio de circovirus porcino e o antigénio de parvovirus porcino compreendem, independentemente um do outro, um antigénio escolhido do grupo consistindo num antigénio completo vivo atenuado, um antigénio completo inactivado, um antigénio subunitário, um vector vivo recombinante capaz de expressar o referido antigénio e um vector de ADN capaz de expressar o referido antigénio. 1
4. 4. Preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que esta compreende, adicionalmente, outra valência que corresponde a outro patogénio suino.
5. 5. Preparação de acordo com a reivindicação 4, em que esta compreende outra valência escolhida de entre o grupo consistindo no virus da Sindrome Reprodutora e Respiratória Porcina, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, Rinite Atrófica, Pseudo-raiva, cólera Suina, influenza Suína e combinações destes.
6. 6. Preparação de acordo com a reivindicação 4, em que esta compreende outra valência que é o vírus da Sindrome Reprodutora e Respiratória Porcina.
7. 7. Vacina contra a Sindrome do Depauperamento Multissistémico Porcino, compreendendo uma quantidade eficaz de uma preparação antigénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, num veículo ou excipiente aceitável do ponto de vista veterinário.
8. 8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, em que esta compreende um adjuvante aceitável do ponto de vista veterinário.
9. 9. Vacina de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que esta compreende antigénios de diversos circovírus porcinos.
10. 10. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que esta compreende um antigénio de circovírus porcino, codificado por uma fase de leitura aberta de circovírus, escolhida de entre o grupo consistindo nas ORF I a 13. 2
11. 11. Vacina de acordo com a reivindicação 10, em que esta compreende um antigénio de circovirus porcino, codificado por uma fase de leitura aberta de circovirus, escolhida de entre o grupo consistindo nas ORF 4, 7, 10 e 13.
12. 12. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, em que esta compreende um vector de expressão seleccionado do grupo consistindo em virus vivos, capazes de se multiplicarem em suinos sem serem patogénicos para o suino, e vectores de ADN, este vector de expressão compreendendo e expressando a referida ORF.
13. 13. Vacina de acordo com a reivindicação 12, em que o vector virai é um virus seleccionado do grupo consistindo em herpesvirus suinos, adenovirus e poxvirus porcinos.
14. 14. Vacina de acordo com a reivindicação 13, em que o vector virai é um vírus seleccionado do grupo consistindo no vírus da doença de Aujesky, vírus da vacínia; vírus avipox, vírus da varíola dos canários e vírus da varíola suína.
15. 15. Kit de vacinação contendo, acondicionadas separadamente, uma vacina contra o circovirus porcino e uma vacina contra o parvovírus porcino; em que a referida vacina contra o circovirus porcino compreende um antigénio de circovirus porcino, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 14.
16. 16. Preparação antigénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou uma vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, para utilização na preparação de uma composição farmacêutica. 3
17. 17. Utilização de uma preparação antigénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou uma vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção da Sindrome do Depauperamento Multissistémico Porcino. Lisboa, 11 de Março de 2010 4