PL205299B1 - Preparat antygenowy oraz szczepionka przeciwko zespołowi PMWS - poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu - Google Patents

Preparat antygenowy oraz szczepionka przeciwko zespołowi PMWS - poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu

Info

Publication number
PL205299B1
PL205299B1 PL345948A PL34594899A PL205299B1 PL 205299 B1 PL205299 B1 PL 205299B1 PL 345948 A PL345948 A PL 345948A PL 34594899 A PL34594899 A PL 34594899A PL 205299 B1 PL205299 B1 PL 205299B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antigen
porcine
vaccine
imp
pcv
Prior art date
Application number
PL345948A
Other languages
English (en)
Other versions
PL345948A1 (en
Inventor
Gordon Moore Allan
Brian Martin Meehan
John Albert Ellis
George Steven Krakowka
Jean-Christophe Francis Audonnet
Original Assignee
Merial Sas
Univ Belfast
Univ Saskatchewan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merial Sas, Univ Belfast, Univ Saskatchewan filed Critical Merial Sas
Publication of PL345948A1 publication Critical patent/PL345948A1/xx
Publication of PL205299B1 publication Critical patent/PL205299B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/815—Viral vaccine for porcine species, e.g. swine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest preparat antygenowy oraz szczepionka przeciwko poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu - PMWS (ang. Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome), który nazywany jest również świńskim zespołem wyniszczenia wielonarządowego (ang. Porcine Multisystemic Wasting Syndrome).
W poniż szym opisie cytowane są róż ne publikacje, jak również odniesienia dotyczą róż nych dokumentów, które są powoływane lub cytowane w tych publikacjach. Nie istnieją żadne dokumenty świadczące, że stanowią one stan techniki wobec niniejszego wynalazku. Wszystkie cytowane dokumenty oraz cytowane w nich odnośniki są włączone niniejszym jako referencje.
PCV (świński cirkowirus od ang. Porcine CircoVirus), oryginalnie wykryto jako niecytopatogenne zanieczyszczenie linii komórkowej świńskiej nerki PK/15. Wirus ten zaklasyfikowano do Circoviridae, wraz z wirusem zakaźnej anemii kurcząt (CAV od ang. Chicken Anaemia Virus) i wirusem PBFDV (wirus choroby dzioba i piór u papug od ang. Psittacine Beak and Feather Disease Virus). Są to małe bez-otoczkowe wirusy (od 1 do 24 nm), których wspólną cechą charakterystyczną jest posiadanie genom w postaci kolistego, jednoniciowego DNA o wielkości 1,7 do 2,31 kb (tysiąca par zasad). Początkowo uważano, że genom ten koduje polipeptyd o wielkości około 30 kDa (Tadd i in., Arch. Virol. 1991, 117:129-135). Ostatnie prace wykazały jednak bardziej złożoną transkrypcję (Meehan B.M. i in., 1997, 78:221-227). Ponadto, między trzema znanymi rodzajami cirkowirusów nie są znane znaczące homologie sekwencji nukleotydowych lub na poziomie wspólnych determinant antygenowych.
Wirus PCV pochodzący z komórek PK/15 uważany jest za niepatogenny. Jego sekwencja jest znana z Meehan B.M. i in., J. Gen. Virol. 1997, (78) 221-227. Całkiem niedawno niektórzy autorzy opisali, że szczepy PCV mogą być patogenne i związane z występowaniem zespołu PMWS (Gupi P.S. Nayar i in., Can. Vet. J. tom. 38, 1997:385-387 oraz Clark E.G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997:499-501). Nayar i in., za pomocą technik PCR wykryli DNA PCV u świń z zespołem PMWS.
Zespół PMWS wykryty w Kanadzie, Stanach Zjednoczonych i Francji jest charakteryzowany klinicznie przez stopniową utratę wagi i objawy takie jak szybkie oddychanie, duszność i żółtaczka. Z patologicznego punktu widzenia przejawia się jako nacieki limfocytowe lub ziarniniakowe, uogólnione powiększenie węzłów chłonnych (limfadenopatie) i rzadziej zapalenie wątroby i limfocytowe lub ziarniniakowe zapalenie nerek (Clark E.G. Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 449-501; La Semaine
Veterinaire Nr 26, suplement do La Semaine Veterinaire 1996 (834): La Semaine Veterinaire 1997 (857): 54; Gupi P.S. Nayer i in. Can. Vet. J., 1997, 38: 385-387).
Zgłaszającym udało się wyizolować pięć nowych szczepów PCV z próbek z płuc i węzłów chłonnych, otrzymanych z farm położonych w Kanadzie, Stanach Zjednoczonych (Kalifornia) i Francji (Bretania). Wirusy te wykryto w zmianach chorobowych u świń z zespołem PMWS, natomiast nie u zdrowych świń.
Oprócz tego, Zgłaszający zsekwencjonowali genom czterech spośród tych szczepów, konkretnie szczepów otrzymanych z Kanady i Stanów Zjednoczonych, jak również dwóch szczepów pochodzących z Francji. Szczepy wykazywały bardzo silną homologię ze sobą na poziomie nukleotydowym, przekraczającą 96% i znacznie słabszą ze szczepem PK/15, która wynosiła około 76%. Nowe szczepy można, więc uważać jako reprezentatywne dla nowego rodzaju świńskich cirkowirusów, zwanych typem II, przy czym typ I reprezentowany jest przez PK/15.
Oczyszczone preparaty pięciu szczepów zdeponowano w ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Zjednoczone Królestwo), w czwartek w dniu 2 października, 1997:
- nr dostępu V97100219 (określany tu jako Imp. 1008PCV)
- nr dostępu V97100218 (określany tu jako Imp. 1010PCV)
- nr dostępu V97100217 (określany tu jako Imp. 999PCV) i zgłoszone w piątek w dniu 16 stycznia, 1998:
- nr dostępu V98011608 (określany tu jako Imp. 1011-48285)
- nr dostępu V98011609 (określany tu jako Imp. 1011-48121).
Zgłaszający zaobserwowali, że w badaniu doświadczalnego odtworzenia świńskiego zespołu wyniszczenia wielonarządowego, parwowirus świński połączony z świńskim cirkowirusem powodowały pogorszenie choroby.
Wynalazek dotyczy preparatu antygenowego przeciwko zespołowi PMWS (poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu, zwanym również świńskim zespołem wyPL 205 299 B1 niszczenia wielonarządowego), który to obejmuje antygen świńskiego cirkowirusa i antygen świńskiego parwowirusa.
Korzystnie preparat obejmuje antygen świńskiego cirkowirusa typu II, korzystniej antygen świńskiego cirkowirusa typu II jest antygenem cirkowirusa wybranym z grupy obejmującej preparaty zdeponowane w ECACC pod numerami
- nr dostę pu V97100219
- nr dostę pu V97100218
- nr dostę pu V97100217
- nr dostę pu V98011608
- nr dostę pu V98011609.
W korzystnym preparacie antygen ś wiń skiego cirkowirusa antygen świń skiego parwowirusa obejmuje, niezależnie od siebie, antygen wybrany z grupy obejmującej atenuowany żywy kompletny antygen, inaktywowany kompletny antygen, antygen podjednostkowy, rekombinowany żywy wektor i wektor DNA.
Ponadto korzystnie preparat obejmuje dodatkowo inną wartościowość, która odpowiada innemu patogenowi świń.
Równie korzystnie preparat obejmuje inną wartościowość wybraną z grupy obejmującej: PRRS (wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń), Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, atroficzny nieżyt nosa, pseudowściekliznę, świńską cholerę, świńską grypę i ich kombinacje.
Preparat korzystnie obejmuje inną wartościowość, którą jest PRRS.
Wynalazek również dotyczy szczepionki przeciwko zespołowi PMWS, która obejmuje skuteczną terapeutycznie dawkę preparatu antygenowego według wynalazku, przy czym preparat antygenowy obejmuje skuteczną ilość antygenu świńskiego parwowirusa oraz antygenu świńskiego cirkowirusa typu II w nośniku albo zaróbce dopuszczalnej z weterynaryjnego punktu widzenia.
Szczepionka korzystnie obejmuje adiuwant dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia.
Korzystnie szczepionka obejmuje antygeny kilku świńskich cirkowirusów.
Szczepionka korzystniej obejmuje antygen cirkowirusa, kodowany przez otwartą ramkę odczytu cirkowirusa, wybraną z grupy obejmującej ORF1 do ORF13.
Równie korzystnie szczepionka obejmuje antygen cirkowirusa kodowany przez otwartą ramkę odczytu cirkowirusa wybraną z grupy obejmującej ORF4, 7, 10 i 13.
Korzystnie szczepionka obejmuje wektor ekspresyjny wybrany z grupy obejmującej żywe wirusy zdolne do namnażania w organizmie świń, nie będąc patogennymi dla świń, oraz wektory DNA, przy czym wektor ekspresyjny obejmuje i wyraża wspomniane ORF.
W korzystnej szczepionce wektorem wirusowym jest wirus wybrany z grupy obejmującej świński wirus herpes, świński adenowirus i wirus ospy, korzystniej wektorem wirusowym jest wirus wybrany z grupy obejmują cej wirus choroby Aujeszky'ego, wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirus ospy kanarków i wirus ospy świńskiej.
Opisane rozwiązania umożliwiają więc szczepienie świń przy użyciu świńskiego cirkowirusa, w szczególności typu I albo II, korzystnie typu II, w kombinacji ze szczepieniem szczepionką przeciwko parwowirusowi świńskiemu. Należy rozumieć, że obejmuje to szczepienie szczepionką biwalentną albo równoczesne zastosowanie szczepionki przeciwko świńskiemu cirkowirusowi i szczepionki przeciwko świńskiemu parwowirusowi.
Szczepem referencyjnym dla parwowirusa, jest szczep NADL-2, dostępny w kolekcji ATCC pod numerem dostępu VR-742. Szczepienie przeciwko świńskiemu parwowirusowi jest dobrze znane specjalistom w dziedzinie, zaś szczepionki przeciwko świńskiemu parwowirusowi są dostępne w handlu. Przykładowo można wymienić: Parvovax® (inaktywowana szczepionka przeciwko parwowirozie świń sprzedawana przez Merial). Patrz, również np. P. Vannier i A. Laval. Point. Vet., 1993, 25 (151), 53-60; G. Florent i in., Proceedings of 9-th Congress of Pig Veterinary Society, 15-18 lipca 1986, Barcelona, Hiszpania. Szczepionki DNA opisano np. w WO-A-98 03658.
Opisany jest również preparat antygenowy skierowany przeciwko zespołowi PMWS, obejmujący przynajmniej jeden antygen świńskiego cirkowirusa (korzystnie cirkowirusa typu II) i przynajmniej jeden antygen świńskiego parwowirusa. Zgodnie z przedstawionym opisem antygen świńskiego cirkowirusa (korzystnie cirkowirusa typu II) i antygen świńskiego parwowirusa obejmują, niezależnie od siebie, antygen wybrany z grupy składającej się z atenuowanego żywego kompletnego antygenu, inaktywowanego kompletnego antygenu, antygenu podjednostkowego, rekombinowanego żywego wekto4
PL 205 299 B1 ra i wektora DNA. Należy rozumieć, że opisana kombinacja może obejmować zastosowanie dowolnego odpowiedniego antygenu albo preparatu antygenowego, przy czym zrozumiałe jest, że nie jest konieczne zastosowanie tej samej postaci do danej kombinacji. Preparat antygenowy może obejmować dodatkowo, co jest oczywiste, nośnik albo zaróbkę dopuszczalne z weterynaryjnego punktu widzenia i ewentualnie adiuwant dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia.
Opisana jest również kompozycja immunogenna albo szczepionka przeciwko PMWS, obejmująca skuteczną ilość preparatu antygenowego cirkowirusa + parwowirusa, jak porzedstawione powyżej, w nośniku albo zaróbce dopuszczalnej z weterynaryjnego punktu widzenia, i ewentualnie adiuwant dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia. Kompozycja immunogenna wywołuje reakcję odpornościową, która może, ale nie musi być reakcją ochronną. Tak, więc określenie „kompozycja immunogenna obejmuje kompozycję szczepionki, ponieważ może ona stanowić kompozycję ochronną.
Przedstawione w opisie rozwiązania umożliwiają również wytworzenie zestawu immunologicznego albo zestawu do szczepienia zawierającego, zapakowane osobno, preparat antygenowy albo kompozycję immunogenną albo szczepionkę przeciwko świńskiemu cirkowirusowi oraz preparat antygenowy albo kompozycję immunogenną albo szczepionkę przeciwko świńskiemu parwowirusowi. Zestaw ten może mieć różną charakterystykę przedstawioną powyżej dla preparatów antygenowych, kompozycji immunogennych i szczepionek.
Ponadto opisany jest również sposób immunizacji albo szczepienia przeciwko zespołowi PMWS, obejmujący podawanie immunogennej kompozycji albo szczepionki przeciwko świńskiemu cirkowirusowi i immunogennej kompozycji albo szczepionki przeciwko świńskiemu parwowirusowi lub podawanie biwalentnej immunogennej kompozycji albo szczepionki obejmującej w jednej formulacji, preparat antygenowy swoisty dla każdego z wirusów. W takim sposobie immunizacji lub szczepienia wykorzystuje się w szczególności opisane wyżej szczepionki.
Preparat antygenowy albo kompozycja immunogenna albo szczepionka przeciwko parwowirusowi, w szczególności jak opisane powyżej, mogą być zastosowane do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do stosowania w kontekście zapobiegania zespołowi PMWS, w kombinacji z preparatem antygenowym albo kompozycją immunogenną albo szczepionką przeciwko świńskiemu cirkowirusowi.
Do wytwarzania preparatów antygenowych cirkowirusa, cirkowirusy można uzyskać po przeprowadzeniu pasaży na komórkach, w szczególności liniach komórkowych, np. komórkach PK/15. Nadsącz z hodowli albo ekstrakty, ewentualnie oczyszczone standardowymi technikami można stosować jako preparaty antygenowe.
W kontekś cie atenuowanych preparatów antygenowych i atenuowanych preparatów immunogennych albo szczepionek, atenuację przeprowadza się standardowymi metodami, np. przez pasażowanie na komórkach, korzystnie przez pasażowanie na komórkach świńskich, zwłaszcza liniach komórkowych takich jak komórki PK/15 (przykładowo od 50 do 100, zwłaszcza zalecane jest przeprowadzenie 100 pasaży). Takie kompozycje immunogenne i szczepionki obejmują zwykle nośnik i rozcieńczalnik dopuszczalne z weterynaryjnego punktu widzenia, ewentualnie adiuwant dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia, jak również stabilizator liofilizacji.
Takie preparaty antygenowe, kompozycje immunogenne i szczepionki korzystnie obejmują od 103 do 107 TCID50, odpowiedniego atenuowanego wirusa.
Mogą to być preparaty antygenowe, kompozycje immunogenne i szczepionki oparte na inaktywowanym kompletnym antygenie. Inaktywowane kompozycje immunogenne i szczepionki obejmują, dodatkowo, nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia, ewentualnie z dodatkiem adiuwantu dopuszczalnego z weterynaryjnego punktu widzenia.
Cirkowirusy w frakcjach, w których mogą być obecne, inaktywuje się technikami znanymi specjalistom. Inaktywację przeprowadza się korzystnie metodą chemiczną, jak np. przez wystawienie antygenu na działanie czynnika chemicznego takiego jak formaldehyd (formalina), paraformaldehyd, β-propionolakton albo etylenoimina albo ich pochodne.
Korzystnym sposobem inaktywacji jest ekspozycja na czynnik chemiczny w szczególności elylenoiminę albo β-propiolakton.
Korzystnie, inaktywowane preparaty antygenowe i szczepionki według wynalazku oraz opisane inaktywowane kompozycje antygenowe uzupełnia się o adiuwant, korzystnie dostarczony w postaci emulsji, przykładowo, typu woda-w-oleju albo olej-w-wodzie zgodnie z technikami znanymi specjaliPL 205 299 B1 stom. Jest również możliwe, że rolę adiuwanta będzie spełniał związek zwykle włączony jako adiuwant do czynnika aktywnego.
Wśród adiuwantów, które mogą być stosowane, można wymienić wodorotlenek glinu, saponiny (np. saponinę Quillaja albo Quil A; patrz Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Michael F. Powel i Mark J. Newman, Plennum Press, New York i Londyn, str. 210), Avridine® (Vaccine Design, str. 148), DDA (bromek dimetylodioktadecyloamonu, Vaccine Design, str. 157), polifosfazeny (Vaccine Design, str. 204) albo alternatywnie emulsje typu olej-w-wodzie oparte na olejach mineralnych, skwalenie (np. emulsja SPT, Vaccine Design, str. 147), skwalenie (np. MF59, Vaccine Design, str. 183), albo emulsjach woda-w-oleju opartych na olejach, które mogą być metabolizowane (korzystnie według WO-A-94 20071), jak również emulsjach opisanych w US-A-5,422,109. Możliwe jest również dobranie kombinacji adiuwantów, przykładowo Avridine® albo DDA w połączeniu z emulsją.
Preparaty antygenowe, kompozycje immunogenne i szczepionki korzystnie obejmują od 105 do 108 TCID50 odpowiedniego inaktywowanego kompletnego wirusa.
Adiuwanty dla żywych szczepionek opisane wyżej, można dobrać z tych opisanych powyżej dla inaktywowanych. Korzystne są emulsje.
Poza adiuwantami wskazanymi dla szczepionek inaktywowanych, można dodać te opisane w WO-A-94 16681.
Stabilizatory liofilizacji, które można wymienić, przykładowo obejmują SPGA (Bovarnik i in., J. Bacteriol. 59, 509, 950), węglowodany, takie jak sorbitol, mannitol, skrobia, sacharoza, dekstran albo glukoza, białka, takie jak albumina albo kazeina, pochodne tych związków albo bufory takie jak fosforany metali alkalicznych.
Opisane preparaty antygenowe, kompozycje immunogenne i szczepionki mogą obejmować jeden albo więcej składników czynnych (antygenów) jednego albo wielu opisanych cirkowirusów i/lub parwowirusów.
Oprócz tego, Zgłaszający poznali genom czterech izolatów świńskiego cirkowirusa typu II, których to sekwencje zidentyfikowano jako Id. Sekw. nr 1 do 4. Sekwencję szczepu PK/15 podano jako Id. Sekw. nr 5. Nie trzeba dodawać, że w rozwiązaniach według wynalazku również będą wykorzystywane sekwencje ekwiwalentne, czyli sekwencje, które nie zmieniają funkcjonalności albo swoistości szczepowej opisanych sekwencji albo polipeptydów kodowanych przez te sekwencje. Będzie to również dotyczyło sekwencji różniących się z powodu degeneracji kodu genetycznego.
W rozwiązaniach według wynalazku będą również wykorzystywane sekwencje ekwiwalentne w takim sensie, ż e są zdolne do hybrydyzacji z powyż szymi sekwencjami w warunkach wysokiej surowości i/lub wykazują silną homologię z opisanymi szczepami.
Sekwencje te i ich fragmenty można korzystnie zastosować do ekspresji polipeptydów in vitro i in vivo, przy uż yciu odpowiednich wektorów.
W szczególności, otwarte ramki odczytu (ORF1-ORF13), będ ące fragmentami DNA wykorzystywanymi w rozwiązaniach według wynalazku, które można zastosować w tym celu, zidentyfikowano w sekwencji genomowej cirkowirusów typu II. Stąd opisane w wynalazku rozwiązania będą dotyczyły również dowolnego polipeptydu zawierającego przynajmniej jedną z takich otwartych ramek odczytu (odpowiadającej sekwencji aminokwasowej). Korzystnymi białkami będą białka zasadniczo obejmujące ORF4, ORF7, ORF10 albo ORF13.
W celu ekspresji podjednostek in vitro, do ekspresji stosuje się korzystnie E. coli albo bakulowirus (US-A-4,745,051). Sekwencje kodujące albo ich fragmenty poddaje się integracji z genomem bakulowirusa (np. bakulowirusa poliedrozy jądrowej AcNPV Autographa californica) i poddaje się propagacji na komórkach owadzich, np. Spodoptera frugiperda Sf9 (depozyt ATCC CRL 1711). Podjednostki można również wytworzyć w komórkach eukariotycznych takich jak drożdże (np. Saccharomyces cerevisiae) albo komórkach ssaczych (np. CHO, BHK).
Polipeptydy można wytworzyć in vitro przez ekspresję, a następnie oczyścić konwencjonalnymi technikami. Szczepionka podjednostkowa obejmuje przynajmniej jeden otrzymany w ten sposób polipeptyd, albo fragment, w nośniku albo rozcieńczalniku dopuszczalnym z weterynaryjnego punktu widzenia i ewentualnie adiuwant dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia.
W celu ekspresji in vivo, sł u żącej do wytworzenia immunogennych kompozycji i szczepionek typu żywe rekombinowane lub typu DNA sekwencje kodujące albo ich fragmenty wprowadza się do odpowiedniego wektora ekspresyjnego w warunkach umożliwiających wyrażanie polipeptydów. Jako odpowiednie żywe wektory można korzystnie zastosować żywe wirusy, korzystnie zdolne do namnażania się w organizmie świń, niepatogenne dla świń (naturalnie niepatogenne albo uczynione niepato6
PL 205 299 B1 gennymi), zgodnie z dobrze znanymi w dziedzinie technikami. W szczególności, można zastosować świńskie wirusy herpes, takie jak wirus choroby Aujeszky'ego, świński adenowirus, wirusy ospy, zwłaszcza wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirus ospy kanarków, wirus ospy świń. Jako wektory można również zastosować wektory DNA (WO-A-9011092, WO-A-9319813, WO-A-9421797, WO-A-9520660).
W rozwiązaniach według wynalazku mogą być również wykorzystane wektory i kompozycje immunogenne typu rekombinowane żywe albo typu DNA (polinukleotydy) i wytworzone w ten sposób szczepionki, ich preparaty i zastosowania, kompozycje immunogenne i szczepionki obejmujące, oprócz tego, nośnik albo rozcieńczalnik dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia.
Zgodnie z definicją immunogenna kompozycja DNA lub szczepionka obejmuje wektor DNA, którym jest kolisty plazmid szczepionkowy, w formie superskręconej lub innej, albo cząsteczki w formie liniowej, do którego włączono i który wyraża polipetyd antygenowy.
Kompozycje immunogenne typu DNA i rekombinowanego oraz szczepionki mogą obejmować adiuwant.
W kontekście programów łączonej immunizacji lub szczepienia, możliwe jest również połączenie immunizacji lub szczepień przeciwko świńskiemu cirkowirusowi i świńskiemu parwowirusowi z immunizacją lub szczepieniem przeciwko innym patogenom ś wiń , w szczególnoś ci tym, które mogą być związane z syndromem PMWS. Opisane immunogenne kompozycje lub szczepionki mogą więc obejmować inną wartościowość odpowiadającą innemu patogenowi świni wybranemu z PRRS (zespół rozrodczo-oddechowy świń ang. Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome) i/lub Mycoplasma hyopneumoniae, i/lub E.coli, i/lub wirusa atroficznego zapalenia nosa, i/lub wirusa pseudowścieklizny (choroby Aujeszky'ego), i/lub świńskiej grypy i/lub Actinobacillus pleuropneumoniae i/lub świńskiej cholery, oraz ich kombinacji.
Korzystnie programy immunizacji lub szczepienia oraz szczepionki według wynalazku będą łączyć immunizację lub szczepienia przeciwko świńskiemu cirkowirusowi i świńskiemu parwowirusowi, oraz przeciwko PRRS (WO-A-93/07898, WO-A-94/18311, FR-A-2 709 966; Charreyre i in., Proceedings of the 15th IPVS Congress, Birmingham, Anglia, 5-9 lipca, 1988, str. 139; i/lub Mycoplasma hyopneumoniae (EP-A-597 852, EP-A-550 477, EP-A-571 648; O. Martinon i in., str. 157, 284, 285; i G. Reynaud i in., str. 150, wszystkie powyższe referencje pochodzące z Proceedings of the 15th IPVS Congress) i/lub świńskiej grypie. Stąd możliwe jest zastosowanie dowolnej odpowiedniej formy kompozycji immunogennej lub szczepionki, w szczególności dowolnej komercyjnie dostępnej szczepionki, tak aby połączyć je w kompozycji immunogennej lub szczepionce przeciwko świńskiemu cirkowirusowi i ś wiń skiemu parwowirusowi, tak jak tu opisano.
Rozwiązania według wynalazku mogą być również wykorzystane w wielowartościowych kompozycjach immunogennych oraz szczepionkach, zestawach wieloszczepionkowych, kombinowanej immunizacji lub sposobach szczepienia, które pozwalają na zastosowanie takiej kombinowanej immunizacji lub programów szczepień.
Wynalazek zostanie opisany bardziej szczegółowo w odniesieniu do nieograniczających go przykładowych wykonań i w odniesieniu do rysunku, na którym:
Na figurze 1: Przedstawiona jest sekwencja DNA genomu szczepu Imp.1011-48121.
Na figurze 2: Przedstawiona jest sekwencja DNA genomu szczepu Imp.1011-48285.
Na figurze 3: Przedstawiona jest sekwencja DNA genomu szczepu Imp.999.
Na figurze 4: Przedstawiona jest sekwencja DNA genomu szczepu Imp.1010.
Na figurze 5: Przedstawione jest przyrównanie 4 sekwencji przedstawionych na figurach 1-4 z sekwencją szczepu PCV PK/15.
Lista sekwencji
Id. Sekw. nr 1: Sekwencja DNA genomu szczepu Imp.1011-48121
Id. Sekw. nr 2: Sekwencja DNA genomu szczepu Imp.1011-48285
Id. Sekw. nr 3: Sekwencja DNA genomu szczepu Imp.999
Id. Sekw. nr 4: Sekwencja DNA genomu szczepu Imp.1010
Id. Sekw. nr 5: Sekwencja DNA genomu szczepu PK/15
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Hodowla i izolowanie szczepów świńskich cirkowirusów
Próbki tkanek pobrano we Francji, Kanadzie i USA z płuc i węzłów chłonnych prosiąt. Prosięta te wykazywały objawy kliniczne typowe dla poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczaPL 205 299 B1 jącego. W celu ułatwienia izolowania wirusów, próbki tkanek zamrażano w -70°C bezpośrednio po sekcji.
W celu izolowania wirusa, wytworzono zawiesiny zawierające około 15% próbkę tkanki przygotowaną w minimalnej pożywce zawierającej sole Earle'a (EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham,
UK), penicylinę (100 IU/ml) i streptomycynę (100 μg/ml) (pożywka MEM-SA), przez rozdrabnianie tkanek sterylnym piaskiem przy użyciu moździerza i tłuczka. Rozdrobnione preparaty pobrano w MEM-SA i odwirowano przy 3000 g przez 30 minut w +4°C w celu zebrania nadsączu.
Przed zaszczepieniem hodowli komórkowych, do 2 ml każdego z nadsączów dodawano 100 μl chloroformu i ciągle mieszano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę przenoszono do probówki wirowniczej, odwirowano przy 3000 g przez 10 minut a następnie zbierano nadsącz. Nadsącz zastosowano do zaszczepiania w doświadczeniach nad izolowaniem wirusa.
Wszystkie badania nad izolacją wirusa przeprowadzano na hodowlach komórek PK/15, o których było wiadomo, że nie są zanieczyszczone świńskim cirkowirusem (PCV), pestiwirusami, świńskimi adenowirusami i świńskimi parwowirusami (Allan G. i in., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of piglet foetal material, Vet. Microbiol., 1995, 44, 49-64).
Izolowanie świńskich cirkowirusów przeprowadzono według następującej techniki:
Pojedyncze warstwy komórek PK/15 oddzielono przez trypsynizację (mieszaniną trypsyna-wersen) z hodowli zlewnych, po czym pobrano w pożywce MEM-SA zawierającej 15% płodową surowicę cielęcą, nie skażoną pestiwirusem (pożywka MEM-G) w końcowym stężeniu około 400000 komórek/ml. 10 ml porcje tej zawiesiny komórkowej mieszano z 2 ml porcjami frakcji innokulum opisanymi wyżej i mieszaninę końcową porcjowano w objętości 6 ml do dwóch kolb typu Falcon po 25 cm2. Hodowle te następnie inkubowano w 37°C przez 18 godzin w atmosferze zawierającej 10% CO2.
Po inkubacji, pożywkę hodowlaną z pół-zlewnych hodowli poddano działaniu 300 mM D-glukozaminy (nr kat. G48175, Sigma-Aldrich Company, Limited, Poole, UK) (Tischr I. i in., Arch. Virol., 1987, 96, 39-57), a następnie kontynuowano inkubację przez kolejne 48-72 godziny w 37°C. Po tej inkubacji, jedną z dwóch probówek Falcon poddawano 3 kolejnym cyklom zamrażania/odmrażania. Komórki PK/15 w pozostałej probówce Falcon traktowano roztworem trypsyna-wersen, zawieszano w 20 ml pożywki MEM-G, a następnie zaszczepiano do 75 cm2 butelek Falcon w stężeniu 400000 komórek/ml. Świeżo zaszczepione kolby „nadkażano przez dodanie 5 ml odpowiedniego lizatu otrzymanego po cyklach zamrażania/odmrażania.
P r z y k ł a d 2: Wytwarzanie próbek hodowli komórkowych do wykrywania świńskich cirkowirusów przez immunofluorescencję albo przez hybrydyzację in situ
Objętość 5 ml „nadkażonej zawiesiny pobrano i zaszczepiono na szalkę Petri'ego o 55 mm średnicy, zawierającej sterylne i odtłuszczone szkiełka nakrywkowe. Hodowle w butelkach i na szkiełkach nakrywkowych inkubowano w 37°C i traktowano glukozaminą, jak to opisano w przykładzie 1. Hodowle na szkiełkach nakrywkowych zbierano po 24-48 godzinach po traktowaniu glukozaminą i utrwalano, acetonem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, albo 10% buforowanym formaldehydem przez 4 godziny. Po utrwalaniu, wszystkie szkiełka nakrywkowe przechowywano w -70°C na żelu krzemionkowym, przed zastosowaniem ich do hybrydyzacji in situ i znakowania immunocytochemicznego.
P r z y k ł a d 3: Techniki wykrywania sekwencji PCV przez hybrydyzację in situ
Hybrydyzację in situ przeprowadzono na tkankach pobranych od chorych świń i utrwalono formaliną, jak również na preparatach hodowli komórkowych zakażonych izolatami wirusowymi (patrz, przykład 2) i utrwalano na szkiełkach nakrywkowych.
Zastosowano kompletne sondy genomowe odpowiadające świńskim cirkowirusom PK/15 (PCV) i wirusowi zakaźnej anemii kurcząt (CAV). Plazmid pPCV1, zawierający replikacyjną postać genomu PCV, klonowaną w postaci pojedynczej wstawki o wielkości 1,7 kb (Meehan B. i in., Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses, J. Gen. Virol., 1997, 78, 221-227), zastosowano jako swoistą sondę DNA dla PCV. Analogiczny plazmid, pCAA1, zawierający postać replikacyjną ptasiego cirkowirusa wielkości 3,2 kb zastosowano jako kontrolę negatywną. Odpowiednie banki w glicerynie dwóch plazmidów zastosowano do wytworzenia i oczyszczenia plazmidów metodą lizy alkalicznej (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, 2-gie wydanie Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) w taki sposób, że zastosowano je jako matryce do wytworzenia sond. Sondy cirkowirusowe reprezentatywne dla kompletnych genomów PCV i CAV wytworzono z oczyszczonych plazmidów opisanych wyżej (1 μg dla każdej z sond) oraz z losowych
PL 205 299 B1 starterów heksanukleotydowych stosując dostępny w handlu zestaw do nieradioaktywnego znakowania (DIG DNA Labelling Kit, Boehringer Mannheim, Lewes, UK), które prowadzono według instrukcji producenta.
Sondy znakowane digoksygeniną pobrano w objętości 50-100 μΐ sterylnej wody, po czym zastosowano w hybrydyzacji in situ.
Próbki tkanek od chorych świń, zatopione w parafinie i utrwalone formaliną, jak również preparaty zakażonych hodowli komórkowych, utrwalone formaliną, przygotowano w celu wykrywania kwasów nukleinowych PCV według następującej techniki:
Skrawki grubości 5 μm cięto z bloku tkanek zatopionych w parafinie, uwalniano z parafiny i uwadniano kolejnymi roztworami alkoholu o malejących stężeniach. Skrawki tkanek i hodowle komórkowe utrwalone formaliną inkubowano, odpowiednio, przez 15 minut i 5 minut w 37°C z w 0,5% roztworze proteinazy K w 0,05 M buforze Tris-HCl, zawierającym 5 mM EDTA (pH 7,6). Następnie szkiełka umieszczano w 1% roztworze glicyny w autoklawowanej destylowanej wodzie, przez 30 sekund, płukano dwukrotnie w buforze 0,01 M PBS (roztwór soli buforowany fosforanem, pH 7,2), a na koniec płukano przez 5 minut w sterylnej wodzie destylowanej. Następnie, suszono je na powietrzu i umieszczano w kontakcie z sondami.
Każdy z preparatów tkanki/sondy przykrywano czystym i odtłuszczonym szkiełkiem nakrywkowym, a następnie umieszczano w piecu 90°C przez 10 minut i umieszczano na lodzie przez 1 minutę, zaś na koniec inkubowano przez 18 godzin w 37°C. Następnie preparaty zanurzano krótko w 2X buforze soli z cytrynianem sodu (SSC) (pH 7,0) w celu usunięcia ochronnych szkiełek nakrywkowych, a następnie płukano dwukrotnie przez 5 minut w 2X SSC i końcowo przez 5 minut w buforze PBS.
Po tych płukaniach, preparaty zanurzano w roztworze 0,1 M kwasu maleinowego, 0,15 M NaCl (pH 7,5) (bufor maleinowy), przez 10 minut, a następnie inkubowano w 1% roztworze reagentu blokującego (Nr kat. 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK) w buforze maleinowym przez 20 minut w 37°C.
Następnie preparat inkubowano z roztworem 1/250 przeciwciała monoklonalnego przeciwko digoksygeninie (Boehringer Mannheim), rozcieńczonym w buforze blokującym, przez godzinę w 37°C, płukano w PBS i na koniec inkubowano z biotynylowanym przeciwciałem przeciwko mysiej immunoglobulinie przez 30 minut w 37°C. Preparaty płukano w PBS, a następnie blokowano endogenną aktywność peroksydazową przez traktowanie roztworem 0,5% nadtlenku wodoru w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Preparaty ponownie płukano w PBS i traktowano substratem 3-amino-9-dietylokarbazolem (AEC) (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK), przygotowanym bezpośrednio przed użyciem.
Po końcowym płukaniu w bieżącej wodzie, preparaty podbarwiano hematoksyliną, lekko odbarwiano pod bieżącą wodą i utrwalano na szkiełkach mikroskopowych płynem do utrwalania (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK). Kontrole doświadczalne obejmowały zastosowanie niedopasowanej sondy negatywnej (CAV) i sondy pozytywnej (PCV) na próbkach otrzymanych od chorych i zdrowych świń.
P r z y k ł a d 4: Technika wykrywania PCV przez immunofluorescencję
Początkowe badanie przesiewowe wszystkich preparatów hodowli komórkowych utrwalonych acetonem przeprowadzono techniką immunofluorescencji pośredniej (IIF) stosując rozcieńczenie 1/100 puli surowic dorosłych świń. Pula ta obejmowała surowice od dorosłych macior z Irlandii Północnej, o której wiadomo, że zawierała przeciwciała przeciwko różnym wirusom świńskim, w tym PCV: świńskiemu parwowirusowi, świńskiemu adenowirusowi i wirusowi PRRS. Technikę IIF przeprowadzano przez doprowadzenie do kontaktu surowicy (rozcieńczonej w PBS) z hodowlami komórkowymi przez godzinę w 37°C, a następnie dwukrotne płukanie w PBS. Hodowle komórkowe barwiono rozcieńczeniem 1/80 króliczego przeciwciała przeciwko świńskim immunoglobulinom sprzęgniętym z izotiocyjanianem fluoresceiny w PBS przez godzinę, a następnie płukano w PBS i utrwalano w buforze glicerynowym przed obserwacją pod mikroskopem w świetle ultrafioletowym.
P r z y k ł a d 5: Wyniki hybrydyzacji in situ na tkankach chorych świń
Hybrydyzacja in situ, z użyciem sondy genomowej PCV, na tkankach pobranych od prosiąt z Francji, Kanady i Kalifornii, ze zmianami wyniszczenia wielonarządowego i utrwalanych formaliną, wykazały obecność w niektórych badanych zmianach kwasów nukleinowych PCV związanych ze zmianami. Nie obserwowano sygnału w przypadku zastosowania sondy genomowej PCV na tkankach pobranych od świń zdrowych, albo w przypadku zastosowania sondy CAV na tkankach od chorych świń. Obecność kwasu nukleinowego PCV zidentyfikowano w cytoplazmie i jądrze wielu komórek
PL 205 299 B1 jednojądrzastych naciekających zmiany w płucach u prosiąt z Kalifornii. Obecność kwasu nukleinowego PCV wykazano również w pneumocytach, komórkach nabłonka oskrzeli i oskrzelików oraz komórkach śródbłonka tętniczek, żyłek i naczyń limfatycznych.
U chorych świń z Francji, obecność kwasu nukleinowego PCV wykryto w cytoplazmie licznych komórek pęcherzykowych oraz w jednojądrzastych komórkach wewnątrz zatokowych węzłów chłonnych. Kwas nukleinowy PCV wykrywano również w nielicznych syncytiach. Zależnie od wyniku wykrywania, próbki płuc świń z Kalifornii, węzłów chłonnych krezkowych świń z Francji i narządów świń z Kanady wybrano w celu izolowania nowych szczepów ś wiń skich cirkowirusów.
P r z y k ł a d 6: Wyniki hodowli komórkowej nowych szczepów świńskich cirkowirusów oraz wykrywanie przez immunofluorescencję
Nie obserwowano efektu cytopatycznego (CPE) w hodowlach komórkowych zaszczepionych próbkami pobranymi od prosiąt z Francji (szczep Imp1008), prosiąt kalifornijskich (szczep Imp.999) i prosią t kanadyjskich (szczep Imp.1010) wykazują cych kliniczne objawy zespoł u wyniszczenia wielonarządowego. Jednakże, znakowanie immunologiczne preparatów otrzymanych z zaszczepionych hodowli komórkowych, po utrwaleniu acetonem, przy użyciu puli świńskich surowic poliklonalnych, wykazało fluorescencję jądrową licznych komórek w hodowli zaszczepionej z wykorzystaniem próbek z płuc prosiąt kalifornijskich (szczep Imp.999), węzłów chłonnych krezkowych z prosiąt z Francji (szczep Imp.1008) i z narządów z prosiąt kanadyjskich (szczep Imp.1010).
P r z y k ł a d 7: Ekstrakcja genomowego DNA świńskich cirkowirusów
Postaci replikacyjne nowych szczepów świńskich cirkowirusów (PCV) przygotowano z zakażonych hodowli komórek PK/15 (patrz, przykład 1) (10 butelek Falcon po 75 cm2), zebrano po 72-76 godzinach inkubacji i traktowano glukozaminą, jak to opisano w przypadku klonowania replikacyjnej postaci CAV (Todd D. i in., Dot blot hybrydyzation assay for chicken anaemia agent using a cloned DNA probe, J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 933-939). Dwuniciowy DNA tej postaci replikacyjnej ekstrahowano według modyfikacji techniki Hirt (Hirt B., Selective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures, J. Mol. Biol., 1967, 36, 365-369), jak opisana przez Molitor (Molitor T.W. i in., Porcine parvovirus DNA: characterisation of the genomic and replicative form DNA of two virus izolates, Virology, 1984, 137, 241-254).
P r z y k ł a d 8: Mapa restrykcyjna postaci replikacyjnej genomu szczepu Imp.999 świńskiego cirkowirusa
DNA (1-5 μg) ekstrahowany według techniki Hirt, traktowano nukleazą S1 (Amersham) według instrukcji producenta, a następnie trawiono DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi (Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, UK) i rozdzielano produkty trawienia przez elektroforezę na 1,5% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny, jak to opisano w Todd i in., (Purification and biochemical characterization of chicken anaemia agent, J. Gen. Virol., 1990, 71, 819-823). DNA wyizolowany z hodowli szczepu Imp.999 wykazywał pojedyncze miejsce restrykcyjne EcoRI, 2 miejsca SacI i nie posiada żadnego miejsca dla Pstl. Ten profil restrykcyjny jest jednak różny od wykazywanego przez szczep PCV PK/15 (Meehan B. i in., Sequence of porcine circiovirus DNA: affinities with plant circoviruses, J. Gen. Virol., 1997, 78, 221-227), który dla odmiany wykazuje miejsce Pstl, a nie ma miejsca dla EcoRI.
P r z y k ł a d 9: Klonowanie genomu szczepu Imp.999 świńskiego cirkowirusa.
Fragment restrykcyjny wielkości około 1,8 kb, wytworzony przez trawienie dwuniciowej formy replikacyjnej szczepu Imp.999 PCV przy użyciu enzymu restrykcyjnego EcoRI, wyizolowano po elektroforezie na 1,5% żelu agarozowym (patrz, przykład 3) stosując dostępny handlowo zestaw Qiagen (QIAEXII Gel Extraction Kit, nr kat 20021, Qiagen Ltd., Crawley, West Sussex, UK). Ten fragment restrykcyjny EcoRI-EcoRI poddano ligacji z wektorem pGEM-7 (Promega, Medical Supply Company, Dublin, Irlandia), uprzednio trawionym tym samym enzymem restrykcyjnym i defosforylowanym, według standardowych procedur (Sambrook J i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2-gie (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Otrzymane plazmidy transformowano do szczepu gospodarza E. coli JM109 (Stratagene, La Jolla, US) stosując standardowe techniki. Fragment restrykcyjny EcoRI-EcoRI szczepu Imp.999 PCV klonowano do miejsca EcoRI wektora pBluescript SK+ (Stratagene Inc., La Jolla, US). Wśród otrzymanych klonów dla każdego szczepu gospodarza i każdego plazmidu, wybrano przynajmniej 2 klony zawierające fragmenty oczekiwanej wielkości. Otrzymane klony hodowano, i oczyszczano plazmidy zawierające kompletny genom szczepu Imp. 999 w małej objętości (2 ml) albo w dużej objętości (250 ml), według standardowych procedur izolowania i oczyszczania plazmidu.
PL 205 299 B1
P r z y k ł a d 10: Sekwencjonowanie genomowego DNA (dwuniciowej postaci replikacyjnej) szczepu PCV Imp.999
Ustalono sekwencję nukleotydową 2 klonów Imp.999 EcoRI (klony pGEM-7/2 i pGEM-7/8) z wykorzystaniem metody Sangera z dideoksynukleotydami stosując zestaw do sekwencjonowania „AmpliTaq DNA Polymerase FS (nr kat. 402079, PE Applied Biosystems, Warrington, UK) i aparat do automatycznego sekwencjonowania Applied Biosystems AB1373A, według instrukcji producenta. Początkowe reakcje sekwencjonowania przeprowadzono stosując uniwersalne startery M13 „naprzód i „wstecz. Kolejne reakcje sekwencjonowania przeprowadzono wykorzystując metodę „kroczenia po DNA. Oligonukleotydy konieczne do kolejnych reakcji sekwencjonowania syntetyzowano w Life Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, UK).
Otrzymane sekwencje połączono i analizowano przy użyciu oprogramowania MacDNASIS wersja 3.2 (nr kat. 22020101, Appligene, Durham, UK). Różne ramki odczytu analizowano przy użyciu algorytmu BLAST dostępnego z serwera „National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Kompletna sekwencja (fragment EcoRI-EcoRI) jest przedstawiona na Id. Sekw. nr 3 (figura 3). Pokazuje ona całkowitą sekwencję tego szczepu, którą rozpoczęto arbitralnie od pierwszego miejsca EcoRI, tzn. pierwszym nukleotydem jest G.
W celu uzyskania sekwencji innych trzech izolatów (Id. Sekw. nr 1, 2 i 4 oraz figury 1, 2 i 4) przeprowadzono procedurę w podobny sposób.
Wielkość genomu tych trzech izolatów wynosiła:
Imp.1011-48121 1767 nukleotydów
Imp.1011-48285 1767 nukleotydów
Imp.999 1768 nukleotydów
Imp.1010 1768 nukleotydów
P r z y k ł a d 11: Analiza sekwencji szczepu Imp.999 PCV
Gdy sekwencję otrzymaną dla szczepu Imp.999 zastosowano do badania homologii w odniesieniu do sekwencji zawartych w GenBank, jedyną istotną homologią, którą wykryto, była homologia wynosząca około 76% (na poziomie kwasu nukleinowego) z sekwencją szczepu PK/15 (numer dostępu Y09921 i U49186) (patrz, figura nr 5).
Na poziomie aminokwasowym, test homologii dla sekwencji po translacji w 6 fazach odczytu z danymi bankami danych (algorytm BLAST X na serwerze NABI) umożliwił wykazanie 94% homologii z otwartymi ramkami odczytu odpowiadającymi teoretycznej replikazie wirusa BBTV, podobnego do cirkowirusów u roślin (GenBank, nr identyfikacyjny 1841515), kodowanej przez sekwencję dostępną pod nr U49186 GenBank.
Żadna inna sekwencja zawarta w bazach danych nie wykazywała istotnej homologii w porównaniu z sekwencją uzyskaną dla szczepu Imp.999 PCV.
Analiza sekwencji otrzymanych ze szczepu Imp.999, wyhodowanego ze zmian uzyskanych od kalifornijskich prosiąt wykazujących objawy kliniczne zespołu wyniszczenia wielonarządowego wykazuje wyraźnie, że ten izolat wirusowy stanowi nowy szczep świńskiego cirkowirusa.
P r z y k ł a d 12: Analiza porównawcza sekwencji
Przeprowadzono przyrównanie sekwencji nukleotydowych 4 nowych szczepów PCV z sekwencją szczepu PK/15 PCV (figura 5). Ustalona matryca homologii brała pod uwagę cztery nowe szczepy i poprzednio znany szczep PK/15.
Otrzymano następujące wyniki:
1: Imp.1011-48121
2: Imp.1011-48285
3: Imp.999
4: Imp.1010
5: PK/15
1 2 3 4 5
1 1,0000 0,9977 0,9615 0,9621 0,7600
2 1,0000 0,9621 0,9632 0,7594
3 1,0000 0,9949 0,7560
4 1,0000 0,7566
5 1,0000
PL 205 299 B1
Homologia pomiędzy dwoma szczepami francuskimi Imp.1011-48121 i Imp.1011-48285 wynosiła ponad 99% (0,9977).
Homologia pomiędzy dwoma szczepami północnoamerykańskimi, Imp.999 i Imp.1010 wynosiła również ponad 99% (0,9949). Homologia pomiędzy szczepami francuskimi i szczepami północnoamerykańskimi wynosiła nieco ponad 96%.
Homologia pomiędzy tymi wszystkimi szczepami i PK/15 wynosiła miedzy 75 a 76%.
Stąd wywnioskowano, że opisane szczepy są reprezentatywne i stanowią nowy rodzaj świńskiego cirkowirusa, różny od rodzaju stanowiącego szczep PK/15. Ten nowy rodzaj, wyizolowany od świń wykazujących zespół PMWS, nazywany jest typem II świńskiego cirkowirusa, przy czym PK/15 jest reprezentantem typu I. Szczepy należące do typu II wykazują istotną homogenność sekwencji nukleotydowej, mimo iż wyizolowano je z geograficznie odległych regionów.
P r z y k ł a d 13: Analiza białek kodowanych przez genom nowych szczepów PCV
Sekwencja nukleotydowa izolatu Imp.1010 uważana jest za reprezentatywną dla innych szczepów cirkowirusów, związanych z zespołem wyniszczenia wielonarządowego. Sekwencję tę analizowano szczegółowo przy użyciu algorytmu BLASTX (Altshul i in., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410), i kombinacją programów z zestawu MacVector 6.0 (Oxford molecular Group, Oxford 0X4 4GA, UK). W sekwencji można było wykryć 13 otwartych ramek odczytu (albo ORF) o wielkości ponad 20 aminokwasów (genom kołowy). Te 13 ORF przedstawiono niżej:
Nazwa Start Koniec Nić Wielkość ORF w nukleotydach (nt) Wielkość białka w aminokwasach (aa)
ORF1 103 210 sensowna 108 nt 25 aa
ORF2 1180 1317 sensowna 138 nt 45 aa
ORF3 1363 1524 sensowna 162 nt 53 aa
ORF4 398 1342 sensowna 945 nt 314 aa
ORF5 900 1079 sensowna 180 nt 59 aa
ORF6 1256 1334 sensowna 81 nt 26 aa
ORF7 1018 704 antysensowna 315 nt 104 aa
ORF8 439 311 antysensowna 129 nt 42 aa
ORF9 190 101 antysensowna 90 nt 29 aa
ORF10 912 733 antysensowna 180 nt 59 aa
ORF11 645 565 antysensowna 81 nt 26 aa
ORF12 1100 1035 antysensowna 66 nt 21 aa
ORF13 314 1381 antysensowna 702 nt 213 aa
Położenie początku i końca każdej z ORF dotyczy sekwencji przedstawionej na figurze nr 4 (Id. Sekw. nr 4) genomu szczepu 1010. Granice ORF 1 do 13 są identyczne dla szczepu 999. Są one również identyczne dla szczepów 1011-48121 i 1011-48285, z wyjątkiem ORF 3 i 13:
ORF3 1432-1539, sensowna, 108 nt, 35 aa
ORF13 314-1377, antysensowna, 705 nt, 234 aa.
Wśród 13 ORF-ów, 4 wykazują istotną homologię z analogicznymi ORF położonymi w genomie klonowanego wirusa PCV PK-15. Analizowano każdą z otwartych ramek odczytu występujących w genomie wszystkich izolatów cirkowirusów związanych z zespołem wyniszczenia wielonarządowego. Te 4 ORF przedstawiono poniżej:
Nazwa Start Koniec Nić Wielkość w nukleotydach (nt) Wielkość białka w aminokwasach (aa) Ciężar cząsteczkowy
1 2 3 4 5 6 7
ORF4 398 1342 sensowna 945 nt 314 aa 37,7 kDa
0RF7 1018 704 antysensowna 315 nt 104 aa 11,8 kDa
PL 205 299 B1 ciąg dalszy
1 2 3 4 5 6 7
ORF10 912 733 antysensowna 180 nt 59 aa 6,5 kDa
ORF13 314 1381 antysensowna 702 nt 233 aa 27,8 kDa
Położenie początku i końca każdego z ORF dotyczy sekwencji przedstawionej na Fig. 4 (Id. Sekw. nr 4). Wielkość ORF (w nukleotydach = nt) obejmuje kodon stop. Porównanie pomiędzy organizacją genomową izolatów PCV Imp.1010 i PCV PK-15 umożliwiło zidentyfikowanie 4 ORF zachowanych w genomie dwóch wirusów. Tabela poniżej przedstawia zaobserwowane stopnie homologii:
ORF Imp.1010/ORF PVC PK-15 Procent homologii
ORF4/ORF1 86%
ORF13/ORF2 66,4%
ORF7/ORF3 61,5% (na poziomie zachodzenia 104 aa)
ORF10/ORF4 83% (na poziomie zachodzenia 59 aa)
Największą identyczność sekwencji obserwowano pomiędzy OFR4 Imp.1010 i ORF1 PK-15 (86% homologii). Było to oczekiwane, ponieważ białko to jest prawdopodobnie związane z replikacją wirusowego DNA i jest istotne dla replikacji wirusa (Meehan i in., J. Gen. Virol., 1997, 78, 221-227; Mankerz i in., J. Gen. Virol., 1998, 79, 381-384).
Identyczność sekwencji pomiędzy ORF13 Imp. 1010 a ORF2 PK-15 jest mniejsza (66,4% homologii), ale każda z tych dwóch ORF wykazuje silnie zakonserwowany zasadowy region N-końca, który jest identyczny z regionem N-końca głównego białka strukturalnego ptasiego cirkowirusa CAV (Meehan i in., Arch. Virol. 1992, 124, 301-319). Ponadto, znaczne różnice obserwowano pomiędzy ORF7 Imp. 1010 i ORF3 PK-15, oraz pomiędzy ORF10 Imp. 1010 i ORF4 PK-15. W każdym przypadku, występowała delecja regionu C-końcowego ORF7 i ORF10 izolatu Imp. 1010, przy porównaniu z ORF3 i ORF4 z PCV PK-15. Największą homologię sekwencji obserwowano na poziomie regionów N-końcowych ORF7/ORF3 (61,5% homologii na poziomie zachodzenia tzw. nakładki) i ORF10/ORF4 (83% homologii na poziomie nakładki).
Wydaje się, że organizacja genomowa świńskiego cirkowirusa jest dość złożona, w wyniku skrajnej kondensacji jego genomu. Główne białko strukturalne pochodzi prawdopodobnie ze składania kilku ramek odczytu położonych na tej samej nici genomu świńskiego cirkowirusa. Można więc uznać, że dowolna ramka odczytu (ORF1 do ORF13) jak opisana w powyższej tabeli może stanowić całość albo część antygenowego białka kodowanego przez świńskiego cirkowirusa typu II i stąd jest potencjalnym antygenem, który można zastosować do swoistej diagnostyki i/lub szczepienia. Dlatego w rozwiązaniach według wynalazku mogą zostać wykorzystane białka obejmujące przynajmniej jeden z tych ORF. Korzystnie, będą to białka zasadniczo obejmującego ORF4, ORF7, ORF10 albo ORF13.
P r z y k ł a d 14: Zakaźny charakter genomu PCV klonowanego z nowych szczepów
Plazmid pGEM-7/8, zawierający kompletny genom (postać replikacyjną) izolatu Imp.999 transfekowano do komórek PK/15 techniką opisaną przez Meehan B. i in. (Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken anemia agent: sequence analysis of cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome fragments. Arch. Virol., 1992, 124, 301-319). Analiza immunofluorescencyjna (patrz, przykład 4) przeprowadzona na pierwszym pasażu po transfekcji na nie zakażonych komórkach PK/15 wykazała, że plazmid z klonu pGEM7/8 był zdolny do indukowania wytwarzania zakaźnego wirusa PCV. Dostępność klonu zawierającego zakaźny materiał genetyczny PCV umożliwia dowolną przydatną manipulację na genomie wirusowym w celu wytworzenia modyfikowanych wirusów PCV (zarówno atenuowanych na świniach albo defektywnych), które można zastosować do wytwarzania szczepionek atenuowanych albo rekombinowanych, albo do wytwarzania antygenów do zestawów diagnostycznych.
P r z y k ł a d 15: Wytwarzanie antygenów PCV przez hodowlę in vitro
Hodowlę nie zakażonych komórek PK/15 i namnożenie wirusa przeprowadzono sposobami opisanymi w przykładzie 1. Zakażone komórki zebrano po trypsynizacji po 4 dniach inkubacji w 37°C i policzono. Następny pasaż zaszczepiono przy użyciu 400000 zakażonych komórek na ml.
PL 205 299 B1
P r z y k ł a d 16: Inaktywacja antygenów wirusowych
Na zakończenie hodowli wirusa, zakażone komórki zebrano i poddano lizie stosując ultradźwięki (urządzenie Branson Sonifier) albo przy użyciu młyna koloidalnego typu rotor-stator (UltraTurrax, IKA). Zawiesinę odwirowano przy 3700 g przez 30 minut. Zawiesinę wirusową inaktywowano u 0,1% etylenoiminą przez 18 godzin w 37°C, albo przy użyciu 0,5% beta-propionoklaktonu przez 24 godziny w 28°C. Jeżeli miano wirusa przed inaktywacją było nieodpowiednie, zawiesinę wirusa zatężano przez ultrafiltrację stosując membranę o ciężarze odcięcia 300 kDa (Millipore PTMK300). Inaktywowaną zawiesinę wirusa przechowywano w 5°C.
P r z y k ł a d 17: Wytwarzanie szczepionki w postaci emulsji opartej na oleju mineralnym
Szczepionkę wytworzono w oparciu o następującą formułę:
- zawiesina inaktywowanego świńskiego cirkowirusa 250 ml
- Montanide® ISA 70 (SEPPIC) 750 ml
Fazę wodną i fazę olejową sterylizowano osobno przez filtrację. Emulsję wytworzono przez mieszanie i homogenizację składników przy użyciu emulgatora turbinowego Silverson.
Jedna dawka szczepionki zawierała około 107,5 TCID50. Objętość jednej dawki szczepionki do podawania drogą śródskórną wynosiła 0,5 ml i 2 ml dla przeznaczonej do podawania drogą domięśniową.
Szczepionkę tę zastosowano w programie szczepień przeciwko zespołowi wyniszczenia wielonarządowego w kombinacji ze szczepionką Parvovax®.
P r z y k ł a d 18: Wytwarzanie szczepionki w postaci emulsji opartej na metabolizowanym oleju
Szczepionkę wytworzono według następującej formuły:
- zawiesina inaktywowanego świńskiego cirkowirusa 200 ml
- Dehymuls HRE 7 (Henkel) 60 ml
- Radia 7204 (Oleofina) 740 ml
Fazę wodną i fazę olejową sterylizowano osobno przez filtrację. Emulsję wytworzono przez mieszanie i homogenizację składników przy użyciu emulgatora turbinowego Silverson.
Jedna dawka szczepionki zawierała około 107,5 TCID50. Objętość jednej dawki szczepionki do podawania drogą śródskórną wynosiła 0,5 ml i 2 ml do podawania drogą domięśniową.
Szczepionkę tę zastosowano w programie szczepień przeciwko zespołowi wyniszczenia wielonarządowego w kombinacji ze szczepionką Parvovax®.
P r z y k ł a d 19: Wyniki immunofluorescencji pośredniej w odniesieniu do szczepów wirusa PCV z USA i Francji oraz do zanieczyszczenia PK/15, przy użyciu surowicy hiperimmunizowanej (PCV-T), panelu przeciwciał monoklonalnych F99 wytworzonych z PK/15 i surowicy hiperimmunizowanej wytworzonej ze szczepu kanadyjskiego (PCV-C)
Wirus
PK/15 USA Francj a
Surowica odpornościowa PCV-T > 6400 200 800
Surowica odpornościowa PCV-C 200 > 6400 > 6400
F99 1H4 >10000 < 100 100
F99 4B10 >10000 < 100 < 100
F99 2B7 >10000 100 < 100
F99 2E12 >10000 < 100 < 100
F99 1C9 >10000 < 100 100
F99 2E1 >10000 < 100 < 100
F99 1H4 >10000 100 < 100
* odwrotność ostatniego rozcieńczenia surowicy albo przeciwciała monoklonalnego, które dawało pozytywną reakcję w teście immunofluorescencji pośredniej.
P r z y k ł a d 20: Doświadczalne wytwarzanie świńskiego zespołu wyniszczenia wielonarządowego - protokół 1
PL 205 299 B1
Trzydniowe prosięta gnotobiotyczne otrzymane z cięcia cesarskiego i trzymane w izolatce zaszczepiano roztworem wirusa PCV. Zastosowanymi wirusami PCV typu II był izolat Imp. 1010, a wirus pochodził z homogenatów węzłów chłonnych otrzymanych od chorych świń.
Sformowano pięć grup. Prosięta zaszczepiono w wieku 3 dni, drogą ustno-nosową, przy użyciu 1,5 ml zawiesiny wirusa według następującego schematu:
Grupa Liczba Wirus Dawka
A 6 homogenat z węzłów chłonnych ND
B 5 Imp.1010 (wczesny pasaż) 102 TCID50
C 4 Imp.1010 (późny pasaż) 102 TCID50
D 2 lizat komórek PK15 pozbawiony wirusa PCV ...
E 3 ... ...
Wyniki eksperymentalnej prowokacji:
Podczas 5-tygodniowego okresu obserwacji, prosięta nie rozwinęły objawów klinicznych, z wyjątkiem jednego zwierzęcia w grupie B, które wykazywało znaczne wyczerpanie. Podczas sekcji, świnie z grupy A, B i C wykazywały przerost węzłów chłonnych (o wielkości 2 do 10 krotnie większej niż u zwierząt w grupach D i E), w szczególności dotyczyło to zwojów podżuchwowych, oskrzelowych, krezkowych, biodrowych i udowych. Przerost ten był powiązany ze znaczną ekspansją stref korowych przez naciek monocytów i makrofagów. Prosięta w grupie A, B i C wykazywały również hiperplazję tkanki limfatycznej oskrzeli.
Po jednym prosięciu w grupie A, B i C miało zapalenie płuc.
Prosię w grupie B, które wykazywało istotne wyczerpanie oraz jedno prosię w grupie A miało wrzód żołądka.
Ponadto, wszystkie zwierzęta w grupach A, B i C wykazywały zapalenie mięśni w błonie mięśniowej żołądka i jelit.
Większość zwierząt w grupach A, B i C wykazywało zapalenie mięśnia sercowego, wieloogniskowe zapalenie wątroby z naciekami limfocytów, makrofagów i eozynofilów, jak również zapalenie nerek korowe i rdzeniowe śródmiąższowe.
Jedno z prosiąt w grupie C miało wątrobę o wielkości przekraczającej normalną wielkość, z rozsianymi jasnymi ogniskami na powierzchni.
Nie obserwowano zmian u prosiąt w grupie D i E.
Cirkowirus był izolowany z narządów świń z grup A, B i C.
P r z y k ł a d 21: Doświadczane odtworzenie świńskiego zespołu wyniszczenia wielonarządowego - protokół 2 i 3
Konwencjonalne prosięta, ale izolowane od matek po urodzeniu, zaszczepiono roztworem wirusa PCV typu II, świńskiego parwowirusa albo mieszaniną obu wirusów.
Wirusami PCV typu II były izolaty Imp. 1010 i Imp. 1011 (szczep 48121).
Wirusem PPV był izolat pochodzenia kanadyjskiego, Imp. 1005. Wirus ten miał sekwencję (1/3 z sekwencjonowanego genomu) identyczną z innymi znanymi szczepami świńskiego parwowirusa (PPV szczepów NADL-2 i Kresse).
Przeprowadzono dwa protokoły doświadczalne.
Protokół 2
Stworzono trzy grupy 3-dniowych prosiąt. Wszystkie prosięta zaszczepiono drogą ustno-nosową, przy użyciu 1 ml zawiesiny wirusa według następującego schematu:
Grupa Liczba Wirus Dawka
A 5 Imp. 1010 107 TCID50
B 5 Imp. 1010 + Imp. 1005 5x106 TCID50
C 2 ... ...
PL 205 299 B1
Wyniki doświadczalnej prowokacji:
Grupa A: 2 prosięta padły 21 dni po zaszczepieniu, zaś jedno z prosiąt zabito humanitarnie 24 dni po zaszczepieniu.
Grupa B: 1 prosię padło 23 dni po zaszczepieniu, zaś jedno z prosiąt zabito humanitarnie 24 dni po zaszczepieniu.
Sekcja przeprowadzona na prosiętach padłych po zaszczepieniu wykazała obecność istotnych zmian makroskopowych: obecności płynu w jamie opłucnej, obrzęku płuc, krwotoków w nerkach, białawych zmian na nerkach przypominających w formie łebki od szpilki, martwicy wątroby. Zmiany te są identyczne z obserwowanymi w przypadkach polowych.
Sekcja przeprowadzona na zabitych prosiętach nie wykazała zmian makroskopowych.
Badanie histologiczne przeprowadzone na narządach pobranych od prosiąt z grup A i B, które padły po zakażeniu, jak również na zabitych prosiętach z obu grup wykazało typowy i kompletny wzorzec zmian charakterystyczny dla świńskiego zespołu wyniszczenia wielonarządowego, które obserwowano u zwierząt w przypadkach polowych: martwicę wątroby, martwicę węzłów chłonnych, martwicę trzustki, ogniskową martwicę i ciężkie wybroczyny w nerkach, obecność syncytiów w płucach, ciężką martwicę hepatocytów z obecnością inkluzji jądrowych.
Należy zaznaczyć, że znaczną ilość antygenu PCV stwierdzono we wszystkich tych zmianach (u świń martwych albo zabitych), ale nie stwierdzono obecności antygenu PPV w tych samych zmianach.
Nie stwierdzono zmian u świń w grupie C (kontrola).
Protokół 3
Stworzono 4 grupy z 4-tygodniowych prosiąt. Wszystkie świnie zaszczepiono drogą ustnonosową stosując 1 ml zawiesiny wirusa według następującego schematu:
Grupa Liczba Wirus Dawka
A 2 — —
B 4 Imp. 1005 (PPV) 105,3 TCID50
C 4 Imp. 1011 (PCV) 105 TCID50
D 4 Imp. 1005 + Imp. 1011 105+5x104TCID50
Wyniki doświadczalnej prowokacji:
prosię „kontrolne i 2 prosięta z każ dej z grup eksperymentalnych (B, C i D) zabito w humanitarny sposób i poddano sekcji w 2 tygodnie po zaszczepieniu. Istotne zmiany immunohistologiczne obserwowano u dwóch prosiąt w grupie D (zaszczepionej jednocześnie PCV + PPV). Należy zaznaczyć, że nie można było wykryć obecności świńskiego parwowirusa w tych zmianach, jakkolwiek obserwowano serokonwersję w odniesieniu do świńskiego parwowirusa u wszystkich świń w grupie D.
Nie obserwowano żadnych zmian makroskopowych ani histologicznych u prosiąt kontrolnych oraz prosiąt w innych grupach.
Stąd wydaje się, że kombinacja wirusów PCV + PPV umożliwia odtworzenie histologicznych zmian typowych dla zespołu wyniszczenia wielonarządowego świń.
W oparciu o te dwa protokoły eksperymentalne można zaobserwować, że szczepienie samym PCV, jak również mieszaniną PCV + PPV, prowadzi do mniej lub bardziej nasilonego odtworzenia świńskiego zespołu wyniszczenia wielonarządowego, ale w zmianach może być wykryty jedynie świński cirkowirus. W przeciwieństwie, doświadczalne zakażenie samym PPV (grupa B protokołu 3) nie umożliwia wywołania zmian makroskopowych albo histologicznych. Natomiast w obecności PCV, obserwuje się pojawienie zmian u 4-tygodniowych świń (grupa D protokołu 3).

Claims (10)

1. Preparat antygenowy przeciwko zespołowi PMWS (poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający), obejmujący antygen świńskiego cirkowirusa i antygen świńskiego parwowirusa.
2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje antygen świńskiego cirkowirusa typu II.
3. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że antygen świńskiego cirkowirusa typu II jest antygenem cirkowirusa wybranym z grupy obejmującej preparaty zdeponowane w ECACC pod numerami:
- nr dostępu V97100219
- nr dostępu V97100218
- nr dostępu V97100217
- nr dostępu V98011608
-nr dostępu V98011609.
4. Preparat według jednego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że antygen świńskiego cirkowirusa i antygen świńskiego parwowirusa obejmuje, niezależnie od siebie, antygen wybrany z grupy obejmującej atenuowany żywy kompletny antygen, inaktywowany kompletny antygen, antygen podjednostkowy, rekombinowany żywy wektor i wektor DNA.
5. Preparat według jednego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo inną wartościowość, która odpowiada innemu patogenowi świń.
6. Preparat według zastrz. 5, znamienny tym, że obejmuje inną wartościowość wybraną z grupy obejmującej: PRRS (wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń), Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, atroficzny nieżyt nosa, pseudowściekliznę, świńską cholerę, świńską grypę i ich kombinacje.
7. Preparat według zastrz. 5, znamienny tym, że obejmuje inną wartościowość, którą jest
PRRS.
8. Szczepionka przeciwko zespołowi PMWS, znamienna tym, że obejmuje skuteczną terapeutycznie dawkę preparatu antygenowego określonego w jednym z zastrz. 1-7, przy czym preparat antygenowy obejmuje skuteczną ilość antygenu świńskiego parwowirusa oraz antygenu świńskiego cirkowirusa typu II w nośniku albo zaróbce dopuszczalnej z weterynaryjnego punktu widzenia.
9. Szczepionka według zastrz. 8, znamienna tym, że obejmuje adiuwant dopuszczalny z weterynaryjnego punktu widzenia.
10. Szczepionka według zastrz. 8 albo 9, znamienna tym, że obejmuje antygeny kilku świńskich cirkowirusów.
PL345948A 1998-07-06 1999-06-28 Preparat antygenowy oraz szczepionka przeciwko zespołowi PMWS - poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu PL205299B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9808777A FR2781159B1 (fr) 1998-07-06 1998-07-06 Vaccin circovirus et parvovirus porcin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL345948A1 PL345948A1 (en) 2002-01-14
PL205299B1 true PL205299B1 (pl) 2010-04-30

Family

ID=9528441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL345948A PL205299B1 (pl) 1998-07-06 1999-06-28 Preparat antygenowy oraz szczepionka przeciwko zespołowi PMWS - poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6217883B1 (pl)
EP (1) EP1094837B1 (pl)
JP (2) JP4749547B2 (pl)
KR (1) KR100730336B1 (pl)
CN (1) CN1168502C (pl)
AT (1) ATE452653T1 (pl)
AU (1) AU746234B2 (pl)
BR (1) BRPI9911870B8 (pl)
CA (1) CA2332627C (pl)
CY (1) CY1110290T1 (pl)
DE (1) DE69941843D1 (pl)
DK (1) DK1094837T3 (pl)
ES (1) ES2338616T3 (pl)
FR (1) FR2781159B1 (pl)
HU (1) HU227805B1 (pl)
MX (1) MXPA00012785A (pl)
PL (1) PL205299B1 (pl)
PT (1) PT1094837E (pl)
RU (1) RU2237492C2 (pl)
TW (1) TWI221774B (pl)
UA (1) UA72891C2 (pl)
WO (1) WO2000001409A2 (pl)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7192594B2 (en) * 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
JP3795751B2 (ja) * 1997-12-11 2006-07-12 ユニバーシティ オブ サスカッチェワン ブタからの離乳後多全身系消耗症候群ウイルス
US6943152B1 (en) * 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
DE10044648A1 (de) * 2000-09-08 2002-03-21 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Vermehrung oder zur Entfernung von Cirocoviren aus biologischem Material
KR100876629B1 (ko) 2001-03-27 2009-01-07 유니버시티 오브 사스카췌완 써코바이러스의 배양 방법
US20030096377A1 (en) * 2001-06-28 2003-05-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2
US7276353B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
EP2390352A1 (en) 2003-03-18 2011-11-30 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
US7468273B2 (en) 2003-05-01 2008-12-23 Meial Limited Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use
US20040258700A1 (en) * 2003-06-23 2004-12-23 Frimann Tine Holland Vaccine formulation with a preservative
CA2545886A1 (en) 2003-11-13 2005-06-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods of characterizing infectious bursal disease virus
MXPA06009452A (es) 2004-02-19 2007-03-15 Univ Alberta Polimorfismos del promotor de leptin y sus usos.
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
DK1833992T3 (da) * 2004-12-30 2015-06-08 Boehringer Ingelheim Vetmed PCV2-immunogene sammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af sådanne sammensætninger
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
WO2006115843A2 (en) 2005-04-25 2006-11-02 Merial Limited Nipah virus vaccines
TW200643171A (en) * 2005-06-07 2006-12-16 Temasek Life Sciences Lab Ltd Porcine circovirus type 2 vaccines
US20080241184A1 (en) 2005-08-25 2008-10-02 Jules Maarten Minke Canine influenza vaccines
KR100693077B1 (ko) * 2005-11-03 2007-03-12 채찬희 돼지 복합 호흡기 질환 예방 및 치료용 생물학적 조성물
US7771995B2 (en) 2005-11-14 2010-08-10 Merial Limited Plasmid encoding human BMP-7
EP2186823A1 (en) 2005-11-14 2010-05-19 Merial Limited Gene therapy for renal failure
CN109125721A (zh) 2005-12-29 2019-01-04 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 Pcv2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途
PL2275132T3 (pl) * 2005-12-29 2021-09-13 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Multiwalentne immunogenne kompozycje PCV2 i sposoby ich wytwarzania
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
EP2076284A4 (en) * 2006-10-05 2010-03-31 Cerebus Biolog Inc METHODS OF TREATING, PREVENTING AND DIAGNOSING TTV INFECTION IN PORK
WO2008064299A2 (en) * 2006-11-22 2008-05-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of reducing porcine circovirus-associated disease outbreaks
EP2859900A1 (en) * 2006-12-11 2015-04-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
CN107412761A (zh) * 2006-12-15 2017-12-01 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 以pcv2抗原治疗猪
EP1941903A1 (en) * 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) * 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
CN101294224B (zh) * 2007-05-08 2011-04-06 深圳太太基因工程有限公司 一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列
JP2010528604A (ja) * 2007-05-30 2010-08-26 ワイス・エルエルシー ブタウィルスの遺伝子を発現するアライグマポックスウィルス
US20090017064A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
ME01156B (me) * 2007-12-21 2013-03-20 Zoetis Services Llc Postupci i kompozicije za imunizaciju svinja protiv svinjskog cirkovirusa
AU2008347235A1 (en) * 2007-12-31 2009-07-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 ORF2 virus like particle with foreign amino acid insertion
EP2242511A4 (en) * 2008-01-23 2012-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmed IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE PCV2, AND METHODS FOR PRODUCING SUCH COMPOSITIONS
US20110033495A1 (en) * 2008-02-15 2011-02-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
US7927586B2 (en) * 2008-07-08 2011-04-19 South Dakota State University Vaccine for porcine post-weaning diarrhea caused by enterotoxigenic Escherichia coli
CN102428099B (zh) 2009-04-03 2016-03-16 梅里亚有限公司 运载新城疫病毒的禽疫苗
TWI627281B (zh) * 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
US8986706B2 (en) 2010-08-31 2015-03-24 Merial, Inc. Newcastle disease virus vectored herpesvirus vaccines
CN101947318B (zh) * 2010-09-09 2012-09-05 扬州优邦生物制药有限公司 一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法
TWI442935B (zh) 2010-12-22 2014-07-01 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２）、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
AU2012240240A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
AU2012240246A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
AU2012245395A1 (en) 2011-04-20 2013-11-14 Merial, Inc. Adjuvanted rabies vaccine with improved viscosity profile
CA2834288A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Advanced Bioscience Laboratories, Inc. Truncated hiv envelope proteins (env), methods and compositions related thereto
EP2714077B1 (en) 2011-06-01 2018-02-28 Merial, Inc. Needle-free administration of prrsv vaccines
HUE035774T2 (en) 2011-08-12 2018-05-28 Merial Inc Biological substances, in particular vaccines, preserved by vacuum
UA113192C2 (xx) 2011-12-06 2016-12-26 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
CN102961742A (zh) * 2012-01-13 2013-03-13 普莱柯生物工程股份有限公司 猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN105749273A (zh) * 2012-01-13 2016-07-13 普莱柯生物工程股份有限公司 猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法
WO2013138776A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Merial Limited Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g
CN102719407B (zh) * 2012-05-25 2013-09-04 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪细小病毒bq-c株及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用
US9556419B2 (en) 2013-03-12 2017-01-31 Merial Inc. Reverse genetics Schmallenberg virus vaccine compositions, and methods of use thereof
WO2014182872A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Protatek International, Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
JP6821429B2 (ja) 2013-09-25 2021-01-27 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー Ｐｃｖ２ｂ分岐ワクチン組成物及び使用方法
WO2015051099A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 protein variant and virus like particles composed thereof
DK3076996T3 (en) * 2013-12-03 2020-03-09 Intervet Int Bv Vaccine mod porcint circovirus type 2
CN104250640A (zh) * 2014-08-22 2014-12-31 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
AU2015343369B2 (en) 2014-11-03 2018-11-22 Georgia Tech Research Corporation Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
CN111560355A (zh) * 2015-03-20 2020-08-21 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
MX2017014414A (es) 2015-05-14 2018-03-16 Merial Inc Metodo para la produccion de circovirus porcino y vacunas pcv2.
BR112017027895A2 (pt) 2015-06-23 2018-11-06 Merial Inc vetores virais recombinantes contendo proteínas menores de prrsv e métodos de fabricação e utilização destes
RU2746127C2 (ru) * 2016-03-23 2021-04-07 Интервет Интернэшнл Б.В. Вакцина для внутрикожного применения против инфекции вируса pcv2 и prrs
CN106435016B (zh) * 2016-08-30 2019-07-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速显色一步法检测猪圆环病毒2型的lamp试剂盒
DK3534939T3 (da) 2016-11-03 2023-04-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine mod porcin parvovirus og porcin reproduktions- og respirationssyndromvirus og fremgangsmåder til fremstilling deraf

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1538305A1 (ru) 1987-07-21 1994-12-15 Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов Госагропрома СССР Ассоциированная вакцина против лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней
US5811103A (en) * 1989-03-19 1998-09-22 Akzo Nobel N.V. Hog cholera virus vaccine and diagnostic
ES2026827A6 (es) 1991-03-26 1992-05-01 Ercros Sa Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino.
FR2751224B1 (fr) * 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0102770A3 (en) 2004-10-28
DK1094837T3 (da) 2010-04-12
HU227805B1 (en) 2012-03-28
BRPI9911870B8 (pt) 2015-09-22
JP2003522106A (ja) 2003-07-22
KR100730336B1 (ko) 2007-06-19
JP4749547B2 (ja) 2011-08-17
PT1094837E (pt) 2010-03-18
CY1110290T1 (el) 2015-01-14
CN1168502C (zh) 2004-09-29
WO2000001409A3 (en) 2000-06-29
JP2010222359A (ja) 2010-10-07
FR2781159A1 (fr) 2000-01-21
US6953581B2 (en) 2005-10-11
AU746234B2 (en) 2002-04-18
EP1094837A2 (en) 2001-05-02
US6217883B1 (en) 2001-04-17
CA2332627C (en) 2010-06-01
WO2000001409A2 (en) 2000-01-13
CA2332627A1 (en) 2000-01-13
ES2338616T3 (es) 2010-05-10
BR9911870B1 (pt) 2014-08-12
PL345948A1 (en) 2002-01-14
DE69941843D1 (de) 2010-02-04
KR20010081991A (ko) 2001-08-29
CN1311690A (zh) 2001-09-05
AU4907799A (en) 2000-01-24
UA72891C2 (en) 2005-05-16
TWI221774B (en) 2004-10-11
EP1094837B1 (en) 2009-12-23
US20020146431A1 (en) 2002-10-10
ATE452653T1 (de) 2010-01-15
MXPA00012785A (es) 2002-04-24
RU2237492C2 (ru) 2004-10-10
FR2781159B1 (fr) 2000-10-06
HUP0102770A2 (hu) 2001-11-28
BR9911870A (pt) 2001-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU746234B2 (en) Porcine circovirus and parvovirus vaccine
JP5869658B2 (ja) ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬
US7122192B2 (en) Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents
AU2002302120B2 (en) Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents
MXPA00003263A (en) Porcine circoviruses, vaccines and diagnostic reagents